Thèses sur le sujet « MED/20 CHIRURGIA PEDIATRICA E INFANTILE »

2015 - 2016
BACKGROUND. Lo sviluppo di sistemi medicali sempre più avanzati per l’acquisizione delle immagini finalizzati all’estrazione di informazioni tridimensionali sugli organi del corpo umano tramite metodi non invasivi, hanno portato all’affermazione di una nuova disciplina scientifica nota come medical imaging. L’innovazione degli ultimi anni, dalla quale nasce il mio progetto di ricerca, è lo sviluppo di programmi informatici che creano immagini con risoluzione 3D, avendo come substrato le immagini 2D generate con gli esami TC (Tomografia Computerizzata) e RM (Risonanza Magnetica) in pazienti con patologia tumorale o malformativa. Le ricostruzioni 3D trovano la loro applicazione principale nel supporto della diagnosi, considerando che le immagini possono essere trasmesse ad esperti in tutto il mondo per consultazioni in tempo reale (tele-medicina), e nella pianificazione del trattamento chirurgico in termini di tipo di approccio, scelta del materiale, scelta della tecnica più idonea, salvaguardia di strutture vicine. CASISTICA. Durante i 3 anni di dottorato, sono stati inclusi nello studio 40 pazienti, 13 femmine e 27 maschi, con un’età compresa tra 6 mesi e 17 anni. Sono stati suddivisi in 3 gruppi sulla base della patologia: malformativa (29/40), tumorale (7/40) e altro (4/40). Tutti i pazienti hanno eseguito TC o RM dalle cui immagini è stata eseguita la ricostruzione 3D con il programma Vr Render 0.81. Tutti i 40 bambini sono stati sottoposti ad intervento chirurgico. Per ognuno di loro le immagini ricostruite sono state discusse tra il chirurgo pediatrico e il radiologo-per pianificare al meglio la strategia chirurgica. Non riportiamo complicanze intraoperatorie né discrepanze tra la ricostruzione 3D e la reale anatomia del paziente. CONCLUSIONI. Dall’analisi retrospettiva del nostro studio è emerso che la ricostruzione 3D permette una buona e migliore pianificazione chirurgica delle patologie tumorali e malformative. L’immagine sviluppata dal programma Vr Render garantisce una definizione corretta della dimensione della patologia, della sua localizzazione e i suoi rapporti con le strutture circostanti. Importante e necessaria è stata la collaborazione tra il Chirurgo Pediatra e il Radiologo, emblema della multidisciplinarietà, ormai tipica, del management di patologie complesse. Il futuro della renderizzazione 3D è certamente una sempre maggiore applicazione nella pianificazione chirurgica e nel training e formazione dei giovani chirurghi. [a cura dell'autore]
BACKGROUND. The development of advanced medical imaging systems led to a new scientific discipline known as medical imaging. the main gol of this branch is to obtain three-dimensional information on human body organs through non-invasive methods. In tha last 10 years, many programs, that create images with 3D resolution following 2D images obtained by TC (Computer Tomography) and MRI (Magnetic Resonance) in patients with cancer or congenital malformation, have been developed. The 3D reconstructions find their main application in diagnose and plan surgical treatment in terms of approach type, choice of material, choice of the most suitable technique, safeguarding nearby structures. MATERIALS and METHODS. During the 3-year of study, 40 patients, 13 females and 27 males, aged 6 months to 17, were included in the study. They were subdivided into 3 groups based on the pathology: malformative (29/40), tumor (7/40) and others (4/40). All patients underwent TC or MRI. Based on CT or MRI images, 3D reconstruction was carried out with the Vr Render 0.81 program. All 40 children underwent surgery. All imaging have been discussed between pediatric surgeon and radiologist to plan surgical strategy. We do not report intraoperative complications or discrepancies between the 3D reconstruction and the real anatomy of the patient. CONCLUSION. After retrospective analysis of our study, we can conclude that 3D reconstruction allows to better plan surgery of tumor and malformative pathologies. The Vr Render program guarantees to have a correct definition of the size of the pathology, its location and its relationships with nearby structures. The multidisciplinary team (Pediatric Surgeon and the Radiologist) has been Important for the management of complex pathologies. The future of 3D rendering is certainly a major application in surgical planning and training of young surgeons. [edited by author]
XXIX n.s.

Obiettivi Il COVID-19 è una malattia principalmente respiratoria nell’età adulta; nei bambini, al contrario, i sintomi gastrointestinali sono più frequenti. Inoltre, non si conoscono i meccanismi di infezione in epoca fetale, epoca in cui i pazienti sono raramente colpiti da COVID-19. Gli organoidi sono uno strumento relativamente nuovo per stabilire in vitro colture di lunga durata che assomigliano tridimensionalmente al tessuto di origine e possono sia mantenere la staminalità che differenziarsi completamente in tutti i tipi di cellule. Abbiamo quindi mirato a sviluppare un sistema di coltura per organoidi gastrointestinali (GIO) per studiare l'infezione da SARS-CoV-2 nell'epitelio gastrico lungo tutta la durata della vita. Metodi I GIO sono stati derivati da feti di 8-21 settimane e da tessuti pediatrici e adulti. Sono stati coltivati utilizzando un terreno chimicamente definito, per testare la loro capacità di mantenere la forma e di differenziarsi completamente. GIO sono stati analizzati in correlazione all'ECM circostante. Gli organoidi sono stati quindi indotti a differenziarsi nella forma a polarità cellulare inversa (RP-GO) e quindi incubati con SARS-CoV-2. Tutti gli esperimenti sono stati analizzati mediante qPCR, immunofluorescenza e analisi qualitativa a seconda dei casi. Risultati Gli organoidi gastrointestinali possono essere isolati da tutte le età gestazionali, dimostrando la normale morfologia dell'epitelio gastrico ed esprimendo tipi di cellule mature, comprese le cellule della nicchia, del villo/ghiandola e di tipo enteroendocrino. Queste colture possono essere mantenute indefinitamente in vitro e coltivate in condizioni conformi alle indicazioni GMP. Gli RP-GO mostrano polarità apicale, esponendo ACE2 sulla superficie esterna, ottimizzando le condizioni per l'infezione virale. La nucleoproteina virale è stata dimostrata nelle cellule in fase di apoptosi, con gli RP-GO pediatrici più suscettibili ed infettati in modo efficiente rispetto agli organoidi fetali e adulti. Conclusioni Abbiamo stabilito con successo un efficiente sistema di coltura di organoidi gastrointestinali per tutte le età, dalla vita fetale all'età adulta. La tecnologia basata sugli organoidi può essere utilizzata per modelli di malattie in vitro, test sui farmaci o terapia cellulare. L'applicazione di regole conformi alle GMP rende la traduzione clinica più vicina.
Aims Adult COVID-19 is mainly respiratory illness, but in children GI symptoms are more frequent. Furthermore, fetuses are rarely affected by COVID-19. Organoids are a relatively new tool to in vitro establish long-living culture that three-dimensionally resemble the tissue of origin and may both maintain the stemness and fully differentiate in all cell types. As a proof of concept, we aimed to develop a culture system for gastrointestinal organoids (GIOs) to investigate SARS-CoV-2 infection in gastric epithelium across the lifespan. Methods GIO were derived from 8-21 week fetuses and from pediatric and adult tissues. They were cultured using chemically-defined medium, to test their ability to maintain stemness and to fully differentiate. GIO were analyzed in correlation to the surrounding ECM. Reverse cellular polarity Organoids (RP-GOs) were induced and incubated with SARS-CoV-2. All experiments were analyzed by qPCR, immunofluorescence and qualitative analysis as appropriate. Results Gastrointestinal organoids can be isolated from all gestational ages, demonstrating normal gastric epithelial morphology and expressing mature gastric cell types including, the niche, secretive, and enteroendocrine cells. These cultures may be maintained indefinitely in vitro and cultured in GMP-compliant conditions. RP-GOs exhibit apical-out polarity, exposing ACE2 on the external surface, optimizing conditions for viral infection. Viral nucleoprotein was demonstrated in cells undergoing apoptosis, with pediatric RP-GOs most susceptible and efficiently infected compared to fetal and adult organoids. Conclusions We have successfully established an efficient gastrointestinal organoid culture systems for all ages, from fetal life to adulthood. Organoid-based technology can be used for in vitro disease modelling, drug testing or cell therapy. The application of GMP compliant rules makes the clinical translation closer.

Background and Purpose: Pediatric arterial ischemic stroke (AIS) may underlie an as yet undiagnosed syndrome often characterized by simple Mendelian inheritance. We aimed to establish and validate a targeted gene panel for AIS associated with monogenic disorders, and to determine its diagnostic yield and clinical utility. Methods: Clinical and neuro-radiological data were collected for every patient enrolled in the study. DNA samples were tested by means of a customized gene panel including 15 genes associated with known genetic diseases related with AIS. Results: Thirty-eight patients (23 males, mean age 6.5 years) were selected with heterogeneous AIS phenotypes, mostly multiple and asynchronous and secondary to vasculopathy. Ten out of 38 resulted to carry rare potentially causative mutations in at least one of the 15 genes analyzed. In 4 cases the analyses led to a definite genetic diagnosis while results were either controversial or null in the remaining patients. Conclusions: While the complexity of the different clinical phenotypes associated with AIS is not fully accounted for by the genes tested in the present study, the achieved diagnoses had a great beneficial impact on patient management. A wider gene panel or an unbiased genome wide approach would be better suited to explain a greater proportion of pediatric stroke events.

Background The aetiology and the prognostic factors of biliary atresia (BA), a progressive obstructive cholangiopathy of infants, are still not well known. Four different subtypes of BA have been described in relation to the age of the developmental failure during gestational age (i.e. Biliary Atresia Splenic Malformation (BASM), Cystic BA, CMV IgM +ve BA and Isolated BA). We aimed to investigate the relation between the bile duct damage in the porta hepatis and liver and cells with an intestinal phenotype (expressing Cytokeratin 20 (CK-20)) in order to establish if this could be considered a prognostic marker of BA. Methods Samples were orientated intra-operatively then immunostained with anti-cytokeratin 20 (CK20). Sections were then digitised and analysed. Clinical and immunohistochemical data were compared. Data are quoted as median (range). Non-parametric statistical comparisons were made as appropriate. P < 0.05 was regarded as significant. Results 48 consecutive infants were treated with Kasai Portoenterostomy (KPE) or primary liver transplantation in a single-centre between 1999 and 2017. CK20 expression in the liver was not associated with a successful KPE (P = 0.69) or native liver survival (P = 0.91). By contrast, remnant porta hepatis CK20 expression was associated with a successful KPE (P=0.04, HR: 0.49). Diffuse expression (distribution > 50% of slide) was associated with a longer period of native live survival (P=0.01; HR: 0.29). Conclusions CK20 diffuse expression in the porta hepatis is associated with a successful KPE and it is a predictor of native liver survival.

Short Bowel Syndrome (SBS) in children is a condition of intestinal malabsorption and dysmotility, caused by rare congenital malformations or acquired diseases, requiring extensive bowel surgical resection which in severe cases can lead to irreversible intestinal failure. Nowadays, the management of pediatric patients affected by SBS is multidisciplinary, involving different possible strategies of treatment: total parenteral nutrition, surgical intestinal lengthening up to intestinal transplantation. The main aim of all these approaches is to promote bowel absorption, but none of them is free from complications that may impair children quality of life. Based on these considerations, this Research Project aims to identify new options to manage and treat SBS. Hence, two aspects were considered: a clinical and an experimental one. As known, the management of SBS patients requires a careful follow-up by a multispecialistic team, able to survey their possible short- and long-term complications and their progressive weaning from parenteral support. Considered this, the clinical part of this Research Project focused on the evaluation of citrulline as a reliable serum marker of residual bowel function. The goal was to verify the possibility of suggesting it for routine dosage in case of intestinal failure, similarly to creatinine in renal impairment and for transaminases in hepatic failure. Briefly, we identified a sample population consisting of 10 SBS patients, age ≤ 5 years and residual bowel length (after surgery) ≤ 100 cm. Patients followed-up with parenteral and enteral nutrition programs and were subjected to citrulline dosages at least 6 weeks after surgery. At the end of the clinical evaluation, we highlighted that serum values of citrulline are strongly related with both the residual intestinal length and the duration of their dependence on parenteral support (p < 0.01). Likewise, the experimental research turned its attention to Tissue Engineering that is a new medical science which aims to achieve functionally active tissue substitutes by scaffolds, cells and growth factors. The second part of the Research Project focused on the possibility to develop a bio-synthetic scaffold for tissue engineering applications in SBS. We manufactured, according to a protocol we patented, new hydrogels based on polyvinyl alcohol with a degree of oxidation of 1% and 2% respectively. The purpose of the chemical oxidation was to confer to the derived biomaterial a certain biodegradation rate. Hence, oxidized hydrogels obtained via physical cross-linking (freezing-thawing) were compared to native PVA hydrogels for their morpho-mechanical and biological properties by means of ultrastructural analysis with scanning electron microscopy, tensile tests, swelling index analysis, and in vivo biodegradation studies. These investigations showed that the strength and the stiffness of the polymer are significantly related to the chemical modification as they decrease along with the oxidation degree; conversely, the swelling and the biodegradation rate increase along with it. The obtained results led us to identify in scaffolds prepared by using 1% Oxidized PVA the supports with the most adequate morpho-mechanical and biodegradation properties to our purposes. Hereafter, it was set up a composite scaffold in 1% Oxidized PVA cross-linked with decellularized intestinal extracellular matrix (ECM). The combination of the polymer with the bioactive matrix allowed us to obtain a support with good mechanical properties and able to promote cell growth and proliferation. Briefly, the small intestine of adult rats was removed and decellularized according to the detergent-enzymatic protocol by Meezan. After having assessed the effectiveness of the procedure (DAPI staining) the acellular matrix was characterized by histological staining (hemotoxylin/eosin). Thereafter, the extracellular matrix (intact and homogenized) was crosslinked with 1% Oxidized PVA and the ability of the composite scaffold to support cell adhesion and proliferation was investigated using a primary culture of adipose mesenchymal stem cells. After 7 days from seeding, a significant cell growth on the composite scaffolds was observed in comparison with the nude polymeric support. Finally, based on of the TESI (Small Intestine Tissue Engineering) model, the scaffold was implanted in the omentum of adult rats; after 4-weeks, composite scaffolds demonstrated their ability to induce the formation of a composite pseudoepithelial tissue with intestinal-like features.
La sindrome dell'intestino corto o Short Bowel Syndrome (SBS) in età pediatrica è una condizione di malassorbimento e dismotilità intestinali, conseguenza di rare malformazioni congenite o patologie acquisite, che comportino resezioni chirurgiche più o meno estese dell'intestino sino, nei casi più gravi, ad insufficienza intestinale. Allo stato attuale, la gestione dei pazienti affetti da SBS è multidisciplinare; varie le possibili strategie terapeutiche: la nutrizione parenterale totale, la chirurgia di "allungamento intestinale" e, nelle fasi più avanzate della patologia, il trapianto di intestino. L'obiettivo primario di tutti questi approcci è quello di promuovere l'assorbimento intestinale, tuttavia nessuno di essi è scevro da complicanze capaci di inficiare la qualità della vita dei pazienti. Sulla base delle precedenti considerazioni, questo Progetto di Ricerca si propone di identificare nuovi approcci per il management ed il trattamento della SBS. A tal fine, la ricerca si è sviluppata su due versanti: uno clinico e l’altro sperimentale. Come noto, la gestione della SBS necessita di un attento follow-up dei pazienti da parte di un'equipe multispecialistica che sia in grado di monitorare, nel breve e nel lungo termine, le possibili complicanze nonché la svezzabilità del paziente dal supporto parenterale. In tale senso, nella parte di ricerca clinica è stata studiata e valutata l'attendibilità della citrullina come marker sierico della funzionalità intestinale residua; l’obiettivo è di proporne un impiego routinario esattamente come avviene per la creatinina nell'insufficienza renale e per le transaminasi nell'insufficienza epatica. A tale scopo, all’interno del nostro campione di pazienti affetti da SBS e seguiti in follow-up, è stata individuata una sottopopolazione campionaria costituita da 10 pazienti inseriti in un programma di nutrizione parenterale ed enterale domiciliare, con età ≤ 5 anni e lunghezza intestinale residua (dopo chirurgia) ≤ 100 cm, che sono stati sottoposti a dosaggio della citrullinemia ad almeno 6 settimane di distanza dalla chirurgia. I valori della citrullinemia sierica sono risultati essere correlati in maniera statisticamente significativa (p < 0,01) sia con la lunghezza intestinale residua di tali pazienti, che con la durata della loro dipendenza dal supporto parenterale. In parallelo, la Ricerca Sperimentale ha rivolto l’attenzione verso una nuova disciplina medica: l’Ingegneria Tissutale. Quest’ultima è una scienza multidisciplinare che si propone di realizzare in laboratorio sostituti tissutali funzionalmente attivi attraverso l’impiego di scaffold, cellule e fattori di crescita. In particolare, in questa seconda parte del progetto di ricerca è stata investigata la possibilità di sviluppare uno scaffold bio-sintetico per applicazioni di ingegneria tissutale intestinale. Brevemente, sono stati realizzati, secondo un protocollo brevettato dal nostro gruppo di ricerca, dei nuovi idrogeli a base di polivinil alcol con un grado di ossidazione dell’1% e del 2%. L'obiettivo dell’ossidazione chimica è stato quello di conferire al biomateriale caratteristiche di biodegradabilità in confronto alla sua forma non ossidata. Dopo cross-linking fisico mediante freezing-thawing, idrogeli in PVA nativo e PVA ossidato sono stati caratterizzati per le loro proprietà morfo-meccaniche e biologiche, tramite analisi ultrastrutturali di microscopia elettronica a scansione, test di trazione, valutazione dell’indice di rigonfiamento e studio di biodegradazione in vivo. Queste indagini hanno dimostrato che la resistenza meccanica e la rigidità del polimero vengono modulate dalla modifica chimica, diminuendo all’aumentare del grado di ossidazione. Diversamente, l’indice di rigonfiamento e il tasso di biodegradazione sono tanto più elevati quanto più aumenta la percentuale dei gruppi carbonilici derivati dall’ossidazione. I risultati ottenuti hanno consentito di identificare nel PVA ossidato all’1% il polimero con caratteristiche morfo-meccaniche e di biodegradazione congeniali ai nostri scopi. Sulla base di questo, è stato allestito uno scaffold composito, costituito da PVA ossidato all’1% cross-linkato con matrice extracellulare intestinale decellularizzata (intera e omogenizzata): la combinazione del polimero (avente proprietà meccaniche e di biocompatibilità/biodegradazione ottimali) con la matrice bioattiva ha consentito di ottenere un supporto capace di favorire la crescita e la proliferazione cellulare. Brevemente, la realizzazione dello scaffold composito ha previsto l'espianto di intestino tenue da ratto adulto e la successiva decellularizzazione del tessuto con metodo detergente-enzimatico secondo Meezan. Dopo aver valutato l'efficacia della procedura di decellularizzazione (marcatura con DAPI) la matrice acellulare è stata caratterizzata tramite colorazione con ematossilina/eosina. A seguito del cross-linking della matrice extracellulare (intera e liofilizzata) con l’idrogelo in PVA ossidato all’1%, la capacità dello scaffold composito nel sostenere l'adesione e la proliferazione cellulare è stata indagata utilizzando cellule staminali mesenchimali da tessuto adiposo umano. A 7 gg dalla semina è stato possibile riscontrare una crescita cellulare significativa sugli scaffold compositi in confronto al solo supporto polimerico. Infine, sulla scorta del modello TESI (Tissue Engineering Small Intestine), tali scaffold sono stati impiantati in omento di ratti adulti, dimostrando, ad un end-point di 4 settimane, la capacità di generare uno pseudoepitelio composito con caratteristiche di tipo intestinale.

INTRODUCTION Kidney transplantation has progressively established as the treatment of choice for end stage renal disease (ESRD). The progressive loss of function of the transplanted organ is the leading cause of graft failure. The outcome of graft is influenced by many parameters: one of them is the "delayed graft function" (DGF). Graft damage can be influenced by events occurred during donor reanimation or at the time of brain death. The more recent available studies on this subject are almost exclusively based on an adult population. Assuming that some variables concerning donor resuscitation can influence DGF development and transplant outcome, the main purpose of this project was to understand whether this correlation also exists in the pediatric renal transplantation. MATERIALS AND METHODS We reviewed the data of all patients (<15 years) who underwent a kidney transplantion from 26/12/2003 to 18/04/2011. Donor data were extracted from observations of the intensive care units (ICU) after diagnosis of brain death. We considered: type and volume of plasma expander, transfusions, inotropic drugs, shock episodes, episodes of cardiac arrest, time of stay in ICU , serum creatinine, blood urea and urine output. the recipients data were obtained through the systematic review of medical records. Patients were divided into two Groups: Group 1 (DGF positive) and group 2 (DGF negative). Endpoints of the study were: DGF incidence, graft function and patient survival at 6,12,24 months after transplantation. RESULTS In this period were performed 141 kidney transplants of which 116 with complete donation data. Univariate analysis of donor’s parameters has shown that age, cause of death and donor sex are risk factors for development of DGF. The multivariate logistic regression model confirmed age of the donor as independent risk factor for DGF. CONCLUSIONS Donor age has been revealed as an important independent risk factor for development of DGF. DGF is also an important risk factor for long term loss of graft function, but has no effect on patient’s survival
INTRODUZIONE ED OBIETTIVI Da quando è stato introdotto 40 anni fa, il trapianto di rene si è progressivamente affermato come la terapia di scelta dell'insufficienza renale terminale. La progressiva perdita di funzione dell'organo trapiantato rimane, tuttavia, la principale causa di fallimento del trapianto. L'outcome del graft è influenzato da molteplici parametri: uno di questi è la €"delayed graft function"€ (DGF), ovvero la ritardata ripresa funzionale dell'organo trapiantato. C'è crescente evidenza che il grado di danno dell'organo da trapiantare possa essere influenzato da eventi intercorsi in terapia intensiva o durante il periodo di morte cerebrale. Un punto chiave, quindi, per capire la qualità dell'organo da trapiantare, sembrerebbe essere la gestione rianimatoria del donatore in morte cerebrale. Gli studi disponibili in letteratura sull'argomento sono quasi esclusivamente basati su una popolazione adulta oppure prendono in considerazione un numero ristretto di parametri. Non ci risulta che esistano attualmente studi simili condotti su pazienti pediatrici. Partendo quindi dall'ipotesi, dimostrata nell'adulto, che alcune variabili riguardanti la rianimazione del donatore possano influenzare la DGF e quindi l'outcome del trapianto, scopo principale del presente progetto di ricerca è stato capire se esista questa correlazione anche nell'ambito del trapianto renale pediatrico. SCOPI Analisi della prevalenza di DGF e i suoi fattori di rischio in una popolazione selezionata. Valutazione dell'impatto della DGF sulla funzionalità del trapianto e sulla sopravvivenza del paziente e del graft a 24 mesi dopo il trapianto. MATERIALI E METODI Sono stati presi in considerazione i dati di tutti i pazienti con età inferiore ai 15 anni sottoposti a trapianto di rene presso il nostro Dipartimento di Pediatria (Chirurgia Pediatrica e Nefrologia Pediatrica- Azienda Ospedaliera e Università degli Studi di Padova) ed è quindi stato condotto uno studio retrospettivo su tutti i casi di trapianto di rene da donatore non vivente eseguiti dal 26/12/2003 al 18/04/2011. E'stato escluso il periodo antecedente per la sostanziale differenza nella terapia immunosoppressiva, fatto che avrebbe costituito una notevole fonte di errore nell'analisi dei dati. I dati dei donatori sono stati estratti dalle osservazioni delle unità di terapia intensiva dalla diagnosi di morte cerebrale al prelievo dell'organo. Sono state considerate: tipo e volume di Plasma Expander, trasfusioni, utilizzo di inotropi, episodi di shock ipotensivo, episodi di arresto cardiocircolatorio, ermanenza in terapia intensiva, creatininemia, uremia e diuresi. I dati dei riceventi sono stati ottenuti attraverso la revisione sistematica delle cartelle cliniche dei reparti di Chirurgia Pediatrica e Nefrologia Pediatrica del nostro centro. I criteri di inclusione sono stati:età inferiore ai 18 anni, donatore cadavere in morte cerebrale, follow-up di almeno un anno. I pazienti sono stati divisi in gruppo 1 (11 pz.) con Delayed Graft Function (DGF) e gruppo 2 (105 pz.) senza DGF. Gli endpoints dello studio sono stati: DGF, funzione dell‘organo trapiantato a 6-12-24 mesi dal trapianto e sopravvivenza del paziente a 6-12-24 mesi. RISULTATI Nel periodo di tempo considerato sono stati eseguiti un totale di 141 trapianti di rene, 126 da donatore cadavere, dei quali in 116 bambini i dati relativi alla donazione erano completi. L'analisi univariata dei parametri del donatore in morte cerebrale ha mostrato che l'età , la morte da accidente cerebrovascolare e dil sesso del donatore sono fattori di rischio per lo sviluppo di DGF. Il modello di regressione logistica multivariata haconfermato come fattore di rischio indipendente per DGF l'età del donatore. A 6 mesi di follow-up, il gruppo con DGF ha mostrato una funzionalità renale e un quadro istologico bioptico peggiori rispetto al gruppo senza DGF, ma non abbastanza da raggiungere la significatività . CONSIDERAZIONI CONCLUSIVE L'età del donatore si è rivelata un importante fattore di rischio indipendente per lo sviluppo di DGF, a sottolineare quanto già presente in letteratura di come reni provenienti da donatori pi๠“anziani” siano pi๠suscettibili ad esaurire prima la loro funzionalità . La DGF è risultato inoltre un importante fattore di rischio la perdita di funzione del graft a lungo termine , ma non ha alcun effetto sulla sopravvivenza del paziente

ABSTRACT BACKGROUND: Oesophageal Atresia (OA) is a congenital defect that occurs during gestation and prevents the correct oesophagus development in 1 every 3000-4500 ¬births. Tissue Engineering could represent a therapeutic alternative for the most severe cases, where oesophageal replacement becomes necessary. Decellularised matrices are the ideal option because they are derived from tissue-specific extracellular-matrix (ECM) after removing all the cells therefore avoiding the risk of incompatibility and rejection. However, appropriate preservation may significantly affect scaffold behaviour. AIM: here we aim to create a decellularised oesophageal scaffold in a large animal and to establish an innovative method of scaffold storing. METHODS: rabbit oesophagi were decellularised using a detergent-enzymatic treatment (DET) and evaluated at 2 and 4 weeks, 3 and 6 months of storage. Four storage methods were compared: SCM (slow cooling in medium with 10% DMSO at -1°C/min, then stored in liquid nitrogen), SF (snap-freezing in liquid nitrogen, then stored in -80°C), FD (freeze-drying, then stored in -20°C) and 4C (phosphate-buffered saline solution at 4°C). Structural and functional analyses were performed prior to and after each storage condition. RESULTS: efficient decellularisation with preservation of the ECM was achieved after 2 DET cycles as evidenced by histology and DNA quantification. Only the SCM method maintained the architecture and biomechanical properties of the scaffold up to 6 months. On the contrary, all other methodologies failed long-term preservation of the original structure. In particular, SF-oesophagi displayed irreversible tissue collapse, FD-samples were impossible to rehydrate 3 and 6 months post-storage and the 4C option led to a progressive distortion of the tissue architecture. DISCUSSION: scaffolds for oesophageal tissue engineering can be obtained in a large animal using a combination of detergent and enzymatic agents. Efficient storage allows a timely use of decellularised oesophagi, essential for clinical translation. Here we describe for the first time that slow cooling in a DMSO/medium solution and liquid nitrogen leads to reliable long-term storage of decellularised scaffolds.
RIASSUNTO INTRODUZIONE: vi sono patologie nelle quali è necessario procedere a sostituzione totale o parziale dell'esofago. Tra di esse vi è l'atresia esofagea, una malattia dello sviluppo esofageo che colpisce 1 ogni 3000-4500 neonati. Tra le terapie emergenti ed innovative per il trattamento delle forme più gravi si propone l'uso di matrici decellularizzate create mediante tecniche di Tissue Engineering. Queste strutture rappresenterebbero la scelta ideale, in quanto esse mantengono le caratteristiche della matrice extracellulare (ECM) dell'esofago nativo, ma sono private della componente cellulare abbattendo il rischio di incompatibilità e di rigetto. Tuttavia va identificata un'adeguata strategia di conservazione delle matrici prodotte in laboratorio per garantirne la preservazione in modo da renderle disponibili e utilizzabili nella pratica clinica. SCOPI: identificare un metodo efficace di produzione e conservazione delle matrici esofagee decellularizzate in un modello di grande animale. MATERIALI E METODI: esofagi di coniglio sono stati prelevati e decellularizzati utilizzando un metodo che combina l'uso di detergenti ed enzimi (DET). Le matrici sono state analizzare dopo 2-4 settimane e 3-6 mesi dopo averle conservate in 4 modi differenti: SCM (congelate lentamente in medium e conservate in azoto liquido); SF (snap-frozen in azoto liquido e conservate a -80°C), FD (freeze-dryed e poi conservate a -20°C); 4C (in PBS a 4°C). Analisi di struttura e meccanica sono state effettuate ad ognuno dei 4 time-points. RISULTATI: abbiamo raggiunto una decellularizzazione efficace con preservazione dell'ECM dopo 2 cicli DET (come mostrato dalla quantificazione del DNA e dall'istologia). Solo il metodo SCM preserva le caratteristiche strutturali e meccaniche della matrice fino all'ultimo time point dei 6 mesi. Gli altri metodi non sono efficaci, in particolar modo SF porta a collasso della micro-architettura tissutale, i campioni in FD non possono essere reidratati dopo 3 o 6 mesi e la conservazione a 4°C porta a progressiva distorsione delle strutture. DISCUSSIONE: è possibile creare matrici esofagee decellularizzate utilizzando la combinazione di detergenti ed agenti enzimatici. Un metodo di conservazione efficace permette di preservare la matrice esofagea decellularizzata rendendola uno strumento concretamente utilizzabile nella terapia sostitutiva dell'esofago. Abbiamo illustrato come il metodo SCM sia il migliore a tale scopo.

BACKGROUND The etiology and pathogenesis of anorectal malformations (ARM) are multifactorial, poorly understood and controversial. The classification of ARM from a genetic perspective, it is not easy due to the fact that these malformations exist in various forms probably influenced by different factors such as gender and associated anomalies. In the literature, several chromosomal genetic syndromes have been associated with this malformations; the analysis of associated malformations is an important aspect of the genetic study of ARM, because the association of anomalies with mendelian transmission or with a recognized causative gene can be an essential starting point for further investigations. The normal development of the hindgut depends on the proper development of the cloaca and the cloacal membrane, and epithelial-mesenchymal interactions on the correct essential for proper morphogenesis. Sonic Hedgehog (Shh) is an excellent candidate as a mediator in the interaction between endoderm and mesoderm, multiple studies in animal models have shown that the reduced or non-presence of Shh or its downstream signal mediators, are able to cause defects of different anorectal region. AIM OF THE STUDY The first part of the study is for the most part retrospective, and has the purpose of classifying the genetic point of view and clinical the patients suffering from ARM followed at the Department of Pediatric surgery until the year 2011 (period 1991-2011), dividing them into syndromic forms and not , in isolated or familial cases. Another part of the study aims to identify chromosomal abnormalities associated with ARM. The second part is intended to perform a morphological and immunohistochemical staining of tissue taken from the site of the malformation to verify such alteration parietal are present, and assess the expression of Shh in the context of normal and pathological tissue. MATHERIALS AND METHODS The first retrospective of the project has been obtained by re-evaluating the clinical history of all patients followed at the Department of Pediatric Surgery from 1991 until 2011. To achieve the second objective was performed classical and molecular cytogenetic analysis (by FISH: Fuorescence in situ hybridization or array-CGH: array-based comparative genomic hybridization) of the peripheral blood of patients followed since 2000, with possible extension to their parents or other family members. For the morphological study of the material coming from the site of the malformation, was evaluated by light microscopy and subjected to classical staining hematoxylin-eosin, with the aim to evaluate: the type of coating, the presence of erosion and/or ulceration, edema of the lamina own, the structural architecture of the muscularis layer, the presence of the connective tissue and its disposal. Study of some immunohistochemical markers of muscle differentiation and maturation processes (myogenin), stem cell markers (CD34, CD133,) and the possible pathogenetic pathways involved Shh. RESULTS Were identified in the period 1991-2011, 143 patients divided into 56 isolated forms, 82 associated forms with 6 syndromic forms, 4 clinical associations; 5 cases are not classified. In the male are 50 associated forms and 32 with isolated forms, in the female are 32 associated forms and 24 with the isolated forms. Syndromic forms are found: 2 chromosomal syndromes, 4 genetic syndromes. Was not identified familial form. The most interesting observations of histological study relate to the muscularis evaluated both in its internal and external component: in most of the defects is observed an important disarray of muscle fibers with significant fibrosis. The expression of CD133 was evaluated in the different layers of the intestinal wall and it shows there is an intense expression of this marker but to a lesser extent than the CD34 that presents an intense positivity in all the layers, especially in the lamina propria directly to below the epithelium. The myogenin is constantly negative. Regarding Shh levels of signal strength is considerably lower in the muscularis. CONCLUSIONS The results of this work indicate, in agreement with the literature, that 60% of patients with ARM has a defect associated. Rectovescical fistula in 80% of cases are associated with other malformations, followed by: cloaca (78%), rectourethral fistula (71%), vestibular fistula (65%), perineal fistula (49%). From the reduced expression of Shh in the mesodermal tissue can mean that, or an alteration that affects directly Sonic or its downstream mediators, that causes absence of an optimal gradient parietal necessary for a correct shaping of the intestinal wall layers, and hence the changes in the observed in this preliminary study. This down-regulation may provide a molecular support to the hypothesis that the incomplete formation and division of the cloaca results in a wide variety of malformations of the hindgut. To confirm this hypothesis are still needed further studies on the expression of mediators downstream of the Shh signal such as for example Gli2, Bmp-4, Hox genes and the Wnt protein.
PRESUPPOSTI DELLO STUDIO L’eziopatogenesi delle malformazioni anorettali è sconoscosiuta e multifattoriale. La classificazione delle MAR dal punto di vista genetico non è semplice per il fatto che tali malformazioni si presentano sotto differenti forme influenzate probabilmente, da fattori diversi come il genere e le anomalie associate. Sono descritte in letteratura sindromi genetiche e cromosomiche associate a tali malformazioni e per tale motivo risulta importante conoscere il fenotipo con le quali si manifestano ed eseguire un analisi citogenetica classica nei pazienti con MAR al fine di per poterle individuare anomalie cromosomiche che potrebbero essere associate ad una certa ereditarietà. Il normale sviluppo dell’intestino posteriore (hindgut) dipende dal corretto sviluppo della cloaca e della membrana cloacale, nonché dalle corrette interazioni epitelio-mesenchimali indispensabili per una morfogenesi corretta. Sonic Hedgehog (Shh) è un eccellente candidato come mediatore nelle interazione tra endoderma e mesoderma , multipli studi su modelli animali hanno evidenziato come la ridotta o mancata presenza di Shh o dei mediatori a valle del suo segnale, siano in grado di causare difetti diversi nello sviluppo della regione anorettale. SCOPO La prima parte dello studio è per la maggior parte retrospettivo, ed ha lo scopo di classificare dal punto di vista genetico e clinico, i pazienti affetti da MAR seguiti presso il reparto di chirurgia pediatrica fino all’anno 2011 (periodo 1991-2011), suddividendoli in forme sindromiche e non, in casi sporadici o familiari. Un ulteriore parte dello studio ha lo scopo di identificare anomalie cromosomiali associate alle MAR. La seconda parte ha lo scopo di effettuare una caratterizzazione morfologica e immunoistochimica del tessuto prelevato dal sito della malformazione per verificare quali alterazione parietali siano presenti, e valutare l’espressione di Shh nel contesto del tessuto normale e patologico. MATERIALI E METODI La prima parte del lavoro retrospettivo è stato ottenuto rivalutando la storia clinica di tutti i pazienti seguiti presso il reparto di chirurgia Pediatrica dall’anno 1991 fino al 2011. Per il conseguimento del secondo obiettivo è stata effettuata l’analisi citogenetica classica e molecolare (mediante FISH: Fuorescence in situ Hybridization o con array-CGH: array based-comparative genomic Hybridization), del sangue periferico dei pazienti seguiti dall’anno 2000, con eventuale estensione ai genitori o altri familiari. Per lo studio morfologico il materiale proveniente dalla sede della malformazione, è stato valutato al microscopio ottico e sottoposto alla colorazione classica Ematossilina-Eosina, con lo scopo di valutare: il tipo di rivestimento, presenza di erosione e/o di ulcerazione, edema della lamina propria, l’architettura strutturale della tonaca muscolare, la presenza della trama connettivale e della sua disposizione. Per lo studio immunoistochimico sono stati utilizzati di alcuni marcatori dei processi di maturazione e differenziazione muscolare (Miogenina), dei marcatori di staminalità (CD34, CD133,) e delle possibili vie patogenetiche coinvolte (Shh). RISULTATI Sono stati individuati nel periodo 1991-2011, 143 pazienti affetti da MAR suddivisi in forme isolate 56, forme associate 82, con 6 forme sindromiche , 4 associazioni cliniche; 5 casi non sono classificabili. Nel maschio sono 50 le forme associate e 32 le forme isolate; nella femmina sono 32 le forme associate e 24 le forme isolate. Le forme sindromiche riscontrate sono: 2 sindromi cromosomiche, 4 sindromi genetiche. Non è stata identificata nessuna forma familiare Le osservazioni più interessanti dello studio istologico riguardano la tonaca muscolare valutata sia nella sua componente circolare interna che longitudinale esterna: nella maggior parte dei difetti si osserva un importante disarrangiamento delle fibre muscolari con rilevante dissociazione da parte della componente fibrosa. L’espressione di CD133 è stata valutata nei diversi livelli della parete intestinale; vi è un’intensa espressione di tale marker ma in misura minore rispetto il CD34 che presenta un’intensa positività in tutti gli strati, soprattutto nella lamina propria direttamente al di sotto dell’epitelio. La miogenina è costantemente negativa. Per quanto riguarda Shh i livelli di intensità del segnale è notevolmente più basso nella tonaca muscolare. CONCLUSIONI I risultati di questo lavoro indicano, in accordo con la letteratura, che il 60% dei pazienti con MAR ha un difetto associato. La fistola rettovescicale nel 80% dei casi si associa ad altre malformazioni seguita da: cloaca (78%), fistola rettouretrale (71%), fistola rettovestibolare (65%), fistola perineale (49%). Dalla ridotta espressione di Shh a livello del tessuto mesodermico del difetto si può ipottizare che o, ad un alterazione che colpisce direttamente Sonic o i suoi mediatori a valle, porti all’assenza di un ottimale gradiente parietale necessario per un corretto modellamento degli strati parietali intestinali, e quindi alle alterazioni in parte osservate in questo studio preliminare. Questa down-regulation può fornire una supporto molecolare all’ipotesi che l’incompleta formazione e divisione della cloaca determina un’ampia varietà di malformazioni dell’intestino posteriore. Per confermare tale ipotesi sono comunque necessari ulteriori studi sull’espressione dei mediatori a valle del segnale Shh quali per esempio Gli2, Bmp-4, Hox geni e le proteine Wnt.

ABSTRACT Introduction and Aim of the Study. Studies devoted to brain dead donor parameters are all based on adult populations. The aim of this study was to analyze the correlation of delayed graft function (DGF) with brain-dead donor variables in a population of 116 consecutive pediatric recipients and to compare the clinical outcomes of non-DGF versus DGF recipients. Patients and Methods. We classified the recipients into two groups: group 0 (No. 11) with DGF and group 1 (No. 105) without DGF. Endpoints of the study were: DGF, 6 months graft function and short-term patient and graft survival. Multivariate analysis was performed to determine independent risk factors of DGF. Results. Monovariate analysis of donor parameters showed that donor age above 15 years, gender combination female donor/male recipients, and vascular cause of donor brain death were risk factors for prolonged DGF. The multivariate logistic regression model confirmed as independent risk factors for DGF donor age > 15 years and gender combination female donor to male recipient. After 6 months follow-up, the DGF group showed worse graft function, as well as a smaller incidence of normal histological pattern at graft biopsies. Conclusions. About parameters associated with brain-death donor resuscitation, except for non-traumatic cause of death, the others did not demonstrate any relationship with DGF. Importantly we show that donor age > 15 years and gender combination female donor to male recipient are clearly major independent risk factors for prolonged DGF in children. Furthermore in our paediatric series DGF revealed an important predictor of poor short-term graft function.
RIASSUNTO Introduzione e scopo dello studio. In pazienti adulti, danni legati allo stato di morte cerebrale e alle manovre rianimatorie possono influenzare la ”delayed graft function” (DGF) e l‟outcome dell‟organo trapiantato. Scopo dello studio è stato valutare, in trapiantati di rene in età pediatrica, la correlazione tra parametri rianimatori del donatore cadavere e l‟outcome dell‟organo trapiantato. Materiali e Metodi. Il campione casistico è consistito in 116 pazienti (età ≤ 16 anni), sottoposti a trapianto di rene da cadavere dal 2004 al 2011. I pazienti sono stati divisi in gruppo 0 (No. 11) con DGF e gruppo 1 (No. 105) senza DGF. Gli “endpoints” dello studio sono stati: DGF, funzione dell‟organo trapiantato a 6 mesi dal trapianto e sopravvivenza del paziente e del rene trapiantato a 6 mesi. Risultati. L‟analisi monovariata dei parametri del donatore in morte cerebrale ha dimostrato che l‟età superiore a 15 anni, la combinazione donatore femmina/ricevente maschio e morte da accidente cerebrovascolare rappresentano fattori di rischio per lo sviluppo di DGF. Il modello di regressione logistica multivariata ha confermato come fattori di rischio indipendente per DGF l‟età del donatore e la combinazione donatore femmina/ricevente maschio. A 6 mesi di follow-up, il gruppo con DGF ha dimostrato una funzionalità renale e un quadro istologico bioptico significativamente peggiori rispetto al gruppo senza DGF. Conclusioni. Ad eccezione della causa di morte non traumatica, nessuna variabile ha influenzato la DGF nei bambini trapiantati. L'età del donatore (>15 anni) e la combinazione donatore femmina/ricevente maschio si sono rivelati importanti fattori di rischio indipendente per lo sviluppo di DGF. Inoltre, la DGF è risultato un fattore predittivo di funzionalità a breve termine dell‟organo trapiantato.

Thoracic Non-Rhabdo Soft Tissue Sarcomas (NRSTS) are a rare entity in paediatric age, and are characterized by a dismal prognosis. Being a seldom occurring site, thorax is grouped together with other infrequent localizations, following the classification used for Rhabdomyosarcomas. Inside the thorax, clinicians divide three different sub-localizations: thoracic wall, paraspinal site and intrathoracic region. The most frequent histotype is represented by Ewing Sarcomas (ES)/pPNET, followed by the “adult-type” NRSTS, the Synovial Sarcoma and other histotypes. The aim of the present analysis has been to evaluate the data about patients with thoracic NRSTS enrolled in three subsequent Italian Paediatric Protocols since 1979 to 2005, in order to improve the knowledge on this rare subject. Ninety-nine patients have been considered: 66 were localized in the thoracic wall, 18 were intrathoracic, 15 paraspinal; 58 were ES/pPNET, 29 “adult-type” NRSTS, 5 Synovial Sarcoma and 7 other histotypes. We have identified the prognostic role played by dimensions, local invasiveness, loco-regional lymph nodes involvement and metastatic distant spread; but we have also identified the undoubtful prognostic advantage determined by the initial complete excision, itself correlated to the over mentioned characteristics. These patterns are common to all the localizations and to all histotypes, even if paraspinal tumours present a worst prognosis compared to other sites and ES/pPNET more often are diagnosed with advanced disease and metastatic spread. We are aware of the wide variety of the examined population and of the complexity of this analysis, therefore no definitive conclusions are possible, but this work improves the knowledge on this topic. Thoracic NRSTS represent a challenge in particular for paediatric surgeons, especially from the technical point of view: on one hand the “radicality”, with the aim to remove completely the tumour, on the other side the reconstructive program. The local control is fundamental in order to give good chances to obtain a long-term survival, but a satisfying functional and aesthetic result is equally important in young patients. And thoracic cage presents some peculiar characteristics of resistance and elasticity, therefore being a good subject to research new operative techniques and innovative reconstructing strategies, respecting the radicality and thus avoiding radiotherapy and its long-term sequelae.
I Sarcomi delle Parti Molli non Rabdomiosarcoma (NRSTS) localizzati al torace rappresentano un’entità rara in età pediatrica, caratterizzata da una prognosi infausta. Il torace, proprio per il fatto di essere una sede raramente colpita da questi tumori, viene raggruppato insieme ad altre sedi infrequenti, seguendo quella che è la classificazione applicata ai Rabdomiosarcomi: al suo interno si possono distinguere la parete toracica, la sede paraspinale e la regione intratoracica. L’istotipo più frequentemente rappresentato è il Sarcoma di Ewing (ES)/pPNET, seguito dal gruppo dei NRSTS “adult-type”, dal Sarcoma Sinoviale e da altri istotipi. Scopo della presente analisi è stato quello di analizzare la popolazione di NRSTS toracici registrati nei tre Protocolli Italiani che si sono susseguiti dal 1979 al 2005, al fine di incrementare le conoscenze su questo raro gruppo di neoplasie. Sono stati presi in considerazione 99 pazienti, 66 localizzati a livello della parete toracica, 18 a localizzazione intratoracica, 15 paraspinali; 58 erano ES/pPNET, 29 “adult-type” NRSTS, 5 Sarcomi Sinoviali e 7 altri istotipi. E’ stato riconosciuto il ruolo prognostico giocato da dimensioni, invasività locale, estensione linfonodale loco-regionale e disseminazione metastatica a distanza; ma anche l’indubbio vantaggio prognostico determinato dall’exeresi iniziale completa, che a sua volta è correlata alle caratteristiche summenzionate. Queste caratteristiche sono trasversali a tutte le sottosedi e a tutti gli istotipi, sebbene i tumori paraspinali dimostrino una prognosi più severa rispetto alle altre sedi ed i ES/pPNET si manifestino più frequentemente in una forma avanzata di malattia con metastasi a distanza. Sicuramente l’eterogeneità del campione preso in esame rende difficili delle conclusioni definitive, tuttavia questa analisi apporta un incremento nelle conoscenze su questo argomento, che rappresenta una sfida particolare per il chirurgo pediatra anche dal punto di vista delle difficoltà legate alla chirurgia, sia nella sua parte demolitiva sia nella sua parte ricostruttiva. Infatti, se è pur vero che il controllo locale è fondamentale per dare delle valide possibilità di guarigione, è altrettanto importante garantire un risultato funzionale ed estetico soddisfacente a questi piccoli pazienti, e la gabbia toracica, con le sue caratteristiche di resistenza ed elasticità, costituisce uno stimolo alla ricerca di strategie operatorie e di tecniche ricostruttive innovative, sempre nel rispetto della radicalità che consente di evitare la radioterapia ed i suoi possibili effetti collaterali.

ABSTRACT Background. The diagnosis of pediatric adrenocortical tumors (ACT) is sometimes difficult and it does not always allow to distingush beteween benigna and malignant tumors. Wieneke’s score is useful to classify ACT in benign, indeterminate and malignant tumors but it is based on the evaluation of nine different histological features. The Reticulin Algorithm (RA) has been proved to be reliable and easily reproducible in the classification of adult adrenocortical tumors. Aim of this study is to retrospectively validate the use of RA in a series of pediatric ACT. Materials e methods. Thirty-seven pediatric ACT treated in 3 different european centers were evaluated: according the Wieneke’s score, they were classified as benign in 46% of cases (17), indeterminate in 22% (8) e malignant 32% (12). All cases were reclassified according the RA (malignant if necrosis, vascular invasion and high mitotic count were found associate to an altered reticulin framework). The mitotic index considered was both the adult one (>5/50 HPF; aRA) and the pediatric one (>15/20 HPF; pRA). The reticulin was considered altered with both qualitative and quantitative alterations. Five pathologists revised independently the sections stained for the reticulin framework and a second round was performed in order to obtain a consensus on discordant cases. Results. Reticulin framework was intact in 8 cases (22%), all benign according Wieneke’s score as well. The remaining 29 cases (78%) showed an alteration (quantitative in 16 cases, qualitative in 9 and both in 4). Both Wieneke’s score (p<0.0001) and RA (pRA p=0.0005 e aRA p=0.015) showed an association with the overall outcome. All indeterminate cases according to Wieneke had a favourable clinical course, except for 2 who are alive with disease. aRA distributed these case as follows: 4 in the benign group e 4 in the malignant group; pRA classified 5 as benign and 3 as malignant. Conclusions. RA is a reliable prognostic algorithm to diagnose and stratify pediatric ACT both in its version already described for adult ACT and in the version, described for the first time, here adapted for pediatric ACT.
ABSTRACT Background e obiettivi. La diagnosi istologica dei tumori adrenocorticali (ACT) in età pediatrica è difficoltosa in alcuni casi e non permette sempre agevolmente la distinzione tra forme benigne e forme maligne. Lo score di Wieneke, che permette di classificarli in tumori benigni, tumori indeterminate e tumori maligni, prevede però la valutazione di ben nove parametri istopatologicici. Nei tumori corticosurrenalici dell'adulto, l'algoritmo della reticolino è stato dimostrato essere un metodo affidabile e facilmente riproducibile per la classificazione dei tumori adrenocorticali. Lo scopo di questo studio è di validare retrospettivamente l'applicazione dell'algoritmo della reticolina (RA) ad una casistica di ACT pediatrici. Materiali e metodi. Sono stati analizzati 37 casi di ACT pediatrici trattati da 3 diversi centri europei: questi erano stati classificati come benigni nel 46% (17 casi), indeterminati 22% (8) e maligni 32% (12) secondo lo score di Wieneke. Tutti i casi sono stati riclassificati con il RA (maligni se all'alterazione del reticolo si associava necrosi, invasione vascolare o un'alta conta mitotica). Si è provveduto a considerare sia il cut-off degli adulti (>5/50 HPF; aRA) sia quello pediatrico (>15/20 HPF; pRA). L'alterazione del reticolo considerata era sia qualitativa sia quantitativa. Cinque patologi hanno rivisto le sezioni colorate per il reticolo ed un secondo round di revisione è stato effettuato per raggiungere un consensus sui casi discordanti. Risultati. Il reticolo è risultato intatti in 8 casi (22%) tutti benigni anche secondo il Wieneke index. Gli altri 29 casi (78%) hanno mostrato un'alterazione del network intercellulare (quantitativi in 16 casi, qualitativi in 9 e misti in 4). Sia il Wieneke index (p<0.0001) sia il RA (pRA p=0.0005 e aRA p=0.015) hanno mostrato di associarsi all'outcome clinico. Tutti i casi indeterminati secondo Wieneke sono andati incontro ad un outcome favorevole, tranne 2 casi che risultano vivi con malattia. Il aRA distribuisce questi casi: 4 nel gruppo dei tumori benigni e 4 nel gruppo dei maligni; il pRA li classifica 5 come benigni e 3 come maligni. Conclusioni. Il RA è un valido algoritmo prognostico per diagnosticare e stratificare gli ACT pediatrici sia nella sua versione descritta per i casi dell'adulto sia nella versione, descritta qui per la prima volta, adattata per i casi pedatrici.

We consider rare tumors in pediatric age those tumors with an incidence less than 2 cases/1.000.000 children/year, which are not included in treatment protocols of the Associazione Italiana di Emato-Oncologia Pediatrica (AIEOP). These tumors are object of a national project called TREP, aiming to register patients with rare tumors and promote studies of these cancers. We hypothesize that infancy-onset of typically adulthood tumors, extremely rare in pediatric age, could be the expression of an underlying predisposing genetic condition. In fact, the earliest is the age of onset, the least is the exposition to environmental factors. The renal cell carcinoma (RCC) occurs in a sporadic form or as part of genetic diseases, such as Von Hippel-Lindau disease. Likewise, phechromocytoma and paraganglioma occur in a sporadic form or associated with hereditary disorders such as Von Hippel-Lindau disease, Hereditary Paraganglioma-Pheochromocytoma Syndrome, Multiple endocrine neoplasia type 2 (MEN2) syndrome and neurofibromatosis, type 1. AIM We report the preliminary results of a retrospective and prospective study of a TREP project aiming to evaluate the prevalence of main hereditary syndromes associated with renal cell carcinoma and pheochromocytoma in pediatric age. MATERIALS AND METHODS. Patients diagnosed with renal cell carcinoma or pheochromocitoma from January 2000 until May 2009 (age at diagnosis <18 years) and registered in the TREP, alive, with or without disease, were considered for this study. These patients were registered at 18 reference Italian Pediatric Surgery or Oncology centers. Patients were contacted by the Reference Center in order to obtain blood DNA to detect germ-line mutation of the following genes: VHL (Von Hippel-Lindau disease): in renal cell carcinomas and pheochromocytomas RET (MEN2), SDHB, SDHC, SDHD (Hereditary Paraganglioma-Pheochromocytoma Syndrome): in pheochromocytomas only. For patients with renal cell carcinoma, referring clinicians were asked to complete a questionnaire, aimed to enlighten the presence of signs and symptoms suggestive of the possible associated syndromes. Mutation scanning of the VHL gene for identification of point or small size mutations was conducted on the entire coding sequence and intron-exon boundaries, by PCR amplification, DHPLC and direct sequence analysis. Quantitative Real Time PCR for the identification of deletions of part or the entire gene, was performed on genomic DNA fragments representing each VHL exon. Genetic analysis of RET, SDHB, SDHC, SDHD genes was conducted by direct sequencing of coding sequence and intron-exon boundaries. For RET gene, exons 8, 10, 11, 13, 15 and 16 were sequenced. For SDHx genes, all 8 SDHB exons, all 6 SDHC and 4 SDHD exons were entirely sequenced. Rearrangement analysis was conducted by MLPA (Multiple Ligation Probe Assay). Finally we analyzed clinical data in relation to the presence of genetic syndromes. RESULTS Genetic analysis was performed in 13 on 32 eligible patients with renal cell carcinoma. In all cases no mutation were found. In no case the questionnaire, completed in 11 patients, suggested the presence of an underlying genetic syndrome. 14 patients with pheochromocytoma (on 20 eligible) underwent the genetic analysis: we found a germ-line mutation in 7 (2 VHL, 1 SDHD, 4 SDHB) with an overall prevalence of 50%. When possible, genetic analysis was extended to family members: until now we found 9 mutations in SDHB gene and 1 mutation of SDHD. From a clinical point of view our data support the role of a complete surgery of the tumor. Patients with genetic syndrome did not significantly differ from nonsyndromic ones in terms of clinical manifestations and prognosis. CONCLUSIONS As far as renal cell carcinoma is concerned, the limited number of cases analyzed until today does not allow to draw any significant conclusion. Particularly, we could not detect an association with VHL disease. We found an high prevalence (50%) of genetic disorders associated with pheochromocytoma otherwise labeled "sporadics". This prevalence is higher than what reported in adulthood, confirming that the incidence of pheochromocytoma in pediatric age is more frequently associated to an inherited disorder. Our data show that some rare tumors in pediatric age can be the first manifestation of a genetic syndrome. Both renal cell carcinoma and pheochromocytoma clinical outcome strictly depend on completeness of surgery; however these patients need to be considered also from a genetic point of view for the possible implication that a family cancer syndrome can have for the patient and other family members.
Consideriamo "tumori rari in età  pediatrica" quei tumori con un incidenza inferiore ai 2 casi/1.000.000 bambini/anno e che non sono inclusi in protocolli di trattamento dell'Associazione Italiana di Emato-Oncologia Pediatrica (AIEOP). Questi Tumori sono l'oggetto di un progetto nazionale denominato Progetto TREP che si propone fra gli obiettivi la registrazione dei pazienti con tumore raro e l'avvio di studi a loro dedicati. Questo studio si basa sull'ipotesi che l'insorgenza in un bambino di un tumore tipico dell'età  adulta, ma estremamente raro in età  pediatrica possa essere l'espressione di una condizione genetica predisponente. Infatti più è precoce l'età  di insorgenza di un tumore meno è facile che sia avvenuta un' esposizione a fattori ambientali. Il carcinoma renale (CR) può presentarsi in forma sporadica o come parte del quadro clinico di alcune malattie genetiche, tra cui la malattia di Von Hippel-Lindau. Analogamente feocromocitoma e paraganglioma possono presentarsi sia in forma sporadica che associati ad alcune malattie geneticamente trasmissibili tra cui la malattia di Von Hippel-Lindau, la sindrome del feocromocitoma/paraganglioma ereditario, la sindrome da neoplasie endocrine multiple tipo 2 (MEN 2) e la neurofibromatosi tipo 1. SCOPO Nella tesi riportiamo i dati preliminari di uno studio retrospettivo e prospettico condotto nell'ambito del Progetto TREP, che ha lo scopo di valutare la prevalenza delle principali sindromi genetiche associate a carcinoma renale e a feocromocitoma in età  pediatrica. MATERIALI E METODI Sono stati considerati i pazienti con carcinoma renale e con feocromocitoma registrati nel Progetto TREP di età  <18 anni, con diagnosi da gennaio 2000 a maggio 2009 e vivi, con o senza evidenza di malattia, al momento dello svolgimento di questo studio. Questi pazienti sono stati registrati da 18 Centri italiani di Chirurgia o Oncologia Pediatrica. I pazienti, sono stati ricontattati dal medico del centro di riferimento e gli è stato proposto di essere sottoposti a prelievo di sangue periferico per ricerca di alterazioni genetiche. In particolare sono state ricercate: VHL (malattia di Von Hippel-Lindau): sia per i carcinomi renali che per i feocromocitomi RET (MEN2), SDHB, SDHC e SDHD (sindrome del feocromocitoma/paraganglioma familiare): solo per i feocromocitomi. Inoltre per i carcinomi renali è stato compilato dal clinico che aveva in cura il paziente un questionario che cercava di identificare sintomi e segni delle possibili sindromi associate. L'analisi delle mutazioni del gene VHL per l'identificazione di mutazioni puntiformi o di piccola taglia è stata condotta sull'intera sequenza codificante e sulle zone di giunzione introne-esone attraverso amplificazione in PCR, DHPLC e sequenziamento diretto. La PCR Real Time quantitativa è stata utilizzata su frammenti di DNA genomico rappresentanti ogni esone del gene VHL per identificare delezioni di parti o dell'intero gene. L'analisi genetica del gene RET e dei geni SDHB, SDHC ed SDHD è stata condotta mediante sequenziamento diretto delle regioni codificanti e delle regioni introniche fiancheggianti. Per il gene RET sono stati sequenziali gli esoni 8, 10, 11, 13, 15 e 16. Per quanto riguarda i geni SDHx sono stati sequenziati interamente gli 8 esoni di SDHB, i 6 di SDHC e i 4 di SDHD; inoltre è stata condotta l'analisi dei riarrangiamenti mediante MLPA (Multiple Ligation Probe Assay). Abbiamo infine analizzato i risultati del trattamento correlandoli alla presenza di una sindrome genetica. RISULTATI Per quanto riguarda i carcinomi renali sono stati identificati 32 pazienti eligibili al nostro studio. La scheda anamnestica è stata somministrata in 11 pazienti, e non ha posto in nessun paziente il sospetto clinico di una sindrome genetica associata. L'analisi genetica per VHL è stata condotta in 13 pazienti ed in tutti i casi ha dato esito negativo. Clinicamente la prognosi è apparsa correlata con lo stadio e quindi con la chirurgia: i pazienti con tumore localizzato asportato completamente hanno mostrato un' ottima sopravvivenza. Per i feocromocitomi l'analisi genetica è stata condotta in 14 pazienti su 20 eligibili ed ha evidenziato una mutazione germinale in 7 (2 VHL, 1 SDHD, 4 SDHB) con una prevalenza totale del 50%. Ove possibile l'analisi genetica è stata estesa anche ai familiari: finora sono stati identificati 9 familiari con mutazione del gene SDHB e uno con mutazione di SDHD. Dal punto di vista clinico i nostri dati confermano l'importanza di una chirurgia completa del tumore. Non è stata riscontrata una differenza significativa nelle manifestazioni cliniche e nella prognosi dei pazienti sindormici quando confrontati a quelli non sindormici. CONCLUSIONI Per quanto riguarda il carcinoma renale, non siamo riusciti ad evidenziare una associazione con la sindrome di VHL, ma la limitata numerosità del campione esaminato ci permette di trarre solo delle conclusioni preliminari. Nei feocromocitomi abbiamo riscontrato un' elevata prevalenza (50%) di sindromi genetiche associate. Tale frequenza è superiore rispetto a quanto riportato in casistiche di pazienti adulti confermando che l'insorgenza di un feocromocitoma in età  pediatrica è maggiormente associata ad una sindrome genetica. I nostri dati dimostrano che alcuni tumori rari per l'età pediatrica possono rappresentare la prima manifestazione di una sindrome genetica. Il risultato del trattamento è strettamente correlato all' esito della chirurgia sia per i carcinomi renali che per il feocromocitoma. E' però importante sottolineare che oltre le problematiche inerenti al trattamento vanno considerate quelle di tipo genetico per le implicazioni che una family cancer syndrome può avere per la famiglia e il paziente stesso.

Introduction and purpose Bladder exstrophy (BE) is a rare malformation that involves not only the bladder, urethra and genital organs but also all of the pelvic floor and bones. Its prevalence is about 1/25.000-40.000 born in Italy and about 15 new cases are estimated each year. The disease affects males and females with a ratio of 2:1. The etiology is unknown. The effect of this malformation, affecting the urogenital complex, can be reflected on urinary continence and sexual life. These aspects can influence strongly the social life of patients. We evaluated both psychosexual and psychosocial aspects and sexual dysfunctional in adult with BE using a validated instrument. Materials and methods We conducted a survey using SESAMO (Sexuality Evaluation Schedule Assessment Monitoring). We evaluated a group of patients (cases) and a group of controls. All are invited to complete the male or female, single or partnership version of the instrument. The questionnaires are loaded into the program SESAME-Win and processed by the software SESAME-R. Both cases and the controls are analyzed in general and by sex and by emotional situation (single or partnership). We investigated the Areas found to be significant in the group of cases and not in the corresponding group of controls; in these Areas we analyzed individually every Items, highlighting the percentage of significant responses. We also assessed the state of continence about patients. Results This questionnaire is being distributed to 45 patients with BE, including 30 men (M) and 15 women (W) and 40 controls, 20 M and 20 W. 26 cases (17 M and 9 W), with a response rate of 57.7%, and 35 controls (18 M and 17 W) with a response rate of 87.5%, were finally included in analysis. With regard to the cases 16 (11 M and 5 W), completed the questionnaire as situation of “partnership” and 10 (6 M and 4 W) as "single". In group of controls 26 (14 M and 12 W) completed the questionnaire as situation of "partnership" and 9 (4 M and 5 W) as "single". Median age was 28 years in the Cases group and 30.5 in Controls. Environmental psychology and Lived Body Areas were significant in all groups of Cases (except in Females Total about Lived Body) and never in groups of controls. Desire Area is significant only in females Cases. Pleasure Areas are significant only in the groups of Controls and never in Cases. Remote Masturbation is significant, both in the group of Cases that Controls Females. Previous Experiential and the Sexual and Medical History are significant in all groups (except in the group of females controls about this last Area). Patients had a continence rate of 80, 7%. Conclusions Patients with bladder exstrophy have a tendency toward obsessive-compulsive disorder towards sexuality. They are dissatisfied about their free time, but they reached a satisfactory social position. They have a critical relationship with their parents and especially with mother, certainly more present in the clinical pathway. Especially with female patients, there is a lack of communication about sexuality. They present a difficulty to express and share their experiences, particularly sexuality, which they define like frustration experience. The body perception was very critical, more critical in single cases than in partnership. The areas of the body affected by the malformation are hated by themselves. Sexual dysfunction affects a high percentage of both sexes and the women seem to have more difficulty in having a satisfying sexual relationship. Sexuality appear a pathological experience in both single and partnership group. Singles are not satisfied with their emotional situation and even the frequency of sexual intercourse. Patients who live in a partnership use frequently masturbation not for his own pleasure but as act that substitute a complete sexual intercourse.
Introduzione e scopo dello studio L’Estrofia Vescicale-Epispadia (EV) è una rara patologia congenita caratterizzata da uno sviluppo incompleto della vescica e dell’uretra. La sua prevalenza varia da 1/25.000 a 1/40.000 nati ed in Italia si stima un'incidenza di circa 15 nuovi casi ogni anno. La patologia colpisce maschi e femmine con un rapporto di 2:1. L’etiologia non è nota. La patologia, colpendo l’apparato uro-genitale si riflette su elementi di primaria importanza, vale a dire la continenza urinaria e la vita sessuale. Tali aspetti possono condizionare fortemente la vita di relazione dei soggetti affetti. Scopo dello studio è stato quello di identificare sia gli aspetti psicosessuali e psicosociali che gli aspetti disfunzionali sessuali in soggetti affetti da EV. Materiali e metodi Abbiamo eseguito un’indagine strutturata mediante il questionario SESAMO (Sexuality Evaluation Schedule Assessment Monitoring - Boccadoro, Perillo 1996). Sono stati individuati due gruppi d’indagine: un gruppo di pazienti (casi) e uno di soggetti non portatori della patologia (controlli). Tutti i soggetti sono stati invitati a rispondere alla versione maschile o femminile, single o di coppia del questionario. I questionari sono stati caricati nel programma SESAMO-Win ed elaborati dal software SESAMO-R. Sia i Casi che i controlli sono stati analizzati sia in generale che divisi per sesso e situazione affettiva single/coppia. Sono state indagate le Aree risultate significative nel gruppo dei Casi e non nel corrispettivo gruppo dei Controlli; di tali Aree sono stati analizzati singolarmente i vari Item che le componevano, evidenziando la percentuale di risposte significative. Abbiamo inoltre valutato lo stato di continenza dei pazienti. Risultati Il questionario è stato consegnato a 45 pazienti affetti da EV di cui 30 maschi (M) e 15 femmine (F) e 40 controlli, di cui 20 M e 20 F. Hanno aderito allo studio 26 casi (17 M e 9 F), con un tasso di risposta di 57,7%, e 35 controlli (18 M e 17 F) con un tasso di risposta di 87,5%. In particolare per quanto riguarda i casi, 16 (61,5%) di cui 11 M e 5 F, hanno compilato il questionario come situazione affettiva di “coppia” e 10 (38,5%) di cui 6 M e 4 F come “single”; riguardo i controlli 26 (74,5%) (14 M e 12 F) hanno compilato il questionario come situazione affettiva di “coppia” e 9 (25,5) (4 M e 5 F) come “single”. L’età mediana è stata di 28 anni nel gruppo dei casi e 30,5 nei controlli. Le Aree Relati psicoambientali e Vissuto corporeo sono risultate significative in tutti i gruppi dei Casi (eccetto nei Casi Femmine totali per quanto riguarda il vissuto corporeo) e mai nei gruppi dei Controlli. L’Area Desiderio è significativa solo nei Casi Femmine. Gli Ambiti del piacere sono significativi solo nei gruppi dei Controlli e mai nei Casi. La Masturbazione remota è significativa sia nel gruppo dei Casi che dei Controlli Femmine. L’Esperienziale pregresso e l’ Anamnesi Medica e Sessuale sono significative in tutti i gruppi (eccetto nel gruppo dei Controlli Femmine per quest’ultima Area). I pazienti hanno presentato un tasso di continenza dell’80,7%. Conclusioni I pazienti affetti da estrofia vescicale presentano una spiccata tendenza all’ossessività che si manifesta sia nelle pratiche quotidiane che nei confronti della sessualità. Sono insoddisfatti del loro tempo libero ma circa la metà di essi ha raggiunto una condizione sociale soddisfacente. Presentano un rapporto critico con i propri genitori e in particolar modo con la madre, figura sicuramente più presente nel percorso clinico; specialmente nelle pazienti di sesso femminile si riscontra una carente comunicazione intrafamiliare riguardo alla sessualità. E’ emersa inoltre una difficoltà ad esprimere e raccontare le loro esperienze, in particolare quelle sessuali che definiscono frustranti. L’attenzione rivolta al “se’ corporeo” è risultata molto critica, più nei casi in situazione di coppia che nei single; le zone interessate dalla malattia e di conseguenza coinvolte negli interventi chirurgici sono le più odiate da essi. Le disfunzioni sessuali colpiscono in alta percentuale entrambi i sessi e nel complesso le donne sembrano avere più difficoltà ad avere un rapporto sessuale soddisfacente. La sessualità è vissuta in maniera patologica sia nel gruppo dei pazienti “single” che “coppie”. I pazienti single non sono soddisfatti della loro situazione affettiva e neppure della frequenza dei rapporti sessuali. I pazienti che vivono una situazione di coppia sono spinti ad attuare con maggiore frequenza la masturbazione non per proprio piacere ma come atto sostitutivo al rapporto sessuale completo.

This project rises from the hypothesis of using cell therapy and tissue engineering in the gastrointestinal system. The clinical environment the project borne is the Pediatric Surgery. However the faced topics embrace all age population. In particular we explored the possible correction of sphincter defect by using skeletal muscle precursors. In this view we studied the capability of skeletal muscle precursors (committed stem cells) of integrating into contractile tissue of gut. In vitro and in vivo experiments have been done. The most data have been obtained from the murine model of cryo-injury of gastroesophageal junction. We studied the regeneration after injection of cultured or freshly isolated satellite cell (obtained by the single fibre technique) compared with other cell populations. The candidate personally managed several technique to obtain skeletal muscle precursors, primary cell culture, co-culture between various cell-type; analysis techniques ( conventional histology, immunofluorescent analysis of cryo-sections, western-blotting, cytofluorimetric anlysis, statistical analysis, microscopy imaging). Further micro-surgery techniques have been used in the in vivo experiments on small animals. Results have been presented in international meetings or publications: - Murine Muscle Precursor Cells survived and integrated in a Cryoinjured Gastroesophageal Junction. Fascetti Leon F, Malerba A, Boldrin L, Leone E, Betalli P, Pasut A, Zanon GF, Gamba PG, Vitiello L, DeCoppi P. J Surg Res. Epub 2007 Jun 19 - Muscle precursors injection in the gastroesophageal junction: further experience. Fascetti Leon F, Malerba A, Boldrin L, Zanon GF, Gamba PG, Pierro A, De Coppi P. Oral presentation at the 8th European Congress of Paediatric Surgery (EUPSA) Turin, Italy 2007 In vitro enhancement of muscle precursors cells differentiation enhanced by co-cultures with neurogenic cells. A Malerba, F Fascetti Leon, L Boldrin, C Caldwell, N, Thapar, A Pierro, P De Coppi British Association of Paediatric Surgeons (BAPS) annual meeting Edimburgh, UK 2007 - Further experience with the injection of muscle precursors in the gastroesophageal junction Fascetti Leon F, Malerba A, Boldrin L, Vitello L, Talenti E, Zanon GF, Gamba PG, Pierro A, De Coppi P. presentation at the American Paediatric Surgeons Association (APSA) Orlando, Florida 2007 - Long term integration of muscle precursor cells injected in the lower esophageal sphincter. Fascetti Leon F, Malerba A, Boldrin L, Betalli P, Gamba PG, Vitiello L, A. Pierro, DeCoppi P. submitted. Cell culture have been conduced at the Regenerative Medicine Lab of Della Città della Speranza (c/o Dipartimento di Pediatria e Istituto VIMM). Part of the analyses and the co-culture have been conduced at the Institute of Child Health - Great Ormond Street Hospital of London. The in vivo section have been done at The work allows the conclusion that adult skeletal muscle precursors could be used in the regeneration of digestive tract contractile tissue. In particular good engrafting and data regarding the possible trans-differentiation through smooth muscle lineage led to follow this approach (correction of sphincter defect). Few data have been obtained from the preliminary experiments on anal sphincter. Furthermore, the capability of integrating and interacting in vitro between ganglion derived cells and muscle cells, let us think to the possible wilder application to gastro-intestinal contraction defects.
Il progetto di ricerca nasce dall’ipotesi dell’utilizzo di approcci di terapia cellulare ed ingegneria tissutale nel tratto digerente. L’ambiente clinico da cui nasce lo spunto per questo progetto di ricerca è la Chirurgia Pediatrica. Tuttavia le tematiche affrontate abbracciano trasversalmente ogni fascia di età. Ci si è interessati in particolare alla possibilità di correggere difetti “sfinteriali” tramite l’utilizzo di precursori derivati dal muscolo scheletrico. In tale ottica sono state esplorate le capacità di integrazione nel tessuto contrattile del tubo digerente di precursori cellulari del muscolo scheletrico (cellule staminali committed). Sono stati eseguiti esperimenti in vivo e in vitro. La maggior parte dei dati sono stati ottenuti utilizzando un modello di danno da congelamento a carico della giunzione gastro-esofagea di topo. Sono state esplorate le possibilità di rigenerazione dopo iniezione di cellule satellite coltivate o a fresco ottenute con la tecnica della singola fibra. Il candidato ha personalmente utilizzato diverse tecniche per l’ottenimento di precursori staminali da muscolo scheletrico, colture cellulari primarie, coculture tra vari tipi cellulari, nonché varie tecniche di analisi (istologia convenzionale, analisi d’immunofluorescenza delle criosezioni, western-blotting, citofluorimetria, analisi statistica e d’immagine microscopica). Per gli esperimenti in vivo,inoltre, sono state utilizzate tecniche di microchirurgia sul piccolo animale. Risultati del lavoro svolto sono stati oggetto di presentazioni in congressi nazionali ed internazionali: - Murine Muscle Precursor Cells survived and integrated in a Cryoinjured Gastroesophageal Junction. Fascetti Leon F, Malerba A, Boldrin L, Leone E, Betalli P, Pasut A, Zanon GF, Gamba PG, Vitiello L, DeCoppi P. J Surg Res. Epub 2007 Jun 19 - Muscle precursors injection in the gastroesophageal junction: further experience. Fascetti Leon F, Malerba A, Boldrin L, Zanon GF, Gamba PG, Pierro A, De Coppi P. Oral presentation at the 8th European Congress of Paediatric Surgery (EUPSA) Turin, Italy 2007 In vitro enhancement of muscle precursors cells differentiation enhanced by co-cultures with neurogenic cells. A Malerba, F Fascetti Leon, L Boldrin, C Caldwell, N, Thapar, A Pierro, P De Coppi British Association of Paediatric Surgeons (BAPS) annual meeting Edimburgh, UK 2007 - Further experience with the injection of muscle precursors in the gastroesophageal junction Fascetti Leon F, Malerba A, Boldrin L, Vitello L, Talenti E, Zanon GF, Gamba PG, Pierro A, De Coppi P. presentation at the American Paediatric Surgeons Association (APSA) Orlando, Florida 2007 - Long term integration of muscle precursor cells injected in the lower esophageal sphincter. Fascetti Leon F, Malerba A, Boldrin L, Betalli P, Gamba PG, Vitiello L, A. Pierro, DeCoppi P. submitted. Gli esperimenti “in vivo” e ‘analisi istologica sono stati condotti presso il Centro inter-dipartimentale Vallisneri dell’Unioversità di Padova. Le colture cellulari sono state eseguite presso il Laboratorio di Medicina Rigenerativa Della Città della Speranza (c/o Dipartimento di Pediatria e Istituto VIMM). Parte dell’analisi e delle co-culture sono state eseguite presso l’Institute of Child Health - Great Ormond Street Hospital di Londra. Il lavoro svolto porta alla conclusione che cellule precursori muscolari derivati da tessuto muscolare scheletrico adulto sono potenzialmente utilizzabili nella rigenerazione delle strutture contrattili del tubo digerente. In particolare la buona capacità di integrazione e dati sulla possibile trans-differenziazione verso la linea cellulare muscolare liscia stimolano a proseguire nella direzione di una terapia cellulare dei difetti sfinteriali. Pochi dati sono derivati dagli esperimenti condotti sullo sfintere anale interno, che vanno pertanto considerati preliminari. Inoltre la capacità di integrazione e interazione in vitro tra cellule nervose gangliari e muscolari derivate da muscolo scheletrico fanno pensare ad un più ampio utilizzo nei difetti di contrattilità gastro-intestinali.

Background. Repair of skeletal muscle loss due to trauma, surgical resection or malformations represent a challenge for clinicians. Several attempts to create a bioscaffold to substitute skeletal muscle have been done but no satisfying results were obtained due to lack in regeneration process and functionality of repaired tissue. Some studies on tissue engineering investigated the application of decellularized extracellular matrix (ECM) derived from skeletal muscle observing positive effect towards regeneration. It is becoming relevant the role of tissue-specificity in the field of tissue engineering. This study aims to compare the regenerative effect of both tissue-specific and no tissue-specific scaffolds when applied in a volume of volume muscle loss. Muscle regeneration and macrophagic response are investigated. Material and Methods. Decellularized extracellular scaffold from murine skin, intestine and rhabdomyosarcoma (ARMS) were obtained using a detergent-enzymatic protocol. Scaffolds’ characteristics were investigated. Wild type mice were used as animal model for in vivo implantation on diaphragm and tibialis anterioris muscles. Samples were obtained at sequential timepoints and analysed with Histology, DNA quantification techniques, Immunofluorescence, Real-time PCR. Results. Decellularized ECM scaffold were obtained from each tissue. Moreover, their ECM maintained ultrastructure and composition. Implantation in vivo showed a regeneration of new, centre nucleated myofibers when muscle scaffold was used. No significant regeneration was observed with other scaffolds. With muscle implants, macrophagic response was present and characterized by organized distribution of cells. Conclusions. The decellularization protocol used in this study demonstrated to be effective in maintaining ECM properties even if in absence of cells. Pro-regenerative results obtained only with implantation of muscle-derived scaffolds underline the importance of tissue-specificity in order to obtain the ideal material to repair muscular defects.
Premesse. Il trattamento della perdita di sostanza muscolare dovuta a traumi, resezioni chirurgiche o malformazioni rappresenta ancora una sfida in ambito medico. In passato sono stati creati diversi bioscaffold che potessero sostituire il tessuto muscolare ma i risultati sono stati poco soddisfacenti a causa del mancato stimolo alla rigenerazione tissutale e del mancato recupero funzionale. Alcuni studi hanno hanno esaminato le potenzialità rigenerative di bioscaffold derivati da matrice extracellulare di muscolo scheletrico. In ambito di ingegneria tissutale risulta sempre più importante la specificità tissutale dello scaffold. Questo studio mette a confronto il potenziale rigenerativo di scaffold tessuto-specifici e non in un modello di perdita di sostanza muscolare. In particolare vengono studiati i meccanismi di rigenerazione muscolare e la risposta macrofagica. Materiali e Metodi. Utilizzando un protocollo di decellularizzazione detergente-enzimatico, sono stati ottenuti da modello murino scaffold di matrice extracellulare di cute, intestino, rabdomiosarcoma. Di tali scaffold sono state studiate le caratteristiche intrinseche. Come modello animale è stato utilizzato il topo wild type. Gli scaffold sono stati impiantati chirurgicamente a livello del diaframma e del muscolo tibiale anteriore. I campioni, prelevati a timepoints diversi, sono stati esaminati con istologia, quantificazione del DNA, Immunofluorescenza, Real-Time PCR. Risultati. E' stato possibile ottenere scaffold di matrice extracellulare decellularizzata da ciascun tessuto esaminato. La struttura e la composizione della matrice extracellulare è stata preservata nonostante il trattamento di decellularizzazione. L'applicazione in vivo di scaffold derivati da muscolo ha indotto la rigenerazione di nuove fibre muscolari centro-nucleate. L'applicazione in vivo degli scaffold derivati dagli atri tessuti non ha condotto a rigenerazione tissutale. Una volta applicato lo scaffold derivato dal muscolo la risposta macrofagica è stata significativa e caratterizzata da una distribuzione regolare delle cellule. Conclusioni- Il protocollo di decellularizzazione utilizzato in questo studio è risultato efficace nell'ottenere matrici extracellulari decellularizzate pur preservando le caratteristiche della matrice stessa. Lo stimolo rigenerativo ottenuto solamente mediante impianto di matrice muscolare sottolinea l'importanza della specificità tissutale nell'ottica di ottenere un valido sostituto in caso di danno con perdita di sostanza.

Background. In the last years tissue engineering for cardiac pathologies has been broadly developed with the aim to restore or improve the diseased or damaged heart. Novel cardiac tissue engineering approaches combine the use of biocompatible scaffolds with stem cells to conjugate material science, surgery and cell therapy techniques. So far, different kinds of stem cells have been described and their potential for cardiac regeneration broadly investigated. We have previously described that it is possible to derive lines of broadly multipotent cells from the amniotic fluid (Amniotic Fluid Stem cells; AFS cells). The aim of this study was to characterize more in detail the AFS cells cardiomyogenic potential both in vitro and in vivo. Methods. Neonatal rat cardiomyocyte (rCM) cells were obtained by enzymatic digestion of 2-3-days old rat hearts. GFP-positive rat AFS (gfp+rAFS) cells were obtained from amniotic fluid samples from GFP-positive transgenic pregnant rats. Human AFS (hAFS) cells were obtained from healthy amniotic fluid back up samples from prenatal diagnosis, following informed consent. AFS cells were isolated by immunosorting for the stem marker c-kit. Before applying a tissue engineering approach, using biocompatible scaffolds, to the AFS and rCM cells coculture, the AFS cells “cardiomyocyte-like” phenotype, acquired in cocolture, had been functionally evaluated by patch-clamp analysis. In this work two different kinds of bidimensional micropatterned scaffolds were used: hydrogel films and PDMS (silicon) membranes. The scaffolds were obtained by microcontact printing technique and using a mold scratched with the desidered micropattern and their viability was tested using, at first, the rat neonatal primary culture. AFS and rCM cells were seeded together on the micropatterned PDMS membranes and analyzed for the expression of troponin T by immunostaining after 6 and 10 days of culture. For the in vivo study, immunodeficient nude male rats underwent a cryoinjury on the heart left ventricle with a 3D collagen scaffold implantation and 5x10e6 hAFS cells/animal local or systemic injection after 15 days. hAFS cells were previously labelled with the red intracellular fluorescent dye CMTMR. Animals were sacrificed at 24 hours, 15 and 30 days after cells injection and hearts stained for cardiac and inflammatory markers. For the acute myocardial infarct model, male Wistar rats underwent an ischemic injury by left anterior descendent coronary artery ligation for 30 minutes and then they were reperfused injecting via the external jugular vein 10e7 or 10e6 gfp+rAFS and 10e7 or 5x10e6 hAFS cells/animal for 2 hours; rats were sacrificed afterwards and hearts analyzed for infarct size measurement by Evans blue staining, by 2,3,5-triphenolltetrazolium chloride (TTC) staining and planimetry with the software Image J. Heart, lungs, spleen and liver were analyzed as well by immunostaining for evaluating hAFS cells content. hAFS cells were also analyzed for the presence of a subpopulation of cardiac progenitors, by RT-PCR analysis, for the expression of early cardiac commitment genes as Isl1 and Kdr. The cells were then studied by ELISA essay to speculate if they can secrete in the culture medium the protein thymosin beta 4, paracrine and cardioprotector factor. Results and Conclusions. Regarding the in vitro results, AFS cells were demonstrated to express a “pace maker cell-like” action potential, when cocultured with rat neonatal cardiomyocyte cells. Moreover, when cultured on the bidimensional scaffold, AFS cells showed to follow the longitudinal orientation of the microstruttured membrane, expressing beating activity and the cardiac protein troponin T. Our in vivo data revealed that hAFS cells, injected into the cryoinjured rat heart, survived in the host up to 30 days, moved from the injection site to the lesioned area in the heart and gave rise to new chimeric capillaries in the patch and cryoinjury area. In the acute myocardial infarct model the results obtained suggested that hAFS cells could exert a paracrine effect in vivo, decreasing the infarct size (measured as the ratio between the infarct area and the ischemic area at risk of necrosis) from a 53,9 ± 2,3% (obtained in control animals receiving PBS injection) to 40,0 ± 3,0% of the ischemic area. Furthermore, hAFS cells were also demonstrated to have a subpopulation of cardiac progenitors, positive for the expression of the early cardiac commitment genes Isl1 and Kdr and to to secrete in the culture medium thymosin beta 4, a paracrine factor previously shown to act as cardioprotector and angiogenic agent. In conclusions, our results are very encouraging and challenging, suggesting that AFS cells can show cardiomyogenic potential and cardioprotective therapeutic application in cell based therapy tissue engineering.

AIM : Balanitis xerotica obliterans (BXO) is a chronic inflammatory skin disorder of unclear etiology, it is considered the male genital variant of lichen sclerosus. The etiology and the exact molecular mechanisms underlying the disease are still unknown. The histopathology of BXO is characterized by alterations in the epidermis and dermis as well as inflammatory cell infiltration. In this regard several factors may be involved in underling molecular changes associated with inflammatory response. Antiinflammatory drugs are commonly used in pre-operative setting to decrease the inflammatory/autoimmune response and for proper wound healing. Olive Oil Ozonides are used in several medical applications for its anti-inflammatory, anti-microbial and skin restoring properties. The human Transglutaminases (TGs) family consists of several proteins with catalytic activity essential for biological processes such as skin barrier formation and extracellular matrix assembly but can also contribute to the pathophysiology of various inflammatory , autoimmune and degenerative conditions. Given the key role played by TGs in the maintenance of epidermis integrity and extracellular matrix stability, the aim of this study was to investigate transcript levels of three TGs in foreskin of children underwent to surgery for phimosis without or with histologically confirmed BXO, to characterize the relationship between changes of TG levels and BXO and furthermore we evaluated the anti-inflammatory effects of treatment by assessing their effects on foreskin of patients with BXO. M&M. Thirty children with acquired phimosis were enrolled. The removed foreskins were sent both for the histological diagnosis and for the analysis of transcript levels of keratinocyte TG (TG1), tissue TG (TG2), epidermal TG (TG3) and IFN-γ, these were evaluated by quantitative Real-Time PCR .Furthermore, fifteen patients with BXO and previously treated by pediatrician with topical olive oil ozonides were compared with fifteen without any treatment. The foreskins were used to evaluate the transcript levels of pro-inflammatory cytokines, transglutaminase 2 (TG2), inducible nitric oxide synthase (NOS2), enzymes involved in the inflammatory process, as well as Vascular endothelial growth factor (VEGF) by Real-Time PCR. Results. We observed a significant increase in IFN-γ and TG2 mRNA levels by 2.8 and 2.9 folds (p<0.001), respectively, and a decrease in TG1 and TG3 transcripts by about 70% (p<0.001) in foreskin from patients with BXO (n=15) in comparison with patients without BXO (n=15). We observed a reduction by about 70% (p<0.001) in mRNA levels of cytokines, such IL-1β, TNF-α and INF–γ, as well as a decrease higher than 90% (p<0.001) in TG2 and NOS2 gene transcripts in tissues from Ozonides group. We also found an increase of 17 folds (p<0.001) in VEGF transcript in tissues treated with ozonides in comparison to untreated patients. Conclusion The reduced expression of TG1 and TG3 is associated with altered structure of foreskin in BXO and can be a consequence of damage to keratinocytes. Increased expression of TG2 and IFN-γ can be the result of chronic inflammation. TG2 overexpression can play a pivotal role in triggering and maintaining the inflammatory response in BXO patients. Our results suggest that pre-operatory treatment with Ozonides could provide a considerable benefit in terms of reduction of the inflammatory response in tissues with BXO. Additionally, the increased production of VEGF could stimulate a faster recovery and promote the healing process in patients undergoing surgery