Littérature scientifique sur le sujet « Meccanismo d'azione »

Il paziente nefropatico cronico facilmente presenta alterazioni morfologiche e funzionali dell'apparato gastroenterico. I segni più comuni e precoci nella sindrome uremica cronica sono rappresentati dai disturbi gastrointestinali. Da alcuni decenni abbiamo a disposizione dei farmaci con potente azione inibente la secrezione acida gastrica: gli inibitori di pompa protonica (IPP) hanno una struttura chimica affine, uno stesso meccanismo d'azione e sono molto importanti per il trattamento delle patologie acido correlate, per l'eradicazione dell'Helicobacter Pylori, per la prevenzione e la cura della gastropatia da farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS). Somministriamo ai nostri pazienti questa classe di farmaci, con terapie che continuano nel tempo, nonostante la risoluzione della malattia (gastroprotezione). Ma gli IPP possono essere utilizzati indistintamente nei nefropatici cronici oppure sarebbe utile conoscere il profilo del farmaco per una corretta scelta? In questo articolo si argomenta che i loro effetti collaterali non sono molto rilevanti e sono abbastanza simili: il loro impiego nel lungo termine è sicuro. La potenza e l'efficacia dei vari IPP, dall'analisi comparativa dei vari trial clinici, risulta essere molto simile sulla base dei milligrammi di sostanza utilizzata. L'unica eccezione illustrata in questo lavoro è rappresentata da 6 pazienti in emodialisi, trattati con lansoprazolo (15 mg), che presentavano gastriti e ulcere peptiche complicate da gravi episodi di ematemesi e melena con conseguente anemia. Tutti gli IPP hanno dimostrato un'efficacia clinica sovrapponibile, tuttavia vanno valutati di volta in volta i vantaggi (relativi) di ciascun IPP. I criteri di scelta di un IPP sembrano basati, principalmente sulle indicazioni autorizzate, sulle formulazioni disponibili, sul profilo di sicurezza del farmaco.

In questo articolo, l'autrice, propone una ipotesi teorica con cui potersi muovere negli angusti spazi che si avvertono nella terapia con i pazienti con struttura perversa. L'autrice, dopo aver meglio delineato il paziente con strutturazione perversa a cui si riferisce, propone di pensare a questi pazienti come a persone che "non hanno abbastanza gioco", così come si può dire di una vite che non gira bene perché "non ha gioco", non ha spazio sufficiente per poter dispiegare il proprio movimento naturale. Riferendosi alla concezione del gioco di Winnicott, inteso nel suo doppio statuto di spazio che permette il gioco e contemporaneamente di gioco che avviene in quello spazio, l'autrice propone di pensare ai tipici meccanismi perversi di controllo dell'oggetto, manipolazione, costruzione di una neo-realtà, ecc. come tentativi di ripristinare il proprio movimento psichico che non ha potuto dispiegarsi a sufficienza nell'esperienza psichica del soggetto e che si sclerotizza pervertendosi, ripiegandosi all'interno. L'autrice porta un caso clinico a sostegno di questa ipotesi di lavoro sottolineando alcuni aspetti che caratterizzano l'esperienza perversa, in particolare un tipo di abuso psichico che non permette una buona espressione dell'aggressività con un conseguente ripiegamento verso l'interno dello spazio potenziale e d'azione del soggetto.

L'autore procede ad una revisione bibliografica sul tema del trattamento combinato psicoterapeutico e psicofarmacologico nei disturbi depressivi e d'ansia utilizzando PUBMED e riviste specializzate in farmacologia, psicofarmacologia e psichiatria. Tuttora determinate scuole di salute mentale sostengono che le cause dei disturbi mentali derivano da alterazioni genetiche e biologiche, oppure da conflitti socioculturali, senza considerare la coniugazione tra variabili genetico-biologiche e socioculturali. Queste prese di posizione radicali generano orientamenti estremi - o tutto č biologia e prescrizione farmacologica, o tutto č contesto ed interpretazione - e ostacolano approcci transdisciplinari. Per di piů, su un altro versante, le psicoterapie psicodinamiche e la psicoanalisi hanno una storia di descrizione di casi, e pochi studi basati sulle evidenze, o di confronto tra procedimenti terapeutici. Nondimeno, diversi autori hanno tentato nel corso degli anni di articolare dimensione biologica e approccio socioculturale, senza invalidare nessuno dei due approcci. Oggigiorno, la comprensione del ruolo giocato dai fattori etiopatogenetici e neurobiologici nei disturbi psichiatrici, evidenzia l'interazione gene-contesto e attutisce le antiche dicotomie teoriche. Le scoperte nel campo delle neuroscienze evidenziano i meccanismi d'azione dei processi terapeutici. Gli studi basati sulle evidenze sottolineano la necessitŕ di utilizzare percorsi di cura integrati combinando psicoterapie e cure psicofarmacologiche, in particolare nei quadri dei disturbi depressivi e d'ansia. Finora, la maggioranza degli studi sono stati realizzati con terapie cognitivo-comportamentali (CBT) e terapie interpersonali, tuttavia esiste ormai un numero crescente di lavori basati sulla psicoterapia psicodinamica e sulla psicoanalisi.

Malaria nowadays remains one of the world’s greatest public health problems, especially in the developing countries. Despite numerous efforts expended to reduce its mortalityand morbidity,[1] malaria still threatens approximately 2 billion people worldwide, being responsible for almost two million deaths per year, mostly among young children in sub-Saharan Africa.[2] Among the four malaria species that infect humans, the parasite P. falciparum is universally considered the most aggressive. Particularly impressive is its ability in mutating forms in response to administered antiplasmodial treatment, rapidly giving rise to adaptation and resistance. 4-Aminoquinolines have recently been indicated to be an important class of chemotherapeutic agents for artemisinin based antimalarial combination therapy. A rapid, cheap, possibly clean and scalable route to 4-aminoquinolines endowed with multiple diversity is therefore badly needed. We here report microwave flash-heating chemistry to allow the efficient conversion of the available 4,7-dichloroquinoline into a library of aminoquinolines in high yields and purities, with no need for further purification steps and requiring very short reaction times. Some of the compounds in this library were active against chloroquine-sensitive and chloroquine-resistant parasite strains. [3].The combined use of conventional SNAr reaction and microwave irradiation is another approach developed, proved very valuable in producing derivatized triazines with tunable substituents. A library of 2,4,6-triamino-1,3,5-triazines was synthesized as both cycloguanil and chloroquine analogues, and were assessed in terms of in vitro antimalarial activity and toxicity. [4] [5]Some of the compounds in this library showed higher activity against CQ-resistant parasite strains and some exhibited CQ-sensitive activity in the same order as chloroquine itself. Another important parts of this thesis was study mechanism of action of peroxide compounds. We have demonstrated that a non metallic reagent such a leucomethylene blue is capable of efficiently activating a series of endoperoxides compounds including dioxanes, trioxanes and tetraoxanes. In principle our results suggest that is possible to hypothesize the existence of a unique common activator at the biological level inducing devastating effect toward parasite survival.The present work puts under discussion the assumption of the roles of iron and C center radical in the mechanism of action of antimalarial drugs based on artemisinin derivatives , and paves the way towards a new interpretation of the biological evidences so far.[7,8] We also demonstrated that In line with the enhancement of antimalarial activities of the current clinical artemisinins against parasites cultured under CO, the artemisinins are unaffected in vitro by carboxyhemoglobin (CO–Hb–FeII) or CO–heme–FeII, but are competitively decomposed by Hb–FeII or heme–FeII. In the latter case, the heme studies are greatly facilitated by solubilization of the heme in aqueous medium by use of arginine. None of the Hb species has an appreciable effect on artemisone, or on other aminoartemisinins, and antimalarial activities are either less affected or remain essentially unchanged against parasites cultured under standard microaerophilic conditions or under CO.The findings not only indicate that artemisinins do not require Hb–FeII or heme–FeII for promotion of antimalarial activity, but are also important in relation to the therapy of severe/complicated or cerebral malaria.[6] References [1] World Health Organization 2006: http://www.rollbackmalaria.org/malariaFAQ.html.[2] C. A. Swales, P. L. Chiodini, B. A. J. Bannister, Infect. 2007,54, 107–110; b) D. A. van Schalkwyk, T. J. Egan, Drug Resist.Updates 2006, 9, 211–226.[3] S. Melato, P. Coghi, N. Basilico, D. Prosperi, D. Monti, “Novel 4-Aminoquinolines through Microwave-Assisted SNAr Reactions: a Practical Route Antimalarial Agents”.Eur. J. Org. Chem. 2007, 6118–6123. [4] S.Melato, D.Prosperi, P.Coghi, N.Basilico, and D.Monti. “A Combinatorial Approach to 2,4,6-Trisubstituted Triazines with Potent Antimalarial Activity: Combining Conventional Synthesis and Microwave-Assistance” ChemMedChem,2008, 1 – 4.[5] Expert Meeting COST B22 "DRUG DISCOVERY & DEVELOPMENT FOR PARASITIC DISEASES", Modena, Italy, 19-20 February 2007.[6] Coghi, P. ; Basilico, N. ; Wing-Chi Chan ; Haynes K.R. ; Taramelli ;Monti D. Interaction of Artemisinins with Oxyhemoglobin Hb-FeII, Hb-FeII, CarboxyHb-FeII, Heme-FeII, and Carboxyheme FeII: Significance for Mode of Action and Implications for Therapy of Cerebral Malaria Chemmedchem .2009 [7] Richard K. Haynes, Kwan-Wing Cheu, Maggie Mei-Ki Tang, Min-Jiao Chen, Zu-Feng Guo, Zhi-Hong Guo, Paolo Coghi, Diego Monti Reactions of Antimalarial Peroxides with Each of Leucomethylene Blue and Dihydroflavins: Flavin Reductase and the Cofactor Model Exemplified.. Chemmedchem .2011[8] Richard K. Haynes,Wing-Chi Chan,Ho-Ning Wong, Ka-Yan Li, Wai-Keung Wu, Kit-Man Fan, Herman H. Y. Sung, Ian D. Williams, Davide Prosperi, Sergio Melato,Paolo Coghi, and Diego Monti Facile Oxidation of Leucomethylene Blue and Dihydroflavins by Artemisinins: Relationship with Flavoenzyme Function and Antimalarial Mechanism ofAction,ChemMedChem. 2010, 1-19

The research focused on the identification and the study of the mechanism of action of new compounds endowed with antiproliferative activity and characterized by three different chemical structures: twelve benzo- and pyrido-thiopyranoindol derivatives (Group A); twenty one 2-aryl substituted benzothiopyrano-fused pyrimidines (Group B); and fourteen triphenylethylenic derivatives (Group C). As preliminary evaluation, the ability of compounds to inhibit cell proliferation on human tumor cell lines was estimated and in particular, the GI50 values (concentration of compound able to induce 50% cell death with respect to a control), were calculated for each compound. For compounds characterized by the most significant antiproliferative activitiy, the mechanism of action has been investigated, with the aim to establish the intracellular targets involved in the cytotoxic effect. In this connection, both macromolecules and intracellular organelles have been taken into consideration as potential molecular targets responsible for the cytotoxicity. In detail, the ability to form a molecular complex with DNA, along with the capacity to interfere with the catalytic activity of both topoisomerases I and II, were evaluated. Furthermore, the effect on the tyrosin kinase receptor, VEGFR-2 (KDR), involved in the angiogenesis process which participates to the tumor growth, was investigated. Finally, the death pathway induced by the studied compounds was determined by cytofluorimetric analyses. The occurrence of apoptotic process, such as the contribution of the intrinsic pathway, through the mitochondrial depolarization, allowed to draw for each group of compounds the mechanism involved in the cytotoxicity
L'attività di ricerca svolta ha riguardato l'individuazione e lo studio del meccanismo d'azione di composti ad attività antiproliferativa appartenenti a tre gruppi strutturalmente distinti: gruppo A formato da dodici derivati benzo- e pirido-tiopiranoindolici; gruppo B costituito da ventuno derivati benzotiopiranopirimidinici; e il gruppo C al quale appartengono quattordici derivati trifeniletilenici. Su tutti i composti è stata effettuata una prima determinazione con l'obiettivo di valutare la capacità inibitoria sulla proliferazione cellulare. A questo scopo sono state utilizzate linee cellulari tumorali umane e sono stati determinati i valori di GI50 (concentrazione di composto in grado di provocare il 50% di morte cellulare rispetto ad una coltura di controllo). Successivamente, dei composti dotati di attività antiproliferativa più significativa, è stato studiato il meccanismo d'azione, allo scopo di individuare i bersagli intracellulari coinvolti nella morte cellulare. Nell'ambito dell'individuazione dei bersagli molecolari responsabili dell'attività, sono state prese in considerazione sia macromolecole che organelli intracellulari. In particolare è stata valutata la capacità di complessarsi con il DNA, così come di interferire con i processi metabolici della macromolecola stessa mediati dagli enzimi nucleari topoisomerasi I e II. Analogamente si è considerata la possibile interferenza con enzimi recettoriali ad attività tirosinchinasica, quale VEGFR-2 o KDR, strettamente coinvolto nel processo neoangiogenico tumorale. Infine la tipologia di morte cellulare indotta dai composti in esame è stata determinata attraverso una serie di studi di citofluorimetria. La valutazione dell'attivazione del processo apoptotico, così come il contributo della via intrinseca, determinato a livello mitocondriale, hanno consentito di definire in modo completo per ciascun gruppo di composti il meccanismo coinvolto nell'effetto citotossico

Pramipexole (PPX) is a dopamine (DA) D3 and D2 receptors agonist widely used alone or in combination with levodopa as Dopamine Replacement Therapy in Parkinson’s disease. In clinical and preclinical studies, PPX improved motor deficits, this evidence led to lowering daily dose of levodopa, delaying the motor side effects associated with its use. Recently, PPX administration has been associated to the development of addictive-like behaviors related to the DA Dysregulation Syndrome, particularly in a subpopulation of treated patients, characterized by impulsive-compulsive personality traits as well as previous addiction’s experience. Based on these evidences, the aim of this study was twofold: first to investigate the pharmacological action of PPX, using a unilateral model of Parkinson’s disease in which 6-OHDA was injected in the medial forebrain bundle. After two weeks, we tested in primed and naive rats, the ability of three different doses of PPX (0,035; 0,1 and 0,35 mg/kg s.c.), to induce contralateral turning behavior as well c-fos expression after pretreatment of DA D1 antagonist SCH 39166. Next, we checked the ability of PPX to induce contralateral rotations after D2 (eticlopride) and D3 (S33084) DA antagonist pretreatment. In order to investigate the role of PPX (0,05 mg/kg s.c.) in behavioral sensitization, we tested its effect with S33084 pretreatment in levodopa sensitized rats. Second, we assessed the correlation between PPX treatment, Parkinson’s disease and the onset of DA Dysregulation Syndrome on Conditioned Place Preference (CPP) paradigm. To do this, 6-OHDA was injected bilaterally in DA striatal terminals, in three different strains of rat: the addiction prone Lewis (LEW), the addiction resistant Fisher 344 (F344) inbred strains, and the Sprague Dawley (SD) outbred strain. Furthermore, to test its rewarding properties, PPX was directly infused in the nucleus accumbens shell (NAc), a DA mesolimbic region known to be involved in the rewarding effects of drugs of abuse, in healthy rats belonging to the above mentioned strains. We discovered that in primed rats, PPX (0,35 mg/kg s.c.) induced turning behavior that was increased by SCH 39166 pretreatment (0,1 mg/kg s.c.). No effect was seen in naive rats both for turning behavior and c-fos expression. D2 receptors antagonist eticlopride (0,1 mg/kg s.c.) reduced PPX-induced turning behavior more than D3 receptors antagonist S33084 (0,5 mg/kg s.c.), also a previous levodopa sensitization increased PPX-induced turning behavior on its first administration. This suggests that PPX’s action could be related to D2 stimulation, and it seems to require a previous D1/D2 stimulation to observe a behavioral outcome. PPX (1 mg/kg s.c.) was able to induce a significant CPP in SD and LEW lesioned rats but not in F344 and control rats, and the persistence of preference was stronger in LEW than in SD rats. When injected into the NAc shell, PPX (5 μg/0.5 μl) induced CPP in all rat strains, but the persistence of its effect was more strong in LEW compared to SD and F344 rats. These results suggest that the parkinsonian state might be more sensitive to the rewarding properties of PPX, which do not seem entirely influenced by phenotype.

The program research has focused on the identification and the study of the mechanism action of compounds with antiproliferative activity isolated from natural plant extracts and semisynthetic derivatives. A first evaluation was carried out with the aim to estimate the ability of compounds to inhibit cell proliferation on human tumor cell lines. In particular, the IC50, (concentration of compound able to induce 50% cell death with respect to a control), was determined. For compounds characterized by the most significant antiproliferative activities, the mechanism of action has been studied, with the aim to establish the intracellular targets involved in the cytotoxic effect. More specifically, the effect of all compounds has been evaluated on isolated rat liver mitochondria. In particular, it was studied the induction of mitochondrial permeability transition (MPT), a process involved in cell death, by the release of pro-apoptotic factors such as AIF (Apoptosis Inducing Factor) and cytochrome c. Thus, by evaluating specific mitochondrial parameters, such as swelling, transmembrane electrical potential, ICR (respiratory control index) and the mitochondrial oxidative state, it has been possible to achieve information about the intracellular mechanism of action of the test compounds.
L’attività di ricerca svolta ha riguardato l’individuazione e lo studio del meccanismo d’azione di composti ad attività antiproliferativa isolati da estratti naturali di origine vegetale e di derivati semisintetici. Innanzitutto è stata effettuata una prima valutazione con l’obiettivo di stimare la capacità inibitoria sulla proliferazione cellulare. A questo scopo sono state utilizzate linee cellulari tumorali umane, determinandone l’IC50 (concentrazione di composto in grado di provocare il 50% di morte cellulare rispetto ad una coltura di controllo). Successivamente, dei composti dotati di attività più significativa, è stato studiato il meccanismo d’azione, focalizzando la ricerca su bersagli intracellulari coinvolti nel processo apoptotico. Nel dettaglio, l’effetto di tali composti, è stato valutato principalmente sulla funzionalità di mitocondri isolati, in modo specifico sull’induzione della transizione di permeabilità mitocondriale (MPT), processo implicato nell’induzione del fenomeno di morte cellulare, mediante il rilascio di fattori pro-apoptotici quali AIF (Apoptosis Inducing Factor) e citocromo c. Valutando quindi specifici parametri mitocondriali, quali swelling, potenziale elettrico transmembrana, I.C.R. (Indice di Controllo Respiratorio) e l’eventuale induzione di uno stress ossidativo, indicatori di MPT, è stato possibile ottenere informazioni sull’effettivo meccanismo d’azione dei composti studiati.

2014-2015
Natural products are small-molecule secondary metabolites displaying considerable structural complexity and “privileged scaffolds”. They are able to bind several endogenous targets eliciting biological effects as chemical weapons or to convey information from one organism to another. Nowadays, medicinal plant drug discovery continues to provide new and important leads against various pharmacological targets. Therefore, the primary purpose of this PhD thesis has been a comprehensive characterization of the interactome profile and then the molecular mechanism of action of bioactive natural molecules. Achieving this in an effective, unbiased and efficient manner subsists as a significant challenge for the new era in drug discovery and optimization. Indeed, the full understanding of the mechanism of action of natural molecules could lead to a number of advantages: first of all, exploit their full therapeutic potential, the identification of side effects or toxicity, or the ability to set up target-based assays and to allow structure activity relationships studies to guide medicinal chemistry efforts towards lead optimization. In my research project, the attention was paid on ent-kaurane diterpenes, a class of natural terpenoids with a great structural variability and a wide spectrum of biological activities. Firstly, I focused on the determination of the interactome of a semi synthetic compound 15-ketoatractyligenin methyl ester. This compound has been previously reported to possess high antiproliferative activity against several solid tumor-derived cell lines. In this regard, I decided to investigate the mechanism of action of this actratylignin derivative researching first of all its molecular targets, responsible for the biological activity. In order to achieve this goal, I used a chemical proteomic approach first. This study led to the identification of PPARγ as the main cellular partner of this compound; achieved results were supported and validated through different biological assays. Subsequently, I studied another diterpene: oridonin. This molecule has been shown to have multiple biological activities. Among them, the anticancer activity has been repeatedly reported by many research groups. With the aim of expanding and validate our knowledge about this molecule, also seen the limitations of the fishing for partners method, I decided to use two orthogonal compound-centric proteomics approaches to define the possible protein target(s) of oridonin. Using this strategy HSP70 and nucleolin were identified. Therefore, several in vitro and in cell tests have been performed to validate the interaction of oridonin with these proteins, and to evaluate its effect on their activity. Some of these tests were developed and optimized during my period of research abroad at the Massachusset General Hospital- Center for System Biology -Harvard Medical School; in that twelve months period I expanded my knowledge into the techniques useful for the study of the mechanism of action of a small molecule, also applying experimental methods complementary to proteomics and focusing on the use of high-resolution intravital microscopy imaging for drug pharmacology. [edited by Author]
XIV n.s.

Gli ormoni steroidei sono una classe di composti che regolano specifiche funzioni endocrine o non-endocrine dell'organismo quali, per esempio, i processi riproduttivi, il comportamento sessuale (progesterone, estrogeni, androgeni), o sono coinvolti in funzioni omeostatiche modulando equilibri idrico-salini (mineralcorticoidi), o i livelli ematici di glucosio, le risposte immunitarie, le risposte allo stress (glucocorticoidi), ecc. Nell'esplicare queste funzioni, gli ormoni steroidei agiscono a livello delle cellule bersaglio tramite proteine recettoriali specifiche, che modulano l'espressione di una grande varietà di geni specifici, agendo come fattori di trascrizione. I recettori per il progesterone, gli estrogeni, gli androgeni, i glucocorticoidi e i mineralcorticoidi sono stati caratterizzati sia biochimicamente che, più recentemente, con metodi di biologia molecolare che hanno permesso il clonaggio del DNA che codifica per le varie proteine. Attraverso i dati raccolti, si è definita una famiglia di proteine con caratteristiche comuni, sia in termini strutturali (per la presenza di caratteristici domini funzionali), sia per il meccanismo d'azione, che è generalmente conosciuta come "famiglia dei recettori degli steroidi"; questa super-famiglia comprende anche proteine recettoriali il cui legante è solo parzialmente correlato, dal punti di vista strutturale, agli steroidi, come la vitamina D, o la cui struttura è totalmente non-steroidea come gli ormoni tiroidei, o l'acido retinoico (Evans, 1988). Infine comprende anche una serie di proteine, caratterizzate durante il clonaggio dei vari recettori per gli steroidi che hanno alcune caratteristiche in comune con detti recettori, ma che vengono chiamate orfane in quanto non è stato per loro ancora identificato nessun tipo di legante (Carson-Jurica et al., 1990). Il lavoro qui descritto riguarda un aspetto particolare del meccanismo d'azione del recettore steroideo e cioè la sua fosforilazione. Verrà discusso con maggiore attenzione quello che avviene nel caso del recettore per il progesterone; si cercherà tuttavia di evidenziare, ove possibile, e sulla base della letteratura disponibile, i meccanismi comuni a tutta la famiglia dei recettori steroidei.

In the mouse nervous system, Sox2 is expressed in stem cells and early precursors, and in few mature neurons (Zappone et al., 2000; Ferri et al., 2004). Adult Sox2-deficient mice, in which Sox2 expression is decreased by about 70%, exhibit neural stem/precursor cell proliferative defects in the hippocampus and periventricular zone (Ferri et al., 2004). I performed in vitro differentiation studies on neurosphere derived neural cells. Neural stem cells from Sox2-deficient mice produce reduced numbers of neural progenitors. Moreover, I found the SOX2 is important for the neural progenitors cell cycle progression. I demonstrated that SOX2 promoted the proliferation of neural stem cells through facilitating the G1/S transition with the levels of cyclin D1 and cyclin E expression in neural progenitors samples. Mash1 is an important regulator of neurogenesis in the ventral telencephalon, where it is required both to specify neuronal precursors and to control the timing of their production. Mash1 is required for the generation of neocortical neurons with characteristics of GABAergic interneurons. Moreover, in vivo Sox2 deficiency causes a reduction of GABAergic neurons (Cavallaro M. et al., 2008). These observations point to a possible role for SOX2 togheter with Mash1 in the genesis of neural progenitors of GABAergic neurons. The early neural progenitors, derive from Sox2-deficient mice produce reduced numbers of MASH1 positive cells. In vivo Chromatin immunoprecipitation assays reveal interactions of SOX2 and Mash1 in early neural progenitor cells. My data also suggest that the specific recruitment of these protein to the Mash1 in the ventral telencephalon defines the spatiotemporal activity of MASH1 in the developing nervous system.

Nanoparticles (NPs) are particulate structures of various shapes and different composition with size ranging 1 and 100 nm. They are divided in NPs of natural origin (produced by combustion as in volcanoes), NPs of anthropogenic origin (produced by diesel engines or industrial incinerators) and artificial NPs (obtained through nanotechnology). These structures possess unique and innovative physical and chemical properties, dependent on their nanoscale dimensions and especially on the high ratio surface area/volume, that give to the NPs a new chemical reactivity and new optical, magnetic, catalytic and electrochemical properties (Sanvincens et al., 2008). In the last decades, these characteristics have made the NPs of considerable interest in technological development and wide used in medicine and diagnostics (Sanvincens et al., 2008), in biotechnology (Abu-Salah et al., 2010; Karn et al., 2009) and in cosmetics, food and materials (Liu et al., 2009). However, the increasing exposure to nanoscale particles requires studies that characterize the properties and potential cytotoxic effects. Although they are applied in a vast number of fields that seem to be destined to increase, their behavior inside the cell remains undetermined. It seems that NPs may lead to in vitro alteration of gene expression and cell death and that they are able to induce DNA damage both directly and indirectly, causing oxidative stress and inflammatory responses (Singh et al., 2009). Although many suppositions have been made about the possible harmful effects of nanoparticles on the body, it is not clear yet what is the exact mechanism by which these nanostructures interact with cells and subcellular structures. My Ph.D. work is part of the project funded by ECSIN (European Centre for the Sustainable Impact of Nanotechnology) that aims to assess the toxicity induced by nanostructures produced at industrial scale. In particular, a research was carried out on in vitro cytotoxicity of commercial Ludox® nanoparticles (a trademark product of W. R. Grace & Co) in human cell systems. These colloidal amorphous silica NPs are widely used in various industrial fields, such as in the production of printer's inks and paints, in textile industry, and in food industry for the fining of drinks. In particular the formulations that have been used are AS30 and SM30, 20 and 7 nm in diameter respectively. First of all, the two aqueous solutions of nanoparticles were characterized in collaboration with the Department of Chemistry, University of Padua, by measuring the ζ,potential, an indicator of the stability of colloidal suspension, by analyzing the form and the size with the transmission electron microscope, and finally with the analysis of the diameter by dynamic light scattering. It was also investigated the interaction of nanoparticles with the components of cell culture medium and serum proteins: studies of spectroscopy and analysis by dynamic light scattering have shown that even at low concentrations (0.01 mg/ml), Ludox® NPs aggregate in presence of even small percentages of serum (3%). The interaction with serum proteins resulting in large aggregates takes place immediately after preparing the solution of NPs in medium with serum and increases with incubation time. This phenomenon does not occur when the NPs are retained in aqueous suspension or in culture medium without serum. Because of the many toxicological studies conducted on cultured lung fibroblasts (Mroz et al., 2007; Foldbjerg et al., 2010) and the high risk of exposure to nanoparticles in the lungs (Gwinn et al., 2006; Nel et al., 2006), I selected a human cell line, CCD-34 Lu, derived from neonatal lung fibroblasts, and two human tumoral cell lines, A549 from a lung cancer and fibrosarcoma's cells HT-1080, were selected for this work. Initially the exposure's effects to various concentrations of Ludox® nanoparticles on cell viability were tested using the MTS colorimetric assay and the clonogenic assay. Cell viability was measured by incubating the cells in culture medium supplemented with 3% of serum for different times (24, 48 and 72 h) and for only 2 h in absence of serum to avoid the aggregation phenomena. The results showed that the two tested silica NPs give a dose and time-dependent toxicity in all the three cell lines. In addition, it was found that NPs with smaller diameter and greater surface air (Ludox SM30®) have generally a higher cytotoxic activity in agreement with literature studies (Lin et al., 2006; Napierska et al., 2009). Probably the smaller NPs can more easily penetrate the membranes and, at the same weight, they are also administered to the cells in a bigger amount than the AS30 NPs. The results of cell viability tests were compared by treating the cells in presence or in absence of serum in culture medium for a short time (2 h): both the clonogenic and the MTS assays showed that cells have a higher viability when the treatment occurs in medium with 3% of serum. I hypothesize that the NPs, forming reversible and unstable aggregates with serum proteins, are less toxic, probably because they are unable to penetrate the cell membrane because of their larger size. Finally, the normal cell line CCD-34 Lu was more sensitive to treatment with NPs than the two tumor cell lines, which show a significant decrease in cell viability only at doses that resulted almost lethal to normal cells (~0.02 mg/ml). Given the many clinical and experimental evidences that nanoparticles can damage cells and cause toxic effects (Nel et al., 2006), the production of reactive oxygen species (ROS) by cells after incubation with Ludox® AS30 and SM30 was analyzed. In agreement with the results of viability tests, it was observed that the normal line CCD-34 Lu produces high levels of ROS at concentrations of NPs at which the tumor cell lines were unaffected (~0.03mg/ml). For all the three cell lines, however, it was found a dose-dependent production of ROS after 2 h of incubation in culture medium without serum. Previous data have shown that the formation and accumulation of reactive oxygen species may cause serious damages to cells and are able to induce double breaks to DNA (Mroz et al., 2007; Mroz et al., 2008). For this reason, the induction of DSBs (double strand breaks) has been analyzed by the presence of foci of the phopshorylated form of the histone H2AX (γH2AX) in the nucleus of treated cells. The phosphorylation of this histone is necessary for the signalling of the damage and the consequent recruitment of proteins of DNA repair in the breaking point. The histone H2AX phosphorylation is not exclusively induced by the presence of DNA double strand breaks, but it is highly correlated to them, as demonstrated by several studies of induction of oxidative stress and exposure to ionizing radiation (Hamer et al., 2003). The results obtained in this work have revealed that only the fibrosarcoma human cell line HT-1080 was positive for the presence of foci after treatment with Ludox® nanoparticles AS30 and SM30, at concentrations of 0.02-0.04-0.06 mg/ml, whereas CCD-34 Lu and A549 cells were negative for all times and doses of treatment analysed. To assess whether the treatment with Ludox® NPs induces cell death by apoptosis, the cells were analysed by means of fluorescence microscopy after staining with the nuclear dye DAPI to detect the nuclear morphology and the presence of apoptotic bodies. An increase of apoptotic index was found following the treatment with nanoparticles, especially those with a smaller diameter (SM30, 0.04 mg/ml), and mainly in tumour cell line HT-1080. CCD-34 Lu cells are proved negative instead, in agreement with data showing that the normal fibroblasts does not meet to apoptosis but present different ways of response to cytotoxic activity of various agents. These data were then confirmed in the two cancer lines through the fluorimetric assay of caspase-3 activation, a cistein-protease involved in the initial stages of apoptosis. Finally to assess the possible genotoxic effects caused by incubation with Ludox® NPs, the gene expression alteration is assessed through Agilent®'s kit "Whole Human Genome Oligo Microarray". With DNA microarray technology it is possible to measure the expression levels of thousands of genes simultaneously, using the basic principles of hybridization of nucleic acids. A typical microarray experiment is divided into four distinct phases: 1) marking of the sample; 2) hybridization on a solid support; 3) image acquisition; 4) extraction of raw data and statistical analysis of measured values. The signal intensity detected in each spot of the array is ultimately an indirect measure of the concentration of that target (in this case mRNA) in the cell. Through the microarray analysis it is possible therefore to understand not only which genes are expressed in the examined conditions, but also if their expression is altered compared to the control sample (Kronick, 2004). The preliminary results achieved in this work relate to the A549 cell line incubated with Ludox® nanoparticles AS30 and SM30 at a concentration of 0.02 mg/ml, with a treatment of 2 h without serum, followed by a recovery in complete medium for 3 h (for SM30 and AS30 NPs) or 22 h (only for AS30 NPs). The number of genes whose expression is significantly altered compared to the control is higher in the sample treated with SM30 NPs (354 genes) compared to the sample treated with AS30 NPs (222 at 3 h after the end of treatment and 118 at 22 h). In both cases a greater number of altered genes are over-expressed in relation to those under-expressed when compared with the control sample. Furthermore, the level of gene expression is more altered when the analysis is conducted after 3 h of incubation in normal medium compared to 22 h. Investigating the expression levels of the main altered genes and the cellular pathways in which they are involved, it was observed that the main altered pathways are cell cycle control, the ways regulated by p53, the signaling pathway of the MAPK and the organization of the cell cytoskeleton. Although the study of gene expression profiles has revealed an alteration of the expression of genes in the cell cycle after treatment with Ludox® NPs, cell cycle analysis by flow cytometry in all the three cell lines examined did not bring out any change due to the NPs in any of the treatment conditions studied. The results obtained during my Ph.D. thesis constitute a preliminary study conducted in vitro on human cells about the cytotoxic effects caused by Ludox® silica nanoparticles, which are a model of commercial nanoparticles. In recent decades the NPs have found an increasingly wide use in various fields, from construction to textiles and food, imposing at the same time the need to provide exhaustive information for an assessment of the impact of nanomaterials on human health and the consequent regulation of their use.
Le nanoparticelle (NP) sono strutture particolate, di varia forma e di diversa composizione, con dimensioni comprese tra 1 e 100 nm. Si distinguono in NP di origine naturale (prodotte da combustioni come nei vulcani), NP di origine antropogenica (prodotte da motori diesel o inceneritori industriali) e NP artificiali (ottenute attraverso le nanotecnologie). Queste strutture possiedono proprietà  fisico-chimiche innovative uniche, dipendenti dalle loro dimensioni nanometriche e soprattutto dall'elevato rapporto area superficiale/volume, che conferiscono una nuova reattività  chimica e nuove proprietà  ottiche, magnetiche, catalitiche ed elettrochimiche (Sanvincens et al., 2008). Queste caratteristiche hanno reso le NP negli ultimi decenni di notevole interesse nello sviluppo tecnologico e di largo impiego in campo medico-diagnostico (Sanvincens et al., 2008), in campo biotecnologico (Abu-Salah et al., 2010; Karn et al., 2009) e nell'industria cosmetica, alimentare e dei materiali (Liu et al., 2009). Tuttavia, la crescente esposizione a particelle nanometriche necessita di studi che ne caratterizzino le proprietà e i potenziali effetti citotossici. Nonostante esse siano applicate in un numero così vasto di campi che sembra essere destinato ad aumentare, il loro comportamento all'interno della cellula resta ancora da accertare; sembra che possano indurre in vitro alterazione dell'espressione genica e morte cellulare e che siano in grado di causare danni al DNA sia in modo diretto che indiretto, inducendo stress ossidativi o risposte infiammatorie (Singh et al., 2009). Sebbene si siano fatte numerose ipotesi sui possibili effetti dannosi delle NP per l'organismo, tuttavia non è ancora chiaro quale sia l'esatto meccanismo con il quale queste nanostrutture interagiscano con le cellule e con le strutture subcellulari. Questo lavoro di Dottorato di Ricerca si colloca all'interno del progetto promosso e finanziato da ECSIN (European Centre for the Sustainable Impact of Nanotechnology) volto a valutare la tossicità  indotta da nanostrutture prodotte a livello industriale. In particolare è stata condotta un'indagine in vitro sulla citotossicità  di nanoparticelle commerciali Ludox® (prodotto a marchio registrato della W. R. Grace & Co) in sistemi cellulari umani. Queste NP colloidali di silice amorfa sono ampiamente utilizzate in vari campi industriali, ad esempio nella produzione di inchiostri per la stampa e vernici, nell'industria tessile e in quella alimentare per la chiarificazione di bevande. In particolare sono state utilizzate le formulazioni AS30 e SM30, rispettivamente di 20 e 7 nm di diametro. Prima di tutto le due soluzioni acquose di nanoparticelle sono state caratterizzate in collaborazione con il Dipartimento di Scienze Chimiche dell'Università  di Padova, attraverso la misura del potenziale ζ,, indicatore della stabilità  della sospensione colloidale, attraverso analisi al microscopio elettronico a trasmissione per visualizzarne forma e dimensione, e infine con la misura del diametro mediante analisi al dynamic light scattering. Inoltre si è indagato sulla possibile interazione delle nanoparticelle con le componenti del terreno di coltura cellulare e con le proteine del siero: studi di spettrofotometria e analisi al dynamic light scattering hanno dimostrato che anche a concentrazioni basse (0,01 mg/ml), le NP Ludox® aggregano in presenza anche di piccole percentuali di siero (3%). L'interazione con le proteine del siero con conseguente formazione di aggregati di dimensioni maggiori avviene subito dopo la preparazione della soluzione di NP in terreno con siero e aumenta con l'aumentare del tempo di incubazione. Questo fenomeno non si verifica quando le NP vengono mantenute in sospensione acquosa o in terreno di coltura privo di siero. Dati i numerosi studi di tossicità  condotti su colture di fibroblasti polmonari (Mroz et al., 2007; Foldbjerg et al., 2010) e l'alto rischio di esposizione alle nanoparticelle a livello polmonare (Gwinn et al., 2006; Nel et al., 2006), per questo lavoro sono state selezionate una linea cellulare umana, CCD-34 Lu, derivata da fibroblasti di polmone neonatali, e due linee umane tumorali: A549, di carcinoma polmonare, e HT-1080, di fibrosarcoma. Gli effetti dell'esposizione a varie concentrazioni di nanoparticelle Ludox® sulla vitalità  cellulare sono state innanzitutto analizzati mediante il saggio colorimetrico MTS e il saggio clonogenico, dopo incubazione a diversi tempi: 24, 48 e 72 h in terreno di coltura addizionato al 3% di siero. La vitalità  cellulare è stata misurata anche incubando le cellule per 2 h in assenza di siero, nella condizione in cui le NP non vanno incontro a fenomeni di aggregazione. I risultati ottenuti hanno evidenziato innanzitutto che le due NP di silice saggiate danno una tossicità  dose e tempo dipendente in tutte e tre le linee cellulari. Inoltre, è stato verificato che le NP di diametro inferiore e aerea superficiale maggiore (Ludox® SM30) possiedono generalmente una maggiore attività  citotossica in accordo con studi di letteratura (Lin et al., 2006; Napierska et al., 2009), probabilmente perché, essendo più piccole, possono penetrare più facilmente nelle membrane e inoltre, a parità  di peso, ne vengono somministrate alle cellule un numero maggiore rispetto alle NP AS30. Sono stati poi confrontati i risultati dei saggi di vitalità  cellulare trattando le cellule in presenza di siero nel terreno di coltura o in assenza di siero per tempi brevi (2 h): sia il saggio clonogenico che il test MTS hanno messo in evidenza che le cellule hanno una vitalità  superiore quando il trattamento con le NP Ludox® avviene in terreno con il 3% di siero. Questo probabilmente è determinato dal fatto che le NP, formando aggregati reversibili ed instabili con le proteine del siero, risultano meno tossiche, probabilmente perché non sono in grado di penetrare nella membrana cellulare date le maggiori dimensioni. Infine, la linea cellulare normale CCD-34 Lu è risultata più sensibile al trattamento con le NP rispetto alle due linee tumorali, che mostrano un calo significativo della vitalità  cellulare solo a dosi di NP che risultano pressoché letali per la linea normale (~0,02 mg/ml). Date le numerose evidenze sperimentali e cliniche che le nanoparticelle possono causare danni a livello cellulare e avere effetti tossici (Nel et al., 2006), in questo lavoro è stata analizzata la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) da parte delle cellule, come conseguenza dell'incubazione con Ludox® AS30 e SM30. In accordo con i risultati dei test di vitalità , si è osservato che la linea normale CCD-34 Lu produce alti livelli di ROS a concentrazioni di NP a cui le linee cellulari tumorali risultano insensibili (~0,03 mg/ml). Per tutte e tre le linee cellulari prese in esame si è comunque riscontrata una produzione di ROS dose-dipendente dopo 2 h di incubazione in terreno di coltura in assenza di siero. Dati precedenti hanno dimostrato che la formazione e l'accumulo di specie reattive dell'ossigeno possono causare notevoli danni a livello cellulare e sono in grado di indurre doppie rotture a livello del DNA (Mroz et al., 2007; Mroz et al., 2008). Per questo motivo è stata analizzata tramite immunofluorescenza l'induzione di DSBs (double strand breaks) al DNA per mezzo di un marcatore di tale lesione, ovvero i foci dell'stone H2AX fosforilato. La fosforilazione di questa variante istonica è necessaria per la segnalazione del danno e il conseguente reclutamento di proteine di riparazione del DNA nel sito di rottura. La fosforilazione dell'istone H2AX non è esclusivamente indotta dalla presenza di doppie rotture al DNA, ma è altamente correlabile ad esse, come dimostrato da diversi studi di induzione di stress ossidativo e di esposizione a radiazioni ionizzanti (Hamer et al., 2003). I risultati ottenuti in questo lavoro hanno evidenziato che solo la linea cellulare di fibrosarcoma umano HT-1080 è risultata positiva per la presenza di foci di riparazione dopo trattamento con nanoparticelle Ludox® AS30 e SM30, alle concentrazioni di 0,02-0,04-0,06 mg/ml, mentre le cellule CCD-34 Lu e A549 sono risultate negative per tutti i tempi e le dosi di trattamento analizzate. Per valutare poi se il trattamento con NP Ludox® induce morte cellulare per apoptosi, tutte e tre le linee cellulari prese in esame sono state analizzate al microscopio a fluorescenza dopo fissazione con il colorante nucleare DAPI per evidenziare la morfologia nucleare e l'eventuale presenza di corpi apoptotici. Si è così potuto evidenziare un aumento dell'indice apoptotico in seguito al trattamento con nanoparticelle soprattutto per quelle di diametro inferiore (SM30, 0,04 mg/ml), principalmente nella linea cellulare tumorale HT-1080 e in misura minore anche nella linea cellulare A549. Le cellule CCD-34 Lu sono invece risultate negative a conferma di dati riportati in letteratura che dimostrano che questa linea di fibroblasti polmonari umani normali non va incontro ad apoptosi ma presenta differenti modalità  di risposta all'attività  citotossica di diversi agenti. Questi dati sono stati poi confermati nelle due linee tumorali tramite il saggio fluorimetrico di attivazione della caspasi 3, una cistein-proteasi coinvolta nelle fasi iniziali dell'apoptosi. Per valutare poi gli eventuali effetti genotossici causati dall'incubazione con NP Ludox® si è valutata l'alterazione dell'espressione genica tramite il kit della Agilent® 'Whole Human Genome Oligo Microarray'. Con la tecnologia dei microarray a DNA è possibile misurare il livello di espressione di migliaia di geni contemporaneamente, sfruttando i principi di base dell'ibridazione degli acidi nucleici. Un tipico esperimento di microarray si divide in quattro fasi distinte: 1) marcatura del campione; 2) ibridazione sul supporto solido; 3) acquisizione dell'immagine; 4) estrazione dei dati grezzi ed analisi statistica dei valori misurati. L'intensità del segnale rilevata in ogni spot dell'array è in definitiva una misura indiretta della concentrazione di quel target (in questo caso RNA messaggero) nella cellula. Tramite l'esperimento di microarray è possibile quindi capire non solo quali sono i geni espressi nelle condizioni esaminate, ma anche se la loro espressione è alterata rispetto al campione di controllo (Kronick, 2004). I risultati preliminari raggiunti in questo lavoro riguardano la linea cellulare A549 incubata con nanoparticelle Ludox® AS30 e SM30 alla concentrazione di 0,02 mg/ml, con un trattamento di 2 h senza siero, seguito poi da un ripristino in terreno completo di 3 h (per le NP AS30 e SM30) o di 22 h (solo per le NP AS30). Il numero di geni la cui espressione risulta significativamente alterata rispetto al controllo è più alto nel campione trattato con le NP SM30 (354 geni) rispetto al campione trattato con le NP AS30 (222 dopo 3 h dalla fine del trattamento e 118 dopo 22 h). In entrambi i casi comunque un numero maggiore di geni alterati risulta sovra-espresso rispetto a quelli sotto-espressi, se confrontati con il campione di controllo. Inoltre, il livello di espressione genica risulta maggiormente alterato quando l'analisi viene condotta dopo 3 ore di incubazione in terreno normale rispetto a 22 h. Indagando i livelli di espressione dei principali geni alterati e le vie metaboliche cellulari in cui questi sono coinvolti, si è potuto osservare che i principali pathways alterati sono il controllo del ciclo cellulare, le vie regolate da p53, la via di signalling delle MAPK e la regolazione dell'organizzazione del citoscheletro cellulare. Nonostante lo studio dei profili di espressione genica abbiano messo in evidenza un'alterazione dell'espressione di geni del ciclo cellulare dopo trattamento con NP Ludox®, l'analisi del ciclo cellulare tramite citofluorimetria a flusso in tutte e tre le linee cellulari prese in esame non ha portato in evidenza alcuna alterazione imputabile alle NP in nessuna delle condizioni di trattamento studiate. I risultati di questo lavoro costituiscono uno studio preliminare condotto in vitro degli effetti citotossici provocati in cellule umane dalle nanoparticelle di silice Ludox®, che costituiscono un modello di nanoparticelle commerciali. Le NP negli ultimi decenni hanno trovato un impiego sempre più vasto in svariati campi, dall'edilizia al settore tessile ed alimentare, imponendo allo stesso tempo l'esigenza di fornire informazioni esaurienti per una valutazione dell'impatto dei nanomateriali sulla salute umana e una conseguente regolamentazione del loro utilizzo.

The mechanism of action of antitumor drugs, both used in clinical practice and investigated for preclinical development, has been studied. The first part of this thesis focused on the interactions between anticancer drugs currently used for treatment of solid malignancies. The study was aimed at optimizing drug combination and administration protocols, by analyzing the rational basis for their interaction both in vivo and in vitro. In particular, the effect of the interaction between alkylating agents, antimetabolites and antitopoisomerasic drugs on DNA topoisomerase expression was studied, based on the observation that topological enzymes are essential enzymes involved in most of DNA repair/replication processes. Indeed, the current study has been able to show that both antimetabolites and alkylating agents affect topoisomerases expression, and that higher cytotoxic effects are obtained when the topoisomerase poison is administered (at high doses) before the alkylating or antimetabolite drugs (at doses lower than their IC50). In the second part, new synthetic quinone methide derivates have been studied. These display alkylating properties upon selective and controlled bioactivation. The aim of this thesis was to define the tested compound mechanism of action and intracellular molecular targets, for potential development of telomerase-targeted anticancer drugs. Some of these innovative compounds have demonstrated to selectively recognize and alkylate telomeric sequences in their folded G-quadruplex conformation. Compounds presenting the naphtho diimidic nucleus and conformationally free reactive aromatic arms were the best stabilizers and binders of the G-quadruplex folded sequence. Moreover, preliminary studies highlighted an antiviral activity toward HSV-1, not directly dependent on the compound covalent reactivity.