Thèses sur le sujet « Malattia Alzheimer »

In questa tesi sono stati studiati in dettaglio due modelli matematici per la malattia di Alzheimer. Il primo modello, incentrato sull'esordio della patologia, riguarda l'aggregazione e la diffusione della beta-amiloide, il peptide che costituisce le placche senili e la cui forma oligomerica è strettamente connessa alle disfunzioni cognitive tipiche della malattia. L'aggregazione è stata modellizzata mediante l'equazione di Smoluchowski. Sono stati utilizzati tre problemi di Cauchy-Neumann per descrivere il comportamento di monomeri, oligomeri solubili e placche. Per il problema costituito da questi tre sistemi è stata dimostrata l'esistenza di una soluzione per tutti i tempi positivi, la sua unicità e positività, utilizzando in particolare il principio di massimo parabolico e il teorema del confronto che ne deriva. Si è così garantito che il modello è ben posto. Tramite strumenti classici, come il teorema della divergenza e il lemma di Gronwall, sono state provate stime asintotiche per la massa totale di monomeri, oligomeri e placche. Il secondo modello studia l'evoluzione della malattia, concentrandosi sull'interazione tra beta-amiloide e proteina prionica, che da numerosi studi sembra essere un recettore del peptide. Con tecniche classiche di teoria delle equazioni differenziali ordinarie è stato provato che il sistema costituito dalle equazioni di evoluzione per le quattro quantità d'interesse (densità delle placche e concentrazioni di oligomeri, di proteina prionica e del complesso formato da un oligomero che si lega alla proteina prionica) ha un'unica soluzione globale non negativa. È stato poi dimostrato che il sistema ha un unico stato stazionario e, mediante il criterio di Routh-Hurwitz, ne è stata dedotta la stabilità asintotica locale. Sotto una determinata condizione sui parametri e considerando la velocità di nucleazione nulla, si è infine ottenuto un risultato di stabilità asintotica globale, desunto da criteri di stabilità di Liapunov e Lasalle.

Among pathologies of the old people, dementia represent one of the main sanitary problems. Approximately 70% of the dementia cases it is represented by the Alzheimer’s Disease, a neurodegenerative cerebral pathology, whose prevalence is supposed to be increased in the next years. One pathological hallmark is represented by amyloid-beta (Aβ) plaques, which represent the key element to oxidative and pro-inflammatory mechanisms by the activated microglia. The interaction, in fact, between activated microglia and plaques of Aβ induces the release of pro-inflammatory citokynes, like interleukin-6 (IL-6), or neurotoxic factors, like the tumor necrosis factor-α, and stimulates the expression by the microglia of some scavengers receptors, deputies to remove the Aβ plaques: among them the multifunctional protein of class B type I (SRBI) CD36. Currently an effective diagnosis of AD is possible only post mortem: for this reason during the last few years has been intensified the search for biological and hormonal markers that could be useful in the early diagnosis of AD. These markers are expressed also from the peripheral leucocytes, cells easily obtainable, which express virtually all hormones and hormone receptors, which are under the same regulatory mechanisms that control their expression in the brain. So the leucocytes may be profitably used as tools to investigated the changes occurring in brain areas reportedly inaccessible in humans. In particular, it has been recently demonstrated that the leukocyte expression of CD36 is significantly reduced in patients with AD and in patients with mild cognitive impairment (MCI), a prodromic phase of AD. CD36 could represent an earlier marker of increased neurodegenerative risk. Epidemiologic studies have shown a greater incidence of AD in the individuals of female sex. A possible cause of this is represented by the modifications of the endocrine functions, that occur during the menopausal transition and that develop an unfavorable hormonal milieu predisposing to the neurodegeneration. It is demonstrated that estrogens have a neuroprotective and neurotrophic role by the binding to specific receptors, present in two isoformes (ER-α and ER-β), and that in course of AD they prevent the formation of the Aβ-fibrils, inhibit the inflammatory reaction due to the plaque deposition, and protect the cells from their cytotoxic action. The diminished estrogen secretion in postmenopausal age, in fact, is correlated inversely with the “cerebral health” and directly with the entity of the cognitive deterioration. An other female sexual hormone, the progesterone, seems to carry out multiple functions centers different from the riproduction function: the regulation of the cognitive processes, the mitochondrial function of the neuronal cell, the neurogenesis and the repair of the damaged nervous tissue. The neuronal response regulated from the progesterone are mediated by the receptors PR-A and PR-B, included some forms derived from alternative splicing. At the level of the central nervous system them (CNS), therefore, the estrogens and the progesterone cooperate in regulating some neuronal functions, such as the neuroprotection and various cognitive processes. The PR gene contains promoter sequences able to bind ER; therefore, the gene expression of PR supposes the existence of one (efficient) estrogenic stimulation. Moreover, it has been demonstrated the existence of points of convergence between intracellular signaling of estrogens and the factor of insulin-like growth factor type 1 (IGF-1), a neuromodulator that regulates the synaptic plasticity and has been involved in the tissue regeneration, guaranteeing protection during the neurodegenerative processes. Based on this, in the present thesis we evaluated the leukocyte expression of some biological parameters, in order to clearly understand the balance between the neuroprotective and proneurotoxic hormonal factors in during the life, focusing the interest on the phase of menopausal transition, a critical period of the women life during which conditions predisposing to the neurodegeneration occur. We recruited, health male and female subjects as control, of age between 20 and 91 years, and AD patients, both male and female. Fasting blood samples were drawn from all the subjects to isolated the leucocytes and the plasma. With RT-PCR we analyzed the CD36 expression, ER-α, ER-β, PR-A/B, IGF-R1 and IL-6 on the leucocytes and, by RIA or ELISA, the levels of estradiol, progesterone, IGF-1 and IL-6 in the plasma, with the following results: • as aspected, the leukocyte expression of CD36 was significantly reduced in the AD patients than the controls, young and old. Moreover, while in the healthy males the expression was not modified with the age, in the women it endured a remarkable reduction in the period correspondent to the menopausal transition (decade of age between 51 and 60 years), in order then to return to normal levels in the older subjects; interesting was that in women with AD the values were similar to those found in the women in peri-menopause; • the leukocyte expression of ER-α and ER-β in the women of 51 and 60 years of age was significantly increased, while in the men was quitly constant in the course of the life and in the AD patients of both sexes it wasn’t different by the healthy subjects of comparable age; • the leukocyte expression of PR-A/B in the healthy men was lower than the women of the same age and progressively it increased until a peak in the decade of age between 41 and 50 years, after that it was reduced in the successive decades in order then to remain stable with increasing of the age. In the women, instead, there was two-phase pathway with a minimum in the subjects 41-50 years old and higher values in older and younger. In the patients with AD of both sexes the PR-A/B expression was similar to that observed in control subjects; • the leukocyte expression of IGF-1R in the male controls diminished with increasing of the age, while in the women this decrease was less evident. In the AD patients of male sex the IGF-1R expression was significantly higher of that of the healthy subjects of the same sex; • the leukocyte expression of IL-6 in the male control population was constant while in the female population occurs an abrupt increase in the decade between 51 and 60 years. In the AD patients of both sexes the IL-6 expression was lower than the healthy controls of comparable age; • the plasmatic levels of estradiol and progesterone in the healthy men did not vary according to the age. On the contrary, in the women starting with the menopause the both hormones levels were significantly reduced. In the AD men the levels of estradiol0 were lower than the controls, while in the AD women they were similar to those found in the controls of comparable age; • the plasmatic levels of IGF-1 progressively diminished in the healthy subjects of both sexes. This reduction was not only more evident, but also more precocious in women than men. The levels of IGF-1 were significantly higher in the AD patients of both sexes than the control subjects of equal age; • none of the biological parameters investigated was related to age, except for the estradiol and progesterone levels in women and IGF-1 in both sexes; • in the healthy population of both sexes a direct correlation between the expression of ER-α or ER-β and IL-6 and between the concentrations of IGF-1 and the expression of IGF-1R was observed. In order to estimate the role of IGF-1 in the menopausal transition, the female pre- and post- menopausal population has been subdivided in the groups with normal or reduced levels of IGF-1 based on a predefined cut-off: in the group of pre-menopause women with normal levels of IGF-1 the plasma concentrations of estradiol were positively related to the leukocyte expression of PR-A/B, but this association was less evident when the group with reduced levels of IGF-1 was considered. On the contrary, in post-menopause women with normal or reduced levels of IGF-1 any statistically significative correlation between the two parameters was observed. On the base of these data it can be asserted that the phase of menopausal transition represents a “critical temporal window” in which an hormonal milieu characterized by a strong loss of balance of various hormonal factors and by the evident prevalence of pro-neurotoxic infuences is developed (in particular, the reduction of the estrogen protection, which in presence of normal levels of IGF-1, is not able to stimulating the PR-A/B expression and to reduce the production of IL-6). This could be a favoring element to develop neurodegeneration. In the second part of this thesis we decided to investigated the effectiveness of estrogens in modifying, in favorable sense, the balance between neuroprotective vs. pro-neurotoxic infuences (for eg., reduction of microglial expression of CD36 by citokynes stimulation) in vitro For this study we treated murine microglial immortalized N9 cells with 17--estradiol and TNF- in a time-dependent way: estradiol before, after or simultaneously to TNF-, in order to analize the effect of a precocious, late or simultaneous 17--estradiol administration on the CD36 expression. As previously said, the CD36 reduction is a phenomenon predisposing to the disease; in fact TNF-α, one of the citochine mainly expressed in course of AD, induce a significative reduction of CD36. Only a precocious treatment with 17-β-estradiolo was able to revert the effect of the pro-inflammatory citokyne, demonstrating the effective existence of a temporal window in which the estrogen carries out its protecting role. Moreover, since is increased the tendency to the prescription of isoflavones derived from soy (phytoestrogens) in order to contrast the hot flushes, which plague many women in the precocious menopause phases, could be useful to investigate the possiblel neuroprotective ability to these compounds, evaluating the effects of hormonal replacement therapy (HRT) or of a therapy with phytoestrogens on the expression of CD36, as precocious biochemical marker of increased dementia risk by Real-Time PCR, or by mmunostaining For this study we used females rats, subdivided into 4 groups: intact + vehicle, ovariectomized + vehicle, ovariectomized + 17-β-estradiol and ovariectomied + phytoestrogen and we investigated some parameters of correct estrogenic replacement, with the following result: • analysis of the body weight: it was higher in the ovariectomied animals, and in the animals in phytoestrogen therapy, while the intact animals and those in therapy with estrogen were less fat, although the weights of the two groups of animals were not exactly the same; • analysis of the uterus weight: the ovariectomy and the phytoestrogen therapy induced the uterus atrophy, while the intact animals or in therapy with estrogens showed trophic uteri, although with a discrepancy between the two groups; • analysis of the femoral bone denity: the ovariectomy and the phytoestrogen therapy reduced the femoral mineral bone density (diaphisis and metaphisis included), while the intact animals and those in therapy with estrogen, the bone density was not affected and the values of bone density of the two groups were very similar, except about diaphisis; • plasma levels of 17-β-estradiol: the levels were lower in the ovariectomized group and in the phytoestrogen therapy group, while they were higher, but always different, in the intact animals and those in therapy with estrogen; • cerebral gene expression of CD36 (PCR): CD36 expression in the ippocampus and in the cortex of ovariectomized animals was low and the therapy with 17-β-estradiol was able to revert this effect, bringing back it to the levels of the intact group; • peripheral gene expression of CD36: it did not vary between the 4 groups; • CNS protein expression of CD36 (immunostaining): it did not changes in the various groups and tended to form some clusters; • CNS protein expression of GFAP (immunostaining): the animals shown a state of gliosis age-related, but no any difference occurred between the several groups; • CNS protein expression of Ferritina (immunostaining): the staining was similar to that for CD36, except for the endoteliali cells. Analyzing the result about the body weight, the uterus, the bone and the plasma concentrations of 17-β-estradiol in these animals we can conclude that the estrogen exogen administration was efficient to contrast the ipoestrogenic assessment. Moreover, in considering the data obtained in human subjects, we can maintain a loss of balance during menopause towards unfavorable factors, as CD36 reduction. The discrepancy between gene and protein CD36 expression probably is due to a different method sensibility. At last, considering the role wide demonstrated in literature of CD36 in the pathogeneses of AD and to test the possibility to use CD36 as precocious biochemical marker of disease, we investigated the CD36 expression in APP23 mice, valid model of AD, by Real-Time PCR and immunostaining. To We used animals of 1,3,6,9 and 12 months of age, in which the deposition of plaques begins around the sixth month of age; at the same time we assist at the maximum gene and protein expression of CD36, in order then to return to lower levels. Moreover, a staining with tioflavina S, which stains for Aβ plaques, showed an inverse relation between plaque and CD36, determining for this receptor a role in the acute phase of disease. In conclusion, the protecting effect of estrogens in contrasting the CD36 reduction, is showed to be time and dose-dependent. Moreover, would seem to have a precocious in the diagnosis of this disease.

Le alterazioni della funzionalità mitocondriale detengono un ruolo cruciale nella patogenesi della malattia di Alzheimer (AD), sostenendo il processo neurodegenerativo attraverso meccanismi quali la riduzione della disponibilità energetica e la iperproduzione di ROS. Alle numerose ipotesi di patogenesi dell’AD, si è recentemente affiancata la cosiddetta ipotesi vascolare. Nei soggetti AD è stata riscontrata una significativa riduzione della disponibilità di ossigeno a livello neuronale (ipossia neuronale). Da numerosi studi è poi emerso che l’ipossia gioca un ruolo fondamentale nello sviluppo dell’AD contribuendo a più vie patogenetiche contemporaneamente. Tuttavia, non sono stati ancora chiariti tutti i meccanismi attraverso cui l’ipossia esplica la sua azione di danno. Lo scopo di questo studio è stato quello di contribuire a chiarire il ruolo patologico dell’ipossia nell’AD, analizzando principalmente le alterazioni della funzionalità mitocondriale indotte dalla riduzione della disponibilità di ossigeno. Nella prima fase dello studio cellule PC12 sono state coltivate in presenza di β-amiloide e ipossia. In questo modello abbiamo osservato un potenziamento dei fenomeni di deplezione dell’ATP e di generazione delle ROS indotti dalla Aβ quando anche l’ipossia era presente come fonte di danno cellulare, ipotizzando per i due fattori un effetto congiunto di tipo additivo. Nella seconda fase abbiamo esposto all’ipossia fibroblasti prelevati da pazienti AD portatori di mutazioni a carico dei geni APP e PSEN. La presenza di mutazioni predisponenti ad un fenotipo AD era in grado di determinare un danno bioenergetico e ossidativo. Le alterazioni bioenergetiche riscontrate in normossia risultavano ulteriormente potenziate quando i fibroblasti erano coltivati in ipossia, mentre lo stato di stress ossidativo veniva evidenziato solo in condizioni ipossiche. Sulla base dei risultati finora conseguiti si può ipotizzare che uno dei meccanismi attraverso cui l’ipossia esplica la sua azione di danno nella AD, possa essere dovuto alla capacità di potenziare ulteriormente le alterazioni della funzionalità mitocondriale.
Mitochondrial dysfunctions play a crucial role in the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD), sustaining the neurodegenerative process through mechanisms such as energy deprivation and ROS overproduction. The etiopathogenesis of AD is still obscure, although several hypothesis have been formulated. Recently the vascular hypothesis has been proposed. In AD patients, the cerebral blood flow is significantly decreased, with a consequent reduction of oxygen tension (neural hypoxia). Several studies have shown that hypoxia has a central role in AD pathogenesis, since it is involved in different pathogenic pathways. However, the role of hypoxia in AD is not fully understood. The aim of this study was further to elucidate the pathological role of hypoxia in AD, mainly analyzing the mitochondrial dysfunction induced by reduction of oxygen tension. In the first part of the study, PC12 cells were cultured in the presence of amyloid-β peptide and hypoxia. In this model, hypoxia and amyloid-β showed a synergistic effect, strongly contributing to ATP depletion and ROS overproduction. In the second part of the study we used, as cellular model, AD patient skin fibroblasts exposed to hypoxia. These fibroblasts are characterized by mutations of APP and PSEN genes that increase the production of amyloid-β peptide. The AD fibroblasts showed an alteration of energy metabolism and a condition of oxidative stress. The bioenergetic alterations found under normoxia were further increased by hypoxia, while the oxidative stress was observed only under hypoxic conditions. In the light of the results, we suggest that one of the pathological consequences of hypoxia in AD is the inhibition of mitochondrial function, which may contribute to the neuronal dysfunction and the impairment of cognitive capacities.

Le alterazioni della funzionalità mitocondriale detengono un ruolo cruciale nella patogenesi della malattia di Alzheimer (AD), sostenendo il processo neurodegenerativo attraverso meccanismi quali la riduzione della disponibilità energetica e la iperproduzione di ROS. Alle numerose ipotesi di patogenesi dell’AD, si è recentemente affiancata la cosiddetta ipotesi vascolare. Nei soggetti AD è stata riscontrata una significativa riduzione della disponibilità di ossigeno a livello neuronale (ipossia neuronale). Da numerosi studi è poi emerso che l’ipossia gioca un ruolo fondamentale nello sviluppo dell’AD contribuendo a più vie patogenetiche contemporaneamente. Tuttavia, non sono stati ancora chiariti tutti i meccanismi attraverso cui l’ipossia esplica la sua azione di danno. Lo scopo di questo studio è stato quello di contribuire a chiarire il ruolo patologico dell’ipossia nell’AD, analizzando principalmente le alterazioni della funzionalità mitocondriale indotte dalla riduzione della disponibilità di ossigeno. Nella prima fase dello studio cellule PC12 sono state coltivate in presenza di β-amiloide e ipossia. In questo modello abbiamo osservato un potenziamento dei fenomeni di deplezione dell’ATP e di generazione delle ROS indotti dalla Aβ quando anche l’ipossia era presente come fonte di danno cellulare, ipotizzando per i due fattori un effetto congiunto di tipo additivo. Nella seconda fase abbiamo esposto all’ipossia fibroblasti prelevati da pazienti AD portatori di mutazioni a carico dei geni APP e PSEN. La presenza di mutazioni predisponenti ad un fenotipo AD era in grado di determinare un danno bioenergetico e ossidativo. Le alterazioni bioenergetiche riscontrate in normossia risultavano ulteriormente potenziate quando i fibroblasti erano coltivati in ipossia, mentre lo stato di stress ossidativo veniva evidenziato solo in condizioni ipossiche. Sulla base dei risultati finora conseguiti si può ipotizzare che uno dei meccanismi attraverso cui l’ipossia esplica la sua azione di danno nella AD, possa essere dovuto alla capacità di potenziare ulteriormente le alterazioni della funzionalità mitocondriale.
Mitochondrial dysfunctions play a crucial role in the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD), sustaining the neurodegenerative process through mechanisms such as energy deprivation and ROS overproduction. The etiopathogenesis of AD is still obscure, although several hypothesis have been formulated. Recently the vascular hypothesis has been proposed. In AD patients, the cerebral blood flow is significantly decreased, with a consequent reduction of oxygen tension (neural hypoxia). Several studies have shown that hypoxia has a central role in AD pathogenesis, since it is involved in different pathogenic pathways. However, the role of hypoxia in AD is not fully understood. The aim of this study was further to elucidate the pathological role of hypoxia in AD, mainly analyzing the mitochondrial dysfunction induced by reduction of oxygen tension. In the first part of the study, PC12 cells were cultured in the presence of amyloid-β peptide and hypoxia. In this model, hypoxia and amyloid-β showed a synergistic effect, strongly contributing to ATP depletion and ROS overproduction. In the second part of the study we used, as cellular model, AD patient skin fibroblasts exposed to hypoxia. These fibroblasts are characterized by mutations of APP and PSEN genes that increase the production of amyloid-β peptide. The AD fibroblasts showed an alteration of energy metabolism and a condition of oxidative stress. The bioenergetic alterations found under normoxia were further increased by hypoxia, while the oxidative stress was observed only under hypoxic conditions. In the light of the results, we suggest that one of the pathological consequences of hypoxia in AD is the inhibition of mitochondrial function, which may contribute to the neuronal dysfunction and the impairment of cognitive capacities.

Questo lavoro nasce dall osservazione che il peptide beta-amiloide (Abeta), fondamentale nella patogenesi della Malattia di Alzheimer (Alzheimer s disease - AD), agisce sul sistema ossido nitrico/GMPc inducendo una diminuzione della plasticità sinaptica, dei livelli di GMPc e della fosforilazione del fattore di trascrizione e molecola della memoria CREB. Considerato che gli inibitori delle fosfodiesterasi 5 (PDE5) aumentano i livelli di GMPc e la fosforilazione di CREB, abbiamo studiato se tali molecole possano avere un effetto benefico nel fenogtipo dell AD su modelli murini di deposizione di amiloide, detti APP/PS1. Abbiamo dimonstrato che l inibitore delle PDE5 sildenafil, scelto poichè già ampiamente studiato nelle sue proprietà farmacologiche, effetti collaterali e follow-up sugli esseri umani, determina un miglioramento della funzione sinaptica, della fosforilazione di CREB e della memoria nei topi APP/PS1. Quindi, l inibizione delle PDE5 potrebbe rappresentare un nuovo target nella terapia dell AD. Inoltre, l effetto a lungo termine potrebbe essere molto utile per migliorare la compliance nei pazienti affetti da AD.

Tau is a microtubule-stabilizing protein detected in both cytosolic/cytoskeletal and nuclear cellular compartments of neuronal and non-neuronal cells, with a tightly regulated phosphorylation, in physiology (mitosis for example) and pathology (neurofibrillary tangles). In Alzheimer’s disease (AD) it is not yet established whether entangled tau represents a cause or a consequence of neurodegeneration. The amyloid β-precursor protein (AβPP) is considered pivotal in the genesis of AD, and the “amyloid hypothesis” states that amyloid β-peptides (Aβ), derived from aberrant AβPP processing, cause neurodegeneration and tau hyperphosphorylation. Here we provide evidence that AβPP, when ectopically overexpressed or in cells bearing trisomy 21, modulates the phosphorylation of tau in mitotic and pathogenic phosphoepitopes during cell cycle and regulates the intracellular localization of phospho-tau, reducing the nuclear pool and the overall ratio nuclear/cytoskeletal. We show that the modulation of tau phosphorylation mediated by AβPP is strictly dependent on β-secretase activity as well. This specific phosphorylation of tau is required during mitosis in vitro and in vivo, likely via an ERK1/2 signaling cascade; the consequent phenotype is an upregulation of cell growth kinetic induced by AβPP in proliferating cell lines. Also in differentiated neuronal A1 cells, the overexpression of AβPP modulates tau phosphorylation, altering the ratio between cytoskeletal and nuclear pools, but in this case AβPP induces cell death. The nuclear localization of phospho-tau is significantly underrepresented in neurons of AD patients, in which predominate neurofibrillary tangles, in comparison to non-AD patients. Finally we investigate the potential protective effect of sodium selenate on tau phosphorylation and tau inclusions in a transgenic mouse model of human tauopathy. Treatment with sodium selenate in these transgenic mice reduces both phospho-tau and tau inclusions, likely by activating phosphatase activity (PP2A) and increasing the autophagic degradation of tau aggregates. In summary, in this work we provide evidence for a direct contribution of APP in a signaling activity targeted to the activation of specific kinases, with a role in the phosphorylation and homeostasis of the nuclear and the cytoskeletal pool of tau, with consequences in cell cycle dynamics that may lead to cell death in postmitotic neurons. The use of pharmacological tools that may reduce kinases’ activation and stimulate the autophagic degradation of tau inclusions, as shown here using Na Selenate in transgenic mice, may revert this pathological process. In our opinion a deeper comprehension of molecular mechanisms that cause the disequilibrium between nuclear vs cytoskeletal phosphorylation of tau is essential for the identification of novel targets for AD therapy.
Tau è una proteina stabilizzatrice i microtubuli identificata in entrambi i compartimenti cellulari, quello citosolico/citoscheltrico e quello nucleare, di cellule neuronali e non neuronali; si contraddistingue per la sua fosforilazione altamente regolata in eventi sia fisiologici (per esempio durante mitosi), che patologici (come negli aggregati neurofibrillari). Nella malattia dell’Alzheimer (AD) non è stato ancora stabilito se gli aggregati neurofibrillari rappresentano una causa o una conseguenza della neurodegenerazione; secondo l’ipotesi dell’amiloide, la proteina precursore dell’amiloide (AβPP) svolge un ruolo chiave nella neurodegenerazione, producendo i peptidi tossici Aβ che sono a loro volta responsabili dell’iperfosforilazione di tau. In questo lavoro di ricerca noi dimostriamo che AβPP, quando è overespressa ectopicamente o in cellule con trisomia 21, modula la fosforilazione di tau a livello di fosfo-epitopi patogenetici e mitotici durante il ciclo cellulare e regola la localizzazione intracellulare di fosfo-tau, riducendone la quota nucleare e il rapporto nucleo/citoscheletro; tale regolazione è risultata essere strettamente dipendente dall’attivitá di γ-secretasi. Questa specifica fosforilazione di tau è richiesta durante la mitosi sia in vivo che in vitro ed è modulata dal pathway segnale di ERK1,2; il conseguente fenotipo è una stimolazione della crescita cellulare indotta da AβPP in linee cellulari proliferanti. Anche in cellule neuronali differenziate A1, l’overespressione di AβPP modula la fosforilazione di tau, alterandone il rapporto nucleo/citoscheletro ed è, in questo caso, anche correlata con la morte cellulare. A differenza dei tessuti cerebrali di casi controllo, in quelli AD la localizzazione nucleare di tau è irrilevante e si osserva la predominanza di aggregati neurofibrillari. Abbiamo infine, investigato l’azione protettiva del selenato di sodio sulla fosforilazione e gli aggregati di tau in un modello murino di tauopatia transgenico per la tau umana recante la mutazione P301S. Il trattamento con tale droga mostra ridurre sia la fosforilazione di tau, sia le sue inclusioni, attivando l’attività fosfatasica (PP2A) e la degradazione autofagica degli aggregati di tau. Riassumendo, in questo lavoro noi dimostriamo un diretto contributo di AβPP nell’attivazione di un pathway segnale volto all’attivazione di specifiche chinasi, coinvolte nella fosforilazione e nell’omeostasi dei pools nucleare e citosolico/citoscheletrico di tau, con consegnenze nelle dinamiche del ciclo cellulare che potrebbero indurre la morte cellulare in neuroni post-mitotici. L’uso di tools farmacologici che potrebbero ridurre l’attivazione di chinasi e stimolare la degradazione di inclusioni di tau, come mostrato qui usando il selenato di sodio in topi transegenici, potrebbe revertire questo processo patologico. A nostro avviso, una comprensione piú profonda dei meccanismi molecolari che causano lo squilibrio tra la fosforilazione nucleare vs. quella citoscheletrica di tau è essenziale per l’identificazione di nuovi targets terapeutici per l’AD.

La malattia di Alzheimer è un disordine neurodegenerativo progressivo e rappresenta la forma di demenza più diffusa: si stima che nel 2050 una persona su 85 ne sarà affetta. È caratterizzata da un accumulo di proteine fluide, di placche amiloidi e grovigli neurofibrillari all’interno della struttura cerebrale responsabili della perdita neuronale, comportando nel paziente un progressivo declino cognitivo con perdita della memoria e quindi dell’autonomia. Tuttavia, è stato scoperto che la maggior parte dell’accumulo avviene circa 10-15 anni prima rispetto alla comparsa dei sintomi. In questo elaborato di tesi si è proceduto all’analisi di tecniche di machine learning in neuroimaging strutturale per la diagnosi precoce della malattia di Alzheimer. In particolare, è stato scelto di utilizzare un modello di apprendimento automatico supervisionato, come quello delle macchine vettoriali di supporto per valutare l’accuratezza nella classificazione tra soggetti sani e malati all’interno del dataset OASIS2. Dalle neuroimmagini pesate in T1 di risonanza magnetica sono state estratte delle features che saranno poi utilizzate come input dell’algoritmo. Dopo avere effettuato il pre-processing dei dati, sono stati ottimizzati i valori dei parametri, attraverso valutazione della curva ROC. Dalle analisi è emerso come il machine learning possa aiutare in ambito clinico, riuscendo spesso ad individuare pattern specifici, oppure correlazioni tra le variabili che sfuggono all’occhio medico, nella prospettiva futura di riuscire ad effettuare una diagnosi precoce.

ABSTRACT IN ENGLISH Objectives: to elucidate the natural history of senile myoclonic epilepsy, a type of myoclonic epilepsy associated with Alzheimer’s disease in adult Down syndrome patients. Methods: Twelve Down syndrome patients over the age of 40 years with myoclonic epilepsy and Alzheimer’s disease underwent clinical, neuropsychological, neurophysiological and neuroradiological study. The kariotypes, APOE polymorphisms, all exons in the PSEN1 and PSEN2 genes and exons 16 and 17 in the APP gene were determined for all patients. CSF Aβ42, p-tau181, and t-tauAg were determined for two patients. Results: Three main stages appeared during the course of the syndrome. The first stage was characterized by dementia onset (mean age: 51±6.63 years), diffuse EEG abnormalities during sleep, and cerebral atrophy determined using neuroimaging. During the second stage, myoclonic epilepsy manifested (mean age: 51.4±7.29 years) with myoclonic jerks time-locked to diffuse epileptiform abnormalities upon awakening, which was controlled with antiepileptic drugs. During the third stage (mean age: 54.8±7.61 years), myoclonic seizures were replaced with myoclonus beyond seizure events, and cerebellar signs, severe dementia and photosensitivity developed. All patients showed complete trisomy 21. Mutations were ruled out on the APP, PSEN1 and PSEN2 genes, and APOE analysis revealed ε3/ε3 homozygosity. CSF biomarkers showed a decrease in Aβ42 and an increase in p-tau181. Conclusions: The natural history of senile myoclonic epilepsy is consistent with progressive myoclonus epilepsy. Chromosome 21 is implicated in its pathophysiology; however, other genetic and/or environmental risk factors cannot be excluded. The absence of the APOE type 4 allele may predict its progression. Key-words: Down syndrome, video-EEG/polygraphy, senile myoclonic epilepsy, Alzheimer’s disease, progressive myoclonus epilepsy, APOE, CSF biomarkers, PSEN 1 gene, PSEN2 gene, APP gene. ABSTRACT IN ITALIANO Obiettivi: definire la storia naturale dell’Epilessia Mioclonica Senile, un forma di epilessia mioclonica associata alla Malattia di Alzheimer in soggetti adulti con Sindrome di Down. Materiali e Metodi: 12 pazienti con sindrome di Down di età > 40 anni con epilessia mioclonica e malattia di Alzheimer sono stati sottoposti ad un completo studio clinico, neuropsicologico, neurofisiologico e neuroradiologico. Il cariotipo, lo studio dei polimorfismi dell’APOE, di tutti gli esoni dei geni della presenilina 1 e 2 e degli esoni 16 e 17 del gene della proteina precursore dell’amiloide sono stati determinati in tutti i pazienti. Sono stati anche valutati in due pazienti i livelli liquorali di Aβ42, p-tau181, e t-tauAg.. Risultati: tre principali stadi compaiono durante il decorso del quadro sindromico. La prima fase si caratterizza per la comparsa della demenza (età media di insorgenza: 51±6.63 anni), con anomalie diffuse nel corso del sonno e l’evidenza di atrofia cerebrale alle neuroimmagini. Durante la seconda fase, si apprezza l’insorgenza della epilessia mioclonica (età media di insorgenza: 51.4±7.29 anni), con scosse miocloniche, di solito al risveglio e controllate dal trattamento con farmaci anti-epilettici, correlate a diffuse anomalie epilettiformi. La terza fase (età media di insorgenza 54.8±7.61 anni) si caratterizza per la comparsa di mioclono associato ad una sindrome cerebellare con demenza di grado severo e fotosensibilità. Tutti i pazienti mostravano una trisomia completa del cromosoma 21 e un genotipo ε3/ε3 dell’APOE. Non sono state documentate mutazioni a carico dei geni della presenilina 1 e 2 e della proteina precursore dell’amiloide. I biomarcatori liquorali hanno documentato un decremento della Aβ42 e un incremento della p-tau181, suggestivi per una patologia neurodegenerativa di tipo alzhemeriana. Conclusioni: la storia naturale dell’epilessia mioclonica senile è compatibile con una epilessia mioclonica progressiva. Il cromosoma 21 è implicato nella sua fisiopatologia, sebbene non si possa escludere il ruolo di altri fattori di rischio genetici e/o ambientali. La mancata documentazione dell’allele di tipo 4 dell’APOE potrebbe rappresentare un fattore predittivo di progressione della malattia.

The depression symptoms in the elderly may accompany mild cognitive impairment. The aim of this study was to evaluate the role of depression on the risk of evolving to Alzheimer disease (AD) among mild cognitive impairment (MCI) subjects. We present the results of a clinical study of 169 MCI. Diagnosis of depression was based on clinical criteria. The endpoint was development of AD. Result: 81 MCI subjetcs conversion in AD, MCI depressed subjects had reduced risck of conversion.

Dott. ssa Eliana Venturelli Dottorato in Medicina Molecolare, Ciclo XIX TITOLO: Effetto di polimorfismi genetici coinvolti nel processo infiammatorio e nel danno ossidativo nella malattia di Alzheimer Alzheimer s Disease (AD) is a multifactorial disease caused by both genetic and environmental factors. The aim of this project was to carry out association studies, to detect significant differences in polymorphism frequency in molecules involved in AD pathogenesis, including Nitric Oxide Synthase (NOS) isoforms (NOS3 and NOS1) and IP-10 (CXCL10) gene between patients and age matched healthy controls. ApoE, NOS3 Glu298Asp and T-786C, NOS1 C276T, VNTR and G-84A, were determined by PCR-RFLP and IP-10 exons were sequenced. ApoE e4 allele, NOS3 wild type (Glu/Glu) genotype, NOS1 T/T genotype and VNTR short alleles have been demonstrated to act as a risk factor for AD. On the contrary NOS3 T-786C, NOS1 G-84A and IP-10 did not increase the risk to develop the pathology. In conclusion, our genetic analysis contributed to identify some susceptibility factors for AD. Future perspectives are represented by the possibility to carry out pharmacogenetic studies for identifying responders and non responders.

La Malattia di Alzheimer è invalidante per la persona che ne è affetta, ma anche per coloro che se ne prendono cura, i cosiddetti caregiver. I caregiver sono considerati le vittime nascoste della Malattia di Alzheimer poiché, al già difficile lavoro di cura del malato, se ne aggiungono altre, come la difficoltà di accettare la malattia e il conciliare la propria vita con gli oneri del caregiving. In letteratura il carico di questa attività e il successivo stress che ne deriva viene definito caregiver burden. Ma se in letteratura sono presenti articoli e strumenti atti a misurare il grado di caregiver burden, sono ancora molto pochi, in Italia, i servizi dedicati. Infatti molti servizi si rivolgono solamente al malato, tralasciando quindi i bisogni del caregiver. La Regione Veneto con una Delibera della Giunta Regionale ha approvato il Progetto Sollievo. Questo progetto prevede l’apertura di Centri Sollievo in cui malati di Alzheimer passano alcune ore, seguiti da volontari adeguatamente formati, e dando così sollievo ai caregiver. Nel territorio dell’ex ULSS 13 è stato attuato il Progetto IN.TE.SE. che prende le basi dal Progetto Sollievo. Il progetto IN.TE.SE. prevede però due percorsi: uno dedicato ai malati per il mantenimento delle loro capacità e della socializzazione, uno, psico-educazionale, dedicato ai caregiver; è prevista una formazione adeguata e un sostegno psicologico. Questi due progetti portano numerose novità e indicano la direzione verso cui proseguire.

In the pharmacological treatment of Alzheimer's Disease (AD), evaluation of a cognitive gain or the extinction of some behavioral abnormalities is carried out before and after the pharmacological treatment by means of special tests, scales and/or questionnaires (eg, MMSE, ADAS-cog, NPI, etc.). However, an increase of only a few points in a test or subtest scale has little statistical value per se. Minimal changes in the procedures of carrying out the test or the mood and cognitive state of the patient may account for these differences. Some clinicians also have limited their examinations to subjective impressions rather than real findings of improvement, stability or worsening after treatment. The so-called Clinicians's Interview Based Impression of Change proves to be the a paradigm with a high risk of subjectivity. This work aims to develop a more effective method for evaluating, in AD patients, the effect of therapy cholinesterase inhibitors on mnesic performance through a single case experimental design (N = 1) using the statistical test C. This statistic calculates the probability that the points of a time series are arranged at random or in a statistically significant order, so providing information about the trend of a certain treatment.

Objective: To correlate neuropsychological testing with cerebrospinal fluid Amyloid beta (AD), tau and Ptau levels in patients with Mild Cognitive Impairment (MCI) Background: Principal diagnostic instrument to define global cognitive state is the Mini Mental State Examination (MMSE). Cognitive domains that best predict progression from amnestic MCI to AD are episodic memory and executive functioning. Were selected two neuropsychological tests for both domains: Story Recall Test (SRT) and Paired-Associate Learning (PAL) to examine episodic verbal memory, and Coloured Progressive Matrices of Raven (CPMR) and Clock Drawing Test (CDT) to investigate executive functioning. Methods: Forty subjects with amnestic MCI were recruited. All of them underwent neurological exam, neuropsychological testing and lumbar puncture at time of diagnosis. Cognition were explored by MMSE (global cognitive functioning), CPMR and CDT (executive functions), SRT and PAL (episodic verbal memory). Statistical analysis was carried out by using t-test and Spearman test for correlations. Results: In the whole population, no significant correlation between cognitive and biological markers was observed. Considering CSF biomarker level of amiloidβ, thirteen subjects showed an altered pattern and converted to AD after few months, the other subjects whit a normal profile did not convert. MMSE show a significant difference between converters/no converters groups (26.4 versus 27.6 p=0.066). Also CDT and SRT had a significant difference between two groups (3 versus 5 p= 0.003 and 5.85 versus 8.32, p=0.03). Conclusion: According to these results, MMSE value is lower in converters, in according to patological biomarkers profile. PAL and CDT are more specific to predict conversion from MCI to AD.

Abstract La malattia di Alzheimer è la forma più comune di demenza degenerativa progressivamente invalidante con esordio prevalentemente in età presenile. Si stima che circa il 60-70% dei casi di demenza sia dovuta a Alzheimer disease (AD). AD è una patologia multifattoriale caratterizzata sia da placche senili extracellulari, costituite dall’accumulo della proteina amiloide, sia da grovigli neurofibrillari intracellulari, composti da filamenti Tau patologici (NFTs). Inoltre nell’Alzheimer vi è anche perdita neuronale soprattutto a livello delle aree cerebrali che sottendono i processi di apprendimento e memoria, come per esempio la corteccia frontale e l’ippocampo. L’eziologia dell’AD sembra essere legata a vari meccanismi che non sono stati ancora completamente chiariti. Allo stato attuale, non esistono terapie in uso clinico in grado di influenzare efficacemente il decorso della malattia. Alla luce della complessità della patologia e ovvio pensare che i nuovi farmaci, per essere ritenuti farmacologicamente promettenti, dovrebbero agire contemporaneamente sui vari meccanismi patogenetici coinvolti nell’AD. A tal proposito, l'obiettivo di questo progetto di ricerca è stato quello di verificare se la Palmitoiletanolamide (PEA) è in grado di modulare i sintomi presenti nella malattia di Alzheimer. Per gli obiettivi del progetto, è stato utilizzato un modello transgenico murino della patologia di Alzheimer ed il rispettivo gruppo controllo, non transgenico (NonTg). I topi transgenici, creati nei laboratori del prof. La Ferla (University of California, Irvine, USA) hanno tre geni umani mutanti (APPswe, PS1M146V, e tauP301L), per questo indicati come 3×Tg-AD, e sono considerati tra i modelli animali di malattia di Alzheimer che meglio simulano la patologia riscontrata nell’uomo. Infatti, i 3×Tg-AD sono in grado di sviluppare le placche amiloidi e NTF in maniera tempo dipendente, nelle regioni target del cervello, simulando così la progressione della malattia riscontrata negli esseri umani. Nel nostro protocollo sperimentale, topi a 3 mesi (che presentavano i primi segni di alterazioni neuropatologiche) e 9 mesi (che presentavano evidenti segni di alterazioni neuropatologiche) di vita sono stati trattati con Palmitoiletanolamide (PEA) per 90 giorni e, alla fine del trattamento cronico, i topi sono stati sottoposti a diversi test comportamentali per valutare un eventuale effetto sui deficit cognitivi e non cognitivi riscontrati nel modello transgenico preso in esame. Alla fine dei test comportamentali gli animali sono stati sacrificati per determinare, mediante analisi di biologia molecolare, l'effetto del trattamento sulle alterazioni istopatologiche tipiche della AD. I risultati dello studio hanno dimostrato che la PEA è in grado di migliorare le funzioni cognitive e non cognitive nei topi 3×Tg-AD a 6 mesi di vita, mentre sui topi a 12 mesi di vita ha mostrato un miglioramento significativo solo sulla memoria a breve termine. Circa gli effetti della PEA sulla patologia Aβ e tau nei topi 3xTg-AD, lo studio ha dimostrato che la PEA riduce in modo significativo i livelli di APP nella corteccia di topi 3×Tg-AD a 6 mesi e, cosa ancor più interessante, diminuisce anche i livelli di Aβ*56, un oligomero di Aβ. Inoltre, il trattamento cronico con PEA ha indotto una significativa riduzione della fosforilazione di tau nei residui di fosforilazione 202/205. Questi risultati suggeriscono, pertanto, che il miglioramento delle funzioni cognitive e non cognitive potrebbe essere ascritto alle variazioni sui livelli complessivi di Aβ e di tau indotti dal trattamento cronico con PEA. Inoltre, non abbiamo trovato cambiamenti significativi nei topi 3×Tg-AD per quanto riguarda i marcatori neuroinfiammatori presi in considerazione, come, ad esempio, COX-2 o marcatori di attivazione astrocitari e/o microgliali. Certamente ulteriori studi saranno necessari per determinare i meccanismi molecolari alla base degli effetti della PEA. In conclusione, i nostri dati indicano che il trattamento cronico con PEA potrebbe essere efficace nelle fasi precoci della patologia, ovvero quando l’accumulo di Aβ è nelle sue fasi iniziali ed i danni nel sistema nervoso centrale sono ancora lievi. Abstract in English Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia affecting elderly people. AD is a multifaceted pathology characterized by accumulation of extracellular neuritic plaques, intracellular neurofibrillary tangles (NFTs) and neuronal loss mainly in the cortex and hippocampus. AD etiology appears to be linked to a multitude of mechanisms that have not been yet completely elucidated. At present, no therapies in clinical use are able to effectively impact the disease course. Therefore, new drugs able to simultaneously ameliorate the numerous pathogenic mechanism involved in AD are therapeutically promising.To this regard, the aim of this research project was to investigate whether the Palmitoylethanolamide (PEA), an endogenous fatty acid amide, might modulate the symptoms of the AD. To this aim, the triple transgenic mouse model of AD (3xTg-AD) and wild type littermate (NonTg) have been used. The 3×Tg-AD mice harbor three mutant human genes (APPswe, PS1M146V, and tauP301L) and are one of the most thoroughly characterized model of AD. The 3×Tg-AD mice develop amyloid plaques and NTF pathology in a hierarchical manner in AD-relevant brain regions, and closely mimic the disease progression in humans. The mice at 3-months and 9-months of age have been treated with PEA for 90 days and, at the end of treatment, they were subjected to different behavioral tests in order to investigate their mood and learning/memory domains. At the end of behavioral tests the animals were sacrified to determine, by biochemical analyses, the effect of treatment on neuropathological and neuroinflammatory hallmarks. Interestingly PEA is able to improve cognitive and non-cognitive functions in 3×Tg-AD at 6 months of age, while has only effect on short-term memory in transgenic mice at 12 months of age. The present work provides also an extensive investigation of the effect of PEA treatment on the onset and progression of Aβ and tau pathology in 3×Tg-AD mice. We showed that PEA significantly reduces the levels of full-length APP in cortex of 6-month-old 3×Tg-AD mice and, more interestingly, it decreases also the levels of Aβ*56, an Aβ oligomer. Similarly, PEA treatment is able to reduce steady-state levels of full-length APP also in 3×Tg-AD mice at 12 months of age, suggesting that it could modulate APP processing in these animals. Interestingly, PEA treatment is also associated with a significant reduction in tau phosphorylation at residues 202/205. These results suggest that cognitive improvement is probably due to changes in overall Aβ levels and tau pathology or to a mixture of both hallmarks. Furthermore, we did not find significant changes in almost all neuroinflammatory markers taken into account, such as COX-2 or in microglial/astrocytic activation markers. Although further studies are needed to determine the molecular mechanisms underlying the beneficial effects of PEA against AD neuropathology, our data indicate that the compound may be effective in early AD or when Aβ is accumulating and initiating damage in the central nervous system.

Alzheimer’s disease (AD) and Frontotemporal Lobar Degeneration (FTLD) are two neurodegenerative and multifactorial diseases with complex etiology in which several genes involved in inflammation, oxidative damage and neuronal survival have been proposed to be candidate susceptibility factors. Given these premises, aims of this study have been to further analyze the association of candidate functional and positional genes in a population of 374 patient with AD, 291 with FTLD and 344 age matched controls. The first candidates studied have been the cell-dependent kinase inhibitor (CDKN) 2A and 2B, involved in cell cycle G1 phase progression, because abnormal cell cycle re-entry has been hypothesized to play a role in neurodegenerative disease, primarily AD. Allelic and genotypic frequencies of three tagging Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), namely rs3731239 T/C, rs2811710 C/T and rs3217992 G/A, spanning CDKN2A and CDKN2B, and covering 100% gene variability, were analyzed. According to our data, CDKN2A and CDKN2B don’t likely act as risk factors for AD. Given the potential importance of kinesin KIF24, protein expressed in neurons and involved in axonal transport and neuron development, we studied the distribution of five Single Nucleotide Polymorphism (SNPs) located in the chromosome 9 haplotype identified via linkage analysis, including UBAP1 rs7018487, UBAP2 rs1785506 and rs307658, and KIF24 rs17350674 and rs10814083. A statistically significant increased frequency of the KIF24 rs17350674 AA genotype was observed in FTLD patients compared with controls, particularly in bvFTD and female patients, showing that KIF24 rs17350674 polymorphism may act as a risk factor for sporadic FTLD. BCL2-associated athanogene 1 (BAG1) is an anti-apoptotic factor interacting with tau and regulating its proteasomal degradation. A statistically significant decreased allelic frequency of the BAG-1 rs706118 SNP was observed in patients with FTLD, but not in AD. BAG-1 rs706118 SNP likely acts as protective factor for sporadic FTLD, but not for AD. Finally we studied the Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein hnRNP-A1, which may be linked to AD, because it could influence the maturation of the Amyloid Precursor Protein (APP) mRNA, but also to FTLD, because it contains a glycine-rich consensus domain included in TAR DNA binding protein (TDP)43. In our study, hnRNP-A1 rs7967622 C/C genotype acts as risk factor only for FTLD in male population, while hnRNP-A1 relative expression levels were increased in AD patients, togheter with decreased levels of its transcription regulatory factor hsa-miR-590-3p. We confirmed the importance of genes influencing neuronal transport, metabolism and survival in both neurodegenerative diseases AD and FTLD; the observed differences are probably related to specific roles of these genes in pathogenic events occurring in FTLD only.

This PhD study is intended to perform a genetic screening on a population of AD and FTLD patients in order to identify pathogenetic causal mutations (PSEN1, PSEN2 and APP for AD; MAPT, GRN and the GGGGCC repeat expansion one the C9orf72 gene for FTLD) and to investigate the role of several candidate genes (GRN,TMEM106b and OLR1) considered to be risk factors for the two disease. Eighteen patients were carriers of pathogenetic causal mutations: 1 carrier of Ala260Val (g.49964C>T) situated in exon 8 of PSEN1,16 carriers of GRN gene mutations and 1 carrier of a new variant, Gly304Ser (g.123789G>A), located in exon 10 of MAPT gene. The presence of GGGGCC repeat expansion, positioned on the first intron of C9orf72 gene, was analyzed in a larger population (651 FTLD patients, 21 CBD and 31 PSP patients). Thirty nine patients with FTLD were carriers of pathogenetic repeat expansion, whereas none of CBD and PSP patients as well as 222 controls carried the mutation. Several associations studies were performed in the remaining sporadic population of AD and FTLD patients. Regarding the influence of GRN genetic variability on susceptibility to AD, two SNPs rs9897526G>A and rs5848 were investigated. A tendency to an increased frequency of rs5848T allele was found in AD patients as compared with controls, whereas for the rs9897526 SNP, in patients carrying the rs9897526A variant was observed a significant earlier age at disease onset compared with patients carrying the G allele. The case-control study carried out on a populations of FTLD patients was focused on four Tagging SNPs (rs2879096, rs3785817, rs4792938 and rs9897526) as well as on rs5848 SNP, localized in the 3’UTR of GRN gene. A statistically significant association of the rs4792938 CC genotype was observed in FTLD patients compared with healthy controls. Concerning the role of TMEM106b gene on susceptibility to AD, an association analysis was performed on three SNP, rs1020004 A/G, rs6966915 C/T and rs1990622 A/G, but no significant differences in allelic and genotype frequencies were found for all polymorphisms between AD patients and controls. The possible functional importance of genetic variability associated with this gene was tested by plasmatic ELISA detection of GRN on eighty AD patients. Stratifying the results according to rs1990622 SNP status, no significant differences in progranulin plasma levels were found in AD patients. Regarding OLR1, in particular it was analyzed the SNP rs1050283 T/C, located in 3’UTR of the gene. Logistic regression analysis, adjusted for gender and ApoE status, showed a statistically significant association of OLR1 rs1050283 under the assumption of a dominant and a genotypic model. Therefore this SNP could be considered a susceptibility factor for sporadic AD. Given that the SNP rs1050283 is also located in a predicted binding site of the miRNA has-miR369-3p, a preliminary expression analysis was performed on the two transcripts in the PBMC in order to clarify a possible functional role of individual genetic variability on the expression of OLR1 gene. Stratifying the results according to the presence of rs1050283C allele, a significant decrease of relative expression levels of OLR1 was observed in patients carrying at least one polymorphic C allele, despite the normal expression levels of has-miR369-3p. These data suggest that the presence of the polymorphic allele could influence the binding of has-miR369-3p to its 3’UTR consensus sequence, in which the SNP is located.

Cregiver burden prevention: effect of a psychological support group for families. The aim of this study is to investigate the effect of a psychoeducational and psychological support group for Alzheimer Disease family caregivers. We compare differents dyads patient-carer groups: the experimental group partecipating to the training, and the control group with no interventions. We also study if there are differences in the progression of dementia as outcome of the intervention with carers. Patients were evaluated, at the baseline and at 12 months, for their cognitive, neuropsychological and functional impairment, other then for depression. Caregivers were evaluated with scales for the assessment of burden, distress related to neuropsychological disturbances and depression. Results are discussed

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO Facoltà di Medicina e Chirurgia Dipartimento di Scienze Cliniche “Luigi Sacco” SCUOLA DI DOTTORATO Scienze fisiopatologiche, neuropsicologiche e assistenziali del ciclo di vita-Ciclo XXVII Tesi di Dottorato di Ricerca: Valutazione dell’accuratezza diagnostica di tre test per la Malattia di Alzheimer: Memory Binding, Free and Cued Selective Reminding Test e Dual Task Settore Scientifico Disciplinare Med – 26 Dottorando: Dr.ssa Elena SARTORIO Matricola: R09555 Tutor: Chiar.mo Prof. Claudio MARIANI Coordinatore: Chiar.mo Prof. Roberto L. WEINSTEIN Anno Accademco 2013/2014 Background and hyphothesis The main focus of current Alzheimer’s Disease (AD) research is on early diagnosis. This emphasis has led to the proposal of new research diagnostic criteria, which stress the potential role of biomarkers[Dubois B, 2014; Jack C.R. Jr, 2011 ] in diagnosing the disease in a prodromal, or even in a preclinical stage. While a considerable amount of effort is now dedicated to crucial issues about the use of biomarkers, including the standardization of CSF analysis[Molinuevo J.L, 2014] and of neuroimaging techniques [Cure F, 2014], studies on the cognitive markers are relatively scant. This is surprising, considering that the only clinical criterion supporting the use of biomarkers in subjects with cognitive complaints is the presence of an objective cognitive dysfunction, as assessed by neuropsychological tests. Of paramount importance is the assessment of memory, as the impairment in episodic memory is most commonly seen in subjects with Mild Cognitive Impairment (MCI) who subsequently progress to a diagnosis of AD dementia[Albert M.S, 2011]. Notwithstanding the obvious relevance of this point for any validation of the proposed biomarkers, it is unfortunate that no "gold standard" is available for memory testing of AD. There is clearly the need for tests that are specific for the memory dysfunction of prodromal and early AD, and that are predictive of progression to dementia. We have identified from the literature and from our own preliminary work three tests, which appear to be promising candidates to become "gold standards" for the cognitive assessment of AD. Two tests, Short Term Memory Binding Task (STMBT) and Dual Task (DT) were developed by Human Cognitive Neuroscience, Centre for Cognitive Ageing and Cognitive Epidemiology, Psychology, University of Edinburgh, UK. The first is the STMBT. The impairment of the mechanisms responsible for holding integrated objects in verbal short-term memory was shown to be selectively impaired in mild and moderate AD, in comparison to healthy ageing [Brockmole, J.R., 2008] and chronic depression in the elderly [Parra MA, 2010]. The second is the DT [Baddeley A, 1986; Baddeley A, 1991, Della Sala S, 2010]. Performance on the DT has been shown to effectively discriminate AD from healthy aging and depression [Kaschel R]. Task performance appears to be preserved in subjects with a diagnosis of MCI, suggesting that the test is suitable to map disease progression, rather than for early diagnosis [Foley J.A, 2011]. The third test is the FCSRT [Grober E,1988]. This traditional memory test has been proposed to have high predictive value for the progression of isolated disorders of memory towards AD. In particular, Dubois and colleagues [Dubois B, 2007] have claimed that episodic memory loss of the hippocampal type (characterised by a free recall deficit on testing not normalised with cueing) may be the defining feature of prodromal AD. This hypothesis is supported by a study, which indicated the predictive role of defective performance on the FCSRT on progression to dementia in subjects fulfilling the criteria for MCI [Sarazin M., 2007]. Metodologies and statistical analyses Screening procedure: All participants underwent a diagnostic protocol that included: -medical and neurological examinations, -a functional examination with Activities of Daily Living (ADL), Instrumental Acivities of Daily Living (IADL) and Clinical Dementia Rating to assess the dementia severity staging (CDR); - a depression scale Geriatric Depression Scale (GDS) for MCI group and controls; -a neuropsychological examination with the following standardized measures: 1. Global cognitive function: Minimental State Examination (MMSE) 2. Language: Token Test and semantic fluency 3. Memory: Forward Digit Span Test and story recall. 4. Executive function tests: attentional matrices and Frontal Behavioural Inventory. The Exclusion criteria are: a) organic brain pathology or organic illness affecting the brain according to the ICD-10; b)significant history of head injury; c) major systemic illnesses or medical complications, including vitamin deficiency states, thyroid disorders, and sensory disorders (i.e., blindness or deafness); d) history of drug or alcohol dependence; e) structural brain alterations that included mass lesions and hydrocephalus. The inclusion criterion is the diagnosis of dementia/Major Neurocognitive Disorder [APA, 1994] for AD sample and the diagnosis of amnestic (single or multiple-domain) MCI [Winblad B, 2004] for MCI. The samples will be composed as follows: 21 patients with mild (MMSE score equal to or higher than 21) AD dementia 21 with moderate (MMSE score 14-20) AD dementia with a typical amnestic onset [APA, 1994] and CDR > 0.5; 99 patients with MCI (24 amnestic MCI; 15 single domain MCI and 60 multi-domain MCI) with ADL 6/6; IADL lost functions ≤ 2, CDR=0.5; 52 healthy controls, aged over 65 years. Experimental procedures Participants to the study will undergo the experimental tests. The FCSRT is a paper-and-pencil test which assesses the sensitivity to cueing [Frasson P, 2011]. The STMBT (which uses the change detection paradigm) [Parra M.A, 2009] and the DT (based on the dual task paradigm) [Della Sala S, 2010] are computerized tests. Statistical analysis and results The scores on the neuropsychological battery were compared across groups using one-way ANOVA followed by Bonferroni-corrected post hoc tests. The anagraphic and neuropsychological characteristics of the studied populations are presented as follows: Subjects (N) : Control 52, MCI 99, AD 42; Age, mean (±DS): Controls 72.4 (5.3), MCI 75.5 (6.2), AD 78.5 (6.2), p <0.001; Gender, female number (%):Controls 28 (53.8), MCI 57(57.6), AD 23 (54.8), ns; Education, mean (±DS): Controls 11.4 (4.9), MCI 8.9 (4.6), AD 8.9 (4.9), p= 0,006; MMSE score, mean (±DS): Controls 28.1 (1.9), MCI 24.8 (2.9), AD 20.8 (3.4), p<0.001; Depression, n (%): Controls 7 (13.5), MCI 34 (34.3), AD 11 (26.2), p=0.023; CDR score, mean (±DS): Controls 0.0 (0.0), MCI 0.5 (0.0), AD 1.1 (0.4), p<0.001; ADL lost functions, mean (±DS):Controls 0.0 (0.1), MCI 0.2 (0.4), AD 1.0 (1.5), p<0.001; IADL lost functions, mean (±DS): Controls 0.1 (0.3),MCI 0.4 (0.8), AD 3.2 (2.1), p<0.001. We could not use the DT data in this statistical analysis because of a software errors in management of results but we are trying to retrieve the data. MCI subjects performed similarly to healthy controls but significantly better than AD patients in the condition assessing memory for shape only (STM for shape accuracy: controls 0.92 ±0.09, MCI 0.83±0.14, AD 0.72 ±0.16. Post-hoc analysis: controls vs. MCI non significant; controls vs. AD p=0.003; MCI vs. AD p=0.045) . By contrast, MCI subjects performed similarly to AD patients but significantly worse than healthy controls in the condition assessing the binding of colors and shape in memory (STM binding accuracy: controls 0.83±0.15, MCI 0.65±0.16, AD 0.58±0.12. Post-hoc analysis: controls vs. MCI p=0,006; controls vs. AD p=0,011; MCI vs. AD non significant). MCI subjects performed better than AD patients (p<0.001) and worse than healthy controls p<0.001) performing each FCSRT subitem. Discussion and conclusions STM binding is impaired in MCI. MCI subjects could not remember the temporary binding of shapes and colours to the same extent as the controls. Indeed in the condition “Memory for shape-colour binding” they performed similarly to AD patients. This raise the question as to whether STM binding deficits, which have been demonstrated to be a preclinical marker of familial AD, might also be an early marker of sporadic AD. The novelty consists in assessing the best cognitive markers for early AD with a view of identifying which, if any, could complement the currently available biomarkers. Cognitive test batteries are time-consuming [Connor D.J, 2008]. Biomarkers are still experimental, invasive (CSF analysis) or expensive (amyloid-PET) and are not available in Primary Care. The ideal marker would be targeted at cognitive impairments in AD, could be used in Primary Care and in intervention trials with minimal training, would be non-invasive, quick to administer and inexpensive. Such a test would have economic and health benefits because fewer patients would be referred for inappropriate assessments and the efficacy of interventions would be more accurately assessed. Moreover, even if FCSRT is considered a sensitive marker of early AD and it works more effi ciently than other psychometric tests in identifying those MCI subjects who will progress to dementia [Ghiretti R, 2014], it does not give any information about how different groups of patients perform the STMBT. However, while we have the FCSRT normative data for Italian population, currently they are not available yet for STMBT and we need more studies to better detect the potentiality of the test. Bibliography Albert M.S. et al. Alzheimers Dement. 2011; 7,270-9. Americal Psychiatric Association, DSM, 4th edition ed. 1994, Washington: APA. Baddeley A. et al. Q J Exp Psychol A. 1986; 38:603-18. Baddeley A.D. et al., Brain 1991; 114:2521-42. Boustani M. et al. Ann Intern Med. 2003; 138:927-37. 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La malattia di Alzheimer (AD) rappresenta una delle principali problematiche per la salute pubblica ed è stata identificata come una priorità per la ricerca. Le due caratteristiche patologiche fondamentali della malattia sono le placche amiloidi e i grovigli neuro fibrillari che sono alla base della neuroinfiammazione e del deterioramento cognitivo.Le forme solubili degli oligomeri sono la specie più tossica della β-amiloide (Aβ) e interagiscono con diverse chinasi proteiche coinvolte nella trasduzione del segnale intracellulare come Ras/MAPK e PI3K/AKT che regolano molti processi cellulari e funzioni cognitive, e alcuni meccanismi molecolari coinvolti nella degenerazione neuronale, come l'iperfosforilazione di tau e l'eccitotossicità del glutammato. Negli ultimi anni molta attenzione è stata focalizzata sull'utilizzo di composti naturali come agenti neuroprotettivi. Il luppolo (Humulus Lupulus) contiene flavonoidi, molecole aromatiche che hanno proprietà antiossidanti e antinfiammatorie. È stato dimostrato che l'estratto di luppolo ha effetti antiaggreganti sull’Aβ e sembra impedire la sua produzione nelle cellule in coltura. L'accumulo di Aβ induce anche l'attivazione della proteina 3 del recettore Nod-like receptor 3 (NLRP3) dell’inflammosoma e il conseguente rilascio di citochine proinfiammatorie, il quale svolge un ruolo fondamentale nella neuroinfiammazione associata all'AD. NLRP3 attivato induce la produzione e il rilascio di mediatori infiammatori, tra cui i complessi proteici ASC (ASC specks), IL-1β e IL-18, che facilitano la deposizione di Aβ in un ciclo che si auto alimenta. Impedire l’assemblaggio e l'attivazione del complesso dell’inflammosoma potrebbe essere una possibile strategia per la terapia dell'AD. L'obiettivo generale di questo studio è quello di indagare i meccanismi molecolari coinvolti nelle malattie neurodegenerative e nella neuroinfiammazione utilizzando modelli cellulari periferici ex vivo di AD.Al fine di caratterizzare le interazioni Aβ e vie di trasduzione del segnale MAPK e AKT, abbiamo utilizzato fibroblasti di pazienti AD sporadici con diversa gravità della malattia. Per valutare i meccanismi molecolari che potrebbero prevenire o modulare la tossicità indotta da Aβ, sono stati studiati anche i potenziali effetti citoprotettivi dell'estratto di luppolo e il relativo signaling intracellulare. Inoltre, è stato dato particolare interesse alla via di attivazione del NLRP3-infiammasoma. Abbiamo studiato il coinvolgimento dell'attivazione di NLRP3 sulle vie MAPK e AKT e sui loro bersagli a valle, utilizzando una combinazione di studi in vitro e di campioni ottenuti dai pazienti. In particolare, abbiamo utilizzato monociti umani THP-1 di derivazione macrofagica e monociti derivati da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di soggetti sani (HC) e pazienti affetti da AD, per analizzare la modulazione autofagica e gli effetti della Stavudina (D4T), un inibitore nucleosidico della trascrittasi inversa, che riduce l'attivazione dell'inflammosoma bloccando il recettore purinergico P2X7R. Inoltre, abbiamo analizzato il pathway di attivazione dell'inflammosoma NLRP3 e il ruolo di CRID3 un inibitore selettivo, per confrontare gli effetti dell’inibizione dell’inflammosoma attraverso due pathway differenti. I monociti derivati da HC e AD sono stati differenziati in cellule microglia-like (MDMIs) e caratterizzati per l'espressione di proteine intracellulari e di superficie tipiche delle cellule mieloidi. Funzioni tipiche della microglia come il rilascio di citochine infiammatorie, la fagocitosi e la degradazione sono state valutate anche in seguito all'esposizione di attivatori dell'inflammosoma con o senza CRID3. MDMIs riflettono molte caratteristiche della microglia e sono un modello cellulare utile per comprendere la patogenesi dell'AD, identificare i target terapeutici e consentire lo screening farmacologico su larga scala dei nuovi composti per uso terapeutico.
Alzheimer's disease (AD) is a major public health concern and has been identified as a priority for research in Life Science. The two core pathological hallmarks of AD are extracellular amyloid plaques and intracellular neurofibrillary tangles which underlie microglial and neuronal damage, neuroinflammation and cognitive impairment. Soluble oligomers are the most toxic species of β-amyloid (Aβ) and interact with several protein kinases such as Ras/MAPK and PI3K/AKT pathways, which regulate many cellular processes and cognitive functions. These pathways mediate Aβ toxicity, regulating some molecular mechanisms involved in neuronal degeneration such as cytoskeletal impairment, glutamate excitotoxicity and neuroinflammation. In the last years much attention has been focused on the potential role of natural compounds as neuroprotective agents. Hop (Humulus Lupulus) contains flavonoids, aromatic molecules which have antioxidant, anti-inflammatory and anti-atherogenic properties. In fact, hop extract has anti-aggregating effects on Aβ, and it seems to prevent its production in cultured cells. Aβ induces also the activation of the pattern recognition receptor Nod-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome complex in microglia and the consequent release of proinflammatory cytokines, playing a pivotal role in AD-associated neuroinflammation. NLRP3 activation results in the release of inflammatory mediators, including ASC protein complexes (ASC specks), IL-1β and IL-18, that facilitate Aβ deposition and neuroinflammation in a self-feeding pathogenic loop. Since specific therapeutical strategies are still lacking, the dampening of the inflammasome assembly and activation could be a new strategy for AD. The overall focus of this study is to investigate molecular mechanisms involved in neurodegenerative diseases and in neuroinflammation, using peripheral ex vivo cellular models from AD, to check new potential therapeutical targets. In order to characterize the complex interactions among Aβ, MAPK and AKT signaling, we used fibroblasts from sporadic AD patients with different disease severity. To evaluate any molecular mechanisms that could prevent or modulate Aβ-induced toxicity, the potential cytoprotective effects of Hop extract and related intracellular signaling were also investigated. Fibroblasts provide a useful cellular model for studying AD, since they could be differentiated into patient-specific neural cell lines, using iPSC technologies. Moreover, particular interest was given to NLRP3-inflammasome activation pathway. We investigated the involvement of NLRP3 inflammasome activation on intracellular pathways and their downstream targets, using a combination of in vitro studies and patient-derived samples. In particular, we used macrophage-derived THP-1 human monocytes and peripheral blood mononuclear cells (PBMC)-derived monocytes from healthy control (HC) subjects and AD patients, to analyse phagocytosis, autophagy and apoptosis modulation and the effects of the nucleoside reverse transcriptase inhibitor Stavudine (D4T), that reduces NLRP3 inflammasome activation blocking the purinergic receptor P2X7R. Furthermore, we analyzed the NLRP3 inflammasome pathway and the role of the selective NLRP3 inhibitor CRID3, to compare the effects of inflammasome inhibition through two different mechanisms. At this purpose, HC and AD-derived monocytes were differentiated into microglia-like cells (MDMIs) and characterized for myeloid surface and intracellular proteins expression. Key microglia functions such as inflammatory cytokines release, Aβ phagocytosis and degradation were evaluated upon exposure to NLRP3 inflammasome activators with or without CRID3. MDMIs reflected many features of microglia and, as fibroblasts-derived iPSCs, they are attractive cellular models helpful to understand AD pathogenesis, identify therapeutic targets and allow large-scale drug screening of the novel therapeutic candidates.

In questo lavoro viene presentato un modello matematico per l'aggregazione e la diffusione della beta-amiloide nel cervello umano affetto dalla malattia di Alzheimer, con la particolarità di considerare coefficienti di diffusione variabili e non costanti. Il modello è basato sull'equazione di Smoluchowski discreta per l'aggregazione, modificata in modo opportuno per considerare anche il fenomeno di diffusione.

Alzheimer's Disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder and the most common form of senile dementia. The characteristic histopathological hallmarks of AD are the intracellular neurofibrillary tangles and the amyloid plaques, made of aggregated amyloid peptides (Aß), that deposit in the extracellular matrix of the brain. Aß peptides are the result of two sequential cleavages of the amyloid precursor protein (APP); Aß is eventually released by the α-secretase enzyme. The most abundant Aß peptide species, both physiologically produced throughout life, are Aß40 and Aß42, which is more insoluble and aggregation-prone. Although most AD cases are sporadic, a small percentage of patients is affected by the hereditary form of AD (Familial Alzheimer's Disease, FAD), caused by dominant mutations in one of three genes. These genes code for the APP, presenilin-1 (PS1) and presenilin-2 (PS2); PSs are the catalytic subunits of the α-secretase enzyme complex but they also function in a α-secretase indipendent manner. FAD-linked mutations in PSs lead to an increased Aß42/Aß40 ratio, that promotes Aß plaques deposition. Beside this effect on Aß production, many mutations in PS1 and PS2 have been extensively demonstrated to cause alterations in the intracellular Ca2+ homeostasis, thus making neurons more sensitive to excitotoxic stimuli and apoptosis. The Golgi apparatus (GA) represents, together with the endoplasmic reticulum (ER), the major IP3-sensitive, rapidly mobilizable, intracellular Ca2+ store and its functionality is thus important for shaping cytosolic Ca2+ responses. Increasing evidence suggests that the GA is an heterogeneous Ca2+ handling organelle, equipped with a diverse molecular Ca2+ toolkit compared to the one expressed in the ER. For example, as Ca2+ uptake mechanisms, the GA expresses the classical sarco-endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase (SERCA) but also an additional Ca2+ pump, the secretory pathway Ca2+ ATPase1, SPCA1. The use of a specific Cameleon Ca2+ sensor targeted to the trans-Golgi, allowed us to directly demonstrate the functional GA heterogeneity by showing the distinct behavior of this sub-compartment: it takes up Ca2+ almost exclusively via SPCA1 (and not by SERCA); it does not release Ca2+ in response to IP3 generation, but rather accumulates the cation as a consequence of the cytoplasmic Ca2+ rise. As regard to the other GA compartments, we generated a new FRET-based Ca2+ indicator fused to the cis/medial-Golgi targeting sequence of the enzyme 1,6 N-acetylglucosaminyltransferase (C2gnT). The new probe very nicely co-localizes with the cis/medial-Golgi marker Giantin and thus was used to study Ca2+ dynamics in this compartment at single cell level. The data collected suggest that the GA is unique in terms of Ca2+ homeostasis, with compartments that are separated by a few microns, and in very rapid equilibrium with each other, that still maintain quite substantial differences in terms of ion concentration and response to external stimuli. The differences between the two GA sub-compartments, the medial and the trans-one, are confirmed by the specific effect on Ca2+ homeostasis of the expression of the FAD-linked PS2 T122R mutation. Cells expressing the mutated form of the protein show a decreased Ca2+ content in the cis/medial-Golgi but no effects on trans-Golgi Ca2+ homeostasis. PS2-T122R seems to inhibiting Ca2+ uptake in the cis/medial-Golgi by inhibiting SERCA pump activity while does not affect Ca2+ uptake, mediated by SPCA1, in the trans-Golgi. As a major Ca2+ store, the GA could play an important role in AD and understanding the contribution of GA Ca2+ dysfunction in AD will significantly impact our ability to develop more effective therapies for the disease.
La malattia di Alzheimer's (AD) è un disordine neurodegenerativo e la forma più comune di demenza senile. La caratteristica istopatologica di AD è la presenza di depositi neurofibrillari intracellulari e di placche amiloidi, costituite da aggregati di peptide amiloide (Aß), che si depositano nella matrice extracellulare del cervello. I peptidi Aß sono il risultato di due tagli sequenziali della Proteina Precursore dell'Amiloide (APP); Aß viene poi rilasciato dall'enzima α-secretasi. Le più abbondanti specie peptidiche di Aß, prodotte anche fisiologicamente per tutta la vita, sono Aß40 e Aß42, quest'ultimo più insolubile e più incline all'aggregazione. Sebbene la maggior parte dei casi di AD siano sporadici, una piccola percentuale di pazienti è affetta dalla forma ereditaria di Alzheimer (malattia familiare di Alzheimer, FAD), causata da mutazioni dominanti in uno dei geni codificanti per APP, presenilina-1 (PS1) e presenilina-2 (PS2); le PSs sono le subunità catalitiche del complesso enzimatico della α-secretasi ma funzionano anche in maniera indipendente da tale attività enzimatica. Le mutazioni in PSs legate a FAD portano ad un aumento nel rapporto Aß42/Aß40, che promuove la deposizione di placche amiloidi. Oltre a questo effetto, è stato ampiamente dimostrato che molte mutazioni in PS1 e PS2 provocano alterazioni della omeostasi del Ca2+ intracellulare, rendendo così i neuroni più sensibili agli stimoli eccitotossici e apoptotici. L'apparato di Golgi (GA) rappresenta, insieme al reticolo endoplasmatico (ER), il principale deposito intracellulare di Ca2+, IP3 sensibile, e la sua funzionalità è fondamentale per il controllo delle risposte citosoliche di Ca2+. Sempre maggiori evidenze suggeriscono che il GA sia un organello eterogeneo in termini di Ca2+ handling, essendo dotato di un diverso toolkit molecolare per il Ca2+ rispetto a quello espresso nell' ER. Ad esempio, come meccanismi di uptake per il Ca2+, il GA esprime la classica pompa SERCA (Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase) ma anche un ulteriore pompa, detta SPCA1 (Secretory Pathway Ca2+ ATPase1). L'utilizzo di uno specifico sensore per il Ca2+ specificatamente indirizzato al trans-Golgi, ci ha precedentemente permesso di dimostrare direttamente la eterogeneità funzionale del GA, mostrando il comportamento distinto di questo sub-compartimento: i meccanismi di uptake di Ca2+ sono mediati esclusivamente dalla SPCA1 (e non dalla SERCA); non rilascia Ca2+ in risposta alla generazione IP3, ma piuttosto si accumula il catione come conseguenza dell'aumento di Ca2+ citoplasmatico. Per quanto riguarda gli altri sub-compartimenti del GA, abbiamo generato un nuovo indicatore per il Ca2+ fuso alla sequenza di indirizzamento dell'enzima 1,6 N-acetylglucosaminyltransferasi (C2gnT) residente del cis/medial-Golgi. La nuova sonda co-localizza con il marcatore di cis/medial-Golgi Giantina e quindi è stata utilizzata per studiare le dinamiche di Ca2+ in questo sub-compartimento a livello di singola cellula. Complessivamente i dati ottenuti suggeriscono che il GA sia unico in termini di omeostasi del Ca2+, con tali sub-compartimenti separati da pochi micron, e in equilibrio molto rapido tra loro, ma comunque in grado di mantenere differenze consistenti in termini di concentrazione dello ione e risposta a stimoli esterni . Le differenze tra i due sub-compartimenti del GA sono confermate dall'effetto specifico sulla omeostasi del Ca2+ dell'espressione della forma mutata di PS2T122R legata alla malattia familiare di Alzheimer. Le cellule che esprimono tale proteina mostrano una diminuzione del contenuto di Ca2+ nel cis/medial-Golgi ma nessun effetto sull'omeostasi del Ca2+ nel trans-Golgi. PS2T122R sembra inibire l'assorbimento di Ca2+ nel cis/medial-Golgi, inibendo l'attività della pompa SERCA, mentre non influenza l'assorbimento di Ca2+, mediato dalla SPCA1, nel trans-Golgi. Il GA sembra quindi giocare un ruolo importante nella patogenesi di AD e comprendere il contributo di tale organello nella patogenesi di AD e la sua base fisiopatologica potrà avere un forte impatto sulla possibilità di sviluppare terapie più efficaci per AD.

La barriera ematoencefalica (BEE) costituisce l’interfaccia tra l’encefalo e il torrente ematico e garantisce il corretto funzionamento del sistema nervoso centrale (SNC) mantenendo l’omeostasi cerebrale entro ristretti limiti fisiologici. Infatti, a livello delle cellule endoteliali di barriera, la presenza di un elevato numero di giunzioni strette (tight junctions, TJ) e l’espressione asimmetrica di specifici trasportatori di membrana assicura una fine regolazione del flusso di sostanze in entrata e in uscita dall’encefalo [Enciu et al., 2013; Lakhan et al., 2013; Abbott and Friedman, 2012; Wolburg et al., 2009; Hawkins and Davis, 2005; Ballabh et Al., 2004]. Alla modulazione della permeabilità della BEE partecipano, inoltre, porzioni eterogenee di membrana arricchite in colesterolo e sfingolipidi di dimensioni comprese tra 10 e 200nm, definite microdomini o lipid rafts [Di Paolo and Kim, 2011; Rushworth and Hooper, 2010; Lingwood and Simmons, 2010; Patel and insel, 2009; Wennekes et al., 2009]. Poiché la BEE garantisce il mantenimento dell’omeostasi cerebrale, condizioni che ne alterano la struttura o la funzionalità risultano cruciali nello sviluppo e nella progressione di alcune delle patologie che colpiscono il SNC [Sagare et al., 2012; Grinberg et al., 2012; Jeynes and Provias, 2011]. È noto che l’ischemia cerebrale danneggia la BEE poiché promuove l’aumento della permeabilità paracellulare e la perdita diffusa di sostanze attraverso la parete vasale per effetto della rottura delle giunzioni strette [Lakhan et al., 2013; Jablonski et al., 2011; An and Xue, 2009; Pluta and Ulamek, 2008; Koto et al., 2007]. In aggiunta, l’evento ischemico compromette i meccanismi di autoregolazione del flusso ematico, determinando vasocostrizione ed ipoperfusione [Lin and Perez-Pinzon, 2013; Pluta and Ulamek, 2008]. È stato, inoltre, osservato un aumentato rischio di insorgenza della malattia di Alzheimer (AD) in pazienti che hanno subito ricorrenti episodi ischemici e sebbene i meccanismi molecolari non siano ancora stati completamente chiariti, è stata dimostrata una correlazione fisiopatologica con il metabolismo della Proteina Precursore dell’Amiloide (APP) [Guglielmotto et al., 2009;]. In modelli neuronali, infatti, le condizioni ischemiche promuovono il processamento di APP mediato dalla β-secretasi (BACE1) e la conseguente produzione di peptide amiloide (Aβ42) [Guglielmotto et al., 2009; Zhang et al., 2007; Xue et al., 2006; Sun et al., 2006] e recentemente, è stato dimostrato un aumento dei livelli di Aβ42 in risposta a condizioni ischemiche anche in un modello cellulare di BEE [Bulbarelli et al., 2012]. L’intorno lipidico in cui sono immerse sia la proteina APP sia le secretasi, oltre a svolgere un importante ruolo nel mantenimento delle proprietà della BEE [Dodelet-Devillers et al., 2009; Wolburg et al., 2009; Sugibayashi et al., 2009; McCafftrey et al., 2007], partecipa alla modulazione della produzione di Aβ42 [Sathya et al., 2012; Zhang et al., 2011; Di Paolo and Kim, 2011; Vestergaard et al., 2010]. Ciononostante i dati relativi l’influenza delle condizioni ischemiche sui livelli di espressione dei lipidi di membrana nel distretto vascolare cerebrale non sono del tutto chiari [Maulik et al., 2012; Di paolo and Kim, 2011; Verstergaard et al., 2010; Wennekes et al., 2009]. Pertanto, il presente lavoro si prefigge di valutare, in cellule endoteliali di BEE, il ruolo delle modificazioni lipidiche indotte da condizioni ischemiche, allo scopo di individuare una possibile correlazione con l’aumento dei livelli di Aβ42, [Bulbarelli et al., 2012]. La linea cellulare RBE4 (cellule endoteliali del microcircolo cerebrale di ratto) è stata utilizzata come modello in vitro di BEE e le condizioni ischemiche sono state mimate avvalendoci di un protocollo di deprivazione di ossigeno e glucosio (OGD) già in uso presso il laboratorio [Bulbarelli et al., 2012]. Le analisi sono state condotte dopo 1 e 24 ore di ripristino delle condizioni normossiche e normoglucidiche ed i risultati ottenuti mostrano, la riduzione dei livelli di espressione di GM2 e GM3, l’aumento dei livelli di colesterolo libero (CL) e la concomitante riduzione dei livelli di colesterolo esterificato (CE). L’accumulo di CL in membrana, oltre a determinarne una diminuzione nella fluidità, promuove significativamente l’attività di BACE1 (45%). In più, le alterazioni lipidiche di membrana indotte dal trattamento sembrano favorire, in cellule RBE4, uno spostamento delle proteine APP e BACE1 dai microdomini ed una loro rilocalizzazione nelle porzioni non rafts di membrana. Queste evidenze sperimentali suggeriscono un ruolo dell’evento ischemico nella modulazione dei lipidi delle cellule di barriera che potrebbe spiegare almeno in parte l’attivazione di meccanismi correlati alla produzione di peptide Aβ42 e già osservati presso il laboratorio [Bulbarelli et al., 2012]. Inoltre, differentemente da quanto riportato in letteratura [Keleshian et al., 2013; Gentile et al., 2012; Schonfeld et al., 2011; Espenshade and Hughes, 2007]. nel nostro modello sperimentale il trattamento non determina una riduzione dei quantitativi dei FL. Abbiamo, pertanto, ipotizzato che gli acidi grassi (AG) liberati per idrolisi dal CE possano essere riutilizzati dalla cellula in sostituzione di quelli rilasciati dai FL per una sorta di meccanismo compensatorio. È noto, infatti, che le condizioni ischemiche attivano la fosfolipasi A2 citosolica (cPLA2) promuovendo la sua rilocalizzazione in membrana dove catalizza l’idrolisi degli acidi grassi (AG) dai FL, con il conseguente rilascio di acido arachidonico (AA) in cellula. L’AA è il precursore di diversi mediatori del processo infiammatorio, alla cui sintesi partecipa la cicloossigenasi 2 (COX2) [Gentile et al., 2012; Rao et al., 2012; Kim et al., 2011; Fraser, 2011; Mbonye and Song, 2009]. Effettivamente, da quanto osservato in cellule RBE4, dopo il trattamento OGD l’espressione proteica di cPLA2 nelle frazioni arricchite in membrane (MEF) aumenta, parallelamente all’incremento della proteina COX2, un marcatore di infiammazione [Heneka et al., 2010]. In conclusione, il diffuso aumento dei livelli di CL, (ovvero non localizzato in specifici domini di membrana), potrebbe rappresentare un “effetto collaterale” nella risposta all’evento ischemico, che portando all’attivazione catalitica di BACE1, favorirebbe la produzione di Aβ42. Un meccanismo che, in un quadro più ampio, potrebbe nel tempo partecipare nel soggetto ischemico all’accumulo di peptide amiloide a livello di endotelio cerebrale, alterando strutturalmente e funzionalmente la BEE e risultando importante anche nell’insorgenza della patologia di Alzheimer.

Alzheimer’s Disease (AD) is a neurodegenerative disorder of the central nervous system. It is mainly sporadic, however, a little percentage of cases is inherited (Familial AD, FAD) and due to autosomal dominant mutations on three different genes, coding for Amyloid Precursor Protein (APP), Presenilin 1 (PS1) and Presenilin 2 (PS2). Presenilins, mainly localized at Endoplasmic Reticulum (ER) membranes, are the catalytic core of the ɣ-secretase complex, although several ɣ-secretase-independent activities of PSs, such as modulation of neurites outgrowth, apoptosis, autophagy, synaptic functions and regulation of Ca2+ homeostasis, have been described. Ca2+, a key intracellular second messenger, is involved in multiple cellular functionalities. Interestingly, alterations in Ca2+ homeostasis have been proposed as an early event in different neurodegenerative diseases, including AD. Notably, FAD-PS mutants have been reported to be directly involved in these dysregulations. In our lab, it has been previously showed that PS2 expression, both WT and, more potently, FAD mutants (such as PS2-T122R), but not PS1, decreases the ER Ca2+ content, mainly by inhibiting SERCA pump activity. Moreover, PS2 increases ER-mitochondria physical and functional coupling, favouring the process of ER to mitochondria Ca2+ transfer. However, due to its effect on ER [Ca2+], which results in a lower amount of available Ca2+ within the ER, its expression dampens mitochondrial Ca2+ rises upon cell stimulation. Based on the well-established role of Ca2+ on mitochondrial metabolism, here we investigate the possible effects on mitochondrial functionalities of the complex balance between alterations in ER Ca2+ content and increased ER-mitochondria coupling, induced by FAD-PS2 mutants expression. A neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) grown in a medium containing galactose, as a substitute of glucose, has been used. This growth condition enhances mitochondrial metabolism and results in an excellent experimental protocol to visualize possible mitochondrial defects. Lower total cellular ATP levels were measured in FAD-PS2-T122R expressing cells, grown either in glucose- or galactose-containing medium, with the reduction more evident in the latter condition, thus suggesting possible mitochondrial defects induced by PS2 expression. In order to investigate how Ca2+ dysregulation induced by PS2 could influence mitochondrial metabolism, we stimulated mitochondrial ATP production inducing ER Ca2+ release, followed by mitochondria Ca2+ uptake, using both bradykinin, as a maximal IP3R stimulation, and Fetal Calf Serum (FCS), as a more physiological stimulus. In both conditions, a reduction in mitochondrial ATP production, measured by a mitochondrial luciferase-based ATP probe, has been observed in cells expressing FAD-PS2, but not PS1. The defects in ATP synthesis were observed in SH-SY5Y, MEF, HT22 cells and in cortical neurons from PS2-N141I transgenic (Tg) mice (PS2.30H), by employing FRET-based ATP probes (ATeam 1.03) specifically targeted to the mitochondrial matrix or the nucleus. We also evaluated the glycolytic flux in these cells, by both employing a cytosolic luciferase-based ATP probe and measuring the extracellular medium acidification, but we did not observed any difference in these two parameters in FAD-PS2 expressing cells, compared to controls. In order to understand the mechanism through which PS2 causes the observed mitochondrial dysfunction, we firstly considered the marked Ca2+ dysregulation induced by PS2 expression. We thus decided to modulate Ca 2+ handling in control cells, to mimic the ER Ca2+ depletion caused by PS2 expression. We used two different approaches: i) treating control cells with a SERCA pump inhibitor (Cyclopiazonic acid, CPA), to partially reduce the ER Ca2+ content, or ii) overexpressing a mutated-MICU1 (MICU1mut), a component of the mitochondrial Ca2+ uniporter complex. Although both approaches were able to reduce the capacity of control cells to produce ATP, for similar mitochondrial Ca2+ uptake in control and PS2-expressing cells, a lower mitochondrial ATP production in FAD-PS2 expressing-cells compared to CPA-treated or MICU1mut expressing controls was still observed. Taken together, these results suggest that part of the FAD-PS2-induced defects in mitochondrial metabolism is due to a reduced ER Ca2+ content and, consequently, mitochondrial Ca2+ uptake, negatively regulating the Ca2+-dependent mitochondrial metabolism. However, additional mechanisms, induced by FAD-PS2, are likely involved in mitochondrial dysfunctions. We thus evaluated the respiratory chain activity measuring the oxygen consumption rate (OCR): both basal and maximal OCR were reduced in FAD-PS2, but not in FAD-PS1, expressing cells. Moreover, a reduced mitochondrial ATP-linked respiration was measured in PS2-T122R expressing cells, while no difference was found in the proton leak. Since the expression levels of the ATP synthase and the respiratory chain complexes were not affected by FAD-PS2 expression, and isolated mitochondria from WT and PS2-N141I Tg mice did not reveal substantial differences in mitochondrial respiratory activity, we reasoned that the impairment in ATP production observed in intact cells is not due to defective mitochondria per se, but likely depends on the cellular environment. Importantly, for a proper mitochondrial metabolism, the right amount of substrates produced through glycolysis in the cytosol has to reach the mitochondrial matrix to support the TCA cycle and the respiratory chain activity. Hexokinase1 (HK1), the enzyme that catalyses the first step of glycolysis converting glucose to glucose 6-phosphate, seems to be involved in the modulation of the mitochondrial substrates import, since HK1 interaction/detachment with/from mitochondria can modulate mitochondrial substrates permeability. Firstly, we measured a reduced HK1-mitochondria co-localization in FAD-PS2 expressing SH-SY5Y cells, in FAD-PS2 patient-derived fibroblasts and in primary cortical neurons from FAD-PS2-N141I Tg mice, compared to controls. By mimicking the FAD-PS2 effect on HK1-mitochondria interaction treating control cells with Clotrimazole, a drug capable to detach HK1 from mitochondria, a reduced mitochondrial ATP production was measured; however, the impairment on ATP production induced by clotrimazole was less marked than that caused by FAD-PS2 expression. These results indicate that, although the detachment of HK1 from mitochondria plays a pivotal role in causing mitochondrial defects upon FAD-PS2 expression, the PS2-induced Ca2+ dysregulation, described above, may additionally contribute to the overall mitochondrial impairment. These results have been confirmed also by a genetic approach. We down-regulated the expression of endogenous HK1, by specific siRNAs, and we rescued HK1 protein level by over-expressing siRNA-resistant full-length- (FL-HK1) or truncated- (Tr-HK1) HK1. This latter protein lacks the mitochondrial binding domain, but still conserves the catalytic activity. We found that, upon endogenous HK1 silencing, mitochondrial ATP production is strongly reduced. Interestingly, while the re-expression of FL-HK1 was able to completely rescue the reduced ATP production, the Tr-HK1 was unable to do it, again confirming that the detachment of HK1 from mitochondria is involved in the mitochondrial impairment caused by FAD-PS2. Related to HK1 and its role in the regulation of mitochondrial substrates permeability, an increase in the cytosolic amount of pyruvate was measured in FAD-PS2 expressing cells, compared to controls, employing a cytosolic FRET-based pyruvate probe, Pyronic. Importantly, by pharmacologically blocking mitochondrial pyruvate carrier (MPC), the protein responsible for mitochondrial pyruvate uptake, with two different drugs, UK5099 and Pioglitazone, no differences were anymore detected between control and FAD-PS2 expressing cells, suggesting that FAD-PS2 is acting on this pathway. Overall, we have showed that FAD-PS2 mutants decrease cellular ATP levels, in particular mitochondrial ATP production, by two different mechanisms: 1) causing Ca2+ dysregulation, mainly decreasing the ER Ca2+ content, and thus the amount of Ca2+ available for mitochondrial Ca2+ uptake; 2) inducing the detachment of HK1 from mitochondria, likely affecting the availability of substrates (i.e., pyruvate) for mitochondria. Further experiments will be aimed at: i) evaluate the impact of the PS2-dependent strengthened ER-mitochondria coupling on the reported mitochondrial defects; ii) defining the molecular mechanism through which FAD- PS2 mutants affect HK1 intracellular distribution; iii) evaluate the impact of these alterations on the onset/progression of the AD phenotype.
La malattia di Alzheimer è un disturbo neurodegenerativo del sistema nervoso centrale. È, principalmente, una malattia sporadica; tuttavia in una piccola percentuale di casi è ereditata e dovuta a mutazioni autosomiche dominanti in tre diversi geni, che codificano per la Proteina Precursore dell’Amiloide (APP), per Presenilina1 (PS1) e per Presenilina2 (PS2). Le preseniline, principalmente localizzate nella membrana del reticolo endoplasmatico (RE), costituiscono la porzione catalitica del complesso enzimatico della ɣ-secretasi. Le stesse, oltre ad essere fondamentali per l’attività di questo complesso enzimatico, hanno molte funzioni che sono indipendenti dalla ɣ-secretasi; tra queste, la modulazione della crescita dei neuriti, dell’apoptosi, dell’autofagia, delle funzioni sinaptiche e dell’omeostasi del Ca2+. Il Ca2+ è un secondo messaggero intracellulare fondamentale, coinvolto in molteplici funzionalità cellulari; alterazioni dell'omeostasi del Ca2+ sono state proposte come eventi precoci in diverse malattie neurodegenerative, tra cui la malattia di Alzheimer. In particolare, è stato dimostrato che mutazioni in PS2 associate a forme familiari di Alzheimer (FAD) sono direttamente coinvolte in queste alterazioni. Nel nostro laboratorio è stato precedentemente dimostrato che l'espressione di PS2, sia della forma WT ma soprattutto delle forme mutate associate a FAD (come PS2-T122R), ma non di PS1, riduce il contenuto di Ca2 + nel RE principalmente inibendo l'attività della pompa SERCA. PS2, inoltre, aumenta la vicinanza fisica e funzionale di RE e mitocondri, favorendo il processo di trasferimento di Ca2+ tra i due organelli; tuttavia, a causa del suo effetto sulla [Ca2+] nel RE, che ha come conseguenza una minore quantità di Ca2 + disponibile per il rilascio nel citosol, la quantità di Ca2 + che entra nei mitocondri, dopo stimolazione, è ridotta. Sulla base del ruolo fondamentale svolto dal Ca2 + nella regolazione del metabolismo mitocondriale, nel lavoro presentato in questa tesi abbiamo esaminato i possibili effetti sulla funzionalità mitocondriale del complesso equilibrio tra alterazioni del contenuto di Ca2+ nel RE e l’aumento della vicinanza tra RE e mitocondri, indotti dall’espressione di forme mutate di PS2 legate a FAD. Per svolgere questo studio abbiamo utilizzato una linea cellulare di neuroblastoma (SH-SY5Y), cresciuta in un terreno contenente galattosio, invece di glucosio. Infatti, le cellule cresciute in un terreno che contiene galattosio aumentano il metabolismo mitocondriale, rendendo così questo protocollo sperimentale ottimale per evidenziare eventuali difetti mitocondriali. In cellule esprimenti FAD-PS2-T122R, cresciute in un terreno contenente glucosio o galattosio, sono stati misurati livelli totali di ATP cellulare minori rispetto a quelli di cellule di controllo. La riduzione di questo parametro era più evidente in cellule cresciute in terreno contenente galattosio, suggerendo possibili difetti mitocondriali indotti da PS2. Per studiare come la deregolazione del Ca2+, causata dall'espressione di PS2, possa influenzare il metabolismo mitocondriale, abbiamo indotto il rilascio di Ca2+ dal RE, a cui segue un aumento di Ca2+ nei mitocondri che conseguentemente stimola la produzione di ATP mitocondriale. A tal fine abbiamo utilizzato sia bradichinina, come stimolo massimale del recettore IP3, sia siero fetale di vitello (FCS), contenente fattori che inducono una stimolazione più fisiologica dello stesso recettore. In entrambe le condizioni, è stata osservata una riduzione nella produzione di ATP mitocondriale, misurata utilizzando luciferasi (in particolare la sonda mitocondriale), in cellule esprimenti FAD-PS2, ma non in cellule che esprimevano FAD-PS1. I difetti nella sintesi di ATP sono stati osservati in cellule SH-SY5Y, MEF, HT22 e in neuroni corticali di topi FAD-PS2-N141I (Tg, PS2.30H), utilizzando anche sonde per l’ATP basate su FRET (ATeam 1.03), contemporaneamente espresse nella matrice mitocondriale e nel nucleo. Abbiamo anche valutato se l’espressione di FAD-PS2 potesse influenzare la glicolisi; per fare questo, abbiamo espresso in cellule una luciferasi citosolica, per valutare l’ATP prodotta nel citoplasma, e abbiamo misurato l’acidificazione del mezzo extracellulare, come indice di glicolisi. Per entrambe i parametri, non abbiamo osservato alcuna differenza tra cellule esprimenti FAD-PS2 o di controllo. Per comprendere il meccanismo attraverso il quale PS2 causa la disfunzione mitocondriale osservata, data la nota deregolazione dell’omeostasi del Ca2+ indotta da PS2, abbiamo innanzitutto deciso di simulare la deplezione di Ca2+ nel RE causata dall’espressione di PS2 nelle cellule di controllo. Abbiamo usato due approcci diversi: da un lato abbiamo trattato le cellule di controllo con un inibitore della pompa SERCA (acido ciclopiazonico, CPA) per ridurre il contenuto di Ca2+ nel RE, dall’altro abbiamo sovraespresso una forma mutata di MICU1 (MICU1mut). In entrambi i casi abbiamo ottenuto una riduzione nell’entrata di Ca2+ nel mitocondrio, mimando perfettamente il difetto causato dall’espressione di FAD-PS2. Come atteso, il trattamento con CPA e l'overepressione di MICU1mut riducono notevolmente la produzione di ATP rispetto alle cellule di controllo non trattate. Ciononostante, a parità di Ca2+ che entra nel mitocondrio in cellule esprimenti o meno FAD-PS2, abbiamo misurato una minore produzione di ATP mitocondriale in cellule esprimenti forme mutate di PS2, rispetto ai controlli trattati con CPA o esprimenti MICU1mut. Tali risultati suggeriscono che i difetti nel metabolismo mitocondriale indotti dall’espressione di FAD-PS2 solo almeno in parte riconducibili alla riduzione del contenuto di Ca2+ nel RE, e quindi al suo ingresso nei mitocondri. Tuttavia, sono probabilmente coinvolti meccanismi aggiuntivi nelle disfunzioni mitocondriali osservate. Abbiamo, quindi, valutato l'attività della catena respiratoria misurando la velocità nel consumo di ossigeno (OCR). E’ stato così possibile osservare che sia il consumo di ossigeno a basale che il massimo consumo di ossigeno sono ridotti in cellule esprimenti FAD-PS2, ma non FAD-PS1. Inoltre, in cellule esprimenti PS2-T122R è stata misurata una riduzione della respirazione mitocondriale legata alla produzione di ATP. Tuttavia, poiché i livelli di espressione dell’ATP sintasi e dei complessi della catena respiratoria non variano, in seguito all’espressione di PS2, e dato che misure di respirazione in mitocondri isolati da topi WT e PS2-N141I Tg non hanno rivelato differenze sostanziali, la riduzione nella produzione di ATP osservata in cellule intatta non è verosimilmente dovuta ad un’alterazione intrinseca nell'attività della catena respiratoria. Questo suggerisce che i difetti riscontrati possano dipendere dall'ambiente cellulare, piuttosto che da un difetto intrinseco degli stessi mitocondri. Per un corretto metabolismo mitocondriale, la giusta quantità di substrati prodotti nel citoplasma attraverso la glicolisi deve raggiungere la matrice mitocondriale per supportare il ciclo di Krebs e l'attività della catena respiratoria. L’esochinasi 1 (HK1), enzima che catalizza la prima reazione della glicolisi, convertendo il glucosio in glucosio 6-fosfato, sembra anche modulare l’ingresso dei substrati nei mitocondri, poiché l'interazione/distacco di HK1 con/dai mitocondri può modulare la permeabilità mitocondriale ai substrati. Abbiamo misurato una riduzione nella co-localizzazione tra HK1 e mitocondri in cellule SH-SY5Y esprimenti FAD-PS2, in fibroblasti da pazienti FAD con mutazioni in -PS2 e in neuroni corticali da topi transgenici FAD-PS2. Il trattamento di cellule di controllo con clotrimazolo, una sostanza nota per avere la capacità di indurre il distacco di HK1 dai mitocondri, si è rivelato capace di ridurre la colocalizzazione tra HK1 e mitocondri a un livello simile a quello causato da PS2, mimandone così l'effetto. In seguito a questo trattamento, cellule di controllo mostravano una ridotta produzione di ATP mitocondriale, rispetto a cellule non trattate; tuttavia, l'effetto del clotrimazolo sulla produzione di ATP era meno evidente rispetto alla diminuzione causata dall'espressione di FAD-PS2. Questo significa che, anche se il distacco di HK1 dai mitocondri svolge un ruolo importante nel determinare i difetti mitocondriali osservati in seguito a espressione di FAD-PS2, la disfunzione nell’omeostasi del Ca2+, descritta in precedenza, contribuisce anch’essa alla diminuzione complessiva dell’attività mitocondriale. Questi risultati sono stati confermati anche con un approccio genetico. Abbiamo abbattuto l'espressione di HK1 endogena, mediante specifici siRNAs e abbiamo sovra-espresso la forma intera di HK1 (FL-HK1) o la forma tronca di HK1 (Tr-HK1), proteina ques’ultima che manca del dominio di legame mitocondriale ma che presenta ancora l'attività catalitica. Il silenziamento della proteina endogena causa una notevole riduzione nella produzione di ATP mitocondriale; la ri-espressione di FL-HK1 è in grado di recuperare completamente il difetto nella produzione di ATP, mentre quella di Tr-HK1 no. Questi risultati confermano nuovamente che il distacco di HK1 dai mitocondri è coinvolto nella manifestazione dei difetti mitocondriali osservati in seguito all’espressione di FAD-PS2. Relativamente a HK1 e al suo ruolo nella regolazione della permeabilità mitocondriale ai substrati, in cellule esprimenti PS2 è stato misurato un aumento nella quantità di piruvato nel citoplasma . È importante notare come il blocco farmacologico della proteina responsabile del trasporto del piruvato all’interno del mitocondrio (MPC) con due diversi farmaci, UK5099 e Pioglitazone, annulli le differenze tra le cellule esprimenti FAD-PS2 e i controlli, indicando che l'espressione di FAD-PS2 agisce anche su questa via metabolica. In questo lavoro, abbiamo mostrato che forme mutate di PS2 legate a FAD diminuiscono i livelli cellulari di ATP, in particolare la produzione di ATP mitocondriale, con due diversi meccanismi: 1) causando una deregolazione dell’omeostasi del Ca2+, principalmente diminuendo il contenuto di Ca2+ nel RE, e quindi il conseguente ingresso di Ca2+ nel mitocondrio; 2) inducendo il distacco di HK1 dai mitocondri, influenzando così la disponibilità di substrati (per es., piruvato) per i mitocondri. Ulteriori esperimenti saranno finalizzati a: i) valutare l'impatto dell’aumento della vicinanza tra RE e mitocondri causato dall’espressione di PS2 sui difetti mitocondriali riportati; ii) definire il meccanismo molecolare attraverso il quale FAD-PS2 induce il distacco di HK1 dai mitocondri; iii) valutare l’eventuale impatto di queste alterazioni nella progressione del fenotipo AD.

Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder and the most frequent form of dementia in developed countries, which leads to severe loss of memory and cognitive dysfunctions. By far, the majority of AD cases are sporadic (SAD), with unknown etiology, for which the main risk factors are represented by aging and by the presence of the allelic variant APO-e4 of apolipoprotein E. Only a small but significant percentage of cases, collectively called familial AD (FAD), is inherited and is caused by autosomal dominant mutations in the genes coding for the amyloid precursor protein (APP), presenilin 1 (PS1) and presenilin 2 (PS2) respectively. APP is a single transmembrane domain protein with a large extracellular domain, expressed at high level in the brain. PSs are homologous membrane proteins specially localized in the endoplasmic reticulum (ER) and Golgi apparatus; they represent the essential components of the gamma-secretase complex, which, by cleaving APP in concert with beta-secretase, leads to the production of the neurotoxic beta-amyloid peptides. The identification of these genetic factors involved in FAD cases, allowed the development of transgenic mouse models. Given that SAD and FAD cases are morphologically and clinically similar, these models represent an important research tool to investigate potential common molecular mechanisms between the two AD forms, with the aim of devising effective therapies. In these studies, two transgenic mouse models were used to perform the experiments. The first one is a single transgenic line, homozygous for the FAD-linked PS2-N141I mutation, which is under the prion promoter control and it is ubiquitously expressed. The second model is a double transgenic line homozygous for both the FAD-linked PS2-N141I mutation and APPSwe mutation, which is under Thy.1 promoter control, thus expressed only in neurons. We investigated the possible, early impairment of mitochondrial functions in the brain of the transgenic animals. Mitochondria are cytoplasmic organelles responsible for most of the energy supplied to the cells through ATP production; furthermore, they are involved in many other roles, such as Ca2+ homeostasis, reactive oxygen species production (ROS) and apoptosis. It is well established that mitochondrial impairment contributes to normal aging and to a wide spectrum of age-related diseases, including neurodegenerative diseases, such as AD, Parkinson’s Disease (PD), Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), and Huntington’s Disease (HD). First of all, we started with mitochondria isolated from the brain of WT, single and double transgenic mice of different ages, from neonatal up to 2 years old animals, to investigate the age-dependent progression in the onset of potential mitochondrial dysfunctions. We evaluated mitochondrial bioenergetics parameters such as the oxygen consumption rate (OCR), the membrane potential and the calcium retention capacity (CRC). These experiments didn’t reveal overt defects in the respiratory complexes activity or in the sensitivity of the permeability transition pore (PTP) to matrix Ca2+ overload in transgenic animals compared to WT, suggesting that these FAD-linked mutations do not cause severe primary defects on the organelles. Isolated mitochondria represent a useful tool in many instances, but being removed from the cellular environment do not allow the study of the complex interaction that mitochondria entertain with other organelles or components of the cell. For this reason, we decided to study mitochondria in primary hippocampal cultures, specifically because the hippocampus is one of the first and main affected brain areas in AD. In the context of intact cells, the basal respiration and the ATP synthesis coupled respiration measured by the mean of the Extracellular Flux Analyzer (Seahorse) didn’t show significant differences among the three genotypes, whereas the maximal respiration was significantly higher in WT neurons compared to PS2APP neurons, suggesting a possible impairment in the supply of substrates to mitochondria. Measuring the ability of mitochondria to sustain the membrane potential upon the selective inhibition of either the respiratory chain or the ATP synthase suggested the presence of a possible defect in the latter enzyme, in its ability to hydrolyze ATP, or the presence of an unknown metabolic defect/s limiting the supply of ATP to the synthase to sustain its reverse activity. Despite these interesting data obtained in hippocampal neurons, we didn’t observe the same strong differences under similar conditions in experiments performed in human fibroblast carrying the same FAD-linked PS2 mutation. These differences could be due to the fact that fibroblasts are mostly glycolytic cells, which might be less affected than neurons by mitochondrial dysfunctions. In order to check the ATP synthase reverse activity, we measured NADH oxidation in isolated mouse brain-cortex mitochondria. The preliminary results showed a higher ATP hydrolysis rate in PS2 and PS2APP mitochondria compared with WT, but more experiments are needed to assess the statistical significance of this finding. Blocking the respiratory chain, or the ATP synthase, in neuronal cells, so likely impairing ATP production, didn't show any major difference in the ability of the cells to handle potentially threatening increased cytosolic calcium concentration, [Ca2+]c. This evidence prompted the conclusion that under these experimental conditions, neurons seem to be equally able to handle a decrease in ATP content, and perhaps prolonged and stronger stimuli would be necessary to disclose possible defects. Moreover, the basal ROS production in these cells is very low and seems to be similar among the genotypes. Given the results collected so far, it would be interesting to better clarify the activity of the ATP synthase in the transgenic animals and investigate further the metabolic cross-talk between mitochondria and the rest of the cell.
Il morbo di Alzheimer è la malattia neurodegenerativa più diffusa e una delle principali cause di demenza nei paesi occidentali. Questa patologia determina progressivi danni alla memoria e ad altre importanti funzioni cognitive. La maggior parte dei casi di Alzheimer è sporadica, compare in tarda età e i fattori di rischio più conosciuti sono l’invecchiamento e la variante allelica APO-e4 del gene che codifica per la lipoproteina E. Esiste tuttavia una piccola ma significativa percentuale di casi ereditari (forma familiare di Alzheimer, FAD) che è causata da mutazioni autosomiche dominanti in tre geni che codificano per la Proteina Precursore dell’Amiloide (APP), per la Presenilina-1 (PS1) e la Presenilina-2 (PS2). L’APP è una proteina transmembrana espressa principalmente nel cervello. Le preseniline sono proteine omologhe di membrana presenti soprattutto nel reticolo endoplasmatico e nell’apparato di Golgi. Costituiscono ciascuna, indipendentemente, la parte catalitica dell’enzima gamma-secretasi che, insieme all’enzima beta-secretasi, è responsabile del taglio dell’APP e della conseguente formazione di peptidi Abeta, molto dannosi per il cervello. L’identificazione di mutazioni genetiche coinvolte nelle forme familiari di Alzheimer, ha permesso lo sviluppo di modelli di topi transgenici. Dato che i casi sporadici e quelli familiari della malattia sono clinicamente molto simili, questi modelli rappresentano uno strumento essenziale per la ricerca, poiché permettono lo studio di possibili meccanismi molecolari condivisi e danno la possibilità di scoprire/migliorare eventuali terapie. In questo progetto, gli esperimenti sono stati effettuati utilizzando due modelli transgenici di topi disponibili in laboratorio. Il primo è un topo transgenico omozigote per la mutazione PS2-N141 che è stata posta sotto il controllo del promotore prionico e quindi viene espressa in tutti i tessuti. Il secondo modello è omozigote per la stessa mutazione di PS2 e anche per una mutazione dell’APP (APPSwe) che si trova sotto il controllo del promotore Thy.1, ed è quindi espressa solo nel cervello. L’obiettivo di questo studio è quello di trovare possibili danni precoci nei mitocondri di cervello in questi modelli transgenici di Alzheimer. I mitocondri sono organelli citoplasmatici principalmente coinvolti nel fornire energia alla cellula sotto forma di ATP, ma sono in realtà indispensabili per molte altre funzioni, come ad esempio il controllo dell’omeostasi del calcio, la produzione delle specie radicali di ossigeno (ROS) e l’apoptosi. Al giorno d’oggi, è ampiamente accettato che danni a questi organelli non sono solo presenti durante il normale invecchiamento ma anche in molte altre malattie legate ad esso, comprese le malattie neurodegenerative come l’Alzheimer, il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica e la corea di Huntington. I primi esperimenti sono stati effettuati in mitocondri isolati dal cervello dei topi WT, PS2 e PS2APP, partendo da quelli di 8 giorni fino a topi di 2 anni, per documentare la possibile presenza e/o progressione di disfunzionalità dei mitocondri. Abbiamo valutato diversi parametri bioenergetici, come la velocità di consumo dell’ossigeno (oxygen consumption rate, OCR), il potenziale di membrana mitocondriale e la capacità dei mitocondri di accumulare calcio nella matrice (calcium retention capacity, CRC). I risultati di questi esperimenti non hanno tuttavia rivelato particolari differenze tra i topi WT e quelli transgenici, né per quanto riguarda l’attività dei complessi della catena respiratoria, né per la sensibilità del poro di transizione della permeabilità mitocondriale (permeability transition pore, PTP) ad un elevato aumento di Ca2+ nella matrice. Tali dati suggeriscono che probabilmente, queste mutazioni FAD non inducono direttamente danni ai mitocondri. I mitocondri isolati sono uno strumento molto utile per studiare le caratteristiche e la funzionalità di questi organelli, ma presentano tuttavia alcuni svantaggi: per esempio, in queste condizioni il mitocondrio è separato dal suo ambiente fisiologico e non è così possibile studiare le sue interazioni con le altre componenti del citoplasma. Per questo motivo, abbiamo deciso di spostare la nostra attenzione sulle colture primarie neuronali di ippocampo, perché quest’area del cervello è una delle regioni maggiormente e precocemente colpite dall’Alzheimer. Per prima cosa, abbiamo comparato la respirazione basale e la respirazione accoppiata alla sintesi di ATP misurate con l’Extracellular Flux Analyzer (Seahorse) senza però trovare differenze significative tra le colture dei tre genotipi. La misura della respirazione massima è invece più alta nei WT rispetto a PS2 e PS2APP, e la differenza è significativa tra WT e PS2APP, suggerendo una possibile alterazione nel rifornimento di substrati ossidabili ai mitocondri. In seguito, le misure effettuate per valutare la capacità dei mitocondri di mantenere il potenziale di membrana dopo l’inibizione selettiva dei complessi della catena respiratoria o dell’ATP sintasi, hanno rivelato un possibile difetto in quest’ultima, che potrebbe limitare la capacità di idrolizzare l’ATP, oppure alla presenza di difetti metabolici sconosciuti che limitano il rifornimento di ATP del citoplasma per sostenere l’attività idrolitica. Visti questi risultati, abbiamo provato a ripetere gli esperimenti in fibroblasti provenienti da pazienti caratterizzati dalla stessa mutazione di PS2 presente nei modelli transgenici di topo. In questo caso però, la differenza tra fibroblasti provenienti da controlli sani e quelli provenienti dai pazienti non è così marcata come quelli emersi dagli studi nelle colture neuronali primarie. Questo può essere spiegato dal fatto che i fibroblasti sono cellule molto diverse dai neuroni, potrebbero ad esempio utilizzare di più la glicolisi, o semplicemente potrebbero risentire meno dell’effetto della mutazione in PS2. Per verificare se effettivamente potesse esserci un difetto a livello dell’attività idrolitica dell’ATP sintasi, abbiamo provato a misurare indirettamente la velocità di idrolisi dell’ATP in mitocondri isolati da cervello di topi dei tre genotipi tramite l’ossidazione del NADH. Al momento, sembra che la velocità di idrolisi sia più veloce nei transgenici, anche se il numero di esperimenti non è ancora sufficiente per stabilire se tale differenza sia significativa o meno. Abbiamo inoltre verificato che bloccando la catena respiratoria o l’ATP sintasi, di fatto diminuendo la quota di ATP prodotto dai mitocondri, i neuroni WT, PS2 e PS2APP sono ugualmente in grado di regolare il calcio citosolico. Questo suggerisce che in queste condizioni sperimentali i neuroni sono in grado di sopperire alla riduzione dell'ATP e che probabilmente per evidenziare delle differenze tra i genotipi bisognerebbe utilizzare uno stimolo più forte o prolungato. Un altro parametro verificato è la produzione di ROS, che in condizioni basali è molto basso e che sembra essere simile tra i genotipi. Dati i risultati ottenuti fino ad adesso, sarebbe interessante studiare nel dettaglio l’attività dell’ATP sintasi che potrebbe essere alterata nei modelli transgenici e soprattutto potrebbe essere interessante studiare le interazioni metaboliche tra i mitocondri e il resto della cellula.

In questa tesi di dottorato, viene presentata, per la prima volta, una caratterizzazione a livello molecolare del dominio C-terminale della proteina umana OSCP in soluzione, tramite l’impiego sinergico di diverse tecniche strutturali avanzate come l’NMR, il Bio-SAXS e l’ITC. Successivamente, grazie alle informazioni raccolte anche per il dominio umano N-terminale, è stato possibile porre le basi per una prima indagine biofisica dell’intera subunità in soluzione, comprendendone nuove ed inaspettate proprietà strutturali che aiuteranno a fare luce sugli emergenti ruoli terapeutici di OSCP, anche in qualità di subunità regolatrice del m-PTP. Le nuove informazioni raccolte su OSCP hanno poi permesso di effettuare i primi studi a livello molecolare su due processi di interazione proteina-proteina connessi con la regolazione del m-PTP e con le patologie cellulari ad esso correlate. Il primo riguarda un nuovo legame fra OSCP e la prima isoforma dell’inibitore mitocondriale dell’ATP sintasi IF1-1, ad oggi noto solamente per l’azione inibitrice dell’attività idrolasica del complesso V in condizioni ipossiche, attraverso il legame con la porzione catalitica F1. La nuova interazione tra OSCP e IF1-1 è stata trovata in alcuni modelli cellulari tumorali, nei quali l’inibitore risulta essere particolarmente sovra-espresso, in condizioni in cui l’enzima sintetizza ATP (fosforilazione ossidativa). Questo nuovo legame non influenza l’attività enzimatica dell’ATP sintasi ma inibisce l’apoptosi cellulare, nello specifico attraverso un silenziamento del m-PTP, aiutando così la cellula tumorale a raggiungere una condizione di apoptosi-resistenza e immortalità. Il secondo processo, invece, coinvolge la nota interazione fra OSCP e CypD, finora mai studiata a livello molecolare. La nostra indagine ha permesso di portare alla luce nuove, seppur preliminari, informazioni riguardo il meccanismo strutturale di questo legame proteina-proteina che resta, ad oggi, uno dei pochi processi molecolari riconosciuti dal mondo scientifico come direttamente coinvolto nell’apertura del m-PTP. Viene inoltre riportata la caratterizzazione strutturale dell’interazione fra la chinasi umana CK2α (subunità catalitica) e un nuovo poliossometallato a base di rutenio. Attraverso i risultati sperimentali ottenuti, è stato proposto un interessante meccanismo di inibizione dell’enzima, la cui attività catalitica è particolarmente importante per i meccanismi di proliferazione sfruttati delle cellule tumorali.
In this PhD work, it is provided the first characterization at a molecular level of the C-terminal domain of the human OSCP in solution, by a synergic use of different and advanced structural techniques as NMR, Bio-SAXS and ITC. Thanks to the information collected also for the human N-terminal domain, it has been possible to perform a preliminary investigation of the whole subunit in solution, understanding new and unexpected structural proprieties that will help to elucidate the emerging therapeutic roles of the OSCP, even as a regulatory subunit of the m-PTP. The new information about the OSCP allowed us to study for the first time two protein-protein interaction processes at a molecular level, which are involved in the m-PTP regulation and its related pathologies. The first one is the novel binding event between the OSCP and the first isoform of the ATPase inhibitor IF1-1 that is known for its inhibitory action against the complex V hydrolytic activity in anoxia, through the binding within the F1 catalytic module. The new interaction between the OSCP and IF1-1 was detected in some tumor cell models, where the inhibitor is overexpressed, during mitochondrial respiration and ATP synthesis (oxidative phosphorylation). This novel binding event does not affect the ATP synthase catalysis but it prevents the apoptosis, specifically through the m-PTP desensitization, helping in this way the cancer cell to achieve an apoptosis-resistant phenotype and immortality. The second binding process regards the well known interaction between the OSCP and CypD which has never been studied at a molecular level. Our investigation allowed to elucidate new, despite preliminary, aspects about the structural mechanisms of this protein-protein binding event that remains, nowadays, one of the few molecular processes accepted form the scientific community as directly involved into the m-PTP sensitization. It is also reported, as a side project, the structural characterization of the interaction between human protein kinase CK2α (catalytic subunit) and a novel ruthenium-based polyoxometalate, which provides an interesting inhibition mechanism against the cancer-related CK2, at a molecular level.

La Teoria della Mente (ToM) capacità di rappresentarsi gli stati mentali propri e altrui e di farvi riferimento per prevedere e spiegare il comportamento proprio e altrui riveste un ruolo fondamentale nelle interazioni sociali per un efficace adattamento all'ambiente. Dopo essere stata a lungo indagata in età evolutiva, recentemente la ricerca sulla ToM ha effettuato uno shifting verso fasi successive del ciclo di vita (età adulta ed età anziana) aprendo un nuovo filone di studio in prospettiva life-span. Oggetto della presente tesi di dottorato è lo studio della ToM in prospettiva life-span con tre obiettivi: (1) studiare l'evoluzione della ToM in età adulta e le sue possibile relazioni con la capacità di decision-making, anch'essa dall'alto valore adattivo; (2) studiare la possibile involuzione della ToM in età anziana in condizioni di normalità e di patologia (mild-Alzheimer's disease); (3) indagare i correlati neurali della ToM con metodiche di neuroimaging (fMRI) in soggetti adulti, anziani sani e anziani clinici (Mild Cognitive Impairment, MCI). Le tre ricerche empiriche condotte nella presente tesi di dottorato hanno consentito di rilevare rispettivamente che: (1) la ToM è altamente implicata nei processi di decision-making in età adulta; (2) la ToM subisce una involuzione nei soggetti anziani clinici sin dai livelli più semplici di tale abilità; (3) i circuiti neurali della ToM inizierebbero a mostrare una parziale deattivazione in soggetti anziani clinici rispetto a soggetti di controllo anziani e adulti.
Theory of Mind (ToM) the ability to meta-represent self and others' mental states and to refer to them to foresee and explain the behaviour plays a crucial role in social interactions to provide a successful adaptation to the environment. After being extensively studied in developmental psychology, the research on ToM has recently undergone a shifting towards other life-ages (adulthood and elderly) thus opening a new field if research in a life-span perspective. The object of this PhD thesis is to study of ToM in a life-span perspective with three goals: (1) to study ToM evolution in adult age and to discover its possible relations with the ability of decision-making, which has a major adaptive role as well; (2) to study the possible decay of ToM in old age in normal and clinical conditions (mild-Alzheimer's disease); (3) to study the neural circuits of ToM with neuroimaging methods (fMRI) in adults, healthy old subjects and clinical old subjects (Mild Cognitive Impairment, MCI). The three empiric researches carried on for this PhD thesis provided the following major findings: (1) ToM is highly involved in decision-making processes in adult age; (2) ToM undergoes a decay in clinical old subjects with onset from very simple levels of this ability; (3) ToM neural circuits seem to show a partial deactivation in clinical old subjects and not in healthy old and adult controls.

La Teoria della Mente (ToM) capacità di rappresentarsi gli stati mentali propri e altrui e di farvi riferimento per prevedere e spiegare il comportamento proprio e altrui riveste un ruolo fondamentale nelle interazioni sociali per un efficace adattamento all'ambiente. Dopo essere stata a lungo indagata in età evolutiva, recentemente la ricerca sulla ToM ha effettuato uno shifting verso fasi successive del ciclo di vita (età adulta ed età anziana) aprendo un nuovo filone di studio in prospettiva life-span. Oggetto della presente tesi di dottorato è lo studio della ToM in prospettiva life-span con tre obiettivi: (1) studiare l'evoluzione della ToM in età adulta e le sue possibile relazioni con la capacità di decision-making, anch'essa dall'alto valore adattivo; (2) studiare la possibile involuzione della ToM in età anziana in condizioni di normalità e di patologia (mild-Alzheimer's disease); (3) indagare i correlati neurali della ToM con metodiche di neuroimaging (fMRI) in soggetti adulti, anziani sani e anziani clinici (Mild Cognitive Impairment, MCI). Le tre ricerche empiriche condotte nella presente tesi di dottorato hanno consentito di rilevare rispettivamente che: (1) la ToM è altamente implicata nei processi di decision-making in età adulta; (2) la ToM subisce una involuzione nei soggetti anziani clinici sin dai livelli più semplici di tale abilità; (3) i circuiti neurali della ToM inizierebbero a mostrare una parziale deattivazione in soggetti anziani clinici rispetto a soggetti di controllo anziani e adulti.
Theory of Mind (ToM) the ability to meta-represent self and others' mental states and to refer to them to foresee and explain the behaviour plays a crucial role in social interactions to provide a successful adaptation to the environment. After being extensively studied in developmental psychology, the research on ToM has recently undergone a shifting towards other life-ages (adulthood and elderly) thus opening a new field if research in a life-span perspective. The object of this PhD thesis is to study of ToM in a life-span perspective with three goals: (1) to study ToM evolution in adult age and to discover its possible relations with the ability of decision-making, which has a major adaptive role as well; (2) to study the possible decay of ToM in old age in normal and clinical conditions (mild-Alzheimer's disease); (3) to study the neural circuits of ToM with neuroimaging methods (fMRI) in adults, healthy old subjects and clinical old subjects (Mild Cognitive Impairment, MCI). The three empiric researches carried on for this PhD thesis provided the following major findings: (1) ToM is highly involved in decision-making processes in adult age; (2) ToM undergoes a decay in clinical old subjects with onset from very simple levels of this ability; (3) ToM neural circuits seem to show a partial deactivation in clinical old subjects and not in healthy old and adult controls.

Secondo le stime sulla salute globale pubblicate dall’OMS nel 2019 le demenze costituiscono la settima causa di morte nel mondo. Il progressivo aumento dell’aspettativa di vita produrrà un drammatico incremento della prevalenza e dell’incidenza di questa patologia. Ad oggi le persone affette da demenza sono 50 milioni, ma si stima che nel 2050 questo numero venga triplicato. La forma di demenza più diffusa è la malattia di Alzheimer (AD). Il successo nel trattamento dell'AD dipende dal monitoraggio della progressione della malattia nel paziente, pertanto risulta fondamentale riuscire a diagnosticare la patologia il prima possibile. In questo elaborato è stato presentato un approccio microfluidico, recentemente realizzato da Kasturi et al, per la diagnosi precoce dell’AD basato su biomarcatori, ovvero caratteristiche misurabili che riflettono la presenza o l’aggravarsi di una patologia. I biomarcatori istopatologici caratteristici dell’Alzheimer sono la proteina β-amiloide (1-42) e la proteina tau iperfosforilata. Queste proteine possono essere rilevate nel liquido cerebrospinale da 10 a 20 anni prima che i sintomi clinici siano evidenti e pertanto permettono di effettuare una diagnosi precoce di AD. Il lab-on-a-chip realizzato da Kasturi et al. è un dispositivo microfluido integrato con valvole in grado di controllare il flusso dei fluidi all’interno dei microcanali e un biosensore elettrochimico costituito da tre microelettrodi in grado di rilevare la proteina Aβ-42.

In the present study metal ions role in neurodegenerative processes has been investigated. Two major pathways have been developed: 1) metal ions role in β-amyloid (Aβ folding and deposition from in vitro to in vivo; 2) calcium dyshomeostasis in an in vitro model of neurodegeneration. Firstly, metal ions role (aluminum, copper, iron, zinc) in Aβ folding and deposition was assessed. Aβ misfolding is, in fact, believed to play a critical role in Alzheimer’s disease pathogenesis. Our data confirm that Aβ folding is closely related to the conjugated metal ion, thereby following peculiar metal ion-dependent conformational changes. Strikingly, we report that aluminum, a non physiological metal ion, is the most efficient in “freezing” Aβ in its oligomeric and most toxic state. Within this framework we investigated the mechanisms underlying Aβ and Aβ-metal conjugates toxicity. To that aim we employed two natural compounds (resveratrol and cholesterol) acting on two different Aβ mechanisms of toxicity: oxidative stress and membrane damage, respectively. In both cases, in vitro analysis revealed that resveratrol and cholesterol do not influence Aβ and Aβ-metal conjugates folding processes, but are still effective in protecting a neuronal-like cell line against Aβ toxicity. We reported that resveratrol was able to significantly reduce the Aβ-triggered generation of reactive oxygen species, meanwhile physiological concentrations of cholesterol were effective in protecting cellular membrane structure against Aβ (especially Aβ-Al) lipid disrupting activity. To further assess that differently shaped Aβ-metal conjugates result in different biological responses, we investigated Aβ-Cu and Aβ-Zn role in influencing/altering gene expression profile in a neuronal-like cell line. We found that these two conjugates are effective in modulating expression of transcripts involved in inflammatory processes, oxidative stress, and in apoptotic cell death. Following these in vitro studies we decided to investigate whether expression of transcripts involved in metal ions homeostasis resulted affected in an in vivo model of the disease, represented by the 3xTg-AD mice. Our data highlight a significant overlapping between the expression profiles of young 3xTg-AD mice compared with aged wild type mice; this finding support the notion that Alzheimer’s disease can be interpreted as a boosted variant of otherwise naturally occurring age-driven changes. In our dataset we found several differentially expressed transcripts involved in calcium homeostasis, a key metal ion for the physiology of the cell. Secondly, calcium dyshomeostasis in striatal neurons following excitotoxic challenge was assessed. Striatal neurons degeneration is involved in several pathologies showing motor and behavioral sequelae, such as Huntington’s disease (HD). We tried to determine why a subpopulation of striatal neurons results spared in HD striata, showing a peculiar resistance towards excitotoxic challenges. Our data demonstrate that the striking resistance of these cells may be due to boosted scavenging capabilities embedded in such neuronal subpopulation, resulting in lack of ROS generation upon excitotoxic insults. Collectively, these findings highlight the pivotal role played by metal ions in the development of neurodegenerative disorders. Noteworthy, not only endogenous and biologically relevant metal ions (iron, copper, zinc and calcium) seem involved in the pathogenesis of neurodegenerative disorders, but also exogenous metals (i.e.: aluminum) could have a key and subtle, although less investigated, role in neuronal degeneration
Il presente lavoro di tesi si è suddiviso in due filoni principali che hanno come filo conduttore la disomeostasi di ioni metallici nei processi neurodegenerativi. La prima parte riporta lo studio sul ruolo di alcuni ioni metallici (alluminio, ferro, rame e zinco) nel processo di folding della proteina β-amiloide (Aβ), ritenuta uno dei fattori eziopatogenici del morbo di Alzheimer. I dati ottenuti dimostrano come i complessi Aβ-metallo-ione acquistino una peculiare conformazione dipendente dal metallo legato, conferendo così all’Aβ particolari proprietà citotossiche. Tale citotossicità risulta particolarmente evidente per il complesso Aβ-Al che è in grado di aumentare, in maniera significativa, la tossicità data dalla sola Aβ o dalla stessa Aβ coniugata con metalli diversi dall’Al. All’interno di questo quadro sperimentale si è poi cercato di indagare più nel dettaglio i meccanismi con i quali Aβ, e i suoi complessi metallici, esercitassero la loro citotossicità. A questo scopo sono stati impiegati due composti quali il resveratrolo e il colesterolo, che vanno ad agire su due meccanismi che stanno alla base della tossicità dell’Aβ, come lo stress ossidativo e l’alterata fluidità delle membrane cellulari. Nel primo caso, i dati in vitro hanno permesso di dimostrare come, agendo in maniera selettiva sulla produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) Aβ-mediata, sia possibile ridurre la tossicità di Aβ e dei suoi complessi con metalli redox (rame e ferro) mediante un meccanismo di scavenging dei ROS ad opera del resveratrolo, dalle spiccate proprietà anti-ossidanti e neuro-protettive. A questo punto si è indagata la capacità dei vari complessi Aβ-metalloioni di alterare la struttura di membrane lipidiche attraverso l’uso di modelli di membrane cellulari. In precedenza si era dimostrato come il complesso Aβ-Al fosse l’unico complesso in grado di alterare significativamente la fluidità di layer lipidici. I dati ottenuti ci permettono di affermare che tale capacità è dovuta principalmente alla elevata idrofobicità superficiale del complesso Aβ-Al. Inoltre, agendo sulle membrane cellulari con concentrazioni fisiologiche di colesterolo è stato possibile ridurre l’”irrigidimento” delle membrane (lipidico) conseguente alla presenza di Aβ-Al, e ridurne la citotossicità. Si é quindi approfondito il ruolo geno-tossico dei succitati complessi Aβ-metalloioni andando ad indagare come questi siano in grado di modulare in maniera significativa (e metallo-dipendente) l’espressione genica di numerosi trascritti coinvolti nella patologia di Alzheimer. In particolare, il nostro interesse si è focalizzato sui complessi Aβ-Cu e Aβ-Zn, che si sono rivelati in grado di modulare selettivamente l’espressione di geni coinvolti in processi infiammatori, nello stress ossidativo e nella morte cellulare (apoptosi). Dopo questa serie di studi in vitro si è passati ad indagare l’espressione genica dell’intero genoma umano in un modello in vivo di patologia di Alzheimer. Lo scopo era quello di identificare il network o il pathway d’espressione coinvolti della disomeostasi cationica. I profili d’espressione del modello murino 3xTg-AD sono stati pertanto confrontati con quelli del controllo wild type. In questo contesto, si è scoperta una significativa sovrapposizione dei geni sovra- e sotto-espressi tra topi wild type anziani e topi 3xTg-AD giovani. Questo dato supporta l’idea che il substrato patologico dell’AD possa favorire un processo di invecchiamento precoce. All’interno del gruppo di geni trovati differenzialmente espressi, molti erano coinvolti nell’omeostasi del calcio, ione chiave per la fisiopatologia cellulare. Il secondo filone di ricerca ha riguardato lo studio del ruolo dello ione calcio nell’eccitotossicità dei neuroni dello striato. Tale fenomeno è particolarmente importante in alcune patologie neurodegenerative che hanno come segno caratteristico una progressiva e irreversibile perdita del controllo motorio, come ad esempio il morbo di Huntington. L’interesse si è focalizzato nel determinare il perchè una subpopolazione di neuroni striatali, caratterizzata dalla sovraespressione di nitrico-ossidosintasi, non vada incontro ad apoptosi in seguito a stress eccitotossico. I dati raccolti ci hanno permesso di stabilire che la resistenza di tale sottopopolazione al sovraccarico di calcio è dovuta principalmente ad una potenziata capacità di questi neuroni di detossificarsi rapidamente dalle specie ROS, di origine mitocondriale, specie che si generano durante fenomeni eccitotossici. Conclusione. Nel complesso i dati ottenuti sottolineano una volta di più un ruolo centrale degli ioni metallici nello sviluppo e/o nella progressione di alcune patologie a carattere neurodegenerativo. In particolare è importante notare come, a fianco di alcuni ioni metallici endogeni - che hanno un rilevante ruolo fisiologico (ferro, rame, zinco, calcio) -, anche altri ioni privi (apparentemente) di un ruolo biologico, ma coi quali ci interfacciamo quotidianamente, come ad esempio l’alluminio, sembrino svolgere un ruolo chiave in processi eziopatogenetici legati a fenomeni neurodegenerativi

Questo lavoro ha avuto come obiettivo quello di indagare, tramite lo studio di articoli della letteratura, il ruolo funzionale che riveste il ritmo cerebrale alpha (8-13 Hz) nei processi cognitivi quali attenzione, memoria ed elaborazione di emozioni, ed analizzare come anomalie nell’attività di questo ritmo possano essere associate a diverse patologie neurologiche. Il ritmo alpha sembra avere un ruolo inibitorio: la sincronizzazione delle oscillazioni (ERS) in questo range di frequenze equivale ad una diminuzione dell’attivazione corticale, mentre una desincronizzazione delle oscillazioni (ERD) corrisponde ad una maggiore attivazione corticale. Nello svolgimento di task attentivi e mnemonici, una buona performance è legata alla presenza di ERD in banda alpha nelle regioni corticali rilevanti per il compito, mentre si ha ERS nelle regioni non rilevanti e potenzialmente interferenti, in modo da bloccare l’elaborazione e l’afflusso di informazioni distraenti. In aggiunta, l’asimmetria frontale alpha (FAA) è un parametro analizzato nello studio dell’elaborazione delle emozioni, in quanto uno sbilanciamento nell’attivazione dei due emisferi è responsabile delle differenze interindividuali nella reazione a stimoli emotivi, essendo la corteccia prefrontale sinistra più coinvolta nell’elaborazione di stimoli positivi mentre la destra di stimoli negativi. Anomalie nel ritmo alpha si ritrovano in diverse malattie neurologiche; questo elaborato tratta del disturbo depressivo maggiore, disturbo bipolare e morbo di Alzheimer. Il disturbo depressivo comporta un’attività maggiore in banda alpha nella corteccia frontale sinistra rispetto alla destra, mentre nella zona posteriore si riscontra un’asimmetria opposta. Nel caso del disturbo bipolare poi, i pazienti hanno una notevole riduzione di potenza alpha rispetto a soggetti sani. Infine, individui affetti da morbo di Alzheimer mostrano un decremento dell’attività in banda alpha, insieme ad una diminuzione della coerenza.

Secondo un recente rapporto dell’Organizzazione Mondiale della Sanità un miliardo di persone, distribuite in tutto il mondo, vive con una malattia neurologica, con 50 milioni di casi di epilessia e 24 milioni di casi di demenza questi ultimi destinati ad aumentare fino a 114 milioni nel 2050, soprattutto per quanto riguarda la malattia di Alzheimer (AD) e la demenza vascolare (VD) che rappresentano le due forme principali, giustificando la prima il 50% e la seconda circa il 20% di tutte le cause di demenza. Nello scenario preoccupante di questa grossa diffusione si inserisce la difficoltà di una diagnosi precoce la quale avrebbe indubbi vantaggi per assicurare interventi tempestivi. Nella fase iniziale è difficile distinguere i sintomi della demenza da un normale invecchiamento, nonché distinguere AD,VD e depressione in quanti i sintomi iniziali sono molto simili. Gli attuali criteri per la diagnosi di AD e VD fanno riferimento ad alcune linee guida e seguono un iter diagnostico basato su test neuropsicologici e test di neuroimaging che però non sono sufficienti per una diagnosi precoce. Si cerca infatti di individuare marker diagnostici correlati al danno cerebrale che avviene in queste patologie, ossia la morte neuronale. Tra i possibili marker, sta suscitando particolare interesse il 24S-idrossicolestrolo, un ossisterolo, principale metabolita del colesterolo a livello del SNC che passando attraverso la barriera ematoencefalica si immette nella circolazione sistemica. Essendo il 24S-idrossicolesterolo di sola origine cerebrale, una sua variazione di concentrazione nel sangue di pazienti patologici rispetto ai normali riflette un’alterata omeostasi del colesterolo a livello del sistema nervoso centrale come conseguenza del danno neurologico. Scopo di questo lavoro è stato quindi quello di sviluppare e validare un metodo analitico in LC-MS/MS per il dosaggio del 24S-idrossi nel siero con successiva applicazione all’analisi di campioni controllo e patologici e precisamente di 20 pazienti affetti da Alzheimer ad insorgenza tardiva (LOAD), 20 pazienti affetti da VD e 20 pazienti con Mild Cognitive Impariment (MCI), uno stadio preclinico di demenza. I risultati mostrano una diminuzione significativa dei valori medi di 24S-idrossicolesterolo nei pazienti con AD e VD rispetto ai controlli, mentre un aumento nei pazienti con MCI. Una differenza poco significativa è stata evidenziata tra pazienti AD e LOAD.
According to a recent WHO report, there is 1 billion of people spread all over the world, living with a neurological diseases, in particular 50 million of cases of epilepsy and 24 cases of dementia, that will increase to 114 million within the 2050, especially for Alzheimer’s disease (AD) and vascular dementia (VD), the two main forms of dementia. Alzheimer’s disease represents 50% and vascular dementia 20% of all dementia cases. In the worrying scenario of this wide diffusion there is also a difficulty of early diagnosis that could have got clear advantages to ensure timely intervention. In the early stage is difficult to distinguish symptoms of dementia from a normal ageing as well to distinguish AD from VD and depression. The current standards for dementia diagnosis refer to some guidelines and follow a diagnostic procedure based on neuropsychological and neuroimaging tests that are however not sufficient for early diagnosis. Try to find diagnostic markers linked to brain damage that happens in this kind of pathologies, that is neuronal death. Between the possible markers, it is of great interest 24s-Hydroxycholesterol, oxysterol, the main cholesterol metabolites in the CNS that goes into systemic circulation through the haematoencephalic barrier. The simple variation of concentration of 24S- Hydroxycholesterol, produced only by the brain, in the blood of pathologic patients compared to healthy people entail an altered cholesterol homeostasis in CNS as a consequence of brain damage. The main purpose of this work is to develop and support an analytic method in LC-MS/MS for the serum 24S- Hydroxycholesterol dosage with following application to the analysis of control and pathologic samples (20 persons suffering from late beginning Alzheimer’s disease, 20 persons suffering from VD and 20 persons with MCI, a preclinical dementia stage). The results prove a significant fall in 24S- Hydroxycholesterol average values between people suffering from AD and VD compared to controls, and an increase between sufferers from MCI. A negligible difference has been picked out between AD and LOAD patients.

I disturbi del sonno rappresentano una manifestazione clinica tipica di gran parte delle malattie neurodegenerative. Insonnia, ipersonnia, parasonnie, perdita di specifiche fasi del sonno e disorganizzazione del ciclo veglia-sonno sono alcune delle manifestazioni che caratterizzano le sinucleinopatie, le prionopatie e le taupatie. Recenti evidenze hanno rilevato che in molti casi i disturbi del sonno possono precedere l’insorgenza del quadro sintomatico tipico di queste patologie. In particolare, è stato osservato che la presenza di RBD (disturbo del comportamento durante il sonno REM) nella sua forma idiopatica (iRBD) sembra costituire un fattore predittivo per l’insorgenza di una futura sinucleinopatia. L’utilizzo di modelli animali è uno degli strumenti più utilizzati in campo biomedico per lo studio della patologia umana e lo sviluppo di nuovi metodi più efficaci per la diagnosi e il trattamento di malattie sia umane che animali. Scopo di questa tesi è stato quello di verificare se le alterazioni del sonno fossero presenti anche in modelli murini di alcune malattie neurodegenerative con diversa eziologia. Tra queste abbiamo preso in considerazione l’Insonnia Fatale Familiare (FFI), la malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD) e la malattia di Alzheimer (AD). In seconda istanza, la disponibilità di un modello murino a diversi stadi evolutivi, ha permesso di indagare l’ipotesi di una precoce insorgenza dei disturbi del sonno nella malattia di Creutzfeldt-Jakob. A questo scopo è stato registrato poligraficamente e analizzato il ciclo veglia-sonno in modelli murini delle tre patologie sopra citate. Nel primo esperimento è stato analizzato il ciclo veglia-sonno di topi transgenici che esprimevano l’omologo murino della mutazione (D178N/M129) al gene Prnp che codifica per la proteina prionica (PrP). Questa mutazione nell’uomo è associata a insonnia fatale familiare. Il ciclo veglia-sonno di questi animali è stato confrontato con due ceppi di topi di controllo: i) topi wild type (C57BL/6J) e ii) topi knock-out per la PrP. Nel secondo esperimento sono state analizzate le caratteristiche del sonno in topi transgenici recanti l’omologo murino della mutazione (D178N/V129) al gene Prnp, che nell’uomo porta a una forma familiare di Creutzfeldt-Jakob (CJD178). Il ciclo veglia-sonno di questi topi è stato confrontato con i ceppi di controllo già descritti per il primo esperimento. Ciascun ceppo di topi, inoltre, è stato analizzato a tre diverse età: 6, 12 e 18 mesi che rappresentano stadi evolutivi diversi (rispettivamente: giovani, adulti e anziani); questo al fine di valutare l’evoluzione delle alterazioni del sonno e la loro effettiva insorgenza. Nel terzo esperimento è stato preso in considerazione un modello, in acuto, di malattia di Alzheimer (AD). Il ciclo veglia-sonno di topi C57BL/6J è stato analizzato in seguito a somministrazione intracerebroventricolare (ICV), in acuto, di oligomeri sintetici di β-amiloide (A-β1-42). Questi sono i costituenti delle placche amiloidi riscontrate in pazienti affetti da AD. La somministrazione veniva eseguita all’inizio della fase di luce del ciclo luce-buio. In seguito, il ciclo veglia-sonno era registrato poligraficamente per le successive 24 ore in condizioni normali di laboratorio. Questa condizione è stata confrontata con il ciclo veglia-sonno degli stessi topi (disegno within) in seguito a somministrazione di due trattamenti di controllo: i) un veicolo (tampone fosfato salino, PBS) e ii) i monomeri sintetici di β-amiloide. In tutti e tre i modelli murini considerati si sono osservate marcate alterazioni del ciclo veglia-sonno, nei termini di una riduzione del sonno REM. La perdita di questa fase era essenzialmente dovuta a una diminuzione del numero dei suoi episodi. I modelli murini delle tre malattie neurodegenerative mostravano, infatti, una certa difficoltà nell’iniziare un episodio di sonno REM. La decurtazione di sonno REM era accompagnata, anche, da una riduzione del potere spettrale della banda theta durante gli episodi di sonno REM. L’analisi dei tracciati elettroencefalografici (EEG) ha, inoltre, messo in evidenza la presenza di attività EEG anomala, consistente in complessi polifasici di ampio voltaggio e con un picco di frequenza attorno ai 7 Hz. Le registrazioni del modello murino di CJD a diversi stadi evolutivi hanno evidenziato che le alterazioni del sonno in questo modello si presentano già a 12 mesi di età, ancora prima dell’insorgenza dei sintomi tipici della patologia. Le alterazioni del sonno sono, quindi, presenti anche in modelli murini di alcune malattie neurodegenerative, incluse quelle in cui il disturbo del sonno non rappresenta il sintomo principale. Nel modello murino di CJD, inoltre, l’alterazione del normale ciclo veglia-sonno sembra precedere la manifestazione del quadro sintomatico tipico della patologia. Questi dati suggeriscono una stretta relazione tra alterazioni del ciclo veglia-sonno e malattie neurodegenerative. Per questo motivo, in campo clinico e diagnostico, sarebbe opportuno porre una maggiore attenzione ai disturbi del sonno. Questi sembrano essere, infatti, parte integrante di molte malattie contraddistinte da degenerazione neuronale. L’alterazione del normale ciclo veglia-sonno potrebbe avere, inoltre, un valore predittivo per alcune delle patologie neurodegenerative o comunque essere un valido aiuto nel processo diagnostico. In futuro, il miglioramento della qualità del sonno e/o la normalizzazione del ciclo veglia-sonno potrebbero essere validi strumenti al fine di prevenire la neurodegenerazione e l’insorgenza di alcune malattie neurodegenerative, o almeno rappresentare un approccio palliativo in corso di malattia.
Sleep disturbances represent an important clinical feature in different neurodegenerative disorders. Insomnia, hypersomnia, parasomnia, loss of specific sleep stages and alterations in circadian rhythms characterize synucleinopathies, prionpathies and tauopathies. Recent evidences highlight that, in many instances, sleep alterations could disclose the onset of a neurodegenerative disorder. In particular, it has been shown that the idiopathic form of the REM sleep Behavior Disorder (iRBD) could be a prognostic factor for the development of a future synucleinopathy. The use of animal models is very common in biomedical research and is essential to develop new and more effective methods for diagnosis and treating disease that affecting both humans and animals. The first aim of this thesis is to verify if murine models of neurodegenerative disorders with different aetiology show sleep alterations similar to those observed in humans. Secondly, the availability of a murine model at different stages of the disease’s course allowed us to investigate whether the sleep alterations precede (or not) the development of other features of the disease. To this purpose, the sleep-wake cycle was poligraphically recorded and analyzed in the murine models of three neurodegenerative disorders: i) Fatal Familial Insomnia (FFI), ii) Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) and iii) Alzheimer’s disease (AD). In the first experiment we analyzed the sleep-wake cycle of transgenic mice expressing the murine homolog of the D178N/M129 human mutation at the Prnp gene, encoding for prion protein (PrP). This kind of mutation is associated in human with FFI. We compared the sleep-wake cycle of these animals with two control mice strains: i) wild-type mice (C57BL/6J, WT mice) and ii) PrP knock-out mice (KO mice). In the second experiment we analyzed the sleep-wake cycle in mice expressing the murine homolog of the D178N/V129 human mutation, associated with a familial form of Creutzfeldt-Jakob disease (CJD178). We compared the sleep of these mice with WT and KO mice. In order to evaluate the course of sleep alterations and their onset, each mice strain was recorded at three different ages: 6, 12 and 18 months of age. At these ages animals can be considered as young, adult and old, respectively. In the third experiment, we considered an acute mice model of Alzheimer’s disease (AD). C57BL/6J mice were intracerebroventricularly injected with three different solutions: i) synthetic oligomers of amyloid-β (A-β1-42); ii) phosphate buffer saline, PBS (vehicle); iii) synthetic monomers of amyloid-β (A-β1-42). A-β1-42 oligomers are the main elements of A-β plaques, observed in AD patients. The other two solutions were administered as control condition. All mice received all the three injections (within design) at the light onset. Hereafter, the sleep-wake cycle was polygraphically recorded during the next 24 hours in baseline conditions. We compared the sleep-wake cycle of mice following the injection of A-β1-42 oligomers with that followed the administration of the control conditions. In all three experiments the murine models showed marked sleep-wake alterations, in particular a reduction of the amount of REM sleep. The loss of REM sleep was due to a reduction of the number of REM sleep bouts. In other words, the murine models showed a difficulty in entering REM sleep. The reduction of the time spent in REM sleep was combined with a decrease of EEG theta power during REM sleep bouts. Moreover, the EEG activity of murine models was characterized by bursts of polyphasic complexes, peaking at around 7 Hz. At last, analyses of the murine model of CJD at different ages revealed that sleep alterations were already present at 12 months of age, before any other evidence of clinical signs. As well as in humans, sleep alterations are have been described in animal models of neurodegenerative disorders, including those in which sleep disturbance is not considered a main feature. Moreover, in the murine model of CJD, the alteration of the normal sleep-wake cycle seems to precede the onset of other clinical signs of the disease. These data suggest the existence of a relationship between sleep-wake cycle alterations and some neurodegenerative disorders and suggest to pay more attention to sleep disturbances, in clinic and diagnostic field. Sleep alterations seem to represent an important feature of numerous neurodegenerative disorders and could be considered a prognostic factor for the evolution of these disorders and something to be taken into account in the evaluation of the clinical picture. In the future, it would be useful considering the enhancement of sleep quality and/or the normalization of sleep-wake cycle as a new tool to prevent the evolution of neurodegeneration and the onset of several neurodegenerative disorder, or at least represent a palliative care in course of the disorders.

Introducción: La exploración neuropsicológica es esencial en el ámbito de las demencias y útil para realizar el diagnóstico diferencial con otros trastornos. Existe una creciente necesidad en la evaluación de la cognición en pacientes ancianos con datos normativos ajustados por edad y escolaridad. El objetivo de este trabajo es presentar la creación, validación y normalización de una nueva herramienta que permita la evaluación cognitiva en sujetos con riesgo de padecer demencia, llamada BNB-D. Método: Se ha administrado la BNB-D a 1680 sujetos control y 5800 pacientes entre 50 y 93 años de edad. Este estudio proporciona las propiedades psicométricas de esta nueva herramienta en la evaluación cognitiva. Resultados: La validez concurrente entre la BNB-D y el MMSE fue r=62 (Sig. P= 0,001), con el ADAS-Cog r= 0,814 (Sig. P= 0,001), con la R-BANS r= 0,846 (Sig. P= 0,001) y con el Test Barcelona r= 0,805 (Sig. P= 0,001). La consistencia interna mostró una Alfa de Cronbach de 0.687. El índice Kappa utilizado para determinar la fiabilidad inter-evaluador fue de K=0.92. La fiabilidad test-retest fue r= 0,91 (Sig. P= 0,001) por el Índice de Correlación Intraclase (ICC). El análisis de regresión lineal mostró un claro efecto de la edad y la escolaridad en la BNB-D (F del ANOVA de los modelos de regresión lineal con valores de significación de P inferiores a 0,05). Conclusiones: La BNB-D cumple los principios básicos de la psicometría clásica: validez y fiabilidad. Se normaliza la prueba con una amplia muestra, evitando los problemas de la conversión de puntuaciones directas mediante regresión lineal múltiple y se describen los principales perfiles cognitivos en demencias.
Background: Neuropsychological assessment is crucial in the field of dementia and useful for the differential diagnosis with other pathologies. There is an increasing need for standardized assessment of cognition in older patients with normative data adjusted for age and scholarship. The aim of this paper is to present the creation, validation and normalization of a new tool that allows for an evaluation of the cognitive status in subjects at risk of dementia called BNB-D. Methods: We tested BNB-D in 1680 control subjects and 5800 patients between 50 and 93 years of age. This paper reports the psychometric properties of this new tool in cognitive assessment. The effect on BNB-D by age and educational level was established using lineal regression model. Results: The concurrent validity between the BNB-D and MMSE was r= 0,62 (Sig. P= 0,001), with ADAS-Cog was r= 0,814 (Sig. P= 0,001), with R-BANS was r= 0,846 (Sig. P= 0,001) and with Barcelona Test was r= 0,805 (Sig. P= 0,001). Internal consistency showed a Cronbach Alpha of 0.687. The Kappa index used to determine Inter-rater reliability was of K=0.92. Test-retest reliability was r= 0,91 (Sig. P= 0,001) for Intraclass Correlation Index (ICC). Regression analysis showed clear effect on BNB-D by age and educational level (ANOVA F of regression models with P values less than 0,05). Conclusions: The BNB-D fulfills the basic principles of classic psychometrics of construct criterion, validity and reliability. Normalization is due with extended control avoiding the multiple regression direct scores conversion problems and it is described the principal cognitive profiles in dementia.

La malatia d'Alzheimer és freqüent en els éssers humans i extremadament infreqüent en altres mamífers. Per tant, alguns dels canvis que van tenir lloc durant l'evolució cerebral humana podrien tenir relació amb aquesta malaltia. Durant l'evolució cerebral humana s'han produït canvis heterocrònics, consistents en la retenció de caràctes juvenils en l'edat adulta, com una elevada plasticitat sinàptica, en algunes árees cerebrals (neotènia neuronal). Les lesions pròpies de la malaltia d'Alzheimer coincideixen amb les àrees en que s'ha produït una neotènia neuronal. Aquestes àrees es caracteritzen per un elevat turn-over sinàptic. Les proteïnes que formen part de la via de senyalització de la reelina intervenen en la plasticitat sinàptica. Hem trobat tres gens que participen en aquesta via que presenten polimorfismes de nucleòtid únic que poden augmentar o disminuir significativament el risc de presentar Alzheimer o deteriorament cognitiu lleu. Aquests genotips són RELN (rs 528528 i rs 2299356), PLK2 (rs 15009 i rs 702723) i CAMK2A (rs 3756577 i rs 3822606). Tres dels genotips trobats són a la regió promotora del gen. Això suggereix que en la malaltia d'Alzheimer podrien intervenir canvis epigenètics que alterin l'expressió de determinats gens relacionats amb la plasticitat sinàptica.
La enfermedad de Alzheimer es frecuente en los seres humanos y extremadamente infrecuente en otros mamíferos. Por lo tanto, algunos de los cambios ocurridos durante la evolución cerebral humana podrían tener relación con esta enfermedad. Durante la evolución cerebral humana se han producido cambios heterocrónicos, consistentes en la retención de caracteres juveniles en la edad adulta, como una elevada plasticidad sináptica, en algunas áreas cerebrales (neotenia neuronal). Las lesiones propias de la enfermedad de Alzheimer coinciden con las áreas en que se ha producido una neotenia neuronal. Dichas áreas se caracterizan por un elevado turn-over sináptico. Las proteínas que forman parte de la vía de señalización de la reelina intervienen en la plasticidad sináptica. Hemos encontrado tres genes que participan en dicha vía que presentan polimorfismos de nucleótido único que pueden aumentar o disminuir significativamente el riesgo de presentar Alzheimer o deterioro cognitivo leve. Dichos genotipos son RELN (rs 528528 y rs 2299356), PLK2 (rs 15009 y rs 702723) y CAMK2A (rs 3756577 y rs 3822606). Tres de los genotipos encontrados están en la región promotora del gen, lo que sugiere que en la enfermedad de Alzheimer podrían intervenir cambios epigenéticos que alteren la expresión de determinados genes relacionados con la plasticidad sináptica.
Alzheimer's disease is very common in the humans and extremely rare in other mammals. Therefore, some of the changes that have occurred during human brain evolution may be related with this disease. During the human brain evolution heterocronic changes have occurred, consisting in the retention of juvenile characters in adulthood, as a high synaptic plasticity in some brain areas (neuronal neoteniy). The characteristic lesions of Alzheimer's disease coincide with the areas in which there has been a neuronal neoteny. These areas are characterized by a high synaptic turn-over . The proteins that form part of the reelin signaling pathway are involved in the synaptic plasticity.We found three genes that participate in the reelin signaling pathway that present single nucleotide polymorphisms that may increase or decrease significantly the risk of presenting Alzheimer or mild cognitive impairment. These genotypes are RELN (*rs 528528 and *rs 2299356), PLK2 (*rs 15009 and *rs 702723) and CAMK2To (*rs 3756577 and *rs 3822606). Three of the genotypes are found in the promoter region of the gene, which suggests that in Alzheimer's disease could intervene epigenetic changes that alter the expression of certain genes related with the synaptic plasticity.

Recenti studi sulla progressione della malattia d’Alzheimer(AD)suggeriscono che la patologia possa essere trasmessa da un’area all’altra del cervello tramite diffusione locale o lungo le fibre assonali.Tuttavia,quest’ipotesi necessita di maggiori conferme ed è ancora meno chiaro se questi modelli possano essere applicabili alle varianti non amnesiche di AD(naAD),un gruppo di fenotipi AD caratterizzati da relativo risparmio all’esordio della memoria episodica e deficit cognitivi dominio-specifici.Pochi studi ad oggi hanno infatti analizzato la progressione longitudinale della malattia in naAD, tutti al massimo con due sole di queste varianti. Inizialmente abbiamo confrontato 240 RMN pesate in T1 da 129 pazienti AD con RMN di controlli sani per stabilire l’atrofia in 120 regioni di interesse(ROI); poi abbiamo calcolato modelli di progressione di malattia separatamente per ogni fenotipo: AD amnesici(aAD),variante logopenica di afasia primaria progressiva(lvPPA),atrofia corticale posteriore(PCA)e variante frontale di AD(fvAD).Tutti i pazienti avevano evidenza di patologia AD tramite dati autoptici o da liquor cefalorachidiano(CSF).I risultati dalla coorte di aAD sono stati utilizzati per determinare i parametri per l’algoritmo di assegnazione delle fasi,basato sull’associazione con lo staging di patologia di Braak. Per ogni variante AD,4 fasi di atrofia regionale sono state definite sulla base della frequenza decrescente di atrofia tra i soggetti.Abbiamo osservato pattern unici di atrofia cumulativa per ogni fenotipo.Le ROI di fase 1 nel nostro modello rappresentano l’origine anatomica di ogni fenotipo,inclusi: il lobo temporale mesiale(MTL)per il gruppo aAD(risparmiato negli altri gruppi),il lobo temporale sinistro nella lvPPA,la corteccia parieto-occipitale nella PCA,quella temporo-parietale per la CBS e le aree fronto-temporali per la fvAD.Successivamente abbiamo assegnato una fase ad ogni RMN dei pazienti in base alla somiglianza dei pattern di atrofia regionale con l’atrofia predetta per il fenotipo corrispondente ad ogni fase.Le fasi ROI erano correlate con parametri patologici disponibili,mentre le fasi RMN erano correlate con misure demografiche e cliniche. Dopodiché abbiamo deciso di studiare le modifiche nel tempo della sostanza grigia(GM)in una coorte di pazienti in parte sovrapposta a quella usata per lo studio trasversale,ad esclusione di CBS: 17 aAD,25 lvPPA,20 PCA e 12 fvAD,con 37 controlli abbinati.Abbiamo analizzato il volume della GM e le sue modifiche longitudinali nelle ROI di fase 1 dallo studio trasversale per naAD e l’MTL per aAD.Abbiamo anche studiato l’atrofia longitudinale al di fuori di queste aree tramite un’analisi accessoria all’intero cervello e abbiamo comparato i fenotipi tra loro. Abbiamo osservato pattern regionali unici di atrofia iniziale e diffusione longitudinale nella neocorteccia con tassi differenti in lvPPA,PCA e fvAD,che correlavano con i deficit cognitivi.La progressione di atrofia nel tempo ha coinvolto aree sia prossimali sia distanti dal sito d’esordio della malattia,suggerendo quindi più meccanismi di diffusione della patologia coinvolti; per quanto riguarda il secondo,in particolare,una misura di connettività strutturale prediceva la severità di atrofia longitudinale,corroborando quindi l’ipotesi delle vie lunghe.Nell’MTL,i pazienti naAD mostravano al basale meno atrofia dei pazienti aAD,ma i tassi longitudinali non erano diversi tra gruppi; il relativo risparmio dell’MTL in naAD potrebbe quindi essere dovuto a un esordio più tardivo della degenerazione nell’MTL rispetto all’aAD,considerando che l’età più avanzata era associata con atrofia in quest’area,indipendentemente dal gruppo. Il presente studio ha corroborato probabili aree di malattia precoce in naAD e mostrato che ogni fenotipo ha un diverso pattern di progressione di atrofia lungo la corteccia,fornendo anche dati importanti sulla trasmissione della patologia.
Recent studies of Alzheimer’s disease (AD) spread suggest that pathology may be transmitted from one brain area to another either via local diffusion or long-way transport via white matter pathways. However, this hypothesis requires more confirmations, and it’s even more unclear whether such models are applicable in non-amnestic AD (naAD), a group of AD phenotypes characterized by relative spared episodic memory at onset and domain-specific cognitive impairments. Few studies to date have in fact addressed the longitudinal spread of disease in naAD, and all of them considering no more than two variants. At first we compared 240 T1-weighted anatomical MRIs from 129 AD patients with elderly controls’ scans to assess atrophy in each of 120 regions-of-interest (ROIs); then we computed disease progression models separately for each phenotype: typical amnestic AD (aAD), logopenic variant primary progressive aphasia (lvPPA), posterior cortical atrophy (PCA), corticobasal syndrome (CBS), and frontal-variant AD (fvAD). All patients had autopsy or cerebrospinal fluid (CSF) evidence of AD pathology. Results from the amnestic cohort were used to determine appropriate parameters for the phase assignment algorithm, based on association with Braak pathology staging. For each AD variant, 4 phases of regional atrophy were defined based on decreasing frequency of atrophy across participants. We observed a unique distribution of accumulating atrophy for each phenotype. Phase 1 ROIs in our model represent the anatomical origin for each phenotype, including: medial temporal lobe (MTL) for the aAD group (spared in the other phenotypes), left lateral temporal lobe for lvPPA, occipito-parietal cortex for PCA, temporo-parietal cortex for CBS, and fronto-temporal cortex for fvAD. We subsequently assigned a phase to each patient MRI scan based on the similarity of regional atrophy patterns with atrophy predicted for the corresponding phenotype at each phase. ROI phases were strongly correlated with available pathological factors, while MRI phase was significantly correlated with demographic and clinical measures. Then we decided to investigate grey matter (GM) change over time in MRIs within a cohort of patients partly overlapping with the sample used for the cross-sectional study, with the exception of CBS patients (insufficient longitudinal data): 17 aAD, 25 lvPPA, 20 PCA, and 12 fvAD patients, compared to 37 matched controls. We analyzed GM volume and its longitudinal change in phase 1 ROIs from the cross-sectional study for naAD variants, and in MTL for aAD. We also investigated longitudinal atrophy outside these areas through an accessory whole-brain analysis, and we compared phenotypes between each other. We observed unique regional patterns of initial atrophy and longitudinal neocortical disease spread with different rates in lvPPA, PCA, and fvAD, which correlated with cognitive impairments. Atrophy spread over time included both proximal and distant regions from the hypothesized focus of disease onset, thus suggesting that multiple mechanisms of disease progression may have been involved; for what concerns the second mechanism, in particular, a measurement of structural connectivity predicted the severity of longitudinal atrophy, thus corroborating the hypothesis of long-distance fiber pathways. In MTL regions, naAD patients had less severe atrophy than aAD patients at baseline, but longitudinal rates did not differ between groups; MTL sparing in naAD may be due to later onset of MTL degeneration than in aAD, considering that older age was associated with atrophy in this area, independent of group. The current study corroborated probable areas of early disease for naAD and showed that each phenotype has a different pattern of atrophy progression across the cortex, providing also important data about pathology transmission.

Esta tesis profundiza en el conocimiento de las enfermedades neurodegenerativas y, concretamente, en la enfermedad de Alzheimer tanto en sus fases sintomáticas como en la etapa preclínica (antes de que se manifiesten los síntomas). Esto es posible a través del estudio de biomarcadores en líquido cefalorraquídeo, que reflejan in vivo los cambios que tienen lugar en el cerebro desde fases muy iniciales de la enfermedad y que son el hilo argumental de esta tesis doctoral. A modo de introducción, el capítulo 1 define el marco y el contexto general de esta tesis resumiendo el conocimiento acerca de la enfermedad de Alzheimer y los biomarcadores. En el capítulo 2 estudiamos la viabilidad de la punción lumbar, la incidencia de complicaciones relacionadas con esta técnica y los factores que se asocian con ellas con el fin de determinar el impacto de este procedimiento para el estudio de biomarcadores de líquido cefalorraquídeo en las enfermedades neurodegenerativas. En el capítulo 3, se analizan las diferencias patofisiológicas entre la enfermedad de Alzheimer esporádica y familiar. El estudio de biomarcadores en líquido cefalorraquídeo nos permite identificar in vivo algunas características que complementan la información sobre el procesamiento de la proteína precursora de amiloide obtenida en el estudio neuropatológico. En el capítulo 4 profundizamos en las diferencias en biomarcadores en líquido cefalorraquídeo entre distintas enfermedades neurodegenerativas que cursan con demencia en sus fases sintomáticas, y estudiamos la relación entre biomarcadores involucrados en distintos procesos fisiopatológicos. La extensión de este estudio a las fases preclínicas conforman el capítulo 5. Para ello, analizamos el mismo conjunto de biomarcadores en una extensa cohorte de participantes sin déficits cognitivos. El capítulo 6 analiza la relación entre uno estos biomarcadores, YKL-40, y el grosor cortical medido por resonancia magnética en las fases predemencia de la enfermedad de Alzheimer. Finalente, en el capítulo 7 se pone en perspectiva todo lo expuesto para argumentar las conclusiones finales y formular las futuras líneas de investigación derivadas de estos proyectos. En resumen, en esta tesis doctoral utilizamos los biomarcadores en líquido cefalorraquídeo para estudiar la enfermedad de Alzheimer des de un punto de vista traslacional en todas sus fases (clínica y preclínica), y para establecer relaciones entre diferentes procesos fisiopatológicos. Este tipo de abordaje es esencial para obtener herramientas de diagnóstico más precisas, profundizar en el conocimiento de los procesos que tienen lugar en fases iniciales de la enfermedad y, potencialmente, identificar nuevas dianas terapéuticas.
This thesis deepens in the knowledge of key aspects of neurodegenerative diseases, and more precisely in AD, both in symptomatic and preclinical stages. This is achieved through the study of CSF biomarkers that reflect in vivo the changes that take place in the brain very early in the disease process, and that are the central line of the thesis. As an introduction, Chapter 1 sets the framework and general context for this thesis by summarizing the current knowledge on the field of AD and biomarkers. In chapter 2, we assessed the feasibility of lumbar puncture, the incidence of complications and their associated factors so as to determine the impact of this procedure in the study of CSF biomarkers of AD. Chapter 3 analyzes the pathophysiological differences between sporadic and autosomal dominant AD. CSF biomarkers allowed us to identify in vivo some characteristics in the processing of the amyloid precursor protein that complement the information found in neuropathological studies. In chapter 4, we study the differences in CSF biomarkers between neurodegenerative diseases that cause dementia in their symptomatic stages. We chose markers related to different pathophysiological processes and studied their relationship. We extended this study to preclinical stages in chapter 5. For this aim, we analyzed the same set of biomarkers in a large cohort of cognitively normal participants. Chapter 6 studies the relationship between one of these biomarkers, YKL-40, and cortical thickness measured by MRI in predementia stages of AD. Lastly, in chapter 7 we provide a general discussion and formulate the concluding remarks and future perspectives. In summary, in this thesis we use CSF biomarkers to study AD from a translational perspective in both clinical and preclinical stages and to identify relationships between distinct pathophysiological pathways. This kind of approach is essential to stablish new accurate diagnostic tools, to learn about the processes in the early stages of the disease, and, potentially, to discover new therapeutic targets.

Prion diseases are perhaps the most mysterious and peculiar diseases in nature. These diseases do not rely on the general dogmas of modern biology, seen in other infectious diseases caused by conventional pathogens, such as viruses and bacteria. On the contrary, their infectious agent is an unconventional proteinaceous pathogen, termed prion, that lacks functional nucleic acids. Prion diseases are also known as Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs), since the diseases are transmissible from one host to another and manifest a spongiform appearance as result of the destruction of brain tissue during a long incubation period. Prion diseases include Creutzfeldt-Jakob disease in humans, bovine spongiform encephalopathy (BSE, “mad cow disease”) in ruminants, scrapie in sheep and goats and chronic wasting disease in deer and elks. As demonstrated in the BSE outbreak and its transmission to humans, the onset of diseases is not limited to a certain species but can be transmissible from one host species to another. Such a striking nature of prions has generated huge concerns in public health and attracted serious attention in the scientific communities. To date, the potential transmission of prions to human has not been alleviated and TSEs still have no reliable preclinical screening tests and effective treatments. This doctoral thesis deals widely with the prion diseases, from epidemiology to pathogenesis, from diagnosis to therapy and prevention. Moreover it describes in detail three experimental projects aimed to clarify different aspects of TSEs. In all of them wild-type mouse bioassays are used, as they are the gold standard for assessing the biological properties of prions. The goal of the first study was to assess the therapeutic and/or preventive activity on TSEs of the chronic administration of a new γ-secretase modulator. The second research investigated the ability to identify BSE in presence of scrapie. The third project was aimed to study the effects induced by chronic administration of lipid enriched/depleted specific diets on the pathogenesis of prion diseases.

Dottorato di Ricerca in Scienze ed Ingegneria dell'Ambiente, delle Costruzioni e dell'Energia. Ciclo XXIX
Starting from the particular female exposure to Alzheimer’s disease (AD), the aim of the study was to investigate gender differences in the onset and evolution. 1925 medical records of AD patients, diagnosed with NINCDS-ADRDA criteria, were digitalized in order to extrapolate data. The mean age of the sample was 71 years, 57 years for early onset patients and 75 years for late onset, with duration of the disease around 9 years. Data taken into account and differentiated for gender were: prevalence and onset of the disease; time elapsed between the onset and the first visit, the duration of follow-up and the duration of disease; the educational level, cardiovascular and metabolic risk factors. MMSE score was considered at T0 (first visit), T1 (2yrs>T0) and T2 (4yrs>T0). A checklist of symptoms and signs, extrapolated from the cognitive-behavioral anamnesis, was then analyzed. It was furthermore calculated the genotype frequency and the allele frequency on a sample of 912 patients. IBM SPSS 20 statistics software was used (significance was given by p <0.05). Results highlighted that women were more represented in the cohort (67.1%) and in the early onset group (81.6%, p=0.008). There was no gender differences in the time elapsed from symptoms onset to the first visit (4 years), in the follow-up period (4 years) and in the duration of disease (9 years). Women were more cognitively impaired at T0 with 15.9+5.9 MMSE score vs 17+6.5 male score, while men seemed to decline faster at T2, -3.85+4.66 vs -2.93+4.39. Women had a lower level of education 5.6 years vs 6.51 years of men (p=0.000) and presented a higher comorbidity: dysthyroidism (p=0.000), cholesterol (p=0.000) hypertension (p=0.000) and a higher incidence of depression (p=0.000) while men were more statistically represented for irritability (p=0.000). Signs extrapolated from the cognitive-behavioral anamnesis have revealed a higher percentage of man for language impairment (p=0.000), behavioral symptoms (p=0.009), apraxia (p=0.005), spatial disorientation (p=0.006) and calculus impairment (p=0.035). APOE results were not representative in terms of gender differences but confirmed a possible impact of the allele ε4 on cognitive decline. Results have outlined a female patient highly represented in the sample, less educated, with a worse cognitive impairment and more exposed to comorbidity. Men seemed to impair faster in the first 2 years from onset, presenting a more aggressive picture. Furthermore, the diagnosis of the disease for the entire cohort delays of 3 years compared to the international and national mean of time elapsed from onset to first visit, which is about only 1 year The particular exposure of women to dementia and the different evolutionary impact of neurodegenerative diseases, from a gender point of view, still require ample studies and in-depth observations. In particular, the identification of specific gender aspects may be a valuable aid for a more timely identification of diseases and their better management.
Università della Calabria.

Improved methods for early diagnosis and non-invasive surrogates of disease severity in Alzheimer's disease (AD) are becoming a modern challenge. Magnetic resonance (MR) techniques are being evaluated as possible surrogate measures of disease progression. The purpose of this work was to correlate the results of combined advanced MRtechniques with neuropsychological performance in order to identify a sensible and sensitive imaging approach to neurodegenerative quantification disease progression. We enrolled 19 patientswith Alzheimer's disease (9 males and 10 females, with a mean age of 74±8). Mean MMSE score of AD patients was 20 ±6. All the AD patients underwent a brain magnetic resonance imaging examinations and a battery of neuropsychological test which included Milan Overoll Dementia Assessment (MODA), Raven's Progressive Matrices, Visual Search, Digit Span, Rey list, prose memory, constructional apraxia, phonological and semantic fluency, and trail making. We measured regional cortical thickness, surfaces and volumes using a set of automated tools (Freesurfer) to reconstruct the brain's cortical surface from T1-weighted three-dimensional volumetric brain magnetic resonance imaging. Magnetic resonance spectroscopy was carried out in the temporal lobes, parietal lobes and frontal lobes; the evaluated metabolites were N-acetylaspartate (NAA),choline (Cho), creatine (Cr). We used Spearman coefficient to analyze the correlation among the different factors. We analyzed the relationship of the regional measure of cortical thickness and volume of vulnerable AD area to severity of symptoms of cognitive impairment. MMSE was directly correlated with the thickness of right brain entorinal cortex, fusiform area, inferior superior and temporal pole (P >0.01). Other significative correlation were observed between left brain vulnerable area and ReyTest and Raven's Progressive Matrices. Sperman’s Rho analisys of MRS ratios NAA/Cr demonstrated an higher significant correlation between the battery of neuropsychological test and right frontal withe matter and left frontal grey matter. Sperman’s Rho analisys of MRS ratios Cho/Cr demonstrated an higher significant correlation between the battery of neuropsychological test and mesial occipital grey matter(Tab.1).We observed a selective correlation between FA measured in corpus callosum (CC) and MMSE, MODA and Rey Test and a preferred correlation between FA evaluated in right fronto-parietal and temporal structures with the major test for cognitive evaluation. Finally with multimodal imaging analysis we observed a combined relationship between FA value of CC, it’s volume and MMSE Combining non conventional magnetic resonance imaging, including morphometry, spectroscopy, MD and FA evaluation, provide a novel framework for both anatomical, metabolic and ultratructural evaluation of neurodegeneration in AD.

La Memoria Prospettica (PM) è la capacità di ricordare di eseguire un’azione a distanza di tempo, in un preciso momento o all’accadere di uno specifico evento, è dunque una funzione complessa e di fondamentale importanza nell’aging normale e patologico in quanto strettamente legata al mantenimento dell’autonomia e allo svolgimento delle attività di vita quotidiana. Il nostro studio prende in considerazione un campione di 135 pazienti (16 AD, 64 MCI di cui 49 aMCI e 15 naMCI e 55 SCI) e 46 HC ponendosi come obiettivi quelli di: valutare la capacità di un test standardizzato di PM (il MIST) di discriminare tra i diversi livelli di compromissione, di indagare nei singoli gruppi i domini cognitivi sottesi al funzionamento della PM e di valutare il ruolo della PM come marker precoce di declino cognitivo in soggetti SCI. I risultati del nostro studio mostrano come il MIST sia uno strumento efficace nel discriminare i diversi livelli di compromissione, distinguendo tra AD, MCI e HC; sebbene inoltre non siano state riscontrate differenze significative tra HC e SCI è stato possibile osservare performance peggiori dei pazienti con disturbo soggettivo rispetto ai controlli, sia nel punteggio totale al MIST che in tutti punteggi parziali. Inoltre, l’analisi dei domini cognitivi che sottendono al funzionamento della PM nei diversi gruppi mette in luce un dato interessante, mostrando come nei soggetti sani le prove PM siano sottese principalmente dalle componenti mnesiche e dalle funzioni esecutive mentre negli SCI il contributo della memoria scompare e le performance al compito di PM sembrano essere spiegate esclusivamente dai domini esecutivi. Infine, il nostro studio di follow-up a 12 mesi condotto su 11 SCI reclutati tra quelli presenti nello studio principale sebbene non abbia evidenziato differenze significative tra le prove di PM alla baseline e al follow-up, ha fornito interessanti spunti per studi futuri permettendoci di considerare la valutazione della PM un valido strumento per l’identificazione precoce dei deficit cognitivi.