Littérature scientifique sur le sujet « Migrazione cellulari »

L'elaborato di tesi analizza la migrazione collettiva cellulare in presenza e assenza di un campo elettrico esterno. Essa è un processo fondamentale per la fisiologia e lo sviluppo degli animali, per esempio mantiene intatto e continuo un tessuto o una struttura rimodellandola. Inoltre è stato scoperto che le cellule si muovono in risposta a deboli campi elettrici in un processo chiamato galvanotassi. Ci sono vari modelli che provano a spiegare questi fenomeni. Per analizzarli sono state osservate delle colture cellulari di glioblastoma multiforme mentre rigeneravano un taglio. Una coltura in presenza e una in assenza di un campo elettrico. Con l'ausilio del programma “Imagej” e di python sono stati calcolati i valori del MSD (Mean Square Displacement), della VACF (Velocity Autocorellation Function) e della curvatura dei fronti cellulari. Per i primi due valori è stato fatto un fit rispetto alla funzione F=Dt^b, per vedere la loro dipendenza nel tempo. I parametri di b per il MSD per i diversi fronti sono risultati compresi tra 1.1/1.6, evidenziando un andamento super-diffusivo. I parametri di b per la VACF sono compresi tra -1.2/-0.2 dimostrando la presenza di forze deboli che agiscono sulla migrazione rendendo la velocità non autocorrelata. Dallo studio della curvatura si è visto che le zone con questa positiva (in assenza di sporgenze) tendono a non formare protrusioni mentre le zone in presenza di esse tendono a rimanere in questa posizione. Inoltre vi è una relazione tra la curvatura e la diffusione, cioè a zone più negative di curvatura corrispondono zone con diffusività maggiore. Non sono state rivelate differenze significative tra l'acquisizione con e senza campo elettrico. Si è visto nel primo caso una diversa diffusività tra i due fronti, destro e sinistro, maggiore nel fronte concorde al campo elettrico. Questa incongruenza si è però osservata anche nell'altro caso per cui non si è potuto concludere che il campo elettrico abbia influito alla migrazione.

2013-2015
Il recettore per l'attivatore di tipo urochinasico del plasminogeno (uPAR), è un recettore ad áncora GPI presente sulla superficie della cellula; esso è coinvolto nei processi di migrazione cellulare e di invasione tissutale. L'uPAR lega anche la vitronectina (VN) e si associa alle integrine; è iper-espresso nei tumori ed è considerato un fattore prognostico negativo in vari tipi di cancro. Queste considerazioni ci hanno spinti a chiarire i meccanismi che regolano le attività e le interazioni dell'uPAR, al fine di esplorare nuove strategie in grado di inibire le sue funzioni nel cancro. Questo progetto ha lo scopo di esaminare le possibili interazoni dell'uPAR con nuove molecole di superficie, in particolare con i recettori chemiotattici per il peptide formilato di origine batterica fMLF (fMLF-R). Abbiamo dimostrato che l'uPAR co-localizza e co-immunoprecipita con FPR1, il recettore ad alta affinità per fMLF, sulla superficie di cellule HEK-293, trasfettate con uPAR. Abbiamo, inoltre, osservato la co-localizzazione uPAR/Integrine β1 e FPR1/Integrine β1. La stimolazione con siero o con il peptide WKYMVm (W Pep), ligando di FPR1, incrementa fortemente tutte le co-localizzazioni osservate nelle cellule uPAR-293, inclusa la co-localizzazione FPR1/Integrine β1. La co-localizzazione FPR1/Integrine β1 non è stata osservata nè in assenza, nè in presenza di stimoli in cellule HEK-293 trasfettate col vettore vuoto (V-293), uPAR-negative. Abbiamo, poi, analizzato il ruolo delle interazioni dell'uPAR nella migrazione cellulare. Sia le cellule uPAR-293 che le cellule HEK-293 trasfettate col vettore vuoto (V-293) di controllo, migrano efficacemente verso siero o verso EGF purificato. I trattamenti effettuati su tali cellule per bloccare le interazioni dell'uPAR con fMLF-R o integrine, o per inibire mediatori di segnale specifici, riducono la migrazione cellulare, senza sortire alcun effetto sulle cellule controllo uPAR-negative V-293. Tali cellule possono, quindi, migrare utilizzando meccanismi sia uPAR-dipendenti che uPAR-indipendenti. La degradazione dell'áncora GPI dell'uPAR o la disgregazione dei lipid raft, inibisce la migrazione uPAR-dipendente delle cellule uPAR-293, ripristinando i meccanismi di migrazione uPAR-indipendenti, indicando un ruolo cruciale dell'áncora GPI nella migrazione uPAR-dipendente. Risultati analoghi sono stati ottenuti in cellule PC3, in cui l'uPAR è espresso costitutivamente. In tali cellule è osservata solo la migrazione uPAR-dipendente. Parallelamente, poichè uPAR e il suo ligando non proteolitico (VN) sono iper-espressi nel cancro, abbiamo selezionato e caratterizzato due composti organici in grado di bloccare tale legame. Tali composti inibiscono selettivamente l'adesione di cellule uPAR-293 alla VN e la loro migrazione su VN. Poichè questi due composti bersagliano i residui aminoacidici R91 e S88, residui chiave anche nel legame dell'uPAR con fMLF-Rs, abbiamo esaminato e dimostrato anche la loro capacità di bloccare l'associazione di uPAR a fMLF-Rs.[a cura dell'autore]
XIII n.s.

Il Bisfenolo A (BPA) è un composto di sintesi utilizzato per la produzione di materie plastiche. Classificato come potenziale interferente endocrino, è stato identificato in diversi tessuti e fluidi umani tra cui nel liquido amniotico, nel tessuto placentare e nel sangue del cordone ombelicale. Data la crescente associazione tra BPA ed effetti sulla salute, la sua presenza nella placenta sta sollevando grande preoccupazione. In particolare, l’esposizione al BPA durante la placentazione, una fase critica e complessa in cui cellule di trofoblasto si differenziano e invadono i tessuti materni per favorire l’impianto dell’embrione e lo sviluppo della placenta, potrebbe alterare tale processo che è in parte controllato dagli estrogeni. Scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di analizzare i potenziali effetti del BPA i) sulle capacità di proliferazione e migrazione della linea cellulare di trofoblasto HTR-8/SVneo e ii) sulla via di trasduzione del segnale mediata dalle MAPK, attraverso cui il BPA potrebbe modulare tali funzioni fisiologiche. A seguito dell’esposizione per 3 giorni a concentrazioni crescenti di BPA, sono state studiate le diverse risposte cellulari: la proliferazione attraverso l’E-screen assay; la migrazione, con l’impiego di apposite cellette di migrazione e microscopia ottica; la fosforilazione delle MAPK attraverso western blotting. Il BPA è in grado di aumentare la proliferazione dei trofoblasti HTR-8/SVneo anche a concentrazioni riscontrate nei tessuti umani, ed è in grado di diminuirne significativamente la capacità migratoria. Inoltre, induce la fosforilazione delle proteine ERK 1/2, presupponendo l’attivazione dell’intera via di segnalazione. Considerando che le informazioni oggi disponibili circa l’effetto di interferenti endocrini sui processi gestazionali sono carenti, questo studio fornisce un supporto all’evidenza che l’esposizione al BPA può determinare effetti deleteri sulla placentazione.

Humans, as others mammals, are able to synthesize steroid hormones from endocrine organs, such as gonads, adrenal gland and placenta. The expression and activity of steroidogenic enzymes in peripheral tissues provide the intracrine production of active androgens and estrogens by transformation of adrenal precursor dehydroepiandrosterone (DHEA). Only human and primates are unique in having large amounts of the inactive adrenal DHEA and especially DHEA-sulfate (DHEA-S). However, adrenal secretion decreases from the age of 30 years in both sexes, thus potentially providing an explanation for part of the mechanisms involved in the pathogenesis of age-related conditions, such as skin aging. In this study, it was determined whether human skin expresses the enzymes required for the local biosynthesis of active sex steroid hormones. Specifically, biopsies of skin and hair follicles (HFs) were collected from female healthy donors, and cultured dermal fibroblasts (DFs) and cultured epidermal keratinocytes (EKs) were established from female and male healthy donors. The mRNA expression of seven key steroidogenic proteins (P450arom, P450scc, P450c17, STS, OATP2B1, 5α-reductase 1 and 5α-reductase 2), and the estrogen receptors (ERα and ERß) and the androgen receptor (AR) were investigated using RT-PCR and qRT-PCR. All samples produced PCR products of the expected size for P450scc, P450c17, STS and 5α-reductase 1. The mRNA expression of 5α-reductase 2 was detected only in HF. EK did not produce the transcript of P450arom and DF did not express OATP2B1. Both ERα and ERß were expressed in EK as well as in DF. In particular, EK showed to strongly express ERß compared to ERα. In contrast, ERα has been detected with higher expression than ERß in DF. Differences in estrogen receptors expression have been demonstrated also in human HFs that have showed strongly expressed ERß in comparison with ERα. On the other hand, all the samples showed AR expression. In order to the possibility of steroids metabolism, a gene array analysis was performed on whole transcriptome of human HFs and cultured EKs after steroid treatment. Three different hormones were used for 24h of incubation: DHEA-S (10µM), testosterone (TST) (50nM) and 17ß-estradiol (E2) (1nM). The global mRNA expression profiling revealed changes in the expression of a large number of genes. In particular, interesting up-regulation of genes involved in inflammation, cell proliferation and differentiation and structural functions. The analysis on EKs was focused on four genes up-regulated with all three steroids investigated: CXCL1, ANGPTL4, TXNIP, and LMNB1. In addition, the in vitro scratch wound assay was used to determine the direct effects of E2, DHEA, DHEA-S and TST on the migration of mechanically wounded human DFs and EKs. All steroids stimulated cell migration, although both DHEA and TST were blocked by an aromatase inhibitor (Arimidex) and DHEA-S by the STS inhibitor. These results indicate an important role for local synthesis of E2 in skin from the circulating precursor DHEAS and expression of its action in the wound healing process. To verify the hypothesis of the local synthesis of E2, the activity of the aromatase, which is the enzyme that catalyzes the conversion of androgen to estrogen, was assessed in EKs and DFs using the tritiated water (3H2O) assay. Specifically, it was investigated whether the aromatase activity and mRNA expression were modulated in cultured skin cells in response to either dexamethasone or mechanical wounding. The analysis revealed that dexamethasone increased the activity and mRNA expression in particular in DFs, in contrast, the mechanically wounded showed in EKs an increase of the aromatase activity at 24h compared to the non-wounded confluent monolayer cells. All data suggest that human skin and individual cells as target and source of active androgens and estrogens. Further studies are required to understand the role of steroids in inflammation, proliferation and differentiation which have implications for hair growth, skin cancer, aging and wound-healing. In particular, a greater understanding of DHEA signalling may help develop wound-healing therapies, without the risks of estrogen therapy, benefiting the elderly and patients with impaired wound-healing.
Gli umani, come altri mammiferi, sintetizzano ormoni steroidei da organi endocrini come le gonadi, la surrenale e la placenta. L’espressione e attività di enzimi steroidogenici a livello di tessuti periferici provvedono alla formazione intracrina di androgeni ed estrogeni attivi a partire dal precursore deidroepiandrosterone (DHEA). Solamente umani ed alcuni primati secernono alti livelli di DHEA e DHEA-S. Tuttavia con l’età si presenta in entrambi i sessi una riduzione della secrezione adrenalica che si riflette in un notevole declino della produzione periferica di ormoni sessuali. Questa diminuita formazione è potenzialmente correlata alla patogenesi di malattie che incorrono con la vecchiaia tra cui anche alcune condizioni della pelle. Nel presente studio è stata valutata l’espressione dell’mRNA di sette proteine chiave della steroidogenesi (P450arom, P450scc, P450c17, STS, OATP2B1, 5α-riduttasi 1 e 5α-riduttasi 2), oltre che dei recettori di estrogeni (ERα e ERß) ed androgeni (AR), in biopsie di pelle e follicoli piliferi derivati da donatrici donne sane e in fibroblasti dermici e cheratinociti epidermici primari di donatori femmine e un maschio sempre sani. L’analisi condotta con RT-PCR e qRT-PCR ha rilevato in particolare che solo i follicoli esprimono 5α-riduttasi 2, i cheratinociti non presentano espressione dell’aromatasi (P450arom) e i fibroblasti non risultano esprimere il trasportatore OATP2B1. Dall’altra parte, entrambi i recettori ERα e ERß e quello per androgeni sono espressi nelle cellule della pelle e nei follicoli piliferi. In particolare ERß risulta con più forte espressione in cheratinociti e follicoli piliferi rispetto a ERα e il contrario in fibroblasti. In relazione quindi alla possibilità di una locale formazione ed azione di ormoni sessuali nella pelle, è stato investigato l’effetto in vitro di tre steroidi sull’espressione genica di follicoli piliferi e cheratinociti ottenuti da pelle facciale di donne sane. L’intero trascrittoma è stato analizzato dopo un’incubazione di 24 ore con DHEA-S (10µM), testosterone (TST) (50nM) e 17ß-estradiolo (E2) (1nM). In particolare sono state individuate modulazioni dell’espressione di geni coinvolti in funzioni come infiammazione, proliferazione e differenziamento cellulare, e di struttura. L’analisi condotta su cheratinociti è stata focalizzata su quattro geni sovra-espressi da tutti e tre i diversi trattamenti steroidei: CXCL1, ANGPTL4, TXNPI e LMNB1. Dati gli effetti e funzioni implicati dagli ormoni in esame, è stato valutato in vitro l’effetto di E2, DHEA, DHEA-S e TST sulla migrazione di fibroblasti e cheratinociti mediante scratch wound assay. L’analisi ha rilevato l’accelerazione della migrazione di entrambi i tipi cellulari in presenza di tutti gli steroidi in esame. In particolare, la combinazione di un inibitore dell’aromatasi (Arimidex) e uno della steroide solfatasi (STX64) hanno determinato l’inibizione dell’effetto stimolatorio rispettivamente di DHEA e TST, e di DHEA-S. I risultati suggeriscono un importante ruolo della formazione locale di E2 nella pelle a partire dal precursore DHEA (-S) e della sua azione nel processo di wound healing. Per verificare tale ipotesi della sintesi locale di estradiolo, è stata investigata l’attività dell’enzima catalizzante la conversione di androgeno ad estrogeno, l’aromatasi. Le misurazioni dell’attività aromatasica sono state eseguite con il metodo dell’acqua triziata. Specificatamente, l’esame è stato condotto su fibroblasti e cheratinociti umani e individuando l’effetto su attività ed espressione dell’mRNA dell’enzima dopo trattamento con desametasone o eseguendo mechanical scratch wound. Nel primo caso, il desametasone ha indotto stimolazione sia di attività che di espressione del trascritto. Mentre nel secondo caso, è stato rilevato un incremento in cheratinociti dopo 24 ore dallo scratch. In generale questo studio suggerisce che la pelle umana, oltre che separatamente fibroblasti e cheratinociti, e follicolo pilifero, siano target e fonte degli ormoni sessuali. Ulteriori studi saranno necessari per comprendere il ruolo di estrogeni ed androgeni in meccanismi come infiammazione, proliferazione e differenziamento cellulare, che possono avere implicazioni nella crescita del pelo, cancro della pelle, invecchiamento e wound healing. In particolare, la comprensione del signalling di DHEA aiuterebbe lo sviluppo di terapie per il wound healing riducendo i rischi correlati alla somministrazione degli estrogeni.

La crescente generazione e trasmissione di energia elettrica, con lo sviluppo di nuovi sistemi di telecomunicazione e delle applicazioni mediche e industriali, ha fatto sorgere la volontà di indagare sui potenziali effetti nocivi dei campi elettromagnetici (CEM) sulla fisiologia delle cellule dell’organismo umano. Lo scopo della tesi è quindi quello di svolgere attività di ricerca al fine di rendere disponibili dati affidabili sugli effetti biologici dei CEM, come prerogativa per la protezione della salute umana. Questo studio è incentrato sui potenziali effetti dei CEM ad alta frequenza (HF-EMF) su cellule umane di trofoblasto HTR-8/SVneo. Per simulare i CEM generati dall’uso di un telefono cellulare GSM (Global System for Mobile Communications) è stato utilizzato un sistema di esposizione realizzato dall’IT’S-Foundation di Zurigo. Gli esperimenti sono stati svolti a frequenza portante di 1.8 GHz con esposizione intermittente (5 minuti on 10 minuti off) per 1 e 24 ore. ediante il software che gestisce il funzionamento dell’irraggiatore sono state impostate tre modalità di irraggiamento: Continuos Wavelength signal (CW), GSM-217 Hz amplitude modulation e GSM-Talk. Gli esperimenti effettuati si basano sul confronto di campioni di cellule irraggiate e campioni di controllo. Dopo l’irraggiamento, sono stati fatti tre tipi di analisi per valutare tre endpoint: analisi delle citochine IL-6,IL-8,TNFα e MCP-1 per valutare l’infiammazione cellulare, colorazione con cristal violetto per valutare la migrazione cellulare, e infine analisi della Caspasi-3 per valutare l’apoptosi cellulare tramite la tecnica del Western Blotting. Le differenze di ciascun campione rispetto al controllo sono state valutate mediante t-test (Sigma Stat)(p < 0.05). Per nessuno degli esperimenti i campioni trattati sono risultati significativamente diversi dal controllo, potendo concludere che l’esposizione di cellule di trofoblasto a HF-EMF non provoca danni in termini di infiammazione, migrazione e apoptosi cellulare.

Historically the function of uPAR in cancer cell invasion is strictly related to its property to promote uPA-dependent proteolysis of extracellular matrix and to open a path to malignant cells. These features are typical of mesenchymal motility. Here we show that the full-length form of uPAR is required when prostate and melanoma cancer cells convert their migration style from the "path generating" mesenchymal to the "path finding" amoeboid one, thus conferring a plasticity to tumor cell invasiveness across three-dimensional matrices. Indeed, in response to a protease inhibitors-rich milieu, prostate and melanoma cells activated an amoeboid invasion program connoted by retraction of cell protrusions, RhoA-mediated rounding of the cell body, formation of a cortical ring of actin and a reduction of Rac-1 activation. While the mesenchymal movement was reduced upon silencing of uPAR expression, the amoeboid one was almost completely abolished, in parallel with a deregulation of small Rho-GTPases activity. In melanoma and prostate cancer cells we have shown uPAR colocalization with β1/β3 integrins and actin cytoskeleton, as well integrinsactin co-localization under both mesenchymal and amoeboid conditions. Such colocalizations were lost upon treatment of cells with a peptide that inhibits uPAR-integrin interactions. Similarly to uPAR silencing, the peptide reduced mesenchymal invasion and almost abolished the amoeboid one. These results indicate that full-length uPAR bridges the mesenchymal and amoeboid style of movement by an inward-oriented activity based on its property to promote integrin-actin interactions and the following cytoskeleton assembly.