Thèses sur le sujet « Mitocondriale »

ABSTRACT Mitochondrial DNA is maternally inherited and its copy number can reach thousand per cell. Phatological mutations of human mtDNA have been known for many years and mutant mtDNA molecules frequently co-exist with wild-type copies of mtDNA. The most common point of mutation is adenine to guanine transition at nucleotide position (nt) 3243 of human mtDNA that is associated with the neuromuscular disease MELAS. How deleterious mtDNA mutations become established, and how they wax and wane over the course of the time are matters of intense investigation. Several reports have suggested that mutant mtDNA become fixed purely by the stochastic process of genetic drif. However, recent study in mouse suggest that a purification, selection process, operates in germline to week out deleterious mtDNA variants. The distribution of A3243G mtDNA in patients with mitochondrial disease was found to be non-random in on study. Thus, there is ample evidence that mutant load is not merely determined by random genetic drift. The segregation and transmission of mtDNA is dependent on mitochondrial movement and elimination. Even in non-dividing cells mitochondria are dynamic undergoing fusion and fission; they range from small spherical structures to complex interconnected networks. The extent of the network depends on the balance between elongation and fragmentation of mitochondria. In our laboratory was demonstrated that altering the balance between mitochondrial fission and fusion influences the segregation of mutant and wild-type mtDNA variants, suggesting that the level of mutant and wild-type mitochondrial DNA can be manipulated by alteing expression of nuclear encodedfactors involved in mitochondrial fission and mitochondrial quality control (mtQC). The goals of the project are i) the clarify the relationship between mutant mtDNA segregation and mitochondrial dynamics with a manipulation of the mitochondrialfusion by Mitofusin1 gene silencing and ii) study the autophagic and mitophagic machinery in cells with different proportion of MELAS mutant mtDNA : lung cybrids (0%, 35, 70%, 99% mutant) and muscle cybrids (0%,70%,80%,99%). Since lung (A549 adenocarcinoma) cybrids favour wild-type mtDNA and muscle (RD rhabdomyosarcoma) cybrids favour mutant mtDNA.In this work we have obtained the downregulation of Mfn1 in six clones of RD cybrids harbouring 80% mutant load by using RNAi method.In these clones a decrease of mutant mtDNA molecules wasn’t observed. Autophagywas tested by quantifying expression e protein levels of the autophagic markers LC3 and p62.. We found that both the proteins were well rapresented in both the cells harbouring A3243G mutant mtDNA with different nuclear background , indicating a good autophagy in both cell lines with no differences linked to the nuclear background;. We analysed the sequestration, sorting and elimination of damage mitochondria by quantifying expression and protein level of the mitophagic markers PINK1, Parkin and BNIP3 atmorphological, biochemical and molecular level. All the data demonstrated that in lung cybrids the mitophagy increased with the increase of mutant load, indicating an active elimination of damaged mitochondria. Interesting in muscle cybrids occurred the opposite: the mitophagic process decreased with the increase of mutant load. These data clarify that in muscle background the mutant mtDNA is favored since mitophagy is altered.compare lung cybrids.
RIASSUNTO Il DNA mitocondriale ha una trasmissione matrilineare ed ogni cellula contiene tra le 500 e le 10000 molecole di mtDNA. Le mutazioni patologiche dell’mtDNA umano sono conosciute da numerosi anni ed è noto che le molecole di DNA mitocondriale mutato e wild-type coesistono all’interno della stessa cellula, condizione nota come eteroplasmia. La mutazione puntiforme più comune è la mutazione A3243G nel gene tRNA Leu(UUR) del DNA mitocondriale umano ed è associata alla sindrome MELAS (mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes). In che modo le mutazioni dannose dell’mtDNA si stabilizzino, e come crescano e diminuiscano con il passare del tempo sono argomenti di grande interesse e che richiedono ancora notevole studio. Diversi articoli suggeriscono che il DNA mitocondriale mutato si fissa solamente attraverso un processo stocastico. Comunque studi recenti condotti su topo hanno dimostrato che a livello germinale vi è una purificazione, un processo selettivo, per eliminare le varianti dannose. Ed un altro studio un altro ha evidenziato che la distribuzione della mutazione A3243G nell’mtDNA di pazienti affetti da malattia mitocondriale non era casuale. C’è quindi una forte evidenza che la quantità di mutazione non è solamente determinata da un processo casuale di deriva genetica. La segregazione e la trasmissione dell’mtDNA sono dipendenti dai movimenti mitocondriali e dalla loro eliminazione. Anche in cellule che non si dividono i mitocondri sono organelli dinamici che sottostanno ad eventi di fissione e fusione; essi oscillano da una struttura piccola e sferica ad una complessa rete interconnessa. L’estensione di questa rete dipende dall’equilibrio tra elongazione e frammentazione dei mitocondri. Nel nostro laboratorio è stato dimostrato che perturbando l’equilibrio tra la fissione e la fusione mitocondriale viene influenzata la segregazione dell’mtDNA wild-type e mutato, suggerendo che i livelli di DNA mitocondriale wild-type e mutato possono essere manipolati dall’alterazione dell’espressione di fattori nucleari codificanti per proteine coinvolte nella fissione e nel controllo di qualità mitocondriale (mtQC). Lo studio ha avuto come obbiettivi: i) chiarificare la relazione tra la segregazione dell’mtDNA mutato e la dinamica mitocondriale grazie alla manipolazione della fusione mitocondriale silenziando geneticamente Mitofusina1 e ii) studiare il macchinario autofagico e la mitofagia in cellule con una diversa percentuale di mutazione MELAS dell’mtDNA: cibridi di polmone (0%, 35%, 70% e 99% mutati) e cibridi di muscolo (0%, 70%, 80% e 99% mutati). Poiché i cibridi di polmone (A549 adenocarcinoma polmonare) favoriscono l’mtDNA wild-type e i cibridi di muscolo (RD rabdomiosarcoma) favoriscono il DNA mitocondriale mutato. In questo lavoro abbiamo ottenuto la down regolazione di Mfn1 in sei cloni di cibridi RD con l’80% di mutazione utilizzando la tecnica dell’RNAi. In questi cloni non è stato osservato un decremento delle molecole di mtDNA mutate. L’autofagia è stata analizzata quantificando l’espressione genica e la quantità di proteina dei principali markers quali: p62 e LC3. Abbiamo scoperto che entrambe le proteine sono presenti nelle due linee cellulari con mutazione A3243G dell’ mtDNA e diverso background nucleare, indicando che vi è una buona “auto pulizia” in entrambe le linee cellulari e che non vi sono differenze legate al background nucleare. Abbiamo analizzato anche l’eliminazione specifica dei mitocondri danneggiati, mitofagia, quantificando l’espressione genica e i livelli di proteina di tre markers mitofagici: PINK1, Parkin e BNIP3. Inoltre sono state condotte analisi morfologiche, biochimiche e molecolari sempre per valutare sia l’autofagia che la mitofagia. Tutti i dati dimostrano che nei cibridi di polmone la mitofagia aumenta con l’aumentare del DNA mitocondriale mutato, indicando che vi è una attiva rimozione dei mitocondri danneggiati. Interessante è notare che nei cibridi muscolari si verifica l’opposto: la mitofagia diminuisce all’aumentare della percentuale di mutazione. Questi dati ci spiegano perchè nei cibridi con background muscolare viene favorito il DNA mitocondriale mutato, e mostrano come possibile causa di questo comportamento la presenza di una mitofagia alterata e meno efficiente rispetto a quella dei cibridi con background polmonare.

La catena respiratoria mitocondriale è principalmente costituita da proteine integrali della membrana interna, che hanno la capacità di accoppiare il flusso elettronico, dovuto alle reazioni redox che esse catalizzano, al trasporto di protoni dalla matrice del mitocondrio verso lo spazio intermembrana. Qui i protoni accumulati creano un gradiente elettrochimico utile per la sintesi di ATP ad opera dell’ATP sintasi. Nonostante i notevoli sviluppi della ricerca sulla struttura e sul meccanismo d’azione dei singoli enzimi della catena, la sua organizzazione sovramolecolare, e le implicazioni funzionali che ne derivano, rimangono ancora da chiarire in maniera completa. Da questa problematica trae scopo la presente tesi volta allo studio dell’organizzazione strutturale sovramolecolare della catena respiratoria mediante indagini sia cinetiche che strutturali. Il modello di catena respiratoria più accreditato fino a qualche anno fa si basava sulla teoria delle collisioni casuali (random collision model) che considera i complessi come unità disperse nel doppio strato lipidico, ma collegate funzionalmente tra loro da componenti a basso peso molecolare (Coenzima Q10 e citocromo c). Recenti studi favoriscono invece una organizzazione almeno in parte in stato solido, in cui gli enzimi respiratori si presentano sotto forma di supercomplessi (respirosoma) con indirizzamento diretto (channeling) degli elettroni tra tutti i costituenti, senza distinzione tra fissi e mobili. L’importanza della comprensione delle relazioni che si instaurano tra i complessi , deriva dal fatto che la catena respiratoria gioca un ruolo fondamentale nell’invecchiamento, e nello sviluppo di alcune malattie cronico degenerative attraverso la genesi di specie reattive dell’ossigeno (ROS). E’ noto, infatti, che i ROS aggrediscono, anche i complessi respiratori e che questi, danneggiati, producono più ROS per cui si instaura un circolo vizioso difficile da interrompere. La nostra ipotesi è che, oltre al danno a carico dei singoli complessi, esista una correlazione tra le modificazioni della struttura del supercomplesso, stress ossidativo e deficit energetico. Infatti, la dissociazione del supercomplesso può influenzare la stabilità del Complesso I ed avere ripercussioni sul trasferimento elettronico e protonico; per cui non si può escludere che ciò porti ad un’ulteriore produzione di specie reattive dell’ossigeno. I dati sperimentali prodotti a sostegno del modello del respirosoma si riferiscono principalmente a studi strutturali di elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni non denaturanti (BN-PAGE) che, però, non danno alcuna informazione sulla funzionalità dei supercomplessi. Pertanto nel nostro laboratorio, abbiamo sviluppato una indagine di tipo cinetico, basata sull’analisi del controllo di flusso metabolico,in grado di distinguere, funzionalmente, tra supercomplessi e complessi respiratori separati. Ciò è possibile in quanto, secondo la teoria del controllo di flusso, in un percorso metabolico lineare composto da una serie di enzimi distinti e connessi da intermedi mobili, ciascun enzima esercita un controllo (percentuale) differente sull’intero flusso metabolico; tale controllo è definito dal coefficiente di controllo di flusso, e la somma di tutti i coefficienti è uguale a 1. In un supercomplesso, invece, gli enzimi sono organizzati come subunità di una entità singola. In questo modo, ognuno di essi controlla in maniera esclusiva l’intero flusso metabolico e mostra un coefficiente di controllo di flusso pari a 1 per cui la somma dei coefficienti di tutti gli elementi del supercomplesso sarà maggiore di 1. In questa tesi sono riportati i risultati dell’analisi cinetica condotta su mitocondri di fegato di ratto (RLM) sia disaccoppiati, che accoppiati in condizioni fosforilanti (stato 3) e non fosforilanti (stato 4). L’analisi ha evidenziato l’associazione preferenziale del Complesso I e Complesso III sia in mitocondri disaccoppiati che accoppiati in stato 3 di respirazione. Quest’ultimo risultato permette per la prima volta di affermare che il supercomplesso I+III è presente anche in mitocondri integri capaci della fosforilazione ossidativa e che il trasferimento elettronico tra i due complessi possa effettivamente realizzarsi anche in condizioni fisiologiche, attraverso un fenomeno di channeling del Coenzima Q10. Sugli stessi campioni è stata eseguita anche un analisi strutturale mediante gel-elettroforesi (2D BN/SDS-PAGE) ed immunoblotting che, oltre a supportare i dati cinetici sullo stato di aggregazione dei complessi respiratori, ci ha permesso di evidenziare il ruolo del citocromo c nel supercomplesso, in particolare per il Complesso IV e di avviare uno studio comparativo esteso ai mitocondri di cuore bovino (BHM), di tubero di patata (POM) e di S. cerevisiae.

La catena respiratoria mitocondriale è principalmente costituita da proteine integrali della membrana interna, che hanno la capacità di accoppiare il flusso elettronico, dovuto alle reazioni redox che esse catalizzano, al trasporto di protoni dalla matrice del mitocondrio verso lo spazio intermembrana. Qui i protoni accumulati creano un gradiente elettrochimico utile per la sintesi di ATP ad opera dell’ATP sintasi. Nonostante i notevoli sviluppi della ricerca sulla struttura e sul meccanismo d’azione dei singoli enzimi della catena, la sua organizzazione sovramolecolare, e le implicazioni funzionali che ne derivano, rimangono ancora da chiarire in maniera completa. Da questa problematica trae scopo la presente tesi volta allo studio dell’organizzazione strutturale sovramolecolare della catena respiratoria mediante indagini sia cinetiche che strutturali. Il modello di catena respiratoria più accreditato fino a qualche anno fa si basava sulla teoria delle collisioni casuali (random collision model) che considera i complessi come unità disperse nel doppio strato lipidico, ma collegate funzionalmente tra loro da componenti a basso peso molecolare (Coenzima Q10 e citocromo c). Recenti studi favoriscono invece una organizzazione almeno in parte in stato solido, in cui gli enzimi respiratori si presentano sotto forma di supercomplessi (respirosoma) con indirizzamento diretto (channeling) degli elettroni tra tutti i costituenti, senza distinzione tra fissi e mobili. L’importanza della comprensione delle relazioni che si instaurano tra i complessi , deriva dal fatto che la catena respiratoria gioca un ruolo fondamentale nell’invecchiamento, e nello sviluppo di alcune malattie cronico degenerative attraverso la genesi di specie reattive dell’ossigeno (ROS). E’ noto, infatti, che i ROS aggrediscono, anche i complessi respiratori e che questi, danneggiati, producono più ROS per cui si instaura un circolo vizioso difficile da interrompere. La nostra ipotesi è che, oltre al danno a carico dei singoli complessi, esista una correlazione tra le modificazioni della struttura del supercomplesso, stress ossidativo e deficit energetico. Infatti, la dissociazione del supercomplesso può influenzare la stabilità del Complesso I ed avere ripercussioni sul trasferimento elettronico e protonico; per cui non si può escludere che ciò porti ad un’ulteriore produzione di specie reattive dell’ossigeno. I dati sperimentali prodotti a sostegno del modello del respirosoma si riferiscono principalmente a studi strutturali di elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni non denaturanti (BN-PAGE) che, però, non danno alcuna informazione sulla funzionalità dei supercomplessi. Pertanto nel nostro laboratorio, abbiamo sviluppato una indagine di tipo cinetico, basata sull’analisi del controllo di flusso metabolico,in grado di distinguere, funzionalmente, tra supercomplessi e complessi respiratori separati. Ciò è possibile in quanto, secondo la teoria del controllo di flusso, in un percorso metabolico lineare composto da una serie di enzimi distinti e connessi da intermedi mobili, ciascun enzima esercita un controllo (percentuale) differente sull’intero flusso metabolico; tale controllo è definito dal coefficiente di controllo di flusso, e la somma di tutti i coefficienti è uguale a 1. In un supercomplesso, invece, gli enzimi sono organizzati come subunità di una entità singola. In questo modo, ognuno di essi controlla in maniera esclusiva l’intero flusso metabolico e mostra un coefficiente di controllo di flusso pari a 1 per cui la somma dei coefficienti di tutti gli elementi del supercomplesso sarà maggiore di 1. In questa tesi sono riportati i risultati dell’analisi cinetica condotta su mitocondri di fegato di ratto (RLM) sia disaccoppiati, che accoppiati in condizioni fosforilanti (stato 3) e non fosforilanti (stato 4). L’analisi ha evidenziato l’associazione preferenziale del Complesso I e Complesso III sia in mitocondri disaccoppiati che accoppiati in stato 3 di respirazione. Quest’ultimo risultato permette per la prima volta di affermare che il supercomplesso I+III è presente anche in mitocondri integri capaci della fosforilazione ossidativa e che il trasferimento elettronico tra i due complessi possa effettivamente realizzarsi anche in condizioni fisiologiche, attraverso un fenomeno di channeling del Coenzima Q10. Sugli stessi campioni è stata eseguita anche un analisi strutturale mediante gel-elettroforesi (2D BN/SDS-PAGE) ed immunoblotting che, oltre a supportare i dati cinetici sullo stato di aggregazione dei complessi respiratori, ci ha permesso di evidenziare il ruolo del citocromo c nel supercomplesso, in particolare per il Complesso IV e di avviare uno studio comparativo esteso ai mitocondri di cuore bovino (BHM), di tubero di patata (POM) e di S. cerevisiae.

The mitochondrial genomes (mtDNA) of Tunicata, basal chordates and sister group to vertebrates, seem to follow different evolutionary dynamics to those of other chordates, characterized by many gene rearrangements and accelerated evolutionary rates. In order to investigate the peculiarities of mtDNA evolution in tunicates, we amplified (by long PCR) and completely sequenced the mtDNA of five ascidians: two Stolidobranchia species, Microcosmus sulcatus (Pyuridae) and Styela plicata (Styelidae); two cogeneric Phlebobranchia species, Phallusia mammillata and Phallusia fumigata (Ascidiidae); and a Ciona intestinalis individual isolated in Plymouth, UK. The analyses confirmed previous observations of a high rate of gene rearrangement in these genomes. Furthermore, base compositional variability, shortness of rRNA genes, and absence of a main non-coding region were confirmed as common features of ascidian mitochondrial genomes and indicate that the evolutionary dynamics of ascidian mtDNA markedly diverge from those of vertebrates. Finally, we used a mitogenomic approach to unambiguously demonstrate the existence of two cryptic species in Ciona intestinalis, currently described as a single species. A comprehensive comparative analysis between the mtDNAs of two types of C. intestinalis revealed strong differences in gene order, size/number of non-coding regions, base composition, codon usage, and evolutionary rate of protein-coding genes. All such features are incompatible with intra-specific variability, and concur with the existence of two cryptic species in this model organism. Furthermore, our mitogenomic approach allowed the development of fast diagnostic tests for the discrimination of the cryptic species without recourse to morphological analyses, demonstrating that mtDNA represents an accessible and powerful tool to be used in routine taxonomic analyses.

La tipizzazione del DNA mitocondriale (mtDNA) ha trovato un’importante nicchia nell’analisi forense dei campioni degradati, dei capelli ed al verificarsi dei disastri di massa. Attualmente la maggior parte dei laboratori forensi, che si occupano di mtDNA, si focalizzano sull’informazione che deriva dal sequenziamento delle due regioni ipervariabili (HVI ed HVII), dell’estensione di oltre 600 paia di basi, poste all’interno della Regione di Controllo. Una limitazione dell’analisi del DNA mitocondriale è rappresentata dal basso potere di discriminazione associato ai tipi comuni HVI/HVII: ad esempio nel database forense relativo ai Caucasici Europei ci sono circa 20 tipi comuni HVI/HVII, condivisi da circa il 21% della popolazione ivi rappresentata. Abbiamo sequenziato l’intero genoma mitocondriale di 40 individui Italiani, suddivisi in base alle differenti aree di provenienza (Nord, Centro, Sud ed Isole) al fine di individuare polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs), all’interno della Regione Codificante, utili per una ulteriore discriminazione (nella definizione degli aplogruppi) e, se presente, in relazione alle differenti aree. Abbiamo posto particolare attenzione ai siti condivisi, neutrali e non ridondanti ed abbiamo verificato il riscontro in letteratura. Abbiamo descritto 8 nuovi polimorfismi, 4 mutazioni private che potenzialmente potrebbero essere dei siti discriminanti, un nuovo polimorfismo di lunghezza in HVIII, una nuova inserzione, una nuova delezione e 2 eteroplasmie di sequenza, in precedenza descritte come semplici transizioni; abbiamo individuato 7 individui, caratterizzati da altrettanti aplogruppi particolari, uno dei quali è anche interessante da un punto di vista genetico-medico. La rimanente quantità di variazione individuata è già stata descritta in letteratura e le frequenze concordano con quelle dei Caucasici: una notevole varietà tra gli aplogruppi rappresentati è stata osservata nel Sud Italia, come atteso dal pattern dei flussi migratori. Il nostro lavoro ha mostrato l’enorme variabilità, peraltro insita nel DNA mitocondriale, perfino in un piccolo campione di individui ed ha dimostrato l’utilità degli SNPs nella definizione degli aplotipi individuali, ma nel contempo ha sottolineato l’utilità di potenziare la ricerca nella migliore definizione delle malattie associate al DNA mitocondriale. Dall’altro lato, sostiene fortemente la necessità di migliorare il database forense per il DNA mitocondriale, non soltanto relativamente alla regione di controllo ma anche, come in Gene Bank, relativamente a quella codificante. Questo potrà essere ottenuto incoraggiando l’inserimento delle nuove sequenze prodotte in Gene Bank, ottenute in base alle linee guida standard per l’alta qualità dei dati, che attualmente sono in via di definizione, ed eseguendo il sequenziamento dell’intero genoma mediante tecnologie universali ed innovative (NGS, Next Generation Sequences o tecnologie di Sequenziamento di Prossima Generazione).
Mitochondrial DNA (mtDNA) typing has found an important niche in the forensic testing of degraded samples, hairs and in the evenience of mass disasters. Currently, most forensic mtDNA laboratories focus on sequence information within the two hypervariable regions (HVI and HVII) of >600 bases within the control region. One limitation of mtDNA testing is the low power of discrimination associated with common HVI/HVII types: for example, in the European Caucasian forensic database, there are approximately twenty common HVI/HVII types, matching about twenty-one percent of the population. We have sequenced the entire mtDNA genome of 40 Italian individuals, classified according to the different areas of origin (North, Center, South and Insulae), in order to search for single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the coding region, useful for additional discrimination (in haplogroup defining) and, if any, according to the different areas. In particular, we have payed attention to SNPs which were shared, neutral and non redundant and we have checked for previous descriptions in literature. We have described 8 new polymorphisms, 4 private mutations which could reveal to be useful discriminating SNPs, a new length polymorphism in HVIII, a new insertion, a new deletion and 2 sequence heteroplasmies, previously described as simple transitions; we have identified 7 individuals, harbouring particular haplotypes, one of whom is also interesting by a medical-genetic point of view. The other bulk of variation we have found has already been described and frequencies agree with those of Caucasians: a notable variability among represented haplogroups has been detected in the South of Italy, as could be expected by the pattern of migrations. Our work has shown the enormous variability, which is typical of mtDNA, even in a small sample of individuals and has demonstrated the utility of SNPs in defining the individual haplotypes, but has also pointed out the usefulness of increasing research in better defining mtDNA-associated diseases. On the other hand, it strongly supports the need for the improvement of the forensic database for mitochondrial DNA, not only regarding the control region, but also, as Gene Bank does, regarding the coding region. This may be reached by encouraging the submission of the newly described sequences to Gene Bank, issued according to standard guidelines for high quality data, which are currently been developed, and performing the whole Genome sequencing by universal, new technologies (NGS, Next Generation Sequencing).

MtDNA replication is not limited to the S phase of the cell cycle but takes place also in differentiated cells where nuclear DNA replication has stopped. The cell needs a balanced supply of the four deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP) to replicate and repair its DNA properly. Eukaryotic cells contain two separate pools of dNTPs, a cytosolic-nuclear pool and a mitochondrial pool which are synthesized through two pathways: the cytosolic de novo synthesis and the two salvage pathways. In proliferating cultured cells the canonical cytosolic ribonucleotide reductase (RNR) is the prominent synthetic enzyme that by de novo synthesis provides most of dTTP. Otherwise dTTP can be synthesized by phosphorylation of thymidine to dTMP via the mitochondrial and the cytosolic salvage pathway catalyzed respectively by TK2 and the cytosolic thymidine kinase (TK1). The aim of this work is to clarify the mechanisms involved in dTTP pool metabolism in human cells, focusing on the role of TK2 in quiescent cells. We also investigate the mitochondrial carrier responsible for the exchange of pyrimidine precursors exchange between cytosol and mitochondria.
La replicazione del mtDNA non è limitata alla sola fase S come quella del DNA nucleare, ma avviene per tutta la durata del ciclo cellulare nelle cellule proliferanti e anche nelle cellule quiescenti e differenziate. Perché la sintesi e la riparazione del DNA si svolgano con precisione le cellule devono disporre di dNTP in quantità adeguate e proporzioni corrette. Nelle cellule eucariotiche esistono due pool di dNTP separati ma comunicanti, uno citoplasmatico ed uno mitocondriale e il loro mantenimento avviene attraverso due vie: la sintesi de novo citoplasmatica e le sintesi di recupero citosolica e mitocondriale. Nelle cellule proliferanti il dTTP è sintetizzato sia attraverso la sintesi de novo il cui enzima chiave è la ribonucleotide reduttasi (RNR), sia attraverso le vie citosolica e mitocondriale di recupero dei deossiribonucleosidi, dove la timidina viene fosforilata a dTMP rispettivamente dalla timidina chinasi citosolica (TK1) e dalla TK2. Lo scopo di questo lavoro di dottorato è chiarire i meccanismi coinvolti nel metabolismo del pool del dTTP in cellule umane, ponendo particolare attenzione all’attività enzimatica della TK2 in cellule quiescenti, dove la TK1 non è attiva e all’identificazione del trasportatore responsabile dello scambio dei precursori pirimidinici tra citosol e mitocondri.

Nuclear and mitochondrial DNA replication require a Corrected balance of dNTP. Mutations affecting mitochondrial DNA or factors involved in its replication or maintenance lead to the onset of mitochondrial diseases. The molecular output of these diseases are dysfunctions in the respiratory chain activity with consequent effects on mitochondrial energy production. For these reasons, tissues with high energy requirement, such as liver, brain and muscles, are specifically or preferantially affected. Mitochondrial DNA depletion syndromes (MDS) are one group of diseases characterized by reduction of mtDNA copy number and caused by mutations in nuclear genes. Four of such genes are involved in dNTP synthesis: thymidine phosphorylase (TP), mitochondrial thymidine kinase 2 (TK2), deoxyguanosine kinase (dGK) and the p53 dependent isoform of the small subunit of ribonucleotide reductase (p53R2). Mutated thymidine kinase 2 and deoxyguanosine kinase lead to the myopathic and hepatocerebral form of mitochondrial DNA depletion syndromes, which are severe diseases with an early onset resulting in death during the first year of life. Deoxyguanosine kinase is an enzyme involved in the mitochondrial salvage pathway for dNTP synthesis. It phosphorylates deoxyguanosine, deoxyinosine, deoxyadenosine and deoxycytidine, and a number of different deoxynucleoside analogs. Deoxyguanosine kinase is coded by the gene DGUOK, localized in the nuclear genome, and it is constituted by an omodimer of two identical monomers of 28 kDa each. dGTP pool metabolism is more complex. Deoxyguanosine, dGTP precursor, can be phosphorylated both by deoxycytidine kinase and by deoxyguanosine kinase. Moreover in the cytosol it can also be degraded by the purine nucleoside phosphorylase to guanine and deoxyribose-1-phosphate and then the base can be recycled by hypoxantine-guanine-phosphorybosiltransferase in the ribonucleotide pool and RNA.Results have shown that cytosolic and mitochondrial dGTP pools can communicate and exchange deoxynucleotides, even if they are separated by the mitochondrial membrane. We have observed both movement of guanine deoxynucleotides from the mitochondria to the cytosol and from the cytosol to mitochondria. In this way a dynamic equilibrium arise between the two pools, determined by the synthesis of dGTP and its incorporation into DNA and degradation. Most of the dGTP necessary in cycling and quiescent cells is produced by ribonucleotide reductase activity. The dGTP pool has a rapid turnover, shown by the complete and fast loss of radioactivity from the pools when the isotope was removed from the medium. When we inhibited DNA synthesis by aphidicolin we observed no pool changes, possibly due to an increased degradation of dGTP. Instead blocking ribonucleotide reductase with hydroxyurea, we decreased dGTP turnover leading to radioactivity accumulation in the cytosolic deoxynucleotide pool. All these observations are in agreement with those obtained for the dTTP pools, suggesting that the inferred rules for dNTP synthesis and regulation can be extended also to the other deoxynucleotide pools.
Il corretto bilanciamento del pool dei deossinucleotidi è importante per la replicazione del DNA nucleare e di quello mitocondriale. Mutazioni a carico del DNA del mitocondrio o di fattori necessari alla sua replicazione ed alla sua stabilità provocano l’insorgenza di patologie mitocondriali. Il fenotipo dal punto di vista molecolare è una disfunzione della catena respiratoria, con una ridotta produzione di energia da parte del mitocondrio. Per queste ragioni, i fenotipi clinici osservati nei pazienti affetti da queste patologie coinvolgono organi e tessuti ad alta richiesta energetica, come il fegato, il cervello, e i muscoli scheletrici. Una classe di queste patologie è quella delle sindromi da deplezione del DNA mitocondriale (MDS), nella cui patogenesi sono coinvolte anche mutazioni a carico di geni responsabili della sintesi dei dNTP all’interno della cellula. Tra questi vi sono i geni per la timidina fosforilasi (TP), la timidina chinasi 2 mitocondriale (TK2), la deossiguanosina chinasi (dGK) e un’isoforma della subunità minore della ribonucleotide reduttasi p53 dipendente (p53R2).La deossiguanosina chinasi è uno delle due deossinucleoside chinasi della via mitocondriale di recupero dei dNTP. In particolare, essa fosforila la deossiguanosina, la deossiinosina, la deossiadenosina, e la deossicitidina, oltre a diversi analoghi nucleosidici. La deossiguanosina chinasi è codificata dal gene DGUOK, localizzato nel genoma nucleare, ed è un omodimero costituito da due monomeri di 28 kDa ciascuno. Finora lo studio sul metabolismo dei deossinucleotidi si era concentrato principalmente sul pool del dTTP, il quale è più facile da analizzare visto che il suo precursore timidina viene utilizzato solamente all’interno dle pool dei deossinucleotidi, dalla timidina chinasi 1 nel citosol e dalla timidina chinasi 2 nel mitocondrio. Lo studio del pool del dGTP, invece, è più complesso in quanto il suo precursore, la deossiguanosina, può essere fosforilata nel citosol dalla deossicitidina chinasi, e nel mitocondrio dalla deossiguanosina chinasi, ma può anche essere velocemente degradata a guanina nel citosol, dalla fosforilasi dei nucleosidi purinici. La base viene poi riciclata dall’enzima ipoxantina-guanina-fosforibosiltransferasi ed incorporata nel pool dei ribonucleotidi e nell’RNA. Per poter seguire l’incorporazione della deossiguanosina nel dGTP attraverso la sola via di recupero abbiamo dovuto inibire con l’Immucillina H la degradazione citosolica da parte della fosforilasi dei nucleosidi purinici, ed utilizzare cellule mutanti nell’enzima ipoxantina-guanina-fosforibosiltransferasi, così da evitare il riciclo della guanina nel pool dei ribonucleotidi. Solamente in queste condizioni è stato possibile seguire l’incorporazione del precursore nei pool del dGTP e quindi nel DNA. il pool citosolico e mitocondriale del dGTP comunicano e si scambiano nucleotidi. É stato osservato un movimento bidirezionale di deossinucleotidi dal mitocondrio verso il citosol, e viceversa. Questo scambio favorisce l’instaurarsi di un equilibrio dinamico tra i due compartimenti, determinato dalla continua sintesi di dGTP e dalla incorporazione nel DNA oppure dalla sua degradazione ed eliminazione. In esperimenti di pulse e chase abbiamo osservato che il pool del dGTP ha un turnover molto rapido che comporta una completa perdita in pochi minuti della radioattività incorporata nel pool citosolico e mitocondriale.Abbiamo anche valutato gli effetti dell’inibizione della sintesi del DNA nucleare attraverso l’aggiunta di afidicolina e dell’inibizione della sintesi de novo tramite trattamento con l’idrossiurea, inibitore specifico della ribonucleotide reduttasi. Gli esperimenti con afidicolina hanno dimostrato che nonostante il dGTP non venga incorporato nel DNA esso non si accumula nel pool ma viene degradato ed eliminato velocemente. Nel caso invece dell’idrossiurea, l’inibizione della ribonucleotide reduttasi provoca un accumulo di radioattività nei deossinucleotidi della guanina nel citosol dovuta ad una riduzione del turnover del dGTP. Le informazioni sugli scambi tra citosol e mitocondri e sull’importanza della sintesi de novo per il rifornimento dei dNTP mitocondriali ricavte da questi esperimenti con la deossiguanosina sono in accordo con quelle raccolte in precedenza per il pool del dTTP, così da poter concludere che esse rappresentano leggi generali che regolano la sintesi e regolazione dei pool dei dNTP e sono valide per tutti e quattro i deossinucleotidi.

Intere sequenze di DNA mitocondriale sono state analizzate da 151 individui rappresentativi della popolazione Mongola, attraverso Next Generation Sequencing e metodo di Sanger, che attualmente rappresenta il metodo gold-standard. Non sono state osservate importanti discrepanze al confronto tra i due sistemi analitici che risultano sovrapponibili, fatta eccezione per l'interpretazione delle C-stretches. E' stata inoltre confrontata in parallelo, la risoluzione genetica in termini di "potere discriminativo" tra l'intera sequenza del DNA mitocondriale e la sola regione di controllo. L'analisi dell'intero genoma mostra un maggiore rapporto di "Random Match Probability", utile nei database a scopo genetico-forense, che permette anche una maggiore risoluzione all'interno delle linee filogenetiche principali. Il vantaggio offerto dal sequenziamento NGS nella capacità di analizzare vaste regioni genomiche in un tempo ristretto ed a basso costo, viene attualmente sfruttata nella ricerca bio-medica. A causa dell'elevata sensibilità strumentale, la sua applicazione anche nel campo genetico-forense richiede tuttavia l'allestimento di corrette linee guida per l'interpretazione dei risultati.
Whole mtDNA sequence from 151 individuals representative of Mongolian population was analyzed by the innovative technology of Next Generation Sequencing, and by Sanger method which actually represents the gold-standard.We observed a global high level of consistency between the two techniques. Discrepancies were found mainly in C-strecthes interpretation.In the same time we also compared the genetic resolution in terms of "power of discrimination" between the whole mitochodrial genome, and the coding region only. As expected, the whole genome analysis show a major ratio of "Random Match Probability", useful in database for forensic genetics purpose, also allowing a major dissection of the most common philogenetic lines. The main advantage offered by NGS analyzing wide genomic regions in short time with lower expenses compared to Sanger sequencing, it is largely exploited in many bio-medical research fields, and it might be soon a reality also in forensic genetics. Nonetheless, its application will require guidelines for correct interpretation due to the high instrumental sensitivity.

Numerosi dati sperimentali dimostrano che la disfunzione mitocondriale è coinvolta in molti disordini neurodegenerativi. I mitocondri rappresentano il sito di inizio del danno nei disordini neurodegenerativi e queste evidenze si basano parzialmente sul decremento dell attività dei complessi della catena respiratoria nella malattia di Parkinson, nella malattia di Alzheimer, e nella malattia di Huntington. Nel 1972 Harman propose che i mitocondri avessero un ruolo centrale nei processi di invecchiamento. Secondo questa teoria, i radicali liberi, considerati i fattori primari di stress ossidativo, generati attraverso il metabolismo mitocondriale, possono causare funzioni anormali e morte cellulare, L ossidazione delle proteine e dei lipidi altera l omeostasi redox e porta all accumulo di proteine unfolded o misfolded nel cervello. Il morbo di Parkinson, la malattia di Alzheimer e l atassia di Friedreich sono malattie neurologiche che hanno come comune denominatore la produzione di proteine anomale. La disfunzione mitocondriale e lo stress ossidativo contribuiscono alla patogenesi delle così dette malattie delle proteine conformazionali. Uno dei principali sistemi redox intracellulari coinvolti nella neuroprotezione è il sistema dei vitageni. I vitageni codificano per la heat shock protein (Hsp) Hsp-70, l emeossigenasi-1, la tioredoxina reduttasi e le sirtuine. Studi nutrizionali dimostrano che l invecchiamento negli animali può essere significativamente influenzato da una restrizione della dieta. La qualità della vita (lifespan) aumenta, poiché i vari tessuti, nelle malattie, possono essere protetti riducendo l energia d entrata, con il controllo della restrizione calorica o con il digiuno ad intermittenza. Il ruolo neuroprotettivo di antiossidanti dietetici, quali il curcumino, l acetyl-L-carnitina e la carnosina è stato dimostrato attraverso l attivazione di queste vie intracellulari redox-sensibili. I vitageni potrebbero quindi rappresentare importanti targets per nuove strategie terapeutiche. La modulazione dei pathways di stress cellulare e la ricerca di strategie neuroprotettive, mediante interventi di tipo farmacologico ed alimentare, potrebbe avere un ruolo fondamentale nel trattamento delle malattie neurodegenerative.

Il complesso dell’Uniporto Mitocondriale del Calcio è una struttura multiproteica composta dal canale selettivo al calcio (MCU) e da una serie di proteine accessorie, tra cui MICU1, MICU2 ed EMRE. L’attività integrata e sinergica di queste proteine, presenti a livello della membrana mitocondriale interna, è fondamentale per la sottile regolazione dell’ingresso del calcio nella matrice mitocondriale al fine di sostenere la bioenergetica cellulare e regolare la risposta apoptotica. Allo scopo di assolvere questi compiti anche il turnover cellulare di tutte le componenti del complesso deve essere altamente regolato in modo da evitare l’instaurarsi di condizioni patologiche associate alla deregolazione del calcio mitocondriale; i meccanismi coinvolti nella degradazione di queste proteine mitocondriali non sono ancora noti. Questo lavoro di tesi ha messo alla luce una degradazione rapida e selettiva di MICU1, regolatore positivo del complesso dell’Uniporto Mitocondriale del Calcio, da parte del sistema di degradazione citosolico Ubiquitina-Proteasoma (UPS). Come potenziale candidato coinvolto in questa regolazione viene identificata la E3 ubiquitina-ligasi Parkin (PARK2), le cui mutazioni sono causa di forme autosomiche recessive ad insorgenza precoce di Parkinson. A sostegno di ciò l’overespressione di Parkin induce una netta diminuzione dei livelli basali di MICU1. I risultati ottenuti evidenziano inoltre un’interazione fisica tra Parkin e MICU1 ed è interessante notare che la presenza del dominio Ubl sembra essere fondamentale per la degradazione di questo regolatore di MCU suggerendone il coinvolgimento nei meccanismi di autoinibizione basale di Parkin. I dati sostengono quindi un modello in cui Parkin, l’E3 ubiquitina-ligasi associata al Parkinson, è coinvolta nella degradazione selettiva di MICU1, questa regolazione contribuisce alla modulazione dei segnali mitocondriali di calcio evidenziando come alterazioni nella capacità dei mitocondri di captare calcio possono contribuire all’insorgenza del Parkinson.
The mitochondrial Ca2+ uniporter machinery is a multiprotein complex composed by the Ca2+selective pore-forming subunit mitochondrial uniporter (MCU) and accessory proteins, including MICU1, MICU2 and EMRE. Their concerted action at the inner mitochondrial membrane is required to fine-tune the uptake of Ca2+ into the matrix to sustain cell bioenergetics and to regulate the apoptotic response. To fulfill such requirements, and to avoid the many cell-type dependent pathological conditions associated with impaired mitochondrial Ca2+ handling, the intracellular turnover of all the components must also be tightly regulated. However, the mechanism(s) and the players involved in this process are still unknown. This work shows that the MCU complex regulator MICU1 is rapidly and selectively turned-over by the Ubiquitin Proteasome System (UPS). Moreover, the multifunctional E3 ubiquitin ligase Parkin (PARK2), whose mutations cause autosomal recessive early-onset Parkinson’s disease (PD), was identified as a potential candidate involved in this regulation since its upregulation strongly decreases the MICU1 basal levels. Parkin was also found to interact with MICU1 and, interestingly, the presence of the Ubl-domain is required for the Parkin-mediated degradation of MICU1, suggesting that it may play a role in the basal auto-inhibited state. These findings support a model in which the PD-related E3 ubiquitin ligase Parkin participates in the selective regulation of the MCU complex regulator MICU1, thus contributing to shape the mitochondrial Ca2+ signals and supporting the notion that impairments in the ability of mitochondria to take up Ca2+ might contribute to the pathogenesis of PD.

Abstract in italiano Background: La Sindrome delle Apnee Ostruttive del Sonno (OSAS) è una malattia associata con l’aumento del rischio cardiovascolare ed è caratterizzata da episodi ripetuti di ipossia intermittente (IH) durante il sonno, che induce lo stress ossidativo e l’infiammazione sistemica. I mitocondri sono organelli cellulari coinvolti nella respirazione cellulare e contengono un proprio materiale genetico, il DNA mitocondriale (MtDNA). Lo scopo di questo studio è quello di valutare se l’aumento dello stress ossidativo nei pazienti OSAS può indurre un’alterazione dell’MtDNA. Materiali e Metodi: 46 pazienti OSAS (età 59.27 ± 11.38; BMI 30.84 ± 3.64; AHI 36.63 ± 24.18) sono stati confrontati con 36 soggetti di controllo (età 54.42 ± 6.63; BMI 29.06 ± 4.7; AHI 3.8 ± 1.10). Nelle cellule del sangue il contenuto del DNA Mitocondriale (MtDNA) e del DNA nucleare (nDNA) è stato amplificato e quantificato nei pazienti OSAS mediante la Real-Time qPCR. Il rapporto tra MtDNA/nDNA è stato poi calcolato. La presenza dello stress ossidativo è stata valutata dai livelli dei Metaboliti Reattivi dell’Ossigeno (ROMs), misurati con il d-ROMs test. Risultati: Il rapporto MtDNA/nDNA era più alto nei pazienti OSAS rispetto al gruppo di controllo (150.94 ± 49.14 vs 128.96 ± 45.8; p = 0.04), il livello dei ROMs era anche più alto nei soggetti OSAS (329,71 ± 70,17 vs 226.0 ± 36,76; p = 0,04) ed è stato positivamente correlato con l’MtDNA/nDNA (R = 0.5, p <0.01). Conclusioni: Nei pazienti OSAS vi è un danno del DNA mitocondriale indotto dall’aumento dello stress ossidativo. L’ipossia intermittente sembra essere il principale meccanismo che porta a questo processo. Abstract in english Background: Obstructive Sleep Apnea (OSAS) is a disease associated with the increase of cardiovascular risk and it is characterized by repeated episodes of Intermittent Hypoxia (IH) which inducing oxidative stress and systemic inflammation. Mitochondria are cell organelles involved in the respiratory that have their own DNA (MtDNA). The aim of this study was to investigate if the increase of oxidative stress in OSAS patients can induce also MtDNA alterations. Methods: 46 OSAS patients (age 59.27 ± 11.38; BMI 30.84 ± 3.64; AHI 36.63 ± 24.18) were compared with 36 control subjects (age 54.42 ± 6.63; BMI 29.06 ± 4.7; AHI 3.8 ± 1.10). In blood cells the content of MtDNA and nuclear DNA (nDNA) was measured in OSAS patients by Real Time PCR. The ratio between MtDNA/nDNA was then calculated. The presence of oxidative stress was evaluated by levels of Reactive Oxygen Metabolites (ROMs), measured by diacron reactive oxygen metabolite test (d-ROM test). Results: MtDNA/nDNA was higher in patients with OSAS than in the control group (150.94 ± 49.14 vs 128.96 ± 45.8; p = 0.04), the levels of ROMs were also higher in OSAS subjects (329.71 ± 70.17 vs 226.0 ± 36.76; p = 0.04) and they were positively correlated with MtDNA/nDNA (R = 0.5, p < 0.01). Conclusions: In OSAS patients there is a Mitochondrial DNA damage induced by the increase of oxidative stress. Intermittent hypoxia seems to be the main mechanism which leads to this process.

Resistance to chemotherapeutic agents is well known in patients with hepatocarcinoma. Inhibition of the mitochondrial permeability transition pore (PTP) is a crucial step in tumor cell resistance to apoptosis induced by anticancer drugs. Since SERPINB3 is overexpressed in hepatocellular carcinoma and has an anti-apoptotic activity, aim of the study was to assess the role of this serpin on PTP modulation during treatment with chemotherapeutic agents. HepG2 cells stably transfected with SERPINB3 where assayed for cell death induced by Cisplatin, Doxorubicin, Etoposide and 5-Fluorine Uracil. Reactive Oxygen Species (ROS) were detected with dichlorofluorescein. Threshold of PTP opening was evaluated by CRC assay and Complex I activity was determined by spectrophotometric assay. After cell death induction by Cisplatin and Doxorubicin, HepG2 cells expressing SERPINB3 showed a significant increase in viability compared to controls, while there was no difference in cell death after Etoposide and 5-FU treatments. The addition of the antioxidant N-acetyl cysteine abrogated cell death induction by Cisplatin and Doxorubicin, suggesting that SERPINB3 protects from death through an antioxidant activity. Since Cisplatin and Doxorubicin induce mitochondrial oxidative stress and favor PTP opening, cells were treated with the PTP inducer EM20-25 that acts at mitochondrial level. In presence of SERPINB3 the effect of EM20-25 resulted in PTP opening inhibition and decreased ROS formation. Subcellular localization analysis revealed that a fraction of SERPINB3 was located in mitochondria and that it increased after death-promoting treatments. Mitochondrial SERPINB3 was found associated to respiratory chain Complex I by immunoprecipitation experiments. In vitro analysis confirmed the inhibition by SERPINB3 of Complex I activity, known as one of the main sources of mitochondrial ROS. In conclusion, SERPINB3 acts at mitochondrial level protecting cells from chemotherapeutic-induced oxidative stress and consequent cell death. This antioxidant function could represent a relevant advantage for a transformed cell to balance its ROS equilibrium and for SB3-expressing cells exposed to anticancer treatments.
L'epatocarcinoma (HCC) è la quinta forma di cancro più diffusa nel mondo ed è caratterizzato da un'alta proliferazione cellulare e da un'alta resistenza ai trattamenti chemioterapici. Negli ultimi anni l'associazione tra la ov-serpina SERPINB3 (precedentemente conosciuta anche come SCCA1) e la progressione della patologia epatica e lo sviluppo di HCC si è fatta sempre più stretta, portando ad ipotizzare che questa proteina possa giocare un ruolo importante nella biologia del tumore epatico. SERPINB3 è in grado di inibire la morte cellulare in sistemi cellulari di tipo epiteliale, ma non si conosce ancora il suo esatto meccanismo d'azione molecolare né la sua funzione nel fegato. Lo scopo dello studio è stato verificare il ruolo di SERPINB3 nella morte cellulare indotta da trattamenti chemioterapici in un modelli epatici sperimentali e di indagarne l'azione a livello molecolare. Esprimendo SERPINB3 in una linea di epatoma (HepG2), si è messo in evidenza come la presenza della proteina riduce la morte cellulare dopo trattamento con Cisplatino e Doxorubicina, ma non dopo trattamento con Etoposide o 5-FluoroUracile. Esperimenti successivi hanno documentato come la resistenza alla morte sia associata ad un diminuito stress ossidativo, definito come riduzione dei livelli di ROS, nelle cellule che esprimono SERPINB3. E' stato dimostrato che la diminuzione dei livelli di ROS si associa alla presenza di SERPINB3 a livello mitocondriale. Utilizzando l'EM20-25, un composto che fa parte della famiglia dei chemioterapici BH3-mimetici, è stato confermato che la protezione viene conferita a livello mitocondriale in quanto viene diminuita l'attività del Complesso I della catena respiratoria con conseguente diminuzione dei livelli di ROS. Questo meccanismo molecolare è stato confermato mediante la documentazione dell'inibizione del Poro di Transizione di Permeabilità mitocondriale da parte di SERPINB3, che è considerato un regolatore chiave dell'innesco della morte cellulare. Dato che SERPINB3 non è presente nel fegato sano, ma la sua espressione progressivamente aumenta in corso di infiammazione cronica e di cirrosi, la sua azione antiossidante, inizialmente protettiva, potrebbe contribuire alla sopravvivenza di cellule trasformate e allo sviluppo di tumore. Nell'ambito dell'epatocarcinoma SERPINB3 potrebbe contribuire alla resistenza ai trattamenti chemioterapici, nota caratteristica di questa forma tumorale epatica.

La superossido dismutasi (SOD) è un enzima antiossidante, presente in tutti gli eucarioti, che svolge la funzione di difendere la cellula dall anione superossido. Nonostante siano state descritte 3 isoforme diverse, la Cu-Zn SOD, o SOD1 è l isoforma più abbondante nel citosol. Negli ultimi anni l interesse verso lo studio di questa proteina è cresciuto sempre di più, dal momento che diverse mutazioni della proteina sono state ritrovate in tessuti di pazienti affetti da sclerosi laterale amiotrofica (SLA), una patologia neurodegenerativa, che colpisce i motoneuroni del sistema nervoso. Oltre alla funzione antiossidante, sono state descritte altre funzioni per la proteina SOD1. Nel lievito S.cerevisiae, SOD1 è coinvolta nella regolazione della repressione del metabolismo mitocondriale, in quanto la cellula che cresce su glucosio utilizza quasi esclusivamente la fermentazione per la produzione di energia, reprimendo la respirazione ossidativa. Inoltre recentemente è stato dimostrato che SOD1 può agire da attivatore della trascrizione di geni coinvolti nella difesa allo stress ossidativo e nella riparazione del DNA. Il metabolismo respirativo che avviene all interno del mitocondrio, è in gran parte favorito dalla presenza della proteina VDAC1 (Voltage Dependent Anion Channel). Essa, localizzata sulla membrana mitocondriale esterna, assicura la sua permeabilità, favorendo gli scambi di metaboliti e ioni tra il mitocondrio e il citosol. In S.cerevisiae la delezione del gene che codifica per questa proteina (ceppo ?por1) causa scompensi nella funzionalità del mitocondrio, a tal punto che la cellula non è più in grado di crescere e riprodursi utilizzando il glicerolo come fonte di carbonio, proprio perché non è in grado di effettuare la respirazione mitocondriale. Tale difetto, può essere recuperato dall espressione eterologa di proteine omologhe appartenenti a specie diverse, tra cui quella umana, a conferma della conservazione della proteina durante il processo evolutivo. Alla luce delle evidenze descritte, in questo lavoro è stata posta l attenzione sulla funzione che la SOD1 svolge all interno del metabolismo mitocondriale mediato da VDAC1 per comprendere il delicato ruolo di cooperazione svolto dalle due proteine all interno della cellula. È importante precisare l origine e il modo con cui è stato ottenuto il ceppo protagonista di questa tesi di dottorato, ovvero il ceppo ?por1 che esprime la proteina umana SOD1. Questo ceppo, era stato generato come il controllo di un esperimento in cui ?por1 era stato trasformato contemporaneamente con le sequenze codificanti la proteina umana VDAC1 e la proteina SOD1 wild type o mutanti coinvolti nella SLA. Attraverso l osservazione e lo studio del ceppo co-trasformato si voleva studiare l effetto che le proteine SOD1 mutanti avevano sul metabolismo mitocondriale mediato da VDAC1, al fine di individuare una possibile interazione funzionale tra le due proteine. La successiva analisi fenotipica del ceppo controllo ?por1 trasformato con hSOD1 umana ha permesso di osservare un inattesa e sorprendente ripresa della crescita su glicerolo, che ha subito dato avvio alla ricerca del meccanismo coinvolto. Gli studi scaturiti, dimostrano che l espressione di hSOD1 recupera la funzionalità mitocondriale del ceppo ?por1, modulando l espressione delle proteine della membrana mitocondriale esterna e incrementando la quantità dei mitocondri e le copie di mt-DNA. Tale ceppo, inoltre, presenta un caratteristico rimodellamento della struttura della parete cellulare, che la rende più resistente all azione di agenti chimici. Infine è stata caratterizzata l isoforma yVDAC2, risultata la più espressa tra le proteine ß-barrel della membrana mitocondriale esterna nel ceppo ?por1 trasformato con hSOD1. Questa proteina, ad oggi poco conosciuta, si è rivelata in grado di formare canali in membrane lipidiche artificiali seppur con qualche differenza rispetto all isoforma principale yVDAC1.

OPA1 is a protein with pleiotropic functions ranging from the orchestration of mitochondrial fusion and cristae remodeling to transcriptional reprogramming 1, 2. Here we present two different mechanisms by which OPA1 exerts a transcriptional regulation activity in endothelial and breast cancer cells. Mitochondria are dynamic organelles that are now recognized as regulators of signal transduction able to impact on cellular genetic programs 3, 4. Increasing evidence support a fundamental role for mitochondrial shape in the orchestration of cellular transcriptional programs, but how cells sense and respond to changes in mitochondrial shape is unclear 5. We recently discovered that angiogenesis is transcriptionally modulated by the key mitochondrial fusion gene OPA1 through NFκB activation1. In particular, ablation of OPA1 in vivo and in vitro leads to developmental and tumor angiogenesis inhibition 1. A deep RNA sequencing analysis identified a signature for the Ras-proximate-1 RAP1, and its cyclic AMP (cAMP)-activated nucleotide exchange factor EPAC1 upon OPA1 deletion in Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs). Previously, several studies had reported the essential role of Rap1 in developmental angiogenesis and vessel stabilization 6, 7. After birth, Rap1 is not essential, but it participates in the maintenance of vasculature and nitric oxide (NO) homeostasis 6, 8. Albeit EPAC1 is highly abundant and cover numerous functions in endothelial cells, its role in angiogenesis remained to be clarified 9. Likewise, EPAC1 was shown to be important for endothelial cells biology 10, 11. A handful of studies retrieved EPAC1 in mitochondria, and RAP1 in mitochondria associated membranes (MAMs) by proteomics, suggesting that they might be linked to mitochondria 12, 13. Whether the EPAC1/RAP1 axis could sense changes in mitochondria driven by OPA1 deletion was unknown. Our results show that EPAC1 and RAP1 localize in proximity to mitochondria and in MAMs, that are emerging as hubs for mitochondria-derived signals. Moreover, EPAC1 accumulates on mitochondria upon pharmacological activation and following OPA1 silencing. OPA1 silencing results in an increase in Ca2+ and in localized cAMP increase in proximity of mitochondria that in turn activated EPAC1 and therefore RAP1. Notably, Ca2+ chelation by BAPTA-AM treatment suppress the EPAC1/RAP1 activation elicited by OPA1 downregulation. Furthermore, the analysis of angiogenic parameters like migration and tubulogenesis revealed that the blockage of EPAC1 and RAP1 signaling could correct the defects caused by OPA1 downregulation. Thus, our work places EPAC1/RAP1 in the retrograde signaling pathway connecting mitochondria to angiogenesis and highlights the intricate network of signals and second messengers that can execute transcriptional changes when mitochondria are perturbed.
OPA1 is a protein with pleiotropic functions ranging from the orchestration of mitochondrial fusion and cristae remodeling to transcriptional reprogramming 1, 2. Here we present two different mechanisms by which OPA1 exerts a transcriptional regulation activity in endothelial and breast cancer cells. Mitochondria are dynamic organelles that are now recognized as regulators of signal transduction able to impact on cellular genetic programs 3, 4. Increasing evidence support a fundamental role for mitochondrial shape in the orchestration of cellular transcriptional programs, but how cells sense and respond to changes in mitochondrial shape is unclear 5. We recently discovered that angiogenesis is transcriptionally modulated by the key mitochondrial fusion gene OPA1 through NFκB activation1. In particular, ablation of OPA1 in vivo and in vitro leads to developmental and tumor angiogenesis inhibition 1. A deep RNA sequencing analysis identified a signature for the Ras-proximate-1 RAP1, and its cyclic AMP (cAMP)-activated nucleotide exchange factor EPAC1 upon OPA1 deletion in Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs). Previously, several studies had reported the essential role of Rap1 in developmental angiogenesis and vessel stabilization 6, 7. After birth, Rap1 is not essential, but it participates in the maintenance of vasculature and nitric oxide (NO) homeostasis 6, 8. Albeit EPAC1 is highly abundant and cover numerous functions in endothelial cells, its role in angiogenesis remained to be clarified 9. Likewise, EPAC1 was shown to be important for endothelial cells biology 10, 11. A handful of studies retrieved EPAC1 in mitochondria, and RAP1 in mitochondria associated membranes (MAMs) by proteomics, suggesting that they might be linked to mitochondria 12, 13. Whether the EPAC1/RAP1 axis could sense changes in mitochondria driven by OPA1 deletion was unknown. Our results show that EPAC1 and RAP1 localize in proximity to mitochondria and in MAMs, that are emerging as hubs for mitochondria-derived signals. Moreover, EPAC1 accumulates on mitochondria upon pharmacological activation and following OPA1 silencing. OPA1 silencing results in an increase in Ca2+ and in localized cAMP increase in proximity of mitochondria that in turn activated EPAC1 and therefore RAP1. Notably, Ca2+ chelation by BAPTA-AM treatment suppress the EPAC1/RAP1 activation elicited by OPA1 downregulation. Furthermore, the analysis of angiogenic parameters like migration and tubulogenesis revealed that the blockage of EPAC1 and RAP1 signaling could correct the defects caused by OPA1 downregulation. Thus, our work places EPAC1/RAP1 in the retrograde signaling pathway connecting mitochondria to angiogenesis and highlights the intricate network of signals and second messengers that can execute transcriptional changes when mitochondria are perturbed.

Induction of chronic oxidative stress by hepatitis C (HCV) and B (HBV) virus is one of the molecular events leading to hepatocellular carcinoma (HCC) development. Telomeres are prone to oxidative modifications, that induce a progressive telomere shortening and a consequent chromosomal instability. Telomerase activity plays a crucial role in telomeres maintenance and cell immortalization. TERT, the rate limiting factor for telomerase transcription, is regulated by epigenetic mechanism and under oxidative stress migrates to mitochondria, where it ameliorates the membrane stability and exerts an anti-apoptotic role. The aim of the study was to investigate the complexmolecular networkunderlying virus-related liver carcinogenesis, evaluating: 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG), a marker of oxidative DNA damage, and OGG1 gene, telomere length, telomerase activity, TERT promoter methylation and mitochondrial TERT translocation. One hundred sixty-two patients were investigated: 21with HCC (bothtumor and peritumoral tissue samples), 71 with chronic hepatitis HCV-related and 35 with chronic hepatitis HBV-related and 15 controls. Eight-OHdG was quantified through HPLC-EC, telomerase activity and telomeres length by Real Time PCR, TERT promoter methylation status by Quantitative Methylation Specific PCR and mitochondrial TERT translocation by western blotting. Overall, 8-OHdG levels were significantly higher in tumor tissues than in controls (p=0.02), telomeres were significantly shorter in HCC compared to the less advanced stages of disease (p=0.01), whereas telomerase activity was significantly higher in tumor tissues than in controls (p=0.01). Eight-OHdG levels inversely correlated with telomere length in HCC. Overall, TERT promoter was hypermethylated in HCC and peritumoral tissue samples (p=0.0001). When the patients were subgrouped on the basis of etiology, HBV-related liver damage progression was characterized by later 8-OHdG accumulation and a pronounced telomerase activation limited to HCC tissue. TERT was localized in mitochondria in all the investigated HCC samples and, in mitochondria DNA, 8-OHdG levels were significantly lower than in genomic DNA (p=0.0003). These data describe a complex network in which oxidative DNA damage is linked to changes in telomeres length, extent of telomerase activation and higher methylation of TERT promoter in HBV/HCV related carcinogenesis. The role of mitochondrial TERT in HCC is open to debate, but an intriguing work hypothesis is that it could down-regulate apoptosis.
Lo stress ossidativo e le specie reattive dell’ossigeno (ROS), la cui sintesi è indotta dal danno epatico causato dai virus delle epatiti C (HCV) e B (HBV), sono in grado di scatenare la cascata di eventi molecolari che portano allo sviluppo del carcinoma epatocellulare (HCC). I telomeri sono siti elettivi di attacco da parte dei ROS, che inducono un loro progressivo accorciamento e una conseguente instabilità cromosomica. L’attività della telomerasi gioca un ruolo cruciale nel mantenimento dei telomeri e nell’immortalizzazione cellulare. TERT, il fattore limitante per la trascrizione della telomerasi, è regolato da meccanismi epigenetici e in condizioni di stress ossidativo può migrare ai mitocondri, dove sembra migliorare la stabilità della membrana ed esercitare una funzione anti-apoptotico. Lo scopo di questo studio è stato quello di indagare la complessa rete molecolare alla base della carcinogenesi epatica ad eziologia virale mediante la valutazione:  della presenza dell’8-idrossideossiguanosina (8-OHdG), marker di danno ossidativo al DNA, mediante HPLC-EC, e del polimorfismo del gene di riparazione (OGG1);  della lunghezza dei telomeri e dell'attività della telomerasi mediante Real-Time-PCR;  dello stato di metilazione del promotore di TERT mediante PCR quantitativa specifica;  dell’eventuale traslocazione mitocondriale di TERT mediante western blotting. In questo studio sono stati esaminati 162 pazienti di cui 21 con HCC (di questi pazienti sono stati analizzati sia i campioni di tessuto tumorale che peritumorale), 71 con epatite cronica HCV-correlata, 35 con epatite cronica HBV-correlata e 15 controlli. In generale, considerando i pazienti tutti insieme, i dati ottenuti hanno mostrato livelli di 8-OHdG significativamente più alti nei tessuti tumorali rispetto ai controlli (p=0.02); i telomeri sono risultati significativamente più corti negli HCC rispetto agli altri gruppi con stadio di malattia meno avanzato (p=0.01), mentre l'attività della telomerasi è risultata significativamente più elevata nei tessuti tumorali rispetto ai controlli (p=0.01). Negli HCC i livelli di 8-OHdG sono risultati inversamente correlati con la lunghezza telomerica. Nelle nostre analisi il promotore di TERT è risultato essere ipermetilato nel carcinoma epatico e nei campioni di tessuto peritumorale (p=0.0001). Inoltre, è’ interessante notare che, quando i pazienti sono stati suddivisi in base all’eziologia virale, è stato possibile verificare come la progressione del danno epatico correlato all’HBV sia caratterizzato da un accumulo di 8-OHdG più tardivo e che caratterizza le fasi più avanzate, rispetto a quello indotto da HCV e, successivamente, da una attivazione della telomerasi limitata, però, al solo tessuto tumorale. Infine la proteina TERT è stato localizzata nei mitocondri di tutti i campioni di HCC esaminati, dove è stato dimostrato non avere attività telomerasica, e, nel DNA mitocondriale (mtDNA), i livelli di 8-OHdG sono risultati significativamente più bassi rispetto a quelli valutati nel DNA genomico (p=0.0003). Questi dati descrivono una complessa rete di eventi nella carcinogenesi epatica HBV/HCV correlata in cui il danno ossidativo al DNA è legato a cambiamenti nella lunghezza dei telomeri, all’attivazione della telomerasi e ad un’aumentata metilazione del promotore di TERT. Infine, il ruolo di TERT a livello mitocondriale nell’HCC è ancora argomento di discussione, ma un'ipotesi interessante riguarda il suo potenziale coinvolgimento nella possibile regolazione dell’apoptosi.

Background and aim: It has been hypothesized the existence of an impairment in mitochondrial function among the several effects that may be implicated in the pathogenesis of obesity, insulin resistance and their progression towards type 2 diabetes. Furthermore, insulin resistance is associated with a reduction in mitochondrial content and eNOS enzymatic activity. Physical exercise has been shown to induce important physiological adaptations, involving not only skeletal and cardiac muscle, but also vascular and metabolic systems. Two major events induced by physical activity are the induction of eNOS gene expression and the increase of tissue nitric oxide production, which in turn could influence mitochondrial biogenesis and glucose uptake. All these aspects suggest to further study the mechanisms involved in physical exercise-inducing mitochondrial biogenesis and nitric oxide production in order to better understand the cellular signalling and the gene expression regulation. I studied the effects of chronic aerobic exercise in different tissues obtained from eNOS-/- mice in terms of evaluation of biochemical parameters, mitochondrial biogenesis and capability of glucose uptake and I studied the effects of the treatment with a nitric oxide donor (DETA-NONOate) on HL-1 and 3T3-L1 cells in terms of mitochondrial biogenesis and glucose uptake. Materials and Methods: I performed a biochemical analysis, an expression analysis of genes involved in mitochondrial biogenesis, a mtDNA quantification and an analisys of the capability of glucose uptake in different tissues obtained from eNOS-/- and wild type mice after a 6 weeks period of exercise training. I set up a protocol for an in vitro treatment with a nitric oxide donor (DETA-NONOate 100µM for 72 hours) of HL-1 cardiomyocites and 3T3-L1 adipocytes and then I performed a gene expression analysis, a measurement of the capability of basal and insulin stimulated glucose uptake, an immunofluorescence analysis of mitochondrial biogenesis and a quantification of GLUT4 translocation after insulin stimulation. Results and conclusions: I observed an increase in gene expression, mtDNA content and capability of both basal and insulin-stimulated glucose uptake in different tissues obtained from wild type but not eNOS-/- mice after the exercise training protocol. In cells treated with DETA-NONOate I observed an increase in gene expression, mitochondrial biogenesis, capability of basal and insulin- stimulated glucose uptake and GLUT4 translocation compared to those without treatment. These results suggest that nitric oxide is a key molecule in the regulation of energy balance and glucose metabolism, and it may be involved in the activation of mitochondrial function and biogenesis. Further studies are needed to better clarify the role of NO and mitochondrial biogenesis in the pathogenesis of cardiovascular abnormalities linked with obesity and type 2 diabetes.
Stato dell'arte e scopo della tesi: Tra i differenti meccanismi implicati nella patogenesi dell'obesità , della resistenza insulinica e della loro progressione verso il diabete di tipo 2 è stata ipotizzata l'esistenza di un danno della funzione mitocondriale. Inoltre l'insulino resistenza è associata ad un ridotto contenuto mitocondriale e ad una riduzione dell'attività  dell'enzima eNOS che si presume essere il primo fattore implicato nella catena di signalling. Partendo dal presupposto che l'esercizio fisico aumenta la sensibilità  insulinica e la produzione di ossido nitrico, e che l'ossido nitrico è in grado di stimolare la biogenesi mitocondriale si è voluto analizzare se l'aumento della sensibilità  insulinica e della mitocondriogenesi mediato dall'esercizio fisico fosse correlato al metabolismo dell'ossido nitrico. Durante il mio dottorato di ricerca mi sono occupata dello studio degli effetti dell'esercizio fisico in alcuni tessuti di topi eNOS-/- in seguito a un protocollo di allenamento cronico di tipo aerobico. Ho studiato questi effetti in termini di dosaggi plasmatici, espressione genica e aumento del DNA mitocondriale e capacità  di captazione del glucosio in tessuto cardiaco, muscolare e adiposo. Mi sono inoltre occupata della valutazione degli effetti della somministrazione di ossido nitrico su cellule in coltura, cardiomiociti HL1 e adipociti 3T3-L1. Materiali e Metodi: Ho eseguito analisi biochimche mediante saggi enzimatici e misurazioni di parametri endocrino-metabolici, analisi di espressione genica, quantificazione di mtDNA e della capacità  di captazione di glucosio in diversi tessuti ottenuti da topi eNOS-/- e wild type dopo un periodo di 6 settimane di allenamento. Ho allestito un protocollo per il trattamento in vitro con un donatore di ossido nitrico (DETA-NONOato 100µM per 72 ore) su cellule HL-1 e 3T3-L1 e in seguito ho valutato l'espressione genica, la capacità  di captazione del glucosio sia in condizioni basali che insulino stimolate, l'analisi in immunofluorescenza della biogenesi mitocondriale e la traslocazione del trasportatore GLUT4 di queste cellule. Risultati e conclusioni: Ho osservato un aumento dell'espressione genica, del contenuto di mtDNA e della capacità  di captazione del glucosio in diversi tessuti dei topi wild type ma non di quelli eNOS-/- in seguito al periodo di allenamento. Nelle cellule trattate con DETA-NONOato ho osservato un aumento dell'espressione genica, della biogenesi mitocondriale, della capacità di captazione di glucosio sia basale che insulino-stimolata e della traslocazione di GLUT4 rispetto alle cellule di controllo che non erano state sottoposte al trattamento. Questi risultati suggeriscono che l'ossido nitrico abbia un ruolo chiave nella regolazione del bilancio energetico e del metabolismo del glucosio e confermano un suo coinvolgimento nell'attivazione della biogenesi mitocondriale. Saranno necessari ulteriori studi per indagare ulteriormente il suo ruolo nella patogenesi di complicanze cardiovascolari legate all'obesità  e al diabete di tipo 2.

We have characterized the mitochondrial and cellular effects of two molecules identified by Genextra's S.p.A from a chemical library by high throughput screening (HTS) designed to identify novel inhibitors of the mitochondrial permeability transition pore (PTP). The screening, based on in vitro calcium-induced mitochondrial swelling, yielded several PTP inhibitory compounds and two of them, CngPtP003 and CngPtP006, have been selected for the present study. We studied the inhibitory properties of CngPtP003 and CngPtP006 on PTP in isolated mouse liver mitochondria with the Calcium Retention Capacity (CRC) assay, and the inhibitory profiles compared with those displayed by the well known PTP inhibitor cyclosporin A (CsA). From this first set of experiments we confirmed that both compounds are PTP inhibitors with different biological potency and efficacy, and that their molecular targets are not the same as that of CsA, with which both compounds displayed additive effects. In a second set of experiments we studied the mitochondrial effects of CngPtP003 and CngPtP006 in intact HeLa cells with the tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) assay, which measures the mitochondrial membrane potential. We found that only CngPtP003 is able to protect the cells from the depolarization and from cell death caused by the PTP inducer arachidonic acid. Lack of inhibition by CngPtP006 data has been confirmed both in HeLa isolated mitochondria and in several human permeabilized cell lines, indicating that the inhibitory properties of CngPtP006 are limited to mouse mitochondria, which were used in the primary screening. These results validate the HTS approach for the identification of novel PTP inhibitors, whose suitability for drug development is currently under investigation.

Il danno mitocondriale è associato a molte malattie neurodegenerative, quali: Parkinson, Alzheimer e Sclerosi Laterale Amiotrofica. Queste malattie sono associate anche a cambiamenti di isoforme tramite splicing alternativo di alcuni geni. In questo lavoro dimostriamo che il danneggiamento mitocondriale modula lo splicing alternativo in maniera generale. Cellule di neuroblastoma umano sono state incubate con l’agente chimico paraquat (una neurotossina che danneggia i mitocondri e crea stress ossidativo) e analizzate mediante RT-PCR per il pattern di splicing di 13 geni. Tutti gli mRNAs soggetti a splicing alternativo mostrano un’incremento dell’isoforma più piccola in maniera dose e tempo dipendente. Al contrario degli esoni alternativi, gli esoni costitutivi non cambiano dopo induzione con il paraquat. Dai dati ottenuti usando altre droghe, si evince che la modulazione dello splicing alternativo è correlata con il danno mitocondriale e la conseguente mancanza di ATP. Linee cellulari non neuronali non mostrano gli stessi cambiamenti nello splicing, indicando una selettiva suscettibilità delle cellule neuronali. Dato che una significativa percentuale di mRNAs di mammiferi è sottoposta a splicing alternativo, abbiamo ipotizzato che il danneggiamento mitocondriale causi uno squilibrio tra le varie isoforme dando un importante contributo alla neurodegenerazione. Con lo scopo di identificare eventuali targets farmacologici, abbiamo cercato di capire quale sia la via di trasduzione del segnale che trasmette lo stress mitocondriale al macchinario dello splicing. Due classi di proteine determinano la selezione dei siti di splicing: la famiglia delle proteine SR e la famiglia delle proteine hnRNP; entrambe regolate dalla fosforilazione, che è importante per la loro attività. Le proteine hnRNP ed SR sono state purificate da cellule di neuroblastoma umano di controllo e trattate con paraquat e studiate mediante un approccio sub-proteomico. Mentre le proteine hnRNPs non mostrano cambiamenti, le proteine SR sembrano essere down regolate e defosforilate in seguito a trattamento con il paraquat. Infine, utilizzando diversi inibitori che coinvolgono diversi pathway presenti nella cellula, abbiamo dimostrato che il calcio ha un ruolo nella via di trasduzione del segnale che stiamo osservando. I dati ottenuti non sono ancora conclusivi, ma sicuramente hanno dimostrato una correlazione fra la neurodegenerazione e lo splicing alternativo e hanno posto le basi per capire il modo in cui lo splicing alternativo è modulato nei neuroni in risposta a stimoli esterni.
Mitochondrial damage is linked to many neurodegenerative deseases, such as Parkinson, Alzheimer and Amyotrophic Lateral Sclerosis. These diseases are linked to changes in the splicing pattern of individual mRNAs. Here, we test the hypothesis that mitochondrial damage modulates alternative splicing, not only of a few mRNAs, but in a general manner. We incubated cultured human neuroblastoma cells with the chemical agent paraquat (a neurotoxin that interferes with mitochondrial function, causing energy deficit and oxidative stress) and analysed the splicing pattern of 13 genes by RT-PCR. For each alternatively spliced mRNA, we observed a dose and time dependent increase of the smaller isoforms. In contrast, splicing of all constitutive exons we monitored did not change after paraquat treatment. In addition, we prove that the modulation of alternative splicing by using different drugs correlates with ATP depletion, not with oxidative stress. Such drastic changes in alternative splicing haven’t been observed in cell lines of non-neuronal origin, suggesting a selective susceptibility of neuronal cells to modulation of splicing. Since a significant percentage of all mammalian mRNAs undergoes alternative splicing, we predict that mitochondrial failure will unbalance a large number of isoform equilibriums, thus permitting an important contribution to neurodegeneration. To identify possible drug targets, we tried to understand which is the signal trasduction trasmitting the mitochondrial damage to the splicing machinery. Two classes of proteins determine splice site selection: the hnRNP and the SR proteins. Both of them are phosphorylated and phosphorylation is important for their activity. We have purified hnRNPs and SR proteins from both paraquat-treated and human neuroblastoma control cells and we have studied them with a sub-proteomic approach. While the maps of paraquat-treated and control hnRNPs do not show up significant modifications, the SR proteins appear hypophosphorylated and downregulated by paraquat treatment. Finally, using different inhibitors involving different pathways in the cell, we demonstrate that calcium has a role in the signal trasduction that we are observing. The obtained data are not yet conclusive, but certainly have shown us a correlation between the neurodegeneration and Alternative Splicing. They have laid down the foundation for understanding the way by which the Alternative Splicing is modulated in neurons depending on external stimuli.

Mitochondrial DNA (mtDNA), in contrast to nuclear DNA, undergoes a continuous turnover and replicates throughout the cell cycle. Cells need a balanced supply of deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) to replicate and repair their DNA properly. Mammalian cells contain two separate pools of dNTPs, a cytosolic-nuclear pool and a mitochondrial pool, which are in communication and are synthesized through two pathways: cytosolic de novo synthesis and the salvage pathway (two parallel pathways, one cytosolic and one mitochondrial). In proliferating cells dTTP is predominantly provided by the S-phase specific de novo synthesis catalyzed by ribonucleotide reductase (RNR) in the form R1/R2 and secondarily by the cytosolic salvage pathway, where thymidine is phoshporylated into dTMP by the action of cytosolic thymidine kinase (TK1). Inside cells, TK1 has a 100-fold higher activity compared to mitochondrial thymidine kinase (TK2), this is why TK1 has a main role in the salvage of thymidine during S-phase. In the synthesis of dTTP anabolic reactions are counterbalanced by catabolic ones, catalyzed by thymidine phosphorylase (TP), that degrades thymidine to deoxyuridine, and by the cytosolic (cdN) and the mitochondrial (mdN) deoxynucleotidases, that convert dTMP to thymidine building up a regulatory substrate cycle with TK1 and TK2 respectively. Both TK1 and the R2 subunit of RNR are cell-cycle regulated and undergo proteolytic degradation in late mitosis. In non-cycling cells de novo synthesis is reduced to about 2% as compared to the rate of synthesis during proliferation and depends on R1/p53R2, while TK2 is the only enzyme responsible for the salvage synthesis of dTTP. As a result of these changes both cytosolic and mitochondrial pools are ten-fold lower in quiescent mammalian cells. Thus dNTPs production changes in parallel with the reduced consumption of DNA precursors, limited to mtDNA synthesis (a small percentage compared to the total DNA content of the cell). In this context the roles of TK2 and p53R2 become more relevant in non-cycling cells and this is confirmed by the existence of mtDNA depletion syndromes (MDS) linked to mutation in either TK2 or p53R2 genes. MDS are a group of autosomal recessive disorders, clinically heterogeneous and characterized by reduced copy numbers of mtDNA. MDS show marked tissue-specificity and affect post-mitotic cells. Mutations in genes involved in dNTP metabolism or in mtDNA replication have been found to cause MDS. Genetic inactivation of TK2 or p53R2 is linked to myopathic MDS, which primarily affects skeletal muscle. The pathology is attributed to a dNTP pools imbalance in the affected tissues. The aim of my work is to explore the metabolic mechanisms which could account for the muscle vulnerability in TK2 and p53R2 deficiencies. In the first part I studied quiescent cultures of TK2-mutated skin fibroblasts isolated from two patients affected by myopathic MDS. My purpose was to assess if cell types not affected by TK2 mutations are endowed with some mechanism of compensation that buffers the effects of the genetic deficiency. In the second part I studied differentiated culture of muscle cells in order to understand what makes muscle so vulnerable to genetic inactivation of TK2 or p53R2. By comparing these two cellular models we aimed to find out differences that could account for the tissue-specificity observed for the mutations in these genes. In cycling cells dTTP synthesis is not affected by TK2- or p53R2-deficiency because dTTP is primarily synthesized in the cytosol by R1/R2 and TK1. For this reason I performed my experiments in quiescent or differentiated cultures, where dTTP pool depends exclusively on TK2 activity and R1/p53R2 de novo synthesis. Quiescence in skin fibroblasts can be obtained by shifting the medium of confluent cultures from 10% to 0.1% serum and keeping them in these conditions for at least 10 days before performing the experiments. I studied quiescent cultures of two lines of skin fibroblasts obtained from patients (Pa and Pb) that are compound heterozygotes and harbored two different pairs of TK2 mutations (T77M/R161K and R152G/ K171del). I compared them with two wild-type lines coming from biopsies obtained from healthy subjects of corresponding ages. I measured TK2 enzymatic activity in cellular extracts. Patient cells contained 5% (Pa) or 40% (Pb) residual TK2 activity. However, the marked reduction in TK2 activity did not affect the dNTP pools: both cytosolic and mitochondrial dTTP pools were unchanged and also the overall composition of dNTP pools was normal. Looking for possible mechanisms that could compensate TK2 deficiency in the mutant lines, I measured the enzymatic activities of thymidine phosphorylase, and the two deoxynucleotidases cdN and mdN and I evaluated the expression of the three RNR subunits both by real-time PCR and western blot analysis. I did not find any sign of metabolic adaptation in the mutated cells, such as a down-regulation of catabolic pathways or an up-regulation of de novo R1/p53R2 synthesis. When I compared the dynamics of the dTTP pool in mutated and control fibroblasts by incubating the cells with radioactive thymidine, in striking contrast to the low TK2 activity measured in cell extracts, the mutated cells phoshporylated thymidine as efficiently as the wild-type cells. By pulse-chase experiment I compared dTTP turnover in control and patient cells and I found that the control cells in vivo synthesized dTTP with the same efficiency as the mutant cells, i.e. at a rate 10-fold lower than that observed in TK2 enzymatic assays. The expression of TK2 increases when wild-type cultured fibroblasts become quiescent (Rampazzo et al., 2007), but the enzyme does not work at its full potential. These data show that a small fraction of such potential TK2 activity is sufficient to maintain the dTTP pools of wild-type fibroblasts. In the mutants, however, the in situ (in cultured cells) and in vitro (in protein extracts) rates of TK2 activity coincide, and by fully exploiting their TK2 complement, the cells preserve their dTTP pools, which might explain the lack of mtDNA depletion in these cells (Frangini et al., 2009). C2C12 mouse myoblasts can be induced to differentiate by shifting them to a 2% horse serum medium (differentiation medium): myoblasts become post-mitotic myocytes and fuse into multinucleated cells called myotubes, which exhibit spontaneous contraction. Differentiated cultures of C2C12 cells contain a significant fraction of mononucleated cells whose dNTP pool sizes and enzymatic setup differ from those of multinucleated myotubes. I set up a protocol for the separation of myotubes and myoblasts from differentiated cultures. The purity of the fractions was evaluated by measuring TK1 activity (expected to be present in mononucleated cells only) and the expression of muscle-specific proteins, myogenin and myosin (characteristic of myotubes). The latter parameter was also an index of the degree of differentiation within experiments. Thanks to this procedure I obtained a fraction of differentiated myotubes with a minimal contamination by mononucleated unfused cells. I first characterized the dNTP metabolism in these cells by measuring the expression of the key anabolic and catabolic enzymes, the activity of the enzymes of dTTP salvage synthesis and the composition of the four total dNTP pools. I focused on all the changes that take place at the onset of a post-mitotic status. A clear difference between muscle cells and fibroblasts was an exceedingly low activity of TK2 in the former that did not increase at differentiation (in fibroblasts at the onset of quiescence there is a 3-fold induction). This cellular model was compared to mouse skeletal muscle by microarray analysis. The results show a strict similarity between the expression profiles of the enzymes of dNTP metabolism. So, we decided to use this cellular system to reproduce in vitro the myopathic phenotype of MDS linked to TK2 or p53R2 deficiencies. I set up a protocol for transfection with Stealth siRNA (Invitrogen) that combines transfection and differentiation and obtained 80-90% and 60-70% silencing for p53R2 and TK2, respectively. As a result of mitochondrial biogenesis during myogenesis, differentiating C2C12 cells usually show a 7-8 fold mtDNA expansion with differentiation. The evaluation of the mtDNA content by quantitative realtime PCR revealed 50% mtDNA depletion in TK2-silenced myotubes at only 4 days of differentiation, while in p53R2 silenced cells the first sign of mtDNA depletion appeared at the 8th day of differentiation. Also TK2-/- (Zhou et al., 2008; Akman et al., 2008) and p53R2-/- (Kimura et al., 2003) mice differ for the time of onset of the pathological phenotype, the former show the first symptoms 7 days after birth, while the latter only after 8 weeks. Even if these are preliminary experiments, we can say that we obtained a cellular model for myopathic MDS that showed mtDNA depletion in vitro. We did not find indications for a mechanism of transcriptional compensation for TK2 and p53R2 deficiencies in the expression of key enzymes of dNTP metabolism. The preliminary pool determination in the silenced myotubes do not allow to draw conclusions on the molecular basis of the observed phenotype. The experiments must be repeated. In particular the transfection procedure decreases the efficiency of myotube purification, affecting the reproducibility between experiments. We need to improve the procedure of sample preparation for the extraction of nucleotide pools from the transfected muscle cells, in order to reduce the variability in dNTP content. More investigation are also needed to clarify the molecular phenotype of silenced myotubes.
Il DNA mitocondriale (mtDNA), a differenza di quello nucleare, è sottoposto ad un continuo turnover e si replica lungo tutto il ciclo cellulare. Affinché la sintesi e la riparazione del DNA avvengano correttamente è necessario che vi sia un apporto bilanciato di deossiribonucleosidi trifosfato (dNTP). Le cellule di mammifero contengono due pool di dNTP separati, uno citosolico e uno mitocondriale, che si trovano in comunicazione tra loro e il cui mantenimento avviene attraverso due vie di sintesi: la via de novo e la via di recupero citosolica e mitocondriale. Nelle cellule proliferanti il dTTP è sintetizzato principalmente nel citosol attraverso la via de novo il cui enzima chiave è la ribonucleotide reduttasi (RNR), in fase S costituita dalle subunità R1/R2, e in misura minore dalla via di recupero di deossiribonucleosidi, dove la timidina viene fosforilata a dTMP dalla timidina chinasi citosolica (TK1). All’interno delle cellule la TK1 ha un’attività cento volte superiore a quella della timidina chinasi mitocondriale (TK2) e perciò il suo ruolo è predominante nella sintesi di recupero della timidina in fase S. Le vie anaboliche sono bilanciate dalle vie cataboliche catalizzate dalla timidina fosforilasi (TP), che degrada la timidina a deossiuridina, e dalle deossinucleotidasi citosolica (cdN) e mitocondriale (mdN), che convertono il dTMP in timidina costituendo un substrate cycle regolativo rispettivamente con la TK1 e la TK2. Sia la subunità R2 della RNR che la TK1 sono regolate con il ciclo cellulare e subiscono una degradazione proteolitica in tarda mitosi. Nelle cellule non ciclanti la sintesi de novo si riduce ad un 2% di quella presente in condizioni di proliferazione e dipende da R1/p53R2, mentre la timidina chinasi mitocondriale, TK2, è l’unico enzima responsabile della fosforilazione della timidina nella sintesi di recupero del dTTP. Il risultato di questa riorganizzazione comporta un ridimensionamento dei pool nucleotidici citoplasmatici e mitocondriali, che si riducono entrambi di circa 10 volte nelle cellule di mammifero quiescenti. In questo modo le cellule ricalibrano la produzione dei dNTP in funzione del ridotto consumo di precursori, limitato alla replicazione del mtDNA (una piccola percentuale rispetto al DNA totale). In questo contesto i ruoli della TK2 e di p53R2 assumono notevole rilevanza e ciò è dimostrato dal fatto che mutazioni in questi enzimi causano patologie caratterizzate da deplezione del mtDNA (sindromi da deplezione del mtDNA o MDS). Esse rappresentano una classe di malattie mitocondriali ereditarie, a trasmissione autosomica recessiva, clinicamente eterogenea e caratterizzata da una riduzione quantitativa del numero di copie di mtDNA e sono causate da mutazioni in geni nucleari codificanti proteine coinvolte nel metabolismo dei dNTP o nella replicazione del mtDNA. Le MDS sono caratterizzate da un’elevata tessuto-specificità e interessano tessuti differenziati, dove le cellule non sono in attiva proliferazione. L’inattivazione genica della TK2 o di p53R2 è correlata all’insorgenza di una forma miopatica di MDS, in cui il muscolo è il principale tessuto colpito. La patologia è stata aattribuita ad uno sbilanciamento dei pool dei dNTP nei tessuti affetti. Lo scopo del mio lavoro di dottorato è quello di individuare le basi molecolari che determinano la tessuto-specificità nelle MDS miopatiche dovute a mutazioni della TK2 o di p53R2. Nella prima parte mi sono dedicata allo studio di colture quiescenti di fibroblasti di pelle provenienti da pazienti con deficienza della TK2. Il mio obiettivo era quello di capire se nei tipi cellulari non colpiti dalla miopatia, come i fibroblasti, ci fossero dei meccanismi di compensazione in grado di tamponare gli effetti di una ridotta attività della timidina chinasi mitocondriale. Nella seconda parte mi sono dedicata allo studio di un modello di cellule muscolari differenziate in coltura, per cercare di individuare che cosa rende il tessuto muscolare così vulnerabile all’inattivazione di TK2 e p53R2. Nel confronto di questi due modelli cellulari abbiamo mirato all’individuazione di elementi divergenti che potessero costituire punti di fragilità del muscolo rispetto a una deficienza genetica delle due proteine. In cellule proliferanti la deficienza della TK2 o di p53R2 è ininfluente per il mantenimento del pool mitocondriale del dTTP, prodotto principalmente nel citosol attraverso l’attività di R1/R2 e della TK1. Di conseguenza ho eseguito tutti gli esperimenti in colture quiescenti o differenziate, in cui il mantenimento del pool del dTTP è garantito dall’attività della TK2 e della via de novo catalizzata da R1/p53R2. In questo contesto i ruoli della TK2 e di p53R2 assumono notevole rilevanza e ciò è dimostrato dal fatto che mutazioni in questi enzimi causano patologie caratterizzate da deplezione del mtDNA (sindromi da deplezione del mtDNA o MDS). Esse rappresentano una classe di malattie mitocondriali ereditarie, a trasmissione autosomica recessiva, clinicamente eterogenea e caratterizzata da una riduzione quantitativa del numero di copie di mtDNA e sono causate da mutazioni in geni nucleari codificanti proteine coinvolte nel metabolismo dei dNTP o nella replicazione del mtDNA. Le MDS sono caratterizzate da un’elevata tessuto-specificità e interessano tessuti differenziati, dove le cellule non sono in attiva proliferazione. L’inattivazione genica della TK2 o di p53R2 è correlata all’insorgenza di una forma miopatica di MDS, in cui il muscolo è il principale tessuto colpito. La patologia è stata aattribuita ad uno sbilanciamento dei pool dei dNTP nei tessuti affetti. Lo scopo del mio lavoro di dottorato è quello di individuare le basi molecolari che determinano la tessuto-specificità nelle MDS miopatiche dovute a mutazioni della TK2 o di p53R2. Nella prima parte mi sono dedicata allo studio di colture quiescenti di fibroblasti di pelle provenienti da pazienti con deficienza della TK2. Il mio obiettivo era quello di capire se nei tipi cellulari non colpiti dalla miopatia, come i fibroblasti, ci fossero dei meccanismi di compensazione in grado di tamponare gli effetti di una ridotta attività della timidina chinasi mitocondriale. Nella seconda parte mi sono dedicata allo studio di un modello di cellule muscolari differenziate in coltura, per cercare di individuare che cosa rende il tessuto muscolare così vulnerabile all’inattivazione di TK2 e p53R2. Nel confronto di questi due modelli cellulari abbiamo mirato all’individuazione di elementi divergenti che potessero costituire punti di fragilità del muscolo rispetto a una deficienza genetica delle due proteine. In cellule proliferanti la deficienza della TK2 o di p53R2 è ininfluente per il mantenimento del pool mitocondriale del dTTP, prodotto principalmente nel citosol attraverso l’attività di R1/R2 e della TK1. Di conseguenza ho eseguito tutti gli esperimenti in colture quiescenti o differenziate, in cui il mantenimento del pool del dTTP è garantito dall’attività della TK2 e della via de novo catalizzata da R1/p53R2. Nei fibroblasti la quiescenza è stata indotta in colture confluenti riducendo la percentuale di siero nel mezzo di coltura dal 10% allo 0.1% e mantenendo le cellule in condizioni quiescenti per 10 giorni, prima di eseguire gli esperimenti. Ho studiato colture quiescenti di due linee di fibroblasti di pelle provenienti da pazienti (Pa e Pb), genotipicamente distinti, portatori di mutazioni in eterozigosi nel gene della TK2 (T77M/R161K e R152G/ K171del). Le due linee di pazienti sono state confrontate con due linee di fibroblasti di controllo (Ca e Cb) provenienti da biopsie di soggetti sani di età corrispondente. Ho misurato l’attività enzimatica della TK2 negli estratti cellulari. Le cellule dei pazienti mostrano una notevole riduzione di attività TK2, gli estratti Pa hanno un’attività TK2 più bassa (circa il 5% dei controlli) rispetto agli estratti Pb (circa il 40% dei controlli). Tuttavia a questa riduzione di attività enzimatica della TK2 non corrisponde uno sbilanciamento dei pool dei dNTP: le dimensioni dei pool citosolici e mitocondriali del dTTP sono paragonabili a quelle dei controlli e anche la composizione dei pool dei quattro dNTP non subisce modificazioni. Ricercando possibili meccanismi che potessero compensare la deficienza della TK2 nelle linee mutanti, ho misurato le attività enzimatiche della timidina fosforilasi e delle deossinucleotidasi e l’espressione delle tre subunità della RNR, valutata a livello di mRNA mediante real-time PCR e a livello proteico mediante western blot. Nelle linee mutate non ho ritrovato meccanismi di adattamento metabolico quali una riduzione delle vie cataboliche o una maggior dipendenza dalla via de novo di R1/p53R2. Confrontando le dinamiche del pool del dTTP nei mutanti e nei controlli, in esperimenti di marcatura con timidina triziata, ho osservato che nonostante la ridotta attività TK2 i mutanti fosforilano il precursore con la stessa efficienza dei controlli. Dall’analisi del turnover del dTTP, attraverso esperimenti di pulse-chase, risulta che le cellule di controllo sintetizzano il dTTP in situ con la stessa efficienza delle cellule mutate, ad un tasso 10 volte inferiore a quello misurato nei saggi enzimatici eseguiti negli estratti proteici. L’espressione della TK2 aumenta in fibroblasti di pelle wild-type quiescenti (Rampazzo et al., 2007), ma l’enzima sembra lavorare a livelli inferiori alle sue potenzialità. Dai risultati ottenuti in questo mio lavoro, una piccola percentuale dell’attività potenziale della TK2 sembra venga effettivamente utilizzata per mantenere il pool del dTTP nei fibroblasti wild-type. Nelle cellule mutanti, invece, i tassi di fosforilazione in vitro (in estratti proteici) e in situ (in colture cellulari) non differiscono. Si potrebbe pensare che queste cellule siano in grado di mantenere adeguati livelli del pool del dTTP sfruttando completamente la loro attività TK2 residua. Ciò spiegherebbe l’assenza di deplezione del mtDNA riscontrata in queste linee mutate (Frangini et al., 2009). Nella linea di mioblasti murini C2C12 si può indurre il differenziamento sostituendo il terreno di coltura con un mezzo al 2% di siero di cavallo (terreno di differenziamento) : i mioblasti diventano miociti post-mitotici e si fondono in sincizi multinucleati detti miotubi, che esibiscono attività contrattile. Tuttavia, colture differenziate di C2C12 contengono una frazione significativa di cellule mononucleate, in cui la quantità di dNTP e l’assetto enzimatico differiscono rispetto ai miotubi differenziati. Ho quindi messo a punto un protocollo che permette di separare la frazione di miotubi da quella di mioblasti a partire da una coltura differenziata. La purezza delle frazioni è stata valutata misurando l’attività enzimatica della TK1 (marcatore di cellule proliferanti) e l’espressione di proteine muscolo-specifiche, la miogenina e la miosina, da cui si può stimare il grado di differenziamento. Grazie a questo protocollo di purificazione sono riuscita ad ottenere una frazione di miotubi differenziati in cui la presenza di cellule mononucleate non fuse è minimizzata. Ho quindi svolto una caratterizzazione dei miotubi misurando l’espressione degli enzimi coinvolti nelle vie biosintetiche dei deossinucleotidi, l’attività enzimatica degli enzimi della sintesi di recupero del dTTP e la composizione dei pool cellulari totali dei quattro dNTP. Ho preso in esame in particolare le modificazioni che si instaurano con il differenziamento dei mioblasti in miotubi, alla ricerca di eventuali differenze rispetto a quanto già osservato in fibroblasti di pelle al passaggio dalla proliferazione alla quiescenza. La differenza che spicca maggiormente da questo confronto è la presenza di un’attività molto bassa della TK2, che non aumenta con il differenziamento (nei fibroblasti che entrano in quiescenza aumenta invece di circa 3 volte). Dal confronto del modello mioblasti/miotubi con il muscolo scheletrico, effettuato in collaborazione con un altro laboratorio mediante analisi di microarray, è emersa una stretta similarità tra i profili di espressione dei geni del metabolismo dei dNTP nei miotubi e nel muscolo. Abbiamo quindi deciso usare questo modello cellulare per simulare in vitro le MDS miopatiche correlate a mutazioni di p53R2 e della TK2. Ho messo a punto un protocollo di trasfezione con siRNA Stealth (Invitrogen) che combinasse trasfezione e differenziamento ottenendo un silenziamento dell’80-90% per p53R2 e del 60-70% per la TK2. Nelle C2C12 in coltura il differenziamento determina un’espansione del numero di copie del mDNA di circa 7-8 volte rispetto ai mioblasti proliferanti, in conseguenza della stimolazione della biogenesi mitocondriale che accompagna la miogenesi. La quantificazione del mtDNA mediante real-time PCR quantitativa nei miotubi silenziati per la TK2 mostra una deplezione di circa il 50% a soli 4 giorni di differenziamento; quando è p53R2 ad essere silenziata, gli effetti sul mtDNA iniziano a manifestarsi all’ottavo giorno di differenziamento. Una differenza temporale nella manifestazione fenotipica è stata osservata anche tra i topi TK2-/- (Zhou et al., 2008; Akman et al., 2008) e p53R2-/- (Kimura et al., 2003), i primi iniziano a mostrare sintomi a 7 giorni dalla nascita, mentre i secondi a 8 settimane. Da questi esperimenti preliminari di silenziamento possiamo affermare di aver ottenuto un modello cellulare per le MDS miopatiche in cui si osserva deplezione del mtDNA. Non emergono indicazioni a favore di un meccanismo di compensazione trascrizionale per la deficienza di p53R2 e TK2 nell’espressione dei geni del metabolismo dei dNTP. Le prime determinazioni dei pool dei dNTP nelle colture silenziate non ci hanno permesso finora di chiarire le basi molecolari del fenotipo osservato. Gli esperimenti andranno sicuramente ripetuti. In particolare il procedimento della trasfezione determina una riduzione dell’efficienza di purificazione dei miotubi trasfettati, minando la riproducibilità dei risultati tra esperimenti diversi. Sarà necessario introdurre dei miglioramenti nella preparazione dei campioni per l’estrazione dei pool nucleotidici dalle cellule trasfettate per avere una determinazione più affidabile del loro contenuto di dNTP. Prevediamo che ulteriori indagini ci consentiranno di chiarire meglio il fenotipo di questi silenziamenti e di mettere in luce le relazioni tra la deplezione o la mancata espansione del mtDNA durante il differenziamento e la carenza di precursori.

Il Coenzima Q10 (CoQ10) è un trasportatore di elettroni essenziale nella catena respiratoria mitocondriale e la carenza di tale coenzima causa gravi malattie multi-sistemiche. La deficienza primaria di coenzima Q10 è una malattia eterogenea sia dal punto di vista clinico sia genetico, dovuta alla riduzione dei livelli di CoQ10 nei tessuti e associata a diverse patologie, quali l’encefalopatia neonatale fatale, la sindrome nefrosica resistente a steroidi (SRNS), la cardiomiopatia ipertrofica (HCM), la retinopatia o atrofia ottica e l’ipoacusia neurosensoriale. I bassi livelli di CoQ10 in organi e tessuti possono essere dovuti alla presenza di mutazioni nei geni chiamati “geni COQ”, i quali codificano per proteine coinvolte nella biosintesi del coenzima Q10. Molti studi riguardanti la biosintesi del coenzima Q sono stati condotti in Saccharomyces cerevisiae, un organismo modello che è stato un punto di partenza essenziale per la caratterizzazione funzionale di molte proteine COQ. In ogni caso, il processo di biosintesi del coenzima Q10, tutte le proteine coinvolte e la loro funzione precisa non sono stati ancora compresi del tutto. Due tra questi geni sono COQ10A e COQ10B (ortologi del gene Coq10 di S. cerevisiae), i quali si ipotizza possano essere coinvolti nella biosintesi del CoQ, ma la cui la funzione in cellule umane è ancora completamente sconosciuta. Lo scopo di questo lavoro è quello di sviluppare un modello efficiente e facile da maneggiare per lo studio della funzione dei geni COQ10A e COQ10B in cellule umane, per comprendere meglio il processo di biosintesi del CoQ10 e possibilmente trovare nuovi target terapeutici per pazienti affetti da deficienza primaria di CoQ10. Per raggiungere questo obbiettivo, abbiamo utilizzato la tecnologia CRISPR/Cas9 in cellule embrionali umane di rene (HEK 293), con l’intento di generare tre linee cellulari “knockout” (KO): COQ10A KO, COQ10B KO e COQ10AB KO, in cui uno o entrambi i geni COQ10 fossero danneggiati, in modo da impedirne la corretta trascrizione e traduzione in proteina funzionante. Le linee KO sono state caratterizzate funzionalmente, in particolare la linea COQ10AB KO, dato che presentava un fenotipo più severo e non vi era il rischio che ci fosse complementazione funzionale tra i due geni. Tutte e tre le linee cellulari KO presentavano livelli fisiologici di Q10 endogeno e un’attività dei complessi respiratori mitocondriali III e II+III leggermente ridotta. Solo le cellule COQ10AB KO mostravano una sottile differenza nell’assemblaggio del complesso III nei supercomplessi mitocondriali. Le cellule COQ10AB KO presentavano inoltre una normale attività in gel del complesso V, alti livelli di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e una fosforilazione ossidativa altamente compromessa rispetto alle cellule sane di controllo (wild type). Eccezionalmente, la supplementazione esogena con Q10 non ha portato al recupero della respirazione nelle cellule COQ10AB KO, mentre l’aggiunta di Q6 ne ha ripristinato solo parzialmente la respirazione e invece la supplementazione con Q4 ha portato al completo recupero della respirazione mitocondriale. I dati qui presentati mettono in discussione il ruolo dei geni COQ10A e B nella biosintesi del coenzima Q10 e portano ad un’ipotesi completamente nuova riguardo al ruolo delle proteine COQ10A e COQ10B nel metabolismo cellulare.
Coenzyme Q10 (CoQ10) is an essential electron shuttle in mitochondrial respiratory chain and its deficiency cause severe multisystemic disorders. Primary CoQ10 deficiency is a clinically and genetically heterogeneous disorder due to reduced levels of CoQ10 in tissues and associated with several diseases, such as fatal neonatal encephalopathy, steroid-resistant nephrotic syndrome (SRNS), hypertrophic cardiomyopathy (HCM), retinopathy or optic atrophy and sensorineural hearing loss. The cause of low CoQ10 levels in tissues and organs could be the presence of mutations in the so called “COQ genes”, which encode for proteins involved in CoQ10 biosynthesis. Many studies about CoQ biosynthesis have been conducted on Saccharomyces cerevisiae, a model organism which have been an essential starting point for functional characterization of many COQ proteins. However, CoQ10 biosynthetic process, all proteins involved, and their precise function have not been fully understood yet. Two of these genes are COQ10A and COQ10B (hortologs of S. cerevisiae Coq10 gene), they are putatively involved in CoQ10 biosynthesis, but their function is still completely unknown in humans. The aim of this work is to develop an efficient and easy-to-handle model to study COQ10A and COQ10B function in human cells, to better clarify CoQ10 biosynthetic process and likely find new therapeutic targets for patients with primary CoQ10 deficiency. To accomplish this, we employed CRISPR/Cas9 technology in Human Embryonic Kidney (HEK) 293 cell line in order to generate three different cellular knockout (KO) cell lines: COQ10A KO, COQ10B KO and COQ10AB KO, in which one or both genes were disrupted to impair their correct transcription and translation into functional proteins. KO cell lines were functionally characterized, in particular COQ10AB KO cell line, since it presented a more severe phenotype and no risk of functional compensation between the two genes. All three KO cell lines presented physiological levels of endogenous CoQ10 and a slightly reduced activity of mitochondrial respiratory complexes III and II+III. Only COQ10AB KO showed a subtle difference in complex III assembly in the analysis of mitochondrial supercomplexes. COQ10AB KO cell line had also normal complex V activity in gel, higher levels of reactive oxygen species (ROS) and highly impaired oxidative phosphorylation compared to wild type cells. Very interestingly, exogenous supplementation with Q10 did not rescue COQ10AB KO cells respiration, while Q6 addition partially restore respiration and supplementation with Q4 leads to a fully recovered mitochondrial respiration. These data question the role of COQ10A and B in Coenzyme Q10 biosynthesis and lead to a completely new hypothesis about the role of COQ10A and COQ10B in human cells metabolism.

Questo elaborato di tesi presenta uno studio volto a identificare il ruolo dell’autofagia nella patogenesi della neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON), una patologia neurodegenerativa mitocondriale dovuta a mutazioni nel mtDNA. Tali mutazioni generano difetti nella catena respiratoria, nelle vie apoptotiche mediate dai mitocondri e nella produzione di ROS; dati preliminari hanno dimostrato una correlazione tra le mutazioni LHON e l’omeostasi mitocondriale, regolata dai processi contrapposti di autofagia e mitobiogenesi. Secondo questa ipotesi, le alterazioni LHON aumentano il flusso autofagico soprattutto negli individui affetti, mentre i portatori di mutazione sani (carrier) risultano protetti da un importante incremento nella mitobiogenesi che agisce da meccanismo compensatorio. È stata dunque caratterizzata tramite Western Blotting l’espressione proteica di due marker autofagici, LC3 e p62, in PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells) estratte da pazienti LHON, affetti e carrier, e individui di controllo. Sono stati inoltre quantificati i livelli cellulari di due proteine della membrana interna mitocondriale, COX IV e SDHA, al fine di valutare la massa mitocondriale come parametro di confronto rispetto ai livelli di autofagia. È stata infine analizzata l’influenza dell’idebenone sull’autofagia e sulla massa mitocondriale, confrontando pazienti affetti in terapia con questo farmaco e pazienti affetti non trattati. Lo studio ha in parte avvalorato i risultati preliminari; l’elevata variabilità riscontrata porta però all’esigenza, nelle analisi future, di una maggiore campionatura, nonché di indagini di diversa natura condotte in parallelo per validare i risultati.

In eukaryotes the translation process occurs in most cases through a cap-dependent mechanism which starts the mRNA scanning process up to the first AUG start codon. The AUG codon is not always read in the correct open reading frame (ORF) context, in these cases, alternative translation initiation mechanisms are activated, including the cap-independent translation process mediated by nucleotide sequences that serves as the internal ribosome entry site (IRES). The IRES sequences form long and ordered RNA structures which recruit ribosomes to initiate translation at an internal start codon of the mRNA sequence, bypassing the canonical scanning mechanism. This IRES-dependent translation had been shown that it is important in guiding protein synthesis in particular cellular contexts where cap-dependent translation is impaired, such as stressful conditions (apoptosis, response to hypoxia and ischemia), disease or during embryogenesis and development. IRES elements have also been identified in G protein-coupled receptors (GPCRs), a family of transmembrane receptors involved in numerous physiological and pathological processes, present in different tissues and systems, that are essential for the proper functioning of the living organism. GPCRs have a typical serpentine structure, with a single polypeptide chain crossing the membrane seven times; the seven transmembrane domains are connected to each other by intracellular and extracellular loops. The third cytoplasmic loop and the carboxy-terminal domain are responsible for the interaction with the G protein, determining its activation, which causes a series of phosphorylation in order to promote a cellular response. To the GPCRs family belongs the subfamily of the mAChR, muscarinic acetylcholine receptors, activated by the endogenous neurotransmitter acetylcholine. Mutations in the DNA sequence corresponding to the third cytoplasmic loop of the M2 receptor, allowed us to identify the third in-frame methionine, Met368, as the alternative starting point of the translation of C-terminal portion, triggered by the IRES sequence. Therefore in this thesis, starting from this assumption, we have seen through fluorescence microscopy that the M2tail doesn’t follow the normal route to the plasma membrane, as the wild-type receptor does, but it is sorted into the mitochondria. The presence in the mitochondria induces a considerable decrease in oxygen consumption by impairing oxidative phosphorylation that leads to a reduced cell growth and affects the oxygen radical formation. In this thesis I present data concerning the expression of the C-terminal region of M2 muscarinic receptor, as well as of other GPCRs, that can regulate mitochondrial function, that represents a novel mechanism that cells could activate for controlling their metabolism under variable environmental conditions.

La Sarcopenia è una condizione non patologica legata all’invecchiamento, relativa alla perdita sia di massa muscolare che della forza e in quanto tale, determina il rallentamento nello svolgimento delle più semplici attività quotidiane incrementando il rischio di cadute, di fratture ed un conseguente abbassamento della qualità della vita. Il significativo costo socio-economico dei disordini muscolo scheletrici generati dalla sarcopenia nella popolazione anziana richiede interventi preventivi e terapeutici. Al momento non è stato approvato l’utilizzo di nessun farmaco per il trattamento dei disturbi legati alla sarcopenia. I fattori che contribuiscono all’insorgenza della sarcopenia sono di tipo nutrizionale, ormonale, metabolico e legato ad alterazioni immunologiche, che nell’insieme determinano delle modificazioni a carico del sistema neuromuscolare le quali causano a loro volta il malfunzionamento dei motoneuroni e atrofia a livello delle miofibre. Ci sono numerose evidenze che supportano il declino delle funzioni mitocondriali e il conseguente incremento nelle Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS) che contribuiscono all’invecchiamento del muscolo e quindi all’insorgenza della sarcopenia. Nei soggetti anziani inoltre, si verifica uno sbilanciamento dell’equilibrio cellulare a favore della produzione di ROS che potrebbe compromettere la risposta adattativa dell’esercizio fisico. Il signaling radicalico, alla base della risposta antiossidante all’interno della cellula, rappresenta il fattore chiave nel mantenimento sia della forza muscolare che delle performance fisiche. In questo senso, il presente studio ha focalizzato l’attenzione sull’impatto della supplementazione con antiossidanti (ubichinolo) in combinazione con l’esercizio fisico regolare per contrastare la sarcopenia. L’ubichinolo è un cofattore lipofilico endogeno con entrambe le funzioni, antiossidante e bioenergetica e i cui livelli di sintesi tendono a diminuire con l’avanzare dell’età. Gli aspetti poc’anzi citati sono stati valutati su modelli murini di invecchiamento sottoposti ad attività fisica regolare e a supplementazione con ubichinolo usando un disegno fattoriale. Inoltre, colture cellulari di miociti, giovani e anziani, sono state esposte in vitro a concentrazioni crescenti di statina, un farmaco comunemente impiegato nella prevenzione degli effetti ipercolesterolemici ma in grado di ridurre la sintesi endogena di Coenzima Q. I dati mostrano un effetto sinergico dell’ubichinolo e l’attività fisica regolare nella promozione della biogenesi mitocondriale e nel contemporaneo abbassamento dello stress ossidativo a livello del muscolo scheletrico. Questi effetti sono evidenti nella popolazione anziana e meno negli organismi senescenti che risultano essere molto più compromessi a livello cellulare. I risultati suggeriscono un’interessante prospettiva legata all’utilizzo dell’ubichinolo nel trattamento preventivo dell’insorgenza della sarcopenia in associazione all’esercizio fisico, in condizioni subliminali di deficit di sintesi di Coenzima Q, durante l’invecchiamento e il trattamento farmacologico con statine.
Sarcopenia is a condition of age-related loss of muscle mass and strength which affects balance, gait and overall ability to perform tasks of daily living, with increased risk of falls and fractures and low quality of life. The significant socio-economic costs of musculoskeletal disorders in the expanding elderly human population urges for prevention and therapeutic interventions. There are currently no approved drug treatments for sarcopenia. Factors contributing to sarcopenia have been related to nutritional, hormonal, metabolic, and immunologic alterations that affect the neuromuscular system and lead to loss of motor neurons and myofiber atrophy. There is some evidence to support that the decline in mitochondrial function and the consequent increase in Reactive Oxygen Species (ROS) production contribute to muscle ageing and sarcopenia. Furthermore, age-related ROS imbalance may underpin the blunted adaptive response to physical exercise highlighted in elderly people. Thus, the interplay between ROS and protective antioxidant response in the cell is regarded as a key factor in maintaining muscle strength and physical performance. In this view, the present project focuses on the impact of antioxidant (e.g. ubiquinol) supplementation in combination with exercise training to counteract sarcopenia. Ubiquinol is a lypophilic endogenous cofactor with both antioxidant and bioenergetics function whose levels are known to decrease with age. In the project these issues have been studied in murine models of ageing subjected to physical exercise and supplemented with ubiquinol using a factorial design. Moreover cultured myocytes have been exposed in vitro to statin, common HMG-CoA inhibitor drugs with hypocholesterolemic effect, that are able to affect CoQ synthesis. Presented Data shows a synergistic effect of Ubiquinol and physical exercise in promoting mitochondrial biogenesis and lowering oxidative stress at muscular level. These effects are prominent in the ageing population but result less effective in senescent organisms that are more compromised. The data suggest an interesting prospective for ubiquinol treatment in association with physical exercise in prevention of sarcopenia in condition of subliminal deficit of CoQ synthesis including ageing and statin treatment.

ABSTRACT Mitochondria are the energy producing organelles in eukaryotic cells providing ATP through oxidative phosphorylation (OXPHOS). Mitochondria are highly dynamic and undergo fission, fusion and move into the cell along the microtubules to generate the mitochondrial network. Mitochondrial dynamics play a critical role in the control of organelle shape, size, number, function and quality control of mitochondria. It is regulated by several GTPases that play an important role in fusion and fission processes. In mammals, mitochondrial fusion is controlled by Mitofusin 1 (Mfn1), Mitofusin 2 (Mfn2) and Optic atrophy protein 1 (Opa1), while mitochondrial fission is regulated by Dynamin related protein 1 (Drp1). The aim of this study is to understand how mitochondrial distribution in neuronal cells is affected by mitochondria function and/or morphology. We use Drosophila melanogaster , whose genome contains homologs for all mitochondrial fusion and fission proteins, as a modelorganism to study how loss of fusion and fission protein modify the axonal distribution and motility of mitochondria. We demonstrate that loss of Marf (Mitochondrial associated regulatory factor, homologous to human mitofusins) or Opa1 causes an accumulation of mitochondria in the soma, a defect in the axonal distribution of mitochondria, a severe depletion of mitochondria in neuromuscular junctions (NMJs) and reduced mitochondrial motility. Simultaneous loss of Drp1 rescues the Opa1 phenotype very robustly while loss of Marf essentially does not. Viability data however show the opposite trend. The expression of Marf RNAi or Opa1 RNAi cause lethality, and so does the double down regulation of Opa1 and Drp1. Conversely individuals expressing Marf RNAi and Drp1 RNAi simultaneously survive and are comparable to the controls. We then examined possible alterations of mitochondrial function by analyzing the mitochondrial respiratory capacity, the activity of the respiratory chain complexes and ATP production capacity. The data show that individuals where Marf, Opa1 or simultaneously Opa1 and Drp1 are down-regulated display severe alterations in mitochondrial function, while there are no obvious energy defects in individuals in which the expression of Marf and Drp1 is simultaneously reduced. Collectively our results obtained suggest that mitochondrial morphology is important for a homogeneous distribution of mitochondria along the axon and their transport to synapses and that these mechanisms are independent of mitochondria function.
RIASSUNTO I mitocondri sono organelli essenziali per la cellula e la loro funzione primaria è di produrre energia sottoforma di ATP. I mitocondri sono organelli altamente dinamici:processi di fusione e fissione delle membrane mitocondriali ne controllano la forma, la lunghezza e il numero e un equilibrio tra i due meccanismi è fondamentale per una corretta morfologia mitocondriale. Numerose proteine sono coinvolte nei processi di fusione e fissione mitocondriale: Mitofusina 1 e Mitofusina 2 (Mfn1 e Mfn2) e Optic atrophy 1 (Opa1) regolano i processi di fusione mitocondriale, mentre Dynamin-related protein 1 (Drp1)mediala fissione. Drosophila possiede il gene mitochondrial assembly regulatory factor (MARF), espresso in modo ubiquitario ed omologo al gene MFN2. Nel tessuto muscolare la riduzione di espressione di Marf induce frammentazione e alterazione della morfologia del mitocondrio. Inoltre, mutanti di Marf mostrano una severa deplezione dei mitocondri nelle giunzioni neuromuscolari (NMJs) ed un’alterazione della morfologia della giunzione caratterizzata dall’aumento nel numero e da una riduzione nella dimensione dei bottoni sinaptici. Un altro aspetto della dinamica mitocondriale, oltre ai processi di fusione e fissione, è la motilità dei mitocondri, che deve essere altamente regolata soprattutto in cellule come i neuroni. Il trasporto mitocondriale e la continua ridistribuzione dei mitocondri lungo l’assone è essenziale per il mantenimento dell’integrità assonale e delle normali funzioni della cellula. Studi hanno messo in evidenza come la mancanza di mitocondri a livello delle giunzioni neuromuscolari in Drosophila comprometta la trasmissione sinaptica e come difetti nel trasporto mitocondriale assonale siano implicati nello sviluppo di disordini neurologici e malattie neurodegenerative (Chan, 2006). Lo scopo di questo lavoro è quello di capire il ruolo della morfologia e della funzione mitocondriale nella distribuzione intracellulare dei mitocondri nei neuroni. Per fare questo abbiamo utilizzato Drosophila melanogaster, organismo modello efficace per l’analisi della funzione genica, inclusa quella di geni responsabili di patologie umane. L’analisi della morfologia mitocondriale è stata effettuata utilizzando linee di Drosophilache esprimono in vivo un transgene per RNA interference e che permette di ridurre l’espressione di geni endogeni coinvolti nei processi di fusione e fissione mitocondriale, quali Marf, Opa1 e Drp1. Abbiamo inoltre creato linee che esprimono contemporaneamente i trangeni per RNAi di Marf e Drp1 o Opa1 e Drp1, con lo scopo di bilanciare i meccanismi di fusione e/o fissione. Ci siamo soffermati in particolare sullo studio di due aspetti principali, la morfologia e la funzionalità mitocondriale, per capire se difetti nella morfologia e nella funzionalità mitocondriale siano collegate e concorrano insieme allo sviluppo di patologie.Numerose patologie neurodegenerative sono infatti caratterizzate da alterazioni del trasporto mitocondriale e spesso questo è associato a difetti nella morfologia e nella funzionalità mitocondriale. Per studiare la morfologia mitocondriale, le linee UAS-RNAi sono state incrociate con una linea che contiene il promotore ELAV per l’espressione tessuto-specifica nei neuroni ed esprime una GFP mitocondriale. Abbiamo analizzato la morfologia dei mitocondri, sia nel corpo cellulare sia negli assoni e la distribuzione mitocondriale in assoni lunghi come i motoneuroni e assoni corti come quelli del nervo ottico e la distribuzione mitocondriale nella giunzione neuromuscolare.I risultati ottenuti mostrano che frammentazione dei mitocondri e alterazione della distribuzione mitocondriale assonale in individui in cui sia ridotta l’espressione di proteine di fusione. Inoltre si osserva una diminuzione della percentuale dei mitocondri mobili e del numero assoluto dei mitocondri anterogradi e retrogradi. Questi dati dimostrano che vi è una stretta correlazione tra morfologia mitocondriale e distribuzione dei mitocondri, in particolare in assoni lunghi. Inoltre analizzando le linee Marf RNAi Drp1 RNAi e Opa1 RNAi Drp1 RNAi, nelle quali gli eventi di fusione e fissione ridotti ma sono in equilibrio tra loro, si osserva un miglioramento la morfologia, la distribuzione e il trasporto mitocondriale assonale in modo particolare nel caso di Opa1 e non nel caso di Marf. Abbiamo cercato di capire quindi se in questi individui vi fossero alterazioni delle funzionalità mitocondriali attraverso l’analisi della capacità respiratoria mitocondriale, dell’attività dei complessi della catena respiratoria e della capacità di produzione di ATP. I risultati ottenuti dimostrano che morfologia e funzionalità mitocondriale non sempre sono collegate tra loro hanno effetti diversi nella modulazione della distribuzione mitocondriale assonale. In conclusione possiamo affermare che solamente la morfologia e la dimensione del mitocondrio sembrano essere essenziali per la corretta distribuzione mitocondriale assonale.

In the last few years, the importance of organelles as central coordinators of plant responses to internal/external stimuli has become increasingly important. Mitochondria have a fundamental role in energy production, but play also a role as stress sensors of environmental stimuli, being a component of a complex communication network between organelles and nucleus. WHIRLYs are plant-specific proteins that have been characterized as ssDNA-binding proteins because of a characteristic conserved DNA-binding domain. In Arabidopsis, the WHIRLY family includes three members: WHIRLY1, WHIRLY2 and WHIRLY3, presenting specific target sequences that localize them in the plastids and nucleus (WHIRLY1, WHIRLY3) or in the mitochondria (WHIRLY2). WHY2 among the proteins involved in mtDNA repair is the most abundant and evidences suggest an important role of it in mitochondrial genome replication necessary to complete mtDNA activity. Recent results on WHY2 show a link between mtDNA stability and proper mitochondrial morphology, dynamics and functionality, indicating a fundamental role of this protein in mitochondrial activity during development and stress responses. Failure in maintaining the mitochondrial genome stability results in the accumulation of mutations and genomic rearrangements that can become deleterious. In the present work data are reported showing the relationship between mtDNA maintenance, high levels of WHY2 and the response to abiotic stress. Evidences show that WHY2 plays a role in the response to different abiotic stresses. Our results also suggest an involvement of WHY2 protein in retrograde signalling in response to abiotic stresses. The study of mitochondrial proteins, as WHY2, contributes to open up a new conception of the role of mitochondria as a stress response center and to unveil molecular mechanisms underlying the communication between mitochondria and nucleus in response to stress.
In the last few years, the importance of organelles as central coordinators of plant responses to internal/external stimuli has become increasingly important. Mitochondria have a fundamental role in energy production, but play also a role as stress sensors of environmental stimuli, being a component of a complex communication network between organelles and nucleus. WHIRLYs are plant-specific proteins that have been characterized as ssDNA-binding proteins because of a characteristic conserved DNA-binding domain. In Arabidopsis, the WHIRLY family includes three members: WHIRLY1, WHIRLY2 and WHIRLY3, presenting specific target sequences that localize them in the plastids and nucleus (WHIRLY1, WHIRLY3) or in the mitochondria (WHIRLY2). WHY2 among the proteins involved in mtDNA repair is the most abundant and evidences suggest an important role of it in mitochondrial genome replication necessary to complete mtDNA activity. Recent results on WHY2 show a link between mtDNA stability and proper mitochondrial morphology, dynamics and functionality, indicating a fundamental role of this protein in mitochondrial activity during development and stress responses. Failure in maintaining the mitochondrial genome stability results in the accumulation of mutations and genomic rearrangements that can become deleterious. In the present work data are reported showing the relationship between mtDNA maintenance, high levels of WHY2 and the response to abiotic stress. Evidences show that WHY2 plays a role in the response to different abiotic stresses. Our results also suggest an involvement of WHY2 protein in retrograde signalling in response to abiotic stresses. The study of mitochondrial proteins, as WHY2, contributes to open up a new conception of the role of mitochondria as a stress response center and to unveil molecular mechanisms underlying the communication between mitochondria and nucleus in response to stress.

Tra le varie isoforme di SOD quella contenente Cu e Zn è la proteina maggiormente studiata e meglio caratterizzata dal punto di vista strutturale e funzionale. Nonostante ciò, in questi ultimi anni stanno emergendo nuovi aspetti riguardanti il ruolo fisiologico di questo enzima e riguardo gli effetti della sua carenza. In particolare, si è sviluppato un grosso interesse della comunità scientifica internazionale nello studio del ruolo della Cu,ZnSOD nell’insorgenza di disordini del mitocondrio e del citoscheletro correlati alle malattie neurodegenerative e l’invecchiamento. Tramite l’uso dell’RNA interference, è stato possibile studiare adeguatamente una finestra temporale nella quale si evidenziano i principali effetti intracellulari della carenza della Cu,ZnSOD in cellule di neuroblastoma umano. Gli studi sulla down-regolazione della Cu,ZnSOD ci hanno mostrato come una piccola variazione della sua concentrazione induca comunque un effetto rapido e rilevante sullo stato redox intracellulare. e come questo abbia una sua influenza sull'omeostasi mitocondriale e sull'equilibrio del citoscheletro essenzialmente in cellule di origine neuronale. Questi dati offrono una nuova chiave di lettura per comprendere la reale importanza della Cu,ZnSOD nel sistema nervoso ed in particolare al fine di chiarire il significato della elevata concentrazione di questo enzima in questo distretto.
Among Superoxide dismutases, the copper,zinc containing form is the most studied and well caracterized. The pathological effects of its disfunction linked to mutations on its gene have been extensively studied in the occurrence of neurodegenerative diseases as ALS. Although, many emerging data link not only its disfunction but also its decrease to disorders of cytoskeleton and mitochondria as ageing. By the use of RNA interference, we studied the effects of Cu,ZnSOD down-regulation in neuroblastoma cell lines in a short time-window. We demonstrated that a little decrease of Cu,ZnSOD concentration can lead to a significant change in redox homeostasis which in turn is responsible for the impairment of mitochondrial function and the transient disruption of cytoskeletal network only in neuronal deriving cells. These data give effort to the importance of Cu,ZnSOD in neuronal cells and to the real significance of its high concentration in these cells.

It is well known that Hsp90 chaperone protein contributes in stabilizing oncoproteins over-expressed in malignant cell lines, playing a key role in survival, proliferation, invasion, metastasis and angiogenesis, which represent the hallmark traits of the cancer.1 In the last decade Hsp90 has emerged as a possible therapeutic target and many efforts have been dedicated to the discovery of Hsp90 inhibitors as new potent anticancer agents. TRAP 1 (Tumor Necrosis Factor-Associated Protein ), the mitochondrial isoform of Hsp90, is a component of a mitochondrial pathway selectively up-regulated in tumor cells which antagonizes the proapoptotic activity of cyclophilin D, a mitochondrial permeability transition pore regulator, and is responsible together with Hsp90, for the maintenance of mitochondrial integrity, thus favoring cell survival. Interestingly, novel TRAP1 antagonists cause sudden collapse of mitochondrial function and selective tumor cell death, suggesting that this pathway may represent a novel molecular target to improve anticancer therapy. A number of derivatives from structures of known HSP90 inhibitors, previously synthesized by our research group, has been modified to direct them into mitochondria. The idea for a mitochondrial targeting of TRAP1 inhibitors is based on the assumption of the negative potential on the matrix face of the inner mitochondrial membrane. Thus, for a first synthetic approach we have decided to linking lipophilic cations to the Hsp90 molecule inhibitors, in order to give access to cationic drugs to internalize into the negative organelles: on the basis of literature data we selected different groups as the polyamines, which protonated at physiological pH, have the optimal characteristic to pass through the mitochondria membrane and internalize into the organelle. Alternatively a group of triphenylphosphonium salts derivatives as well as of pyridinium and guanidinium ones were also considered as cationic heads for targeting TRAP1 inhibitors into mitochondria. The preliminary biological results show that some Hsp90 inhibitors proved also of interest as TRAP1 ATPase inhibitors (IC50 0.4micromolar) and that some of these have the capacity to accumulate into mitochondrial compartment. A second synthetic approach, however, has been realized by acting directly on the pharmacophore, i.e. on the structure of resorcinol, making changes on some sites essential for the binding of Hsp90, in order to act, and then selectively inhibit TRAP1. In this case, starting from some biological activity of molecule inhibitors of cytosolic Hsp90, we have made changes to see if the interaction between them and the receptor site of TRAP1 can be improved. Biological assays of this second class of compounds are still in progress.

Using a linkage whole-genome SNP genotyping, we identified a missense mutation within the GFER gene as the cause of an infantile progressive mitochondrial myopathy. The human GFER (growth factor ERV1 homolog), also called ALR (augmenter of liver regeneration), belongs to the ERV1/ALR sulfhydryl oxidase family, which requires flavin adenine dinucleotide (FAD) as a cofactor. The physiological role of Erv1 has been elucidated in S. cerevisiae. ERV1 is an essential gene whose product is localized to the mitochondrial IMS. Together with Mia40, it participates in the DRS that drives the import of small IMS proteins to their final localization. Briefly, the DRS consists of two essential components: the sulfhydryl oxidase Erv1 (homolog to human GFER) and the redox-regulated import receptor Mia40. The DRS drives the import of cysteine-rich proteins into the IMS by an oxidative folding mechanism. Erv1p is reoxidized within this system, transferring its electrons onto molecular oxygen via interaction with cytochrome c and Cytochrome c Oxidase (COX), thereby linking the DRS to respiratory chain activity. Proteins belonging to the class of IMS, substrates of the DRS, are only partially identified. These include: a) small Tim proteins, chaperones involved in transport from the outer to the inner mitochondrial membrane; b) proteins involved in COX assembly; c) protein involved in protection from superoxide radicals generated by cellular respiration. The consequence of the mutation at the muscle and fibroblast levels are: 1) reduction of multiple mitochondrial respiratory chain complexes activity (predominantly Complex IV), which was restored by overexpression of the wild-type protein; 2) impaired import of human cysteine-rich proteins, known to be imported through the DRS in yeast, into mitochondria; 3) abnormal mitochondrial ultrastructural morphology, with enlargement of the IMS; 4) defective mtDNA maintenance, with accelerated time-dependent accumulation of multiple mtDNA deletions. Moreover, the Saccharomyces cerevisiae erv1R182H mutant strain reproduced the Complex IV activity defect and showed genetic instability of mtDNA and mitochondrial morphological defects. The aforementioned findings shed light on novel mechanisms of mitochondrial biogenesis and mtDNA maintenance, establish the role of ERV1 homologue in the human DRS, and promote the understanding of pathogenesis of a novel form of mitochondrial-related disease.

Il Complesso I (CI) mitocondriale è uno dei target metabolici più promettenti nelle terapie anti- cancro. In particolare, la metformina è un inibitore noto del CI, capace di inibire la crescita delle cellule tumorali, ma non di eradicare la patologia. Recentemente, l’associazione metformina ed ipoglicemia si è rivelata letale per i tumori, sebbene l’efficacia terapeutica del trattamento sinergico possa essere influenzata dall’accumulo di alterazioni genetiche nei più noti drivers della tumorigenesi. Abbiamo così investigato l’effetto dello stress metabolico indotto dalla restrizione di glucosio in un pannello di linee cellulari tumorali con un severo deficit sul CI e con un diverso stato genetico di TP53. Il deficit del CI associato alla carenza di glucosio inducono un abbattimento dei livelli di espressione della proteina p53 mutata, ma non della controparte wild-type. Il fenomeno biologico osservato non dipende né da un blocco trascrizionale, né dall’innesco di vie di degradazione intracellulare, come proteasoma ed autofagia. La scomparsa di p53 mutata, invece, sembra dipendere da un blocco generale della sintesi proteica, verosimilmente indotto dallo stress energetico e nutrizionale. Nella controparte p53 wild-type, invece, si osserva solo una parziale riduzione della sintesi proteica, suggerendo l’innesco di possibili vie di adattamento per compensare il danno sul CI. La carenza di amminoacidi è una caratteristica dei tumori solidi che potrebbe essere esacerbata in condizioni di deficit generali della catena respiratoria mitocondriale. In particolare, l’inibizione del CI causa auxotrofia da aspartato, metabolita limitante per la proliferazione, condizione che potrebbe generare il blocco della sintesi proteica osservato. L’incremento di espressione dei livelli del trasportatore aspartato/glutatammato mediata da p53 mutata compensa l’auxotrofia da aspartato, identificando un meccanismo di adattamento al deficit del CI. Dunque, i risultati ottenuti sottolineano l’importanza di implementare la terapia anti-complesso I nel cancro, poiché il diverso stato di p53 può alterare l’efficacia del trattamento.
Mitochondrial Complex I (CI) is one of the most promising metabolic targets in anti-cancer therapies. Metformin is a known inhibitor of CI inhibiting cancer cell growth, but not of eradicating the disease. Recently, the combination of metformin and hypoglycaemia has been shown to be lethal in tumours, although the therapeutic efficacy of synergistic treatment may be affected by the accumulation of genetic alterations in the known drivers of tumorigenesis. We thus investigated the effect of metabolic stress induced by glucose restriction in a panel of tumour cell lines with a severe CI deficiency and with a different genetic status of TP53. The CI deficiency associated with glucose restriction induced a decrease in the expression levels of the mutated p53 protein, but not of its wild-type counterpart. The biological phenomenon observed depends neither on a transcriptional blockade nor on the triggering of intracellular degradation pathways such as proteasome and autophagy. The decrease of mutated p53 seems to depend on a general blockade of protein synthesis, probably induced by energy and nutritional stress. In the wild type p53 counterpart, on the other hand, only a partial reduction in protein synthesis is observed, suggesting the triggering of possible adaptive pathways to compensate for the damage on the CI. Amino acid deprivation is a feature of solid tumours that could be exacerbated under conditions of mitochondrial respiratory chain deficiency. The CI inhibition causes aspartate auxotrophy, a condition that could generate the observed blockade of protein synthesis. Increased expression of aspartate/glutamate transporter levels mediated by mutated p53 could compensate for aspartate auxotrophy, identifying a possible mechanism of adaptation to CI deficiency. Thus, the results obtained underline the importance of implementing anti-complex I therapy in cancer, as different p53 status may alter treatment efficacy.

Spinocerebellar ataxias (SCAs) are a genetically heterogeneous group of cerebellar degenerative disorders, characterized by progressive gait unsteadiness, hand incoordination and dysarthria. The mutational mechanism in spinocerebellar ataxia type1 (SCA1), a dominantly inherited form of SCA, consists of an expanded trinucleotide CAG repeat that encodes a polyglutamine tract in ataxin1. Mutant SCA1 transgenic mice present pathological cerebellar signs with concomitant progressive Purkinje neuron atrophy and relatively little cell loss, at least in the early stage of life; this evidence suggests that the SCA1 phenotype is not the result of cell death per se, but a possible effect of cellular dysfunction that occurs before neuronal demise. In the present study we correlated the earliest histopathological changes in both homozygous and heterozygous transgenic SCA1 mice, 2 and 6 months old, to the mitochondrial oxidative metabolism in cerebellar cells. Our results showed selective Cytochrome c Oxidase (COX) deficiency in Purkinje cells (PC). Analysis on COX-competent and -deficient PC, isolated by laser-microdissector, demonstrated that the observed oxidative dysfunction is related to mitochondrial DNA (mtDNA) depletion. In conclusion, we provide evidence of a selective oxidative metabolism defect in neuronal PC expressing mutant ataxin. This defect could represent one of the earliest pathogenetic step of the Purkinje cells’ suffering in SCA1 disease.

The heart is especially vulnerable to mitochondrial derangements. In fact, many cardiomyopathies are caused by anomalous mitochondrial metabolism or alterations of mitochondrial bioenergetics. The involvement of mitochondria in cardiac diseases is likely to be extended to structural changes, since mitochondrial activity and cellular signaling are tightly linked with mitochondrial morphology. A major example of this link is provided by the relationship between mitochondrial fragmentation and the progression of apoptosis. Among the proteins involved in mitochondrial dynamics, the dynamin-like GTPase Optic Atrophy 1 (OPA 1) is required for mitochondrial inner membrane fusion and maintenance of normal cristae structure. The research activity of this thesis was aimed at both investigating whether OPA 1 is altered in hearts subjected to ischemia and reperfusion and elucidating the relationships between OPA 1 changes and alterations in mitochondrial morphology. Due to the established role of mitochondria in generating reactive oxygen species, oxidative stress was investigated as a crucial mechanism altering OPA 1 structure and function.The susceptibility of OPA 1 to oxidation was initially characterized in intact hearts, cardiomyoblasts and isolated mitochondria. In isolated rat hearts perfused with hydrogen peroxide (H2O2) or subjected to ischemia and reperfusion OPA 1 was found to undergo the formation of high molecular weight (HMW) bands that were barely detectable in normoxic hearts. Since these HMW bands were only observed in electrophoreses carried out under non-reducing conditions, their formation reflected the oxidation of vicinal cysteinyl residues resulting in the generation of disulphide cross-bridges. In mitochondria isolated from heart perfused with H2O2, Blue Native-PAGE (BN-PAGE) analysis displayed the aggregation of OPA 1 in various complexes with high molecular weight (ranging from xx to xx). These complexes were not present in mitochondria isolated from normoxic rat hearts. Then OPA 1 complex formation was analyzed both in HL-1, a proliferating atrial cardiomyocites derived from mouse AT-1 cells, and in mouse embryonic fibroblasts (MEFs), as a model cell line. Oxidative stress caused by incubation with H2O2 resulted in the formation of OPA 1 complexes that disappeared under reducing conditions, confirming the presence of intermolecular cross-bridges. Notably, under the same experimental condition causing OPA 1 aggregation (i.e., incubation with increasing concentration of H2O2) a fragmentation of mitochondrial network was observed in HL-1 cells suggesting that oxidation of cysteine residues might hamper the ability of OPA 1 to favour mitochondrial fusion. This hypothesis was validated by identifying which residues of cysteine were involved in the formation of disulfides cross-bridges. Since NMR and crystallographic structure of OPA 1 is not available, 3D structure information were obtained by means of homology modeling. In a collaborative effort with Prof. S. Moro (Faculty of Pharmacy, University of Study of Padova), analyses were carried out aimed at identifying the cysteine residues exposed on the protein surface that is also the region involved in OPA 1 dimerization. As a result of this study, cysteines 853, 856 and 874 were indicated as the residues that more likely contribute to the formation of OPA 1 complexes. This hypothesis was verified by performing site-directed mutagenesis experiments on the expression construct containing wild-type Opa1 isoform 1. By substituting the native cysteine residues with serine. This approach allowed us obtaining the following mutants: (i) the double mutant in C853-6S; (ii) the single mutants in C853S or in C874S. New clones have been sequenced to ensure fidelity. Lentiviral vectors containing the mutated cysteine plasmids were produced in order to transfect OPA 1-/- MEF cell line (kindly given by Prof. L. Scorrano). Both C853S and C853-6S expressed detectable level of OPA 1, while cells containing OPA 1 mutated in the single residue C874S were not obtained. Cells harbouring the OPA 1 mutants were assessed for mitochondrial morphology. Under control conditions C853-6S cells displayed punctuate mitochondria that is similar to the mitochondrial phenotype displayed by OPA 1-/- MEF cells; conversely, the expression of the C853S mutant restored the fusion morphology. Cells were incubated with H2O2 in order to elucidate the relationship between OPA 1 aggregation and disulphide crossbridge formation. OPA 1 complex formation was inhibited in both cell lines. To investigate the correlation between OPA 1 aggregation and mitochondrial fission, C853S cells were treated with H2O2. In C853S mutants the time required for completing the fission process was doubled with respect of MEF wild type cells. In conclusion these findings highlight the relevance of cysteine 853 in maintaining the role of OPA 1 in mitochondrial fusion, and especially in the derangement of this function caused by oxidative stress. In fact, when cells expressing the mutant C853S were exposed to a severe oxidative stress, OPA 1 aggregation was prevented along with a significant delay in the occurrence of mitochondrial fission.
Il cuore è particolarmente soggetto a disfunzioni mitocondriali e numerose cardiomiopatie sono associate ad un anomalo metabolismo mitocondriale o ad alterazioni bioenergetiche mitocondriali. Studi recenti hanno messo in evidenza come l’attività dei mitocondri e le vie di trasduzione del segnale cellulare influenzino la morfologia dei mitocondri, ad esempio, la frammentazione della rete mitocondriale è correlata al processo di apoptosi. La proteina OPA 1, GTPasi appartenente alla famiglia delle dinamine, è coinvolta nel processo di fusione della membrana interna mitocondriale e nel mantenimento della struttura delle cristae interne mitocondriali. Tuttavia sono necessari maggiori studi atti a contribuire ad una maggiore comprensione delle proteine e dei meccanismi alla base delle funzionalità di OPA 1. Nel presente lavoro di tesi è stato studiato l’effetto dello stress ossidativo sulla proteina mitocondriale OPA 1 nel cuore, dato che i mitocondri sono sede di produzione e bersaglio delle specie reattive dell’ossigeno (ROS). Inizialmente, utilizzando cuori di ratto isolati e perfusi ex-vivo, è stato valutato l’effetto di ischemia/riperfusione e perfusione con perossido di idrogeno (H2O2) sulla proteina OPA 1. Nei campioni trattati è stata osservata la formazione di complessi ad alto peso molecolare (high molecular weight, HMW) della proteina in esame. In condizioni riducenti, tali complessi vengono disgregati. Questi risultati indicano che in condizioni di forte stress ossidativo con H2O2 si ha l’aggregazione di OPA 1 e che nella formazione dell’aggregato è coinvolta la formazione di ponti disolfuro. In seguito, mediante Blue Native-PAGE (BN-PAGE), è stata eseguita un’analisi dei complessi proteici a partire da mitocondri isolati da cuore di ratto in condizioni normossiche e da cuori perfusi con H2O2. L’analisi ha dimostrato che OPA 1 aggrega in complessi di diverso peso molecolare in condizioni native. La formazione del complesso di OPA 1 è stata analizzata sia cellule HL-1, una linea di cardiomiociti da atrioma murino, che in fibroblasti embrionali murini (mouse embryonic fibroblasts, MEFs). Al fine di indurre stress ossidativo le cellule sono state incubate con 1 mM H2O2 per 2 ore. Il complesso di OPA 1 scompare in condizioni riducenti, confermando la formazione di ponti disolfuro intermolecolari. Inoltre, in cellule HL-1 incubate con concentrazioni crescenti di H2O2 è stata osservata frammentazione della rete mitocondriale. Ci siamo proposti di individuare quali fossero i residui cisteinici coinvolti nella formazione del ponte disolfuro. La struttura della proteina OPA 1 non è stata determinata né mediante NMR né mediante tecnica cristallografica. In collaborazione con il Prof. S. Moro (Facoltà di Farmacia, Università degli Studi di Padova) è stata ipotizzata la struttura 3D della proteina mediante homology modelling al fine di caratterizzare quali fossero i residui cisteinici esposti sulla superficie proteica. In questo modo le cisteine 853, 856 e 874 sono stati individuati come residui più probabilmente coinvolti nella formazione del complesso di OPA 1. Per confermare questa ipotesi, sono stati eseguiti degli esperimenti di mutagenesi sito-diretta a partire da un costrutto plasmidico contenente la sequenza genica per l’isoforma 1 umana del gene OpaI. Mediante questa tecnica sono stati ottenuti plasmidi mutati a livello delle singole cisteine 853 (C853S) e 874 (C874S), ed un doppio mutante cisteina 853-6 (C853-6S). I cloni sono stati sequenziati per confermare le avvenute mutazioni. Sono stati prodotti vettori lentivirali contenenti i plasmidi mutagenizzati al fine di esprimere stabilmente la proteina di interesse nella linea cellulare MEF OPA 1-/- (gentilmente fornita dal Prof. L. Scorrano). Sono state ottenute linee cellulari esprimenti la proteina OPA 1 mutata a livello del singolo residuo cisteinico 853 e dei residui 853-6, mentre non è stata ottenuta la linea esprimente la proteina mutata in C874S. È stata quindi valutata la morfologia mitocondriale nelle linee cellulari ottenute. Le cellule C853-6S presentano mitocondri disgregati con un fenotipo simile alla linea MEF OPA 1-/-; al contrario, nelle cellule esprimenti la proteina OPA 1 mutata a livello del residuo 853, si verifica il ripristino del fenotipo di fusione mitocondriale. Al fine di chiarire la relazione tra l’aggregazione di OPA 1 e la formazione dei ponti disolfuro, le cellule sono state incubate con H2O2. La formazione del complesso di OPA 1 risulta inibita in ambedue le linee cellulari contenenti la proteina mutata. Le cellule C853S sono state trattate con H2O2 per verificare la correlazione tra l’aggregazione della proteina in esame e il processo di fissione mitocondriale. I cloni C853S completano il processo di fissione mitocondriale in un tempo doppio rispetto alla linea MEF WT. Per concludere, in condizioni di elevato stress ossidativo la proteina OPA 1 è esposta ad ossidazione che ne modifica lo stato di aggregazione. Tale processo è correlato ad una diminuzione della fusione mitocondriale e, nelle cellule HL-1, ad un aumentato rilascio di citocromo c. Il meccanismo di aggregazione della proteina è stato stabilito mediante mutagenesi sito specifica che mette in luce il ruolo del residuo cisteinico 853.

L'etiologia de l'esquizofrènia és encara desconeguda però hi ha evidències que l'ADN mitocondrial (ADNmt), que s'hereta exclusivament a través de la mare, està implicat en el desenvolupament d'aquesta malaltia. La present tesi doctoral es va realitzar basant-se en aquesta hipòtesi. En el primer treball es van recollir totes les evidències d'herència materna, disfunció mitocondrial i alteracions de l’ADNmt associades a l'esquizofrènia i es va identificar la presència de simptomatologia psicòtica en pacients amb un trastorn mitocondrial causat per una mutació en l'ADNmt. El segon treball va analitzar el risc de presentar esquizofrènia i altres malalties psiquiàtriques en familiars, considerant si compartien o no l'ADNmt amb el pacient. Els familiars que compartien l'ADNmt amb un pacient tenien més risc de presentar esquizofrènia i, a més, les dones tenien més risc de presentar depressió, trastorns d'ansietat i característiques clíniques associades a trastorns mitocondrials. El tercer estudi va comparar les característiques clíniques freqüentment presents en les malalties mitocondrials entre un grup de pacients amb esquizofrènia i un grup control. Es va observar que la fatiga crònica i les crisis epilèptiques eren significativament més freqüents en el grup de pacients. Les conclusions d'aquesta tesi doctoral són les següents: 1) Hi ha evidències de disfunció mitocondrial i d'herència materna en l'esquizofrènia, i la simptomatologia psicòtica es pot presentar en pacients amb un trastorn mitocondrial causat per una mutació en l'ADNmt; 2) Els familiars que comparteixen l'ADNmt amb un pacient d'esquizofrènia tenen més risc de presentar la malaltia, i en dones, compartir l'ADNmt amb un pacient d'esquizofrènia confereix risc per desenvolupar altres malalties psiquiàtriques com la depressió i els trastorns d'ansietat; i 3) Característiques clíniques associades a les malalties mitocondrials són més freqüents en els pacients amb esquizofrènia que en la població control.
La etiología de la esquizofrenia es aún desconocida pero hay evidencias de que el ADN mitocondrial (ADNmt), que se hereda exclusivamente a través de la madre, está implicado en el desarrollo de esta enfermedad. La presente tesis doctoral se realizó basándose en esta hipótesis. En el primer trabajo se recogieron todas las evidencias de herencia materna, disfunción mitocondrial y alteraciones del ADNmt asociadas a la esquizofrenia y se identificó la presencia de sintomatología psicótica en pacientes con un trastorno mitocondrial causado por una mutación en el ADNmt. El segundo trabajo analizó el riesgo de presentar esquizofrenia y otras enfermedades psiquiátricas en familiares, considerando si compartían o no el ADNmt con el paciente. Los familiares que compartían el ADNmt con un paciente tenían más riesgo de presentar esquizofrenia y, además, las mujeres tenían más riesgo de presentar depresión, trastornos de ansiedad y características clínicas asociadas a trastornos mitocondriales. El tercer estudio comparó las características clínicas frecuentemente presentes en las enfermedades mitocondriales entre un grupo de pacientes con esquizofrenia y un grupo control. Se observó que la fatiga crónica y las crisis epilépticas eran significativamente más frecuentes en el grupo de pacientes. Las conclusiones de esta tesis doctoral son las siguientes: 1) Existen evidencias de disfunción mitocondrial y de herencia materna en la esquizofrenia, y la sintomatología psicótica puede presentarse en pacientes con un trastorno mitocondrial causado por una mutación en el ADNmt; 2) Los familiares que comparten el ADNmt con un paciente de esquizofrenia tienen más riesgo de presentar la enfermedad, y en mujeres, compartir el ADNmt con un paciente de esquizofrenia confiere riesgo para desarrollar otras enfermedades psiquiátricas como la depresión y los trastornos de ansiedad; y 3) Características clínicas asociadas a las enfermedades mitocondriales son más frecuentes en los pacientes con esquizofrenia que en la población control.
The etiology of schizophrenia is unknown but there is evidence that mitochondrial DNA (mtDNA), which is inherited exclusively from the mother, is involved in the development of this disease. This thesis was conceived based on this assumption. In the first study all evidence of maternal inheritance, mitochondrial dysfunction and mtDNA alterations associated with schizophrenia were collected, and the presence of psychotic symptoms in patients with mitochondrial dysfunction caused by mutations in mtDNA were identified. The second study analyzed the risk of schizophrenia and other psychiatric disorders in relatives, considering if they shared or did not share mtDNA with the patient. Family members who shared mtDNA with a patient had a higher risk of developing schizophrenia and, moreover, women were more likely to develop depression, anxiety disorders and clinical features associated with mitochondrial disorders. The third study compared the clinical features often present in mitochondrial diseases between schizophrenia patients and control subjects. It was observed that chronic fatigue and seizures were significantly more frequent in the group of patients. The conclusions of this thesis are: 1) There is evidence of mitochondrial dysfunction and maternal inheritance in schizophrenia and psychotic symptoms can occur in patients with a mitochondrial disorder caused by a mtDNA mutation; 2) Family members who share mtDNA with a schizophrenic patient have higher risk of developing the disease than those who do not share mtDNA and, in women, to share mtDNA with a schizophrenic patient confers risk for other psychiatric illnesses such as depression and anxiety disorders; and 3) Clinical features associated with mitochondrial disorders are more common in patients with schizophrenia than in the control population.

Molecular markers, at the mitochondrial and nuclear level, were applied to the study of the population structure of shore crab Carcinus aestuarii (Decapoda: Portunidae, Nardo, 1847). A 482-base-pair fragment of the mitochondrial cytochrome c oxidase I (COI) gene was analysed to examine the phylogeography and demographic history of C. aestuarii. Moreover, 8 microsatellites markers specific for shore crab were isolated ex novo; additional three microsatellites loci, specific for the sibling species C. maenas, already reported to cross-amplify in C. aestuarii, were also amplified to study population genetic of shore crab. Due to its high dispersive planktonic larval stage and ease of sampling sample, C. aestaurii is a good model for studying lagoon ecosystems and understanding connectivity patterns of populations from different lagoons. COI was analysed from 255 crabs collected in 8 different lagoons of the Mediterranean Sea. 164 sequence variants were found among the 255 individuals studied. Fixation indices (Fst) and Analysis of Molecular Variance (AMOVA) showed a significant, though weak, genetic difference between samples, confirming the existence of a slight population structure and rejecting the panmixia hypothesis. AMOVA also showed that the 3.90% of the total genetic variability was explained by differences between groups of population that resemble the Tyrrenian and Adriatic-Ionian Sea. We also investigated the demographic history of C. aestuarii populations. We found that all the samples showed departures from neutrality that are consistent with massive population expansions. Neutrality tests, mismatch distribution and bayesian skyline plot confirmed the exponential growth in effective population size in all eight population samples. Estimated times for these expansions for Adriatic and Ionian population samples fall before the Last Glacial Maximum. Instead, population expansion for Tyrrenian sample falls well within the last pleistocenic glaciation. Microsatellites markers confirmed the results obtained with mitochondrial markers: a significant, though weak, genetic differentiation was found between samples. In particular, the application of microsatellite loci was very important for detecting a slight differentiation between population samples of Adriatic and Ionian Sea, that DNA mitochondrial marker did not find. Microsatellites also revealed the presence of isolation by distance and were useful in estimating migration rates between samples. The data are not simply explainable: the migration flows have most often a north to south direction with two considerable exceptions. Both for Venezia-Marano and for Aquatina-Marano the migration has a different direction: from south to north. The cause of this pattern is probably due to the circulations of the Adriatic Sea. In the last section of this study, two typical lagoon species (Zosterisessor ophiocephalus and Atherina boyeri) were used for a comparative analysis of the population genetic of Mediterranean lagoons organisms.
In questo lavoro di tesi sono stati applicati due tipi di marcatori molecolari, il DNA mitocondriale e i microsatelliti, per analizzare la struttura genetica di campioni di popolazione adriatici di Carcinus aestuarii (Decapoda: Portunidae, Nardo, 1847). Questo ha implicato l'amplificazione di un frammento di 482 paia di basi del gene mitocondriale codificante per la subunità  I della citocromo c ossidasi (COI) al fine di indagare alcuni aspetti di filogeografia e di demografia storica della specie. Inoltre, è stato effettuato l'isolamento ex novo di 8 marcatori microsatellite specie-specifici per C. aestuarii, a cui sono stati affiancati 3 loci specifici per la specie atlantica C. maenas, per ricavare informazioni sulla genetica di popolazione del granchio verde. C. aestuarii può essere considerato a tutti gli effetti un valido modello di studio delle lagune, essendo un tipico rappresentante della fauna di questi ambienti in tutto il Mediterraneo. Per l'elevato potere dispersivo larvale e per la facilità di campionamento, C. aestuarii può ricoprire un ruolo determinante nella comprensione delle possibili connessioni tra popolazioni di lagune differenti. A livello di analisi di DNA mitocondriale, sono stati sequenziati complessivamente 255 individui (suddivisi per 8 campioni di popolazione provenienti da altrettante lagune adriatiche, ioniche e tirreniche). Sono state trovate 164 diverse varianti di sequenza (aplotipi). Il calcolo degli indici Fst, come pure l'analisi molecolare della varianza (AMOVA) hanno permesso di evidenziare un basso ma significativo livello di differenziamento genico tra i campioni di popolazione analizzati, confermando la presenza di una lieve strutturazione genetica e permettendo di rigettare l'ipotesi di panmissia. In particolare, è stato visto che una quota significativa della variabilità  (3.90%) è dovuta alla suddivisione in gruppi, riconducibili rispettivamente al bacino tirrenico e a quelli adriatico-ionico. Inoltre, è stato possibile evidenziare come tutte le popolazioni di C. aestuarii analizzate abbiano subito, in passato, fenomeni di espansione. Questo è stato possibile attraverso l'utilizzo dei test di neutralità-equilibrio, delle mismatch distribution e dei bayesian skyline plot, che hanno permesso di trarre indicazioni riguardo ai fenomeni demografici avvenuti in passato. In particolare, pare che per i campioni adriatico-ionici tali espansioni si siano realizzate in un intervallo di tempo antecedente le ultime glaciazioni pleistoceniche; mentre, per il campione tirrenico una variazione nelle dimensioni di popolazione sembra collocarsi in un periodo che coincide con gli ultimi cambiamenti climatici avvenuti in Mediterraneo. Anche l'analisi attraverso i microsatelliti ha evidenziato, confermando i risultati mitocondriali, un debole ma significativo differenziamento tra i campioni di popolazione analizzati. L'uso dei marcatori microsatellite si è dimostrato di fondamentale importanza per rilevare, inoltre, piccole differenze presenti tra i campioni di popolazione dell'Adriatico e dello Ionio, dato non riscontrabile con il solo impiego del DNA mitocondriale. Attraverso i microsatelliti, infine, è stato possibile verificare la presenza di isolamento per distanza e stimare i tassi di migrazione tra i campioni analizzati. Ne è emersa una situazione di non facile interpretazione: i flussi migratori nella maggior parte dei casi presentano direzione nord-sud con, tuttavia, due rilevanti eccezioni. Sia nel caso dei campioni di Venezia e Marano (alto Adriatico), che in quello dei campioni di Aquatina (bacino Adriatico meridionale) e Marano, la migrazione si inverte, andando da sud a nord. Il motivo di un tale andamento potrebbe essere attribuito alle correnti oceanografiche presenti nel Mar Adriatico. Nella parte finale della tesi, vi è poi una sezione dedicata all'analisi di due specie lagunari (Zosterisessor ophiocephalus e Atherina boyeri) con lo scopo di condurre un'indagine comparata sulla genetica di popolazione di organismi che occupano abitualmente le lagune costiere del Mediterraneo.

Le malattie mitocondriali (MD) sono un gruppo clinicamente eterogeneo di patologie dovute al difetto di funzione dei mitocondri, in particolare della catena respiratoria mitocondriale (RC) e della fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Le funzioni mitocondriali sono sotto il controllo di due diversi genomi: DNA mitocondriale (mtDNA) e genoma nucleare (nDNA). Le forme infantili sono più spesso associate a mutazioni nel nDNA; negli ultimi anni tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (Next Generation Sequencing-NGS) hanno permesso di identificare nuovi geni malattia; in collaborazione con altri centri abbiamo contribuito alla definizione del fenotipo associato ai nuovi geni malattia identificati. L’applicazione di tale tecnica è stata estesa anche allo studio del mtDNA: anche se sono state descritte più di 100 mutazioni e delezioni nel mtDNA in associazione a uno spettro estremamente eterogeneo di presentazioni cliniche, solo alcune di esse sono associate a sindromi cliniche ben definite nell'infanzia. Abbiamo effettuato una valutazione sistematica dei dati clinici, strumentali, metabolici e biochimici di una vasta coorte di pazienti affetti dal MD più comune nell'infanzia: la sindrome di Leigh. Abbiamo analizzato in questa popolazione la correlazione genotipo-fenotipo nei casi associati al gene nDNA e mtDNA al fine di identificare indizi diagnostici per la sindrome di Leigh correlata al mtDNA. In casi geneticamente irrisolti e vari fenotipi (sindrome di Leigh, leucodistrofia ...), abbiamo eseguito lo screening del mtDNA utilizzando tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) al fine di valutare, con elevata precisione, mutazioni puntiformi e delezioni singole o multiple di grandi dimensioni, entrambe in omoplasma o stato eteroplasmico. Abbiamo identificato mutazioni sia nuove che note associate a fenotipo inatteso (es. MTCO3). I nostri dati definiscono e ampliano meglio lo spettro fenotipico del mtDNA-MD nell'infanzia.
Mitochondrial diseases (MD) are a clinically heterogeneous group of disorders that arise as a result of dysfunction of the mitochondrial respiratory chain (RC) and oxidative phosphorylation (OXPHOS). Mitochondrial functions are under the control of two different genomes: mitochondrial DNA (mtDNA) and nuclear genome (nDNA). Childhood phenotypes are often associated with nDNA mutations; in recent years, new-generation sequencing technologies (Next Generation Sequencing-NGS) have identified novel causative genes; in collaboration with other centers we contributed to the definition of phenotype associated with the new identified disease genes. The application of this technique has also been extended to the study of mtDNA: even if more than 100 mutations and deletions in mtDNA have been described in association with an extremely heterogeneous spectrum of clinical presentations, only a few of them are associated with well-defined clinical syndromes in childhood. We performed a systematic evaluation of clinical, instrumental, metabolic and biochemical data of a large cohort of patients affected by the most common MD in childhood: Leigh syndrome. We analyzed in this population, genotype-phenotype correlation in nDNA and mtDNA gene associated cases in order to identify diagnostic clues for mtDNA related Leigh syndrome. In genetically unresolved cases and various phenotypes (Leigh syndrome, leukodystropy..), we performed mtDNA screening using next-generation sequencing (NGS) technologies in order to assess, with high accuracy, point mutations and single or multiple large deletions, both in homoplasmic or heteroplasmic state. We identified both novel and known mutations associated to unexpected phenotype (i.e. CO3 gene). Our data better define and expand the phenotypic spectrum of mtDNA-MD in childhood.

Neurodegenerative disorders, such as Parkinson’s diseases (PD), are characterized by loss of specific neuronal populations and have been associated with mitochondrial dysfunction and oxidative stress. In addition, endoplasmic reticulum (ER) stress, a severe alteration in the structure and function of the ER with the accumulation of misfolded proteins and alterations in calcium homeostasis, has been suggested to be involved in some neuronal diseases. Finally, disturbed functions of the ubiquitin proteasome system (UPS), responsible for the degradation of cytosolic, ER, and synaptic proteins, is known to contribute to ER stress. The mechanisms through which these alterations impact on cell function are complex. Among them, however, the effect on the spatio-temporal patterns of a key second messenger, such as Ca2+, most likely plays a key role. My PhD program aimed at clarifying this important issue, focusing on simple pathogenetic models. Indeed, although most forms of PD are sporadic and multifactorial, an increasing number of mutations in specific genes were found in rare, genetic forms of the disease. Understanding the molecular pathogenesis of these forms may give important clues to the understanding of the more common sporadic cases, as well as provide some novel insight into the basic cell biology mechanisms. Specifically, mutations in a set of genes (alpha-synuclein, parkin and most recently in DJ-1, PINK1, ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase-1, LRRK2/dardarin and Omi/HTRA2) have been associated with familial cases of PD. In all cases, the normal function of the gene products is not fully understood. Our aim was to study the role of these gene products in subcellular Ca2+ homeostasis, with major focus on mitochondria. Mitochondria play a central role in cell biology not only as producers of ATP, but also in the sequestration of Ca2+. Since they are the major site of free radical production in cells, they are also a primary target for oxidative damage and subsequent dysfunction. Mitochondria are also repositories of several proteins which regulates apoptosis. Perturbations in the normal functions of mitochondria will inevitably disturb cell function, may sensitise cells to neurotoxic insults and may initiate cell death. Alterations in mitochondrial Ca2+ signalling could synergize with mitochondrial dysfunction in causing deleterious functional alterations and committing the cell to death. In addition to the analysis of Ca2+ homeostasis, we have analysed other aspects of mitochondrial physiology including the energetic metabolism and the relationship between mitochondria and ER. Common interesting aspects are emerging from the data presented in this thesis, which have considered both the overexpression and the silencing of alpha-synuclein, parkin, DJ-1 and PINK1 proteins: all of them are able to modulate mitochondrial Ca2+ homeostasis. In particular alpha-synuclein, parkin, DJ-1 operate through the same mechanism by enhancing the ER-mitochondria contact sites of about 10%, thus enhancing the Ca2+ transfer between the two organelles. When this action is missing, as we have documented in the case of alpha-synuclein, the autophagic process can be activated. As for PINK1 we have identified an interesting biphasic effect. We have now to clarify whether this action could be related to distinct PINK1 distribution on mitochondrial membranes in respect to its expression levels and whether it may act by regulating the activity of the mitochondrial Ca2+ toolkit proteins. Experiments performed in permeabilized cells exposed to fixed 1 microM Ca2+ concentration account for this possibility.
Le malattie neurodegenerative, tra le quali il morbo di Parkinson (PD) sono associate a disfunzioni mitocondriali e a stress ossidativo. Inoltre, è stato suggerito che profonde alterazioni della struttura e delle funzioni del reticolo endoplasmatico (RE), una condizione nota come “ER stress”, e disfunzioni del sistema proteosoma-ubiquitina (UPS) siano alcuni dei processi cellulari coinvolti nell’insorgenza di queste malattie. I meccanismi attraverso i quali queste disfunzioni alterano la funzione cellulare sono complessi e solo parzialmente chiariti. Tra questi, gli effetti sulla distribuzione spazio-temporale di un secondo messaggero fondamentale per la corretta comunicazione cellulare, quale lo ione Ca2+, è sicuramente importante. Il programma del mio Dottorato di Ricerca prevedeva di chiarire alcuni di questi aspetti utilizzando modelli cellulari semplici. Infatti, anche se la maggior parte delle forme di PD sono sporadiche e multifattoriali, un numero crescente di mutazioni in geni specifici sono state individuate in alcune forme di malattia familiare. Lo studio delle funzioni delle proteine codificate da questi geni rappresenta quindi uno strumento molto importante per la comprensione degli aspetti molecolari alla base del processo neurodegenerativo. L’aspetto interessante è rappresentato dal fatto che le alterazioni cellulari alla base dei difetti genetici sono le stesse identificate nei casi sporadici. La delucidazione dei meccanismi patogenici delle forme genetiche, oltre a contribuire alla comprensione delle forme più diffuse, potrebbe quindi fornire anche nuove informazioni sui meccanismi cellulari alla base della insorgenza dei processi neurodegenerativi. In particolare, mutazioni in geni diversi (che codificano le proteine alfa-sinucleina, parkina, DJ-1, PINK1, ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase-1 (UCHL-1), LRRK2/dardarina e Omi/HTRA2) sono state individuate in pazienti affetti da forme familiari di PD. In tutti i casi l’esatta funzione dei prodotti genici non è ancora completamente chiarita. Il programma di ricerca prevedeva di studiare il loro ruolo nella regolazione dell’omeostasi del Ca2+, con particolare attenzione alla funzione mitocondriale. Uno degli elementi comuni di molte malattie neurodegenerative è infatti rappresentato da disfunzioni del metabolismo mitocondriale del Ca2+. I mitocondri hanno un ruolo centrale nella biologia cellulare, non solo in quanto sono la sede principale di produzione di ATP, ma anche perché svolgono un ruolo importante nel sequestro del Ca2+ intracellulare e nella produzione di specie reattive dell’ossigeno e di radicali liberi. Essi sono il primo bersaglio del danno ossidativo e delle disfunzioni che ne derivano, inoltre contengono numerose proteine che regolano il fenomeno della morte cellulare per apoptosi. Perturbazioni della funzionalità mitocondriale portano quindi inevitabilmente a disturbi del funzionamento cellulare e possono dare origine al processo di morte cellulare rendendo le cellule più suscettibili agli insulti neurotossici. Oltre all’omeostasi mitocondriale del Ca2+ sono stati analizzati anche altri aspetti legati alla fisiologia mitocondriale, in particolare il metabolismo energetico e i rapporti tra mitocondri e RE. Dagli esperimenti presentati in questa tesi, che hanno analizzato sia gli effetti della sovraespressione che del silenziamento delle proteine alfa-sinucleina, parkina, DJ-1 e PINK1, emergono alcuni aspetti comuni molto interessanti: tutte queste proteine sono in grado di modulare l’omeostasi del Ca2+ mitocondriale. Per quanto riguarda alfa-sinucleina, parkina, DJ-1 abbiamo osservato che esse condividono anche il meccanismo con il quale operano questa modulazione: in tutti e tre i casi la loro sovraespressione provoca un aumento di circa il 10% dei contatti tra reticolo endoplasmatico e mitocondri e quindi potenzia il trasferimento di Ca2+ tra questi due organelli. Se questa funzione viene a mancare, come abbiamo dimostrato nel caso di alfa-sinucleina, viene attivata la risposta autofagica. Per quanto riguarda PINK1 abbiamo evidenziato la possibilità che possa regolare l’omeostasi mitocondriale del Ca2+ attraverso un’azione bifasica, resta da chiarire se ciò dipenda dalla sua distribuzione nelle membrane mitocondriali e dalla sua attività sulle proteine che regolano il trasporto del Ca2+ mitocondriale. Gli esperimenti condotti in cellule permeabilizzate, ed esposte ad una concentrazione di Ca2+ pari a 1 microM, sembrano suggerire questa possibilità.

Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder and the most frequent form of dementia in developed countries, which leads to severe loss of memory and cognitive dysfunctions. By far, the majority of AD cases are sporadic (SAD), with unknown etiology, for which the main risk factors are represented by aging and by the presence of the allelic variant APO-e4 of apolipoprotein E. Only a small but significant percentage of cases, collectively called familial AD (FAD), is inherited and is caused by autosomal dominant mutations in the genes coding for the amyloid precursor protein (APP), presenilin 1 (PS1) and presenilin 2 (PS2) respectively. APP is a single transmembrane domain protein with a large extracellular domain, expressed at high level in the brain. PSs are homologous membrane proteins specially localized in the endoplasmic reticulum (ER) and Golgi apparatus; they represent the essential components of the gamma-secretase complex, which, by cleaving APP in concert with beta-secretase, leads to the production of the neurotoxic beta-amyloid peptides. The identification of these genetic factors involved in FAD cases, allowed the development of transgenic mouse models. Given that SAD and FAD cases are morphologically and clinically similar, these models represent an important research tool to investigate potential common molecular mechanisms between the two AD forms, with the aim of devising effective therapies. In these studies, two transgenic mouse models were used to perform the experiments. The first one is a single transgenic line, homozygous for the FAD-linked PS2-N141I mutation, which is under the prion promoter control and it is ubiquitously expressed. The second model is a double transgenic line homozygous for both the FAD-linked PS2-N141I mutation and APPSwe mutation, which is under Thy.1 promoter control, thus expressed only in neurons. We investigated the possible, early impairment of mitochondrial functions in the brain of the transgenic animals. Mitochondria are cytoplasmic organelles responsible for most of the energy supplied to the cells through ATP production; furthermore, they are involved in many other roles, such as Ca2+ homeostasis, reactive oxygen species production (ROS) and apoptosis. It is well established that mitochondrial impairment contributes to normal aging and to a wide spectrum of age-related diseases, including neurodegenerative diseases, such as AD, Parkinson’s Disease (PD), Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), and Huntington’s Disease (HD). First of all, we started with mitochondria isolated from the brain of WT, single and double transgenic mice of different ages, from neonatal up to 2 years old animals, to investigate the age-dependent progression in the onset of potential mitochondrial dysfunctions. We evaluated mitochondrial bioenergetics parameters such as the oxygen consumption rate (OCR), the membrane potential and the calcium retention capacity (CRC). These experiments didn’t reveal overt defects in the respiratory complexes activity or in the sensitivity of the permeability transition pore (PTP) to matrix Ca2+ overload in transgenic animals compared to WT, suggesting that these FAD-linked mutations do not cause severe primary defects on the organelles. Isolated mitochondria represent a useful tool in many instances, but being removed from the cellular environment do not allow the study of the complex interaction that mitochondria entertain with other organelles or components of the cell. For this reason, we decided to study mitochondria in primary hippocampal cultures, specifically because the hippocampus is one of the first and main affected brain areas in AD. In the context of intact cells, the basal respiration and the ATP synthesis coupled respiration measured by the mean of the Extracellular Flux Analyzer (Seahorse) didn’t show significant differences among the three genotypes, whereas the maximal respiration was significantly higher in WT neurons compared to PS2APP neurons, suggesting a possible impairment in the supply of substrates to mitochondria. Measuring the ability of mitochondria to sustain the membrane potential upon the selective inhibition of either the respiratory chain or the ATP synthase suggested the presence of a possible defect in the latter enzyme, in its ability to hydrolyze ATP, or the presence of an unknown metabolic defect/s limiting the supply of ATP to the synthase to sustain its reverse activity. Despite these interesting data obtained in hippocampal neurons, we didn’t observe the same strong differences under similar conditions in experiments performed in human fibroblast carrying the same FAD-linked PS2 mutation. These differences could be due to the fact that fibroblasts are mostly glycolytic cells, which might be less affected than neurons by mitochondrial dysfunctions. In order to check the ATP synthase reverse activity, we measured NADH oxidation in isolated mouse brain-cortex mitochondria. The preliminary results showed a higher ATP hydrolysis rate in PS2 and PS2APP mitochondria compared with WT, but more experiments are needed to assess the statistical significance of this finding. Blocking the respiratory chain, or the ATP synthase, in neuronal cells, so likely impairing ATP production, didn't show any major difference in the ability of the cells to handle potentially threatening increased cytosolic calcium concentration, [Ca2+]c. This evidence prompted the conclusion that under these experimental conditions, neurons seem to be equally able to handle a decrease in ATP content, and perhaps prolonged and stronger stimuli would be necessary to disclose possible defects. Moreover, the basal ROS production in these cells is very low and seems to be similar among the genotypes. Given the results collected so far, it would be interesting to better clarify the activity of the ATP synthase in the transgenic animals and investigate further the metabolic cross-talk between mitochondria and the rest of the cell.
Il morbo di Alzheimer è la malattia neurodegenerativa più diffusa e una delle principali cause di demenza nei paesi occidentali. Questa patologia determina progressivi danni alla memoria e ad altre importanti funzioni cognitive. La maggior parte dei casi di Alzheimer è sporadica, compare in tarda età e i fattori di rischio più conosciuti sono l’invecchiamento e la variante allelica APO-e4 del gene che codifica per la lipoproteina E. Esiste tuttavia una piccola ma significativa percentuale di casi ereditari (forma familiare di Alzheimer, FAD) che è causata da mutazioni autosomiche dominanti in tre geni che codificano per la Proteina Precursore dell’Amiloide (APP), per la Presenilina-1 (PS1) e la Presenilina-2 (PS2). L’APP è una proteina transmembrana espressa principalmente nel cervello. Le preseniline sono proteine omologhe di membrana presenti soprattutto nel reticolo endoplasmatico e nell’apparato di Golgi. Costituiscono ciascuna, indipendentemente, la parte catalitica dell’enzima gamma-secretasi che, insieme all’enzima beta-secretasi, è responsabile del taglio dell’APP e della conseguente formazione di peptidi Abeta, molto dannosi per il cervello. L’identificazione di mutazioni genetiche coinvolte nelle forme familiari di Alzheimer, ha permesso lo sviluppo di modelli di topi transgenici. Dato che i casi sporadici e quelli familiari della malattia sono clinicamente molto simili, questi modelli rappresentano uno strumento essenziale per la ricerca, poiché permettono lo studio di possibili meccanismi molecolari condivisi e danno la possibilità di scoprire/migliorare eventuali terapie. In questo progetto, gli esperimenti sono stati effettuati utilizzando due modelli transgenici di topi disponibili in laboratorio. Il primo è un topo transgenico omozigote per la mutazione PS2-N141 che è stata posta sotto il controllo del promotore prionico e quindi viene espressa in tutti i tessuti. Il secondo modello è omozigote per la stessa mutazione di PS2 e anche per una mutazione dell’APP (APPSwe) che si trova sotto il controllo del promotore Thy.1, ed è quindi espressa solo nel cervello. L’obiettivo di questo studio è quello di trovare possibili danni precoci nei mitocondri di cervello in questi modelli transgenici di Alzheimer. I mitocondri sono organelli citoplasmatici principalmente coinvolti nel fornire energia alla cellula sotto forma di ATP, ma sono in realtà indispensabili per molte altre funzioni, come ad esempio il controllo dell’omeostasi del calcio, la produzione delle specie radicali di ossigeno (ROS) e l’apoptosi. Al giorno d’oggi, è ampiamente accettato che danni a questi organelli non sono solo presenti durante il normale invecchiamento ma anche in molte altre malattie legate ad esso, comprese le malattie neurodegenerative come l’Alzheimer, il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica e la corea di Huntington. I primi esperimenti sono stati effettuati in mitocondri isolati dal cervello dei topi WT, PS2 e PS2APP, partendo da quelli di 8 giorni fino a topi di 2 anni, per documentare la possibile presenza e/o progressione di disfunzionalità dei mitocondri. Abbiamo valutato diversi parametri bioenergetici, come la velocità di consumo dell’ossigeno (oxygen consumption rate, OCR), il potenziale di membrana mitocondriale e la capacità dei mitocondri di accumulare calcio nella matrice (calcium retention capacity, CRC). I risultati di questi esperimenti non hanno tuttavia rivelato particolari differenze tra i topi WT e quelli transgenici, né per quanto riguarda l’attività dei complessi della catena respiratoria, né per la sensibilità del poro di transizione della permeabilità mitocondriale (permeability transition pore, PTP) ad un elevato aumento di Ca2+ nella matrice. Tali dati suggeriscono che probabilmente, queste mutazioni FAD non inducono direttamente danni ai mitocondri. I mitocondri isolati sono uno strumento molto utile per studiare le caratteristiche e la funzionalità di questi organelli, ma presentano tuttavia alcuni svantaggi: per esempio, in queste condizioni il mitocondrio è separato dal suo ambiente fisiologico e non è così possibile studiare le sue interazioni con le altre componenti del citoplasma. Per questo motivo, abbiamo deciso di spostare la nostra attenzione sulle colture primarie neuronali di ippocampo, perché quest’area del cervello è una delle regioni maggiormente e precocemente colpite dall’Alzheimer. Per prima cosa, abbiamo comparato la respirazione basale e la respirazione accoppiata alla sintesi di ATP misurate con l’Extracellular Flux Analyzer (Seahorse) senza però trovare differenze significative tra le colture dei tre genotipi. La misura della respirazione massima è invece più alta nei WT rispetto a PS2 e PS2APP, e la differenza è significativa tra WT e PS2APP, suggerendo una possibile alterazione nel rifornimento di substrati ossidabili ai mitocondri. In seguito, le misure effettuate per valutare la capacità dei mitocondri di mantenere il potenziale di membrana dopo l’inibizione selettiva dei complessi della catena respiratoria o dell’ATP sintasi, hanno rivelato un possibile difetto in quest’ultima, che potrebbe limitare la capacità di idrolizzare l’ATP, oppure alla presenza di difetti metabolici sconosciuti che limitano il rifornimento di ATP del citoplasma per sostenere l’attività idrolitica. Visti questi risultati, abbiamo provato a ripetere gli esperimenti in fibroblasti provenienti da pazienti caratterizzati dalla stessa mutazione di PS2 presente nei modelli transgenici di topo. In questo caso però, la differenza tra fibroblasti provenienti da controlli sani e quelli provenienti dai pazienti non è così marcata come quelli emersi dagli studi nelle colture neuronali primarie. Questo può essere spiegato dal fatto che i fibroblasti sono cellule molto diverse dai neuroni, potrebbero ad esempio utilizzare di più la glicolisi, o semplicemente potrebbero risentire meno dell’effetto della mutazione in PS2. Per verificare se effettivamente potesse esserci un difetto a livello dell’attività idrolitica dell’ATP sintasi, abbiamo provato a misurare indirettamente la velocità di idrolisi dell’ATP in mitocondri isolati da cervello di topi dei tre genotipi tramite l’ossidazione del NADH. Al momento, sembra che la velocità di idrolisi sia più veloce nei transgenici, anche se il numero di esperimenti non è ancora sufficiente per stabilire se tale differenza sia significativa o meno. Abbiamo inoltre verificato che bloccando la catena respiratoria o l’ATP sintasi, di fatto diminuendo la quota di ATP prodotto dai mitocondri, i neuroni WT, PS2 e PS2APP sono ugualmente in grado di regolare il calcio citosolico. Questo suggerisce che in queste condizioni sperimentali i neuroni sono in grado di sopperire alla riduzione dell'ATP e che probabilmente per evidenziare delle differenze tra i genotipi bisognerebbe utilizzare uno stimolo più forte o prolungato. Un altro parametro verificato è la produzione di ROS, che in condizioni basali è molto basso e che sembra essere simile tra i genotipi. Dati i risultati ottenuti fino ad adesso, sarebbe interessante studiare nel dettaglio l’attività dell’ATP sintasi che potrebbe essere alterata nei modelli transgenici e soprattutto potrebbe essere interessante studiare le interazioni metaboliche tra i mitocondri e il resto della cellula.

The program research has focused on the identification and the study of the mechanism action of compounds with antiproliferative activity isolated from natural plant extracts and semisynthetic derivatives. A first evaluation was carried out with the aim to estimate the ability of compounds to inhibit cell proliferation on human tumor cell lines. In particular, the IC50, (concentration of compound able to induce 50% cell death with respect to a control), was determined. For compounds characterized by the most significant antiproliferative activities, the mechanism of action has been studied, with the aim to establish the intracellular targets involved in the cytotoxic effect. More specifically, the effect of all compounds has been evaluated on isolated rat liver mitochondria. In particular, it was studied the induction of mitochondrial permeability transition (MPT), a process involved in cell death, by the release of pro-apoptotic factors such as AIF (Apoptosis Inducing Factor) and cytochrome c. Thus, by evaluating specific mitochondrial parameters, such as swelling, transmembrane electrical potential, ICR (respiratory control index) and the mitochondrial oxidative state, it has been possible to achieve information about the intracellular mechanism of action of the test compounds.
L’attività di ricerca svolta ha riguardato l’individuazione e lo studio del meccanismo d’azione di composti ad attività antiproliferativa isolati da estratti naturali di origine vegetale e di derivati semisintetici. Innanzitutto è stata effettuata una prima valutazione con l’obiettivo di stimare la capacità inibitoria sulla proliferazione cellulare. A questo scopo sono state utilizzate linee cellulari tumorali umane, determinandone l’IC50 (concentrazione di composto in grado di provocare il 50% di morte cellulare rispetto ad una coltura di controllo). Successivamente, dei composti dotati di attività più significativa, è stato studiato il meccanismo d’azione, focalizzando la ricerca su bersagli intracellulari coinvolti nel processo apoptotico. Nel dettaglio, l’effetto di tali composti, è stato valutato principalmente sulla funzionalità di mitocondri isolati, in modo specifico sull’induzione della transizione di permeabilità mitocondriale (MPT), processo implicato nell’induzione del fenomeno di morte cellulare, mediante il rilascio di fattori pro-apoptotici quali AIF (Apoptosis Inducing Factor) e citocromo c. Valutando quindi specifici parametri mitocondriali, quali swelling, potenziale elettrico transmembrana, I.C.R. (Indice di Controllo Respiratorio) e l’eventuale induzione di uno stress ossidativo, indicatori di MPT, è stato possibile ottenere informazioni sull’effettivo meccanismo d’azione dei composti studiati.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctor en Bioquímica
La acumulación de proteínas mal plegadas dentro de las mitocondrias genera una respuesta transcripcional adaptativa, denominada UPR mitocondrial. A través de esta respuesta, las mitocondrias señalizan hacia el núcleo para aumentar la expresión de genes que permiten restaurar la homeostasis proteica. Sin embargo, se desconoce si además de esta respuesta genética, existe un cambio adaptativo en el metabolismo celular en las etapas tempranas del estrés mitocondrial. El acoplamiento físico-funcional del retículo endoplásmico (RE) con la mitocondria es uno de los principales reguladores del metabolismo mitocondrial, el cual permite el traspaso directo de Ca2+ entre ambos organelos. En la mitocondria, el Ca2+ actúa como cofactor de enzimas que participan en el ciclo de Krebs, potenciando la producción de ATP. No obstante, actualmente no existe información sobre posibles cambios en el acoplamiento mitocondria-RE y su papel durante el estrés mitocondrial. A partir de estos antecedentes, se planteó como hipótesis de esta tesis que la acumulación de proteínas mal plegadas al interior de la mitocondria (UPR mitocondrial) favorece el aumento del metabolismo mitocondrial y el incremento en el contacto funcional entre mitocondria y RE. Para responder esta hipótesis se trabajó con la línea celular HeLa, induciendo el estrés mitocondrial mediante el tratamiento con doxiciclina, antibiótico que inhibe la traducción de proteínas en la mitocondria. De esta forma, se produce un desbalance entre la expresión de las subunidades nucleares y mitocondriales de los complejos respiratorios lo que lleva a estrés por acumulación de proteínas no ensambladas. En estas condiciones se estableció que el tratamiento con doxiciclina produce, entre las 24 y 72 h, un desbalance mito-nuclear de proteínas que son parte de los complejos respiratorios e induce la respuesta frente a este estrés en cuanto a expresión de marcadores de la UPR mitocondrial (CHOP, C/EBPβ, ClpP, mtHsp60), sin afectar la viabilidad celular. Por otra parte, a tiempos cortos de tratamiento, de entre 2 y 4 h, la doxiciclina aumentó los parámetros metabólicos celulares, como los niveles totales de ATP y el consumo de oxígeno. A estos mismos tiempos de tratamiento, doxiciclina incrementó los contactos físicos y funcionales entre mitocondrias y RE, evaluados mediante colocalización por inmunofluorescencia indirecta y cinéticas de captación de Ca2+ mitocondrial por microscopía confocal. Se puede concluir que el estrés mitocondrial inducido por doxiciclina estimula el acoplamiento RE-mitocondria y una potenciación del metabolismo celular a tiempos tempranos. Estos resultados sugieren que esta respuesta metabólica favorece la adaptación celular frente al estrés mitocondrial
The accumulation of unfolded proteins within the mitochondria generates an adaptive transcriptional response, denominated mitochondrial UPR. Through this response, the mitochondria signal back towards the nucleus to increase gene expression that allow restoring protein homeostasis. However, it is still unknown whether, in addition to this genetic response, there is an adaptive change in cell metabolism in the early stages of mitochondrial stress. The physical-functional coupling of the endoplasmic reticulum (ER) with the mitochondria is one of the main regulators of mitochondrial metabolism, which allows the direct transfer of Ca2+ between both organelles. In mitochondria, Ca2+ acts as a cofactor of enzymes involved in the Krebs cycle, enhancing ATP production. However, there is currently no information on possible changes in mitochondrial-ER coupling and its role during mitochondrial stress. From this background, we hypothesized that the accumulation of unfolded proteins inside the mitochondria (mitochondrial UPR) favours the increase in mitochondrial metabolism and in the functional contact between mitochondria and ER. To address this hypothesis, we worked with the HeLa cell line, inducing mitochondrial stress by treatment with doxycycline, an antibiotic that inhibits the translation of mitochondrial-encoded proteins. In this way, there is an imbalance between the expression of nuclear and mitochondrial subunits of the respiratory complexes leading to a stress by accumulation of non-assembled proteins. Under these conditions, we established that the treatment with doxycycline produces a mito-nuclear imbalance of the proteins, between 24 and 72 h, that are part of the respiratory complexes and induces the response against this stress as an expression of the mitochondrial UPR markers (CHOP, C/EBPβ, ClpP, mtHsp60), without affecting cell viability. On the other hand, at short treatment times (between 2 and 4 h), doxycycline increased cellular metabolic parameters, such as total ATP levels and oxygen consumption. At these times, doxycycline increases the physical and functional contacts between mitochondria and ER, evaluated by indirect immunofluorescence colocalization and kinetics of mitochondrial Ca2+ uptake using confocal microscopy. In summary, the mitochondrial stress induced by doxycycline stimulates an early mitochondrial-RE coupling and potentiates cell metabolism. These results suggest that this metabolic response favours cellular adaptation to mitochondrial stress
Conicyt; Fondecyt; Fondap

Este trabajo, pretende ofrecer nuevos conocimientos acerca de los mecanismos moleculares que provocan afectación celular en los desordenes mitocondriales provocados por las mutaciones m.14487T>C, m.8993T>G, m.3243A>G y m.8344A>G del ADN mitocondrial. Para conseguir nuestro objetivo, como modelo de estudio se obtuvieron líneas de cíbridos transmitocondriales para las diferentes mutaciones de estudio, las cuales fueron cultivadas en unas condiciones de cultivo que permitiesen manifestar el defecto en el sistema OXPHOS (sistema de fosforilación oxidativa) manteniendo la viabilidad, incluso en aquellas mutaciones que afectan a ARNt. En estas condiciones de cultivo, se estudiaron parámetros que nos permitieron valorar la función mitocondrial como la concentración de lactato, succinato, ATP, ADP, AMP, Adenosina y el potencial de membrana mitocondrial, evidenciando el gran defecto en el sistema OXPHOS causado por las mutaciones que afectan a ARNt no siendo tan evidente en aquellas mutaciones que afectan a subunidades del sistema OXPHOS. Además los estudios de expresión génica realizados nos permitieron identificar la posible activación de procesos autofágicos y apoptóticos como posibles mecanismos moleculares responsables de los desordenes mitocondriales causados por las mutaciones m.3243A>G y m.8344A>G. Así como, evidenciar la no inducción de biogénesis mitocondrial en ninguna de las cuatro mutaciones estudiadas, incluso en aquellas mutaciones que afectan a ARNt con una mayor depleción en el contenido de ATP. Toda la información que se derivó de los estudios de expresión génica, no solo mostró una respuesta transcripcional diferencial entre mutaciones que afectan a ARNt y subunidades sino que además se observó una respuesta nuclear específica para cada una de las mutaciones del ADNmt estudiadas. Poniendo de manifiesto la complejidad de la fisiopatología de las enfermedades mitocondriales. Nosotros en este estudio intentamos poner de manifiesto esta complejidad y a la vez intentar esclarecer los mecanismos fisiopatológicos implicados en las mutaciones estudiadas, en algunos casos, como en las mutaciones en ARNt (gracias a las condiciones de cultivo utilizadas) hemos propuesto posibles mecanismos (que deben ser ratificados) que podrían explicar la degeneración celular causada por estas mutaciones y en otros, como en las mutaciones que afectan a subunidades hemos identificado aspectos a tener en cuenta en la fisiopatología de estas mutaciones.
This work aims to provide new insights into the molecular mechanisms that cause cell involvement in mitochondrial disorders caused by mutations m.14487T>C, m.8993T>G, m.3243A>G and m.8344A>G in mitochondrial DNA. To achieve our goal, as a study model lines cybrids were obtained to study the different mutations, which were grown in culture conditions that allowed the defect state in the OXPHOS system (oxidative phosphorylation system) maintaining the viability, even in those mutations that affect tRNA. In these culture conditions were studied parameters were allowed assess mitochondrial function as the lactate concentration, succinate, ATP, ADP, AMP, adenosine and mitochondrial membrane potential, demonstrating the great defect in the OXPHOS system caused by mutations tRNA affecting not be so apparent in those subunits mutations affecting OXPHOS system. Furthermore gene expression studies allowed us to identify made possible activation of apoptotic and autophagic processes as potential molecular mechanisms responsible for mitochondrial disorders caused by mutations m.3243A>G and m.8344A>G. So as not show the induction of mitochondrial biogenesis in any of the four mutations studied, even those mutations that affect tRNA in a greater depletion of ATP content. All information derived from studies of gene expression, not only showed a differential transcriptional response mutations that affect tRNA and subunits but also showed a specific nuclear response to each of the mitochondrial DNA mutations studied. Noting the complexity of the pathophysiology of mitochondrial diseases. We in this study we manifest this complexity while trying to clarify the pathophysiological mechanisms involved in the mutations studied, in some cases, such as mutations in tRNA (thanks to the culture conditions used) have proposed possible mechanisms (which should be ratified) that may explain the cellular degeneration caused by these and other mutations, such as mutations affecting subunits have identified aspects to consider in the pathophysiology of these mutations.

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Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
As doenças mitocondriais são o resultado de mutações herdadas ou espontâneas do DNA mitocondrial (DNAmt) ou DNA nuclear (DNAn) levando à função anormal do sistema de fosforilação oxidativa. Um dos defeitos no DNAn mais freqüentemente descritos neste grupo de doenças são as deficiências isoladas do Complexo I, que é o maior complexo enzimático da cadeia respiratória com 42 subunidades (7 codificadas pelo DNAmt). Propõe-se que a subunidade de 39kDa (CI-39kDa) apresente estreita correlação com a atividade enzimática do complexo I. Sendo assim, poderíamos interrogar se a diminuição da expressão de CI-39kDa, detectada por Western blotting, poderia ser utilizada como um método diagnóstico para as deficiências do Complexo I, além deste método ter como vantagem a utilização de pequena porção de tecido congelado obtido por biópsia. Este trabalho teve como objetivo avaliar a freqüência da diminuição da proteína mitocondrial CI-39kDa no músculo esquelético de pacientes com suspeita de doença mitocondrial, e verificar se mutações conhecidas em genes codificadores de subunidades do Complexo I estariam associadas à diminuição da expressão desta proteína. As proteínas foram obtidas através do lisado de músculo esquelético de 56 pacientes e 21 controles. As proteínas foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida denaturante, transferidas para membrana PVDF, que foi incubada com um anticorpo anti-CI-39kDa e SDH-Fp (succinato desidrogenase-fração flavoproteína). As bandas foram obtidas por autoradiografia e quantificadas por densitometria. A diminuição da expressão da proteína CI-39kDa, encontrada nos casos com diagnóstico possível e provável para doença mitocondrial, foi de 6%. O estudo por seqüenciamento mostrou somente uma alteração suspeita: mutação de sentido ainda não descrita em NDUFV2. Nossos resultados mostraram que: (1) a freqüência da diminuição da expressão de CI-39kDa foi baixa nos casos estudados com suspeita de doença mitocondrial; (2) a avaliação molecular desses casos mostrou que mutações em genes codificados pelo DNAmt, e mutações conhecidas em genes nucleares para subunidades do complexo I, não foram a causa do defeito destes pacientes; (3) a alteração de NDUFV2 pode ser a causa de uma disfunção do complexo I, a qual deverá ser melhor investigada para confirmar a sua patogenicidade. A ampliação deste estudo poderá confirmar a utilidade deste método para o diagnóstico das deficiências do Complexo I.
Mitochondrial diseases are caused by mutations in mitochondrial DNA (mtDNA) or nuclear DNA (nDNA), leading to abnormal function of the oxidative phosphorylation. One of the most frequent nDNA defects described in this group of diseases are Complex I deficiency. Complex I is the largest enzymatic complex of the respiratory chain, contains 42 subunits (7 are mtDNA encoded). It is proposed that a 39kDa subunit (CI-39kDa) expression closely correlates with the enzymatic activity of complex I. Thus we could hypothesize that a decrease in the expression of CI-39kDa, detected by Western blotting, would be a good diagnostic method for complex I deficiencies, considering the requirement of low amounts of frozen biopsied tissue as a good advantage of this method. The aim of this study was to evaluate the frequency of decreased expression of the CI- 39kDa in skeletal muscle of patients with a suspicion for mitochondrial disease and to verify whether known mutations in Complex I subunit genes are associated with a decrease in the expression of this protein. Total proteins were obtained by skeletal muscle lysates of 56 patients and 21 controls. Proteins were electrophoresed through a denaturing polyacrylamide gel, transferred to a PVDF membrane and incubated with antibodies against CI-39kDa and SDH-Fp (succinate dehydrogenase-flavoprotein subunit). After autoradiography the bands were quantified by densitometry. A decreased expression of CI-39kDa was found in 6 % of the cases with a possible or probable diagnosis of mitochondrial disease. Sequencing studies demonstrated only one abnormality: a not yet described missense mutation in NDUFV2. Our results show that: (1) the frequency of a decreased expression in CI-39kDa was low in the studied cases with a suspicion of mitochondrial disease; (2) molecular studies of these cases showed that mutations in mtDNA encoded genes and known mutations in nuclear encoded genes for complex I subunits were not the cause of the defects observed in these patients; (3) the mutation in NDUFV2 can be the cause of a complex I defect, but further investigations are still needed to confirm its pathogenicity. Confirmation of the utility of this method for the diagnosis of complex I deficiency will probably be achieved by a continuation of this study.

Measures of connectivity and dispersion of the spiny lobster Palinurus elephas (Fabricius, 1787) in Sardinia through the use of STRs and mitochondrial genetic markers The spiny lobster Palinurus elephas is an important alieutic resource for all the Mediterranean Sea and especially Sardinia. For this reason, recently, in order to protect the intensively exploited stocks of the species, several no-take areas have been created in Sardinia seas. Apart from the first area (Su Pallosu), established in 1998, 14 new no-take areas have been created in 2009, after the encouraging results of the first experimentation. On the basis of this new important project, for the first time a genetic survey was established, through the development of this thesis, in order to achieve several important objectives. In fact, the present work permitted to: i) evaluate the genetic effects of the first pilot project established in Su Pallosu in 1998, comparing the molecular data of individuals sampled at the time of the institution and after twelve years; ii) provide the first genetic data and characterize the populations living in the new no-take areas, which will serve as a future baseline for comparison in assessing the effectiveness of new project; iii) estimate the extent of the gene flow and thus the connectivity and genetic structuring among populations of Palinurus elephas in Sardinia; iv) assess the health status of the stock, through the measurement of genetic variability and any demographic changes over time; v) verify the efficiency and the differences of two genetic markers here implemented. The study was accomplished through the use two different molecular markers: 10 different microsatellite loci, of nuclear origin, and a portion of the mitochondrial control region. The two types of markers have substantial differences in terms of measuring the spatial and temporal variability, thus can be considered complementary in the study. In order to achieve all the objectives, 305 individuals of spiny lobsters were sampled, representing 7 of the 15 no-take areas, and genetically characterised for all microsatellite loci and mitochondrial control region. Results evidenced a positive increment in genetic variability in the first experimental area Su Pallosu from 1998. This results enforces the success of the repopulation action. Moreover, mitochondrial marker did not reveal any significant structure among sampling sites, whereas the individuals seem to belong to the same unique population. From a demographic point of view, Su Pallosu sample seems to be stable, mainly because of the release in the area of tagged spiny lobster during the restocking project, while all other samples are most probably expanding at the moment. Once again, all efforts towards the establishment of an active repopulation seems to be positive. Microsatellite loci, on the other side, seem to reveal a fable population structure, also because of the higher resolution degree of the marker, nevertheless this structure is not to be considered as consequence of a reduced gene flow. This weak structure could be the result of two important opposite forces driving the gene flow: a very dispersive larval phase versus a more sedentary adult lifestyle. In conclusion, the results here shown demonstrate the efficacy of a more aware and conscious policy towards such an important ecological and economic resource. All efforts to repopulate and make recover the Sardinian spiny lobsters population seem to be effective and should be maintained and improved whenever and wherever possible. The results obtained today, originating in 1998, give strong support for locally defined management and conservation plans strategies that have been demonstrated to be effective.

The diagnose of a mitochondrial disease implies biochemical studies such as the enzymatic activities of the mitochondrial respiratory chain (MRC) and the quantification of the amount of CoQ10 in energetic tissues. Throughout this thesis we have worked on the development of methods to improve these studies in order to get a better diagnostic efficiency in these patients. Blue Native electrophoresis gel allows the study of complex V ATPasa activity and complex I enzymatic activity in cultured fibroblasts, which are not possbile to be studied using standard spectrophotometric methods, becoming good complementary assays. Patients with primary CoQ10 deficiencies improve with CoQ10 treatment. We have developed a technique for the study of the endogenous CoQ10 biosynthesis in cells using non-radioactive isotops that discriminates primary from secondary CoQ10 deficiencies.The implemented methodologies have improved the quality of the analysis test and the diagnose in patiens with a supect of mitochondrial disease or CoQ10 deficiecy
El diagnòstic de les malalties mitocondrials inclou estudis bioquímics com ara les activitats enzimàtiques dels complexes de la cadena respiratòria mitocondrial (CRM) i la quantificació del CoQ10 en teixits energètics. En aquesta tesi s’ha treballat en el desenvolupament de mètodes d’estudi per millorar el rendiment diagnòstic dels pacients. La electroforesis en Blue Native-gel permet l’estudi de l’activitat ATPasa del complex V i l’activitat del complex I en fibroblasts, activitats que no es poden determinar mitjançant les tècniques espectrofotomètriques habituals, esdevenint una bona tècnica complementària als estudis espectrofotomètrics. Els pacients amb deficiències primàries de CoQ10 milloren amb tractament amb CoQ10. Hem desenvolupat una tècnica d’estudi de la via de biosíntesi endògena de CoQ10 en cèl•lules mitjançant isòtops no-radioactius que permet discriminar entre deficiències primàries i secundàries de CoQ10. Les metodologies implementades han millorat la qualitat analítica i el diagnòstic en pacients amb sospita de malaltia mitocondrial i/o deficiència de CoQ10

La quantificazione del DNA umano ha un ruolo molto importante nella genetica forense. Una stima quanto più accurata della quantità di DNA umano è indispensabile per una pianificazione e un’ottimizzazione delle reazioni di genotipizzazione, così come è altrettanto utile una valutazione della presenza di sostanze inibitrici della reazione di PCR presenti nei campioni forensi. Inoltre, per campioni altamente compromessi, la quantificazione può fornire informazioni sullo stato di degradazione del DNA, indirizzando l'analista forense verso strategie di genotipizzazione più opportune. In questo studio, presentiamo un test in Real-Time PCR (qPCR TaqMan®) per la quantificazione del DNA specifico per applicazioni forensi, in grado di valutare simultaneamente sia la quantità di DNA nucleare che di DNA mitocondriale (mtDNA). Il saggio combina due target mtDNA e due target di DNA nucleare, con prodotti di amplificazione di dimensioni diverse (mtDNA=69bp e 143bp; DNA nucleare=71bp e 181bp), così da fornire informazioni sullo stato di degradazione del materiale genetico estratto. Inoltre, il test qPCR contiene un controllo positivo interno (IPC) per rilevare la presenza di potenziali inibitori. Tuttavia, a causa di un'interazione tra i primers del target mitocondriale da 69bp e la sonda del target nucleare da 71bp, riscontrata durante la validazione e l'ottimizzazione del saggio qPCR, è stato eliminato dal saggio il target da 71bp del DNA nucleare passando da una reazione pentaplex ad una reazione tetraplex. Il saggio è stato testato su diversi matrici biologiche, costituite da campioni forensi contenenti esigue quantità di DNA nucleare e/o DNA degradato, come ossa, denti, unghie, tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) e fusti dei capelli. I risultati di quantificazione ottenuti mediante il saggio tetraplex sono stati confrontati con i dati ottenuti sugli stessi campioni con altri sistemi di quantificazione esistenti in commercio e di uso comune nei laboratori di genetica forense.
Quantification of human DNA plays a key role in forensic genetics. A more accurate estimate of the amount of human DNA is essential for planning and optimizing genotyping assays, as is an evaluation of the presence of PCR inhibitory substances present in forensic samples. Furthermore, for highly compromised samples, quantification can provide information about the DNA degradation status, directing the forensic analyst towards more appropriate genotyping strategies. In this study, we present a Real-Time PCR assay (qPCR TaqMan®) for the quantification of DNA specific for forensic applications, able to assess simultaneously both the quantity of nuclear and mitochondrial DNA. The assay combines two mtDNA targets and two nuclear DNA targets, with amplification products of different sizes (mtDNA=69bp and 143bp; nuclear DNA=71bp and 181bp), in order to provide information on the degradation status of the extracted genetic material. In addition, the qPCR test contains an internal positive control (IPC) to detect the presence of potential inhibitors. However, due to an interaction between the 69bp mitochondrial target primers and the 71bp nuclear target probe, found during validation and optimization of the qPCR assay, the 71bp DNA target was removed from the assay passing from pentaplex to tetraplex reaction. The assay was tested on various biological matrices, consisting of forensic samples that contain small amounts of nuclear DNA and/or degraded DNA, such as bone, teeth, fingernails, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues and hair shafts. The quantification results obtained by the tetraplex assay have been compared with the data achieved on the same samples with other quantification systems commercially available and commonly used in forensic genetics laboratories.

Las mitofusinas 1 y 2 son unas GTPasas que se encuentran en la membrana mitocondrial externa, donde llevan a cabo el proceso de fusión mitocondrial. La existencia de mutaciones en Mfn2 es la principal causa de la enfermedad de Charcot- Marie-Tooth tipo 2A, un grupo de distintas neuropatías caracterizadas por degeneración axonal. Por otro lado, otras alteraciones en Mfn2 también han sido descritas en múltiples enfermedades neurodegenerativas crónicas, en episodios traumáticos agudos como accidentes cerebrovasculares e incluso otras enfermedades no neurológicas como las cardiometabólicas. Un gran número de estudios han demostrado que Mfn2 está relacionada con la regulación del metabolismo y la bioenergética mitocondrial, ya que su supresión afecta negativamente ambos procesos y su sobreexpresión los estimula. Dado el papel del metabolismo mitocondrial en la fisiopatología de estas enfermedades, entender el mecanismo por el que Mfn2 regula la bioenergética mitocondrial resulta de gran importancia. En esta tesis se demostró que la activación de la bioenergética mitocondrial por parte de Mfn2 requiere su localización en el retículo endoplasmático (RE) y es independiente a su función como proteína de fusión mitocondrial. A diferencia de Mfn1, Mfn2 se encuentra presente en el RE, concretamente en las membranas asociadas con las mitocondrias. Los contactos entre ambos orgánulos son de vital importancia en las células, ya que, entre otras funciones esenciales, crean micro-dominios que permiten la transferencia de Ca2+ del RE hacia las mitocondrias. Por su parte, el Ca2+ captado por las mitocondrias estimula diferentes enzimas del metabolismo mitocondrial y complejos encargados de mantener la bioenergética mitocondrial. En esta tesis, se observó que células carentes de Mfn2 también manifiestan defectos en la homeostasis del Ca2+ y en el mantenimiento de los contactos RE-mitocondrias. Mediante el uso de un enlazador artificial que mimetiza la función enlazadora de Mfn2 o diferentes formas de Mfn2 dirigidas a ambos orgánulos, se determinó que Mfn2 actúa como complejo enlazador de RE y mitocondrias, propiciando la formación de contactos óptimos para la transferencia de Ca2+ del RE a las mitocondrias. A su vez, el restablecimiento de la captación de Ca2+ por las mitocondrias gracias a la función enlazadora de Mfn2 fue capaz de estimular la bioenergética mitocondrial, definiendo de este modo un mecanismo por el cual Mfn2 regula la bioenergética mitocondrial a través de los contactos RE-mitocondria. La relevancia fisiológica de estos resultados se mostró en dos procesos neuronales. Por un lado, la falta de Mfn2 provocó alteraciones en el crecimiento neurítico y la formación de espinas dendríticas durante el periodo de desarrollo neuronal en modelos in vivo de ratón knockout para Mfn2. Estas alteraciones, fueron rescatadas in vitro mediante el enlazador artificial de RE-mitocondrias. Usando distintas formas de Mfn2 dirigidas específicamente a RE o mitocondria, se determinó que el mecanismo por el cual Mfn2 regula la bioenergética a través de los contactos RE-mitocondrias podría ser esencial durante el desarrollo neuronal para un correcto crecimiento y ramificación de sus neuritas. Por otro lado, el restablecimiento de los contactos RE-mitocondria protegió contra la excitotoxicidad. Mfn2 destaca también por su capacidad neuroprotectora frente diferentes tipos de lesiones como daño al ADN, estrés oxidativo o privación de iones K+. Frente a una sobreactivación persistente de los receptores de NMDA, acontece un aumento continuo y acusado de Ca2+ intracelular que desencadena en muerte neuronal. Durante este proceso, los niveles de Mfn2 decrecen, hecho que correlaciona con una mayor predisposición neuronal a la apoptosis. En este estudio, se determinó que la función enlazadora de Mfn2 podría estar relacionada con el reclutamiento de Bax hacia las mitocondrias, hecho típicamente definitorio de un proceso apoptótico. De este modo, se propone este mecanismo como una potencial diana terapéutica en procesos patológicos como los accidentes cerebrovasculares isquémicos, en los cuales aparecen eventos excitotóxicos y los niveles de Mfn2 se ven reducidos.