Littérature scientifique sur le sujet « Microorganismes – Génie génétique – Essais »

ROQUETTE transforme et valorise le pois (Pisum sativum) pour produire des protéines, des fibres et des amidons. Au cours du procédé, diffé-rentes fractions secondaires sont générées dont le soluble de pois, désigné LAB 4960 après atomisation. Ce coproduit riche en fibres est inapte pour la nutrition humaine car il peut causer des désordres diges-tifs, engendrés par la forte teneur en α-GOS, des α-galacto-oligosaccharides formés de 1 à 3 unités de galactose liées par des liaisons α-(1-6). Parmi les α-GOS, on retrouve le raffinose, le stachyose et le verbascose qui sont non digérés par l’homme mais fermentés par le microbiote intestinal. L’objectif de ce projet de thèse est donc de ré-duire la teneur en α-GOS du LAB 4960 par voie microbienne afin d’en améliorer sa digestibilité. Pour atteindre cet objectif, une stratégie a été mise en place en deux temps. Dans une première partie, une collec-tion microbienne très diverse en termes d’espèce et d’origine (végétale vs animale) a été constituée à partir de graines de pois avec la caracté-risation de la diversité microbienne du pois de différents terroirs et à partir des collections internes de l’INRAE et de la société ROQUETTE. Dans une deuxième partie, la collection a été testée pour son aptitude à hydrolyser les α-GOS du LAB 4960. Le criblage de souches a été réparti sur trois phases, impliquant différents critères de sélection. La phase 1 a permis de sélectionner les souches capables de croître sur le LAB 4960 gélosé dans deux conditions d’oxygénation (aérobie et anaérobie) et de pH (acide et neutre). La phase 2 a permis d’identifier les sucres par Chromatographie sur Couche Mince après 72 h de culture sur le LAB 4960 liquide. Les souches ayant réduit les α-GOS ont été retenues en phase 3 pour le dosage des sucres par Chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse. Dans la première partie, l’étude par métagénétique de la diversité de la surface de pois de différents terroirs après trempage, a montré une forte dominance d’espèces bactériennes appartenant aux Proteobacteria (57%) et Firmicutes (28%) et d’espèces fongiques appartenant aux Ascomyco-ta (89%) et Basidiomycota (11%). La structure de la communauté épiphyte associée à la graine de pois a été fortement impactée par son origine (coopératives et pays). A partir du jus de trempage des graines de pois, 102 souches ont été isolées et assignées à 52 es-pèces. Les 52 souches du pois représentatives de chaque espèce identifiée ont été ajoutées aux 157 souches représentatives de 82 espèces microbiennes des collections internes. Dans la seconde partie, le criblage de la collection a montré que 89% des souches testées ont pu croître sur le LAB 4960 gélosé. A peu près 20% des souches ont dégradé uniquement le saccharose. L’apparition des sucres mélibiose, manninotriose et manninotétraose traduisant une défructosylation a suggéré que 19% de souches ont hydrolysé les α-GOS via une β-fructosyltransférase dont 4% provenaient du pois. Enfin, 4% des souches ont hydrolysé les α-GOS via une α-galactosidase dont 1% provenait de pois. Sur les 49 (23%) souches hydrolysant les α-GOS, deux souches se sont démarquées par leur forte activité hydrolytique : Candida pseudoglaebosa CBS 6715T et Serratia liquefaciens GBM09. Une étude sur milieu minimum, milieu LAB 4960 et en bioréacteur sur LAB 4960 de concentrations diffé-rentes a montré que, dans des conditions optimales de croissance, la bactérie GBM09 est capable d’hydrolyser les α-GOS par ordre de degré de polymérisation croissant à pH neutre et à 20°C alors que la levure CBS 6715T hydrolyse l’ensemble des α-GOS simultanément à pH acide et à 28°C. Ces essais préliminaires ont permis de valider une première preuve de concept d’un aliment fonctionnel fermenté et laissent espérer favorablement leur développement à l’échelle industrielle en ouvrant la voie à de nombreuses innovations
ROQUETTE transforms and valorizes peas (Pisum sativum) to produce proteins, fibers and starches. During this process, various secondary fractions are generated, including the pea soluble, designated LAB 4960 after atomization. This fiber-rich co-product is unfit for human consumption in its current form as it can cause digestive disorders, caused by the high content of α-GOS, α-galactooligosaccharides formed from 1 to 3 galactose units linked by α-(1-6) bonds. Among the α-GOS are raffinose, stachyose and verbascose which are not digested by humans, but fermented by the intestinal microbiota. The aim of this thesis project is therefore to reduce the α-GOS content of LAB 4960 by microbial fermentation in order to improve its digestibility. To achieve this objective, a twofold strategy has been implemented. In a first part, a microbial collection that is very diverse in terms of species and ori-gins (plant vs. animal) was built up from pea seeds with the characteri-zation of the microbial diversity of peas from different terroirs and from the private collections of the INRAE Laboratory and the ROQUETTE Company. In a second part, the constituted collection was tested for its ability to hydrolyze the α-GOS from LAB 4960. The screening of the strains was split into three steps, involving different selection criteria. Step 1 allowed the selection of strains capable of growing on LAB 4960 agar under two conditions of oxygenation (aerobic and anaerobic) and pH (acidic and neutral). Step 2 allowed the identification of sugars by Thin-layer chromatography after 72 hours of culture on the liquid LAB 4960. The strains that reduced the α-GOS were selected in step 3 for the quantification of sugars by High performance liquid chromatog-raphy coupled to mass spectrometry. In the first part, the metagenetic study of pea surface diversity according to different terroirs after soak-ing, showed a strong dominance of bacterial species belonging to Proteobacteria (57%) and Firmicutes (28%) and fungal species be-longing to Ascomycota (89%) and Basidiomycota (11%). The structure of the epiphytic community associated with the pea seed was strong-ly influenced by its origin (storage cooperatives and countries). From the pea seed soaking juice, 102 strains were isolated and assigned to 52 species. The 52 pea strains representative of each identified spe-cies were added to the 157 strains representative of 82 microbial species in the internal collections. Screening of the collection showed that 89% of the strains tested were capable of growing on LAB 4960 agar. About 20% of the strains degraded only sucrose. The occurrence of sugars as melibiose, manninotriose and manninotetraose, known to be the product of defructosylation, suggested that 19% of the strains hydrolyzed α-GOS by a β-fructosyltransferase of which 4% came from peas. Finally, 4% of the strains hydrolyzed α-GOS by an α-galactosidase, of which 1% came from peas. Among the 23% strains hydrolyzing α-GOS, two strains stood out for their strong hydrolytic activity: Candida pseudoglaebosa CBS 6715T and Serratia liquefa-ciens GBM09. A study on minimum medium, LAB 4960 medium and in a bioreactor on LAB 4960 of different concentrations showed that, under optimal growth conditions, the GBM09 bacterium is capable of hydrolyzing the α-GOS in increasing order of degree of polymeriza-tion at neutral pH and at 20°C whereas the yeast CBS 6715T hydro-lyzes all the α-GOS simultaneously at acid pH and at 28°C.These preliminary trials have made it possible to validate a proof of con-cept for a fermented functional food and hold out promise of their development on an industrial scale, paving the way for many innova-tions

Bacillus subtilis produit grâce à un mécanisme non-ribosomique trois types de lipopeptides, possédant de nombreuses activités biologiques : les iturines, les surfactines et les fengycines ou plipastatines. La synthèse de ces molécules est le plus souvent soumise à une régulation complexe. Par ailleurs, leurs propriétés tensioactives rendent la production de ces lipopeptides en bioréacteur aéré difficile à cause d’une formation massive de mousse, empêchant leur production à grande échelle. Les travaux effectués reposent sur deux approches pour l’optimisation de la production des lipopeptides de B. subtilis. D’un côté, la mise au point d’un procédé innovant, basé sur la technologie du bioréacteur à contacteur à membrane air/liquide (bioréacteur sans bulles), pour la production de lipopeptides sans la formation de mousse. Les performances de ce bioréacteur à membrane, ont permis par la suite l’élaboration d’un procédé intégré multimembranaire pour la production, l’extraction et la purification en continu des lipopeptides de B. subtilis. D’un autre côté, une optimisation génétique de la production de surfactine a été entreprise pour se libérer de la régulation complexe de la synthèse de ce lipopeptide et obtenir une souche, dérivée de B. subtilis 168, uniquement productrice de surfactine, BBG131. Les différents mutants obtenus dans le cadre de cette optimisation génétique ont également permis de démontrer le caractère soit synergique soit antagoniste de la co-production de la surfactine et de la plipastatine sur les propriétés biologiques de B. subtilis. Par ailleurs, l’exploitation du mutant BBG131 dans le procédé intégré mis au point précèdemment a permis la production, l’extraction et la purification de plusieurs dizaines de grammes de surfactine, laissant entrevoir la faisabilité de ce procédé intégré à l’échelle industrielle
Bacillus subtilis produces up to three families of lipopeptides through a non-ribosomal mechanism, i.e., iturins, surfactins and fengycins or plipastatins. These molecules show a broad range of biological properties.Their biosynthesis is most often subject to complex regulation. In addition, the surface properties of these molecules make the production of the lipopeptide in an aerated bioreactor difficult because of the foaming, rendering difficult their large-scale production. This work was based on two approaches to optimize the production of the lipopeptide. On the one hand, an innovative process based on the technology of membrane bioreactor was developed for the production of lipopeptide to circumvant the massive foaming problem. For the first time, different bubbleless bioreactors were used for lipopeptide production by B. subtilis using hollow fiber membranes as air-liquid contactor. The performance of this bubbleless bioreactor enabled us to conduct a study of the lipopeptide production in a bubbleless bioreactor coupled with a continuous lipopeptide membrane extraction. On the other hand, a genetic optimization of the production of surfactin was undertaken to release its synthesis from a complex regulation and to obtain a single surfactin producer strain derived from B. subtilis 168, named BBG131. The different mutant strains obtained in this genetic optimisation process allow us to demonstrate some synergistic or antagonistic effect of surfactin and fengycin co-production on biological properties of Bacillus subtilis. Furthermore, the use of BBG131 in the integrated process previously developed led to the production, extraction and purification of several tens of grams of surfactin, pointing out the feasibility of this integrated process at the industrial scale

Un procede de culture cellulaire en milieu liquide a ete developpe pour une espece modele, la mandarine commune (citrus deliciosa ten. ). La recherche des facteurs permettant d'orienter a volonte les cultures cellulaires de la multiplication indifferenciee vers l'embryogenese somatique, a montre que la diminution de la densite cellulaire au moment de l'inoculation est 60 fois plus efficace que le remplacement du saccharose par le galactose. La difference de comportement des cellules, placees sur galactose ou sur saccharose, se determine tres tot comme en temoignent les differences de consommation de 4 principaux macroelements (calcium, phosphore, potassium, magnesium). La modification des conditions de l'environnement hydrique, avec l'utilisation de systeme a immersion temporaire, favorise la morphogenese des embryons et leur aptitude a la germination. Disposant d'un systeme de culture cellulaire efficace, les manipulations genetiques ont pu etre envisagees. Deux techniques complementaires ont ete abordees: fusion de protoplastes et transfert de genes dans des protoplastes, tous deux induits par le polyethylene glycol. Apres fusion somatique, des jeunes plantes ont ete regenerees tandis que l'etape de regeneration a echoue dans les experimentations de transformation genetique

Dans ces travaux des approches de génie génétique et métabolique ont été mises en œuvre pour augmenter la fourniture des précurseurs nécessaire à la biosynthèse d’un lipopeptide produit par Bacillus subtilis. Un réseau métabolique du métabolisme des acides aminés chez B. subtilis a d'abord été formalisé et modélisé par des outils bioinformatique. Puis, grâce à l’utilisation de la programmation par contrainte et à l’interprétation abstraite des interruptions de gènes ont été prédites dans ce réseau. Les prédictions se sont basées sur des gènes qui sont directement ou indirectement impliqués dans la régulation des gènes responsables de la biosynthèse de certains acides aminés ou dans le métabolisme central du carbone. Une stratégie de suppression de gènes sans l’utilisation de marqueur antibiotique (technique du Pop-in Pop-out) a été entreprise pour mener à bien ces multiples délétions dans une même souche et en évitant ainsi une limitation par les antibiotiques. Les résultats obtenus suite à la délétion de ces gènes ont montrés un impact différent sur la production du lipopeptide tant d’un point de vue quantitatif que qualitatif. Ce travail a établi que la limitation de la biosynthèse du lipopeptide par la fourniture en précurseur peut être surmontée en utilisant cette approche intégrée
Genetic and metabolic engineering approaches were implemented to increase the precursor availability required for the biosynthesis of a lipopeptide produced by Bacillus subtilis. A metabolic network of amino acids metabolism in B. subtilis was first formalized through biocomputing tools. Then gene knock-out prediction was made using abstract interpretation and constraint solving. Predictions were based on genes which are directly or indirectly involved in the regulation of the genes involved in the biosynthesis of amino acid residues or in central carbon metabolism pathways. A markerless gene deletion strategy (Pop-in Pop-out technique) was adopted to carry out multiple deletions in a single strain and avoid antibiotic limitation. It was observed that the deletion of these genes have varied impact on lipopeptide production quantitatively and qualitatively. This work establishes that the precursor limitation problem of lipopeptide biosynthesis can be overcome by using this integrative approach

Les bioréacteurs à biofilm représentent une technologie prometteuse pour la production continue de biosurfactants microbiens grâce à la robustesse naturelle des cellules immobilisées et à la conception possible de procédés évitant la formation de mousse. La souche bactérienne B. subtilis 168 a le potentiel de produire de la surfactine, un biosurfactant puissant qui possède des activités biologiques exceptionnelles ayant des applications industrielles diverses. Cependant, B. subtilis 168 ne présente que de faibles capacités de formation de biofilms et donc entraîne des capacités d'adhésion cellulaire limitées. Afin d'améliorer l'immobilisation cellulaire naturelle de B. subtilis 168 et pour mieux adapter cette souche à la culture de biofilms, des mutants filamenteux avec une production d'exopolysaccharides (EPS) restaurée ont été générés. Les impacts des modifications génétiques ont été évalués par des tests de colonisation et en mesurant la capacité de formation de biofilm sous faible contrainte de cisaillement dans un réacteur à écoulement goutte à goutte (DFR). Par la suite, les souches les plus performantes ont été sélectionnées et cultivées dans un bioréacteur à biofilm à film tombant continu contenant des éléments de garnissage métallique structurés pour la formation de biofilm. De plus, un modèle de croissance bactérienne a été développé pour décrire la dynamique de croissance des cellules planctoniques et du biofilm dans le système. Le développement des colonies a été fortement affecté par la croissance des cellules filamenteuses et la production d'EPS ce qui s’est manifesté par une capacité accrue d'étalement de surface et de colonisation. Dans le DFR et le bioréacteur à biofilm à film tombant, les mutants EPS+ ont montré des performances significativement augmentées concernant la formation de biofilm et les capacités de production de surfactine. La filamentation cellulaire a eu un impact mineur sur le procédé mais a contribué à une meilleure cohésion cellulaire dans le biofilm et a également conduit à un détachement cellulaire réduit pendant la culture. Ainsi, la production d'EPS et la croissance des cellules filamenteuses ont considérablement contribué à l'amélioration des performances du procédé dans le système. De plus, la culture en mode continu s'est révélée favorable à une production élevée en surfactine. Les données expérimentales du bioréacteur à biofilm à film tombant sont concordantes avec celles obtenues par des simulations avec le modèle de croissance développé. Par conséquent, le modèle de croissance a été validé avec succès et pourrait être utilisé pour une optimisation ultérieure de procédés à biofilm
Biofilm bioreactors show promise for continuous microbial biosurfactant production due to the natural robustness of self-immobilized cells and the possible design of processes avoiding foam formation. The widely used bacterial strain B. subtilis 168 has the potential to produce surfactin, a powerful biosurfactant with exceptional biological activities and various industrial applications. However, B. subtilis 168 exhibits only poor biofilm formation capacities and thus entails limited cell adhesion capacities. In order to improve the natural cell immobilization of B. subtilis 168 to adapt this strain better to biofilm cultivation, filamentous mutant strains with restored exopolysaccharide (EPS) production were generated. The impacts of the genetic modifications were evaluated through colonization assays and by measuring the biofilm formation capacity under low shear stress in a drip-flow reactor (DFR). Subsequently, the most performant strains were selected and cultivated in a newly designed continuous trickle-bed biofilm bioreactor containing highly structured metal packing elements for biofilm formation. Moreover, a bacterial growth model was built able to describe the growth dynamics of the planktonic cell and biofilm population in the system. The colony development was strongly affected by filamentous cell growth and EPS production which was manifested through an enhanced surface spreading and colonization capacity. In the DFR and trickle-bed biofilm bioreactor, the EPS+ mutants showed significantly increased performances regarding the biofilm formation and surfactin production capacities. Whereas cell filamentation had a minor impact on the processes, but contributed to a better cell cohesion in the biofilm and led to reduced cell detachment during the cultivation. Thus, EPS production and filamentous cell growth contributed considerably to an improved process performance in the system. In addition, continuous fermentation has shown to be favorable for a high surfactin productivity. The experimental data from the trickle-bed biofilm bioreactor were in good accordance with those obtained by simulations with the developed growth model. Hence, the growth model has been successfully validated and could be used for further process optimization