Littérature scientifique sur le sujet « Mesenchimali »

Il trattamento poli-farmacologico ha determinato, nel corso degli anni, un significativo rallentamento della progressione della malattia renale cronica verso lo stadio di uremia terminale, ma siamo ancora distanti dallo sviluppo di interventi terapeutici in grado di bloccare questo inesorabile e irreversibile processo. Studi clinico-patologici hanno chiaramente dimostrato che il principale elemento coinvolto nel danno renale è la fibrosi tubulo-interstiziale e che il meccanismo patogenetico alla base di questa condizione ha inizio in larga parte nel compartimento tubulare. In particolare, il processo di transizione epitelio-mesenchimale gioca un ruolo importante nella genesi del danno cronico. Durante questo processo, le cellule epiteliali tubulari subiscono un incremento significativo di markers di superficie di natura mesenchimale e, grazie al rimodellamento del citoscheletro e alla degradazione della membrana basale, sono in grado di migrare nell'interstizio dove svolgono un ruolo chiave nel processo patogenetico. In questo contesto, sembra avere un ruolo chiave l'enzima eparanasi, una endo-β-D-glucuronidasi che taglia le catene dell'eparan-solfato a livello di siti specifici intracatena, e partecipa attivamente alla degradazione e al rimodellamento della matrice extracellulare. La degradazione dei vari costituenti dell'ECM, inclusi i proteoglicani eparan-solfato fa-vorisce il rilascio di fattori trofici quali il FGF-2 che induce l'espressione dei marcatori mesenchimali alfa-SMA, VIM e FN, porta alla degradazione della membrana basale mediante la secrezione di metalloproteinasi della matrice ed aumenta la motilità cellulare. L'epressione dell'eparanasi è regolata da fattori di trascrizione, dalla metilazione del DNA e da varie molecole endogene. L'importanza di questo enzima è stata confermata clinicamente dal riscontro di una sua iperespressione in preparati istologici di biopsie effettuate in soggetti affetti da nefropatie croniche (per esempio, nefropatia diabetica). Pertanto visto l'importante ruolo dell'eparanasi sono in fase di standardizzazione numerose strategie per inibire la sua espressione genica e/o la sua attività enzimatica. Infine, è stato proposto il suo possibile utilizzo come biomarker di progressione del danno tubulo-interstiziale da utilizzare routinariamente in ambito nefrologico.

Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) account for a small population of cells of the non-hematopoietic component of bone marrow. MSCs are multipotent stem cells endowed with neurotrophic potential combined to immunological properties, making them a promising therapeutic tool for neurodegenerative disorders. Although the mechanisms by which they act are still largely unknown, trans-differentiation, paracrine and autocrine actions have been hypothesized. Here we focus on the study of the effects exerted by rat MSCs on CNS neurons and oligodendrocytes by using a simplified in vitro co-culture system that precludes any direct contact between different cell types. The analysis of hippocampal synaptogenesis, synaptic vesicle recycling and electrical activity show that MSCs by themselves, efficiently support morphological and functional neuronal differentiation. Our observations demonstrate that MSCs selectively and directly increased hippocampal GABAergic presynapses and inhibitory transmission. In fact, this increment correlated to a higher expression of the potassium/chloride KCC2 cotransporter and to an enhancement of both the frequency and the amplitude of mIPSC and sIPSC. The decreased of GABA synapses following the treatment with a widely used Trk-neurotrophin receptor blocker, K252a, and the more specific TrkB receptor bodies prompt for the involvement of the brain derived neurotrophic factor (BDNF) in mediating such effects. The involvement of this neurotrophin is also strengthened by test ELISA on the culture medium collected from MSC-neuron co-cultures in which an higher BDNF concentration was detected, when compared to astrocyte-neuron co-cultures. The results obtained indicate that MSC-secreted factors induce glial-dependent neuronal survival and directly trigger an augmented GABAergic transmission in hippocampal cultures, highlighting a new effect by which MSCs could cooperate in CNS repair. Additionally, MSCs have been described to improve the clinical course of some demyelinating pathologies and to promote tissue repair through immunological mechanisms and neuroprotective effects. Following these evidences we performed in vitro and in vivo experiments to assess whether MSCs exert their actions through the support of oligodendrocytes (OLs), the myelinating CNS cells, and participate in the regulation of their proliferation and maturation. Through the analysis of specific proteins typically used as markers of the different stages of proliferation, maturation and differentiation (specifically, the membrane glycoprotein O4, the proteoglycan NG2 and myelin basic protein MBP, respectively), it has been noticed that MSCs are capable to prolong the proliferation phase of OPCs and also to anticipate OL differentiation, with respect to standard astrocyte/OL co-cultures. Moreover we investigated a possible molecular mechanism underlying these phenomena focusing on neurotrophin pathways. Trk receptors activation was analyzed in order to find out a possible role of neurotrophins in MSC-mediated effects on OLs, as it happens in neuronal cultures. We focused on the changes in the phosphorylation level of ERK (Extracellular signaling-regulated kinases), one of the activated effectors by TrK receptors. Our observations show that, in OLs co-cultured with MSCs, ERK is highly phosphorylated with respect to astrocyte/OL co-cultures, suggesting a MSC-induced activation of the pathways regulated by this protein. These data, although preliminary, suggest that MSCs positively act on the regulation of proliferation and maturation of OLs and, due to the observed effects on the regulation of synaptogenesis (see above), make these cells an interesting model for the identification of molecules involved in MSC neuroprotective processes. This may open new therapeutic approaches in the treatment of neurodegenerative diseases involving not only a synaptic imbalance, as it happens in various forms of epilepsy, but also in demyelinating diseases. Thus, in this research project, we aimed at characterising the molecular mechanisms underlying MSC actions that could participate in the recovery of neurological disorders or demyelinating pathologies.

Le cellule staminali mesenchimali (Mesenchymal Stem Cells, MSCs) sono una popolazione con elevata capacità proliferativa e con potenziale di differenziazione multilineare; rappresentano, quindi, delle buone candidate per la terapia cellulare e la medicina rigenerativa. In questo studio sono state valutate MSCs fetali isolate da villi coriali (Chorionic Villi, CV) e da liquido amniotico (Amniotic Fluid, AF), confrontandole con le MSCs ottenute da midollo osseo (Bone Marrow, BM), per la capacità di crescita in presenza di siero umano allogenico (human serum, HS) o di lisato piastrinico (platelet lysate, PL), per le caratteristiche immunofenotipiche, il profilo di espressione citochinico e l’attività immunoregolatoria su linfociti allogenici stimolati e sottopopolazioni immunoselezionate. Data l’elevata potenzialità di espansione delle MSCs fetali, le cellule studiate sono state valutate per la loro stabilità replicativa tramite lo studio della lunghezza dei telomeri, l’attività dell’enzima telomerasi, l’espressione dei geni hTERT, c-myc e p53 e l’analisi del cariotipo. Una popolazione omogenea di cellule fibroblastoidi positiva ai tipici marcatori di superficie mesenchimali è stata isolata da tutti i campioni di CV ed AF analizzati. Le cellule di CV espandono rapidamente in HS (20 raddoppiamenti di popolazione, PDs, in 59 giorni e 6 passaggi di coltura), mentre in siero animale (fetal bovine serum, FBS) raggiungono 27 PDs in 65 giorni e 7 passaggi. Il PL determina un’espansione nel 60% dei campioni CV, comunque minore rispetto a quella in HS. I campioni di AF espandono, invece, 40 PDs in 90 giorni, ma solo nel 20% dei campioni analizzati, non proliferano in PL, mentre in FBS espandono 28.5 PDs in 66 giorni. Le cellule fetali studiate inibiscono la proliferazione di linfociti allogenici stimolati e regolano la crescita anche di popolazioni linfocitarie selezionate CD4+ e CD8+. Nonostante il loro elevato potenziale di espansione, le MSCs fetali studiate hanno mostrato una lunghezza stabile dei telomeri durante la cultura a lungo termine, assenza dell’attività telomerasica, nessuna espressione di hTERT, livelli costanti di espressione di c-myc e p53 e nessuna anomalia cromosomica. In conclusione, i risultati mostrano che i CV rappresentano un’ottima fonte di MSCs con proprietà immunoregolatorie, capace di espandere in un sistema di proliferazione umanizzato a lungo termine senza alterazioni genetiche. In più del 90% dei campioni di CV analizzati si ottiene un’espansione su larga scala in presenza di siero umano, incoraggiante per potenziali applicazioni cliniche.
Mesenchymal stem cells (MSCs) are promising candidates for cell therapy and tissue engineering. In previous studies, the most important source of MSCs was adult bone marrow (BM). Recently, MSCs with similar cell surface markers and differentiation capacity have also been found in developmentally younger tissues. This study showed data from fetal MSCs obtained from first-trimester chorionic villi (CV) and second trimester amniotic fluid (AF), comparing them with BM. The work reports on growth in human allogeneic serum (HS) and platelet lysate (PL), immunophenotype, cytokine expression profile and immunoregulatory activity of fetal MSCs on stimulated peripheral blood mononuclear lymphocyte subpopulations. The cells studied was analyzed also for telomere length, telomerase activity, hTERT, p53 and cmyc transcriptions, to evaluate their replicative stability. Spontaneous chromosomal alterations were excluded by cytogenetic analysis. CV cells grow rapidly in HS, with 20 populations doublings (PDs) after 59 days (6 passages), and also in animal serum, with 27 PDs after 65 days (7 passages). PL allowed an expansion in 60% of the samples tested, though it was lower than HS. HS supported an average of 40 PDs of expansion in 20% of AF cells after 90 days, whereas animal serum supported 28.5 PDs in 66 days. CV and AF cells inhibited the proliferation of stimulated T lymphocytes, suppressing the growth of both CD4+ and CD8+ T subpopulations and, sometimes, CD19+ cells. Despite their high proliferation capacity, fetal MSCs showed no telomerase activity, no hTERT transcriptions and maintained long, stable telomeres. A constant expression level of p53 and c-myc and a normal karyotype were preserved throughout long-term expansion, suggesting the safety of fetal MSCs. In conclusion, these results indicate that CV would be an optimal and safety source of MSCs with high expansion potential in a HS propagation system, immunoregulatory capacity of T and B lymphocytes. More than 90% of CV samples achieved a large-scale expansion in HS, that is encouraging for potential clinical applications of these cells.

SOMMARIO I prodotti di ingegneria tissutale sono medicinali che contengono o consistono in cellule o tessuti sottoposti ad una rilevante manipolazione così da ottenere caratteristiche biologiche, funzioni fisiologiche e proprietà strutturali pertinenti alla finalità di rigenerazione, riparazione o sostituzione. Nel caso di cellule e tessuti manipolati in vitro, l'obiettivo da raggiungere nel controllo dei processi di produzione e della qualità del prodotto finale è garantire la sicurezza e l'efficacia dei prodotti da immettere nell'uso clinico. Ne consegue la necessità di operare nel rispetto di norme proprie dei processi produttivi dei farmaci sia dal punto di vista della qualità che della sicurezza del prodotto. Lo scopo del lavoro svolto durante il dottorato è stato lo studio e messa a punto di sistemi di produzione per la generazione di un prodotto innovativo per terapie avanzate. Si tratta di un prodotto costituito da cellule staminali mesenchimali, ottime candidate per applicazioni cliniche in medicina rigenerativa. Per la produzione di un prodotto di terapia avanzata, l’intero processo, a partire dal campione iniziale fino al prodotto finito, deve essere svolto in un’officina farmaceutica autorizzata che operi nel rispetto delle Good Manufacturing Practices (GMP). Si tratta di linee guida il cui scopo è assicurare che un farmaco sia prodotto, analizzato e rilasciato in un regime di Qualità controllata e certificata in modo da minimizzare il pericolo che vi siano rischi non previsti per il paziente. Nella fase preliminare del processo è stata valutata la fattibilità del metodo e sono stati definiti i protocolli da impiegare. La fase di fattibilità ha permesso di mettere a punto la procedura di isolamento, espansione, differenziamento delle cellule staminali. E’ stato possibile valutare la stabilità genomica e le caratteristiche immunofenotipiche delle cellule a vari passaggi cellulari. Tutti i dati ottenuti durante lo studio di fattibilità sono stati fondamentali per definire i test di controllo di qualità, le specifiche di prodotto e i criteri di accettabilità richiesti per la successiva convalida del processo. I risultati presentati durante lo studio di fattibilità evidenziano come sia possibile trasferire protocolli di ricerca in processi potenzialmente applicabili in sperimentazione clinica. Alla fine del processo di convalida che prevede la produzione di tre lotti di cellule, le specifiche previste per i controlli in ingresso, durante il processo di produzione e sul prodotto finito devono risultare conformi a tutte le richieste. I passi futuri sono la validazione del processo asettico, mediante l’esecuzione di tre mediafill e la valutazione del rischio relativa alla produzione di lotti destinati alla clinica, in modo da completare la serie di studi necessari per la presentazione di una domanda di autorizzazione allo studio clinico.
ABSTRACT Tissue Engineered products may carry cells or tissues either of human or animal origin. The cells and tissues shall be subjected to substantial manipulation in order to obtain biological characteristics, physiological functions or structural properties relevant for the intended regeneration, repair or replacement. For cells and tissues manipulated in vitro, the objective to be achieved in terms of control of production processes and quality of the final product is to ensure the safety and effectiveness of the products that would be placed in clinical use. Hence the need to act in accordance with the rules which define production processes used for drugs, in order to guarantee the quality and safery of the product.. The purpose of the work done during the PhD was the study and the development of production protocol for the generation of an innovative product for advanced therapies. It is a cellular product made of mesenchymal stem cells, good candidates for clinical applications in regenerative medicine. For this production, all stages, starting from the initial sample and up to the final product, must be carried out in an authorized pharmaceutical facility which operates in compliance with Good Manufacturing Practices (GMP). The purpose of these guidelines is to ensure that drugs are produced, analysed and released in a regime of controlled and certified quality minimizing the danger of unexpected risks for the patient. In the preliminary phase of the process the feasibility of the method was evaluated and the protocols to be used were defined. The feasibility phase allowed the development of procedures for the isolation, expansion and differentiation of stem cells. It was possible to evaluate the genomic stability and immunophenotypic features of the cells at different steps. All data obtained during the feasibility study have been fundamental to define the tests of quality control, product specifications and criteria of acceptability required for the subsequent validation of the process. The results presented in the feasibility study show that it is possible to transfer research protocols to a GMP framework which is potentially applicable in clinical trials. At the end of the validation process, which involves the production of three batches of cells, the specifications required for the incoming controls, during the production’s process and on the final product must comply with all the requirements. The future steps will be the validation of the aseptic process, through the execution of three mediafill and the risk assessment related to the production of batches intended for clinical use, in order to complete the series of documents required for the submission of an application for a clinical study.

Le cellule staminali mesemchimali (MSC) sono una popolazione eterogenea di cellule stromali multipotenti, possono essere isolate da diversi tessuti adulti e possono dare origine a diversi tipi cellulari(21). Nel midollo osseo (BM) differenziano principalmente in osteoblasti e adipociti, e l’ interazione con questo microambiente influenza da vicino il loro programma differenziativo. FasL è una citochina molto conosciuta per il suo ruolo pro-apoptotico, in associazione con il suo recettore specifico Fas, tuttavia diversi studi propongono che sia coinvolta anche in altri processi biologici. Questo lavoro dimostra per la prima volta che FasL può essere coinvolto nella proliferazione e nella differenziazione delle BM-MSC. Le BM-MSC trattate con una bassa dose di FasL (0.5 ng/ml) proliferano più rapidamente delle cellule non trattate, senza andare incontro ad apoptosi o a processi differenziativi, mentre dosi più alte (25 ng/ml) inducono il processo apoptotico nel 20% delle cellule, selezionando una popolazione con un fenotipo ancora staminale. A livello molecolare il trattamento con FasL 0.5 ng/ml induce la fosforilazione di ERK 1/2 e l’aumento dell’espressione della survivina mentre FasL 25 ng/ml determina l’attivazione delle caspasi 8 e 3. Inoltre FasL 25 ng/ml attraverso la modulazione di PPARγ e FABP4/aP2 inibisce reversibilmente la differenziazione delle BM-MSC in adipociti. I dati di inibizione dell’adipogenesi in vitro sono stati confermati su topi Fas lpr, mutati per Fas, che hanno mostrato una maggiore espressione dell’mRNA e delle proteine PPARγ e FABP4/aP2 rispetto ai controlli. I nostri dati suggeriscono che il sistema FasL/Fas è coivolto nella biologia delle BM-MSC, e può regolarne sia la proliferazione che il differenziamento adipogenico. Questi risultati possono avere una rilevanza clinica, chiarendo i meccanismi che determinano l’aumento dell’adipogenesi nel midollo durante l’invecchiamento o in alcune condizioni patologiche come l’osteoporosi.
Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent progenitor cells that can differentiate into several cell types. Bone marrow (BM)-MSCs mainly differentiate into osteoblasts or adipocytes. MSC interactions with their microenvironment directly affect their self-renewal/differentiation program. Here we show for the first time that FasL, a well-explored pro-apoptotic cytokine, can promote proliferation of BM-derived MSCs in vitro and inhibits their differentiation into adipocytes. BMMSCs treated with a low FasL dose (0.5 ng/ml) proliferated more rapidly than untreated cells without undergoing spontaneous differentiation or apoptosis, whereas higher doses (25 ng/ml) induced significant though not massive BM-MSC death, with surviving cells maintaining a stem cell phenotype. At the molecular level, 0.5 ng/ml FasL induced ERK1/2 phosphorylation and surviving up-regulation, whereas 25 ng/ml FasL induced caspase activation. Importantly, 25 ng/ml FasL reversibly prevented BM-MSC differentiation into adipocytes by modulating PPARγ and FABP4/aP2 expression induced by adipogenic medium. All such effects were inhibited by anti-Fas neutralizing antibody. The in vitro data regarding adipogenesis were confirmed using Faslpr mutant mice, where higher PPARγ and FABP4/aP2 mRNA and protein levels were documented in whole tibia. These data show that the FasL/Fas system plays a role in BM-MSC biology via regulation of both proliferation and adipogenesis. These findings may have clinical relevance because circulating Fas/FasL levels decline with age and several age-related conditions, including osteoporosis, are characterized by adipocyte accumulation in BM.

L'ingegneria tissutale è un campo multidisciplinare in rapida crescita che si avvale delle scienze fisiche, ingegneristiche e della vita per sviluppare ed ottenere cellule funzionali, tessuti ed organi per riparare, sostituire o migliorare le funzioni biologiche perse a causa di anomalie congenite, traumi, malattie o invecchiamento. Nell’ambito della ricostruzione della cartilagine articolare sono stati fatti notevoli passi in avanti ma la soluzione per il ripristino completo del tessuto sembra ancora essere lontana. Nella prima parte di questo lavoro è stata valutata la capacità di uno scaffold a base di gelatina di indirizzare le ADSCs verso un differenziamento in senso condrogenico. Successivamente, con lo scopo di migliorare il grado differenziamento e diminuire i costi associati all’utilizzo di fattori differenziativi, l’attenzione è stata posta sullo sviluppo di un biomateriale a base di alginato e ioni cobalto in modo da mimare e sfruttare le caratteristiche fisiche della cartilagine piuttosto che il suo intorno chimico. In ultimo, è stato sviluppato un sistema low cost per la produzione di chip microfluidici sfruttabili per la realizzazione di sistemi micrometrici per incapsulazione cellulare.
Tissue engineering is an interdisciplinary and multidisciplinary field that aims at the developmentof biological substitutes that restore, mantain, or improve tissue function. Concerning the articular cartilage many improvments were made, but the complete tissue restoration approach still lacking. In the first part of this work, it was evaluated the ability of a gelatin scaffold to promote the condrogenic differentiation of ADSCs. Successively, in order to obtain a low cost sistem, a based alginate/Cobalt scaffold was designed with the aim to take advantage of the physical features of the cartilage tissue. Finally, it was developted a cost effective method to produce microfluidic chips with the aim to obtain micro-systems for cell encapsulation.

L'ingegneria tissutale è un campo multidisciplinare in rapida crescita che si avvale delle scienze fisiche, ingegneristiche e della vita per sviluppare ed ottenere cellule funzionali, tessuti ed organi per riparare, sostituire o migliorare le funzioni biologiche perse a causa di anomalie congenite, traumi, malattie o invecchiamento. Nell’ambito della ricostruzione della cartilagine articolare sono stati fatti notevoli passi in avanti ma la soluzione per il ripristino completo del tessuto sembra ancora essere lontana. Nella prima parte di questo lavoro è stata valutata la capacità di uno scaffold a base di gelatina di indirizzare le ADSCs verso un differenziamento in senso condrogenico. Successivamente, con lo scopo di migliorare il grado differenziamento e diminuire i costi associati all’utilizzo di fattori differenziativi, l’attenzione è stata posta sullo sviluppo di un biomateriale a base di alginato e ioni cobalto in modo da mimare e sfruttare le caratteristiche fisiche della cartilagine piuttosto che il suo intorno chimico. In ultimo, è stato sviluppato un sistema low cost per la produzione di chip microfluidici sfruttabili per la realizzazione di sistemi micrometrici per incapsulazione cellulare.
Tissue engineering is an interdisciplinary and multidisciplinary field that aims at the developmentof biological substitutes that restore, mantain, or improve tissue function. Concerning the articular cartilage many improvments were made, but the complete tissue restoration approach still lacking. In the first part of this work, it was evaluated the ability of a gelatin scaffold to promote the condrogenic differentiation of ADSCs. Successively, in order to obtain a low cost sistem, a based alginate/Cobalt scaffold was designed with the aim to take advantage of the physical features of the cartilage tissue. Finally, it was developted a cost effective method to produce microfluidic chips with the aim to obtain micro-systems for cell encapsulation.

Introduzione. Un’infiltrazione infiammatoria e un’eccessiva proteolisi della matrice extracellulare(ECM), mediata da metallo-proteinasi(MMPs), sono alterazioni dell’aneurisma dell’addominale(AAA). Le cellule staminali mesenchimali(MSC) sono state isolate dalla parete vascolare e rappresentano potenziali candidati target per la medicina rigenerativa in virtù di differenziazione mesodermica e immuno-modulatoria. Scopo dello studio è stato valutare la presenza di un potenziale ruolo delle MSCs nello sviluppo di AAA. Metodi. Sono stati prelevati segmenti di parete aortica aneurismatica da AAA sottoposti a trattamento chirurgico open e segmenti di tessuti aortici da donatori sani. È stata effettuata valutazione istologica della parete di AAA. Le MSCs sono state isolate dal tessuto di AAA(AAA-MSC) e caratterizzate. Le AAA-MSCs sono poi state testate per caratteristiche di immuno-modulazione mediante co-colture di cellule mononucleate attivate(PBMC)da sangue periferico e di MSCs da donatore sano. Risultati. Le cellule AAA-MSCs hanno mostrato proprietà feno/genotipiche mesenchimali: forma fibroblastica, presenza di antigeni MSC e geni staminali. Le MMP-9 sono risultate significativamente aumentate in AAA-MSCs rispetto MSCs. Le AAA-MSCs hanno dimostrato una debole attività immunosoppressiva. I livelli di MMP-9 sono modulate a livello trascrizione attraverso 'azione paracrina di MSCs sane. Conclusioni. L’AAA non ha influenzato il fenotipo delle MSC, ma ne ha alterato la funzione, aumentando l’attività di MMP-9 e mostrando un’inefficace attività di immuno-modulazione. Questi dati suggeriscono che le MSCs della nicchia vascolare contribuiscono alla formazione diAAA. Lo studio dei processi per ripristinare l’immunomodulazione delle MSsC potrebbe essere utile per trovare un approccio medico per il monitoraggio/progressionee degli AAA.
Background. inflammatory infiltrate and excessive extracellular matrix proteolysis (ECM), by Metalloproteinasis (MMPs), are typical characteristics of abdominal aortic aneurysm (AAA). Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) have been detected in the vascular wall and represent attractive target for regenerative medicine, due to the mesodermal lineage differentiation and immunomodulatory activity. Previous papers underlined an impaired MSC behaviour under pathological conditions. Aim of the study was to define the potential role of vascular MSCs to AAA development. Methods. Aortic tissues were collected from patients with AAA and healthy donors. The analysis was organized in three steps: 1) histology of AAA wall; 2) detection of MSCs and evaluation of MMP-9 expression in AAA; 3) MSC isolation from AAA and characterization for mesenchymal/stemness markers, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 and EMMPRIN. AAA-MSCs were tested for immunomodulation, when cultured with activated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Co-culture of both healthy and AAA MSCs was performed and afterwards MMP-2/9 mRNA levels were analyzed. Results. AAA-MSCs showed mesenchymal features: fibroblastic aspect, MSC antigens, stemness genes. MMP-9 mRNA, protein and enzymatic activity were increased in AAA-MSCs. Moreover, AAA-MSCs showed a weak immunosuppressive activity, as shown by PBMC ongoing along cell cycle. MMP-9 was shown to be modulated at the transcriptional level through the contact as well as the paracrine action of healthy MSCs. Discussion. Vascular injury did not affect the MSC phenotype, but altered their function, as increased MMP-9 expression and ineffective immunomodulation. These data suggest that vascular MSCs can contribute to aortic disease. The study of key processes to restore MSC immunomodulation could be relevant to find a pharmacological approach for the aneurysm progression

Background. Mesenchymal stem cells (MSC) may be of value in regeneration of renal tissue after damage, however lack of biological knowledge and variability of results in animal models limit their utilization. Methods. We studied the effects of MSC on podocytes ‘in vitro’ and ‘in vivo’ utilizing adriamycin (ADR) as a model of renal toxicity. The ‘in vivo’ experimental approach was carried out in male Sprague Dawley rats (overall 60 animals) treated with different ADR schemes to induce acute and chronic nephrosis. MSC were given a) concomitantly to ADR in tail vein or b) in aorta and c) in tail vein 60 days after ADR. Homing was assessed with PKH26-MSC. Results. MSC rescued podocytes from apoptosis induced by ADR ‘in vitro’. The maximal effect (80% rescue) was obtained with MSC/Podocytes co-culture ratio of 1:1 for 72 hours. All rats treated with ADR developed nephrosis. In no case MSC modified the clinical parameters (i.e. proteinuria, serum creatinine, lipids) but protected the kidney from severe glomerulosclerosis when given concomitantly to ADR. Rats given MSC 60 days after ADR developed the same severe renal damage. Only few MSC were found in renal tubule-interstitial areas after 1-24 hours from injection and no MSC was detected in glomeruli. Conclusions. MSC reduced apoptosis of podocytes treated with ADR ‘in vitro’. Early and repeated MSC infusion blunted glomerular damage in chronic ADR nephropathy. MSC did not modify proteinuria and progression to renal failure, that implies lack of regenerative potential in this model.

Background. Mesenchymal stem cells (MSC) may be of value in regeneration of renal tissue after damage, however lack of biological knowledge and variability of results in animal models limit their utilization. Methods. We studied the effects of MSC on podocytes ‘in vitro’ and ‘in vivo’ utilizing adriamycin (ADR) as a model of renal toxicity. The ‘in vivo’ experimental approach was carried out in male Sprague Dawley rats (overall 60 animals) treated with different ADR schemes to induce acute and chronic nephrosis. MSC were given a) concomitantly to ADR in tail vein or b) in aorta and c) in tail vein 60 days after ADR. Homing was assessed with PKH26-MSC. Results. MSC rescued podocytes from apoptosis induced by ADR ‘in vitro’. The maximal effect (80% rescue) was obtained with MSC/Podocytes co-culture ratio of 1:1 for 72 hours. All rats treated with ADR developed nephrosis. In no case MSC modified the clinical parameters (i.e. proteinuria, serum creatinine, lipids) but protected the kidney from severe glomerulosclerosis when given concomitantly to ADR. Rats given MSC 60 days after ADR developed the same severe renal damage. Only few MSC were found in renal tubule-interstitial areas after 1-24 hours from injection and no MSC was detected in glomeruli. Conclusions. MSC reduced apoptosis of podocytes treated with ADR ‘in vitro’. Early and repeated MSC infusion blunted glomerular damage in chronic ADR nephropathy. MSC did not modify proteinuria and progression to renal failure, that implies lack of regenerative potential in this model.

La fibrosi cistica (FC) è una malattia genetica letale, autosomica recessiva, causata dalla mutazione del gene Cystic Fibrosis Trasmembrane Conductance Regulator (CFTR) che codifica per una proteina canale che regola la conduzione transmembrana di cloro, cAMP- dipendente, espressa sul lato apicale delle cellule epiteliali. Il difetto di base dell’epitelio respiratorio nei pazienti è duplice ossia riguarda la secrezione di cloro e l’assorbimento di sodio. Ne deriva un alterato flusso di fluidi attraverso l’epitelio, con alterata clearance mucociliare respiratoria, cicli di infezioni batteriche e infiammazione ed infine grave danno polmonare. Principale causa di morbilità e mortalità è l’infiammazione cronica che colpisce il polmone. Sono stati scoperti farmaci agenti direttamente sulla CFTR ma non riescono a risolvere il difetto associato a tutte le mutazioni responsabili della FC. La terapia cellulare, invece, essendo agnostica per la mutazione, ha la possibilità di poter curare ogni paziente. Oltre al midollo osseo, nuova promettente fonte di cellule staminali è la membrana amniotica, da cui derivano cellule stromali mesenchimali amniotiche umane (hAMSC) che esprimono marcatori di staminalità e possono differenziare in cellule epiteliali respiratorie quando co-coltivate con cellule epiteliali bronchiali umane immortalizzate (CFBE14o-), omozigoti per l’allele F508del, mutazione più frequente nella FC. Le co-colture mostrano un’aumentata espressione e funzionalità della CFTR e una parziale correzione di altri difetti di base associati alla FC. Poiché tali risultati vengono ottenuti solo nelle co-colture, è stato supposto che un contatto diretto tra hAMSC e CFBE14o- sia necessario per il recupero di tali difetti. Uno degli obiettivi di questa tesi è stato comprendere il ruolo della comunicazione intercellulare, mediata dalle gap junctions (GJ), nelle co-colture studiate per l’espressione e la funzionalità della proteina Cx43, una delle principali componenti delle GJ, silenziando o meno le stesse con un siRNA diretto contro l’mRNA di interesse. I risultati evidenziano il ruolo fondamentale delle GJ nella correzione dei difetti di base associati alla FC da parte delle hAMSC. Si è, quindi, indagato quale messaggero molecolare potesse essere trasmesso attraverso le GJ e, eventualmente, mediare l’effetto terapeutico delle hAMSC. Anche i microRNA (miRNA) vengono trasferiti attraverso le GJ ed è stato dimostrato il loro coinvolgimento nei livelli di espressione della CFTR. In particolare, miRNA-138 aumenta l’espressione della CFTR interagendo con la proteina SIN3A. Sono stati quindi studiati i livelli di miRNA-138 mediante droplet digital PCR. I dati preliminari mostrano come le cellule wild-type abbiano dei livelli più alti di miRNA-138 rispetto alle CFBE14o- con un trend all’aumento nelle co-colture. Ulteriore obiettivo è stato studiare se le hAMSC possano velocizzare la rigenerazione dell’epitelio respiratorio bronchiale e la chiusura delle lesioni che continuamente si formano sotto lo stimolo infiammatorio cronico nei polmoni dei pazienti con FC. I risultati dimostrano che le hAMSC aggiunte ad una ferita indotta su un monostrato di CFBE14o-, sono in grado di riparare il danno con la stessa tempistica richiesta ad una ferita simulata su monostrato di cellule epiteliali bronchiali wild type. Questi studi indicano la possibile utilità terapeutica delle cellule hAMSC nella malattia polmonare associata alla FC, sebbene ulteriori studi sul loro meccanismo d’azione e in modelli più vicini alla patologia umana siano necessari.
Cystic fibrosis (CF) is a lethal, autosomal recessive inherited genetic disease caused by mutation on the Cystic Fibrosis Trasmembrane Conductance Regulator (CFTR) gene encoding a cAMP-dependent channel protein that regulates transmembrane conduction of chloride, which is expressed on the apical membrane of epithelial cells. The basic defect of the airway epithelium in CF patients is due to a double defect in chloride secretion and sodium absorption that lead to an altered flow of fluids through the epithelium of the airways, resulting in an alteration of the airway’s mucociliary clearance, opportunistic bacterial infections, inflammation and severe lung damage. The main cause of morbidity and mortality is chronic inflammation affecting the lung. New drugs have been developed recently to act directly on the CFTR protein, in order to rescue the mutated CFTR processing and function. However, there are still mutations that still failed to be rescued by CFTR modulators. Cell therapy, on the other hand, being agnostic for mutation, has the possibility of being able to cure every patient. Recently have been investigated stem cells as potential therapeutic sources for CF. In addition to the bone marrow, stem cells derived from the amniotic membrane, human amniotic mesenchymal stem cells (hAMSC) are very promising as they express stem cells markers and can differentiate into respiratory epithelial cells when they are co-cultured with immortalized human bronchial epithelial cells (CFBE14o-), homozygous for the F508del allele, the most frequent mutation in CF. The co-cultures also show an increased processing and conductance of the CFTR protein and a partial correction of other basic defects associated with the disease. Since these results are obtained only in co-cultures, it has been assumed that direct contact between hAMSC and CFBE14o- is necessary for the recovery of these defects. One of the objectives of this thesis was to understand the role of intercellular communication, mediated by gap junctions (GJ), in co-cultures that were studied for the expression and functionality of the Cx43 protein, one of the main components of GJ, before and after their silencing, obtained using a siRNA directed against the mRNA of interest. The results highlighted the fundamental role of GJ in the correction of the basic defects associated with CF by hAMSC. It was further investigated which molecular messenger could be transmitted through the GJ and, possibly, mediate the therapeutic effect of hAMSC. MicroRNAs (miRNAs) are also transferred across GJ and their involvement in the expression levels of the CFTR protein has been demonstrated. In particular, miRNA-138 increases the expression of the CFTR protein by interacting with the SIN3A protein. The levels of miRNA-138 were then investigated by droplet digital PCR. Preliminary data show that wild-type CFTR cells have higher levels of miRNA-138 than cells with F508del mutation and that there is an upward trend in co-cultures. A further objective of the study was to investigate whether hAMSC can speed up the regeneration of the airway bronchial epithelium and the closure of the injury that continuously form under the chronic inflammatory stimulus in the lungs of CF patients. The results demonstrate that hAMSC added to a wound induced on a monolayer of CFBE14o-, are able to repair the damage with the same timing required for a simulated wound on a monolayer of wild type CFTR bronchial epithelial cells. Taking to account the data generated in the current study, it indicates the possible therapeutic utility of hAMSC in lung disease associated with CF. However, further studies on their mechanism of action conducted in models with closer resemblance to human CF pathology are required.