Littérature scientifique sur le sujet « Non-codants »

Ces dernières années, la découverte des ARN courts non codants a ouvert un tout nouveau champ de la biologie moléculaire. En effet, ces petites séquences, ne codant pour aucune protéine, agissent comme de puissants régulateurs de l’expression des gènes. Il existe différents types d’ARN courts non codants, les mieux caractérisés étant les microARN, les piARN (Piwi-interacting ARN) et les siARN (small interfering ARN). Du fait de leur importante fonction d’ajustement dans la régulation des gènes et dans l’expression du génome, une mauvaise régulation du niveau d’expression de ces courts ARN peut entraîner l’apparition de nombreuses pathologies. Cette revue se concentre sur la biogénèse de ces ARN courts non codants chez les animaux.

Les travaux présentés dans cette thèse s'inscrivent dans le cadre de l'analyse de phénomènes biologiques par des moyens informatiques, c'est-à-dire la bio-informatique. Nous nous intéressons plus particulièrement à l'analyse de séquences nucléiques. Dans ce cadre, nos travaux se décomposent en deux parties: l'identification de séquences codantes et l'identification de séquences non-codantes partageant une structure conservée telles que des ARN non-codants. L'originalité des méthodes proposées, Protea et Carnac, réside dans le traitement d'ensembles de séquences nucléiques faiblement conservées sans avoir recours à leur alignement au préalable. Ces méthodes s'appuient sur un même schéma global d'analyse comparative pour identifier des traces laissées par les mécanismes de sélection durant l'évolution, traces globalement cohérentes entre toutes les séquences. Nous avons évalué Protea et Carnac sur des données de référence pour la communauté et obtenu plusieurs résultats significatifs. Dans le cadre de travaux collaboratifs, nous présentons également deux exemples intégrations de ces logiciels. Magnolia est un logiciel qui construit un alignement multiple de séquences nucléiques respectueux de leur fonction commune prédites par Protea et/ou Carnac. Protea et Carnac sont également intégrés dans une plate-forme d'annotation automatique par génomique comparative.

Les ARN sont des molécules aux propriétés diverses interagissant les uns avec les autres dans le but de médier des fonctions spécifiques. L’évaluation de l’abondance relative des ARN est une étape cruciale à la compréhension de la stoechiométrie nécessaire à ces fonctions. Cependant, plusieurs biais et limitations s’imposent avec l’utilisation de différentes techniques d’évaluation, dont le séquençage d’ARN (RNA-Seq), qui sont problématiques dans l’estimation de l’abondance de différents types d’ARN. De récentes études ont exposé les avantages d’un protocole novateur de RNA-Seq qui utilise une rétrotranscriptase thermostable d’intron de groupe II (TGIRT) d’origine bactérienne afin de réduire ces biais. Ce mémoire fait la comparaison entre différentes techniques de RNA-Seq afin d’élucider si l’utilisation de TGIRT en RNA-Seq offre une représentation plus juste du transcriptome. Les comparaisons avec les valeurs d’abondance de différents types d’ARN décrites dans la littérature ainsi qu’obtenues expérimentalement par notre groupe pointent au fait que TGIRT donne une meilleure estimation de l’abondance relative des ARN, et plus particulièrement des ARN hautement structurés. Cette meilleure estimation de l’ensemble de la composition du transcriptome permet de faire des observations sur les rapports d’abondance entre des ARN codants et non-codants fonctionnellement apparentés. Notamment, des ratios d’expression constants entre les ARN non-codants associés à des RNP et les ARNm codants pour leur facteurs protéiques ont été observés. Ceci suggère la présence d’une régulation transcriptionnelle commune nécessaire à la stoechiométrie de ces complexes. Une forte disparité dans l’expression des snoRNA et de leurs gènes hôtes, dépendant du type de snoRNA et de gène hôte a par ailleurs été constatée, corroborant une régulation distincte de la stabilité de ces transcrits. Dans l’ensemble, nos données suggèrent que la méthode TGIRT-Seq est la plus appropriée dans l’évaluation du transcriptome entier et ouvre donc la voie à des analyses plus holistiques par RNA-Seq en donnant une estimation plus juste de l’abondance relative des transcrits d’ARN.
Abstract : RNA are molecules with a wide range of properties that can interact with one another to mediate specific function. The evaluation of RNA abundance is a crucial step in understanding the stoichiometry needed for these functions. However, many limitations and biases come with the use of different techniques, including RNA sequencing (RNA-Seq), which affects the estimation of the abundance of different RNA types. Recent studies have exposed the advantages of a new RNA-Seq protocol using a thermostable group II intron reverse transcriptase (TGIRT) of bacterial origin to reduce these biases. This thesis makes the comparison between different RNA-Seq techniques to elucidate if the use of TGIRT in RNA-Seq offers a more representative depiction of the transcriptome. The comparisons with the abundance values given in literature and obtained experimentally by our group agree with the fact that TGIRT gives a better estimation of the relative abundance of RNA, especially highly structured RNA. This better estimation of the transcriptomic landscape allows many observations on the abundance relations between coding and non-coding RNA that are functionally related. Namely, constant expression ratios between RNP associated noncoding RNA and the mRNA that codes for their associated proteins have been observed. This suggests the presence of a common transcriptional regulation which is necessary for the stoichiometry of these complexes. A strong disparity in the expression of snoRNA and their host genes depending on snoRNA and host gene types has also been observed and corroborate a distinct regulation of these transcripts’ stability. In summary, our data suggest that the TGIRT-Seq method is the most appropriate to evaluate the transcriptome and thus opens the way to more holistic RNA-Seq analyses by giving a better estimation of RNA transcripts relative abundance.

Les ARN non-codants (ARNnc) forment une classe hétérogène d’éléments transcrits mais non traduits qui participent, par l’intermédiaire de leur structure et/ou leur séquence, à une grande diversité de processus cellulaire selon de multiple modalités. Ces dernières années, un grand nombre d’ARNnc ont été détectés expérimentalement dans les génomes et aujourd’hui les ARNnc sont considérés comme des acteurs majeurs de la biologie des cellules eucaryotes, bactériennes et archaeénnes. Malgré ces récentes avancées, l’étape de détection expérimentale des ARNnc dans les génomes nécessite toujours un investissement important en temps et reste encore rarement suivie d’une caractérisation fonctionnelle des éléments ainsi identifiés. Partant de ces constatations, nous avons développé une méthode de détection in-silico des ARNnc dans les génomes bactériens que nous avons appelée NAPP pour « Nucleic Acid Phylogenetic Profiling ». NAPP est une adaptation du profilage phylogénétique, une méthode utilisée pour prédire la fonction de protéine de fonction inconnue. NAPP analyse la co-occurrence d’éléments codants et non-codants d’un génome de référence dans toutes les espèces bactériennes disponibles. Il construit ainsi des groupes d’éléments d’histoire phylogénétique similaire et donc probablement dépendants les uns des autres, contraints par la nécessité de conserver l’intégrité d’un processus cellulaire. Parmi ces groupes, certains présentent un enrichissement en ARNnc connus, ce qui nous a permis logiquement de faire de NAPP un outil de détection des ARNnc dans les génomes bactériens. En comparaison à d’autres outils bioinformatiques, les performances de notre programme ont été quantifiées et se sont avérées très favorables dans plusieurs espèces modèles. Mais notre validation a été également expérimentale, permettant la découverte de 7 nouveaux ARNnc chez S. Aureus. L’un de ces ARNnc, RsaOG, a particulièrement retenu notre attention. En effet, fortement exprimé et conservé uniquement dans le genre Staphylococcus, RsaOG pourrait présenter une structure en pseudo-noeud encore jamais observée à notre connaissance dans un ARNnc agissant en trans. Après une étape de prédiction de ses cibles putatives, nous recherchons actuellement à les valider expérimentalement et à intégrer RsaOG dans la physiologie des Staphylocoques. Mais la caractéristique la plus intéressante de NAPP est probablement sa capacité intrinsèque à fournir une indication fonctionnelle sur les éléments qu’il classifie. En effet, l’analyse de l’enrichissement en certaines fonctions des groupes d’éléments codants et non-codants peut, dans le meilleur des cas, constituer un indice sur la fonction des éléments de fonction inconnue contenus dans ces groupes. Ce type d’analyse nous a permis, chez B. Subtilis, d’observer qu’un nouvel ARNnc, que nous avons appelé CsfG, se regroupait phylogénétiquement avec quasiment la moitié des gènes impliqués dans la sporulation. Nous avons donc inféré que CsfG était potentiellement lui-même impliqué dans la sporulation et des études expérimentales et in-silico nous ont permis de confirmer l’implication de CsfG dans la sporulation en validant sa régulation par les facteurs Sigma F et G spécifiques de la formation de la préspore
Non-coding RNAs (ncRNA) form a heterogeneous group of transcribed, non-translated elements that play, through their structure, sequence and mechanistic diversity, an important role in many cellular processes. In recent years, thousands of ncRNA have been experimentally detected in genomes and ncRNAs are now accepted as key components of the cellular biology of Eukaryota, Prokaryota and Archaea. Despite these recent advances, the experimental detection of ncRNAs remains a timeconsuming task and is rarely followed by a functional analysis of the identified transcripts. To address this issue, we developed an in-silico method for ncRNA detection in bacterial genomes, named NAPP - Nucleic Acid Phylogenetic Profiling. This method derives from phylogenetic profiling, a method used to predict the function of unknown proteins. Based on a reference genome sequence, NAPP computes the co-inheritance of coding and non-coding elements in all available bacterial genomes and clusters elements that share a similar phylogenetic history. Several of these clusters are enriched in known ncRNAs, which enables using NAPP as an ncrNA classifier. Performance benchmarks indicate that NAPP predictive accuracy is equivalent to that of methods designed specifically for ncRNA detection. We further validate our predictions by the description of seven new ncRNAs in S. Aureus. We further studied RsaOG, one of the new S. Aureus small RNAs identified by NAPP. RsaOG is highly expressed and specifically conserved in the Staphylococcus genus. This RNA may involve a pseudoknotted structure, a new observation for a trans-acting ncRNA. After a round of computational target predictions, we are now trying to validate RsaOG targets to integrate this small RNA in Staphylococcus physiology. The most attractive feature of NAPP, however, is its intrinsic capacity to provide functional information on the classified elements. Indeed, functional enrichment of coding and non-coding clusters can, in favorable cases, provide clues about the function of unannotated elements in these clusters. Using this type of functional analysis in B. Subtilis, we focused on CsfG, an ncRNA detected by NAPP. Half of the genes in the CsfG cluster are involved in sporulation and we inferred that CsfG could be a sporulation-related RNA. Experimental and in-silico studies confirmed this prediction, demonstrating that CsfG is directly regulated by two Sigma factors sigG and sigF, that are specific to the prespore formation

Le phénomène d'empreinte génomique parentale se traduit par une expression différentielle des deux allèles de certains gènes, en fonction de leur origine parentale. Nos travaux ont abouti à la découverte de nombreux gènes de petits ARN non-codants de Mammifères (ARN C/D et microARN) soumis à l'empreinte génomique parentale, et à une première caractérisation de leur expression. Alors que la plupart des ARN C/D participent à la biogenèse des ARN ribosomiques et des petits ARN nucléaires, ceux que nous décrivons en semblent incapables ; les microARN, quant à eux, sont habituellement des répresseurs post-transcriptionnels de gènes spécifiques : parmi les microARN que nous décrivons, deux pourraient ainsi réprimer un rétrotransposon. Les fonctions éventuelles de ces gènes de petits ARN non-codants (dans le contrôle du développement, la répression de ce rétrotransposon, et le mécanisme de l'empreinte génomique parentale) sont discutées.

Les dystrophies musculaires de Duchenne (DMD) et de Becker (BMD) sont dues à des mutations dans le gène DMD codant la Dystrophine. De nombreux aspects des mécanismes pathophysiologiques de ces maladies ne sont pas encore expliqués. Nous nous sommes intéressés à l'étude d'ARN non-codants pouvant participer à ces processus. Une première étude a été centrée sur l’identification de micro-ARNs (miARNs) impliqués dans la régulation de l’oxyde nitrique synthase neuronale (nNOS) une protéine partenaire de la Dystrophine et associée à des caractéristiques de ces pathologies telles que la fatigabilité musculaire. 617 miARNs ont été criblés par Taqman Low Density Array dans des muscles de sujets sains et de patients BMDdel45-55. 4 miARNs candidats ont été sélectionnés de cette étude pour leur surexpression chez les patients BMDdel45-55 et leur capacité théorique à cibler nNOS. Des expériences de modulation de l’expression de ces miARNs dans des myoblastes humains sains ou dystrophiques nous ont permis d’identifier que le miR-708-5p et le miR-34-5p pouvaient cibler nNOS et moduler son expression.Un deuxième axe a été mené sur l’étude des longs ARNs non-codants (lncARNs). Les introns 44 et 55, qui bornent les exons 45 à 55 délétés chez les patients BMDdel45-55, sont de grandes régions contenant des lncARNs décrits comme régulant la Dystrophine. Les points de cassure introniques des mutations de ces patients n’étant pas décrites, nous avons supposé l’existence de profils de lncARNs différents. L’analyse de l’ADN de ces patients montre en effet des profils de lncARNs différents, révélant ainsi l’importance d’une étude plus précise des zones de délétion des patients BMDdel45-55
Duchenne (DMD) and Becker (BMD) muscular dystrophies are due to mutations in DMD gene, encoding Dystrophin. Many aspects of pathophysiological mechanisms of these diseases are not yet well understood. We were interested in the study of non-coding RNAs that could be involved in these pathological processes. A first study focused on micro-RNAs (miRNAs) that could modulate expression of the neuronal nitric oxide synthase (nNOS), a partner of Dystrophin which is linked to pathological features as muscular fatigability. 617 miRNAs were screened by Taqman Low Density Array in muscle biopsies of healthy subjects or BMDdel45-55 patients. 4 candidate miRNAs were selected from this study since they were overexpressed in BMDdel45-55 patients and for their theoretical ability to target nNOS. Experiments modulating the expression of these miRNAs in healthy or dystrophic human myoblasts enabled us to identify that miR-708-5p and miR-34-5p could target nNOS and modulate its expression.A second axis was conducted on long non-coding RNA (lncRNA). Introns 44 and 55, which bound exons 45-55 deleted in BMDdel45-55 patients, are large regions containing lncRNAs described as regulating Dystrophin. Since intronic breakpoints of DMD mutations of these pateints were not described, we have assumed the existence of different profiles of lncRNAs. DNA analysis of these patients actually showed different lncRNAs profiles, thus revealing the significance of a more precise analysis of deletion areas in DMD gene of BMDdel45-55 patients

La recherche d'ARN non-codants (ARNnc) a reçu un regain d'intérêt suite à la découverte de nouveaux types d'ARNnc aux fonctions multiples. De nombreuses techniques ont été développées pour localiser ces ARN dans des séquences génomiques. Nous utilisons ici une approche supposant la connaissance d'un ensemble d'éléments de structure discriminant une famille d'ARNnc appelé signature.

Dans cette approche, nous combinons plusieurs techniques de \textit{pattern-matching} avec le formalisme des réseaux de contraintes pondérées afin de modéliser simplement le problème, de décrire finement les signatures et d'attribuer un coût à chaque solution. Nos travaux nous ont conduit à élaborer plusieurs techniques de filtrage ainsi que des algorithmes de pattern-matching originaux que nous présentons ici.

Nous avons de plus conçu un logiciel, appelé DARN!, qui implante notre approche, ainsi qu'un module de génération de signatures. Ceux-ci permettent de rechercher efficacement de nouveaux ARNnc.

La recherche d'ARN non-codants (ARNnc) a reçu un regain d'intérêt suite à la découverte de nouveaux types d'ARNnc aux fonctions multiples. De nombreuses techniques ont été développées pour localiser ces ARN dans des séquences génomiques. Nous utilisons ici une approche supposant la connaissance d'un ensemble d'éléments de structure discriminant une famille d'ARNnc appelé signature. Dans cette approche, nous combinons plusieurs techniques de pattern-matching avec le formalisme des réseaux de contraintes pondérées afin de modéliser simplement le problème, de décrire finement les signatures et d'attribuer un coût à chaque solution. Nos travaux nous ont conduit à élaborer plusieurs techniques de filtrage ainsi que des algorithmes de pattern-matching originaux que nous présentons ici. Nous avons de plus conçu un logiciel, appelé DARN!, qui implante notre approche, ainsi qu'un module de génération de signatures. Ceux-ci permettent de rechercher efficacement de nouveaux ARNnc
Following recent discoveries about the several roles of non-coding RNAs (ncRNAs), there is now great interest in identifying these molecules. Numerous techniques have been developed to localize these RNAs in genomic sequences. We use here an approach which supposes the knowledge of a set of structural elements called signature that discriminate an ncRNA family. In this work, we combine several pattern-matching techniques with the weighted constraint satisfaction problem framework. Together, they make it possible to model our biological problem, to describe accurately the signatures and to give the solutions a cost. We conceived filtering techniques as well as novel pattern-matching algorithms. Furthermore, we designed a software called DARN! that implements our approach and another tool that automatically creates signatures. These tools make it possible to localize efficiently new ncRNAs

Ce travail de thèse portant sur la physiologie et la génétique et réalisé chez la bactérie Gram-négative modèle Escherichia coli, se divise en deux parties. Une première partie concerne la réponse d’adaptation au stress et notamment la réponse d’adaptation au stress extracytoplasmique. Cette partie est illustrée par un article portant sur l’analyse globale des cinq voies de réponse au stress extracytoplasmique. Ce travail montre que, d’une part les cinq voies répondent aux mêmes signaux mais avec une spécificité d’induction qui est dépendante du seuil et d’autre part la réponse des ces voies sont complémentaires et non redondantes. La deuxième partie de la thèse concerne les ARN non codants d’Escherichia coli et leurs rôles dans la réponse au stress. Cette partie est illustrée par i) une partie de résultats concernant la mise au point d’une méthode biochimique (targetome) permettant de « capturer » les cibles des ARN non-codants et ii) par un article qui porte sur la caractérisation de Ral, un ARN non-codant antisens de la protéase Lon. La méthode targetome reste encore à améliorer cependant elle a permis d’identifier une nouvelle cible putative de l’ARN non-codant MicC. Cette méthode a aussi permis de capturer les cibles putatives de Ral qui sont les ARN messagers des gènes lon et topB. Bien que le mécanisme d’action de Ral soit encore inconnu, sa présence sur un plasmide multicopie induit un retard de croissance et une filamentation en milieu minimum de croissance. Ral est un des rares ARN non-codant cis antisens codé par le chromosome d’Escherichia coli et cette classe d’ARN non-codant semble être à la base de mécanisme de régulation originaux
This work realised in the Gram-negative model bacterium Escherichia coli is divided in two parts. The first part focuses on adaptive response and more precisely the response to extracytoplasmic stress. This part is illustrated by a paper on the global analysis of the five pathways that responde to extracytoplasmic stress. It shows that i) all pathways are activated by the same signals but the specificity of induction is dose-dependent and that II) responses displayed are complementary but not redundant. The second part of this work concerns non-coding RNAs in Escherichia coli. The results’ part introduces a biochemical method to “fish” non-coding RNAs targets (targetome). This part is followed by a paper on Ral, a non-coding RNA antisens of lon protease gene. The targetome method is still in development but it allows the identification of a new putative target for micC RNA. This method was also used to identify Ral putative targets which are lon and topB messenger RNAs. Ral mechanism of action is still unclear but phenotypes associated to the presence of its multicopy plasmid have been isolated. Ral is one of the few cis antisens RNAs that are encoded in the chromosome of Escherichia coli