Thèses sur le sujet « Modelli patologici »

L’integrazione multisensoriale è la capacità del sistema nervoso di utilizzare molteplici sorgenti sensoriali. Una tra le più studiate forme di integrazione è quella tra informazioni visive ed acustiche. La capacità di localizzare uno stimolo acustico nello spazio è un processo meno accurato ed affidabile della localizzazione visiva, di conseguenza, un segnale visivo è spesso in grado di “catturare” (ventriloquismo) o di incrementare (enhancement multisensoriale) la performance di localizzazione acustica. Numerose evidenze sperimentali hanno contribuito ad individuare i processi neurali e le aree cerebrali alla base dei fenomeni integrativi; in particolare, un importante contributo viene dallo studio su soggetti con lesioni cerebrali. Tuttavia molti aspetti sui possibili meccanismi coinvolti restano ancora da chiarire. Obiettivo di questa tesi è stato lo sviluppo di un modello matematico di rete neurale per fare luce sui meccanismi alla base dell’interazione visuo-acustica e dei suoi fenomeni di plasticità. In particolare, il modello sviluppato è in grado di riprodurre condizioni che si verificano in-vivo, replicando i fenomeni di ventriloquismo ed enhancement in diversi stati fisiopatologici e interpretandoli in termini di risposte neurali e reciproche interazione tra i neuroni. Oltre ad essere utile a migliorare la comprensione dei meccanismi e dei circuiti neurali coinvolti nell’integrazione multisensoriale, il modello può anche essere utile per simulare scenari nuovi, con la possibilità di effettuare predizioni da testare in successivi esperimenti.

La parodontite (PD) è un'infezione periferica polimicrobica ad elevata prevalenza, associata a batteri anaerobi gram-. Nella PD l'equilibrio tra batteri e risposta dell'ospite è alterato, risultando in un'infiammazione incontrollata caratterizzata da alti livelli di mediatori infiammatori (IL-1, IL-6, IL-17, TNF-a) e bassi livelli di molecole anti-infiammatorie (IL-10). Localmente, tali molecole interagiscono amplificando la flogosi ed attivando i meccanismi responsabili della distruzione tissutale. Inoltre, nei pazienti con PD, chemochine (IL-8, Monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) e citochine (IL-1ß, IL-6, IL-17, TNF- a) infiammatorie sono elevate anche nel plasma, contribuendo al carico infiammatorio sistemico ed a potenziali effetti sistemici. I dati circa l'associazione della PD con le patologie neurodegenerative sono scarsi, tuttavia essa sembra plausibile sia da un punto di vista epidemiologico che biologico considerato il contributo alla flogosi sistemica/encefalica, l'incremento di citochine nel cervello evocato dalla stimolazione delle fibre nervose trigeminali, i prodotti batterici e/o i batteri stessi, alcuni dei quali sono capaci di invadere il sistema nervoso centrale e sono stati riscontrati in misura maggiore nei campioni di M. di Alzheimer rispetto ai controlli. Lo scopo del presente lavoro è quello di cercare di chiarire il ruolo ed i meccanismi attraverso cui le infezioni croniche possono contribuire all'insorgenza e/o alla progressione di malattie croniche complesse che caratterizzano l'invecchiamento patologico, in particolare il declino cognitivo e le patologie neurodegenerative. A tale scopo, è stato utilizzato, come modello umano di infezione cronica, la parodontite: condizione clinica ad elevata prevalenza caratterizzata da processi distruttivi a carico dei tessuti parodontali, ad eziologia polimicrobica (gram negativi, anaerobi) e patogenesi infiammatoria. Nel setting clinico su tale obiettivo, sono stati reclutati pazienti affetti solo da parodontite i cui dati sono stati utilizzati come controllo nella comparazione con gli analoghi dati dei pazienti con diversi gradi di impairment cognitivo. In particolare è stato analizzato il profilo proteomico salivare dei pazienti con la tecnologia SELDI-TOF-MS (Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry) che permette di eseguire l’analisi proteomica di piccole quantità di campioni biologici mediante la misurazione del rapporto massa/carica (m/z) delle diverse molecole proteiche, al fine di chiarire i meccanismi di interferenza reciproca ditali condizioni e potenzialmente individuare dei biomarkers utili alla loro caratterizzazione clinico-prognostica. I parametri clinici rilevati hanno evidenziato un significativo aumento degli indici di placca e di sanguinamento al sondaggio nel gruppo di studio (p <0,05), il che potrebbe essere giustificato dalla minore abilità e frequenza nell’eseguire una normale igiene orale. A fronte di ciò, non si è accertata significatività statistica nelle differenze per gli altri parametri parodontali clinici; ciò lascia, verosimilmente, supporre che lo status parodontale non differisce in maniera sostanziale nei due gruppi. L’analisi proteomica ha mostrato 10 picchi espressi in maniera significativamente diversa nella saliva del gruppo di studio rispetto ai controlli. L’analisi CART non è, tuttavia, riuscita a costruire un albero classificativo valido (sensibilità 8%, specificità 12%).
Periodontitis is a chronic infectious disease involving gingival tissues, the periodontal ligament and the alveolar bone. It is accompanied by increased low grade inflammation and transient bacteremia. Periodontitis is caused by microorganisms that adhere to and grow on the tooth's surfaces, along with an overly aggressive immune response against these microorganisms. Its association with neurodegenerative disease is still unclear. A possible relationship seems to be related to an increase of cytokines production (IL-1, IL-6, IL-17, TNF-a) in periodontal ligament and the presence of oral microorganisms that may increase the encephalopathy. Current knowledge on the association between periodontitis and encephalopathy is mainly based on small comparative and treatment studies. The aim of the present paper was to investigate the role of periodontitis (a chronic human infection) in neurodegenerative disorders, e.g. Alzheimer. In particular, the presence of markers in saliva by the surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) technology was investigated. SELDI-TOF-MS allows the generation of an accurate protein profile from minimal amounts of biological samples and may produce proteomic profile of saliva, recording all saliva components modification in patients. Clinical parameters measured showed a significant increase in the indices of plaque and bleeding on probing in the study group (p <0.05), which could be justified by the lower frequency and ability to perform a normal oral hygiene. Against this background, it was not found statistically significant differences in other clinical periodontal parameters; thus it seems likely to assume that the periodontal status did not differ substantially between the two groups. Proteomic analysis showed 10 peaks expressed in a manner significantly different in the saliva of the study group compared to controls. However, the CART analysis was not able to build a valid classification tree (sensitivity 8%, specificity 12%).

La PKCε e la PKCδ, chinasi ubiquitariamente distribuite e ad azione pleiotropica, sono implicate del differenziamento, sopravvivenza e proliferazione cellulare. Esse sono coinvolte nel processo differenziativo delle cellule staminali ematopoietiche e in fenomeni patologici associati al compartimento sanguigno. In questa tesi sono presentati i risultati riguardanti lo studio in vitro del ruolo di PKCε e PKCδ nel contesto del differenziamento megacariocitario, in particolare si caratterizza l’espressione e la funzione di queste chinasi nel modello umano e nel modello murino di Megacariocitopoiesi, normale e patologica. Confrontando le cinetiche dei due modelli presi in analisi nello studio è stato possibile osservare come in entrambi PKCε e PKCδ dimostrino avere una chiara e specifica modulazione nel progredire del processo differenziativo. Questi dati, se confrontati, permettono di affermare che PKCε e PKCδ presentano un pattern di espressione opposto e, nel modello umano rispetto a quello murino, reciproco: nell’uomo i livelli di PKCε devono essere down-modulati, mentre nel topo, al contrario, i livelli della chinasi risultano up-modulati durante lo stesso processo. Analogamente, le CD34+ in differenziazione presentano una costante e maggiore espressione di PKCδ durante la maturazione MK, mentre nel modello murino tale proteina risulta down-modulata nella fase più tardiva di formazione della piastrina. Le chinasi mostrano in oltre di agire, nei due modelli, attraverso pathways distinti e cioè RhoA nel topo e Bcl-xL nell’uomo. È stato inoltre verificato che l’aberrante differenziamento MK osservato nella mielofibrosi primaria (PMF), è associato a difetti di espressione di PKCε e di Bcl-xL e che una forzata down-modulazione di PKCε porta ad un ripristino di un normale livello di espressione di Bcl-xL così come della popolazione di megacariociti formanti propiastrine. I dati ottenuti indicano quindi che PKCε e PKCδ svolgono un ruolo importante nel corretto differenziamento MK e che PKCε potrebbe essere un potenziale nuovo target terapeutico nelle PMF.
Protein kinases C (PKC) are known to be ubiquitously distributed and to have pleiotropic effects. Isoforms epsilon (PKCε) and delta (PKCδ) are involved in the regulation of cell growth, survival and differentiation; in particular, they have been also investigated for their role in the hematopoiesis and in aberrant processes of differentiation along the erythroid and megakaryocytic lineages. In this PhD thesis, the results of an in vitro study about the role of these two kinases in models of megakaryocytic (MK) differentiation, both normal and pathological, are presented. The observations about PKCε and PKCδ kinetics show how these proteins have a specific modulation during the MK differentiation that results in an opposite pattern of expression and, in the murine model if compared with the human model, also a reciprocal one. In particular, in human megakaryocytopoiesis, PKCε results down-modulated, whereas in mouse its levels increase. Instead, PKCδ shows a high and steady expression in maturing CD34+ MK committed, but it is strongly down-modulated during the latest phases of platelet maturation in the murine model. The study also elucidates the different pathways PKCε and PKCδ work through, being an inhibitory action of PKCε on RhoA during proplatelets (ppt) formation in the mouse model while, in the human MK differentiation, platelets production is regulated by PKCδ through Bcl-xL. In this dissertation it is also demonstrated how in an aberrant megakaryocytopoiesis, as in the pathologic model of primary myeloproliferative neoplasm (PMF), PKCε is strongly deregulated and it results in an altered Bcl-xL expression. A forced down-modulation of this kinase restores a normal MK differentiation and ppt maturation. Therefore, the data presented show that PKCε and PKCδ play a key role in proper megakaryocyte maturation and that PKCε could be a potential new therapeutic target for PMF.

La PKCε e la PKCδ, chinasi ubiquitariamente distribuite e ad azione pleiotropica, sono implicate del differenziamento, sopravvivenza e proliferazione cellulare. Esse sono coinvolte nel processo differenziativo delle cellule staminali ematopoietiche e in fenomeni patologici associati al compartimento sanguigno. In questa tesi sono presentati i risultati riguardanti lo studio in vitro del ruolo di PKCε e PKCδ nel contesto del differenziamento megacariocitario, in particolare si caratterizza l’espressione e la funzione di queste chinasi nel modello umano e nel modello murino di Megacariocitopoiesi, normale e patologica. Confrontando le cinetiche dei due modelli presi in analisi nello studio è stato possibile osservare come in entrambi PKCε e PKCδ dimostrino avere una chiara e specifica modulazione nel progredire del processo differenziativo. Questi dati, se confrontati, permettono di affermare che PKCε e PKCδ presentano un pattern di espressione opposto e, nel modello umano rispetto a quello murino, reciproco: nell’uomo i livelli di PKCε devono essere down-modulati, mentre nel topo, al contrario, i livelli della chinasi risultano up-modulati durante lo stesso processo. Analogamente, le CD34+ in differenziazione presentano una costante e maggiore espressione di PKCδ durante la maturazione MK, mentre nel modello murino tale proteina risulta down-modulata nella fase più tardiva di formazione della piastrina. Le chinasi mostrano in oltre di agire, nei due modelli, attraverso pathways distinti e cioè RhoA nel topo e Bcl-xL nell’uomo. È stato inoltre verificato che l’aberrante differenziamento MK osservato nella mielofibrosi primaria (PMF), è associato a difetti di espressione di PKCε e di Bcl-xL e che una forzata down-modulazione di PKCε porta ad un ripristino di un normale livello di espressione di Bcl-xL così come della popolazione di megacariociti formanti propiastrine. I dati ottenuti indicano quindi che PKCε e PKCδ svolgono un ruolo importante nel corretto differenziamento MK e che PKCε potrebbe essere un potenziale nuovo target terapeutico nelle PMF.
Protein kinases C (PKC) are known to be ubiquitously distributed and to have pleiotropic effects. Isoforms epsilon (PKCε) and delta (PKCδ) are involved in the regulation of cell growth, survival and differentiation; in particular, they have been also investigated for their role in the hematopoiesis and in aberrant processes of differentiation along the erythroid and megakaryocytic lineages. In this PhD thesis, the results of an in vitro study about the role of these two kinases in models of megakaryocytic (MK) differentiation, both normal and pathological, are presented. The observations about PKCε and PKCδ kinetics show how these proteins have a specific modulation during the MK differentiation that results in an opposite pattern of expression and, in the murine model if compared with the human model, also a reciprocal one. In particular, in human megakaryocytopoiesis, PKCε results down-modulated, whereas in mouse its levels increase. Instead, PKCδ shows a high and steady expression in maturing CD34+ MK committed, but it is strongly down-modulated during the latest phases of platelet maturation in the murine model. The study also elucidates the different pathways PKCε and PKCδ work through, being an inhibitory action of PKCε on RhoA during proplatelets (ppt) formation in the mouse model while, in the human MK differentiation, platelets production is regulated by PKCδ through Bcl-xL. In this dissertation it is also demonstrated how in an aberrant megakaryocytopoiesis, as in the pathologic model of primary myeloproliferative neoplasm (PMF), PKCε is strongly deregulated and it results in an altered Bcl-xL expression. A forced down-modulation of this kinase restores a normal MK differentiation and ppt maturation. Therefore, the data presented show that PKCε and PKCδ play a key role in proper megakaryocyte maturation and that PKCε could be a potential new therapeutic target for PMF.

I Gangli della Base svolgono un importante ruolo nel controllo del movimento volontario: questi nuclei sottocorticali localizzati alla base di entrambi gli emisferi cerebrali sono densamente interconnessi con la corteccia cerebrale, il talamo e il tronco dell’encefalo, ma non con il midollo spinale. Facilitano l’esecuzione di un singolo atto motorio, sopprimendo tutti gli altri. Questa funzionalità ha lo scopo di favorire il comando più appropriato, inibendo i restanti per il tempo necessario. I Gangli della Base fungono da vero e proprio filtro, prendendo informazioni dall'intera corteccia, permettendo il passaggio di alcune e bloccandone altre. Per iniziare, verrà descritta l’anatomia e ogni singola parte che compone questi nuclei, elencando le varie interconnessioni sinaptiche. Successivamente, si passerà alla illustrazione della via diretta e della via indiretta e del meccanismo fisiologico che regola l’apprendimento sinaptico e la selezione di azioni, con annessi i principi teorici che ne costituiscono le fondamenta. Si affronterà il modello sviluppato presso l’Università di Bologna da C. Baston e M. Ursino e verranno mostrate varie simulazioni riguardanti tale modello. In conclusione, si tratteranno la malattia di Parkinson, patologia neurodegenerativa che colpisce principalmente le cellule dopaminergiche di alcune aree dei Gangli della Base, e il morbo di Huntington

A network care model for the management of diabetic patients A feasibility study (approved for funding by the Italian Ministry of Health) has been designed to evaluate an innovative care model for diabetes, based on the Outpatient Day Service (ODS), in term of quality of healthcare, compliance, social and health costs and patient's quality of life and satisfaction. We enrolled eight Diabetes Unit of major regional hospitals. ODS has been defined as an innovative health care modality, which is part of the specialist ambulatory service operating at the territorial level and is aimed at the management of clinical conditions. It requires numerous, multidisciplinary and often complex laboratory and instrumental procedures as defined by a specific diagnostic and therapeutic path centred on the clinical problem, rather than on the individual procedure. ODS includes a basic package and packages for micro and macro vascular chronic complications. It has been investigated the feasibility to insert a "Clinical Pathway" for diabetic patients into the Local Health Authority database SISS (Sistema Informativo Socio Sanitario, Health and Social Informative System), as an Electronic Health Record (EHR) service. The EHR is a virtual healthcare repository that gathers all the citizen's information and clinical documents produced by doctors and health professionals, making them available even when they are produced in different institutes. The Clinical Pathway has been organized as a "virtual folder". The term "folder" expresses the concept of a binder issued to the patient for the specific pathology (in this case diabetes), used to gather structured documents; the term "virtual" describes that the folder filling is shared amongst the different actors that collaborate on the pathway. The clinical pathway implementation is essentially made as a clinical documents collection that belongs to the same subject. Additionally aim of the study is to evaluate whether sharing of a minimum data set across the levels of care can improve the integration between primary and secondary care. Structure indicators, Process indicators, Outcomes, Therapy indicators, Costs, Quality of life and patient satisfaction have been created. A preliminary analysis of the database has been carried out for evaluate data quality and the effective possibility of obtain the indicators. Project help the systematic management of diabetic patients by General Practitioner (primary care) and hospital diabetes facilities and improve integration between first and second care levels.

La calcificazione ectopica (CE) è una deposizione patologica di sali di calcio-fosfato che coinvolge attivamente le cellule e la matrice extracellulare. La CE si verifica in diverse condizioni acquisite e genetiche portando ad una grave compromissione delle proprietà meccaniche dei tessuti connettivi lassi (TCL). Nonostante i numerosi studi effettuati finora, alcuni quesiti rimangono ancora irrisolti: 1) la complessità genetica e l'eterogeneità della CE; 2) il ruolo delle cellule mesenchimali e/o dell'ambiente extracellulare nel modulare la deposizione di minerali; 3) l'identificazione delle vie molecolari coinvolte nel processo patogenetico; 4) i meccanismi che controllano le CE in aree specifiche di un determinato tessuto. Lo Pseudoxantoma elasticum (PXE) è una malattia genetica, caratterizzata da una progressiva mineralizzazione delle fibre elastiche dei TCL, frequentemente utilizzata come modello per comprendere la complessità delle CE. Varianti patogenetiche rare nel gene ABCC6 sono responsabili dell'insorgenza di PXE. Un'ampia coorte di pazienti italiani PXE è stata studiata retrospettivamente per valutare l'insorgenza di manifestazioni cliniche (dalle più frequenti a carico di cute, occhi e sistema cardiovascolare, a quelle meno frequenti come ictus, emorragie gastrointestinali e nefrolitiasi) a seconda dell'età, del genere e del tipo di mutazioni. Inoltre, per migliorare la consulenza dei pazienti PXE, lo score clinico (Phenodex), è stato implementato con manifestazioni oftalmologiche, che permettono di caratterizzare i disturbi molto precoci o tardivi. Poiché l'eterogeneità del fenotipo PXE può essere correlata a geni modificatori, sono stati condotti studi di sequenziamento dell’esoma completo i cui risultati evidenziano: i) la presenza di un'ereditarietà digenica di ABCC6 e GGCX o di ABCC6 e ENPP1; ii) la presenza di varianti genetiche rare in geni coinvolti in patologie retiniche ereditarie (es. ABCC4, IMPG1), ampliando così lo spettro dei geni potenzialmente coinvolti nella progressione della malattia; iii) il coinvolgimento di geni che contribuiscono all'assemblaggio, mantenimento e stabilità delle fibre elastiche creando un ambiente locale pro-calcificante iv) la partecipazione di geni che codificano per proteine mitocondriali. Quest’ultimo dato è stato approfondito con un approccio multidisciplinare su fibroblasti PXE i cui mitocondri risultavano morfologicamente modificati e caratterizzati da un proteoma alterato influenzando l'equilibrio redox, la fosforilazione ossidativa e l'omeostasi del calcio. Inoltre, è noto che lo stress ossidativo può portare all'attivazione delle vie di segnale SMAD che promuovono l'espressione di geni pro-calcificanti. Tale via è stata studiata confrontando la cute di controllo con la cute clinicamente affetta (CAS) e non affetta (CUS) dello stesso paziente PXE. Rispetto al controllo, la via delle SMAD risulta attivata nel PXE indipendentemente dall'area cutanea (CUS o CAS). Tuttavia, l’attivazione delle SMAD non è sufficiente per indurre la calcificazione delle fibre elastiche, in quanto quest’ultime nel CUS appaiono degradate ma non calcificate, suggerendo che ulteriori fattori locali possono contribuire all'ambiente pro-osteogenico. È stato quindi sviluppato un modello in vitro per studiare la mineralizzazione delle strutture fibrillari dell’elastina idrolizzate ed incubate in mezzi a diversa composizione ionica. I risultati dimostrano che la deposizione di minerali sull'elastina insolubile dipende dal tipo di idrolisi, dalla presenza di specie ioniche specifiche e dalla loro concentrazione, spiegando il motivo per cui le fibre elastiche non calcificate e calcificate in vivo possono coesistere all'interno dello stesso tessuto.
Ectopic calcification (EC) is a progressive deposition of calcium-phosphate salts actively involving cells and the extracellular matrix. Aberrant mineralization is responsible for the severe impairment of the mechanical properties of soft connective tissues and takes place in several acquired and genetic conditions. Despite the number of studies performed so far, the following issues are still unresolved: 1) the genetic complexity and heterogeneity of EC; 2) the role of mesenchymal cells and/or of the extracellular environment in modulating mineral deposition; 3) the identification of molecular pathogenetic pathways; 4) the mechanisms controlling the localization of mineral deposits in specific areas within a tissue. Pseudoxanthoma elasticum (PXE) is a genetic disorder characterized by a progressive mineralization of elastic fibers within soft connective tissues, being considered a paradigm of EC diseases, is frequently used as a model to understand the complexity of EC. Rare pathogenic sequence variants in the ABCC6 gene are mostly responsible for the onset of PXE. A large cohort of Italian PXE patients was retrospectively investigated to better evaluate the occurrence of clinical manifestations (from the most frequent affecting skin, eyes, and the cardiovascular system, to the less frequent as stroke, gastrointestinal hemorrhages, and nephrolithiasis) depending also on age, gender, and type of mutations. Moreover, to improve PXE patients’ counselling, the clinical score system (i.e., Phenodex index), was updated by adding ophthalmological findings, which characterize either very early or late manifestations. Since, it has been proposed that the heterogeneity of the PXE phenotype can be related to modifiers genes, whole exome sequencing analysis were performed on several PXE patients. Data highlighted the: i) occurrence of a digenic inheritance of ABCC6 and GGCX or of ABCC6 and ENPP1; ii) presence of pathogenic variants in inherited retinal diseases genes (i.e., ABCC4, IMPG1), thus widening the spectrum of genes potentially involved in the disease progression; iii) involvement of genes contributing to the assembly, maintenance and stability of elastic fibers which create a more favorable local environment to mineral deposition and iv) participation of genes encoding mitochondrial proteins. Consistently, by a multidisciplinary approach, it was demonstrated that PXE mitochondria were morphologically modified and characterized by an altered proteome affecting redox balance, oxidative phosphorylation, and calcium homeostasis. Moreover, the mitochondrial-dependent oxidative stress can lead to the activation of SMAD signaling pathways as inducer of the expression of calcifying genes. This pathway was also investigated in control skin and in both clinically affected (CAS) and unaffected (CUS) PXE skin biopsies from the same patient. Compared to control skin, SMAD signaling was activated in PXE regardless of the skin area (i.e., CUS or CAS). However, the activated SMAD signaling is not sufficient to induce the calcification of elastic fiber, because CUS elastic fibers appear degraded, but not calcified, suggesting that additional local factors can contribute to the pro-osteogenic environment. An in vitro model system was therefore fine-tuned to investigate the mineralization of elastin fibrillar structures hydrolyzed and incubated in cell-free environmental milieu of different ionic composition. Results demonstrated that mineral deposition on insoluble elastin depends on type of hydrolysis, on the presence of specific ionic species and on their concentration, thus explaining why, in vivo, non-calcified and calcified elastic fibers can coexist within the same tissue.

Fusarium graminearum causa la fusariosi della spiga nei cereali a paglia. Il fungo produce sia conidi che ascospore sui residui della coltura precedente, le ascospore sono prodotte in periteci. La produzione e maturazione di periteci e ascospore in risposta a diverse condizioni di temperatura e umidità relativa sono state studiate. Dato che le condizioni atmosferiche influenzano anche l’umidità del substrato su cui l’inoculo è prodotto, la relazione tra i fattori atmosferici e l’umidità dei residui colturali di mais è stata esaminata. I fattori atmosferici influenzano anche il rilascio delle ascospore. L’effetto della temperatura è stato studiato in vitro. Mediante esperimenti in condizioni naturali, sono state definite regole per l’individuazione di condizioni favorevoli al rilascio di ascospore sulla base di pioggia e deficit di pressione di vapore. La distribuzione delle ascospore e dei conidi all’interno della vegetazione del frumento è quindi stata studiata mediante l’uso di captaspore passivi. Le ascospore possono essere rilasciate e depositarsi sulle spighe in condizioni non favorevoli per la germinazione. La germinazione di ascospore sottoposte a periodi asciutti di diversa durata, e a diverse condizioni di temperatura e umidità relativa durante il periodo asciutto, è stata studiata sia in vitro che in planta.
Fusarium graminearum causes Fusarium head blight of small-grain cereals. The fungus produces conidia and ascospores on the previous crop residues, ascospores are formed in perithecia. Production and maturation of perithecia and ascospores at several temperature and relative humidity conditions were studied. As environmental conditions also influence the moisture content of the substrate on which inoculum is produced, the relationship between environmental factors and moisture of maize residues was assessed. Environmental factors also influence ascospore discharge. The effect of temperature was studied in vitro. Experiments in natural condition allowed to define rules for conditions leading to ascospore discharge, based on rain and vapor pressure deficit. Once discharged, the distribution of ascospores and conidia in the wheat canopy was studied using passive spore traps. Ascospores can be discharged and deposit on wheat spikes also in conditions that are unfavorable for germination. Germination of ascospores incubated in dryness for periods of several length, in several condition of temperature and relative humidity during dryness, was studied both in vitro and in planta.

Fusarium graminearum causa la fusariosi della spiga nei cereali a paglia. Il fungo produce sia conidi che ascospore sui residui della coltura precedente, le ascospore sono prodotte in periteci. La produzione e maturazione di periteci e ascospore in risposta a diverse condizioni di temperatura e umidità relativa sono state studiate. Dato che le condizioni atmosferiche influenzano anche l’umidità del substrato su cui l’inoculo è prodotto, la relazione tra i fattori atmosferici e l’umidità dei residui colturali di mais è stata esaminata. I fattori atmosferici influenzano anche il rilascio delle ascospore. L’effetto della temperatura è stato studiato in vitro. Mediante esperimenti in condizioni naturali, sono state definite regole per l’individuazione di condizioni favorevoli al rilascio di ascospore sulla base di pioggia e deficit di pressione di vapore. La distribuzione delle ascospore e dei conidi all’interno della vegetazione del frumento è quindi stata studiata mediante l’uso di captaspore passivi. Le ascospore possono essere rilasciate e depositarsi sulle spighe in condizioni non favorevoli per la germinazione. La germinazione di ascospore sottoposte a periodi asciutti di diversa durata, e a diverse condizioni di temperatura e umidità relativa durante il periodo asciutto, è stata studiata sia in vitro che in planta.
Fusarium graminearum causes Fusarium head blight of small-grain cereals. The fungus produces conidia and ascospores on the previous crop residues, ascospores are formed in perithecia. Production and maturation of perithecia and ascospores at several temperature and relative humidity conditions were studied. As environmental conditions also influence the moisture content of the substrate on which inoculum is produced, the relationship between environmental factors and moisture of maize residues was assessed. Environmental factors also influence ascospore discharge. The effect of temperature was studied in vitro. Experiments in natural condition allowed to define rules for conditions leading to ascospore discharge, based on rain and vapor pressure deficit. Once discharged, the distribution of ascospores and conidia in the wheat canopy was studied using passive spore traps. Ascospores can be discharged and deposit on wheat spikes also in conditions that are unfavorable for germination. Germination of ascospores incubated in dryness for periods of several length, in several condition of temperature and relative humidity during dryness, was studied both in vitro and in planta.

This work deals with stress-strain analysis pathological hip joint. In its introduction a research study from accessible literature sources is carried out. It covers contemporary state of scientific studies, anatomy of single components hip joint, their material properties, ways and magnitudes of loadings and most often FE model used. With use of all these informations, computational system ANSYS and gained CT scans, a model of geometry of pelvis and femur is created. Subsequently, the complete computational model o pathological hip point is compiled. On this model computational solution is executed stress-strain and sensitivity analysis. Subsequently, surgery operation is simulated on this model and it is executed stress-strain analysis. These analyses are compared with analysis of physiological hip joint.

A growing body of evidence support the use of probiotics in the prevention and treatment of difficult healing wounds. Even if several studies in vitro and in vivo have highlighted the pro-healing effects of several probiotic bacteria, the underlying mechanisms are still not fully defined.The doctoral project aimed to investigate the in vitro effects of selected strains of probiotics on two different epithelial models, to study their ability to influence tissue repair. in the first model were analyzed the effect of the soluble fraction of seven selected strains of probiotics on a wound healing model using the HaCaT cell line. Screening of bacterial strains was carried out to identify those able to accelerate the repair process; subsequently the effects of these strains on the two main processes involved in wound healing were evaluated: cell proliferation and migration. The involvement of NO was analyzed in the acceleration process induced by the different bacterial strains evaluating, in particular, the expression of NOS2. In the second model the effects of a probiotic formulation (VIVOMIXX), composed by eight probiotic strains were analyzed on trans-epithelial electrical resistance (TEER), dextran flux, and expression TJ proteins i.e. zonulin-1 (ZO-1) and occludin, in the absence or presence of a heat stress-related damage of cell monolayer. In vitro models, such as those used for this work can be very useful and suitable for an in-vitro verification of the effects of a probiotic or a probiotic combination.

Obiettivi. a) differenziare le subpopolazioni leucocitarie (utilizzando Ab monoclonali in citofluorimetria) nel liquido seminale e nel muco cervicale in 2 modelli clinici di patologia infiammatoria genitale rappresentati da uomini infertili con differente concentrazione di leucociti (L) nel liquido seminale (I parte) e da donne affette da HPV (II parte); b)analisi citofluorimetrica dei parametri spermatici non convenzionali. Casistica. I parte-105 uomini suddivisi in 3 gruppi sulla base della concentrazione iniziale dei L seminali (test colorimetrico perossidasi): gruppo di Controllo (0 mil/ml); gruppo I (0.2 - 0.9 mil/ml); gruppo II (¡Ý1mil/ml). II parte-22 donne sono state suddivise in: Controllo (n=9 soggetti HPV -) e Gruppo A (n=13 pazienti HPV+). Risultati. I parte-i pazienti del gruppo II mostrarono concentrazione, numero totale di spermatozoi, motilit¨¤ progressiva e forme normali significativamente (p<0.05) pi¨´ basse vs controlli, mentre quelli del gruppo I ebbero motilit¨¤ progressiva e forme normali significativamente pi¨´ basse (p<0.05) vs controlli. La concentrazione di cellule CD45+ era sia nei pazienti del gruppo I che del gruppo II significativamente (p<0.05) pi¨´ alta dei controlli. Nei due gruppi e nel controllo non vi erano differenze significative per quanto riguarda i granulociti e i monociti/ macrofagi. Inoltre il gruppo I rispetto ai controlli mostrarono un aumento significativo (p<0.05) dei linfociti T citotossici. Infine il gruppo II mostr¨° un aumento delle percentuali di cellule T helper e T citotossici vs controlli. Analizzando i parametri spermatici non convenzionali i pazienti del gruppo I mostrarono percentuali significativamente (p<0.05) pi¨´ alte di spermatozoi con: basso potenziale di membrana mitocondriale; cromatina decondensata e di DNA frammentato. I pazienti del gruppo II presentavano un quadro peggiore rispetto ai controlli. II parte-Nel muco cervicale delle donne HPV+(gruppo A) vs controlli furono trovati: un aumento significativo (p<0.05) nella concentrazione di: cellule CD45+(mil/ml) e dei linfociti T helper e dei T citotossici. Conclusioni anche il gruppo di pazienti con bassi livelli di L nel liquido seminale si associano a risposta infiammatoria cronica ed ad alterazioni dei parametri spermatici non convenzionali. D¡¯altra parte nel muco cervicale si confermano le concentrazioni delle sottopopolazioni leucocitarie trovate nel ¡°tessuto cervicale¡± di donne HPV- e per la prima volta nel muco cervicale di donne HPV+.

Orientador: Laercio Luis Vendite
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Matemática, Estatística e Computação Científica
Made available in DSpace on 2018-08-08T14:27:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silveira_GracieleParaguaia_M.pdf: 1619969 bytes, checksum: 570ad2c7d6e368e955ded50b3177ab52 (MD5) Previous issue date: 2007
Resumo: O aumento da incidência de casos de câncer de próstata, nos últimos anos, é um importante problema de saúde pública e um desafio para a ciência médica. Nesta dissertação estudamos a construção de um modelo matemático, que foi desenvolvido para predizer o estadiamento patológico do câncer de próstata. A intenção é auxiliar o especialista no processo de tomada de decisão, com relação ao estágio da doença. O modelo consiste num sistema baseado em regras fuzzy, que combina os dados pré-cirúrgicos - estado clínico, nível de PSA e grau de Gleason - valendo-se de um conjunto de regras, de natureza lingüística, elaborado a partir das informações presentes nos nomogramas já existentes. Com isso esperava-se obter, na saída do sistema, a chance de o indivíduo, com determinado quadro clínico, estar em cada estágio de extensão do tumor: localizado, localmente avançado e metastático. Foram feitas simulações, com dados de pacientes do Hospital das Clínicas/UNICAMP. Os resultados obtidos foram comparados com as probabilidades de Kattan et al, que embora sejam utilizadas nas decisões médicas, são consideradas pessimistas, em relação ao estágio da doença. Com o objetivo de aproximar os resultados, da realidade vivida pelos pacientes, efetuamos algumas modificações na modelagem. Tais mudanças foram suficientes para deixar os resultados mais otimistas e, portanto, mais realísticos
Abstract: The increase of the incidence of prostate cancer is a important problem of public health and a challenge to medical science. In this dissertation, we studied the construction of a mathematical model wich it was developed to predict the pathologic stage of prostate cancer. The intention is to help specialist on the decision process about stage of the disease. The model consists on a system founded in fuzzy laws that it combine the pre-surgicals dates - clinic state, PSA levels and Gleason score - availing of a linguistic laws set made with base on informations of the existents nomograms. Herewith we were hoping to ger person's chance, with clinics characteristics determinates, is in each stage of tumor extension: localized, advanced locally and metastatic. Simulations were made with patient's dates of the Clinics Hospital / UNICAMP. The results were compared with Kattan's probabilities that are used on the medicals decisions. However this probabilities to the disease are considered pessimists. With the aim of approach the results and the reality lived by patients, we did some modifications on the model. This changes were enough to became the results more otimists and therefore more realistics
Mestrado
Biomatematica
Mestre em Matemática Aplicada

The fruits of Capsicum annum (sweet pepper) are a good source of natural antioxidants and one of this compound, capsiate the most important capsinoid, is present in great quantity in the fruits of a nonpungent cultivar called CH-19 Sweet. In this work it has been evaluated the antioxidant activity of vanillyl nonanoate, a synthetic analog of natural capsiate, during linoleic acid and cholesterol oxidation, and the LDL-oxidation in presence of Cu2+. In these experimental systems the ability of the compound to inhibit the lipid peroxidation induced by ROO. radicals and its chelating properties has been underlined. Moreover the phenol showed a protective effect in VERO cells against the tBH-induced reduction of the main membrane lipids. The vanillyl nonanoate exerted in vivo an important protective effect on the plasma and kidney lipid fraction of rats in a model of oxidative stress induced by a sub-lethal dose of ferric nitrilotriacetate (FeNTA), showing a more evident protection in the plasma compared to that observed in the kidney. From the obtained results, vanillyl nonanoate showed an interesting antioxidant activity in vitro and in vivo and taking into account that this phenolic compound exhibits the same biological activities of the natural capsiate, it can be considered an attractive antioxidant candidate for human use.

La presente tesi intende esplorare gli effetti della resistenza parziale sulle epidemie di peronospora della vite (Plasmopara viticola). È stato sviluppato un modello di simulazione teorico che comprende lo sviluppo della pianta ospite e le fasi principali della malattia, dalla mobilizzazione dell’inoculo, alla moltiplicazione della malattia sulle foglie, all’infezione dei grappoli. Attraverso esperimenti (monociclici) di inoculazione è stata studiata la risposta alle infezioni di P. Viticola di 16 varietà parzialmente resistenti, analizzando le seguenti componenti: frequenza d’infezione, durata del periodo di latenza, dimensione delle lesioni, produzione di sporangi, durata del periodo infezioso e infettività degli sporangi prodotti sulle lesioni. Queste componenti di resistenza sono state incorporate nel modello, attraverso cui sono stati studiati i loro effetti sull’epidemia (policiclica) in diversi scenari. Le componenti di resistenza hanno mostrato diversi livelli di efficacia nel sopprimere l’epidemia: l’efficienza di infezione e la produzione di sporangi risultano avere un maggiore impatto nella resistenza espressa a livello di pieno campo. Questo approccio è utile per guidare lo studio fenotipico della resistenza dell’ospite e per anticipare le prestazioni di un genotipo a livello di pieno campo, che risulterebbe difficile e dispendioso considerando la natura perenne della vite.
The present dissertation aims to explore the effects of partial resistance on grapevine downy mildew (Plasmopara viticola) epidemics. A theoretical simulation model was developed including host dynamics and main phases of the disease, from inoculum mobilisation to disease multiplication on foliage, and to infection of clusters. The response to P. Viticola infection was studied for 16 grapevine varieties through (monocyclic) inoculation experiments, by measuring components of partial resistance: infection frequency, duration of latent period, size of lesions, production of sporangia, duration of infectious period, and infectivity of sporangia produced on lesion. Components of partial resistance were incorporated into the model and their effects on the (polycyclic) epidemic were investigated accross different scenarios. Components of partial resistance showed different effectiveness on the suppression of epidemics, infection efficiency and spore production having the strongest impact on the overall field resistance response. This approach is an useful tool for phenotyping studies on host plant resistance and for anticipating the performance of a genotype at the field scale, that otherwise is difficult and time requiring due to the perennial nature of grapevine.

La presente tesi intende esplorare gli effetti della resistenza parziale sulle epidemie di peronospora della vite (Plasmopara viticola). È stato sviluppato un modello di simulazione teorico che comprende lo sviluppo della pianta ospite e le fasi principali della malattia, dalla mobilizzazione dell’inoculo, alla moltiplicazione della malattia sulle foglie, all’infezione dei grappoli. Attraverso esperimenti (monociclici) di inoculazione è stata studiata la risposta alle infezioni di P. Viticola di 16 varietà parzialmente resistenti, analizzando le seguenti componenti: frequenza d’infezione, durata del periodo di latenza, dimensione delle lesioni, produzione di sporangi, durata del periodo infezioso e infettività degli sporangi prodotti sulle lesioni. Queste componenti di resistenza sono state incorporate nel modello, attraverso cui sono stati studiati i loro effetti sull’epidemia (policiclica) in diversi scenari. Le componenti di resistenza hanno mostrato diversi livelli di efficacia nel sopprimere l’epidemia: l’efficienza di infezione e la produzione di sporangi risultano avere un maggiore impatto nella resistenza espressa a livello di pieno campo. Questo approccio è utile per guidare lo studio fenotipico della resistenza dell’ospite e per anticipare le prestazioni di un genotipo a livello di pieno campo, che risulterebbe difficile e dispendioso considerando la natura perenne della vite.
The present dissertation aims to explore the effects of partial resistance on grapevine downy mildew (Plasmopara viticola) epidemics. A theoretical simulation model was developed including host dynamics and main phases of the disease, from inoculum mobilisation to disease multiplication on foliage, and to infection of clusters. The response to P. Viticola infection was studied for 16 grapevine varieties through (monocyclic) inoculation experiments, by measuring components of partial resistance: infection frequency, duration of latent period, size of lesions, production of sporangia, duration of infectious period, and infectivity of sporangia produced on lesion. Components of partial resistance were incorporated into the model and their effects on the (polycyclic) epidemic were investigated accross different scenarios. Components of partial resistance showed different effectiveness on the suppression of epidemics, infection efficiency and spore production having the strongest impact on the overall field resistance response. This approach is an useful tool for phenotyping studies on host plant resistance and for anticipating the performance of a genotype at the field scale, that otherwise is difficult and time requiring due to the perennial nature of grapevine.

La Sostanza P (SP) è un neuropeptide di 11 aminoacidi, membro della famiglia delle tachichinine, ampiamente distribuita nel sistema nervoso centrale ed ha un ruolo funzionale sia in condizioni fisiologiche che patologiche, tra le quali le malattie neurodegenerative (Raffa, 1998; Severini et al., 2002). Alterati livelli di SP sono stati riscontrati nelle regioni corticali di tessuti cerebrali di pazienti malati di Alzheimer (AD) (Quigley and Kowall, 1991; Waters and Davis, 1997). Recentemente, è anche stata riportata una riduzione della SP nella corteccia cerebrale, nell’ippocampo, nei gangli basali e nel fluido cerebrospinale dei pazienti malati di AD, il che indica un possibile ruolo svolto dalla SP in questa patologia (Jiménez-Corral et al., 2006). Sulla base di numerose evidenze in vitro e in vivo che dimostrano il ruolo neuroprotettivo della SP, abbiamo utilizzato un modello di granuli cerebellari di ratto in vitro (CGCs). In condizioni di basse concentrazioni di K+ questi neuroni vanno incontro a morte neuronale per apoptosi con attivazione del processamento amiloidogenico dell’APP, mimando così i meccanismi molecolari che avvengono in vivo nella patologia di AD. Dati recenti hanno evidenziato che sostanze in grado di stimolare gli enzimi dell’α-secretasi (ADAM) e quindi la promozione della via non amiloidogenica dell’APP potrebbero avere una potenziale attività terapeutica nella patologia. Scopo del presente lavoro è stato quello di valutare il possibile effetto della SP sul processamento proteolitico dell’APP, con particolare interesse verso la via dell’α-secretasi. Abbiamo trovato che la SP, ad una concentrazione di 200nM, protegge i CGCs dalla morte per apoptosi, riduce la produzione di strutture β extracellulari e i livelli di Aβ1-42 intracellulari. Inoltre abbiamo dimostrato che la SP induce il processamento non amiloidogenico dell’APP, promuovendo la secrezione del frammento neuroprotettivo solubile APPα, aumenta l’attività enzimatica dell’α-secretasi, l’espressione genica e proteica di ADAM 9 e la maturazione di ADAM 10, senza influenzare l’espressione del precursore proteico dell’Aβ (APP) e di BACE 1, l’enzima coinvolto nel processamento amilodogenico dell’APP. In conclusione, il presente studio mette in evidenza che la SP, attivando la via non amilodogenica, potrebbe assumere un’importanza clinica come agente in grado di modificare la patologia di AD.
Substance P (SP) is an 11-aa neuropeptide, member of the tachykinins (TK) family, broadly distributed in the central nervous system and having a functional role both in physiological and pathological conditions, as in neurodegenerative diseases (Raffa, 1998, Severini et al., 2002). Altered levels of SP have been observed in the cortical regions of post-mortem brain tissues from patients with Alzheimer’s disease (AD) (Quigley and Kowall, 1991; Waters and Davis, 1997). Recently, a consistent SP reduction in the cerebral cortex, hippocampus, basal ganglia and cerebrospinal fluid of AD patients was reported, indicating a possible role of SP in the progression of this disease. On the basis of the in vitro and in vivo results demonstrating the involvement of SP in neuroprotection, we used CGCs in low K+ conditions. In this model, CGCs undergo to apoptotic cell death with activation of amyloidogenic processing of APP, mimicking molecular mechanisms that occur in vivo in AD. Recent data demonstrated that drugs that can regulate the processing of APP towards the non-amyloidogenic pathway (ADAM) may have a therapeutic potential in AD. Aim of the present work was to assess the possible effects of SP on proteolytic processing of APP, with particular interest towards the α-secretase pathway. Data of the present work demonstrate that SP, at a concentration of 200nM, protects CGCs against apoptotic cell death induced by low K+ conditions, significantly reduces the extracellular fibrils production and levels of intracellular Aβ1-42. In addiction, we demonstrate that SP increases α-secretase activity, through the secretion of the neuroprotective soluble fragment APPα, induces the activation of α-secretase enzymatic activity, ADAM 9 gene and protein expression, ADAM 10 maturation, without influencing the precursor protein expression of Aβ (APP) and of BACE 1, the enzyme involved in the amylodogenic processing of APP. In conclusion, this study demonstrates that SP, by activating the non-amyloidogenic processing of APP, may have a therapeutic potential as disease-modifying agent in AD.

Os marcadores prognósticos em mastologia têm sido utilizados como apoio diagnóstico para prever o comportamento dos neoplasmas mamários (prognóstico) e determinar a provável resposta ao tratamento pré ou pós-cirúrgico. Estudos têm sido feitos sobre o prognóstico dos tumores mamários caninos (TMCs) que apresentam semelhanças e diferenças com tumores mamários humanos. Além disso, esses tumores exibem, com alta freqüência, proliferação de células mioepiteliais que podem sofrer metaplasia, acompanhada de alterações moleculares. O presente estudo teve o objetivo de verificar a expressão imuno-histoquímica e a associação de diferentes marcadores utilizados como prognósticos nos tumores de mama humana (RE, RP, c-erbB-2 e Ki-67) e marcadores mioepiteliais (p63, CK5 e vimentina) nos TMCs. O primeiro artigo analisa a expressão desses marcadores em 35 tumores encontrados em onze fêmeas caninas nas quais foram identificados tumores malignos múltiplos nas glândulas mamárias. Cada tipo histológico analisado em fêmeas portadoras de tumores múltiplos expressou marcadores prognósticos e mioepiteliais peculiares à sua histogênese, porém houve associação dessa expressão apenas em alguns tipos celulares presentes nos TMCs. Os tumores com componente epitelial carcinomatoso não apresentaram diferenças significativas, no entanto, nos tumores com componente complexo e misto, ocorreu associação entre a expressão da p63, CK5 e vimentina. No conjunto de marcadores estudados, a p63 e a CK5 mostram-se promissoras na elucidação da transformação das células mioepiteliais concomitante à invasão tumoral e com relação à expressão da vimentina que se mostrou bem evidenciada durante a transformação da célula mioepitelial proliferada a célula participante do mesênquima do neoplasma invasor em mamas de caninos, ao menos nos aspectos de expressão molecular e morfológica. O segundo artigo analisa os marcadores mioepiteliais em 82 casos de TMCs malignos. Este estudo comprovou a freqüência e a associação da expressão desses marcadores em determinados tipos histológicos tumorais e celulares, permitindo a identificação das células mioepiteliais em transformação na maior parte dos TMCs malignos, notadamente, os que apresentam componente mesenquimal metaplásico. Mais estudos devem ser feitos na tentativa de verificar a significância da expressão encontrada no comportamento biológico desses tumores.
Prognostic markers in mastology have been used as diagnostic support, to predict the behavior of mammary neoplasias (prognosis) and to determine their possible response to treatment before or after surgery. Studies have been conducted on the prognosis of canine mammary gland tumors (MGTs), which show similarities to and differences from human breast tumors. In addition, these tumors often show proliferation of myoepithelial cells, which may undergo metaplasia, accompanied by molecular alterations. The aim of the present study was to check the immunohistochemical expression and the association between different markers used as prognostic factors in human breast tumors (ER, RP, c-erbB-2 and Ki-67) and myoepithelial markers (p63, CK5 and vimentin) in MGTs. The first article analyzes the expression of these markers in 35 tumors in 11 female dogs, where multiple tumors were identified in the mammary glands. Each histological type analyzed in the female dogs with multiple tumors expressed prognostic and myoepithelial markers that were peculiar to their histogenesis, but the association of this expression was observed only in some cell types of MGTs. Tumors with a carcinomatous epithelial component did not have significant differences, but tumors with complex and mixed components showed association between the expressions of p63, CK5 and vimentin. Of the group of investigated markers, p63 and CK5 proved to be promising tools in elucidating the transformation of myoepithelial cells concomitantly to tumor invasion and in terms of vimentin expression, which was quite pronounced in this transformation from proliferating myoepithelial cells into cells that participate in the mesenchyma of the invasive neoplasia in canine mammary glands, at least with regard to the aspects of molecular and morphological expression. The second article analyzes myoepithelial markers in 82 cases of malignant MGTs. This study corroborated the frequency and association of the expression of these markers in certain histological tumor and cell types, allowing for the identification of myoepithelial cells in transformation in most malignant MGTs, chiefly those with a metaplastic mesenchymal component. Further studies are necessary in order to assess the importance of expression found in the biological behavior of these tumors.

La possibilità di riprogrammare cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs) ha aperto la strada a svariate possibilità nel campo della medicina personalizzata e rigenerativa. Le hiPSCs ci permettono di studiare malattie poco conosciute per le quali risulta difficile trovare un modello di studio adeguato, come le malattie molto rare che colpiscono numerosi organi del corpo. In quest’ottica abbiamo riprogrammato i fibroblasti di una bambina di 11 anni a cui era stata diagnosticata la sindrome cardiospondilocarpofacciale. Abbiamo utilizzato il Virus Sendai come vettore per l’inserimenti dei fattori OSKM che ci ha permesso di ottenere una nuova linea stabile di cellule pluripotenti (UNIBS17-A), che sono in grado di differenziare in tutti i tipi cellulari. Con questa nuova linea di hiPSC sarà possibile conoscere meglio i meccanismi alla base di questa patologia. Le hiPSC sono un modello innovativo e con grandissime potenzialità nell’ambito della ricerca scientifica, ma ancora oggi restano dei limiti associati al loro utilizzo; uno tra questi è legato al grado di maturazione, essenziale per studiare malattie associate all’età come le malattie cardiache. Abbiamo perciò deciso di studiare il grado di maturazione dei cardiomiociti derivati da hiPSCs (hi-CMs). Il nostro studio mostra i hi-CMs non acquisiscono mai del tutto un fenotipo adulto, infatti l’isoforma fetale della troponina Inibitoria non viene mai spenta, anche quando le cellule vengono mantenute in coltura per lunghi periodi (90 gg). al fianco degli studi che si interessano al grado di maturazione degli hiCMs un altro fattore d’interesse è quello che mira a sviluppare nuovi metodi, facilmente applicabili e non invasivi per indagare la funzionalità dei hi-CMs in vitro. Qui riportiamo un metodo di imaging che sfruttando un algoritmo, già precedentemente descritto, ci permette di monitorare nel tempo le proprietà cinetiche e dinamiche delle cellule, senza doverle perturbare. Questo tipo di analisi ci ha permesso di monitorare importanti parametri, quali la frequenza di contrazione, la velocità di contrazione, l’energia cinetica e la forza di contrazione sviluppate dai hi-CMs che abbiamo tenuto in coltura per 90 giorni. I dati ottenuti evidenziano che l’andamento nel tempo dei parametri presi in considerazione potrebbe essere associato alla loro incapacità di raggiungere uno stadio di maturazione completo. Infine un altro campo di grande interesse, per migliorare il fenotipo che viene raggiunto dalle cellule derivate da hiPSCs è rivolto all’utilizzo di queste in modelli 3D quali sferoidi e organoidi. Abbiamo quindi derivato un modello epatico in 3D e per simulare al meglio un contesto paragonabile all’organismo abbiamo utilizzato un bioreattore (LiveBox) in coltura dinamica. Le analisi svolte dimostrano che, mimando le caratteristiche dell’organo e dell’ambiente in cui esso è inserito, si possono ottenere dei vantaggi, infatti le cellule in vitro acquisiscono un fenotipo più simile a quello naturale. Saranno necessari ulteriori miglioramenti, ma, verosimilmente, questo sistema può essere sfruttato per svolgere test farmacologici di epatotossicità su cellule umane, riducendo anche l’utilizzo di modelli animali.
The discovery of hiPSCs made them an appropriate and compelling candidates for disease modelling and personalized cell therapies. The employment of hiPSCs could be a very important tool to better understand pathologies poorly characterized as the ultrarare Cardiospondylocarpofacial syndrome (CSCF). CSCF is a multifactorial syndrome that causes many dysfunctions at the expense of multiple organs. We reported the reprogramming and characterization of a new hiPSC line registered as UNIBS17-A, derived from a patient’s fibroblasts, who was diagnosed for cardiospondylofacial syndrome derived from a de novo mutation c.737-7A>G. We used the Sendai virus as vector for introducing OSKM factors. We obtained a new stable hiPSC line with pluripotent features able to differentiate in the three germs layers, that could be use in disease modelling. hiPSCs are a potential constant source of human cells, in particular hard-to-reach tissue cells such as cardiomyocytes. One of the major limitation in the use of hiPSC for disease modelling is their maturation status. We investigated the expression of the inhibitory isoform of the troponin complex. Our study demonstrates that hi-CMs never fully acquire an adult phenotype, indeed the adult isoform of the inhibitory troponin (cTnI) starts to appear, but the fetal isoform of the inhibitory troponin (ssTnI) is never switch-off both in molecular and protein level, even when cells are cultured for long periods (90 days). Alongside the analysis of hi-CMs maturation, another factor of interest in research is the development of new easily applicable and non-invasive methods to investigate the functionality of hi-CMs in vitro. Here we reported an imaging method that, by exploiting an algorithm (previously described), allow us to monitor the kinetic and dynamic properties of cells over time, without perturbing them. This analysis allows us to monitor frequency, contractility, kinetic energy and force of contraction developed by the hi-CMs kept in culture for 90 days. The data obtained show that the trend over time of the parameter considered in our study could be associated whit the inability of hi-CMs to reach a complete maturation stage. Finally, another hiPSCs field of great interest is to use 3D self-aggregates structure to improve the phenotype of hiPS-derived cells. We derived a 3D model of both spheroids and organoids to better simulate an environment comparable to the organism one. Furthermore, we used a bioreactor (LiveBox) to create a dynamic culture that, leading a continuous flow of nutrient, mimic the natural condition. Our results carried out that mimicking the organs’ characteristics leads cells to acquire a phenotype more similar of those in the human body. Further improvement will be needed, but likely, this system should be a good model on which performing hepatotoxicity test, with the aim of reducing the use of animal models in research.

La possibilità di riprogrammare cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs) ha aperto la strada a svariate possibilità nel campo della medicina personalizzata e rigenerativa. Le hiPSCs ci permettono di studiare malattie poco conosciute per le quali risulta difficile trovare un modello di studio adeguato, come le malattie molto rare che colpiscono numerosi organi del corpo. In quest’ottica abbiamo riprogrammato i fibroblasti di una bambina di 11 anni a cui era stata diagnosticata la sindrome cardiospondilocarpofacciale. Abbiamo utilizzato il Virus Sendai come vettore per l’inserimenti dei fattori OSKM che ci ha permesso di ottenere una nuova linea stabile di cellule pluripotenti (UNIBS17-A), che sono in grado di differenziare in tutti i tipi cellulari. Con questa nuova linea di hiPSC sarà possibile conoscere meglio i meccanismi alla base di questa patologia. Le hiPSC sono un modello innovativo e con grandissime potenzialità nell’ambito della ricerca scientifica, ma ancora oggi restano dei limiti associati al loro utilizzo; uno tra questi è legato al grado di maturazione, essenziale per studiare malattie associate all’età come le malattie cardiache. Abbiamo perciò deciso di studiare il grado di maturazione dei cardiomiociti derivati da hiPSCs (hi-CMs). Il nostro studio mostra i hi-CMs non acquisiscono mai del tutto un fenotipo adulto, infatti l’isoforma fetale della troponina Inibitoria non viene mai spenta, anche quando le cellule vengono mantenute in coltura per lunghi periodi (90 gg). al fianco degli studi che si interessano al grado di maturazione degli hiCMs un altro fattore d’interesse è quello che mira a sviluppare nuovi metodi, facilmente applicabili e non invasivi per indagare la funzionalità dei hi-CMs in vitro. Qui riportiamo un metodo di imaging che sfruttando un algoritmo, già precedentemente descritto, ci permette di monitorare nel tempo le proprietà cinetiche e dinamiche delle cellule, senza doverle perturbare. Questo tipo di analisi ci ha permesso di monitorare importanti parametri, quali la frequenza di contrazione, la velocità di contrazione, l’energia cinetica e la forza di contrazione sviluppate dai hi-CMs che abbiamo tenuto in coltura per 90 giorni. I dati ottenuti evidenziano che l’andamento nel tempo dei parametri presi in considerazione potrebbe essere associato alla loro incapacità di raggiungere uno stadio di maturazione completo. Infine un altro campo di grande interesse, per migliorare il fenotipo che viene raggiunto dalle cellule derivate da hiPSCs è rivolto all’utilizzo di queste in modelli 3D quali sferoidi e organoidi. Abbiamo quindi derivato un modello epatico in 3D e per simulare al meglio un contesto paragonabile all’organismo abbiamo utilizzato un bioreattore (LiveBox) in coltura dinamica. Le analisi svolte dimostrano che, mimando le caratteristiche dell’organo e dell’ambiente in cui esso è inserito, si possono ottenere dei vantaggi, infatti le cellule in vitro acquisiscono un fenotipo più simile a quello naturale. Saranno necessari ulteriori miglioramenti, ma, verosimilmente, questo sistema può essere sfruttato per svolgere test farmacologici di epatotossicità su cellule umane, riducendo anche l’utilizzo di modelli animali.
The discovery of hiPSCs made them an appropriate and compelling candidates for disease modelling and personalized cell therapies. The employment of hiPSCs could be a very important tool to better understand pathologies poorly characterized as the ultrarare Cardiospondylocarpofacial syndrome (CSCF). CSCF is a multifactorial syndrome that causes many dysfunctions at the expense of multiple organs. We reported the reprogramming and characterization of a new hiPSC line registered as UNIBS17-A, derived from a patient’s fibroblasts, who was diagnosed for cardiospondylofacial syndrome derived from a de novo mutation c.737-7A>G. We used the Sendai virus as vector for introducing OSKM factors. We obtained a new stable hiPSC line with pluripotent features able to differentiate in the three germs layers, that could be use in disease modelling. hiPSCs are a potential constant source of human cells, in particular hard-to-reach tissue cells such as cardiomyocytes. One of the major limitation in the use of hiPSC for disease modelling is their maturation status. We investigated the expression of the inhibitory isoform of the troponin complex. Our study demonstrates that hi-CMs never fully acquire an adult phenotype, indeed the adult isoform of the inhibitory troponin (cTnI) starts to appear, but the fetal isoform of the inhibitory troponin (ssTnI) is never switch-off both in molecular and protein level, even when cells are cultured for long periods (90 days). Alongside the analysis of hi-CMs maturation, another factor of interest in research is the development of new easily applicable and non-invasive methods to investigate the functionality of hi-CMs in vitro. Here we reported an imaging method that, by exploiting an algorithm (previously described), allow us to monitor the kinetic and dynamic properties of cells over time, without perturbing them. This analysis allows us to monitor frequency, contractility, kinetic energy and force of contraction developed by the hi-CMs kept in culture for 90 days. The data obtained show that the trend over time of the parameter considered in our study could be associated whit the inability of hi-CMs to reach a complete maturation stage. Finally, another hiPSCs field of great interest is to use 3D self-aggregates structure to improve the phenotype of hiPS-derived cells. We derived a 3D model of both spheroids and organoids to better simulate an environment comparable to the organism one. Furthermore, we used a bioreactor (LiveBox) to create a dynamic culture that, leading a continuous flow of nutrient, mimic the natural condition. Our results carried out that mimicking the organs’ characteristics leads cells to acquire a phenotype more similar of those in the human body. Further improvement will be needed, but likely, this system should be a good model on which performing hepatotoxicity test, with the aim of reducing the use of animal models in research.

La possibilità di riprogrammare cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs) ha aperto la strada a svariate possibilità nel campo della medicina personalizzata e rigenerativa. Le hiPSCs ci permettono di studiare malattie poco conosciute per le quali risulta difficile trovare un modello di studio adeguato, come le malattie molto rare che colpiscono numerosi organi del corpo. In quest’ottica abbiamo riprogrammato i fibroblasti di una bambina di 11 anni a cui era stata diagnosticata la sindrome cardiospondilocarpofacciale. Abbiamo utilizzato il Virus Sendai come vettore per l’inserimenti dei fattori OSKM che ci ha permesso di ottenere una nuova linea stabile di cellule pluripotenti (UNIBS17-A), che sono in grado di differenziare in tutti i tipi cellulari. Con questa nuova linea di hiPSC sarà possibile conoscere meglio i meccanismi alla base di questa patologia. Le hiPSC sono un modello innovativo e con grandissime potenzialità nell’ambito della ricerca scientifica, ma ancora oggi restano dei limiti associati al loro utilizzo; uno tra questi è legato al grado di maturazione, essenziale per studiare malattie associate all’età come le malattie cardiache. Abbiamo perciò deciso di studiare il grado di maturazione dei cardiomiociti derivati da hiPSCs (hi-CMs). Il nostro studio mostra i hi-CMs non acquisiscono mai del tutto un fenotipo adulto, infatti l’isoforma fetale della troponina Inibitoria non viene mai spenta, anche quando le cellule vengono mantenute in coltura per lunghi periodi (90 gg). al fianco degli studi che si interessano al grado di maturazione degli hiCMs un altro fattore d’interesse è quello che mira a sviluppare nuovi metodi, facilmente applicabili e non invasivi per indagare la funzionalità dei hi-CMs in vitro. Qui riportiamo un metodo di imaging che sfruttando un algoritmo, già precedentemente descritto, ci permette di monitorare nel tempo le proprietà cinetiche e dinamiche delle cellule, senza doverle perturbare. Questo tipo di analisi ci ha permesso di monitorare importanti parametri, quali la frequenza di contrazione, la velocità di contrazione, l’energia cinetica e la forza di contrazione sviluppate dai hi-CMs che abbiamo tenuto in coltura per 90 giorni. I dati ottenuti evidenziano che l’andamento nel tempo dei parametri presi in considerazione potrebbe essere associato alla loro incapacità di raggiungere uno stadio di maturazione completo. Infine un altro campo di grande interesse, per migliorare il fenotipo che viene raggiunto dalle cellule derivate da hiPSCs è rivolto all’utilizzo di queste in modelli 3D quali sferoidi e organoidi. Abbiamo quindi derivato un modello epatico in 3D e per simulare al meglio un contesto paragonabile all’organismo abbiamo utilizzato un bioreattore (LiveBox) in coltura dinamica. Le analisi svolte dimostrano che, mimando le caratteristiche dell’organo e dell’ambiente in cui esso è inserito, si possono ottenere dei vantaggi, infatti le cellule in vitro acquisiscono un fenotipo più simile a quello naturale. Saranno necessari ulteriori miglioramenti, ma, verosimilmente, questo sistema può essere sfruttato per svolgere test farmacologici di epatotossicità su cellule umane, riducendo anche l’utilizzo di modelli animali.
The discovery of hiPSCs made them an appropriate and compelling candidates for disease modelling and personalized cell therapies. The employment of hiPSCs could be a very important tool to better understand pathologies poorly characterized as the ultrarare Cardiospondylocarpofacial syndrome (CSCF). CSCF is a multifactorial syndrome that causes many dysfunctions at the expense of multiple organs. We reported the reprogramming and characterization of a new hiPSC line registered as UNIBS17-A, derived from a patient’s fibroblasts, who was diagnosed for cardiospondylofacial syndrome derived from a de novo mutation c.737-7A>G. We used the Sendai virus as vector for introducing OSKM factors. We obtained a new stable hiPSC line with pluripotent features able to differentiate in the three germs layers, that could be use in disease modelling. hiPSCs are a potential constant source of human cells, in particular hard-to-reach tissue cells such as cardiomyocytes. One of the major limitation in the use of hiPSC for disease modelling is their maturation status. We investigated the expression of the inhibitory isoform of the troponin complex. Our study demonstrates that hi-CMs never fully acquire an adult phenotype, indeed the adult isoform of the inhibitory troponin (cTnI) starts to appear, but the fetal isoform of the inhibitory troponin (ssTnI) is never switch-off both in molecular and protein level, even when cells are cultured for long periods (90 days). Alongside the analysis of hi-CMs maturation, another factor of interest in research is the development of new easily applicable and non-invasive methods to investigate the functionality of hi-CMs in vitro. Here we reported an imaging method that, by exploiting an algorithm (previously described), allow us to monitor the kinetic and dynamic properties of cells over time, without perturbing them. This analysis allows us to monitor frequency, contractility, kinetic energy and force of contraction developed by the hi-CMs kept in culture for 90 days. The data obtained show that the trend over time of the parameter considered in our study could be associated whit the inability of hi-CMs to reach a complete maturation stage. Finally, another hiPSCs field of great interest is to use 3D self-aggregates structure to improve the phenotype of hiPS-derived cells. We derived a 3D model of both spheroids and organoids to better simulate an environment comparable to the organism one. Furthermore, we used a bioreactor (LiveBox) to create a dynamic culture that, leading a continuous flow of nutrient, mimic the natural condition. Our results carried out that mimicking the organs’ characteristics leads cells to acquire a phenotype more similar of those in the human body. Further improvement will be needed, but likely, this system should be a good model on which performing hepatotoxicity test, with the aim of reducing the use of animal models in research.

ABSTRACT The induced pluripotent stem cells (iPSc) entrance in the stem cell landscape has given the scientific community a novel approach for studying human diseases and a new promising tool for regenerative medicine. iPSc generation from patients affected by genetic diseases could allow their site-specific genetic correction followed by differentiation and autologous transplantation for disease cure. Infantile malignant osteopetrosis is a life-threatening recessive bone disease caused by a mutation in the TCIRG1 gene, which severely affects osteoclasts resorbing activity. The resulting increased bone density causes severe growth retardation, thickened bones, and reduced medullary cavity, symptoms recapitulated by the oc/oc mouse. Hematopoietic stem cell (HSC) transplantation is the unique possible treatment, however the chance of cure is strongly limited by the need for a matched donor. Therefore, patients should benefit from the generation of corrected autologous HSCs for a novel approach to therapy. The aim of the present thesis was to generate iPSc from murine wt and affected fibroblasts, to correct the TCIRG1 genetic mutation, to differentiate iPSc into the hematopoietic lineage including HSCs, and to transplant them in vivo to revert the oc/oc phenotype. To generate iPSc lines, as delivery system for the reprogramming genes Oct4, Sox2 and Klf4 we employed a third generation polycistronic lentiviral vector, excisable from the host genome by the Cre recombinase. After reprogramming, iPS clones with low vector copy number and normal numerical distribution of chromosomes were chosen, treated with Cre recombinase and sub-cloned to select lines without integrated vectors. Pluripotency of the obtained iPSc was tested by teratoma formation assay, embryonic germ layers in vitro differentiation, and expression of pluripotency markers through immunocytochemistry and real time PCR. Karyotype analyses showed the presence of normal sets of chromosomes. Importantly, iPSc were successfully derived from oc/oc fibroblasts, and subsequently corrected through homologous recombination upon transfection with a BAC containing wt TCIRG1. In conclusion, with our studies we will provide a proof of principle for the future clinical use of a new tool to treat osteopetrosis and potentially other genetic blood disorders.

Gli astrociti, principali cellule gliali del sistema nervoso centrale, sono coinvolti in diverse funzioni cerebrali tra cui trasmissione sinaptica, sintesi e riciclo di neurotrasmettitori, controllo dell’assorbimento di nutrienti e sopravvivenza neuronale. L’omeostasi del calcio è essenziale per le funzioni degli astrociti e per una corretta comunicazione bidirezionale tra astrociti e neuroni. Le diverse funzioni degli astrociti sono confinate in determinati compartimenti a livello cellulare, in particolare le oscillazioni di calcio possono avvenire in specifici microdomini. Un cambiamento dei transienti di calcio nei microdomini influenza la regolazione del rilascio di gliotrasmettitori che è alla base della comunicazione tra astrociti e neuroni. In questo contesto, i mitocondri giocano un ruolo cruciale nella modulazione dei segnali calcio e nella regolazione del metabolismo. Tuttavia, non è stato ancora completamente chiarito il ruolo svolto dal calcio mitocondriale nella fisiologia gliale. L’obiettivo finale di questo progetto è stato quello di studiare una possibile relazione tra calcio mitocondriale e metabolismo. I nostri risultati mostrano che gli astrociti radiali rappresentano un buon modello in vitro per studiare il ruolo del calcio e i segnali metabolici. In questa condizione, gli astrociti sono metabolicamente flessibili, poiché sono in grado di ossidare carboidrati, acidi grassi e amminoacidi. Questo risultato supporta il ruolo centrale degli astrociti nel soddisfare le richieste energetiche neuronali. Infatti, dal punto di vista del segnale calcio, ATP e glutammato generano simili mobilizzazioni di calcio a livello citosolico, tuttavia solo l’ATP causa un percettibile incremento nelle concentrazioni di calcio a livello della matrice mitocondriale. Inoltre, questi stimoli sono codificati in maniera diversa a livello metabolico. Da una parte, la stimolazione cellulare indotta dall’ATP incrementa il metabolismo glicolitico a livello citosolico. D’altra parte, la stimolazione cellulare dovuta al glutammato sostiene la respirazione mitocondriale, anche in assenza di un accumulo di calcio mitocondriale. Per studiare i meccanismi che sono alla base di questo diverso accoppiamento metabolico, abbiamo valutato il contributo dei trasportatori del glutammato GLT-1 e GLAST. In particolare, abbiamo dimostrato che la loro inibizione farmacologica previene parzialmente l’incremento della respirazione mitocondriale, ma influenzando solo limitatamente le dinamiche del calcio. Per analizzare ulteriormente il contributo del calcio mitocondriale sul metabolismo, abbiamo utilizzato due diverse strategie: una basata sull’ inibizione farmacologica del complesso MCU (Uniporto Mitocondriale del Calcio), e l’altra sull’utilizzo di un modello animale caratterizzato della delezione mono-allelica di Mcu. Esperimenti eseguiti in astrociti corticali isolati da topi Mcu+/- hanno mostrato, come atteso, un decremento nell’accumulo di calcio mitocondriale, ma senza causare alterazioni significative nel metabolismo ossidativo, suggerendo che l’aumento di calcio nella matrice mitocondriale giochi un ruolo marginale in questo contesto. In conclusione, i nostri risultati indicano che gli astrociti sono cellule con un profilo metabolico complesso e flessibile. Tuttavia, le dinamiche di calcio citosolico e mitocondriale svolgono una funzione secondaria in questa regolazione, almeno nelle nostre condizioni sperimentali.
Astrocytes are glial cells located in the central nervous system. They play several important roles, including synaptic signalling, neurotransmitter synthesis and recycling, control of nutrient uptake and neuronal survival. Calcium homeostasis is essential for astrocytes functions and for the correct bidirectional communication between astrocytes and neurons. Astrocytes are functionally compartmentalized, and calcium oscillations can occur in specific local microdomains. A change in astrocytic calcium microdomain activity influences the regulation of gliotransmitter release, a first crucial step in neuron to astrocytes signalling. In this context, mitochondria could play a pivotal role in shaping calcium waves and regulating cellular metabolism, at least in principle. However, the genuine contribution of mitochondrial calcium to astrocytes physiology is poorly investigated. Here, we study a possible link between mitochondrial calcium and metabolism. Our results show that star-shaped astrocytes represent a reasonable in vitro model for studying Ca2+ signalling and metabolic pathways. In our culture condition, astrocytes are metabolically flexible, being able to oxidize carbohydrates, fatty acids and amino acids. Thus, this supports the central role played by astrocytes in satisfying the brain energy demands. Indeed, in terms of Ca2+ signalling, ATP and glutamate cause similar cytosolic Ca2+ mobilization, but only ATP stimulates a consintent rise in [Ca2+] in mitochondrial matrix. Moreover, these stimuli are decoded differently at metabolic level. On the one hand, cellular stimulation with ATP selectively increases cytosolic glycolytic metabolism. On the other hand, cellular stimulation with glutamate boosts mitochondrial respiration, even in the absence of substantial mitochondrial Ca2+ uptake. To investigate the mechanisms underlying this different metabolic coupling, we evaluated the contribution of the glutamate transporters GLT-1 and GLAST, and showed that their pharmacological inhibition partially prevents the increase in mitochondrial respiration, but with limited impact on calcium dynamics. To further dissect the contribution of mitochondrial Ca2+ uptake to astrocytic metabolism, we devised two different strategies, one based on the pharmacological inhibition of the MCU (Mitochondrial Calcium Uniporter) complex, and the other based on the use of a mouse model carrying the monoallelic deletion of Mcu gene. Experiments performed in cortical astrocytes from Mcu+/- mice showed, as expected, lower mitochondrial calcium transients, but without major alterations in oxidative metabolism, suggesting a marginal role for matrix calcium elevations in this context. Overall, our results suggest that the astrocytes are cells with a complex and flexible metabolic profile. However, cellular and mitochondrial calcium dynamics play a minor role in this regulation, at least in our experimental settings.

La costruzione di un vaccino protettivo basato su peptidi sintetici di HIV è limitata dalla loro scarsa immunogenicità. Sfruttando le note proprietà immunomodulatorie del BCG e a seguito dell’identificazione in una sub-popolazione africana (Burkina Faso, Costa d’Avorio, West-Camerun) di epitopi virali in grado di suscitare una risposta immunitaria, abbiamo effettuato uno studio per verificare l’induzione di una risposta anticorpale e cellulare verso tali epitopi. Per prima cosa abbiamo valutato l’eventuale tossicità dei prodotti utilizzati e ci siamo chiesti se la presenza di peptidi di HIV nella cosomministrazione o nel costrutto ricombinante potessero influenzare la risposta verso lo stesso BCG. Le capacità adiuvanti del BCG wild-type e ricombinante sono state valutate sia nel modello murino che in primati non umani con il fine ultimo di formulare un vaccino pediatrico contro la trasmissione verticale dalla madre al figlio del virus di HIV attraverso il latte materno.
The formulation of a protective anti-HIV vaccine based on the used of sintetic HIV peptides is limited by their poor immunogenicity. Taking advantage of known immunomodulatory properties of BCG and identified immunogenic viral epitopes in an African sub-population (Burkina Faso, Ivory Coast and West-Camerun), we verified the induction of humoral and cellular response towards these epitopes. First of all we evaluated the potential toxicity of the product used by checking if the contemporary administration of these peptides with BCG or the administration of an HIV-peptide recombinant BCG could interfere with immunological response to BCG. We evaluated the adjuvant capabilities of wild-type BCG and of recombinant BCG both in a mouse and in non-human primate models to generate a pediatric vaccine against mother to child transmission (MTCT) of HIV virus through breast feeding.

Modello ortotopico di neuroblastoma: un valido approccio sperimentale per valutare in vivo l'efficacia dell'inibizione di p38MAPK nel sensibilizzare il neuroblastoma umano al trattamento con etoposide

Gli obbiettivi di questa tesi di dottorato erano: i) valutare l’effetto di differenti condizioni ambientali sulla biologia ed epidemiologia di isolati di B. cinerea appartenenti alle sub-popolazioni transposa e vacuma, e ii) sviluppare un nuovo modello previsionale per predire il rischio di muffa grigia nei vigneti tra le fasi fenologiche di sviluppo delle infiorescenze e maturazione dei grappoli. Gli effetti della temperatura, durata di bagnatura e umidità relativa sulle infezioni di infiorescenze e bacche di Vitis vinifera sono stati valutati con inoculazioni artificiali di isolati di B. cinerea. Gli effetti della temperatura, attività dell’acqua, umidità relativa e composizione delle bacche di uva sulla germinazione dei conidi, crescita miceliale e produzione di conidi sono stati valutati su substrati artificiali. I risultati evidenziano che la capacità di causare infezioni varia con gli isolati indipendentemente dall’appartenenza alle sub-popolazioni transposa o vacuma. Inoltre, le risposte dei differenti isolati al variare delle condizioni ambientali risultano essere simili. Basandosi sui risultati ottenuti sono state sviluppate equazioni matematiche per spiegare l’effetto dei fattori ambientali sull’incidenza delle infezioni di infiorescenze e bacche, germinazione dei conidi, crescita miceliale e produzione di conidi. Un nuovo modello previsionale è stato sviluppato per predire le infezioni di Botrytis cinerea nei vigneti utilizzando le equazioni sviluppate e seguendo un approccio meccanicistico. Il modello è stato validato per 6 anni (2009-2014) in 13 vigneti localizzati in Italia e Francia. Il nuovo modello risulta essere più completo di quelli proposti finora in letteratura e può essere utilizzato per migliorare le strategie di controllo della muffa grigia nei vigneti.
The aims of this Doctoral work were: i) to investigate the effect of different environmental conditions on biology and epidemiology of B. cinerea strains belonging the two transposon types vacuma and transposa, and ii) develop a new weather-driven mechanistic model in order to predict risk of grey mould in vineyards from early growth of inflorescences to berry ripening. The effect of temperature, wetness duration and relative humidity on infection of Vitis vinifera inflorescences and berries was investigated by artificial inoculation of B. cinerea strains. The effect of temperature, water activity, relative humidity and grape berry composition on conidia germination, colony growth and conidial production was investigated in agar-medium. The results showed that the ability to cause infection was a strain rather than a transposon genotype attribute. Moreover, the general response to different environmental conditions is similar among different B. cinerea strains. Based on these data, equations were developed to account the combined effects of environmental factors on infection incidence, conidia germination, colony growth and conidial production. A new previsional model for Botrytis cinerea infections on grapevine was elaborated using the equations developed and following a mechanistic approach. The model was validated over a 6-year period (2009 to 2014) in 13 vineyards located in different grape-growing areas of Italy and France. The model is more complete than the others proposed in literature and represents an improvement to control grey mould in vineyards.

Gli obbiettivi di questa tesi di dottorato erano: i) valutare l’effetto di differenti condizioni ambientali sulla biologia ed epidemiologia di isolati di B. cinerea appartenenti alle sub-popolazioni transposa e vacuma, e ii) sviluppare un nuovo modello previsionale per predire il rischio di muffa grigia nei vigneti tra le fasi fenologiche di sviluppo delle infiorescenze e maturazione dei grappoli. Gli effetti della temperatura, durata di bagnatura e umidità relativa sulle infezioni di infiorescenze e bacche di Vitis vinifera sono stati valutati con inoculazioni artificiali di isolati di B. cinerea. Gli effetti della temperatura, attività dell’acqua, umidità relativa e composizione delle bacche di uva sulla germinazione dei conidi, crescita miceliale e produzione di conidi sono stati valutati su substrati artificiali. I risultati evidenziano che la capacità di causare infezioni varia con gli isolati indipendentemente dall’appartenenza alle sub-popolazioni transposa o vacuma. Inoltre, le risposte dei differenti isolati al variare delle condizioni ambientali risultano essere simili. Basandosi sui risultati ottenuti sono state sviluppate equazioni matematiche per spiegare l’effetto dei fattori ambientali sull’incidenza delle infezioni di infiorescenze e bacche, germinazione dei conidi, crescita miceliale e produzione di conidi. Un nuovo modello previsionale è stato sviluppato per predire le infezioni di Botrytis cinerea nei vigneti utilizzando le equazioni sviluppate e seguendo un approccio meccanicistico. Il modello è stato validato per 6 anni (2009-2014) in 13 vigneti localizzati in Italia e Francia. Il nuovo modello risulta essere più completo di quelli proposti finora in letteratura e può essere utilizzato per migliorare le strategie di controllo della muffa grigia nei vigneti.
The aims of this Doctoral work were: i) to investigate the effect of different environmental conditions on biology and epidemiology of B. cinerea strains belonging the two transposon types vacuma and transposa, and ii) develop a new weather-driven mechanistic model in order to predict risk of grey mould in vineyards from early growth of inflorescences to berry ripening. The effect of temperature, wetness duration and relative humidity on infection of Vitis vinifera inflorescences and berries was investigated by artificial inoculation of B. cinerea strains. The effect of temperature, water activity, relative humidity and grape berry composition on conidia germination, colony growth and conidial production was investigated in agar-medium. The results showed that the ability to cause infection was a strain rather than a transposon genotype attribute. Moreover, the general response to different environmental conditions is similar among different B. cinerea strains. Based on these data, equations were developed to account the combined effects of environmental factors on infection incidence, conidia germination, colony growth and conidial production. A new previsional model for Botrytis cinerea infections on grapevine was elaborated using the equations developed and following a mechanistic approach. The model was validated over a 6-year period (2009 to 2014) in 13 vineyards located in different grape-growing areas of Italy and France. The model is more complete than the others proposed in literature and represents an improvement to control grey mould in vineyards.

Le cucurbitacee possono essere attaccate da più di 200 malattie, una corretta gestione è dunque fondamentale per ridurre il rischio di perdite di produzione, sia in termini di quantità sia in termini di qualità. Tra le malattie più importanti che attaccano le cucurbitacee ci sono l’oidio e la peronospora delle cucurbitacee. Podosphaera xanthii e Golovinomyces cichoracearum sono gli agenti causali dell’oidio. È stato studiato l’effetto della temperature sulla germinazione dei conidi in ambiente controllato a 6 temperature costanti (da 10 a 35°C, ad intervalli di 5C°) da 3 a 72 ore. La temperature ottimale per la germinazone, l’infezione e la sporulazione è risultata essere rispettivamente 24.4, 25.7 e 21.3°C per P. xanthii e 17.9, 17.3 e 16.2°C per G. cichoracearum. Un modello meccanicistico è stato sviluppato per il rischio che i due agenti patogeni causassero un attacco di oidio. Il modello simula la germinazione su foglie infettate sulla base delle condizioni ambientali di temperatura e umidità relativa. Le equazioni che calcolano la germinazione delle dei conidi di entrambi i funghi sono state sviluppate sulla base di dati presenti in bibliografia. Un secondo modello meccanicistico è stato sviluppato per Pseudoperonospora cubensis, agente causale della peronospora delle cucurbitacee. Il modello calcola la data di comparsa dei sintomi e la probabilità del superamento di determinate soglie di gravità della malattia, sulla base di sotto-processi dell’infezione. Il passaggio da uno stato dell’infezione al successivo è dipendente dalle condizioni ambientali. Entrambi i modelli sono stati validati confrontando i dati ottenuti dai modelli con dati indipendenti rilevati in coltivazioni del nord Italia.
Cucurbits are potentially affected by more than 200 diseases of diverse etiologies, so a good disease management is crucial to reduce the risk of high yield losses in terms of quantity and quality. Among the more important diseases there are powdery and downy mildew. Podosphaera xanthii and Golovinomyces cichoracearum are the causal agents of cucurbit powdery mildew. The effect of temperature on conidial germination was studied in controlled condition at 6 constant temperature (from 10 to 35°C, step 5°C) for 3 to 72 hours. Optima temperature for conidial germination, infection and sporulation were 24.4, 25.7 and 21.3°C respectively for P. xanthii and 17.9, 17.3 and 16.2°C for G. cichoracearum. A mechanistic model was developed for the risk posed by P. xanthii and G. cichoracearum to cause cucurbit powdery mildew. The model simulates germination on infected leaves on the base of environmental conditions of temperature and relative humidity. Equation regulating spore germination of both fungi were developed using published data. Another mechanistic model was develop also for Pseudoperonospora cubensis, causal agent of cucurbit downy mildew. The model calculates the symptoms appearance and the probability of overtaking severity threshold based on sub-processes of infection. Changes from one state of the infection to the following one depend on environmental conditions. Both models were validated by comparing model outputs with independent data sets collected in fields located in the north of Italy.

Le cucurbitacee possono essere attaccate da più di 200 malattie, una corretta gestione è dunque fondamentale per ridurre il rischio di perdite di produzione, sia in termini di quantità sia in termini di qualità. Tra le malattie più importanti che attaccano le cucurbitacee ci sono l’oidio e la peronospora delle cucurbitacee. Podosphaera xanthii e Golovinomyces cichoracearum sono gli agenti causali dell’oidio. È stato studiato l’effetto della temperature sulla germinazione dei conidi in ambiente controllato a 6 temperature costanti (da 10 a 35°C, ad intervalli di 5C°) da 3 a 72 ore. La temperature ottimale per la germinazone, l’infezione e la sporulazione è risultata essere rispettivamente 24.4, 25.7 e 21.3°C per P. xanthii e 17.9, 17.3 e 16.2°C per G. cichoracearum. Un modello meccanicistico è stato sviluppato per il rischio che i due agenti patogeni causassero un attacco di oidio. Il modello simula la germinazione su foglie infettate sulla base delle condizioni ambientali di temperatura e umidità relativa. Le equazioni che calcolano la germinazione delle dei conidi di entrambi i funghi sono state sviluppate sulla base di dati presenti in bibliografia. Un secondo modello meccanicistico è stato sviluppato per Pseudoperonospora cubensis, agente causale della peronospora delle cucurbitacee. Il modello calcola la data di comparsa dei sintomi e la probabilità del superamento di determinate soglie di gravità della malattia, sulla base di sotto-processi dell’infezione. Il passaggio da uno stato dell’infezione al successivo è dipendente dalle condizioni ambientali. Entrambi i modelli sono stati validati confrontando i dati ottenuti dai modelli con dati indipendenti rilevati in coltivazioni del nord Italia.
Cucurbits are potentially affected by more than 200 diseases of diverse etiologies, so a good disease management is crucial to reduce the risk of high yield losses in terms of quantity and quality. Among the more important diseases there are powdery and downy mildew. Podosphaera xanthii and Golovinomyces cichoracearum are the causal agents of cucurbit powdery mildew. The effect of temperature on conidial germination was studied in controlled condition at 6 constant temperature (from 10 to 35°C, step 5°C) for 3 to 72 hours. Optima temperature for conidial germination, infection and sporulation were 24.4, 25.7 and 21.3°C respectively for P. xanthii and 17.9, 17.3 and 16.2°C for G. cichoracearum. A mechanistic model was developed for the risk posed by P. xanthii and G. cichoracearum to cause cucurbit powdery mildew. The model simulates germination on infected leaves on the base of environmental conditions of temperature and relative humidity. Equation regulating spore germination of both fungi were developed using published data. Another mechanistic model was develop also for Pseudoperonospora cubensis, causal agent of cucurbit downy mildew. The model calculates the symptoms appearance and the probability of overtaking severity threshold based on sub-processes of infection. Changes from one state of the infection to the following one depend on environmental conditions. Both models were validated by comparing model outputs with independent data sets collected in fields located in the north of Italy.

Mestrado, Enfermagem de Saúde Infantil e Pediatria, 2013, Escola Superior de Enfermagem de Lisboa
A elaboração do presente relatório surge no âmbito do Curso de Mestrado em Enfermagem, na Área de Especialização em Enfermagem de Saúde Infantil e Pediátrica, da Escola Superior de Enfermagem de Lisboa. O percurso formativo e profissional desenvolvido revestiram-se de importância preponderante para a aquisição, atualização de conhecimentos e desenvolvimento de competências de Enfermeiro Especialista em Saúde Infantil e Pediatria (EESIP). O presente documento pretende sintetizar as experiências vividas nos diferentes contextos de estágio, procurando fazer a ponte entre o planeado e as atividades efetivamente realizadas para o desenvolvimento de um Programa de Intervenção Terapêutica em Enfermagem direcionado para os profissionais da Unidade de ORL/Urologia do Hospital de Dona Estefânia. O tema transversal ao percurso desenvolvido foi o da Adesão ao Regime Terapêutico da criança com patologia do foro Urológico. Contudo, foi sofrendo adaptações conforme as necessidades dos diferentes contextos de estágio. A escolha do tema resultou de um conjunto de fatores, nomeadamente interesse pessoal e do diagnóstico de situação realizada na unidade de ORL/Urologia. A adesão ao regime terapêutico é um foco de atenção de enfermagem, e a compreensão deste fenómeno é importante para o exercício de funções. Para aumentar os níveis de adesão na criança, é fundamental conhecer os fatores que influenciam o fenómeno e as estratégias promotoras do comportamento de adesão. O EESIP tem um papel fundamental de intervenção nesta problemática, devendo desenvolver estratégias promotoras de saúde, reduzindo o impacto da doença crónica na criança e família. A metodologia de trabalho incorporou a análise reflexiva e crítica sobre o exercício profissional, a evidência científica e as situações vivenciadas ao longo dos estágios, permitindo identificar problemas e tomar decisões, implementando intervenções direcionadas e aplicáveis aos diferentes contextos. O percurso da formanda apoiou-se no referencial teórico do Modelo de Dorothea Orem – Teoria do Défice de Autocuidado.

Mutations of genes coding for collagen VI are responsible, in humans, of congenital muscular dystrophies, giving rise to three syndromes Bethlem Myopathy (BM), Ullrich Congenital Muscular Dystrophy (UCMD) and Congenital Myosclerosis (CM). Based on the high degree of heterogeneity and the overlap between them, it has been proposed that these disorders may represent a clinical continuum rather than strictly separated entities, and that there may be a wider spectrum of collagen VI related disorders. Despite these major advances in understanding their genetic bases, the molecular pathogenesis remained partially obscure. As it is the case for many genetic diseases, creation of animal models may be the key to understand the physiopathology, and to devise and test potential therapies. Several years ago (Bonaldo at al, 1998) a mutant mouse with targeted inactivation of COL6A1 gene, coding for the 1(VI) chain, was created. In the absence of a 1(VI) chain, collagen VI does not assemble and is not secreted in the extracellular matrix, and therefore homozygous null mice (Col6a1-/-) completely lack collagen VI in their tissues. These mice are affected by early onset myopathic disease with weakness and histological alterations of skeletal muscles. Col6a1-/- muscle have loss of contractile strength with ultrastructural alterations of sarcoplasmic reticulum (SR) and mitochondria and spontaneous apoptosis. There is a latent mitochondrial dysfunction in myofibers which can be revealed upon incubation with the selective F1F0-ATPase inhibitor oligomycin, which causes mitochondrial depolarization, Ca2+ deregulation and increased apoptosis. These defects were reversible, as they can be normalized by plating Col6a1-/- myofibers on collagen VI or by addition of cyclosporin A (CsA), the inhibitor of mitochondrial permeability transition pore (PTP). Collagen VI myopathies, in mice and humans, can be effectively treated with drugs acting downstream on pathogenic lesion. These observations lead to the hypothesis that the lack of collagen VI causes an increased probability of opening of the PTP, but we don’t know through which signalling pathway the lack of collagen VI in the extracellular matrix can have effects on mitochondria. One important partner of collagen VI is the proteoglycan NG2. In particular, there is evidence that NG2 binds to collagen VI via a protein-protein interaction (Tillet et al, 1997). NG2 may be considered an important receptor mediating collagen VI-sarcolemma interactions and this relationship may be disrupted in the pathogenesis of Bethlem and Ullrich dystrophies. We also know that the perturbation of NG2 distribution on the cell surface results in parallel change in collagen VI distribution (Nishiyama et al,1997). The NG2-collagen VI interaction may be important for organization of the extracellular matrix, for binding of cells to the matrix, for determination of cell morphology in relation to the matrix, and for a transduction of transmembrane signalling. To clarify the relevance of NG2 for muscle function and structure, muscles of mice carrying a null mutation of NG2 were studied. The aim of this study was a comparative characterization (in vivo, ex vivo and in vitro) of the phenotype of muscles from ColVI-/- and NG2-/- mice and the evaluation of the differences between the two models to understand in what way the absence of these proteins might lead to mitochondrial damage. The experimental program was aimed to the characterization of muscles from C57BL/6, Col6a1-/- and NG2-/- mice in vivo, ex vivo ed in vitro. The integrity of the membrane was tested with the blue Evans dye which allows to detect, pointed out with blue color, muscle fibers in which the sarcolemma has been damaged. At first the analysis of functional parameters of muscle contraction was carried out in vivo, with the following tests: - mouse force (Grip test) - force developed by the muscle gastrocnemius during isometric contraction. Then the analysis of functional parameters was developed ex vivo: - intact muscle diaphragm, EDL, soleus dissected and analysed in myograph - electrophoresis of proteins from diaphragm, EDL, soleus - histological and histochemical analysis of gastrocnemius and tibial. Finally, single muscle fibres were kept in culture and studied, in vitro: - recording Ca2+ transient in single fibres of FDB - electrophoresis of single fibres - immunocytochemistry analyses. The results of all the above listed tests have shown that the two phenotypes have only a partial overlap and, thus, NG2 does not represent the only structural/functional connection between Collagen VI in the ECM and the intracellular processes in muscle fibres. The role of integrin require to be explored.
Le mutazioni dei geni che codificano per le subunità del collagene VI sono una delle cause delle patologie muscolari ereditarie umane che si manifestano come la Miopatia di Bethlem (BM), la Distrofia Muscolare Congenita di Ullrich (UCMD) e la Miosclerosi Congenita (CM). Basandosi sull’alto grado di eterogeneità e di parziale sovrapposizione tra di loro, è stato proposto che questi disordini possano rappresentare un “continuum” clinico piuttosto che entità strettamente separate, e che ci possa essere un più ampio spettro di disordini connessi al collagene VI. Nonostante i grandi progressi nella comprensione delle loro basi genetiche, la patogenesi molecolare rimane ancora in parte sconosciuta. Come nel caso di molti difetti genetici, la creazione di animali transgenici può essere la chiave per comprendere la fisiopatologia e per mettere a punto, e testare, potenziali terapie. Molti anni fa (Bonaldo et al, 1998) è stato creato un topo mutante con inattivazione mirata del gene COL6A1, che codifica per la catena 1(VI). In assenza della catena 1(VI), il collagene non è assemblato e non è secreto nella matrice extracellulare, e pertanto il topo omozigote mutante (Col6a1-/-) perde il collagene VI nei suoi tessuti. I topi sono affetti da un disordine miopatico ad esordio precoce con debolezza e cambiamenti istologici del muscolo scheletrico. I muscoli del Col6a1-/- perdono forza contrattile e mostrano alterazioni ultrastrutturali a livello del reticolo sarcoplasmatico (SR), dei mitocondri e apoptosi spontanea. E’ presente una disfunzione mitocondriale latente nelle miofibre che si può evidenziare con incubazione con oligomicina, inibitore della F1F0-ATPasi, che causa depolarizzazione mitocondriale, de-regolazione del Ca2+ e aumento dell’apoptosi. Questi difetti sono reversibili, e possono essere normalizzati piastrando le fibre muscolari di Col6a1-/- su collagene VI o somministrando cisclosporina A (CsA), un inibitore del poro di transizione di permeabilità mitocondriale (PTP). Le miopatie dovute al collagene VI, sia umane che negli animali, possono essere efficacemente trattate con tale farmaco che agisce a valle della lesione patogenetica (Irwin et al, 2003 e Merlini et al, 2008). Così queste osservazioni portano ad ipotizzare che la mancanza del collagene VI causa un aumento dell’apertura del PTP ma non è ancora noto per mezzo di quale via di segnale. Un importante partner del collagene VI è il proteoglicano NG2. In particolare, ci sono prove che NG2 si leghi al collagene VI attraverso un interazione proteina-proteina (Tillet et al, 1997). NG2 può essere considerato un importante mediatore dell’interazione collagene VI-sarcolemma e il venir meno di questa relazione potrebbe avere un ruolo nella patogenesi delle distrofie di Bethlem e Ullrich. Sappiamo inoltre che modificazioni nella distribuzione superficiale di NG2 porta ad un parallelo cambiamento nella distribuzione del collagene VI (Nishiyama et al,1997). L’interazione NG2-collagene VI può essere importante nell’organizzazione della matrice, per il legame delle cellule alla matrice, per determinare la morfologia cellulare in risposta alla matrice, e per la trasduzione del segnale transmembrana. Per chiarire l’importanza di NG2 per la funzione e la struttura muscolare, sono stati studiati muscoli di topi con mutazione di NG2. Lo scopo dello studio è la caratterizzazione fenotipica comparativa (in vivo, ex vivo and in vitro) di Col6a1-/- and NG2-/- e la valutazione delle differenze tra i due modelli per comprendere se la mancanza di queste proteine porti ad un simile danno nella fibra muscolare. Si è proceduto dapprima a saggiare l’integrità della membrana con il colorante vitale blue Evans che permette di rilevare, evidenziandole con colorazione blu, le fibre muscolari il cui sarcolemma ha subito un danno. Poi, si è passati quindi all’analisi dei parametri funzionali della contrazione muscolare in vivo quali: - sviluppo di forza (Grip test) - sviluppo della forza massimale del gastrocnemio stimolato per via nervosa. Successivamente è stata effettuata una valutazione ex vivo: - meccanica dei muscoli interi diaframma, EDL e soleo - elettroforesi delle proteine muscolari - analisi istochimiche di gastrocnemio e tibiale. Infine per avere un quadro completo si è continuata l’ indagine in vitro : - transienti di calcio su singole fibre di FDB - elettroforesi su singole fibre di FDB - analisi immunocitochimiche. I risultati di tali analisi hanno mostrato che i due fenotipi hanno solamente una parziale sovrapposizione e quindi NG2 non rappresenta l’unica via di mediazione della presenza del collagene VI. Il ruolo delle integrine richiede di essere esplorato.

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Esta tese emerge de pesquisa no campo da educação médica, tendo como objeto de estudo o modelo pedagógico utilizado na Disciplina de Patologia do Curso de Medicina da Universidade Federal do Rio Grande - FURG. O desenho metodológico proposto pela disciplina, busca otimizar o ensino de patologia para que este possa ser efetivo na formação do estudante de medicina, de acordo com os pressupostos das Competências e Habilidades das Diretrizes Curriculares Nacionais (DCN). Entretanto, a implementação de um modelo pedagógico requer avaliações, reflexões e a flexibilidade de reorientação do projeto. Adotando essa percepção, a tese apresentada como objetivo central, além de reflexões e inquietações quanto ao compromisso com a formação médica, avaliar a metodologia de ensino-aprendizagem proposta na Disciplina de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio Grande - FURG na formação médica, sob a ótica das DCN. A coleta de dados ocorreu via questionário estruturado, respondido por 165 estudantes, que cursaram a disciplina nos anos de 2007 a 2009, após a implementação das mudanças na disciplina. Para a análise dos dados foram utilizados softwares específicos para construção do banco de dados e análise estatística. A análise foi realizada a partir de parâmetros da estatística descritiva, adotando-se medidas usuais de tendência central e de dispersão, e cálculos de frequência simples e relativos. Também se realizou a Análise de Componentes Principais (ACP), técnica multivariada que permite resumir em um conjunto menor de fatores ou componentes, as questões respondidas pelos estudantes a respeito da avaliação da Disciplina de Patologia. A tese é constituída por três artigos científicos que abordam o processo de ensino-aprendizagem na educação médica, a partir da perspectiva de mudança de paradigma no modelo de ensino-aprendizagem na Disciplina de Patologia, do Curso de Medicina da Universidade Federal do Rio Grande – FURG. Para tal, é desenvolvido um percurso teórico que se inicia com o primeiro artigo, que tem como objetivo promover uma reflexão sobre as mudanças no currículo médico a partir da aprovação das Diretrizes Curriculares Nacionais em 2001. O segundo artigo, envolve uma interlocução acerca da relevância do modelo pedagógico desenvolvido na referida disciplina e os pressupostos do processo de aprendizagem revelados pela neurociência. O terceiro artigo tem como objetivo avaliar a metodologia de ensino-aprendizagem proposta na Disciplina de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio Grande-FURG, e sua contribuição no processo de ensino-aprendizagem, a partir da percepção dos estudantes, sob a ótica das Diretrizes Curriculares Nacionais para o Curso de Medicina. Subsequentemente, considerando a interlocução do referencial teórico e dos resultados obtidos junto aos acadêmicos, retomando o objetivo principal, é possível preconizar que a mesma, embasada no entendimento do organismo como sistema complexo, numa perspectiva de saúde integral, atendendo aos pressupostos das DCN, contribui para o desenvolvimento de competências e habilidades essenciais para a formação médica.
This thesis is result of a medical education research being the object of study the pedagogical model used in the discipline of pathology of the medical course at the Federal University of Rio Grande - RS. The methodology pattern proposed by the mentioned discipline aims to optimize the teaching of pathology in order to be effective on medical students training, according to the assumptions of the National Curriculum Guidelines (NCG) Skills and Abilities. However, the implementation of a pedagogical model requires evaluations, reflections and a flexibility to review the proposed project. Adopting this perception, the thesis presented has as main objective not only reflections and concerns about the commitment to medical education but the evaluation of the teaching-learning methodology proposed in the Department of Pathology, Medical School, Federal University of Rio Grande regarding the medical training and considering the NCG. Using a structured questionnaire was collected the useful data. This set of questions was answered by 165 students taking this discipline during 2007-2009, after the implementation of changes in referred discipline. For the data analysis specific to construction of the database and statistical analysis software were used. The analysis was performed from the descriptive statistical parameters, adopting the usual measures of central tendency and dispersion calculations of simple and relative frequency. Moreover the Principal Component Analysis (PCA) was performed, a multivariate technique that allows summarized in a smaller set of factors or components the questions answered by the students regarding the evaluation of the discipline of pathology. The thesis consists of three scientific papers that discuss the process of teaching-learning in medical education regarding a paradigm change in the teaching and learning model in the Department of Pathology, Medical School of the Federal University of Rio Grande - FURG. A theoretical path is developed beginning with the first article, which aims to promote reflection on the changes in the medical curriculum following the approval of the National Curriculum Guidelines in 2001. The second article involves a dialogue about the relevance of the pedagogical model developed in this discipline and assumptions of the learning process revealed by neuroscience. The third article aims to evaluate the teaching-learning methodology proposed in the Department of Pathology, Medical School, Federal University of Rio Grande-FURG, and a contribution to the teaching-learning process, considering the perception of the medical students, and taking into account the National Curriculum Guidelines for Medical School. Later, considering the dialogue of the theoretical framework and the results obtained from the students and resuming the main objective, it is possible to advocate that the dialogue based on the understanding of the body as a complex system focusing a complete health and following the assumptions of Curriculum Guidelines, contributes to develop essential competencies and skills for medical education.

Le cellule CD4(+)CD25(+) T regulatorie (Treg) sono una sottopopolazione delle cellule T CD4(+) coinvolte nel controllo della risposta immunitaria. In vitro, le cellule CD4(+)CD25(+) Treg inibiscono la proliferazione delle cellule CD4(+)CD25(-) Th indotta mediante lo stimolo policlonale anti-CD3 mAb in presenza di APC. L’aggiunta di IL-4 alla coltura cellulare inibisce la soppressione mediata dalle cellule CD4(+)CD25(+) Treg. Partendo dal presupposto che tutti i tipi cellulari usati nella cotura esprimono la catena alpha del recettore per IL-4, noi abbiamo usato diverse combinazioni di cellule CD4(+)CD25(-) Th , cellule CD4(+)CD25(+) Treg, e APC da topi wild-type IL-4Ralpha(+/+) o topi knockout IL-4Ralpha(-/-). I risultati mostrano che la presenza della catena IL-4Ralpha sulle celluleCD4(+)CD25(-) Th le rende resistenti alla soppressione. In più, l’aggiunta di IL-4 alla coltura promuove la proliferazione delle cellule IL-4Ralpha(+/+)CD4(+)CD25(+) Treg , che comunque mantengono a pieno la capacità di sopprimere. Questi dati indicano che IL-4 è fondamentale per l’attiazione delle cellule CD4(+)CD25(-) Th e indicano che che la proliferazione delle cellule CD4(+)CD25(+) Treg indotta da IL-4 è compatibile con la loro attività soppressoria. Il trasferimento di cellule CD4(+)CD45RB(high) T cells da milze di topi normali a topi SCID recipienti induce lo sviluppo di una forma di colite Th1-mediata. E’ dimostrato che le cellule CD4(+)CD45RB(low) Treg prevengono lo sviluppo della colite. Il trasferimento di cellule CD4(+)CD45RB(high) T da milze di topi IL-4Ralfa-/-inducono lo sviluppo della colite in modo meno drammatico rispetto a quella indotta da cellule CD4(+)CD45RB(high) T provenienti da topi IL-4Ralfa+/+.
CD4(+)CD25(+) T regulatory (Treg) cells are a CD4(+) T cell subset involved in the control of the immune response. In vitro, murine CD4(+)CD25(+) Treg cells inhibit CD4(+)CD25(-) Th cell proliferation induced by anti-CD3 mAb in the presence of APCs. The addition of IL-4 to cocultured cells inhibits CD4(+)CD25(+) Treg cell-mediated suppression. Since all cell types used in the coculture express the IL-4Ralpha chain, we used different combinations of CD4(+)CD25(-) Th cells, CD4(+)CD25(+) Treg cells, and APCs from wild-type IL-4Ralpha(+/+) or knockout IL-4Ralpha(-/-) mice. Results show that the engagement of the IL-4Ralpha chain on CD4(+)CD25(-) Th cells renders these cells resistant to suppression. Moreover, the addition of IL-4 promotes proliferation of IL-4Ralpha(+/+)CD4(+)CD25(+) Treg cells, which preserve full suppressive competence. These findings support an essential role of IL-4 signaling for CD4(+)CD25(-) Th cell activation and indicate that IL-4-induced proliferation of CD4(+)CD25(+) Treg cells is compatible with their suppressive activity. The transfert of CD4(+)CD45RB(high) T cells from the spleen of normal mice to SCID recipient leads to the development of Th1-mediated colitis. CD4(+)CD45RB(low) Treg cells show to prevent the development of colitis. The transfert of CD4(+)CD45RB(high) T cells from spleen of IL-4Ralpha-/-mice leads to the development colitis less seriously than CD4(+)CD45RB(high) T cells from spleen of IL-4Ralpha+/+ mice.

INTRODUCTION Transplantation is the only effective treatment for several end-stage lung diseases. Remarkable progress has been made in improving outcomes, although the 5-year graft survival is still less than 50% primarily because of the development of chronic lung allograft dysfunction (CLAD). CLAD has been now recognized as a heterogeneous condition that includes an obstructive form (bronchiolitis obliterans syndrome, BOS) and a restrictive allograft dysfunction (restrictive allograft syndrome, RAS). BOS, and its histological correlate obliterative bronchiolitis -OB- represents the principal form of CLAD (~75%). The specific etiology and pathogenesis of BOS/OB are not fully understood. Multiple immune mechanisms seem to contribute to the development of BOS/OB, thus it is thought to represent a final common pathway of a process triggered by both alloantigen dependent and independent mechanisms. While the role of alloimmunity has long been established more recent studies have begun to demonstrate the role of autoimmunity in the development of BOS. A few experimental and clinical studies have demonstrated that collagen V and K-α1 tubulin, modified during ischemia reperfusion injury, may trigger autoimmune response, both humoral and cell mediated. Interleukin 17 (IL17), a proinflammatory cytokine involved in autoimmune and infectious diseases, has recently been suggested to play a key role in the development of CLAD. The development of animal models, mimicking the human transplantation procedure, is of great importance to elucidate the pathogenetic mechanisms leading to BOS/OB, to identify important biomarkers of OB and finally to test the effectiveness of new target therapies. However up to today two important issues are largely discussed in rodent orthotopic models: 1) the reproducibility of the surgical procedure 2) the identification of the best genetic strain (inbred versus outbred rats) for the development of immunological lesions similar to those in humans. AIM OF THE RESEARCH The main goals of the present PhD research project were: 1) development of a reproducible orthotopic lung transplant animal model, obtaining immunological lesions, particularly CLAD, similar to those of humans; 2) evaluation of IL17/IL23 pathway, crucial in autoimmune response, through a careful investigation in preclinical models and in clinical index cases of CLAD. MATERIALS AND METHODS Two different animal models were used to perform orthotopic lung transplantation (OLT): outbred rat strain (20 CD SPF left lungs were transplanted into VAF) and inbred rat strain (32 Lewis left lung rats were transplanted into Fisher 344). Only the long term survival animals (sacrificed 30 and 90 days after LT) were subjected to a full immunological evaluation as follows: a) detection of donor-specific antibodies (DSA) testing serum samples with the flow cross match technique b) morphological and immunophenotype evaluation of acute and chronic immunological lesions developed in the graft c) immunohistochemical and molecular (RT-qPCR) analysis of IL17/IL23 pathway in the graft and bronchoalveolar lavage (BAL) of animals and in all scheduled transbronchial biopsies of two index cases that developed CLAD. RESULTS Surgical mortality and early graft failure (within 24 hours) was higher in the outbred than inbred group (only 2 of a total 20 outbred rats survived). The two survival OLT outbred rats (sacrified 13 and 14 days after OLT) developed well evident immunological disorders: one showed acute cellular rejection (ACR) with coexistent early OB and the other late OB. Immunological disorders (only minimal ACR: A1B1) were rare (only 1/11; 9%) in the first 15 days of OLT inbred rats. In this period the inbred grafts showed ischemia/reperfusion or infections. ACR (≥A2B1) developed in 2/6 (33%) inbred grafts at 30 days. Ninety days after OLT was the best time point for the development of immunological disorders: ACR (≥A2B1) and OB (both early and late) were detected in 7/15 (46%) and 8/15 (53%) animals respectively, regardless of immunosuppressive treatment. DSA IgG showed higher median levels in those with ACR or OB than those without (70% and 34%, respectively vs 13%). A strong IL17 immunostaining was detected in inbred grafts that developed ACR and OB. IL 17 was equally expressed in inflammatory cells (macrophages and lymphocytes) of inbred grafts with ACR and OB while it was more expressed in epithelial and endothelial cells of inbred grafts with OB. No staining was detected in grafts of animals without any sign of rejection. IL23 expression was high in grafts with both absence and presence of rejection. Molecular analysis of IL17 and IL23 expression in BAL fluids showed higher levels of mRNA in grafts with ACR than OB. All scheduled transbronchial biopsies of the two index cases with ACR and OB showed IL17 overexpression with the same pattern detected in the preclinical model. CONCLUSIONS Outbred rodents that could have been more similar to humans due to high genetic diversity can not be used as a reliable OLT model because of the high rate of dramatic early graft failure. A reproducible model of both ACR and OB was developed in inbred rats (Lewis to Fisher 344) and 90 days post-transplantation was the optimal endpoint established. IL17, overexpressed in ACR and overall in OB lesions, is a crucial mediator in post-transplant immunological lesions and could be considered a potential therapeutic target in clinical transplantation.
INTRODUZIONE Il trapianto di polmone è l’unica opzione terapeutica per alcune patologie polmonari terminali. Notevoli progressi sono stati fatti in questo ambito, tuttavia la sopravvivenza dell’organo dopo 5 anni è inferiore al 50%, principalmente a causa dello sviluppo del rigetto cronico. Il rigetto cronico si presenta in modo eterogeneo, in quanto può essere caratterizzato da una forma ostruttiva (sindrome della bronchiolite obliterante, BOS) o da una restrittiva (RAS). La BOS e il suo corrispondente aspetto istopatologico, la bronchiolite obliterante (BO), rappresentano la principale forma di rigetto cronico (~75%). L’eziologia e l’esatta patogenesi della BOS/BO non sono ancora state completamente chiarite in quanto diversi meccanismi immunitari sembrano essere coinvolti nel suo sviluppo e sembra essere la conseguenza di un processo indotto da meccanismi dipendenti/indipendenti dagli alloantigeni. Infatti, il ruolo dell’alloimmunità nello sviluppo della BOS/BO è stato dimostrato da tempo, mentre quello dell’autoimmunità è emerso solo recentemente. Pochi lavori sperimentali e clinici hanno dimostrato che il collagene V e la tubulina K-α1, modificati nel danno da ischemia e riperfusione, possono indurre la risposta autoimmune, sia umorale che cellulo-mediata. L’interleuchina17 (IL17), una citochina proinfiammatoria coinvolta in patologie autoimmuni ed infettive, è stata proposta recentemente come fattore cruciale nello sviluppo del rigetto cronico. Lo sviluppo di modelli animali, che subiscono una procedura trapiantologica analoga all’umana, risulta di grande importanza al fine di chiarire i meccanismi patogenetici legati allo sviluppo della BOS/BO, di identificare biomarcatori precoci e di provare l’efficacia di nuove terapie. Attualmente, due importanti aspetti vengono largamente discussi nei modelli di trapianto ortotopico nei roditori: 1) la riproducibilità della procedura chirurgica e 2) l’identificazione del migliore genotipo (inbred o outbred) per lo sviluppo di lesioni immunologiche simili a quelle umane. SCOPO DELLA RICERCA I principali obiettivi di questa ricerca sono stati: 1) sviluppo di un modello animale di trapianto ortotopico di polmone riproducibile con lesioni immunologiche simili a quelle umane, in particolare quelle tipiche del rigetto cronico; 2) verificare l’ipotesi che IL17/IL23 giochi un ruolo chiave nello sviluppo del rigetto cronico mediante uno studio scrupoloso nei modelli preclinici e in casi clinici emblematici. MATERIALI E METODI Due modelli animali sono stati utilizzati per eseguire il trapianto ortotopico di polmone (LT): il modello outbred (20 polmoni sinistri CD SPF sono stati trapiantati in VAF) e il modello inbred (32 polmoni sinistri di ratti Lewis sono stati trapiantati in Fisher 344). Esclusivamente i ratti con sopravvivenza a lungo termine (sacrificati 30 e 90 giorni dopo LT) sono stati studiati in modo approfondito dal punto di vista immunologico mediante: a) ricerca di anticorpi anti-donatore (DSA) mediante citometria a flusso sui campioni ematici; b) valutazione morfologica ed immunofenotipica di lesioni immunologiche acute e croniche sviluppatesi nel polmone trapiantato; c) analisi immunoistochimica e molecolare (PCR semiquantitativa) del meccanismo IL17/IL23 nell’organo trapiantato e nel BAL dei modelli animali e nelle biopsie transbronchiali di monitoraggio di due casi clinici emblematici di pazienti che hanno sviluppato la BO. RISULTATI La mortalità perioperatoria e la disfunzione precoce dell’organo trapiantato (entro le 24 ore) erano più elevate nel gruppo di animali outbred rispetto agli inbred (solo 2/20 ratti outbred sono sopravvissuti): uno presentava rigetto cellulare acuto (ACR) con coesistente BO precoce, l’altro un rigetto cronico tardivo. Nei primi 15 giorni dopo LT i topi inbred presentavano raramente lesioni immunologiche (solo 1/11: 9%) e si trattava di ACR lieve (A1B1). In questo periodo i polmoni trapiantati inbred mostravano danno da ischemia/riperfusione o infezioni. In 2/6 (33%) dei polmoni trapiantati inbred è stato riscontrato un importante ACR (≥A2B1) 30 giorni dopo LT. Il sacrificio a 90 giorni è risultato ottimale per lo sviluppo di lesioni immunologiche: ACR (≥A2B1) e BO (lesioni precoci e tardive) sono state riscontrate in 7/15 (46%) e 8/15 (53%) animali rispettivamente, indipendentemente dal trattamento di immunosoppressione. Gli animali con ACR o BO presentavano livelli di Ig DSA maggiori rispetto a quelli che non presentavano alcun segno di rigetto (rispettivamente 70% e 34% vs 13%). Una forte positività immunoistochimica per IL17 è stata riscontrata nei polmoni trapiantati dei topi inbred che avevano sviluppato ACR e BO. Non erano evidenti differenze significative nell’espressione di IL17 nelle cellule infiammatorie (macrofagi e linfociti) di polmoni inbred con ACR e BO, mentre è risultata maggiore nelle cellule epiteliali ed endoteliali di polmoni inbred con BO rispetto a quelli con ACR. Non è stata riscontrata positività nei polmoni di animali senza alcun segno di rigetto. L’espressione di IL23 era elevata sia in assenza che in presenza di rigetto. L’analisi molecolare dell’espressione di IL17 e IL23 nel BAL ha dimostrato maggiori livelli di mRNA nei polmoni trapiantati con ACR rispetto a quelli con BO. Tutte le biopsie di monitoraggio dei due casi emblematici caratterizzate da ACR e BO hanno mostrato un’elevata espressione di IL17 con lo stesso pattern riscontrato nel modello preclinico. CONCLUSIONI I ratti outbred, che potrebbero essere considerati più simili all’uomo data la loro diversità genetica, non possono essere considerati un modello riproducibile di LT a causa dell’elevata mortalità precoce. E’ stato sviluppato un modello riproducibile di rigetto acuto cellulare e cronico nei ratti inbred (da Lewis a Fisher 344) e il sacrificio 90 giorni dopo il trapianto è risultata la tempistica ottimale. IL17, notevolmente espressa nell’ACR e nella BO, è un mediatore cruciale nelle lesioni immunologiche post-trapianto e potrebbe rappresentare un importante target terapeutico nella trapiantologia clinica.

La peronospora della vite è causata dall’Oomicete eterotallico Plasmopara viticola ed è ampiamente diffusa in tutte le aree caratterizzate da primavere miti e piovose. Gli organi svernanti di questo patogeno sono le oospore, che rappresentano l’unica fonte di inoculo per le infezioni primarie. Recenti studi molecolari hanno evidenziato l’importanza delle infezioni primarie e suggerito una revisione dell’epidemiologia di P. viticola. Questa tesi è costituita dagli studi epidemiologici realizzati per indagare il processo di maturazione e germinazione delle oospore mirati all’elaborazione di un modello dinamico per la simulazione delle infezioni primarie di P. viticola. Il modello è stato successivamente validato in diverse aree viticole italiane e, inoltre, utilizzato come base per un warning system in tempo reale per la gestione dei trattamenti in vigneto.
The heterothallic Oomycete Plasmopara viticola represents the causal agent of downy mildew of grapevine (Vitis spp.). The unique source of inoculum is represented by the overwintering sexual spores, originated by the fusion between anteridium and oogonium, so called oospores. Despite their critical impact on the epidemiology of this disease, knowledge about oospores presents some inconsistencies that are engaged in the present dissertation. Initially, the effect of water moistening the grape leaf litter holding overwintering P. viticola oospores was investigated. A close relationship was found between vapour pressure deficit (VPD in hPa) and aW (water activity) of the leaf litter, so that when VPD is lower than 2.13 hPa there is sufficient water for oospores to develop. Results showed that moisture of the leaf litter due to the water flow from the atmosphere makes the oospore development possible also during non rainy periods. Then, the effects of environmental conditions on the variability in germination dynamics of Plasmopara viticola oospores were studied over five years. The germination course was determined indirectly as the relative infection incidence (RII) occurring on grape leaf discs kept in contact with oospores sampled from a vineyard between March and July. The time elapsed between the 1st of January and the infection occurrence was expressed as physiological time, using sums of hourly rates from a temperature-dependent function only in hours when VPD was not a limiting factor (hydro-thermal time, HT). The Gompertz equation calculated over hydro-thermal time produced a consistent modelling of the general relationships between the germination dynamics of a population of P. viticola oospores and weather conditions. It represents the relative density of the seasonal oospores that should have produced sporangia when they have experienced favourable conditions for germination. Finally, a dynamic model for Plasmopara viticola primary infections on grapevine was elaborated according to a mechanistic approach. Development of the sexual stage of the pathogen was split into different state variables, in which changes from one state to another were regulated by rates depending on environmental conditions. The conceptual model was based on the definition of a primary inoculum season, a seasonal oospore (inoculum) dose, and its division into many coeval cohorts. Each cohort progresses along the primary infection cycle (production and survival of sporangia, release, survival and dispersal of zoospores, infection, appearance of disease symptoms) simultaneously, with a time step of one hour. The model was evaluated by comparing model predictions with disease onset in: i) 100 vineyards of Northern, Southern and Insular Italy (1995 to 2007); ii) 42 groups of potted grapevine plants exposed to inoculum (2006 to 2008). Most of the wrong positive predictions occurred in early season, when the host was in the earlier growth stages, or when the oospore germination was triggered by isolated weak rain events. Considering that neither calibration nor empirical adjustment of model parameters were necessary to obtain accurate simulation, it was concluded that this model produces a reasonable approximation of the primary infection processes underlying oospore development. A warning system based on such a model and on short-term weather forecasts was developed and its use was evaluated in experimental vineyards over a 3-year period in North Italy. An unsprayed control was compared with a “warning” treatment (fungicides were applied when the warning system predicted an infection), a “threshold” treatment (fungicides were applied as in the warning treatment, but only for the oospore cohorts higher than a fixed threshold), and the grower’s schedule. Average efficacy in decreasing disease incidence on leaves compared to the unsprayed control was > 90% for all treatments. On the average, 6.8 sprays were applied following the grower’s schedule; use of the warning system reduced applications by about one half (warning treatment) or two third (threshold treatment). The grower’s schedule was the most expensive control strategy, with average of 337 €/ha; the average saving was 174 and 224 €/ha for the warning and the threshold treatments, respectively. The value of this dissertation consists in two relevant and connected aspects. From one side the studies performed on the oospore maturation and germination allowed to better understand and clarify a key point of the downy mildew epidemics still wrapped by a lack of information. From the other side the model elaborated during this thesis represents a practical and efficient tool that leads to the reduction both of growers’ costs and chemical input in the environment.

La peronospora della vite è causata dall’Oomicete eterotallico Plasmopara viticola ed è ampiamente diffusa in tutte le aree caratterizzate da primavere miti e piovose. Gli organi svernanti di questo patogeno sono le oospore, che rappresentano l’unica fonte di inoculo per le infezioni primarie. Recenti studi molecolari hanno evidenziato l’importanza delle infezioni primarie e suggerito una revisione dell’epidemiologia di P. viticola. Questa tesi è costituita dagli studi epidemiologici realizzati per indagare il processo di maturazione e germinazione delle oospore mirati all’elaborazione di un modello dinamico per la simulazione delle infezioni primarie di P. viticola. Il modello è stato successivamente validato in diverse aree viticole italiane e, inoltre, utilizzato come base per un warning system in tempo reale per la gestione dei trattamenti in vigneto.
The heterothallic Oomycete Plasmopara viticola represents the causal agent of downy mildew of grapevine (Vitis spp.). The unique source of inoculum is represented by the overwintering sexual spores, originated by the fusion between anteridium and oogonium, so called oospores. Despite their critical impact on the epidemiology of this disease, knowledge about oospores presents some inconsistencies that are engaged in the present dissertation. Initially, the effect of water moistening the grape leaf litter holding overwintering P. viticola oospores was investigated. A close relationship was found between vapour pressure deficit (VPD in hPa) and aW (water activity) of the leaf litter, so that when VPD is lower than 2.13 hPa there is sufficient water for oospores to develop. Results showed that moisture of the leaf litter due to the water flow from the atmosphere makes the oospore development possible also during non rainy periods. Then, the effects of environmental conditions on the variability in germination dynamics of Plasmopara viticola oospores were studied over five years. The germination course was determined indirectly as the relative infection incidence (RII) occurring on grape leaf discs kept in contact with oospores sampled from a vineyard between March and July. The time elapsed between the 1st of January and the infection occurrence was expressed as physiological time, using sums of hourly rates from a temperature-dependent function only in hours when VPD was not a limiting factor (hydro-thermal time, HT). The Gompertz equation calculated over hydro-thermal time produced a consistent modelling of the general relationships between the germination dynamics of a population of P. viticola oospores and weather conditions. It represents the relative density of the seasonal oospores that should have produced sporangia when they have experienced favourable conditions for germination. Finally, a dynamic model for Plasmopara viticola primary infections on grapevine was elaborated according to a mechanistic approach. Development of the sexual stage of the pathogen was split into different state variables, in which changes from one state to another were regulated by rates depending on environmental conditions. The conceptual model was based on the definition of a primary inoculum season, a seasonal oospore (inoculum) dose, and its division into many coeval cohorts. Each cohort progresses along the primary infection cycle (production and survival of sporangia, release, survival and dispersal of zoospores, infection, appearance of disease symptoms) simultaneously, with a time step of one hour. The model was evaluated by comparing model predictions with disease onset in: i) 100 vineyards of Northern, Southern and Insular Italy (1995 to 2007); ii) 42 groups of potted grapevine plants exposed to inoculum (2006 to 2008). Most of the wrong positive predictions occurred in early season, when the host was in the earlier growth stages, or when the oospore germination was triggered by isolated weak rain events. Considering that neither calibration nor empirical adjustment of model parameters were necessary to obtain accurate simulation, it was concluded that this model produces a reasonable approximation of the primary infection processes underlying oospore development. A warning system based on such a model and on short-term weather forecasts was developed and its use was evaluated in experimental vineyards over a 3-year period in North Italy. An unsprayed control was compared with a “warning” treatment (fungicides were applied when the warning system predicted an infection), a “threshold” treatment (fungicides were applied as in the warning treatment, but only for the oospore cohorts higher than a fixed threshold), and the grower’s schedule. Average efficacy in decreasing disease incidence on leaves compared to the unsprayed control was > 90% for all treatments. On the average, 6.8 sprays were applied following the grower’s schedule; use of the warning system reduced applications by about one half (warning treatment) or two third (threshold treatment). The grower’s schedule was the most expensive control strategy, with average of 337 €/ha; the average saving was 174 and 224 €/ha for the warning and the threshold treatments, respectively. The value of this dissertation consists in two relevant and connected aspects. From one side the studies performed on the oospore maturation and germination allowed to better understand and clarify a key point of the downy mildew epidemics still wrapped by a lack of information. From the other side the model elaborated during this thesis represents a practical and efficient tool that leads to the reduction both of growers’ costs and chemical input in the environment.

L’antracnosi della vite (causato da Elsinoe ampelina), il mariciume dell’uva (o ripe rot causato da Colletotrichum spp.) e la carie bianca (o white rot causato da Coniella diplodiella) sono malattie che minacciano seriamente la produzione viticola in Cina. Infatti, il loro controllo implica la ripetuta applicazione di fungicidi durante la stagione produttiva. Nella presente tesi, le conoscenze disponibili sull’antracnosi e il marciume dell’uva (ripe rot) sono state raccolte dalla letteratura, analizzate e sintetizzate attraverso l’analisi dei sistemi, per sviluppare modelli meccanicistici in cui le variabili ambientali guidano le predizioni del modello. A differenza di quanto ottenuto per questi patogeni, la revisione della letteratura per la carie bianca (white rot) ha evidenziato una carenza di informazioni per alcuni importanti aspetti epidemiologici di questa malattia. Pertanto, sono stati eseguiti diversi esperimenti in laboratorio per studiare l’effetto di diverse condizioni ambienti sull’infezione degli acini, il periodo di incubazione, il periodo di latenza e la dinamica di sporulazione. Sulla base dei risultati di questi esperimenti, è stato quindi sviluppato un modello meccanicistico per la carie bianca che considera l’intero ciclo vitale del patogeno. I tre modelli meccanicistici sviluppati sono stati validati confrontando le predizioni con dati reali indipendenti; i modelli hanno mostrato una buona capacità e accuratezza nella rappresentazione delle epidemie in condizioni reali. I modelli sviluppati in questa tesi forniscono la base per una migliore protezione del vigneto da queste malattie.
Grapevine anthracnose (caused by Elsinoe ampelina), ripe rot (caused by Colletotrichum spp.) and white rot (caused by Coniella diplodiella) are serious threats in many vineyards of China, and their controls require repeated application of fungicides. In the present dissertation, the available knowledge on grapevine anthracnose and ripe rot were retrieved from literature, analyzed, and synthesized to develop weather-driven, mechanistic models for indicated two diseases based on system analysis. Unlike the previous two diseases, the literature review provided incomplete information about some important aspects of epidemiology of grape white rot. Therefore, several artificial inoculation experiments were conducted to investigate the effects of environmental factors on epidemiological parameters of white rot, including berry infection, incubation, latency and sporulation dynamics. Subsequently, a process-based mechanistic model that accounts for the entire life cycle of pathogen was constructed by using these experimental data. The above three mechanistic models were validated by comparing with independent datasets, and provided good ability and accuracy to represent the real epidemiological systems. The models developed in this dissertation provide a basis for better scheduling crop protection actions in vineyards.

Spinocerebellar ataxias (SCAs) are a genetically heterogeneous group of cerebellar degenerative disorders, characterized by progressive gait unsteadiness, hand incoordination and dysarthria. The mutational mechanism in spinocerebellar ataxia type1 (SCA1), a dominantly inherited form of SCA, consists of an expanded trinucleotide CAG repeat that encodes a polyglutamine tract in ataxin1. Mutant SCA1 transgenic mice present pathological cerebellar signs with concomitant progressive Purkinje neuron atrophy and relatively little cell loss, at least in the early stage of life; this evidence suggests that the SCA1 phenotype is not the result of cell death per se, but a possible effect of cellular dysfunction that occurs before neuronal demise. In the present study we correlated the earliest histopathological changes in both homozygous and heterozygous transgenic SCA1 mice, 2 and 6 months old, to the mitochondrial oxidative metabolism in cerebellar cells. Our results showed selective Cytochrome c Oxidase (COX) deficiency in Purkinje cells (PC). Analysis on COX-competent and -deficient PC, isolated by laser-microdissector, demonstrated that the observed oxidative dysfunction is related to mitochondrial DNA (mtDNA) depletion. In conclusion, we provide evidence of a selective oxidative metabolism defect in neuronal PC expressing mutant ataxin. This defect could represent one of the earliest pathogenetic step of the Purkinje cells’ suffering in SCA1 disease.

Le cardiomiopatie sono patologie del cuore associate a disfunzione cardiaca, caratterizzate da alterazioni strutturali a carico dei cardiomiociti e della loro organizzazione tessutale. I dischi intercalari sono zone di contatto e adesione tra le membrane plasmatiche di cardiomiociti contigui e sono costituiti da giunzioni di membrana altamente specializzate: le giunzioni aderenti, i desmosomi e le giunzioni comunicanti. In questo studio è stato analizzato il rimodellamento dei dischi intercalari in corso di cardiomiopatia ipertrofica e dilatativa ereditaria, utilizzando i modelli sperimentali di criceti cardiomiopatici UMX7.1 e TO2, geneticamente privi del δ-sarcoglicano. L’analisi ultrastrutturale di cuori di criceti cardiomiopatici ha evidenziato la disorganizzazione tissutale nei cuori di criceti UMX7.1, con dischi intercalari disorganizzati e aumentati di numero. Nei cuori di criceti TO2 si è rivelata peculiare la presenza di desmosomi e giunzioni comunicanti anche a livello della membrana laterale di cardiomiociti adiacenti. L’analisi immunoistochimica ha evidenziato un aumento di espressione di N-caderina e β-catenina nei criceti UMX7.1 rispetto ai controlli, mentre nei criceti TO2 è risultata peculiare la distribuzione di connessina 43 a livello delle membrane laterali dei cardiomiociti. Sono stati quindi analizzati mediante immunoistochimica campioni di tessuto miocardico provenienti da quarantaquattro pazienti sottoposti a trapianto cardiaco affetti da cardiomiopatia dilatativa idiomatica, da cardiomiopatia dilatativa genetica nota; da cardiomiopatia dilatativa secondaria e infine da cardiomiopatia ipertrofica idiopatica. L’analisi immunoistochimica ha rilevato un aumento di espressione di N-caderina importante nelle cardiomiopatie dilatative secondarie e meno diffuso negli altri casi, e un uniforme aumento di β-catenina. Inoltre nella maggior parte dei casi analizzati è stata osservata una delocalizzazione di connessina 43 a livello della superficie laterale dei cardiomiociti. Considerate, infine, le evidenze cliniche e sperimentali che supportano il ruolo antiinfiammatorio e cardioprotettivo degli acidi grassi ω-3, in questo studio si è voluto analizzare l’effetto che una dieta arricchita di acidi grassi ω-3 ha sul rimodellamento cardiaco in modello sperimentale di criceti UMX7.1. Criceti cardiomiopatici UMX7.1 e criceti sani sono stati nutriti con dieta standard, mentre un altro gruppo di criceti CMPH è stato invece nutrito con dieta arricchita in ALA. E’ stata analizzata l’espressione delle molecole del disco intercalare mediante western blotting, analisi immunoistochimica e analisi ultrastrutturale; tali analisi hanno mostrato complessivamente che la dieta arricchita in ALA ripristina almeno in parte l’organizzazione strutturale del tessuto miocardico in criceti cardiomiopatici. In conclusione in questo studio è stato analizzato il rimodellamento dei cardiomiociti in corso di cardiomiopatia sperimentale e umana ed è stato dimostrato l’effetto benefico di una dieta arricchita in acidi grassi ω-3 sulla struttura dei dischi intercalari e sulla loro composizione molecolare, suggerendo, quindi, il potenziale uso di acidi grassi ω-3 nella prevenzione di aritmie potenzialmente dannose in corso di patologie cardiache.
Cardiomyopathies are cardiac diseases associated to cardiac disfunction, caracterized by structural alterations of cardiomyocytes and their tissutal organization. Intercalated disks are adhesion structures between plasmatic membranes of cardiomyocytes, made of highly specialized membrane junctions: adherens junctions, desmosomes and gap junctions. The present investigation evaluated intercalated disks remodelling during hypertrophic and dilatative cardiomyopathies, in UMX7.1 and TO2 δ-sarcoglican-deficient hamsters. Hamsters hearts ultrastructural analysis showed that the ordered organization is lost in UMX7.1 hearts, where intercalated disks appear chaotically located and structural swirling. In TO2 hamsters, desmosomes and gap junctions are located on the lateral plasmalemma. Immunohistochemistry showed an increase in expression levels of N-cadherin and β-catenin in UMX7.1 hamsters, while connexin 43 appears located on the lateral plasmalemma in TO2 hamsters. Myocardiac tissue samples from 44 patients affected by idiopathic dilatative cardiomyopathy, genetic dilatative cardiomyopathy, secondary dilatative cardiomyopathy and hypertrophic idiopathic cardiomyopathy were analized by immunohistochemistry. The analysis showed a high increased in N-cadherin in secondary dilatatve cardiomyopathies and an uniform increase in β-catenin. Then, in most of the samples observed, connexin 43 appears located on the lateral plasmalemma. Since a lot of clinical and experimental dates show omega-3 essential fatty acids anti-inflammatory and cardioprotective role, in the present investigation it the effect of an ALA- enriched diet on cardiac remodelling in UMX7.1 hamsters has been evaluated. UMX7.1 hamsters and healthy hamsters were fed with standard diet, while a different group of UMX7.1 hamsters was fed with ALA-enriched diet. Intercalated disk molecules expression was evaluated by western blotting, immunohistochemistry and ultrustructural analysis; on the whole, the ALA-enriched diet demonstrates its effects in counteracting the pathological alterations in cardiomyopathic hamsters. Collectively, the present investigation evaluated cardiomyocytes remodelling during experimental and human cardiomyopathy and showed the beneficial effect of an ALA- enriched diet on cardiomyocyte intercalated disk structure and molecular composition; furthermore, it supported the potential use of ω-3 polyunsatured fatty acids in the prevention of potentially dangerous arrhytmias in cardiac diseases. Key words: cardiomyopathy, intercalated disks, ω-3 polyunsatured fatty acids, arrhytmia, connexin 43.

Il presente lavoro di tesi si propone di indagare il deficit di Teoria della Mente (ToM) nella sclerosi multipla (SM). Tale tematica è stata affrontata su due fronti: (1) indagando i meccanismi sottostanti a tale deficit attraverso due studi sperimentali, il primo comportamentale e il secondo di neuroimaging (2) e creando uno strumento di assessment ecologico per la popolazione target. I risultati dimostrano un deficit di mentalizzazione nella SM perlopiù legato alla componente cognitiva della ToM, con una maggiore compromissione nel fenotipo progressivo rispetto al remittente, e una relazione tra ToM e livello cognitivo. Tali evidenze sono confermate dai dati neuro-strutturali, i quali evidenziano un meccanismo di disconnessione, intra- e inter-circuiti neurali della ToM, compromettendo sia i circuiti specifici di ToM sia la comunicazione tra i network di ToM e i loop esecutivi. In ultimo, viene presentato il modello di lavoro adottato per la messa a punto di un nuovo strumento multimediale di screening di ToM, includendo la prima versione della sceneggiatura e degli item del test. Tale implementazione si è basata sul modello di ToM multi-componenziale e sull'intento di presentare diversi contesti di relazione nella vita quotidiana: famiglia, amicizia e relazione romantica.
This thesis aims to investigate the theory of mind (ToM) deficit in multiple sclerosis (MS). This phenomenon has been addressed through a twofold aim: (1) exploring the deficit underlying mechanisms with two experimental studies, a behavioral and a neuroimaging study; (2) creating an ecological assessment tool for this target population. The experimental studies results demonstrate a ToM deficit in MS mostly linked to the cognitive component of ToM, with major damage in the progressive than remitting phenotype, and a relationship between ToM and cognitive level in MS. This evidence is confirmed by neuro-structured data, that highlight a disconnection mechanism, intra- and inter- ToM neural circuits, involving both ToM specific circuits and the communication between ToM network and executive loops. Then, the workflow adopted for the implementation of the new multimedia tool for the ToM screening is presented, including the draft of the screenplay and the test items. The tool implementation grounds on a multi-componential model of ToM and the purpose to present different contexts of relationships in the everyday life: family, friendship and romantic relationship.

In patologia vegetale, un modello epidemiologico è una rappresentazione semplificata delle relazioni tra patogeno, ospite e ambiente che determinano se, quando e come un’epidemia si sviluppa nel tempo. La presente tesi raccoglie lo sviluppo di modelli meccanicistici, dinamici, guidati da variabili ambientali (weather-driven), che possono essere utilizzati per la difesa di precisione dalle principali malattie di frumento e leguminose in rotazione colture. Tramite l’applicazione dell’analisi dei sistemi alle informazioni contenute nella letteratura scientifica, ogni patosistema è stato analizzato e concettualizzato per lo sviluppo teoretico e matematico del modello. I seguenti patogeni sono stati considerati per lo sviluppo dei modelli: i) Ascochyta rabiei agente causale della rabbia (Ascochyta blight) del cece; ii) Puccinia graminis f.sp. tritici agente causale della ruggine nera del grano; iii) Sclerotinia sclerotiorum, una specie polifaga e agente causale di diverse malattie di leguminose e colture industriali (es. marciume bianco di fagiolo e soia, muffa bianca del colza, sclerotiniosi del girasole). La capacità previsionale dei modelli è stata valutata utilizzando dati reali indipendenti raccolti in diversi condizioni ambientali ed epidemiologiche. Dal confronto tra le predizioni e i dati reali di campo, i modelli si sono rivelati accurati e robusti e, quindi, utilizzabili dagli agricoltori nei processi decisionali per la protezione delle colture. La presente tesi contiene anche i risultati di una revisione della letteratura sulle esigenze termiche del genere Colletotrichum, contenente numerosi agenti causali dell’antracnosi di leguminose e diverse colture industriali. L’effetto della temperatura su quattro processi biologici (crescita miceliale, germinazione delle spore, infezione e sporulazione) è stato modellizzato per i maggiori gruppi filogenetici di Colletotrichum spp.. Questo lavoro getta le basi per lo sviluppo di un modello meccanicistico, dinamico, weather-driven generalizzato per Colletotrichum spp. sulla base delle similarità entro i gruppi filogenetici.
A plant disease model is a simplification of the relationships between pathogen, host, and environment that determine whether and how an epidemic develops over time. The present dissertation aims to develop mechanistic, dynamic, weather-driven models, which are suitable to be applied in precision crop protection, for important diseases affecting wheat and legumes in a crop rotation scenario. By exploitation of literature and application of system analysis, information concerning the pathosystem were acquired and analyzed to conceptualize and develop the model both theoretically and mathematically. The following pathogens were considered: i) Ascochyta rabiei causing Ascochyta blight in chickpea; ii) Puccinia graminis f.sp. tritici causing stem (or black) rust of wheat; iii) Sclerotinia sclerotiorum, a polyphagous specie causing diseases in several legumes and industrial crops (e.g., white mold of white bean and soybean, stem rot of canola, head rot of sunflower). Models were evaluated using independent data for their ability to predict the occurrence and development of epidemics, under different environmental conditions. The comparison of model predictions versus real data observed in fields showed that models could be considered accurate and robust and, therefore, they may be used to help growers in making decisions to efficiently protect their crops. The present dissertation contains also results of a literature review carried out on temperature requirements of Colletotrichum spp., which involves several species causing anthracnose on legumes and several industrial crops. Temperature-dependent equations were developed for four biological processes (mycelial growth, germination of spores, spore infection, and spore production) of major phylogenetic clades of Colletotrichum spp.. This work may lay the foundation for the development of a general, mechanistic, dynamic, weather-driven model for Colletotrichum spp. based on the intra-clade similarities.