Littérature scientifique sur le sujet « Medicina rigenerativ »

Nella malattia renale cronica, il rischio di fallimento d’organo dipende dal grado di severità della proteinuria, la quale è determinata dal numero di podociti persi e dalla conseguente fibrosi glomerulare. Esistono, tuttavia, numerose evidenze cliniche e sperimentali che suggeriscono la possibilità di remissione della malattia renale e, in alcuni casi, persino di regressione del danno, quando ancora l’istologia dell’organo non risulti totalmente compromessa. Tali risultati sono ottenuti in particolare mediante l’impiego di terapie con effetti anti-proteinurici. Nuove evidenze sperimentali suggeriscono perché il blocco della perdita di proteine urinarie permetta la remissione della malattia renale cronica. In un recente articolo di Peired et al., è, per la prima volta, dimostrato come l’albuminuria blocchi il processo rigenerativo a causa del sequestro attuato dall’albumina ai danni della vitamina A, noto agente differenziativo per popolazioni di progenitori staminali presenti in vari organi. La conseguente perdita della vitamina A, complessata all’albumina, con le urine, impedisce, quindi, l’attivazione dei progenitori renali residenti nella capsula di Bowman, bloccando sul nascere la risposta rigenerativa e permettendo la progressione della malattia renale cronica.

Lo sviluppo di sempre nuove conoscenze sulle cellule staminali e il contemporaneo progresso delle Techniche basate sull'ingegneria tissutale permettono, ad oggi, di ampliare gli orizzonti della medicina rigenerativa e le sue applicazioni in ambito terapeutico. In questo articolo sono riportate le Techniche e le possibilità di base inerenti la creazione de novo di tessuti ed organi in vitro, evidenziandone sia i benefici, sia le problematiche di maggior rilievo che rendono tali approcci ancora poco applicabili in terapia, come la questione correlata al rigetto di natura immunitaria. Unendo la tematica del rigetto autoimmune e dell'ingegneria tissutale sarà quindi introdotta una possibile alternativa per la creazione di strutture renali totalmente create in vitro, ma anche totalmente funzionali.

Nel gennaio scorso il Senato francese – nell’ambito dell’intenso dibattito sulla revisione delle Lois Bioéthiques del 1994 – ha approvato un disegno di legge che vieta ogni forma di clonazione, vale a dire non solo la clonazione c.d. “riproduttiva”, ma anche la clonazione c.d. “terapeutica”. Si tratta di un risultato importante, ma non ancora definitivo perché su di esso pende la decisione dell’Assemblea Nazionale. Tuttavia merita di essere segnalato, perché controcorrente rispetto al generale atteggiamento favorevole alla “clonazione terapeutica” e contrario alla “clonazione riproduttiva” ed in linea, dunque, con le indicazioni del Parlamento Europeo secondo cui “una nuova strategia semantica cerca di indebolire il significato morale della clonazione umana” poiché “non vi è alcuna differenza tra clonazione a fini terapeutici e clonazione a fini di riproduzione”. Nell’articolo la decisione del Senato viene inserita in un duplice contesto: quello del dibattito biogiuridico in Francia e quello che, più o meno contemporaneamente, è andato e va svolgendosi nel panorama internazionale. I numerosi documenti passati in rassegna mettono in evidenza come, ancora una volta, l’embrione umano sia al centro della discussione: se l’embrione è un oggetto, può essere utilizzato per raggiungere gli obiettivi della medicina rigenerativa, ma se è un soggetto non può essere strumentalizzato per nessun fine. Il principio di relazionalità, il principio di uguaglianza, il principio di solidarietà, il principio cautelativo sono le indicazioni che la moderna concezione del diritto offre per dire che ogni soggetto umano è sempre un soggetto giuridico.

La guarigione di una ferita cronica è un processo articolato e complesso, che richiede una visione clinica globale del paziente. Tuttavia, il trattamento locale del letto della ferita riveste un’importanza fondamentale. Sempre più ormai si parla di medicina rigenerativa di tipo induttivo come mezzo per stimolare le cellule senescenti all’interno di una lesione cutanea cronica, in particolare mediante l’utilizzo delle cellule staminali mesenchimali. Il tessuto adiposo autologo rappresenta una fonte di cellule staminali e la tecnologia Lipogems® ne rende possibile la sua applicazione clinica. In questo studio vengono analizzati i risultati ottenuti con tale metodica che, seppur con i limiti di un numero ancora non consistente di pazienti, sono comunque incoraggianti nel proseguire lungo questa strada, considerata da molti come l’ultima frontiera nel wound care. The healing of a chronic wound is an articulated and complex process, requiring a patient’s clinical global vision. However, local treatment of the wound bed is of fundamental importance. More and more now we talk about regenerative medicine as a means to stimulate senescent cells in a chronic skin lesion, particularly through the use of mesenchymal stem cells. Autologous adipose tissue is a source of stem cells and Lipogems® technology makes it possible for its clinical application. In this study we analyze the results obtained with this method that, even with the limits of a not yet substantial number of patients, they are still in encouraging continue along this road, considered by many as the last frontier in wound care.

La medicina rigenerativa e riparativa è una delle opzioni terapeutiche più interessanti dei prossimi anni, e il potere di sostituire intere strutture organiche danneggiate o organi è, a nostro avviso, la possibilità più innovativa in questo campo. In relazione alla creazione di organi bioartificiali, in particolare, cuori, polmoni, fegato, reni, ovaie, intestino, pancreas e cornee sono già stati generati, tutti in ambito sperimentale. Tuttavia lo sviluppo più innovativo è, senza dubbio, che questi esperimenti hanno già raggiunto il campo clinico, dal momento che in due pazienti con stenosi tracheale dovuta a cause diverse è stato possibile sostituire la trachea colpita con uno nuova creata bioartificialmente; è stato mostrato che dopo il trapianto del nuovo organo, entrambi i pazienti hanno recuperato la loro capacità respiratoria e sono stati quindi in grado di riprendere la loro vita normale. ---------- Regenerative and reparatory medicine is one of the most attractive therapeutic options of the coming years, and the power to replace entire damaged organic structures or organs is, in our opinion, the most innovative possibility in this field. In relation to the creation of bioartificial organs in particular, hearts, lungs, livers, kidneys, ovaries, intestines, pancreas and corneas have already been generated, all in the experimental field. However the most innovative development is, undoubtedly, that these experiments have already reached the clinical field, since in two patients with tracheal stenosis due to different causes, it has been possible to replace the affected trachea with a new one created bioartificially; it was shown that after transplant of the new organ, both patients recovered their respiratory capacity and were consequently able to resume their normal life.

I tessuti biologici e gli organi, con l’avanzamento dell’età, traumi e difetti congeniti possono subire dei danneggiamenti e portare a differenti stati patologici. In queste circostanze, la medicina rigenerativa si propone di riparare e rimpiazzare i tessuti danneggiati. Differenti elementi chiave concorrono negli approcci della medicina rigenerativa; tra i quali, lo sviluppo e l’ingegnerizzazione dei biomateriali rappresenta un elemento cruciale; essi sono sviluppati per portare supporto meccanico e biochimico alle cellule circostanti al danno, contribuendo in questo modo la regolazione del comportamento cellulare promuovendo la rigenerazione dei tessuti danneggiati. Negli anni, differenti biomateriali innovativi sono stati sviluppati, evidenziando che, sia stimoli fisico-meccanici che biochimici sono in grado di guidare il comportamento delle cellule promuovendo specifiche risposte biologiche. Ad oggi i biomateriali vengono progettati mimando il più possibile le condizioni in vivo, replicando le naturali proprietà della matrice extracellulare. Durante il mio PhD differenti aree della chimica organica applicata hanno permesso lo sviluppo di nuovi biomateriali 2D o 3D, funzionalizzati e bioattivati, generando degli scaffold interessanti e con proprietà uniche per le applicazioni della medicina rigenerativa. In questa tesi sono raccolti i risultati ottenuti, con una speciale attenzione rivolta al mondo degli idrogel, materiali innovativi con un’architettura tridimensionale, in grado di mimare la matrice extracellulare e studiare i più profondi meccanismi del comportamento cellulare. Da un punto di vista biochimico, è ben noto come peptidi con sequenze specifiche potrebbero mimare alcuni epitopi funzionali di proteine strutturali quali il collagene, stimolando quindi una risposta analoga e promuovendo in alcuni casi l’espressione di fattori di crescita quali VEGF. Per questo motivo si è sviluppata una nuova matrice bidimensionale con questi peptidi coniugati e i risultati sono altrettanto riportati. Analogamente, anche il livello di ossigeno rappresenta un parametro cruciale per lo sviluppo dei tessuti, sia in vitro che in vivo, in quanto la sua assenza, e più in generale l’assenza di un’adeguata perfusione porta ad uno stato di sofferenza metabolica cellulare impedendo la crescita e lo sviluppo di nuovi tessuti. I Perfluorocarburi (PFCs) negli ultimi anni hanno guadagnato notevole interesse a causa della loro abilità di aumentare la concentrazione di ossigeno a livello della superficie, possibile grazie alle loro proprietà. Con queste premesse 5-(2,3,4,5,6-Pentafluorofenil)-3-undecil-1,2,4-ossadiazoli sono stati usati come modello “PFCs” per funzionalizzare matrici di collagene 2D; sviluppando in questo modo nuovi scaffold. A riguardo delle matrici 3D invece, due vie strategiche per il loro ottenimento sono state messe a punto, nella prima; linkers con estremità triazolinedioniche sono stati sfruttati per la reticolazione chemo-selettiva delle tirosine contenute nella gelatina; successivamente, in un secondo contesto il 4-Dietossi-ciclobutene-1,2-dione (SQ) è stato selezionato per il legame chemo-selettivo delle lisine. Entrambe le reticolazioni hanno portato a nuovi idrogel con proprietà uniche che sono state valutate sia da un punto di vista chimico-fisico, sia da un punto di vista biologico. In fine, data la complessità degli eventi responsabili del riconoscimento cellulare, nuovi dendrimeri funzionalizzati con epitopi saccaradici sono stati sviluppati, esplorando il mondo della chimica dei carboidrati. Qui, proponiamo la sintesi di nuove strutture dendrimeriche equipaggiate con estremita alcossi-amminiche in grado di portare ad una coniugazione multivalente di carboidrati, mediante la formazione di ossime.
Biological tissues and organs, with the age, diseases, trauma, or eventually congenital defects can breakdown and lead to different pathological states. In these circumstances, regenerative medicine has the goal to restore and replace damaged tissues. Different key elements can be involved into regenerative approaches; among them, bio-scaffolds engineering may be crucial, developed to afford mechanical and signalling support to surrounding cells, contributing to directing cell fate toward biological regeneration. Over the years, several innovative bio-materials have been developed, highlighting that both physical and biochemical signals are able to drive cell fate toward specific biological responses. Nowadays, bio-materials can be divided into natural or artificial scaffolds and can be efficiently projected in order to fine-modulate mechanical properties resembling natural tissues (i.e., hardness for bone, elasticity for blood vessels, or cartilage), or to mimic the native cell microenvironment, i.e. the extra-cellular matrix (ECM), , , including complex biochemical signals. In this PhD course several areas of applied organic chemistry allowed to synthesize new functionalized 2D or 3D scaffold and glycol-dendrimers, giving new interesting biomaterials for tissue engineering applications. In this thesis there are collected results, with a special attention on hydrogels synthesis, as a 3D scaffold, to mimic extra-cellular matrix and studying the deepest cell behaviours. From biochemical point of view, it is well known how short peptide with a specific sequence could mimic some functional epitopes of native proteins and then, stimulate in the same way the functional role of native proteins, ideally promoting fundamental biological processes. Among them β-Thymosin Peptide (Tβ4) and Human Vasonectin Peptide (HVP) exert a pro-angiogenic activity or adhesion activity through interaction with actin binding site, promoting Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) expression. Here, it has been presented a new collagen bio-conjugation with these peptides and outcomes. At the same time, also oxygen level is a crucial parameter for the tissue development both in vitro and in vivo because in the absence of tissue perfusion, or any adequate solution, starts to experience metabolic suffering. Perfluorocarbons (PFC), in the last decades, have been gained more interest due to their ability in oxygen storage or oxygen carriers. With these premises 5-(2,3,4,5,6-Pentafluorophenyl)-3-undecyl-1,2,4-oxadiazole was used to functionalize collagen based biomaterials. Developing in this way another type of bioinspired matrices. Regarding 3D matrices, two synthetic strategies have been proposed to develop hydrogels based biomaterials, in the first part, triazoledione chemistry has been proposed as a click-reaction for the chemoselective bioconjugation to tyrosine residues, meanwhile, in the second part, 3,4-Diethoxy-cyclobutene-1,2-dione (SQ) has been used for lysines chemoselective cross-linking. Finally, given the complexity behind recognition processes at cellular level, new glycol-functionalized dendrimers structures are described exploring carbohydrate chemistry. Here, we propose the synthesis of novel oxime-armed dendrimers structures which allow multivalent conjugation of carbohydrates through oxime coupling.

"Il presente lavoro di tesi ha avuto come oggetto di studio la realizzazione di film magnetici a base di calcio fosfato per mezzo del sistema Pulsed Plasma Deposition (PPD), come potenziale piattaforma in grado di disincentivare l’adesione batterica ai comuni materiali utilizzati negli impianti ortopedici. I biomateriali magnetici infatti sono sempre più studiati come potenziali inibitori dell’adesione batterica grazie al fatto di poter essere attivati esternamente da un campo magnetico esterno ed esercitare uno stress meccanico sulla membrana dei batteri in grado di determinarne il distacco dalla superficie o la morte. I film sono stati depositati variando i parametri di deposizione, e successivamente caratterizzati da un punto di vista chimico (XPS e EDX), strutturale (XRD), morfologico (SEM, TEM e AFM), magnetico (SQUID) e meccanico (Nanoindentazione e MicroScratch). Infine, il potenziale effetto antibatterico dei film magnetici a base di calcio fosfato è stato valutato analizzando l’adesione di batteri di E. coli a diversi tempi sperimentali e confrontando i risultati con quelli ottenuti utilizzando film non magnetici."

Liver transplantation remains the only therapeutic option for most of acute and chronic end-stage liver diseases, but its use is limited by a severe shortage of donor organs for transplantation. In this contest the use of stem cells in cell therapy can be considered a promising therapeutical approach instead of liver transplantation. In particular, mesenchymal stem cells (MSCs) can be obtained from several adult tissues and from fetal-derived tissues, such as umbilical cord (UC), umbilical cord blood (UCB) and placenta, and they can be induced to differentiate into several cell types. Nevertheless, proliferative and differentiative potential of these cells has not yet been explained; particularly differentiative potential of fetal-derived tissue cells remains to be investigated. In this study, umbilical cord blood (UCB) and umbilical cord (UC) have been evaluated as potential sources of MSCs. For this purpose, the proliferative potential and plasticity of MSC isolated from UC and UCB to differentiate into adipogenic and osteogenic lineages in vitro were been investigated. After establishing of MSCs plasticity, the cells were differentiated in vitro towards hepatocyte-like cells, evaluating different biological supports for cell growth and differentiation. Finally, in view of clinical applications, the engraftment of these cells in a model of acute CCl4-induced liver injury has been verified. MSCs were capable of differentiating into hepatocyte-like cells as demonstrated by progressive up-regulation of mature hepatocyte markers. In particular the MSCs isolated from UC seem to acquire the features of mature hepatocyte as demonstrated by glycogen storage and albumin secretion. All finding suggested that these cells can grow and differentiate into functional hepatocyte-like cells without any biological support, whereas mature hepatocytes need a three-dimensional scaffold in order to maintain their viability and functional features. Finally the MSCs from human UC seem to contribute to liver regeneration by enhancing the reparative activity of hepatocytes that spontaneously occurs after injury, even if the mechanism of their action is not known. The establishment in vitro of the plasticity of UCB and UC not only towards mesodermal lineage cells but also towards endodermal lineage cells and the in vivo contribution of these cells to regenerate liver tissue, support their future application for cell therapy in acute and chronic liver disease. Moreover, due to availability, safety in the collection and lack of ethical issues, UCB and UC may become elective sources of multipotent MSC
Il trapianto di fegato rappresenta l’unica opzione terapeutica per malattie croniche del fegato in fase terminale e in casi selezionati di insufficienza epatica acuta. Esiste ancora tuttavia un notevole divario fra le donazioni d’organo ed il numero di pazienti in lista d’attesa, divario che ha portato alla ricerca di terapie alternative. In questo contesto le cellule staminali potenzialmente potrebbero svolgere un ruolo di primaria importanza nella terapia cellulare. Tra i vari tipi di cellule staminali, le cellule mesenchimali risultano particolarmente interessanti, in quanto possono essere isolate non solo da vari tipi di tessuti adulti, ma anche da tessuti di derivazione fetale, quali cordone, sangue cordonale e placenta, e possono essere indotte a differenziarsi in numerosi tipi cellulari diversi. Tuttavia, soprattutto per quanto riguarda le cellule isolate da tessuti di derivazione fetale, non è ancora completamente chiarito il reale potenziale proliferativo e differenziativo. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di isolare una popolazione di cellule con caratteristiche mesenchimali da cordone ombelicale (UC) e sangue cordonale umano (UCB). Una volta verificata in vitro la loro capacità di differenziare in cellule di origine mesodermica (adipociti e osteoblasti), è stata testata la loro capacità di differenziare verso la linea epatocitaria utilizzando un terreno contenente fattori di crescita epatogenici e come supporto per le colture due diverse matrici extracellulari o la plastica non trattata. Infine è stata valutata la capacità di engraftment in vivo delle MSC isolate da UC in un modello di danno acuto indotto da CCl4. Le cellule staminali mesenchimali isolate hanno mostrato la capacità di rispondere agli stimoli differenziativi epatogenici sovraregolando l’espressione di marcatori epatici. In particolare le cellule isolate da UC hanno evidenziato la capacità di differenziare in cellule simil-epatocitarie funzionali come dimostra la positività alla colorazione PAS per l’accumulo di glicogeno e il saggio ELISA per la produzione di albumina. I risultati ottenuti dimostrano che il differenziamento non necessita dell’utilizzo di nessuna matrice extra-cellulare come supporto per la crescita delle cellule e il mantenimento della loro funzionalità nel tempo come invece avviene per gli epatociti maturi messi in coltura. Inoltre le MSC da UC somministrate ad animali sottoposti a danno epatico acuto da CCl4, hanno dimostrato di contribuire alla rigenerazione completa dell’organo, anche se il meccanismo d’azione resta ancora da indagare. La dimostrazione in vitro della plasticità delle MSC da UC e UCB non solo verso la linea mesodermica ma anche verso la linea endodermica e la loro capacità in vivo di contribuire alla rigenerazione epatica, rappresenta un risultato utile sulla futura applicazione di tali cellule nella terapia delle malattie epatiche acute e croniche. Inoltre, essendo completamente accessibili, privi di qualsiasi implicazione etica e di rischio nella raccolta, il sangue cordonale e il cordone ombelicale potrebbero diventare due fonti di elezione per l’ottenimento di cellule staminali multipotenti

The aim of the first part of this research project was to improve the knowledge about the existence and location of adult stem cells in the adrenal gland. Although some experiments might suggest that undifferentiated cells derived from the external periphery of cortical zone, the origin of the regenerating cells remains ambiguous, and there are not currently known surface markers for defining these cells. Two distinct cellular populations, from the capsular zone and from the inner part of the adrenal gland, were isolated and investigated in vitro in order to study their phenotype, their proliferative potential and plasticity. The second research project aims to design scaffolds for bone tissue engineering. The development of novel scaffolds for bone tissue engineering is very complex, because ideal support for cellular colonization would possess the same structural and functional characteristics of ECM. In this work, the creation of hybrid scaffolds, mixing a very well known biocompatible synthetic polymer, poly(ε-caprolactones), with different self-assembling peptides, is presented. The microfibrous structure of the scaffold is assured by the electrospinning process, whereas the nanofibrous structure is produces by the self-assembling process of peptides. We prepared six different scaffolds adding six different peptides to poly(ε-caprolactones). These peptides were synthesized by solid phase strategy, and one sequence was prepared condensing a RGD motif to a self-assembling sequence. The characterization of the different scaffolds was carried out through SEM morphological analysis, FT-IR spectroscopy and contact angle measurements. All prepared scaffold exhibit interwoven nanofibers comparable to the ECM ones. FTIR investigations showed that self-assembling peptides incorporated in the PCL nanofibers retain the -sheet conformation, and that an incubation with saline buffered solution can increase the percentage of this structure in the RGD containing peptide. The enrichment with peptides improves the wettability of the polymer scaffold adding an important requirement for better cellular adhesion. The biological assay showed that the presence of self-assembling peptides into the scaffold increases cellular adhesion, the calcium amount and the gene expression of some proteins important for osteoblast.
Premessa Il lavoro di ricerca svolto nel triennio di dottorato si è focalizzato su due progetti. Il primo ha riguardato l’individuazione di cellule staminali nel surrene di ratto, al fine di poterle isolare e caratterizzare. Nel secondo progetto ci si è occupati della progettazione e realizzazione di matrici biomimetiche nanofibrose per la rigenerazione del tessuto osseo. RIASSUNTO Il primo progetto di ricerca ha cercato di chiarire le conoscenze attuali riguardo l’esistenza di cellule staminali adulte residenti nel tessuto surrenale. Sebbene alcune evidenze sperimentali suggeriscano l’esistenza di tali cellule nella parte esterna della corticale surrenale, al riguardo non c’è ancora una teoria riconosciuta in modo unanime: non è stata identificata la loro zona d’origine, né tantomeno sono stati individuati dei marker caratteristici che permettano di isolarle. L’individuazione di tali cellule potrebbe trovare applicazione nella cura di malattie surrenali, ad esempio nell’ipocorticosurrenalismo permetterebbe di evitare la terapia ormonale a vita e quindi, rappresenterebbe la terapia d’elezione. Il progetto si è quindi prefisso come obiettivi di identificare e isolare una popolazione di cellule staminali all’interno della ghiandola surrenale di ratto. Tramite analisi immunoistochimica e di immunofluorescenza sono state ricercate: a) zone cellulari BrdU+ (ratti trattati alla nascita con BrdU), a ciclo cellulare lento; b) marker di staminalità CD105, CD90 e c-kit. Dai surreni di ratto sono state estratte due sottopopolazioni di cellule, capsulari e della parte interna: queste sono state coltivate in vitro, osservate e immunoseparate per CD105 e CD90. Infine, è stata testata la capacità differenziativa delle colture sia in senso osteogenico che adipogenico. Nel secondo progetto sono stati ideati e prodotti scaffold da impiegare nell’ambito dell’ingegneria del tessuto osseo. La progettazione di uno scaffold per l’ingegneria tessutale risulta essere alquanto complessa visto che un supporto ideale per la colonizzazione cellulare dovrebbe possedere le caratteristiche, strutturali e funzionali, della matrice extracellulare. Lo scaffold ideato ha natura ibrida essendo composto di un polimero di sintesi biodegradabile quale il poli(ε-caprolattone) e di peptidi auto-assemblanti. La struttura fibrosa dello scaffold su scala micrometrica è stata assicurata mediante un processo di elettrofilatura. D’altro canto, è noto che i peptidi auto-assemblanti formano spontaneamente matrici tridimensionali con fibre nanometriche estremamente gradite a differenti tipi di cellule, incluse quelle del tessuto osseo. Sono stati ottenuti sei differenti tipi di scaffold utilizzando sei diversi peptidi, ottenuti per sintesi su fase solida, tra i quali una sequenza auto-assemblante coniugata ad un motivo adesivo RGD. Le matrici sono state estesamente caratterizzate mediante analisi di spettroscopia elettronica a scansione, spettroscopia all’infrarosso in trasformata di Fourier e valutazione dell’angolo di contatto. Le matrici risultano essere composte da un intreccio di fibre di dimensioni comparabili a quelle della matrice extracellulare; inoltre, è stato possibile confermare che la struttura β-sheet, che è alla base dell’auto-aggregazione, è presente nelle matrici e viene incrementata, nel caso del peptide auto-assemblante con motivo RGD, dal pre-trattamento con soluzione salina. E’ stato inoltre dimostrato come l’arricchimento con piccole percentuali (5%) di peptidi dello scaffold in poli(ε-caprolattone) produca un grado di bagnabilità notevolmente superiore e quindi crei i presupposti per una maggior colonizzazione della matrice da parte delle cellule. I saggi biologici, eseguiti su tutti gli scaffold, hanno permesso di dimostrare che la presenza di sequenze auto-assemblanti incrementa in modo significativo l’adesione cellulare, la produzione di calcio e l’espressione di geni che codificano per proteine importanti per gli osteoblasti.

Nell’ambito di questa Tesi sono state affrontate le fasi di progettazione, sviluppo e caratterizzazione di materiali biomimetici innovativi per la realizzazione di membrane e/o costrutti 3D polimerici, come supporti che mimano la matrice extracellulare, finalizzati alla rigenerazione dei tessuti. Partendo dall’esperienza di ISTEC-CNR e da un’approfondita conoscenza chimica su polimeri naturali quali il collagene, è stata affrontata la progettazione di miscele polimeriche (blends) a base di collagene, addizionato con altri biopolimeri al fine di ottimizzarne i parametri meccanici e la stabilità chimica in condizioni fisiologiche. I polimeri naturali chitosano ed alginato, di natura polisaccaridica, già noti per la loro biocompatibilità e selezionati come additivi rinforzanti per il collagene, si sono dimostrati idonei ad interagire con le catene proteiche di quest’ultimo formando blends omogenei e stabili. Al fine di ottimizzare l’interazione chimica tra i polimeri selezionati, sono stati investigati diversi processi di blending alla base dei quali è stato applicato un processo complesso di co-fibrazione-precipitazione: sono state valutate diverse concentrazioni dei due polimeri coinvolti e ottimizzato il pH dell’ambiente di reazione. A seguito dei processi di blending, non sono state registrate alterazioni sostanziali nelle caratteristiche chimiche e nella morfologia fibrosa del collagene, a riprova del fatto che non hanno avuto luogo fenomeni di denaturazione della sua struttura nativa. D’altro canto entrambe le tipologie di compositi realizzati, possiedano proprietà chimico-fisiche peculiari, simili ma non identiche a quelle dei polimeri di partenza, risultanti di una reale interazione chimica tra le due molecole costituenti il blending. Per entrambi i compositi, è stato osservato un incremento della resistenza all’attacco dell’enzima collagenasi ed elevato grado di swelling, quest’ultimo lievemente inferiore per il dispositivo contenente chitosano. Questo aspetto, negativo in generale per quanto concerne la progettazione di impianti per la rigenerazione dei tessuti, può avere aspetti positivi poiché la minore permeabilità nei confronti dei fluidi corporei implica una maggiore resistenza verso enzimi responsabili della degradazione in vivo. Studi morfologici al SEM hanno consentito di visualizzare le porosità e le caratteristiche topografiche delle superfici evidenziando in molti casi morfologie ibride che confermano il buon livello d’interazione tra le fasi; una più bassa omogeneità morfologica si è osservata nel caso dei composti collagene-alginato e solo dopo reidratazione dello scaffold. Per quanto riguarda le proprietà meccaniche, valutate in termini di elasticità e resistenza a trazione, sono state rilevate variazioni molto basse e spesso dentro l’errore sperimentale per quanto riguarda il modulo di Young; discorso diverso per la resistenza a trazione, che è risultata inferiore per i campione di collagene-alginato. Entrambi i composti hanno comunque mostrato un comportamento elastico con un minore pre-tensionamento iniziale, che li rendono promettenti nelle applicazioni come impianti per la rigenerazione di miocardio e tendini. I processi di blending messi a punto nel corso della ricerca hanno permesso di ottenere gel omogenei e stabili per mezzo dei quali è stato possibile realizzare dispositivi con diverse morfologie per diversi ambiti applicativi: dispositivi 2D compatti dall’aspetto di membrane semitrasparenti idonei per rigenerazione del miocardio e ligamenti/tendini e 3D porosi, ottenuti attraverso processi di liofilizzazione, con l’aspetto di spugne, idonei alla riparazione/rigenerazione osteo-cartilaginea. I test di compatibilità cellulare con cardiomioblasti, hanno dimostrato come entrambi i materiali compositi realizzati risultino idonei a processi di semina di cellule differenziate ed in grado di promuovere processi di proliferazione cellulare, analogamente a quanto avviene per il collagene puro.

L’ingegneria tissutale è un’emergente disciplina che raccoglie ed integra competenze mediche, biologiche e ingegneristiche. Uno dei suoi scopi è la rigenerazione o la sostituzione dei tessuti biologici danneggiati da patologie o traumi, che viene raggiunto creando dei dispositivi bioingegnerizzati, chirurgicamente impiantabili, integrando cellule, scaffold biocompatibili e fattori bioattivi (quali farmaci, citochine e fattori di crescita) in grado di promuovere la rigenerazione garantendo l’integrazione con i tessuti ospiti circostanti. Questa tecnologia trova grande applicazione in numerosi ambiti clinici come la dermatologia, la chirurgia plastica ricostruttiva, la chirurgia oro-maxillo-facciale e l’ortopedia. La cellula ideale richiesta per l’ingegneria tissutale deve mostrare un buon potenziale autorigenerativo, la capacità di sostituire funzionalmente il tessuto danneggiato e deve essere presente con una disponibilità piuttosto elevata, in quanto potrebbe essere necessario intervenire su difetti molto estesi. Le cellule staminali mesenchimali (MSC, Mesenchymal Stem Cells), oggi coinvolte in molte tecniche di medicina rigenerativa, sono presenti nel midollo osseo e in altri tessuti adulti. Esse sono in grado di differenziare, se stimolate opportunamente, in cellule appartenenti alla linea mesenchimale quali osso, cartilagine, tessuto adiposo e muscoli. Attualmente il midollo osseo è la fonte più comunemente utilizzata per l’isolamento delle MSC (BMSC, Bone Marrow Stromal Cells), ma presenta alcune limitazioni quali la necessità dell’anestesia generale durante il prelievo, la sensazione dolorosa avvertita dal paziente nel post-operatorio e la scarsa resa cellulare. Una fonte alternativa di MSC è stata individuata nel tessuto adiposo sottocutaneo, prelevabile mediante semplici interventi di liposuzione; i vantaggi dell’utilizzo di questo tessuto, normalmente considerato di scarto, sono il prelievo in anestesia locale, e la possibilità di ottenere grandi quantità di tessuto e, di conseguenza, un elevato numero di cellule. Lo scopo del nostro studio è stato quello di valutare l’idoneità del tessuto adiposo umano come fonte di cellule staminali mesenchimali, analizzando dapprima le caratteristiche delle hASC (human Adipose-derived Stem Cells) allo stato indifferenziato e successivamente inducendo il differenziamento delle hASC verso la linea condrogenica, osteogenica ed adipogenica per una futura applicazione clinica. In questo studio in vitro sono state analizzate cellule hASC (human Adipose derived Stem Cells) isolate da tessuto adiposo sottocutaneo prelevato mediante liposuzione da 23 pazienti, di età compresa fra i 20 e i 60 anni (4 uomini e 19 donne, età media: 38 ± 11 anni), opportunamente informati e che hanno sottoscritto il consenso all’utilizzo di tale materiale biologico per sperimentazioni di base. I campioni di tessuto, in quantità variabile fra i 20 e i 250 ml per ciascun donatore, e provenienti da differenti distretti corporei (addome - glutei – coscia - ginocchio), sono stati processati mediante digestione enzimatica con collagenasi di tipo I ottenendo una “Stromal Vascular Fraction” (SVF) dalla quale le hASC sono state separate adesione per aderenza. La resa cellulare, dopo la digestione e prima della semina, è stata di 4,3X105 cellule/ml di tessuto adiposo digerito, con una variabilità piuttosto elevata, ma non correlata all’età del donatore. Dopo circa 10 giorni dall’isolamento le hASC appaiono una popolazione omogenea di tipica forma fibroblastoide, che viene mantenuta oltre il XIV passaggio in coltura. Dopo circa una settimana di “latenza” post isolamento, le hASC, seminate ad una densità di 104 cellule per cm2, hanno cominciato a duplicare rapidamente raggiungendo una confluenza dell’80-90% ogni 2 -3 giorni. La capacità clonogenica delle hASC è stata valutata utilizzando il saggio CFU-F (Fibroblast - Colony Forming Unit) dal quale emerge che il potenziale clonogenico si riduce gradualmente in relazione al periodo di mantenimento in coltura, con una percentuale di precursori clonogenici compresa fra il 10% e il 20% al I o II passaggio, e di circa il 3% al VII e VIII passaggio. Le cellule hASC sono state quindi caratterizzate immunofenotipicamente mediante analisi citofluorimetrica, valutando l’espressione di marcatori specifici delle cellule staminali mesenchimali; oltre il 95% delle hASC esprimono elevati livelli di CD13, CD90 (Thy-1) e CD105/SH2 (Endoglin), circa il 90% sono CD44+, l’80% sono CD29+ e circa il 75% delle hASC esprimono il CD54 (ICAM-1), mentre il CD49d è presente in una percentuale che varia fra l’85% e il 30%. E’ stata inoltre osservata una scarsa espressione di CD14 (1%-9%) e l’assenza di CD45, CD71 e CD106. La valutazione citofluorimetrica ha inoltre permesso di valutare le dimensioni e la granulosità delle varie popolazioni confermandone l’omogeneità. E’ stata anche valutata l’espressione di alcuni marcatori precoci di staminalità all’esordio e ai primi passaggi in coltura: sorprendentemente il CD34 è risultato significativamente espresso in cellule appena isolate (20-60%) come anche il CD271 (p75 NGF receptor, NGFR), anche se in percentuale inferiore (10%-20%); l’espressione di CD34 si riduce poi significativamente in cellule in coltura passando a una positività del 10-30%, mentre CD271 passa a un 5-7% di cellule positive al III passaggio e scompare del tutto dal XIII passaggio. Sulla base di queste osservazioni sono attualmente in corso ulteriori studi caratterizzazione delle sottopopolazioni CD34+ e NGFR+. Il passo successivo è stato quello di determinare la potenzialità differenziativa delle hASC: cellule al IV passaggio allo stato indifferenziato al sono state indotte a differenziare, in presenza di specifici medium, verso la linea adipogenica, condrogenica o osteogenica. Le hASC differenziate verso la linea adipogenica presentano già dopo 7 giorni numerosi vacuoli che risultano ricchi di trigliceridi apolari. Il differenziamento condrogenico è stato indotto con cellule cresciute in 3D in “pellet culture”; dopo 21 giorni di differenziamento le hASC sono state in grado di depositare una matrice simil-cartilaginea ricca di glicosamminoglicani, con aumento significativo di deposizione di circa il 23% rispetto alle cellule mantenute in terreno non induttivo. Cellule hASC differenziate verso la linea osteogenica in due diversi terreni differenziativi, OM1 e OM2, a diversi tempi di coltura (14-21-28 giorni), sono invece state analizzate valutando la deposizione di calcio, l’attività di fosfatasi alcalina (ALP) e l’espressione intracellulare di Osteopontina (OPN), proteina tessuto-specifica. Le hASC coltivate in medium osteogenico, in particolare OM2, differenziano efficientemente rispetto alle hASC non trattate e, infatti già dopo 14 giorni di coltura si osserva un significativo aumento dell’attività fosfatasica e la comparsa di OPN. Inoltre le hASC cresciute in OM2 depositano abbondante calcio extracellulare, che, dopo 21 giorni, risulta di circa 2.5 volte superiore rispetto a quello determinato su cellule non differenziate. Poiché gli scaffold rivestono un ruolo fondamentale in alcune applicazioni di medicina rigenerativa, soprattutto in ambito ortopedico, dove, almeno inizialmente, devono fornire anche un supporto meccanico, abbiamo analizzato il comportamento delle hASC, sia indifferenziate, che già differenziate verso la linea osteogenica, a contatto con alcuni biomateriali utilizzati in campo ortopedico ed odontoiatrico. Le hASC sono state quindi seminate su idrossiapatite, osso bovino deproteinizzato, frammenti di osso umano spongioso di banca, viti di titanio, schiume di poliuretano e fibre di alginato di calcio, per determinare se questi potessero essere dei validi supporti per la crescita e il differenziamento delle hASC. Al microscopio elettronico a scansione (SEM) è stato osservato che le hASC hanno aderito stabilmente a tutti i materiali testati, seppur con qualche differenza dovute alle proprietà di superficie del materiale, e in nessun caso si sono verificati effetti di citotossicità riconducibili ai biomateriali. Le hASC seminate sugli scaffold porosi sono state in grado di produrre livelli di calcio superiori rispetto a quelli prodotti dalle cellule in monostrato, avvalorando l’ipotesi dell’osteoconduttività degli scaffold testati. Infine, non avendo riscontrato differenze in termini di adesione o di potenziale differenziativo tra hASC indifferenziate seminate sugli scaffold e cellule hASC precedentemente differenziate e poi seminate in, si può considerare la possibilità di utilizzare nella pratica clinica in un unico step chirurgico alcuni costrutti hASC-scaffold subito dopo il prelievo e la purificazione. I nostri risultati confermano l’ipotesi che il tessuto adiposo sottocutaneo contiene cellule multipotenti in grado di differenziare verso la linea osteogenica, condrogenica o adipogenica, e che quindi potrebbero essere utilizzate in medicina rigenerativa in alternativa alle cellule mesenchimali isolate da midollo. Il nostro studio proseguirà incentrando le ricerche sull’analisi in vitro delle hASC e dei fenomeni che regolano il differenziamento, e sulle applicazioni delle hASC in vivo in modelli animali, studiando in particolare le modalità di integrazione dei costrutti hASC-scaffold, selezionati in vitro, in particolari lesioni critiche osteocondrali in roditori e ovini.

Background Scopo del progetto di ricerca è valutare se l'utilizzo della core decompression associata a medicina rigenerativa (gel piastrinico, concentrato midollare autologo e matrice ossea demineralizzata) è sicuro ed efficace nel trattamento dell'osteonecrosi della testa del femore, anche per gli stadi più avanzati Materiali e metodi Inclusi in due protocolli di ricerca (ON-08 e AVN-13) sono stati trattati più di 50 pazienti, dei quali 29 con adeguato follow up (29 anche trattate). Nella stessa procedura il midollo osseo viene aspirato e concentrato, poi si procede alla core decompression ed il materiale rigenerativo (demineralizzato, concentrato midollare e gel piastrinico) vengono introdotti all'interno della lesione con approccio mini invasivo. I pazienti vengono poi valutati clinicamente e con radiografie standard e risonanza magentica nucleare ogni 3 mesi. L'outcome primario è stato valutare la sopravvivenza al trattamento (intesa come non conversione in artroprotesi) mentre gli obiettivi secondari sono stati la valutazione dei sintomi (dolore), della clinica (funzione) e la valutazione degli esami strumentali. Results La progressione radiografica è stata riscontrata in 7 anche. Complicazioni in 2 pazienti (una frattura ed una infezione). 16 anche hanno invece riportato risultati buoni o eccellenti con HHS > 80 a 2 anni di follow up. La protesi è stata indicata in 8 casi (27%). Nei casi falliti, lo stadio di nerosi era IIB in 6 e IIA in uno, mentre stadio III in 2 pazienti. Conclusioni I risultati preliminari sono promettenti in quanto sovrapponibili a quelli disponibili in letteratura. In particolare ottimi risultati clinico-funzionali nei pazienti giovani, affetti da neoplasie ematologiche. Ad ogni modo, è necessario un follow up maggiore ed una corte più ampia di pazienti per confermare i buoni risultati ottenuti.
Background We aim to assess whether the use of core decompression and the application of autologous bone marrow concentrate (BMC) along with demineralized bone matrix (DBM) and Platelet Rich Fibrin (PRF) in the treatment of osteonecrosis of the femoral head (ONFH) is safe and effective and whether this technique is indicated in advanced stages. Methods Twenty-nine patients (30 hips) were enrolled in this clinical trial at the Rizzoli Orthopaedic Institute. In the same procedure bone marrow was aspirated and concentrated, then core decompression was performed and BMC mixed with DBM and PRF was introduced into the lesion. Patients were assessed postoperatively with X-Ray and MRI. Primary outcome was the survival rate of hips not converted to total hip arthroplasty (THA). The secondary outcomes were radiographic evolution and clinical symptoms evaluated with Harris Hip Score (HHS). Results Radiographic progression was found in 7 hips. There were complications in 2 hips (one fracture and one deep infection). Sixteen hips with successful treatment had good to excellent functional results at 2-year follow-up (HHS > 80). THA were indicated in 8 hips (27%). In failed cases, the Ficat stage was IIB in 6 and 1 IIA and III respectively in the other two patients. Conclusions The early outcomes of our procedure are similar compared to the literature with promising results in post collapse stages, particularly in young patients treated for haematological malignancies. However, a longer follow-up and more selective study criteria are needed to confirm the present data