Thèses : « LPS- binding proteins »

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SESTITO, STEFANIA ENZA. « LPS-binding proteins : interaction studies with natural and synthetic ligands ». Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano-Bicocca, 2015. http://hdl.handle.net/10281/67756.

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Résumé :

L’obiettivo di questa tesi è elucidare alcuni aspetti dell’interazione tra proteine che legano il lipopolisaccaride (LPS) batterico e il loro ligando naturale o ligandi di sintesi. LptC (Lipopolysaccharide transport C) è una proteina batterica che appartiene al sistema di trasporto Lpt, un sistema di 7 proteine essenziali che trasportano l’LPS sulla membrana esterna dei batteri Gram negativi dopo la sua biosintesi. Sebbene molti elementi della biosintesi dell’LPS siano stati elucidati, il preciso meccanismo di trasporto è ancora poco chiaro. Poiché LptC può essere considerata come proteina modello del sistema Lpt, in quanto presenta lo stesso folding delle altre proteine ed è la prima ad essere localizzata nel periplasma, abbiamo sviluppato ed ottimizzato un saggio di binding in vitro per studiare la sua interazione con l’LPS. Abbiamo ottenuto, per la prima volta, dettagliate informazioni sui parametri termodinamici e cinetici dell’interazione LptC-LPS. Abbiamo infatti dimostrato che in vitro il binding LptC-LPS è irreversibile con una Kd dell’ordine del μM. Considerando le analogie strutturali tra LptC e la proteina eucariotica CD14, appartenente al sistema recettoriale del TLR4, in modo analogo è stata studiata l’interazione di LptC con la molecola sintetica IAXO-102, un noto ligando di CD14. È emerso che IAXO-102 condivide lo stesso sito di legame dell’LPS e che l’interazione con la proteina è irreversibile con un’affinità inferiore a quella LptC-LPS. IAXO-102 può dunque essere considerato un prototipo per lo sviluppo di una nuova generazione di antibiotici che ha come target la biogenesi dell’LPS. L’LPS è in grado di interagire con molte altre proteine, tra le quali quelle del sistema dell’immunità innata (TLR4, CD14, MD-2). Il riconoscimento dell’LPS da parte di questi recettori induce una forte risposta infiammatoria che termina con la produzione di citochine pro-infiammatorie e fattori immunomodulatori. Questa reazione infiammatoria è utile all’organismo, ma quando si manifesta in modo eccessivamente potente e sregolato induce sepsi, processi infiammatori e sindromi autoimmuni per le quali non è ancora disponibile un trattamento farmacologico. Una possibile soluzione al problema consiste nella ricerca e nello sviluppo di composti in grado di modulare questa eccessiva attivazione. Nella seconda parte di questo lavoro, sono riportate le caratterizzazioni biologiche di alcuni composti di sintesi con caratteristiche chimiche differenti. Di tutti i composti è stata valutata la tossicità mediante saggio dell’MTT e l’attività modulatoria del pathway del TLR4 utilizzando cellule HEK stabilmente trasfettate con i geni del TLR4, CD14 ed MD-2. Ulteriori caratterizzazioni sono state effettuate sui composti più promettenti, effettuando saggi in vitro su cellule HEK trasfettate con il complesso umano o murino TLR4•MD-2 e saggi in vivo. Infine, abbiamo investigato la possibile correlazione tra le note proprietà anti-infiammatorie di alcuni composti naturali, come i composti fenolici presenti nell’olio di oliva, e il pathway del TLR4. L’obiettivo di questo lavoro è duplice: individuare un lead compound come possibile modulatore del TLR4, ma anche discriminare quali caratteristiche chimiche siano importanti per ottenere questo effetto. Inoltre, le informazioni ottenute potrebbero essere estremamente utili per guidare il rational design di altri modulatori del TLR4.
The purpose of this work is the elucidation of some aspects of the interaction between lipopolysaccharide (LPS) binding proteins and their natural ligand or synthetic compounds. LptC (Lipopolysaccharide transport C) is a bacterial protein belonging to Lpt complex, a molecular machinery composed of 7 essential proteins involved in the transport of LPS to the outer membrane in Gram negative bacteria after its biogenesis. Although many elements of LPS biosynthesis have been clarified, the precise mechanism of transport is still not completely understood. Since LptC can be considered as a model protein of Lpt complex, sharing the same folding of other proteins and being the first one in the periplasm, we have developed and optimized an in vitro binding assay to study its interaction with LPS. We have obtained, for the first time, detailed information about the thermodynamic and kinetic parameters of LptC-LPS binding. We have shown that the in vitro LptC-LPS binding is irreversible with a Kd of the order of μM. Considering the structural similarities between LptC and the eukaryotic protein CD14, belonging to TLR4 receptor system, the binding between LptC and the synthetic molecule iaxo-102, a known ligand of CD14, has been investigated. It is evident that iaxo-102 shares the same binding site of LPS and that the binding is irreversible with an affinity lower than that LptC-LPS. So, iaxo-102 can be considered as a lead compound for the development a new generation of antibiotics targeting the biogenesis of LPS. LPS also binds to other proteins, such as those of innate immunity TLR4, CD14 and MD-2. The LPS recognition by these receptors induces the production of pro-inflammatory cytokines and immunomodulators that trigger the inflammatory and immune responses. These reactions are useful for the organism, but when TLR4 activation is too strong or not well regulated induces sepsis, inflammation and autoimmune syndromes, which still lack a pharmacological treatment. A possible solution to solve this problem consists in the research and development of compounds which modulate this excessive activation. In the second part of thesis work, the biological characterization of some synthetic compounds, with different chemical features, have been reported. All compounds have been screened for their toxicity using MTT assay, and their modulatory activity on TLR4 pathway by using HEK cells stably transfected with TLR4, CD14 and MD-2 genes. The best compounds have been further characterized by in vitro assays on HEK cells transfected with the human or murine complex TLR4·MD-2 and in vivo studies. Finally, the possible correlation between the known anti-inflammatory properties of some natural compounds, such as the phenolic compounds of olive oil, and TLR4 activity has been investigated. The aim of this study is double: to find a lead compound active on TLR4 pathway, but also to discriminate which chemical features are important to obtain this effect. In addition, the information obtained could be very useful to guide the rational design of other TLR4 modulators.

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CIARAMELLI, CARLOTTA. « Synthesis and characterization of new small-molecule ligands of LPS binding proteins ». Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano-Bicocca, 2015. http://hdl.handle.net/10281/77016.

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Résumé :

Lo scopo del presente lavoro è la progettazione, la sintesi e la caratterizzazione di nuove small molecules, attive come ligandi di LPS (lipopolisaccaridi)-binding proteins. Gli LPS, o endotossine batteriche, sono macromolecole anfifiliche ubiquitarie sulla membrana esterna dei batteri Gram-negativi. Le proteine che legano gli LPS studiate nel corso di questo progetto di tesi di dottorato appartengono a due categorie: le proteine batteriche di trasporto Lpt e il sistema recettoriale TLR4, che comprende anche i co-recettori LBP, CD14, MD2. Le proteine Lpt, e in particolare la proteina LptC, sono responsabili del meccanismo di esportazione del LPS alla superficie cellulare, che è uno step fondamentale della via biosintetica dell’LPS. Pertanto, la biogenesi dell’LPS rappresenta un target ideale per lo sviluppo di nuovi antibiotici contro i batteri Gram-negativi. Inoltre, le strutture delle proteine Lpt sono state risolte, ma il meccanismo di trasporto è ancora da elucidare. Nel presente lavoro di tesi sono stati utilizzate diverse tecniche per studiare l'interazione tra LPS e LptC, con particolare attenzione agli studi di interazione via NMR. Inoltre, un nuovo LPS fluorescente è stato prodotto ed è stato utilizzato come tool per studi di interazione LPS-LptC con tecniche di fluorescenza. Sono state anche sviluppate alcune nuove molecole sintetiche. Questi glicolipidi sono stati progettati e sintetizzati per ottenere ligandi di LptC e, in prospettiva, potenziali antibiotici contro i batteri Gram-negativi. Il Toll-like receptor 4 (TLR4), il recettore dell'immunità innata, riconosce l’LPS aiutato da altre proteine (LBP, CD14 e MD-2) ed è responsabile dell'induzione della risposta infiammatoria. Molecole sintetiche in grado di modulare l'attività dei recettori dell’immunità innata sono un potente mezzo per studiare il sistema recettoriale TLR4 e hanno grande interesse farmacologico come adiuvanti vaccinali (agonisti), agenti antisepsi e anti-infiammatori (antagonisti). L’attività biologica di glicolipidi con una funzione amminica (IAXO-102) come antagonisti del TLR4 è stata chiaramente dimostrata dal nostro gruppo di ricerca. La sintesi di molecole derivate da IAXO-102, che mantengano l'attività biologica del precursore, è stato un obiettivo di questo lavoro. In particolare, sono state portate a termine le sintesi di sonde fluorescenti, utilizzate per studi di interazione, derivati zwitterionici e molecole dimeriche. Nei nostri laboratori sono stati ottenuti anche antagonisti anionici del TLR4 con una struttura chimica più simile a Lipide A. Lo scopo di questo lavoro è stato valutare, tramite esperimenti NMR, la loro capacità di legare co-recettore dell'immunità innata MD-2. Il carattere anfifilico degli analoghi sintetici del lipide A sintetizzati finora è spesso associato ad una bassa solubilità in acqua e a scarsa biodisponibilità. Invece, i composti attivi sul TLR4 di origine naturale hanno una migliore solubilità e biodisponibilità. La modifica chimica di queste strutture è molto utile per modulare l'attività biologica e per migliorare la specificità nei confronti del target. Di conseguenza, in una fase successiva di questo lavoro di tesi, è stata intrapresa la sintesi di nuove molecole con strutture chimiche ispirate ai modulatori naturali del TLR4. Recentemente è stato dimostrato che alcuni composti fenolici estratti da olio di oliva hanno una buona attività come antagonisti del TLR4. Pertanto, la sintesi di alcuni analoghi di queste molecole è stata eseguita per ottenere nuovi potenziali antagonisti del TLR4, con una migliore solubilità in acqua e una ridotta tossicità.
The purpose of this work is the design, synthesis and characterization of new small molecules, active as ligands of two different lipopolysaccharide (LPS)-binding proteins. LPS, or bacterial endotoxin, is an amphiphilic macromolecule ubiquitous on the outer membrane of Gram-negative bacteria. The LPS binding proteins studied during this thesis project belong to two classes: the bacterial proteins of the Lpt transport machinery and the mammalian TLR4 receptor system, including the co-receptors LBP, CD14, MD-2. Lpt proteins, and in particular the protein LptC, are responsible for the export mechanism of LPS to the cell surface of Gram negative bacteria, which is a fundamental step of the LPS biosynthetic pathway. Therefore, the LPS biogenesis represents an ideal target for development of novel antibiotics against Gram-negative bacteria. Moreover, the structures of Lpt proteins have been elucidated, but very little is known about the mechanism of LPS transport. In this thesis work different techniques were used to study the interaction between LPS and LptC, particularly NMR binding studies. Moreover, a new fluorescent LPS was produced and it was used as a tool to perform LPS-LptC interaction studies with fluorescence techniques. Some new synthetic molecules were also developed during this thesis. Glycolipidic small molecules were designed and synthesized in order to obtain LptC ligands and, in perspective, potential antibiotics against Gram-negative bacteria. Toll-like receptor 4 (TLR4), the innate immunity receptor, recognizes LPS, helped by other proteins (LBP, CD14 and MD-2), and it is responsible for the induction of inflammatory responses. Synthetic small molecules able to modulate innate immunity receptors activity are a powerful mean to study the TLR4 receptor system and have great pharmacological interest as vaccine adjuvants (agonists), antisepsis and anti-inflammatory agents (antagonists). Antagonist activity on TLR4 receptor system of amino glycolipids (IAXO-102) was clearly demonstrated by our research group. The synthesis of molecules derived from IAXO-102 which retain the biological activity of the precursor was a target of this work. In particular, the synthesis of fluorescent probes, used for binding studies, zwitterionic derivatives and dimeric molecules were performed. Anionic TLR4 antagonists with a chemical structure more similar to Lipid A were also obtained in our labs. The aim of this work was the evaluation via NMR binding experiments of their ability to bind the innate immunity co-receptor MD-2. The amphiphilic character of the synthetic lipid A analogues synthesized so far is often associated with low water solubility and poor bioavailability. In this respect, the natural TLR4-active compounds have better solubility and bioavailability. The chemical modification of these structures is very helpful to modulate their biological activity and to enhance target specificity. Consequently, in a later stage of this work, the synthesis of new small molecules with chemical structures inspired to natural TLR4 modulators was pursued. Very recently it was found that some phenolic compounds from olive oil extracts presented a good activity as TLR4 antagonists. The synthesis of some analogues of these molecules was performed to obtain new potential TLR4 antagonists with better water solubility and reduced toxicity.

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Eckert, Jana Kristin. « Funktionelle Analyse von Mutanten des LPS-bindenden Proteins (LBP) ». Doctoral thesis, Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I, 2009. http://dx.doi.org/10.18452/15955.

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Résumé :

LBP vermittelt im Wirtsorganismus die direkte Immunantwort auf bakterielle Liganden wie das Lipopolysaccharid (LPS) von Gram-negativen oder Lipopeptide von Gram-positiven Bakterien. In dieser Arbeit wurde die Funktionsweise von LBP weiter aufgeklärt. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine natürlich vorkommende Mutation des LBP (c998t), die an Position 333 zu einem Austausch der Aminosäure Prolin zu Leucin führt, hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf Struktur und Funktionalität des Proteins untersucht. Westernblot-Analysen des rekombinant hergestellten Proteins und humaner Seren von Mutationsträgern weisen auf einen Zerfall des mutierten Proteins hin. Es kommt zu einer Beeinträchtigung der Bindung bakterieller Liganden und einer deutlichen Reduktion der LBP-vermittelten Zytokinausschüttung von Immunzellen. Der hier untersuchte Polymorphismus hat eine Allelfrequenz von 0,072 in einer gesunden europäischen Population. Genotypanalysen von Patientengruppen zeigten, dass es durch die Mutation zu einer deutlich erhöhten Mortalität bei Patienten mit septischen Komplikationen und einer durch Gram-negative Erreger verursachten Pneumonie kommt. Unsere Ergebnisse zur eingeschränkten Funktion des LBP-c998t bieten eine erste Erklärung dafür, wie diese Mutation vermutlich die Fähigkeit, Krankheiten zu bewältigen, beeinträchtigt. Innerhalb dieser Arbeit ging es um die Analyse der Bindung von bakteriellen Liganden an LBP. Dabei wurde eine potentiell gemeinsame Bindungsstelle für Liganden untersucht, die von Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien stammen und später von den Toll-like Rezeptoren (TLRs) 2 und -4 erkannt werden. Dazu wurden Bindungsversuche zwischen Lipopeptiden und LPS mit einer zweiten LBP-Variante (LBP-E94/95) durchgeführt. Beim LPS führt dies zu einem Bindungsverlust. Auch für die Lipopeptide war durch die Mutationen die Interaktion mit LBP beeinträchtigt, was die These einer gemeinsamen Bindungsstelle von TLR2- und TLR4-Liganden an das Protein weiter unterstützt.
LBP enhances the innate immune reaction against bacterial ligands like LPS from gram negative or lipopeptides from gram positive bacteria in the host. Here we investigated the function of LBP using two recombinant mutants of the protein. The first part of this work examines a natural occurring mutation of LBP (c998t) leading to an amino acid exchange of proline to leucine at position 333 with regard to the impact on structure and function of the protein. Western blot analyses of the recombinant protein and sera obtained from individuals differing in the LBP genotype indicate the disaggregation of the mutated protein. Thereby binding of bacterial ligands to LBP is diminished and the LBP mediated cytokine secretion of immune cells is reduced. The gene polymorphism leading to the occurrence of the mutation is present with an allelic frequence of 0.072. A recent study has shown that this LBP-SNP led to a higher mortality in patients with septic complications and gram negative pneumonia. The results presented here, showing the negative impact on the function of LBP due to the mutation, may therefore be a first explanation on how this mutation affects the ability of people to deal with disease. Within this work binding of ligands to LBP was also explored. It was investigated whether ligands which are later recognized by Toll-like receptors (TLRs) 2 and – 4 share a common binding site on LBP. Assays with immobilized lipopeptides and LPS were performed with a second mutated LBP (LBP-E94/95). LPS binding to LBP is diminished completely. Here we showed that binding of lipopeptide to LBP is affected likewise, furthermore supporting the hypothesis of a common binding site for TLR2- and TLR4- ligands.

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Szpryngiel, Scarlett. « Structure and lipid interactions of membrane-associated glycosyltransferases : Cationic patches and anionic lipids regulate biomembrane binding of both GT-A and GT-B enzymes ». Doctoral thesis, Stockholms universitet, Institutionen för biokemi och biofysik, 2016. http://urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:su:diva-131084.

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Résumé :

This thesis concerns work on structure and membrane interactions of enzymes involved in lipid synthesis, biomembrane and cell wall regulation and cell defense processes. These proteins, known as glycosyltransferases (GTs), are involved in the transfer of sugar moieties from nucleotide sugars to lipids or chitin polymers. Glycosyltransferases from three types of organisms have been investigated; one is responsible for vital lipid synthesis in Arabidopsis thaliana (atDGD2) and adjusts the lipid content in biomembranes if the plant experiences stressful growth conditions. This enzyme shares many structural features with another GT found in gram-negative bacteria (WaaG). WaaG is however continuously active and involved in synthesis of the protective lipopolysaccharide layer in the cell walls of Escherichia coli. The third type of enzymes investigated here are chitin synthases (ChS) coupled to filamentous growth in the oomycete Saprolegnia monoica. I have investigated two ChS-derived MIT domains that may be involved in membrane interactions within the endosomal pathway. From analysis of the three-dimensional structure and the amino-acid sequence, some important regions of these very large proteins were selected for in vitro studies. By the use of an array of biophysical methods (e.g. Nuclear Magnetic Resonance, Fluorescence and Circular Dichroism spectroscopy) and directed sequence analyses it was possible to shed light on some important details regarding the structure and membrane-interacting properties of the GTs. The importance of basic amino-acid residues and hydrophobic anchoring segments, both generally and for the abovementioned proteins specifically, is discussed. Also, the topology and amino-acid sequence of GT-B enzymes of the GT4 family are analyzed with emphasis on their biomembrane association modes. The results presented herein regarding the structural and lipid-interacting properties of GTs aid in the general understanding of glycosyltransferase activity. Since GTs are involved in a high number of biochemical processes in vivo it is of outmost importance to understand the underlying processes responsible for their activity, structure and interaction events. The results are likely to be useful for many applications and future experimental design within life sciences and biomedicine.

At the time of the doctoral defense, the following paper was unpublished and had a status as follows: Paper 2: Manuscript.

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Hallatschek, Werner. « Die Regulation des humanen Lipopolysaccharid bindenden Proteins (hLBP) ». Doctoral thesis, Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I, 2005. http://dx.doi.org/10.18452/15202.

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Résumé :

Das Lipopolysaccharid Bindende Protein (LBP) ist ein überwiegend in der Leber synthetisiertes Akutphaseprotein. Es bindet den Zellwandbestandteil Lipopolysaccharid (LPS) Gram-negativer Bakterien und transportiert es zu zellulären Rezeptoren, wodurch das angeborene Immunsystem aktiviert wird. In dieser Arbeit wird die Regulation der LBP-Expression in Interleukin (IL)-1, IL-6 und Dexamethason (Dex) stimulierten humanen Hepatomzelllinien HuH-7 und HepG2 untersucht. Der wichtigste Stimulator ist dabei IL-6, dessen Wirkung über die Transkriptionsfaktoren (TF) Stat-3, C/EBP-beta und AP-1 vermittelt wird. Für alle 3 TF konnten aktive Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor nachgewiesen werden. Für IL-1-Effekte die u. a. über den TF NF-kappaB vermittelt werden, konnten ebenfalls aktive Bindungsstellen nachgewiesen werden. Die Wirkung von Dex wird über Glucocorticoid Responsive Elements (GREs) vermittelt. Auf dem LBP-Promotor befinden, sich wie gezeigt werden konnte, mehrere aktive GREs, wobei einige verstärkend und einige hemmend wirken. Eine zu beobachtende Synergiewirkung von Dex und IL-6 wird durch die Aufregulation des IL-6-Rezeptors durch Dex verursacht. Die LBP-Expression kann durch TGF (Transforming Growth Factor)-beta gehemmt werden. Der TGF-beta-Signalweg über Smads ist in den Hepatomzellen aktiv, vermittelt aber nicht den TGF-beta-Hemmeffekt, sondern eine geringe stimulierende Wirkung, die bei alleiniger TGF-beta-Inkubation auftritt. Die inhibierende Wirkung von TGF-beta wird durch Gfi-1- und AP-1-Bindungsstellen vermittelt. Die Gfi-1-Bindungsstelle nimmt dabei, wie hier erstmals gezeigt werden konnte, eine herausragende Stellung ein. Die Aufklärung der LBP-Regulation und dabei besonders die Hemmung der LBP-Expression kann mittelfristig dazu beitragen, den klinischen Verlauf von inflammatorischen und infektiösen Erkrankungen zu beeinflussen und bietet daher Potenzial für neue Therapieansätze.
Lipopolysaccharide (LPS) binding protein (LBP) is an acute phase protein with the ability to bind and transfer LPS of Gram-negative bacteria. This soluble pattern recognition molecule represents an important defense principle of the host. Regulation of the hepatic acute phase response and its termination are important mechanisms for limiting systemic inflammatory activity of the host. Here were analyze the cooperation of Interleukin (IL)-1, IL-6, and Dexamethasone (Dex) at LBP expression in the hepatoma cell lines HuH-7 and Hep G2. The major inducer of LBP expression is IL-6. Within the LBP promoter numerously highly consensus binding sites such as AP-1, C/EBP-beta? and STAT3 are present, that confer transcriptional activity as shown by truncation and mutation experiments. Additionally, activate NF-kappaB sites activated by IL-1 were detected at the LBP promoter. By mutation experiments of the promoter furthermore were found differentially active glucocorticoid response elements (GREs). The promoter contains GREs enhancing the activity as well as inhibitory ones. The enhancing effect towards LBP expression by Dex was mediated by IL-6. Dex stimulated the expression of the IL-6 receptor and therefore upregulated the IL-6 pathway. Transforming Growth Factor (TGF)-beta is able to inhibit LBP expression in stimulated cells. An AP-1 binding site was identified mediating inhibitory TGF-beta effects towards LBP promoter activity. Furthermore it was shown that a growth factor independence (Gfi)-1 binding site localized near the AP-1 site is essential for mediating the TGF-beta inhibitory effect. The relevancy of the Gfi-1 site fore mediating TGF-beta effects indicates a novel mechanism for understanding inhibitory TGF-beta effects at the transcriptional level. In summary the complex regulation of LBP were elucidate which may help to eventually develop novel intervention strategies for acute phase, sepsis, and septic shock.

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ZAFFARONI, LENNY. « Production of recombinant human MD-2 and development of protein-ligand binding assays for the characterization of new TLR4 modulators ». Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano-Bicocca, 2018. http://hdl.handle.net/10281/207343.

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Résumé :

Il toll-like receptor 4 (TLR4) rappresenta un mediatore centrale dell’immunità innata ed adattativa in mammiferi. L’attivazione di TLR4 in risposta al lipopolisaccaride (LPS) batterico induce un rapido innesco di processi pro-infiammatori essenziali per una risposta immunitaria ottimale. L’attivazione di TLR4 mediata da LPS è un meccanismo che coinvolge la partecipazione di diverse proteine e culmina con la formazione del complesso attivato (TLR4/MD-2/LPS)2. MD-2 è il co-rettore di TLR4, e svolge un importante ruolo nell’interazione con LPS e la susseguente dimerizzazione del TLR4. MD-2 è la componente che interagisce con il ligando (LPS) nel complesso recettoriale TLR4/MD-2. Il legame di LPS al complesso TLR4/MD-2 induce la dimerizzazione del TLR4; mentre gli antagonisti del TLR4 sono in grado di legare il complesso TLR4/MD-2 ma non inducono la dimerizzazione del TLR4. L’attivazione non regolata del TLR4 è correlata ad un’ampia serie di problematiche prive di un trattamento farmacologico specifico. Esse includono disordini autoimmuni, infiammazione cronica, allergie, asma, infezioni e malattie del sistema nervoso centrale, cancro, e setticemia. L’inibizione del TLR4 tramite l’uso di piccole molecole sintetiche o naturali può quindi rappresentare una via per lo sviluppo di nuove terapie contro questa vasta gamma di problematiche. Questa tesi è parte di un studio originale di relazione struttura-attività (SAR) svolto su glicolipidi monosaccaridici sintetici nel contesto della modulazione del TLR4. In particolare, essa si focalizza sulla caratterizzazione del legame in vitro di nuovi glicolipidi monosaccaridici sintetici con il recettore MD-2 purificato. Per gli studi di interazione la proteina MD-2 umana (hMD-2) purificata e funzionale è stata espressa in cellule di lievito. Due diversi sistemi di espressione per la produzione di hMD-2 ricombinante sono stati testati: mammifero (HEK293T) e cellule di lievito (Pichia pastoris). La purificazione di hMD-2 da lievito è stata ottimizzata ottenendo una concentrazione finale di hMD-2 purificato di 30 μM. Per confrontare l’attività biologica di hMD-2 espresso nei diversi microorganismi è stato sviluppato un ELISA. hMD-2 da cellule di mammifero ha ottenuto l’attività biologica più elevata, seguito da hMD-2 espresso in P. pastoris. hMD-2 da E. coli ha ottenuto l’attività biologica più bassa dei tre. Date le rese più elevate di purificazione in lievito, hMD-2 espresso in P. Pastoris è stato utilizzato nei quattro diversi tipi di esperimenti di legame per studiare l’affinità di molecole naturali e sintetiche. I test di legame comprendono due ELISA con hMD-2 immobilizzato, un saggio fluorescente di spiazzamento, e misure di risonanza plasmonica di superficie (SPR). I due test ELISA sono basati su: i) spiazzamento dose-dipendente di un anticorpo da hMD-2 immobilizzato. L’anticorpo lega hMD-2 in una regione in prossimità del sito di legame del ligando; ii) spiazzamento di LPS biotinilato da hMD-2 immobilizzato. L’esperimento di florescenza è basato sullo spiazzamento di bis-ANS da hMD-2. Mentre la tecnica SPR è stata utilizzata per studiare la diretta interazione tra le molecole e hMD-2 immobilizzato. L’affinità per hMD-2 delle molecole analizzate (che risulta essere nell’intervallo del basso μM) è in linea con i risultati di attività biologica e la produzione di citochine in vitro in modelli cellulari. I risultati ottenuti da questi studi in vitro sul recettore hMD-2 purificato evidenziano l’interazione delle molecole con la tasca idrofobica di hMD-2, presentando differenze nei valori di affinità. Questi dati generati permettono uno studio sistemico dei modulatori del TLR4, creando buone prospettive per lo sviluppo di una nuova generazione di farmaci hits e leads che agiscano direttamente sul recettore TLR4.
Toll-like receptor 4 (TLR4) represents a central mediator of innate and adaptive immune responses in mammals. TLR4 activation in response to bacterial lipopolysaccharides (LPS) results in the rapid triggering of pro-inflammatory processes essential for optimal host immune responses. TLR4 activation mediated by LPS is a complex event which involves several proteins (lipid binding protein (LBP), cluster of differentiation 14 (CD14), and myeloid differentiation 2 (MD-2)) and it ends with the formation of the activated (TLR4/MD-2/LPS)2 complex. The TLR4 co-receptor MD-2 plays an important role in the interaction with LPS and subsequent TLR4 dimerization. MD-2 alone binds to LPS, whereas TLR4 alone does not. MD-2 is the ligand-binding component of the TLR4/MD-2 receptor complex. LPS binding to TLR4/MD-2 induces TLR4 dimerization; whereas TLR4 antagonists binding to TLR4/MD-2 does not induce TLR4 dimerization. Deregulated TLR4 activation is related to an impressively broad spectrum of disorders still lacking specific pharmacological treatment. These include autoimmune disorders, chronic inflammations, allergies, asthma, infectious and central nervous system diseases, cancer, and sepsis. The TLR4 inhibition by small molecules of synthetic and natural origin provides access to new TLR-based therapeutics targeting this large array of diseases. This thesis is part of an original structure-activity relationship (SAR) study on synthetic monosaccharide glycolipids in the context of TLR4 modulation. Thesis work focuses on the in vitro binding characterization of new synthetic monosaccharide glycolipids with the purified receptor MD-2. Pure and functional human MD-2 (hMD-2) protein for binding studies has been obtained by expression in yeast cells. Two different expression systems for the production of recombinant hMD-2 were tested: mammalian (HEK293T) and yeast cells (Pichia pastoris). Recovery of hMD-2 from the medium of yeast cells was optimized, achieving a concentration of recombinant hMD-2 of 30 μM. An ELISA was developed in order to compare the biological activity of the hMD-2 expressed in different hosts. hMD-2 from mammalian cells obtained the highest biological activity, followed by the hMD-2 expressed by P. pastoris. hMD-2 expressed by E. coli presented the lowest biological activity of the three. Due to the higher yield of recovery achieved, hMD-2 expressed in P. pastoris was used in four different types of binding experiments to assess its affinity for natural and synthetic molecules. The binding tests comprise two plate based ELISA with immobilized hMD-2, a fluorescence displacement assay and surface plasmon resonance (SPR) measurements. The two ELISA tests were based on: i) dose-dependent displacement of a monoclonal antibody from immobilized hMD-2. The antibody binds to hMD-2 in a region proximal to ligand binding site; ii) displacement of biotin-LPS from immobilized hMD-2. The fluorescence experiment was based on the displacement of the bis-ANS from hMD-2, whereas the SPR technique was used to study the direct interactions between small ligands and immobilized hMD-2. The obtained binding affinities for hMD-2 of the tested molecules (which turned out to be in the low μM range) mirror their biological activity in modulating TLR4 signaling and cytokine production in vitro in cell models. The results obtained from these in vitro cell-free studies indicate that the tested molecules bind to the hMD-2 pocket, with differences in the affinity values. These data allow a systematic study on SAR for TLR4 modulators, opening the way for the development of a new generation of drug hits and leads targeting directly TLR4 signaling.

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Ghanim, Mustafa. « Les aspects génétiques des démences frontotemporales ». Paris 6, 2010. http://www.theses.fr/2010PA066039.

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Agostini, Federico 1985. « Predictions of RNA-binding ability and aggregation propensity of proteins ». Doctoral thesis, Universitat Pompeu Fabra, 2014. http://hdl.handle.net/10803/318159.

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Résumé :

RNA-binding proteins (RBPs) control the fate of a multitude of coding and non-coding transcripts. Formation of ribonucleoprotein (RNP) complexes fine-tunes regulation of post-transcriptional events and influences gene expression. Recently, it has been observed that non-canonical proteins with RNA-binding ability are enriched in structurally disordered and low-complexity regions that are generally involved in functional and dysfunctional associations. Therefore, it is possible that interactions with RNA protect unstructured protein domains from aberrant associations or aggregation. Nevertheless, the mechanisms that prevent protein aggregation and the role of RNA in such processes are not well understood. In this work, I will describe algorithms that I have developed to predict protein solubility and to estimate the ability of proteins and transcripts to interact. I will illustrate applications of computational methods and show how they can be integrated with high throughput approaches. The overarching goal of my work is to provide experimentalists with tools that facilitate the investigation of regulatory mechanisms controlling protein homeostasis.
Las proteínas de unión de ARN son responsables de controlar el destino de una multitud de transcriptos codificantes y no codificantes. De hecho, la formación de complejos de ribonucleoproteínas (RNP) afina la regulación de una serie de eventos post-transcripcionales e influye en la expresión génica. Recientemente, se ha observado que las proteínas con capacidad no canónica de unión al ARN se enriquecen en las regiones estructuralmente desordenadas y de baja complejidad, que son las que participan generalmente en asociaciones funcionales y disfuncionales. Por lo tanto, es posible que interactuar con el ARN pudiera ser una manera de proteger las proteínas no estructuradas de asociaciones aberrantes o de agregación. Sin embargo, los mecanismos que impiden la agregación de proteínas y la función del ARN en tales procesos no están bien descritas. En este trabajo, se describen los me ́todos que he desarrollado para predecir la solubilidad de proteínas y para estimar la capacidad de transcriptos y proteínas de interactuar. De otra parte, voy a ilustrar sus aplicaciones y explicar como los métodos de bajo rendimiento han evolucionado a un mayor rendimiento. El objetivo final es proporcionar instrumentos a los investigadores experimentales que se pueden utilizar para facilitar la investigación de los mecanismos reguladores que controlan la homeostasis molecular.

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Ding, Peihui, et 丁佩惠. « Expression profile, molecular regulation and immuno-inflammatory function of LPS-binding protein in human oral keratinocytes ». Thesis, The University of Hong Kong (Pokfulam, Hong Kong), 2012. http://hub.hku.hk/bib/B49617795.

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Résumé :

Lipopolysaccharide (LPS)-binding protein (LBP) functions as a crucial molecule in innate immune responses to bacterial challenge. Our recent study shows the expression of LBP in human gingiva and its significant association with periodontal condition. Porphyromonas gingivalis is a keystone periodontopathogen with its LPS as a major virulence factor strongly involved in periodontal pathogenesis. Recent study has discovered that P. gingivalis LPS displays a significant lipid A structural heterogeneity. The present study investigated i) the expression profile of LBP in human oral keratinocytes (HOKs) stimulated by P. gingivalis LPS with penta-acylated (LPS1690) and tetra- (LPS1435/1449) lipid A structures as well as E. coli LPS; ii) the involvement of toll-like receptors (TLRs) and downstream signaling mechanisms in LBP expression; and iii) the effects of LBP and its crosstalk with the two isoforms of P. gingivalis LPS on the expression of cytokines and human β-defensins (hBD-2) in HOKs. The expression of LBP mRNA and peptide was significantly up-regulated by P. gingivalis LPS1690 and E. coli LPS, while not by P. gingivalis LPS1435/1449. P. gingivalis LPS1690-induced LBP expression was through both TLR2 and TLR4, and the relevant down-stream signaling mechanisms were then further investigated. Western blot results showed that P. gingivalis LPS1690 activated the phosphorylation of IκBα, p65, p38 MAPK and SAPK/JNK, whereas E. coli LPS phosphorylated IκBα, p38 MAPK and SAPK/JNK. A nuclear translocation of NF-κB transcription factor was confirmed upon stimulation by both forms of LPS. Further blocking assay revealed that P. gingivalis LPS1690 induction of LBP was through NF-κB and p38 MPAK pathways, while E. coli LPS induction of LBP was mediated by NF-κB, p38 MPAK and JNK pathways. The effects of LBP and its crosstalk with P. gingivalis LPS1690 or LPS1435/1449 on the expression of cytokines and hBD-2 were further investigated. Interestingly, recombinant human LBP (rhLBP) per se could significantly up-regulate the expression of IL-6, IL-8 and TNF-α, while down-regulate hBD-2 expression. P. gingivalis LPS1690 or LPS1435/1449 modulated to different extents the rhLBP-induced cytokine expression. Notably, P. gingivalis LPS1690 significantly down-regulated rhLBP-induced IL-8 expression; whereas, P. gingivalis LPS1435/1449 down-regulated IL-8 expression more intensively (around 80% vs. 40% reduction). The key mediators of TLRs and their adaptors like CD180 and MD-1 were significantly down-regulated by rhLBP (fold changes: -2.44 and -9.62, respectively). Both CD180 and MD-1 mRNAs were up-regulated by P. gingivalis LPS1435/1449 (7.11 and 4.05 folds, respectively); while these two genes were reversely modulated by P. gingivalis LPS1690 (20.86 and -6.93 folds, respectively). The present study demonstrates that P. gingivalis LPS with a lipid A structural heterogeneity differentially modulates LBP expression in HOKs. P. gingivalis LPS1690 promotes LBP expression in HOKs through TLR2 and TLR4 as well as NF-κB and p38 MAPK pathways in a way different from E. coli LPS. rhLBP per se significantly up-regulates the expression of IL-6, IL-8 and TNF-α, while down-regulates hBD-2 expression. P. gingivalis LPS with different lipid A structures down-regulates to different extents the rhLBP-induced expression of cytokines in HOKs, likely through fine-tuning of the CD180-MD1 complex and the relevant TLRs.
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Dentistry
Doctoral
Doctor of Philosophy

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Gonzalez, Daniel. « Les "phosphate binding protein" : entre import du phosphate et inhibition de la transcription virale ». Thesis, Aix-Marseille, 2014. http://www.theses.fr/2014AIXM4019.

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Résumé :

Les « phosphate binding protein » (PBP) constituent une famille de protéines présentes de manière ubiquitaire chez les bactéries et plus marginalement chez les Eucaryotes. Impliquées dans l'import du phosphate extracellulaire chez les bactéries, les PBPs présentent un site de fixation du phosphate très bien caractérisé avec, notamment, une liaison hydrogène particulière nommée «low barrier hydrogen bond» (LBHB). Cette LBHB est impliquée dans la discrimination entre le phosphate et des anions proches chez les PBPs. Bien que cette discrimination semble nécessiter une haute conservation du site de fixation du phosphate, dans la nature différentes configurations sont observées. Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés à la PBP d'un organisme pathogène, C.perfringens qui présente un site de fixation alternatif. Avec, entre autre, une perte de la LBHB, cette PBP présente la plus faible capacité de discrimination testée à ce jour. Cette faible capacité de discrimination pourrait être liée au biotope de la bactérie ou bien à un phénomène d'adaptation fonctionnelle. D'autre part, certaines PBPs présentent des propriétés d'inhibition du VIH via l'étape de la transcription virale. Cependant, ces protéines sont particulièrement difficiles à produire en système hétérologue limitant l'étude fonctionnelle. Afin de lever ce verrou technique, nous avons développé une nouvelle méthodologie basée sur la phylogénie en vue de solubiliser notre modèle d'étude (HPBP). Nous avons obtenu un variant soluble de HPBP qui conserve ses activités antivirales permettant de débloquer les études fonctionnelles
The "phosphate binding protein" constitutes a family of proteins ubiquitously found in Prokaryotes but also more sparsely distributed in Eukaryotes. Involved in phosphate import, PBPs exhibits a well-characterized phosphate binding site with a peculiar hydrogen bond called "low barrier hydrogen bond" (LBHB). This LBHB is involved in the unique discrimination properties of PBPs, capable of discriminating phosphate from other similar anions such as arsenate of sulfate. Albeit this high discriminating property needs a high conservation of the phosphate binding pocket, different configurations are observed in nature. Herein, we have been interested in a PBP from a human pathogen, Clostridium perfringens, which presents an alternative phosphate binding site. Exhibiting a loss of the LBHB, C.perfringens PBP is the least discriminating PBP isolated so far. This weak discrimination property might be related to the environment of C.perfringens or to a functional adaptation of the PBP. On the other hand, PBPs issued from eukaryotic tissues exhibit HIV inhibition properties via a step not yet targeted in current therapies, i.e. the transcription. However, these proteins are difficult to obtain from human tissues and their expression in heterologous system remains impossible. We have developed a new methodology based on phylogeny in order to solubilise our study model, HPBP. Thus, we have obtained a soluble variant of HPBP which conserves the HIV-inhibiting properties. This unique tool both allow to unlock functional studies and lead to a better understanding on how PBPs are capable of inhibiting HIV

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Petit, Valérie. « La teneur en lipides du régime affecte les capacitésd'absorption intestinale et la triglycéridémie postprandiale : contribution du récepteur nucléaire PPARβ ? » Phd thesis, Université de Bourgogne, 2007. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00141891.

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Résumé :

Les acides gras à longue chaîne (AGLC) issus des graisses alimentaires exercent de
nombreuses fonctions au niveau de l'organisme (source d'énergie et d'acides gras
indispensables, synthèse d'eicosanoïdes, régulation de gènes). Leur biodisponibilité cellulaire
est donc un paramètre essentiel, principalement conditionné par la barrière intestinale. On sait
que l'absorption intestinale des AGLC est très efficace. En revanche, on ignore si ce
phénomène est inné ou adaptatif. La réponse à cette question est essentielle. Si l'intestin est
capable d'adapter son absorption au contenu en lipides du régime, on pourrait envisager de
nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter la surcharge lipidique de l'organisme dont
les effets sont connus. Dans cette optique, nous avons soumis pendant 21 jours des souris à un
régime hyperlipidique (40% m/m). Nous avons constaté une induction : 1) du captage des
AGLC, 2) de l'activité proliférative qui s'accompagne d'une augmentation de la masse
relative de la muqueuse, 3) de l'expression des gènes impliqués dans le captage (Fatty Acid
Transport Protein 4, FATP-4), le trafic entérocytaire (Fatty Acid Transporter, FAT; Intestinal
and Liver Fatty Acid-Binding Protein, I et L-FABP) des AGLC, la synthèse et la sécrétion des
lipoprotéines (Microsomal Triglyceride transfer Protein, MTP et apolipoprotéine A-IV). Ce
phénomène est adaptatif puisque ces régulations retournent aux valeurs des témoins lorsque
les souris sont renourries avec un régime normolipidique. Ces modifications s'accompagnent
d'une augmentation de l'efficacité de clairance plasmatique des lipoprotéines riches en
triglycérides. Selon les données de la littérature, le Peroxisome Proliferator-Activated
Receptor β (PPARβ) pourrait occuper une place centrale dans cette adaptation intestinale.
C'est pourquoi l'impact de la sur-expression intestinale de ce récepteur nucléaire a été étudié
sur les capacités d'absorption chez la souris. Les données obtenues ont montré que la surexpression
intestinale de PPARβ engendre une adaptation moins efficace des capacités
d'absorption. Selon nos travaux, une moins bonne différenciation des entérocytes chez les
souris doubles trangéniques pourraient être à l'origine de ce défaut d'adaptation.

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Knierim, Jan Holger. « Charakterisierung LPS-inhibierender Effekte von Lipoproteinen und Lipopolysaccharid Bindendem Protein (LBP) in murinem Serum ». Doctoral thesis, [S.l.] : [s.n.], 2000. http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=963608681.

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RENNA, CRISTINA. « BIOCHEMICAL INSIGHTS INTO THE PROTEIN NUMA AND ITS BINDING PARTNERS BETWEEN MITOTIC SPINDLE AND NUCLEAR COMPARTMENTS ». Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano, 2021. http://hdl.handle.net/2434/884397.

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Résumé :

During my PhD program I worked on two Nuclear Mitotic Apparatus (NuMA)-related projects. The first one centred on the biochemical and structural characterization of the NuMA-dynein mitotic interaction and was published last year on Structure. The second project focused on the study of the largely unknown role of NuMA in the nucleus during interphase. Regarding this part, I got interesting details on the NuMA-53BP1 (p53-binding protein 1) interaction in the context of liquid-liquid phase separation (LLPS). In multicellular organisms, the proper organization of the mitotic spindle is essential for accurate cell division, tissue development and homeostasis. In vertebrate cells, the protein NuMA is a master regulator of mitotic spindle functions, implicated in spindle assembly and orientation, working together with the high molecular weight dynein-dynactin microtubule-motor complex. The domain structure of NuMA consists of an N-terminal globular domain, a central extended coiled-coil, and an unstructured C-terminal cargo-binding region. Whether NuMA is a dynein-dynactin activating adaptor is still not known. On these premises, the first part of my PhD project focused on the characterization of the NuMA-dynein binding interface, which I performed in collaboration with other members of the group. The crystal structure of the N-terminal head of NuMA (NuMA_1-153) revealed that it folds into a hook domain, a conserved feature of the Hook-family dynein-dynactin adaptors interacting directly with the Light Intermediate Chain (LIC) subunit of dynein. Pulldown assays performed with purified proteins indicated a direct interaction between NuMA_1-705 and LIC and identified four conserved residues in the NuMA hook domain that are crucial for LIC binding. Interestingly, sequence alignment between NuMA and known CC1-box containing dynein-dynactin adaptors revealed the existence of a CC1-box-like motif in the NuMA N-terminal coiled-coil domain (NuMA_365-376) that we demonstrated to be also implicated in contacting LIC. Thus, our studies identified two sites on NuMA’ N-terminus required for the interaction with a conserved hydrophobic helix in LIC1 C-terminus. Spindle positioning assays in human HeLa cells showed that these newly identified dynein-binding interfaces of NuMA are essential for correct mitotic progression. Collectively, these results support the notion that NuMA acts as a mitotic dynein-dynactin adaptor, forming complexes with similar topology to what observed for other known hook and CC1-box containing adaptors. In vertebrate cells, NuMA accumulates in the nucleus during interphase and contributes to the DNA damage response (DDR), negatively regulating the 53BP1 double strand break (DSB) repair function. The second part of my PhD project focused on the characterization of the NuMA-53BP1 binding interface. By co-immunoprecipitation (co-IP) experiments in human HEK293T nuclear extracts with anti-NuMA antibodies, I confirmed that endogenous NuMA interacts with 53BP1, and that this interaction is decreased upon DNA damage induction. Interestingly, analytical size-exclusion chromatography (SEC) experiments with purified fragments revealed that the C-terminus of 53BP1 (53BP1_1484-1972) interacts directly with the C-terminus of NuMA (NuMA_1821-2115). These are two intrinsically disordered domains, common to proteins that undergo LLPS, a mechanism conferring spatial and temporal regulation to biological processes. Since 53BP1 forms DNA damage foci, which are LLPS condensates promoted by its C-terminal disordered region, I tested whether also NuMA is involved in this mechanism. Interestingly, I found that NuMA_1821-2115 forms liquid droplets in vitro at 20 uM and physiological salt concentrations, promoted by electrostatic and polar interactions. By co-IP experiments in HEK293T nuclear extracts, I also detected an interaction of NuMA with the MT nucleator TPX2. Since TPX2 counteracts the 53BP1 DSB repair function during replication stress and undergoes LLPS, I hypothesized that NuMA could work with TPX2 in regulating the DDR by forming dynamic LLPS condensates. Surprisingly, by co-IP experiments, an interaction between NuMA and 53BP1 was also scored during mitosis, where 53BP1 is known to be part of the centrosome surveillance pathway, another condensate-associated regulatory process. Further studies are required to uncover the molecular basis and the functional role of the NuMA interaction with 53BP1 both in the DDR and in the centrosome surveillance pathway.

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TRIVIER, SZYMICZEK DOMINIQUE. « Etude du proto-oncogene ets-1 dans les hemopathies malignes : etude moleculaire du domaine dna binding ». Lille 2, 1993. http://www.theses.fr/1993LIL2M317.

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Lefrançois, Louise. « Etude des adhésines HBHA et LBP impliquées dans l'interaction de Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis avec les cellules épithéliales intestinales, cibles privilégiées de la bactérie in vivo ». Thesis, Tours, 2012. http://www.theses.fr/2012TOUR4020/document.

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Résumé :

Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (Map), agent étiologique de la paratuberculose, a évolué en deuxtypes dénommés, S pour« Sheep » et C pour « Cattle ». L’intestin grêle est le site primaire de l’infection à Map mais les mécanismes moléculaires impliqués dans l’implantation du bacille restent largement méconnus. L’objectif de mon projet de thèse visait à identifier et caractériser les adhésines exprimées par Map par des approches génétiques et biochimiques. J’ai ainsi purifié la HBHA et la LBP par chromatographie d’affinité puis les ai identifiés en spectrométrie de masse. L’originalité de ce travail repose sur le polymorphisme de ces adhésines observé entre les souches de type C et S. Cette variabilité a été mise en évidence sur le domaine d’interaction avec les sucres sulfatés de la cellule hôte influençant l’affinité des adhésines pour l’héparine. Ce travail de thèse a permis de caractériser pour la première fois ces deux adhésines produites par Map. Le polymorphisme de la HBHA et de la LBP, discriminant les types C et S, ouvre de nombreuses perspectives sur l’évolution de l’espèce M. avium et le rôle de ces adhésines sur le tropisme intestinal, la préférence d’hôte de Map ou encore leur potentiel diagnostic
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map), the etiological agent of paratuberculosis, has evolved into two types called, S for "Sheep" and C for "Cattle." The small intestine is the primary site of Map infection but the molecular mechanisms involved in the establishment of bacilli are still unknown. The aim of my thesis was to identify and characterize the adhesins expressed by Map by genetic and biochemical approaches. I purified HBHA and LBP by affinity chromatography then identified them by mass spectrometry. The originality of this work is based on the polymorphism of these adhesins observed between strains of type C and S. This variability has been demonstrated in the binding domain involved in interaction with sulfated sugars of host cell influences adhesins affinity for heparin. This thesis has characterized for the first time these two adhesins produced by Map. Specific polymorphism highlighted related to the evolution of the species avium, opens large number questions on their role on the pathogenesis of Map including the cellular tropism, host preference or interest of these antigens to improve diagnostic

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Ní, Chárthaigh Róisín-Ana. « Translational control by the RNA-binding protein CSDE1 : Insights into a stimulatory role in translation elongation ». Doctoral thesis, Universitat Pompeu Fabra, 2020. http://hdl.handle.net/10803/669534.

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Résumé :

RNA-binding proteins are potent regulators of post-transcriptional gene expression. Among the repertoire of RNAs bound by a particular RNA-binding protein, networks of co-ordinately regulated RNAs, or ‘regulons’, are functionally related and their regulation in concert acts to drive cellular processes. In melanoma, the RNA-binding protein CSDE1 is highly upregulated. In this context, CSDE1 regulates the translation of mRNA targets in multiple regulons in a direction that is consistent with oncogenic progression, whereby, tumour-suppressors, such as PTEN, are downregulated and pro-metastatic factors, for example, the key epithelial-to-mesenchymal transition proteins, VIM and RAC1, are upregulated. Ribosome profiling studies indicate that CSDE1 enhances the translation of VIM and RAC1 at the level of translation elongation. Such a stimulatory role for an RNA-binding protein in translation elongation may represent a novel mechanism of translational regulation. Here, we seek to elucidate the protein partners of CSDE1 in inducing this unusual stimulatory effect on translation elongation, and to explore the relationship of CSDE1 to the translational machinery. We confirm that CSDE1 promotes the translation of RAC1 mRNA at the level of elongation, and further highlight a rapid adaptation of melanoma cells to CSDE1 depletion. We demonstrate extensive contact of CSDE1 with the translational machinery. CSDE1 is a ribosome-associated protein, interacting with the small ribosomal subunit, and is further observed to co-sediment with translating polysomes. Amongst 38 high-confidence CSDE1-interacting proteins that we identify in melanoma are 16 ribosomal proteins and a further 11 members of the ribo-interactome. Moreover, we show that CSDE1 associates to tRNAs in a manner dependent on both isodecoder and isoacceptor identity, and within these subgroups disparate patterns of CSDE1 affinity to the tRNA structure may be observed. The data lead us to propose a model whereby the stimulatory effect of CSDE1 on translation elongation may be underpinned by the binding of CSDE1 to both its target mRNAs and to tRNAs, thereby concentrating tRNAs towards the translating ribosome.
Les proteïnes d’unió a l’ARN són uns potents reguladors de l’expressió gènica post-transcripcional. D’entre el conjunt d’ARN que es troben units a una proteïna d’unió a l’ARN concreta, podem distingir xarxes d’ARN que es regulen coordinadament, els regulons. Els ARN d’aquests regulons estan funcionalment relacionats i la seva regulació orquestrada promou processos cel·lulars. En el melanoma, la proteïna d’unió a l’ARN CSDE1 està altament sobreactivada. En aquest context, CSDE1 regula la traducció dels seus ARNm diana de manera consistent amb un programa de progressió oncogènica; així, el supressors tumorals com PTEN es troben regulats negativament, mentre que factors pro-metastàtics, per exemple les proteïnes claus en la transició epiteli-mesènquima VIM i RAC1, es regulen positivament. Estudis de ribosome profiling indiquen que CSDE1 promou la traducció de VIM i RAC1 a nivell de l’elongació. Aquesta funció estimulant, duta a terme per a una proteïna d’unió a l’ARN, podria representar un nou mecanisme de regulació de la traducció. En la present tesi busquem clarificar quines proteïnes acompanyen CSDE1 en la inducció de l’efecte estimulatori a nivell de l’elongació traduccional, així com explorar la implicació de CSDE1 en la maquinària traduccional. Hem confirmat que CSDE1 promou la traducció de l’ARNm de RAC1 a nivell de l’elongació, a més a més destaquem que les cèl·lules de melanoma s’adapten ràpidament a la depleció de CSDE1. Demostrem com aquesta proteïna contacta extensivament amb la maquinària traduccional, sent CSDE1 una proteïna associada al ribosoma mitjançant la subunitat petita. D’altra banda, hem observat que co-sedimenta amb polisomes que s’estan traduint. D’un total de 38 proteïnes caracteritzades amb un alt grau de confiança com a proteïnes que interaccionen amb CSDE1, 16 són proteïnes ribosomals i 11 altres són proteïnes que formen part del ribo-interactome. A més a més, CSDE1 s’associa al ARNt, un associació que depèn tant de la identitat dels iso-decodificadors com la dels iso-acceptors, tanmateix, dins d’aquests subgrups s’ha vist que l’afinitat de CSDE1 per a les diferents estructures dels ARNt segueix patrons diferenciats. Aquestes dades ens permeten proposar un model en què l’efecte estimulant de CSDE1 en l’elongació traduccional podria sostenir-se mitjançant l’unió de CSDE1 tant als ARNm diana com als ARNt, tot concentrant aquests últims cap als ribosomes que s’estan traduint

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ROCHE, ELISABETH. « Recherche d'un rythme circadien de la retinol-binding protein chez les sujet agé de sexe féminin ». Aix-Marseille 2, 1989. http://www.theses.fr/1989AIX20363.

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Cook, Neil James. « Le gmp cyclique et la phototransduction chez les vertebres ». Strasbourg 1, 1986. http://www.theses.fr/1986STR13147.

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Hjerdt-Goscinski, Gunilla. « Antibiotic-induced Bacterial Toxin Release – Inhibition by Protein Synthesis Inhibitors ». Doctoral thesis, Uppsala : Acta Universitatis Upsaliensis : Univ.-bibl. [distributör], 2004. http://urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:uu:diva-4692.

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Terrien, Xavier. « Implication de l'Insulin-like Growth Factor Binding Protein-2 dans les processus de lésion/réparation de l'alvéole pulmonaire ». Paris 12, 2005. https://athena.u-pec.fr/primo-explore/search?query=any,exact,990003941690204611&vid=upec.

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Résumé :

La prolifération des cellules épithéliales alvéolaires est un mécanisme cellulaire primordial dans la réparation post-lésionnelle du poumon. Notre équipe a montré antérieurement un lien entre l'expression de l'Insulin-like Growth Factor Binding Protein-2 (IGFBP-2) et la régulation de la prolifération des cellules épithéliales alvéolaires. Nous avons caractérisé l'induction et la colocalisation intracellulaire d'IGFBP-2 et de l'inhibiteur du cycle cellulaire p21CIP1 en réponse à l'inhibition de prolifération dans des lignées cellulaires épithéliales pulmonaires. Nous avons aussi mis en évidence l'implication potentielle d'IGFBP-2 dans la stimulation de la maturation des macrophages alvéolaires. Ces résultats suggèrent l'importance de la protéine IGFBP-2 dans les processus de réparation de l'alvéole pulmonaire. De plus, la découverte d'une interaction directe des IGFBP-2 et -3 avec p21CIP1 suggère un nouveau mécanisme de régulation de la prolifération
Alveolar epithelial cells proliferation plays a major role in lung repair process. Our laboratory has previously reported the involvement of the Insulin-like Growth Factor Binding Protein-2 (IGFBP-2) in the control of type 2 alveolar epithelial cells proliferation. During this work, I have characterized the induction and the intracellular colocalization of IGFBP-2 and the cell cycle inhibitor p21CIP1 in growth-arrested lung epithelial cells. Moreover, I found the implication of IGFBP-2 in the stimulation of alveolar macrophages maturation. Taken together, these data suggest the importance of IGFBP-2 in alveolar repair process. In addition, the identification of a novel direct interaction between IGFBP-2 or -3 and p21CIP1 suggest a new mechanism of cell cycle control

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Terrien, Xavier Henrion-Caude Alexandra. « Implication de l'Insulin-like Growth Factor Binding Protein-2 dans les processus de lésion/réparation de l'alvéole pulmonaire ». Créteil : Université de Paris-Val-de-Marne, 2007. http://doxa.scd.univ-paris12.fr:8080/theses-npd/th0394169.pdf.

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Résumé :

Thèse de doctorat : Biologie cellulaire et moléculaire : Paris 12 : 2005.
Version électronique uniquement consultable au sein de l'Université Paris 12 (Intranet). Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. : 189 réf.

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Aragón, Altarriba Eric. « Smad binding codes broken by WW domain containing proteins = Desxifrant els codis d’unió a Smad de les proteïnes amb dominis WW ». Doctoral thesis, Universitat de Barcelona, 2013. http://hdl.handle.net/10803/129809.

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Résumé :

Cell fate is controlled by a multitude of signals and loss of this control has devastating consequences for living organisms. One of the key players in this network of signals is the TGF-beta family of cytokines. These hormones trigger an immense amount of responses by sending activated Smad transcription factors (Sma and Mad related proteins) to the nucleus where participate in the control of stem cell pluripotency and differentiation, embryo development, tissue regeneration, and differentiated tissue homeostasis (Massagué, 1998). According to their function, Smad proteins are classified as receptor regulated Smads (R-Smads), which include Smads 1, 5 and 8 in the BMP-driven version of the SMAD pathway, and Smads 2 and 3 in the TGF-beta/ Nodal/Activin pathways. R-Smads form complexes with the common co-activator Smad (Co-Smad) Smad4. The SMAD family also contains the two inhibitory Smads (I-Smads), Smad6 and Smad7, which provide critical negative regulation to these powerful and ubiquitous pathways. All Smad proteins are modular (Shi and Massagué, 2003). R-Smads and the Co-Smad consist of two Mad Homology MH1 and MH2 domains connected by a linker that functions as a scaffold upon which other proteins can interact and modulate the functional outcome. This linker contains a conserved cluster of phosphorylation sites adjacent to a PY motif. MH1 domains of R-Smads and Smad4 bind to DNA, whereas the MH2 domain and the linker function as scaffolds for receptors, regulator proteins, and transcription cofactors to interact and determine the outcome of the signal (Shi and Massagué, 2003). Compared to R-Smads and Co-Smads, the I-Smads have low sequence similarity in the MH1 domain but conserve an MH2 domain and a linker region with a characteristic PY motif. The presence of the common regions facilitates the competition of R-Smads and I-Smads for the receptor and ligands and it facilitates the inhibitory role of I-Smads (Figure 1). I-Smads are expressed in response to TGF-β or BMPs to provide negative feedback in the pathway (Bai and Cao, 2002; Hata et al., 1998; He et al., 2002; Kavsak et al., 2000; Nakao et al., 1997; Yan and Chen, 2011) and in response to other pathways such as STAT to oppose TGF-β signaling (Ulloa et al., 1999). Smad6 interferes with the formation of Smad1-Smad4 complexes (Hata et al., 1998) whereas Smad7 interferes with the formation of R-Smads-Smad4 complexes and inhibits TGF-β and BMP receptors (Hayashi et al., 1997; Topper et al., 1998). Several key phosphorylations drive the Smad signaling process. The ligand cytokines activate receptor serine/threonine protein kinases that phosphorylate Smad proteins at the C-terminus. The BMP receptors act on Smads 1, 5 and 8 and the receptors for the TGF-beta /nodal/activin/myostatin group of ligands act mainly on Smads 2 and 3 (Shi and Massagué, 2003). The phosphorylated C-terminus provides a binding site for Smad4, which is an essential component in the assembly of target-specific transcriptional complexes. These phosphorylations are reversed by protein phosphatases that limit the general pool of activated Smad molecules (Inman et al., 2002; Lin et al., 2006; Schmierer et al., 2008; Xu et al., 2002).

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Millery, Julie. « Une adaptation du système olfactif au milieu aérien : les Olfactory-Binding Protein (OBP) chez Xenopus laevis et Xenopus tropicalis ». Dijon, 2009. http://www.theses.fr/2009DIJOS047.

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Résumé :

Les Olfactory-binding protein (OBP), sont des protéines largement retrouvées dans le mucus olfactif d’un grand nombre de vertébrés mais elles n’ont cependant jamais été mises en évidence chez le poisson. Assez peu de choses sont connues sur leur fonction exacte au sein du système olfactif mais un rôle dans l’adaptation de ce système au milieu aérien est fortement suspecté. Le xénope possède un double système olfactif composé de deux cavités l’une dédiée à l’olfaction aquatique (CM) et l’autre dédiée à l’olfaction aérienne (CP). Cette particularité nous a permis de tester notre hypothèse. Nous avons pour la première fois caractérisée des OBP chez X. Laevis et X. Tropicalis. Grâce aux techniques de transcription inverse et de RACE 3’, deux produits ont été clonés et séquencés. Ces clones ont été utilisé afin d’étudier les patrons d’expression de ces protéines au niveau du système olfactif de ces deux espèces par HIS et immunocytochimie. Les transcrits et les protéines ont été localisés uniquement au niveau de la cavité aérienne de ces deux espèces soutenant donc l’idée que ces protéines seraient impliquées dans une adaptation du système olfactif au milieu aérien. De plus, suite à une étude réalisée sur une banque de gènes étiquetés, nous avons mis en évidence l’existence d’un second gène d’OBP présent chez X. Laevis uniquement et pas chez X. Tropicalis
Olfactory Binding Proteins (OBP), commonly associated with aerial olfaction, are currently found in mammals olfactory mucus, but have never been identified in fish. It is not clear yet if OBP is an adaptation of the olfactory system to an aerial environment. Adult olfactory system Xenopus is organized into two olfactory chambers which are thought to be devoted respectively to aquatic (MC) and aerial olfaction (PC). This specificity provides us the opportunity to test this alternative hypothesis. We have identified for the first time Olfactory Binding Protein in Xenopus laevis and tropicalis. By a reverse transcription and 3’ RACE strategy two products were cloned and sequenced. These cloned sequences were used to analyse the expression pattern of the gene by HIS and immunocytochemistry in the olfactory system of two Xenopus species: X. Laevis and X. Tropicalis. The transcripts and the proteins are only present in the aerial chamber supporting the idea that OBPs are an adaptation to aerial olfaction. Moreover, from an EST (expressed sequence tag) library we also demonstrated that X. Laevis has 2 different OBP genes while X. Tropicalis has only one gene

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Combe, Hervé. « Place du dosage de l'insulin-like growth factor binding protein-3 dans les marqueurs d'évolutivité de l'acromégalie : à propos d'une série de 48 acromégales ». Tours, 1995. http://www.theses.fr/1995TOUR3013.

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Brimau, Fanny. « Rôle des odorants-binding protein dans le mécanisme de transduction olfactive : implication de modifications post-traductionnelles dynamiques dans la spécificité de liaison avec les ligands ». Thesis, Tours, 2010. http://www.theses.fr/2010TOUR4038/document.

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Résumé :

Les OBP sont des petites protéines solubles qui se lient avec des molécules odorantes et phéromonales. Le rôle des OBPs n’est pas complètement compris. Une hypothèse suggère que l’OBP solubilise et transporte les ligands aux récepteurs olfactifs et la liaison entre les molécules odorantes et l’OBP est non spécifique. Une autre hypothèse suggère que le complexe formé est une liaison spécifique entre une molécule odorante donnée et une OBP spécifique. Ce travail de thèse montre que les OBPs sont impliquées dans la première étape de la discrimination des odeurs. Dans un premier temps, nous avons montré l’implication de la Phe35 et la Tyr 82 dans la sortie du ligand par l’OBP. Dans un second temps, nous avons mis en évidence la présence de différentes isoformes d’OBP et de VEG qui diffèrent par les modifications post-traductionnelles (phosphorylation et GlcNAcylation) a la fois sur les protéines natives extraites de la muqueuse respiratoire et sur les protéines recombinantes produites par P.pastoris et CHO. Ces isoformes sont capables de discriminer des molécules odorantes et phéromonales. Les OBPs ne sont pas des transporteurs passifs car elles assurent un fin codage des molécules odorantes ou phéromonales avant l’interaction de ce complexe avec un récepteur spécifique
OBPs are small soluble proteins that bind with odorant molecules and pheromones. The role of OBP is not completely understood. A hypothesis suggests that OBP solubilize and transport the ligands to olfactory receptors and the binding between odorant molecule and OBP is unspecific. An other hypothesis suggest that the complex formed is the specific binding between a given odorant molecule and a specific OBP. This work of thesis show that OBP are involved in the first step of odorant discrimination. Initially, we have showed the involvement of the Phe35 and Tyr 82 in the uptake of ligands by OBP. Second, we have given rise to the presence of various isoform of OBP and VEG that differ by post-translational modifications (phosphorylation and GlcNAcylation) both on natives proteins extract of respiratory mucosa and on recombinants proteins produce by P. pastoris and CHO. These isoforms are able to discriminate of odorant molecules and pheromones. OBPs are not passives carriers because they ensure a fine coding of odorant molecules and pheromones before interaction of this complex with specific receptor

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Taha, Mohammed. « L'utilisation de cellules natural killer (NK) comme outil thérapeutique : étude clinique de phase 1 de perfusion de cellules NK du donneur après HSCT : Annexe : Pumilio 2, une protéine de liaison à l'ARN surexprimée dans les cellules NK de patients atteints de LAM, réprime les fonctions des cellules NK ». Thesis, Aix-Marseille, 2018. http://www.theses.fr/2018AIXM0233.

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Résumé :

Les cellules Natural Killer (NK) sont jouent un rôle essentiel dans la surveillance des hémopathies malignes. Cependant, les cellules tumorales développent des mécanismes immunosuppresseurs pour échapper à l'immunité cellulaire NK. Ainsi, le maintien ou l'amélioration des performances des cellules NK sont considérés comme des défis majeurs. Les objectifs de cette partie étaient d'évaluer l'impact de la perfusion de cellules NK activées sur la récupération et la biologie des cellules NK circulantes après l'allo-SCT. Des doses croissantes de cellules NK activées par IL-2 ex-vivo ont été perfusées chez des patients atteints de tumeurs malignes hématologiques 3 mois après allo-SCT. Nos résultats ont montré une fréquence plus élevée des cellules NK dans la périphérie des patients traités. Bien que le phénotype immature soit remarquable peu après le traitement, les cellules NK circulantes, présentaient un état d'activation avec un profil de maturation amélioré après 6 mois de traitement. Nous avons également constaté que l'expression des récepteurs NK activateurs (NKG2D, NKp30 et NKp46) augmentait sur les cellules NK circulantes des patients. De plus, ces cellules ont montré une augmentation significative de la capacité de dégranulation ainsi que de la sécrétion de cytokines (IFN-Ƴ et TNF-α) tout au long de l'étude. Ces différences ont notamment été observées chez les patients ayant reçu des doses plus importantes de cellules NK activées. En conclusion, nous supposons que la perfusion de fortes doses de cellules NK activées ex-vivo pourrait être associée à l'amélioration du phénotype et des fonctions des cellules NK au cours de la reconstitution immunitaire après allo-SCT
Natural killer (NK) cells are effector lymphocytes of the innate immune system that have the ability to kill transformed cells. They play a critical role in hematological malignancies surveillance, however, tumor cells develop immunosuppressive mechanisms to escape NK cell-mediated killing. So, maintaining or improving NK cell performance is considered a major challenge. Our goals are to evaluate the impact of activated NK cells infusion on the recovery and biology of circulating NK cells post allo-SCT.Three different doses (dose 1: 106 NK cell/Kg, n=3; dose 2: 5x106 NK cell/Kg, n=7; dose 3: >5x106 NK cell/Kg, n=6) of ex-vivo IL-2 activated NK cells were infused into patients with hematological malignancies after all-SCT. Our results showed higher frequency of NK cells in the periphery of patients treated with larger doses of activated NK cells. Although the notable immature phenotype shortly after treatment, the circulating NK cells in patients receiving larger doses of activated NK cells displayed more activation status with improved maturation profile after 6 months of treatment. We also found that the expression of activating NK receptors (NKG2D, NKp30, and NKp46) augmented on circulating CD56dim NK cells of patients receiving larger doses of activated NK cells. Moreover, these cells showed a significant increase in degranulation capacity as well as cytokine secretion (IFN-Ƴ and TNF-α) throughout study period. In conclusion, we hypothesize that infusion of high-dose of ex-vivo activated NK cells could be associated with improvements of NK cell phenotype and function during immune reconstitution after allo-SCT

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Marty, Loic. « Structures et spécificités de Protéines Périplasmiques de Fixation pour les mannityl-opines chez Agrobacterium tumefaciens ». Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS238/document.

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Résumé :

L’agent pathogène Agrobacterium tumefaciens induit, chez les plantes, le développement de tumeurs dans lesquelles il prolifère, en intégrant un fragment de son plasmide Ti de virulence dans le génome de son hôte. Les tissus transformés synthétisent des composés originaux, appelés opines, qui sont utilisés comme nutriments spécifiques par la bactérie. Une vingtaine d’opines sont connues à ce jour, et chacune d’elle peut être métabolisée par des souches d’Agrobacterium tumefaciens possédant les gènes de transport et de catabolisme qui lui sont associés, ce qui apparait comme un avantage compétitif dans la colonisation de la tumeur. La présence de ces gènes dépend du type de plasmide Ti que la souche pathogène possède.Agrobacterium tumefaciens B6 possède un pTi de type octopine, qui porte les gènes de métabolisme des mannityl-opines, qui sont la mannopine, l’acide mannopinique, l’agropine et l’acide agropinique. La mannopine et l’acide mannopinique sont synthétisés par la même enzyme, et ont pour précurseurs respectivement la désoxy-fructosyl-glutamine (DFG) et le désoxy-fructosyl-glutamate (DFGA), tous deux opines de la famille de la chrysopine. La DFG est aussi un composé d’Amadori répandu et assimilable par de nombreux organismes. La mannopine sert de précurseur pour la synthèse de l’agropine. Enfin, la mannopine, l’acide mannopinique et l’agropine peuvent toutes trois se lactamiser spontanément en acide agropinique.Malgré la similarité chimique de ces quatre opines, chacune est transportée par une protéine périplasmique de fixation (PBP) associée à un transporteur ATP-binding Cassette (ABC) différent. La PBP sélectionne et fixe une opine pour l’apporter au transporteur ABC, qui permet le passage de l’opine dans le cytoplasme grâce à l’hydrolyse de deux molécules d’ATP. La spécificité du transporteur entier est déterminée par la PBP.Des études génétiques chez des souches possédant un pTi de type octopine ont montré que le système PBP-transporteur ABC AgaABCD est spécifique de l’acide agropinique, AgtABCD spécifique de l’agropine, MoaABCD spécifique de l’acide mannopinique et que MotABCD transporte la mannopine et également l’acide mannopinique. Chez la souche C58, qui ne possède pas un pTi de type octopine, le système de transport SocAB, codé par des gènes situés sur le plasmide cryptique At, transporte la DFG comme nutriment, et semble aussi capable d’importer la mannopine.Mon travail de thèse a permis, dans un premier temps, de caractériser les fortes affinités et la spécificité des PBP AgaA et AgtB pour l’acide agropinique, de la PBP MoaA pour l’acide mannopinique et de la PBP SocA pour la DFG, mais aussi la non spécificité de MotA pour la mannopine, l’acide mannopinique et la DFG, ce qui remet en question les affinités précédemment décrites pour AgtB et SocA. Dans un deuxième temps, ce travail a apporté les bases moléculaires et structurales des complexes PBP-mannityl-opines, complexes jamais caractérisés auparavant. Enfin, dans un troisième temps, la structure de la PBP AttC chez la souche C58, annotée comme mannopine-like, a été déterminée, et les expériences d’interaction ont montré qu’elle n’interagit avec aucune mannityl-opine, ce qui conduit à une révision de son annotation.Mes travaux apportent un éclairage nouveau sur l’import des mannityl-opines chez Agrobacterium tumefaciens. Le fait qu’aucun des transporteurs étudié ne permette l’import de l’agropine laisse penser qu’il existe une autre PBP ou un autre système de transport encore inconnu assurant cette fonction, ouvrant la voie vers de nouvelles études sur les pTi de type octopine et agropine
Agrobacterium tumefaciens pathogenic agent confers the development of tumors in plants, in which it proliferates, integrating a fragment of its virulence Ti plasmid into its host genome. Transformed tissues synthesize original compounds, called opines, used as specific nutrients by the bacterium. More than twenty opines are known so far, and each one of them can be metabolized by A. tumefaciens strains possessing its associated transport and catabolism genes, which appears as a competitive advantage in the tumor colonization. The presence of these genes relies on the Ti plasmid type a pathogenic strain possesses. A. tumefaciens B6 possesses an octopine-type pTi, which harbors the metabolism genes of the mannityl-opines, which are mannopine, mannopinic acid, agropine and agropinic acid. Mannopine and mannopinic acid are synthesized by the same enzyme, and their precursors are deoxy-fructosyl-glutamine (DFG) and deoxy-fructosyl-glutamate (DFGA) respectively, both opines of the chrysopine family. DFG is also a wide-spread Amadori compound which can be uptaken by numerous organisms. Mannopine is a precursor for agropine synthesis. Finally, mannopine, mannopinic acid and agropine can spontaneously lactamize into agropinic acid.Despite the chemical similarity of these four opines, each one is transported by a different periplasmic binding protein (PBP) associated with an ATP-binding cassette (ABC) transporter. The PBP selects and binds one opine to bring it to the ABC transporter, which allows the passage of the opine to the cytoplasm due to two ATP molecules hydrolysis. The whole transporter specificity is determined by the PBP.Genetic studies in strains possessing an octopine-type pTi showed that AgaABCD PBP-ABC transporter system is specific to agropinic acid, AgtABCD to agropine, MoaABCD to mannopinic acid and that MotABCD transports mannopine and also mannopinic acid. In C58 strain, which do not possess an octopine-type pTi, SocAB transport system, coded by genes located on the cryptic pAt plasmid, allows the transport of DFG as a nutrient, and seems able to import mannopine too.My thesis work allowed, first, to characterize the strong affinities and the specificity of PBPs AgaA and AgtB to agropinic acid, PBP MoaA to mannopinic acid and PBP SocA to DFG, and also MotA unspecificity toward mannopine, mannopinique acid and DFG, which leads to a revision of the previously described affinities of AgtB and SocA. Secondly, this work brought molecular and structural basis of PBP-mannityl-opine complexes, never described before. Finally, the structure of PBP AttC, annotated as a mannopine binding-like protein in C58, was determined, and interactions experiments showed that it binds no mannityl-opines, leading to a revision of its annotation.My work sheds light on the mannityl-opines importation in Agrobacterium tumefaciens. The fact that none of the studied transport system allows agropine import lets think that there is another unknown PBP or another unknown whole transport system assuming this role, opening new ways to new studies about octopine- and agropine-type pTis

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Roussel, Céline. « Etude du rôle des chélateurs calciques sur les oscillations du potentiel membranaire neuronal : approche expérimentale et théorique ». Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 2006. http://hdl.handle.net/2013/ULB-DIPOT:oai:dipot.ulb.ac.be:2013/210854.

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Résumé :

Les neurones sont des cellules excitables capables de coder et transmettre l’information sous forme d’oscillations du potentiel membranaire. Cette activité électrique est produite par une modification des flux ioniques transmembranaires. Les neurones constituent un exemple d’oscillateur cellulaire dont la dynamique non linéaire permet l’apparition d’une activité électrique complexe. Dans ce système, les ions calciques sont des messagers intracellulaires importants. Ils servent de médiateur entre un signal électrique et un signal chimique, par une modulation de l’activité enzymatique de certaines protéines. Ils interviennent dans de nombreuses fonctions neuronales, dont l’excitabilité électrique. Un des mécanismes mis en place par les neurones pour contrôler l’homéostasie du calcium intracellulaire provient de protéines cytoplasmiques capables de lier les ions calciques. Ces protéines jouent un rôle de « tampon » du calcium. Cependant, toutes leurs fonctions n’ont pas encore été mises en évidence. C’est l’objectif de notre travail. Nous avons voulu comprendre le rôle joué par une protéine « tampon » particulière, la calrétinine, sur le mode de décharge électrique d’un neurone où elle est exprimée en abondance, le grain cérébelleux. Pour cela, nous avons utilisé une approche théorique et expérimentale.

Au niveau théorique, nous avons élaboré un modèle mathématique de l’activité électrique du grain cérébelleux, prenant en compte la chélation du calcium intracellulaire. Il permet de clarifier le rôle de la chélation du calcium intracellulaire sur les oscillations du potentiel membranaire. La modélisation de l’activité électrique du grain cérébelleux repose sur le formalisme développé par Hodgkin et Huxley pour l’axone géant de calmar. Dans ce contexte, l’application de la conservation de la charge au circuit équivalent de la membrane cellulaire fournit un système d’équations différentielles ordinaires, non linéaires. Dès lors, notre modèle nous a permis d’étudier l’impact des variations de la concentration de chélateur calcique sur les oscillations du potentiel membranaire. Nous avons ainsi pu constater qu’une diminution de la concentration en chélateur calcique induisait une augmentation de l’excitabilité électrique du grain cérébelleux, sans altérer le régime d’oscillations. Par contre, en augmentant fortement la concentration en chélateur calcique, nous avons montré que le grain cérébelleux changeait de dynamique oscillatoire, montrant des transitions d’un mode de décharge périodique régulier vers des oscillations en salve du potentiel membranaire.

Au niveau expérimental, nous avons vérifié les résultats prévus par le modèle théorique. Nous avons ainsi montré que des grains de souris transgéniques déficientes en calrétinine présentaient une excitabilité électrique accrue par rapport aux grains contrôles.

Puis, en restaurant un niveau de chélation calcique normal dans ces grains, par perfusion intracellulaire de chélateur calcique, nous montrons qu’ils retrouvent un niveau d’excitabilité normal. Ensuite, nous avons introduit dans des grains cérébelleux de souris sauvages, une forte concentration en chélateur calcique exogène. Conformément aux résultats théoriques, nous avons pu observer des transitions vers des oscillations en salve du potentiel membranaire. Enfin, nous avons montré que l’absence de calrétinine affecte les paramètres morphologiques du grain cérébelleux des souris transgéniques déficientes en calrétinine.

En conclusion, ces résultats suggèrent que le mode de décharge des cellules excitables peut être modulé d’une façon importante par les protéines liant le calcium. De ce fait, des changements dans le niveau d’expression et/ou dans la localisation subcellulaire des protéines liant le calcium pourraient aussi jouer un rôle critique dans la régulation de processus physiologiques contrôlés par l’excitabilité membranaire. De plus, les mécanismes que nous avons mis en évidence pourraient être à l’origine d’un nouveau principe de régulation de la signalisation dans les circuits neuronaux et pourraient jouer un rôle fonctionnel dans le contrôle du codage de l’information et de son stockage dans le système nerveux central.
Doctorat en sciences, Spécialisation physique
info:eu-repo/semantics/nonPublished

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Le, Bras Morgane. « Rôle des protéines de liaison à l'ARN hnRNP H et hnRNP F dans les régulations traductionnelles dans les glioblastomes ». Thesis, Toulouse 3, 2018. http://www.theses.fr/2018TOU30277.

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Résumé :

Le glioblastome multiforme (GBM) est une tumeur cérébrale extrêmement agressive associée à un mauvais pronostic. C'est pourquoi, il apparaît nécessaire d'identifier les mécanismes moléculaires participant au développement des GBM ainsi qu'à leurs résistances aux traitements afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Récemment, il a été montré que les régulations traductionnelles jouent un rôle fondamental dans les propriétés agressives du GBM. Les protéines de liaison à l'ARN (RBP) sont des acteurs majeurs de ces régulations dont l'expression/activité est altérée dans les GBM. Les RBP hnRNP HF (HF) font partie des RBP les plus surexprimées dans les GBM et leur contribution dans la régulation traductionnelle des GBM n'a encore jamais été investiguée. Nous avons émis l'hypothèse que hnRNP H et hnRNP F soient au centre d'un réseau de régulations post-transcriptionnelles impactant la machinerie traductionnelle qui contrôle le développement tumoral et la résistance aux traitements des GBM. Nos résultats montrent qu'HF régulent la prolifération et la réponse aux traitements car leur perte d'expression (i) diminue la prolifération des GBM (modèle cellulaire, sphéroïde et xénogreffes in vivo), (ii) active les voies de réponse aux dommages à l'ADN et (iii) sensibilise les cellules de GBM aux irradiations. De plus, nous avons identifié un nouveau rôle pour HF en tant que régulateurs de la traduction. En effet, nos données montrent que les hnRNP HF contrôlent la traduction d'un ensemble d'ARNm en régulant l'expression et l'activité de facteurs d'initiation ainsi qu'en collaborant avec des ARN hélicases partenaires en ciblant des ARNm impliqués dans des processus reliés au développement tumoral et la résistance aux traitements possédant des structures secondaires G-quadruplexe dans leurs 5'UTR. Les données que nous avons générées suggèrent que hnRNP H et hnRNP F sont des régulateurs traductionnels essentiels au développement tumoral et à la résistance aux traitements des GBM
Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most aggressive brain tumors with poor prognosis. Understanding the molecular mechanisms involved in the development and resistance to treatments of gliomas could improve treatment efficiency. Recently, it has been demonstrated that translational regulations play a key role in the GBM aggressivity. RNA binding proteins (RBP) are major regulators of these processes and have altered expression / activity in GBM. The RBP hnRNP H and hnRNP F (HF) are among the most overexpressed RBP in GBM and their role in GBM translational regulation has never been investigated yet. We hypothesize that HF are at the core of a post-transcriptional regulation network which impacts the translational machinery that controls GBM tumor development and resistance to treatment. We have demonstrated that hnRNP H and hnRNP F regulate proliferation and response to treatment because their depletion (i) decreases the GBM proliferation (cell line model, spheroid and in vivo xenografts), (ii) activates the DNA damage response pathways and (iii) sensitizes the GBM cells to irradiation. We have identified HF as new regulators of GBM translation. Indeed, our data show that hnRNP H and hnRNP F control mRNA translation by regulating expression/activity of initiation factors and in collaboration with RNA helicases by targeting mRNA involved in oncogenic processes and containing secondary structures called G-quadruplex in their 5'UTR. The data that we have generated suggest that HF are essential translational regulators involved in tumor development and resistance to treatment in GBM

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Chesnel, Laurent. « Conséquences stucturales et fonctionelles de mutations ponctuelles chez les "penicillin-binding proteins" mosai͏̈ques issues de souches de streptococcus pneumoniae résistantes aux beta-lactamines ». Université Joseph Fourier (Grenoble), 2003. http://www.theses.fr/2003GRE19014.

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Yankovsky, Igor. « Évaluation de l'activité photodynamique des photosensibilisants de type chlorine avec les nanovecteurs cyclodextrines-β ». Thesis, Université de Lorraine, 2016. http://www.theses.fr/2016LORR0171/document.

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Résumé :

La thérapie photodynamique (PDT) est un traitement minimalement invasif basé sur une approche photochimique. Ce traitement est prometteur en oncologie et pour d’autres pathologies. La plupart des drogues utilisées en PDT (photosensibilisateurs) y compris le PS de seconde génération, la méta-tétra (hydroxyphényl)chlorine (mTHPC), sont hautement hydrophobiques et nécessitent un système de transport. Pour améliorer la solubilité de la mTHPC et ses propriétés pharmacocinétiques, les dérivés des β-cyclodextrines (β-CDs) ont été proposés. L’étude présente a analysé l’effet des β-CDs sur le comportement de la mTHPC à différentes étapes de sa distribution in vitro et in vivo. L’interaction de la mTHPC avec les β-CDs conduit à la formation de complexes d’inclusion qui abolissent complètement son agrégation après introduction dans le sérum. Il a été démontré que les β-CDs ont un effet lié à la concentration sur le processus de distribution de la mTHPC dans le sérum sanguin et les cultures cellulaires in vitro. L’étude in vivo confirme le fait que l’utilisation de β-CDs permet de modifier les processus de distribution de la mTHPC chez les animaux porteurs de tumeurs, ce qui se traduit par un taux moins élevé d’accumulation du PS dans la peau et les muscles, ainsi qu’une accumulation plus élevée du PS dans la tumeur. En conclusion, l’application des dérivés β-CDs peut ouvrir de nouvelles possibilités pour modifier et contrôler la biodistribution et les pharmacocinétiques de la mTHPC au cours de la PDT
Photodynamic therapy (PDT) is a minimally invasive photochemical treatment with a promising clinical track record for oncological and some other diseases. Most PDT-drugs (photosensitizers) including a second-generation PS meta-tetra(hydroxyphenyl)chorin (mTHPC) are highly hydrophobic and require delivery systems. To improve mTHPC solubility and pharmacokinetic properties, β-cyclodextrins (β-CDs) derivatives were proposed. The present study investigates the effect of β-CDs on mTHPC behavior at various stages of its distribution in vitro and in vivo. Interaction of mTHPC with β-CDs leads to the formation of inclusion complexes that completely abolishes its aggregation after introduction into serum. It was demonstrated that the β-CDs have a concentration-dependent effect on the process of mTHPC distribution in blood serum and cellular cultures in vitro. In vivo study confirms the fact that the use of β-CDs allows modifying mTHPC distribution processes in tumor bearing animals that is reflected in the decreased level of PS accumulation in skin and muscles, as well as in the increased PS accumulation in tumor. In conclusion, application of β-CD derivatives can open up new possibilities to modify and control biodistribution and pharmacokinetics of mTHPC in the course of PDT

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Djeghader, Ahmed. « Etude structurale et fonctionnelle des phosphates-binding proteins : Illustration avec les protéines ding et ding-like et leur implication dans l'infection /inhibition du Vih ». Thesis, Aix-Marseille, 2013. http://www.theses.fr/2013AIXM4073.

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Résumé :

L’acquisition du phosphate du milieu extracellulaire est un processus biologique primordial pour toute les cellules vivantes. Durant ce travail nous nous sommes intéressé à deux famille de phosphate-binding proteins, les protéines DING et DING-like. Les protéines DING sont des protéines ubiquitaires nommées ainsi en raison de leur extrémité N-terminal très conservée DINGGG-. Bien que largement représentées chez les bactéries, ces protéines ont été identifiées initialement chez l’homme en vertu de leurs propriétés biologiques ou leur implication dans les maladies, y compris dans l’inhibition du VIH. La présence chez l’homme de telles protéines soulève plusieurs questions quant à leur rôle lors de l’infection par ce virus. Nous avons entrepris une étude visant à quantifier ces protéines chez une population d’individus infectés par le VIH. Nos résultats montrent une augmentation surprenante de leur concentration chez ces derniers par rapport aux sujet sains. D’autre part, nos travaux sur les protéines DING nous ont amené à nous intéresser à la famille des DING-like, très proche de la famille des protéines DING. Inversement, les protéines DING-like sont exclusivement bactériennes. En plus de leur capacité à fixer le phosphate, certains membres de cette famille semblent jouir d’une activité phosphatase. Durant ce travail nous avons caractérisé structuralement et enzymatiquement deux représentants de ces protéines isolés à partir de Pseudomonas aeruginosa. L’analyse structurale de ces protéines ainsi de la caractérisation de leurs activités pourraient être d’un grand intérêt afin de comprendre leur rôle dans le schéma d’acquisition du phosphate chez cette bactérie
Phosphate acquisition from the extracellular environment is a key process for all living cells. In bacteria, its importation is ensured, in part, by high affinity phosphate binding proteins (PBP). During this work, we are interested to two families of PBPs named DING and DING like proteins. DING proteins are ubiquitous proteins, so named due to their highly conserved N-terminal sequence DINGGG-. Although widely represented in bacteria, these proteins were initially identified in human by virtue of their biological properties or their involvement in diseases, including in HIV-inhibition. Currently, the anti-HIV activity has been shown for two human members of the DING family, HPBP and X-DING CD4. The presence in human of such proteins raises numerous questions about their role during HIV-infection. Thus, we undertook a study to evaluate their serum concentration in HIV-infected patients. Our results shows a surprising increase of the concentration of DING proteins in this population, compared to controls. On the other hand, our work on the DING proteins family led us to be interested on the family of DING-like proteins, closely related to the DING family. Unlike DING proteins, DING-like members were identified exclusively in bacteria. In addition to their ability to bind phosphate, some DING-like members appear to have a phosphatase activity. In this work we have characterize structurally and enzymatically two members of this family isolated from Pseudomonas aeruginosa. The structural analysis of these proteins combined with activities characterization could be of a great interest in order to understand their role in phosphate acquisition in this bacterium

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Karsenty, Julie. « Les Isoformes intestinales et hépatiques des "fatty acid binding proteins" dans le trafic intracellulaire des acides gras et leur expression dans un modèle animal de syndrome métabolique ». Aix-Marseille 2, 2008. http://www.theses.fr/2008AIX20697.

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Résumé :

La consommation excessive de graisses est aujourd’hui l’une des causes principales de l’augmentation de la prévalence des maladies métaboliques. Après leur hydrolyse, les graisses sont absorbées par les ente��rocytes sous forme d’acides gras (AG) et de monoglycérides qui sont pris en charge dans la cellule par de petites protéines cytosoliques, les FABPs. L’entérocyte exprime la I- FABP et la L-FABP dont la fonction spécifique dans le trafic intracellulaire des AG est toujours mal connue. Pour appréhender les relations structure-fonction in vivo, la caractérisation immunocytochimique de cellules Cos-1 transfectées exprimant de grandes quantités de FABPs a été réalisée. Ces protéines ciblent l’AG vers des sites de métabolisation (mitochondries ou réticulum endoplasmique / appareil de Golgi). Lorsque chaque protéine est exprimée isolément dans la cellule, elle distribue de façon spécifique un analogue fluorescent d’AG, suggérant une fonction propre pour chacune. Mais lorsqu’elles sont toutes deux présentes, elles coopèrent pour la distribution de l’AG dans des régions comparables à celles ciblées par la seule I-FABP suggérant un rôle de sensor pour cette protéine. Ce travail a été poursuivi en montrant que les régulations de l’expression de la I-FABP et de la L-FABP différaient dans un modèle de syndrome métabolique induit par un régime riche en fructose chez le rat. Dans ce modèle, nous avons aussi analysé les effets de l’apport dans le régime des AG polyinsaturés oméga 3 sur l’expression de gènes impliqués dans le métabolisme énergétique et l’inflammation. Un rôle spécifique de PPAR delta dans le foie et le cœur a pu être mis en évidence
Excessive consumption of fat has emerged as a major cause of increased prevalence of metabolic diseases. After their hydrolysis in the intestinal lumen, fatty acid (FA) and monoglycerides are absorbed by the enterocytes. Inside these cells FA are bound to small cytosolic proteins, the FABPs, before to be re-esterified into triglycerides then secreted as lipoproteins into the chyle. Enterocytes express I-FABP and L-FABP whose specific role in intracellular FA trafficking is still unknown. To clarify this point we have carried out an in vivo structure-function study by immunocytochemical characterization of transfected Cos-1 cells expressing large amounts of proteins. These proteins target a fluorescent FA to cellular sites of metabolism (mitochondria and endoplasmic reticulum / Golgi apparatus). When each protein is expressed within the cell, the fluorescent bound-FA is specifically distributed, suggesting a specific function. Conversely, when both proteins are present they cooperate for the distribution of the FA in similar areas than those targeted by the I-FABP expressed alone suggesting a sensor role for this protein. Another approach has been to show that the regulation of the expression of I-FABP and L-FABP differed in the rat model of metabolic syndrome induced by a fructose-enriched diet. To enlarge our knowledge of this model, the effects of polyunsaturated omega-3 FA intake on the expression of genes involved in energetic homeostasis and infammatory pathways were described. A specific role of PPAR delta in the liver and the heart was evidenced

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Chatagnon, Amandine. « Spécificité de liaison et de répression de la " Methyl-CpG-Binding Domain protein 2 " (MBD2) : identification de gènes cibles impliqués dans les cancers ». Phd thesis, Université Claude Bernard - Lyon I, 2009. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00603777.

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Résumé :

De nombreux gènes suppresseurs de tumeurs sont inactivés par hyperméthylation dans les cancers. Cette inactivation serait en partie initiée par la protéine, MBD2 (Methyl-CpG-Binding Domain protein 2). Cette protéine recrute au niveau de séquences méthylées des complexes enzymatiques capables de modifier la structure chromatinienne et crée ainsi des régions fonctionnellement inactives. Dès lors, ce répresseur apparaît être une cible potentielle pour combattre le cancer. Dans cette perspective, rechercher les cibles de MBD2 et comprendre sa capacité à contrôler l'expression génique semblent cruciales. Au cours de deux études gènes candidats, nous avons pu démontrer (i) une réelle spécificité de cible du répresseur méthylationdépendant MBD2 pour les loci hTERT et pS2/TFF1 ; et (ii) un nouveau rôle de la protéine MBD2 en tant que modulateur de l'expression génique. De plus, les actions antagonistes entre le répresseur MBD2 et le trans-activateur naturel du gène pS2, le récepteur aux oestrogènes α, ont été explorées. Puis, l'analyse globale des profils de distribution de MBD2, de la méthylation de l'ADN, ainsi que de l'ARN polymérase II, sur puce promoteur a montré que MBD2 possède toutes les caractéristiques d'un répresseur trancriptionnel méthylation-dépendant. En effet, 74% des promoteurs fixés par MBD2 sont méthylés et cette liaison est associée dans 65% des cas à une répression transcriptionnelle.

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Torossian, Avédis. « Contrôle de l'expression de Bcl-2 dans les lymphomes anaplasiques à grandes cellules par la protéine HuR en réponse au crizotinib : impact sur l'apoptose et l'autophagie ». Thesis, Toulouse 3, 2017. http://www.theses.fr/2017TOU30190/document.

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Résumé :

Les lymphomes anaplasiques à grandes cellules (LAGC) sont des lymphomes non-hodgkiniens dits de type T ou nul, représentant la majorité des lymphomes T pédiatriques (20 à 30%). Dans plus de 80% des cas, une translocation chromosomique réciproque aboutissant à l'expression anormale de protéines chimères de type X-ALK qui arborent constitutivement et de manière anormale l'activité tyrosine-kinase ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) est le moteur de la tumorigenèse (LAGC dits "ALK+ "). L'une des particularités de ces lymphomes, mise en évidence par mon équipe, est le fait que B-Cell Lymphoma-2 (BCL-2) demeure indétectable dans les cas ALK+ contrairement aux cas ALK-. Ce point est d'autant plus surprenant que BCL-2, oncogène largement établi comme prototype de protéines anti-apoptotiques ainsi que régulateur clé de l'autophagie, est fortement surexprimé dans la majorité des lymphomes. A l'inverse, Human Antigen R (HuR) est surexprimée dans les LAGC (comme dans la plupart des cancers). Il a été démontré que cette protéine de liaison aux ARN participait au maintien du phénotype tumoral, et que sa localisation subcellulaire et ses fonctions dépendaient étroitement de son statut de phosphorylation, lequel est régulé par ALK dans les LAGC ALK+. Au niveau du cytoplasme, HuR permet de stabiliser et d'augmenter la traduction d'ARNm possédant, dans leur région 3'-UTR, des séquences riches en adénine et uridine (AU-rich elements, "ARE"). De manière plus générale, HuR a la capacité de dialoguer avec les microARNs (miARN), soit en empêchant leur action par compétition, soit à l'inverse en coopérant avec ces derniers et en promouvant ainsi leur fonction de régulateur négatif sur certains transcrits cibles communs. Le transcrit Bcl-2, dont l'expression est réprimée dans les LAGC ALK+, fait partie des cibles potentielles de HuR. Au cours de ma thèse, j'ai ainsi cherché à comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la répression de l'expression de Bcl-2, en me focalisant sur le rôle de HuR et de miARN "partenaires" dans ce processus. Mes données semblent indiquer que ce mécanisme implique le recrutement par HuR du miR-34a sur l'ARNm Bcl-2, conduisant à la mise en silence de ce dernier. A l'inverse, quand l'activité tyrosine- kinase de ALK est inhibée, l'interaction entre HuR et le transcrit Bcl-2 diminue, ce qui limite le recrutement de miR-34a et conduit à une restauration de l'expression de cette oncogène majeur dans les cellules lymphomateuses. Dans le contexte des essais cliniques d'inhibiteurs ciblant l'activité tyrosine kinase de ALK tels que le Crizotinib, la question de cette ré-expression de BCL-2 éclaire d'une lumière nouvelle certains échecs thérapeutiques subis par cette molécule pourtant prometteuse. Je me suis donc également consacré, pendant ma thèse, à l'étude des conséquences de cette ré-expression de BCL-2 sur les LAGC ALK+ traités par le Crizotinib. Les résultats que j'ai obtenus in vitro et in vivo montrent que contrecarrer, par interférence à l'ARN, l'élévation du taux de BCL-2 consécutive au traitement par le Crizotinib, permet de potentialiser les effets de la drogue : cela se traduit en particulier par une potentialisation de la mort par apoptose induite par le traitement mais aussi, de manière fascinante, par une conversion de la réponse autophagique initialement cytoprotectrice et pro-tumorale en une autophagie incontrôlée et délétère, qui participe alors à l'effet thérapeutique accru de la drogue. De manière globale, ce travail permet d'envisager de nouvelles combinaisons et alternatives thérapeutiques pour les patients souffrants de LAGC ALK+, et illustre la complexité des régulations croisées entre processus apoptotiques et autophagiques
Anaplastic large cell lymphoma (ALCL) are T/-null non-hodgkin lymphoma representing most of childhood T-cell lymphoma (up to 30%). More than 80% of cases bear reciprocal chromosomic translocation responsible for abnormal expression and constitutive activation of X-ALK type (Anaplastic Lymphoma Kinase) chimeric proteins (ALK+ ALCL). A striking characteristic of this lymphoma is that B-Cell Lymphoma-2 (BCL-2) remains undetectable in ALK+ cases compared to ALK- cases. This is all the more surprising as the BCL-2 oncogene, which is firmly established as a prototypic anti-apoptotic factor as well as a key autophagy regulator, has been shown to be overexpressed in a majority of lymphomas. On the other hand, the RNA-binding protein HuR (Human Antigen R) is overexpressed in ALCL (as in most cancers). It has been demonstrated that this protein was involved in the sustainability of the tumoral phenotype, and that its subcellular localization and functions were closely related to its phosphorylation status, which in turn heavily depends on ALK activity in ALK+ ALCL. In the cytoplasm, HuR has the ability to bind adenine and uridine-rich elements (ARE) located on the 3'-UTR of target mRNAs, and both protect them from degradation and increase their translation. From a general point of view, HuR is able to establish an interplay with microRNAs (miRNAs), either blocking them through competition, or actually cooperating with them and thus promote their function of negative regulators of gene expression on common target transcripts. The BCL-2 transcript, which expression seems to be silenced in ALK-expressing ALCL, has been described as a potential target of HuR. During my PhD work, I dedicated myself to understand the molecular mechanism at work in the silencing of BCL-2 expression with a focus on HuR and collaborating miRNA. The data I obtained point at a cooperation between HuR and miR-34a leading to the silencing of the BCL-2 transcript. However, when the ALK tyrosine kinase activity is inhibited, it appears the interaction between the BCL-2 mRNA diminishes, which limitates the miR-34a 's access to this transcript and ultimately results in a re-expression of the BCL-2 oncogene in these lymphoma cells. In the current context of clinical trials for ALK-targeting inhibitors, such as the Crizotinib, this BCL-2 re-expression observed upon ALK inhibition shed light on potential reasons behind some therapeutic failures that have recently been reported. Indeed, during my PhD work, I also studied the consequences of the BCL-2 re-expression observed in Crizotinib-treated cells. The data I obtained in vitro and in vivo show that, by blocking this re-expression using RNA interference, the Crizotinib anti-tumoral efficiency can be greatly potentiated. This potentiation took the form of an increase of apoptotic cell death induction and, interestingly, also affected the autophagic response triggered by the drug, making it switch from a cytoprotective- type, protumoral autophagic flux to an enhanced, deletary-type and tumor suppressive flux, adding to the therapeutic effect of the drug. This work in general provides insights for new therapeutic combinations that could potentially benefit to ALK+ ALCL patients, and illustrates the complex cross-regulations between apoptotic and autophagic pathway

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Jäkel, Heidelinde. « Régulation transcriptionnelle de l'apolipoprotéine A5 par les facteurs de transcription "Peroxisome proliferator activated receptor α", "Liver X Receptor" et "Sterol regulatory element binding protein 1c" ». Lille 2, 2005. http://www.theses.fr/2005LIL2S007.

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Résumé :

Les études épidémiologiques démontrent qu’une concentration élevée en triglycérides plasmatiques constitue un facteur de risque indépendant dans le développement des maladies cardiovasculaires. L’apolipoprotéine A-V (apoA-V), récement découverte, présente un nouveau déterminant de la concentration en triglycérides plasmatiques. D’autre part, le rôle joué par des récepteurs nucléaires PPARα et LXR, qui régulent la concentration en triglycérides et ont un effet anti-athérogène, a été étudié dans la régulation de l’expression de l’APOA5. Nous avons montré que las activateurs de PPARα induisent l’expression de l’APOA5 par l’intermédiaire d’un élément de réponse à PPAR situé dans son promoteur. Inversement, nous avons pu mettre en évidence une transrépression de l’APOA5 par les ligands de LXR via la fixation du gène cible, SREBP-1c, sur son promoteur. En résumé, ces résultats obtenus soulignent l’implication de PPARα et LXR dans la régulation de l’expression de l’apoA-V et le métabolisme des triglycérides
Epidemiological studies revealed that an elevated plasma triglyceride concentration constitue an independent risk factor for cardiovascular disease. The recently discovered apolipoprotein A-V (apoA-V) emerged as a new determinant of plasma triglyceride levels. In our study we assessed the regulation of APOA5 by PPARα and LXR ligands, since these nuclear receptors play a crucial role in plasma triglyceride metabolism with an over-all antiatherogenic effect. We showed that PPARα activators elevate APOA5 gene expression via a PPRE in its proximal promoter. Furthermore, we demonstrated that a LXR ligand down-regulates APOA5 gene expression via the fixation of its target gene SREBP-1c on a specific element on its promoter. In conclusion, our results indicate that PPARα and LXR ligands may be implicated in apoA-V gene expression

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MARTINS, DE SA CESAR. « Contribution a l'etude de facteurs cytoplasmiques intervenant dans la regulation post-transcriptionnelle de l'expression genetique chez les eucaryotes ». Paris 7, 1988. http://www.theses.fr/1988PA077114.

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Mallet, Pierre-Luc. « Élucidation chez S. pombe du mécanisme d'import de la protéine nucléaire liant les queues poly(A), Pab2 : ainsi que de son implication en collaboration avec Abp1, une CENP-B homologue, dans la répression d'expression d'éléments génétiques mobiles ». Thèse, Université de Sherbrooke, 2014. http://hdl.handle.net/11143/6660.

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Résumé :

Au laboratoire du Dr. Bachand, l’orthologue chez la levure à fission de la protéine humaine PABPN1 qui est reliée à la dystrophie musculaire oculopharyngée a été découvert. Cette protéine se nomme Pab2. Elle a une localisation nucléaire, fait la navette entre le noyau et le cytoplasme, et les arginines de son domaine arginine riche sont asymétriquement diméthylées tout comme son orthologue humain. Bien que ces protéines aient une localisation nucléaire, aucune étude in vivo n’a été effectuée afin d’élucider leur mécanisme d’import nucléaire. Dans mon premier projet de recherche, la levure à fission a été utilisée pour caractériser le mécanisme d’import nucléaire de ces protéines liant les queues poly(A). Il a été démontré que Pab2 détient un signal de localisation nucléaire de type PY-NLS qui est suffisant et nécessaire à sa localisation nucléaire ainsi qu’à l’exécution de ses fonctions. De plus, il a été démontré que le PY-NLS de Pab2 provoque l’internalisation nucléaire de la protéine hétérologue GST-GFP-Pab2 (139-166). De concert avec un système d’import nucléaire de type PY-NLS, une délétion de la karyophérine Kap104, orthologue de la Kap?2 qui est le transporteur des cargos PY-NLS, engendre un défaut d’import nucléaire de Pab2. S’ensuit aussi par la démonstration d’une interaction physique directe entre Pab2 et Kap104. Il a été observé que la méthylation du domaine arginine riche en C-terminal, où se retrouve le PY-NLS, n’affecte pas la localisation de Pab2. Toutefois, dans un contexte où Pab2 détient un signal de localisation nucléaire sub-optimal ; la méthylation du domaine arginine riche réduit son efficacité d’import nucléaire. Finalement, une vérification in vivo de l’importance du mécanisme d’import de type PY-NLS de PABPN1 par un système d’inhibition spécifique de la Kap?2 a permis de confirmer que ce mécanisme d’import n’est pas nécessaire à sa localisation nucléaire. Suggérant la présence de systèmes d’imports nucléaires redondants ainsi que la possibilité d’une autre voie d’import nucléaire prioritaire pourPABPN1. Une analyse transcriptomique par micropuce d’ADN a permis d’identifier divers gènes surexprimés dans une cellule pab2?. Une des classes de gènes qui ont été identifiés se réfère à des éléments génétiques mobiles se dénommant Tƒ2 chez la levure à fission. La confirmation de l’accumulation d’environ deux fois des transcrits Tƒ2 dans une souche pab2? par buvardage Northern a fit naître mon deuxième projet de recherche. Plusieurs études ont démontré que Pab2 agit dans la même voie que Rrp6, une exonucléase 3’-5’, dans la maturation et la dégradation de divers transcrits de façon post-transcriptionnelle. Afin de corroborer une répression post-transcriptionnelle des Tƒ2 par Pab2; un essai génétique a été effectué en combinant sa délétion à celle d’une protéine, Abp1, connue pour réprimer de façon transcriptionnelle ces Tƒ2. Étonnamment, une diminution d’accumulation de transcrits Tƒ2 a été observée dans le double mutant comparativement au simple mutant abp1?. Une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) par la Pol II a permis de confirmer que ce phénotype était d’ordre transcriptionnel. Les essais de ChIP ont aussi permis de corroborer un rôle post-transcriptionnel de répression des Tƒ2 par Pab2. Il a été démontré par un autre groupe de recherche qu’il y a activation du RNAi envers les Tƒ2 qui mènent à l’établissement d’une marque d’hétérochromatine dans un mutant rrp6?. Un dépistage de transcrits antisens aux Tƒ2 a permis d’en identifier un qui accumule dans un double mutant abp1?/pab2?. Il a aussi été observé que ce transcrit antisens accumule à des étapes spécifiques de la méiose. De plus, son accumulation dans des mutants génétiques ou bien en méiose corrèle négativement avec l’accumulation de l’ARNm des Tƒ2. [symboles non conformes]

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ROY, TERRE MARIANNE. « Etude du recepteur ah et de la proteine "4 s" liant les hydrocarbures aromatiques polycycliques ». Toulouse 3, 1987. http://www.theses.fr/1987TOU30037.

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Leriche, Mélissa. « Mise en évidence d’une interaction entre la protéine 53BP1 et les fragments d’Okazaki ». Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASS065.

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Résumé :

Le maintien de l’intégrité du génome est un processus crucial à la vie cellulaire. Ce n’est que récemment que les protéines de liaison à l’ARN (« RNA-binding protein » ou RBP) ont été montré être impliquées dans ce processus. En présence d’ADN endommagé, les RBP régulent l’expression des gènes de réponse aux dommages de l’ADN et contrôlent le destin cellulaire. Elles jouent également un rôle plus direct dans la prévention et la réparation des dommages de l’ADN. De plus, des ARN sont présents aux sites de dommages de l’ADN et participent au maintien de l’intégrité du génome. Ainsi, le laboratoire recherche des acteurs protéiques capables de lier directement l’ARN au sein des protéines médiatrices de la réponse aux dommages de l’ADN. Un des candidats est la protéine 53BP1 (p53 binding protein 1) qui contient un domaine de liaison à l’ARN nommé domaine GAR (« Glycine-Arginine Rich »). 53BP1 est un acteur central de la signalisation des cassures double-brin de l’ADN et de la régulation de leur réparation par le processus de jonction d’extrémités non homologues pendant la phase G1 du cycle cellulaire. Le recrutement de 53BP1 aux sites de dommages de l'ADN dépend à la fois d'interactions directes entre 53BP1 et des marques d’histones, mais aussi d’une composante ARN.L’objectif était d’étudier l’interaction entre 53BP1 et l’ARN.Grâce aux méthodes de CLIP (« CrossLinking and ImmunoPrecipitation ») et de 2C (« Complex Capture »), nous avons montré que 53BP1 possède une activité de liaison directe à l'ARN, via son domaine GAR. Nous avons identifié l’acide nucléique interagissant avec 53BP1 comme étant une chimère ARN-ADN constituée d’une partie d’environ 10 ribonucléotides, suivie d’environ 100 désoxyribonucléotides. Ce type de molécule est très similaire à celle des fragments d’Okazaki qui sont impliqués dans l’initiation de la synthèse du brin retardé de la fourche de réplication. Par la méthode de SIRF (« In Situ Protein Interaction with Nascent DNA Replication Forks »), nous avons montré que 53BP1 est présent au niveau de l’ADN naissant, dans un contexte de réplication normal. De plus, la déplétion de la sous-unité catalytique de la primase (PRIM1) qui synthétise l’amorce ARN des fragments d’Okazaki, conduit à la diminution de la présence de 53BP1 à proximité d’ADN naissant. La déplétion de PRIM1 affecte également l’interaction de 53BP1 avec la chimère ARN-ADN in vivo. Ces résultats indiquent que 53BP1 est présent à la fourche de réplication via une interaction directe avec les fragments d’Okazaki. Enfin, sous stress réplicatif induit par l’hydroxyurée, la présence de 53BP1 au niveau de l’ADN naissant est fortement augmentée, indiquant que 53BP1 s’accumule aux fourches de réplication bloquées. L'ensemble de ces résultats montre que 53BP1 est une protéine de liaison aux ARN qui interagit directement avec les fragments d’Okazaki
Maintenance of genome integrity is essential for cell survival. It is only recently that RNA-binding proteins (RBPs) have been shown as fundamental actors in this process. In the presence of DNA damage, RBPs regulate the expression of DNA damage response (DDR) related genes and control cell fate. RBPs also have a more direct role in preventing and repairing DNA damage. Moreover, some RNAs are present at sites of DNA damage and, thus, participate in the maintenance of genome integrity. The laboratory is interested in proteins that are both able to directly bind RNA and involved in DDR. One candidate is the 53BP1 protein (p53 binding protein 1) that contains an RNA-binding domain called GAR domain (Glycin-Arginin Rich). 53BP1 is a key protein mediating the signalling of DNA double-strand breaks and channels DNA repair to the non-homologous end-joining pathway during the G1 phase of the cell cycle. The recruitment of 53BP1 to sites of DNA damage depends on both histones marks and an RNA component.The objective was to study the interaction between 53BP1 and RNA.By using CLIP (CrossLinking and Immunoprecipitation) and 2C (Complex Capture) technologies, we showed that 53BP1 presents a direct RNA-binding activity within its GAR domain. We identified the nucleic acid interacting with 53BP1 as being an RNA-DNA chimera composed of about 10 ribonucleotides, followed by about 100 dexoribonucleotides. This type of entity is highly similar to that of Okazaki fragments, that are involved in the initiation of lagging strand synthesis at replication forks. By using the SIRF method (In Situ Protein Interaction with Nascent DNA Replication Forks), we showed that 53BP1 is localized at sites of newly synthetized DNA, under normal conditions of replication. Furthermore, depletion of the catalytic sub-unit of the primase (PRIM1), that catalyzes the synthesis of the RNA primer of Okazaki fragments, results in a decrease in 53BP1 at sites of newly synthetized DNA. PRIM1 depletion also decreases the interaction between 53BP1 and RNA-DNA chimera in vivo. These results indicate that 53BP1 is localized at the replication fork through a direct interaction with Okazaki fragments. Likewise, under replicative stress induced by hydroxyurea, the presence of 53BP1 at the newly synthetized DNA is increased, indicating that 53BP1 accumulates at stalled replication forks. Altogether, these results show that 53BP1 is an RNA-binding protein that directly interacts with Okazaki fragments

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Lebrette, Hugo. « Etude structurale de l'import de nickel par les protéines extracytoplasmiques de systèmes ABC chez les bactéries : le nickel voyage-t-il seul ou accompagné ? » Thesis, Grenoble, 2013. http://www.theses.fr/2013GRENV086.

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Résumé :

Chez les procaryotes, les systèmes ABC (ATP-binding cassette) canoniques permettent un import efficace et de haute affinité du nickel, en grande partie via l'action de la Ni-BP (nickel-binding protein) qui va jouer le rôle de récepteur extracytoplasmique du nickel avant son passage à travers la membrane interne. Dans ces travaux, nous avons cherché à mieux caractériser les stratégies d'import de nickel par les bactéries, notamment par l'étude cristallographique des Ni-BP. La résolution des structures de cinq de ces protéines, en interaction avec du nickel, nous a permis d'identifier les sites de fixation et ainsi de mettre en évidence les différents modes d'interaction de ce métal avec les Ni-BP. Nos résultats montrent notamment que la coordination du nickel requiert toujours la présence d'un métallophore exogène, appelé nickelophore. En parallèle, des études in vivo ont été conduites sur Escherichia coli, montrant que cette bactérie semble être capable de synthétiser son propre nickelophore. D'autre part, ces travaux ont permis la résolution de la structure de HypB de Helicobacter pylori en interaction avec du nickel. Celle-ci permet de mieux appréhender le rôle central de cette protéine au sein des voies de maturation des enzymes à nickel
In prokaryotes, canonical ABC (ATP-binding cassette) importers allow an efficient uptake of nickel with high affinity through the inner membrane, largely via the action of the extracytoplasmic nickel-binding protein (Ni-BP). In this work, we intended to better understand the strategies developed by bacteria to scavenge nickel in the environment, especially through the structural studies of several Ni-BP. The resolution of the crystal structures of five Ni-BPs from diverse bacteria, in interaction with nickel, led us to identify their nickel-binding sites and shed light on the different binding modes. Our results show that the presence of an exogenous metallophore, called nickelophore, is always required. In vivo studies in Escherichia coli were also conducted, showing that this bacteria seems to be able to synthesize its own nickelophore. In addition, we have solved the crystal structure of Helicobacter pylori HypB in complex with nickel. This result provides insight into its cellular function in nickel enzyme maturation pathways

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Bounaix, Morand du Puch Christophe. « Analyse des interactions ADN lésé / protéines : Optimisations méthodologiques et applications aux dommages de l’ADN engendrés par les dérivés du platine ». Grenoble, 2010. https://theses.hal.science/tel-00549987.

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La présence de lésions sur l'ADN contribue à déstabiliser sa structure, bloquant certains processus vitaux pour la cellule. Ces altérations peuvent cependant avoir un intérêt thérapeutique, par exemple dans le cas de l'utilisation d'anticancéreux tels que les dérivés du platine. Les adduits volumineux qu'ils génèrent, s'ils ne sont pas réparés, entraînent la cellule vers l'apoptose. La compréhension de la réponse à ces anticancéreux passe par l'étude des protéines qui interagissent directement avec les dommages, et dont l'ensemble constitue l'interactome des lésions de l'ADN. Ce travail de thèse présente le développement d'outils destinés à compléter la liste des protéines associées aux adduits du platine. Dans un premier temps, nous avons utilisé un piège à protéines (ligand fishing) constitué de plasmides lésés fixés sur des billes magnétiques. Trois dérivés du platine ont été sélectionnés pour générer les lésions : le cisplatine (molécule princeps), l'oxaliplatine, et le satraplatine. Ce piège a permis d'obtenir, à partir d'extraits nucléaires issus de cellules cancéreuses HeLa et grâce à une identification par protéomique, une liste de candidats comprenant des protéines déjà connues (HMGB1, hUBF, complexe FACT), mais aussi 29 nouveaux membres de l'interactome. Parmi ceux-ci, nous avons relevé PNUTS, TOX4 et WDR82, qui constituent les sous-unités du complexe PTW/PP, très récemment découvert. La présence de ce complexe a été également validée sur un modèle d'adénocarcinome mammaire MDA MB 231, et les conséquences biologiques de son interaction avec les adduits du platine devront maintenant être précisées. Dans un second temps, nous avons mis au point une biopuce permettant d'étudier les interactions ADN lésé/protéine par SPRi. Les affinités respectives d'HMGB1 et du nouveau candidat TOX4 pour les adduits des trois dérivés du platine ont pu être ainsi confirmées. Dans un dernier temps, nous avons étudié le rôle de DDB2 (acteur de la reconnaissance des photoproduits UV) dans la prise en charge des adduits platinés. Les expérimentations menées sur les cellules MDA MB 231 exprimant DDB2 de façon différentielle nous ont permis de vérifier que cette protéine ne participe pas à la réparation des adduits du cisplatine, contribuant plutôt à potentialiser l'action cytotoxique de cet agent. Dans le futur, nos microsystèmes pourront être adaptés à l'étude de l'interactome d'autres lésions de l'ADN
DNA lesions contribute to the alteration of DNA structure, thereby inhibiting essential cellular processes. Such alterations may be beneficial for chemotherapies, for example in the case of platinum anticancer agents. They generate bulky adducts that, if not repaired, ultimately cause apoptosis. A better understanding of the biological response to such molecules can be obtained through the study of proteins that directly interact with the damages. These proteins constitute the DNA lesions interactome. This thesis presents the development of tools aiming at increasing the list of platinum adduct-associated proteins. Firstly, we designed a ligand fishing system made of damaged plasmids immobilized onto magnetic beads. Three platinum drugs were selected for our study: cisplatin, oxaliplatin and satraplatin. Following exposure of the trap to nuclear extracts from HeLa cancer cells and identification of retained proteins by proteomics, we obtained already known candidates (HMGB1, hUBF, FACT complex) but also 29 new members of the platinated-DNA interactome. Among them, we noted the presence of PNUTS, TOX4 and WDR82, which associate to form the recently-discovered PTW/PP complex. Their capture was then confirmed with a second model, namely breast cancer cell line MDA MB 231, and the biological consequences of such an interaction now need to be elucidated. Secondly, we adapted a SPRi biochip to the study of platinum-damaged DNA/proteins interactions. Affinity of HMGB1 and newly characterized TOX4 for adducts generated by our three platinum drugs could be validated thanks to the biochip. Finally, we used our tools, as well as analytical chemistry and biochemistry methods, to evaluate the role of DDB2 (a factor involved in the recognition of UV-induced lesions) in the repair of cisplatin adducts. Our experiments using MDA MB 231 cells differentially expressing DDB2 showed that this protein is not responsible for the repair of platinum damages. Instead, it appears to act as a positive mediator of their cytotoxicity. In the near future, the abovementioned microsystems will be adapted to the study of the interactome of other DNA lesions

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Fernandez, Nadia. « Separation et etude des composants de liaison cellulaires fixant les substances aromatiques polycycliques ». Toulouse 3, 1987. http://www.theses.fr/1987TOU30247.

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Mazerbourg, Sabine. « La proteolyse de l'insulin-like growth factor binding protein-4 (igfbp-4) dans les follicules ovariens chez les mammiferes domestiques : identification de la protease, etude de sa regulation, consequences sur la maturation folliculaire ». Paris 6, 2000. http://www.theses.fr/2000PA066319.

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Résumé :

Les igfs (insulin-like growth factors) jouent un role crucial dans le developpement folliculaire en amplifiant l'action des hormones gonadotropes hypophysaires, fsh et lh. Leur action stimulante est modulee par la presence de proteines de liaison, les igf-binding proteins (igfbps), dans le liquide folliculaire. Chez la brebis, la vache, la truie, la jument et la femme, la croissance et l'atresie folliculaire sont associees respectivement a une diminution et a une augmentation des teneurs en igfbp-4 dans le liquide folliculaire. Ces variations sont essentiellement dues a des variations de l'activite proteolytique capable de la degrader. Les objectifs de notre travail ont ete 1) d'identifier la protease responsable de la degradation proteolytique de l'igfbp-4 dans les follicules preovulatoires ; 2) de determiner les mecanismes locaux de regulation de l'activite proteolytique ; 3) de rechercher le role biologique des fragments de proteolyse de l'igfbp-4 dans la maturation folliculaire. Nous avons montre que la pregnancy-associated plasma protein-a (papp-a) est la metalloprotease impliquee dans la degradation de l'igfbp-4 dans les follicules preovulatoires de brebis, de vache, de truie et de jument. Chez la truie et la vache, l'expression des arnms de la papp-a dans les cellules de granulosa est etroitement correlee a celle de l'aromatase et des recepteurs a lh. Elle est maximale dans les follicules preovulatoires et faible, mais non nulle, dans les follicules atretiques et dans les follicules immatures. Au niveau post-traductionnel, l'igf-i potentialise la proteolyse de l'igfbp-4 par la papp-a. A l'inverse, les igfbp-2 et -3 ainsi que des peptides de liaison a l'heparine derives du domaine carboxy-terminal de l'igfbp-3 ou -5 ou du ctgf (connective tissue growth factor), du hip (heparan/heparin interacting peptide) et de la vitronectine inhibent la degradation de l'igfbp-4 par le liquide folliculaire de follicules preovulatoires. Ces effets passent par une reduction de la biodisponibilite intrafolliculaire des igfs et/ou par une interaction directe avec la papp-a par l'intermediaire du domaine de liaison a l'heparine. Enfin, in vitro, des resultats preliminaires montrent un effet potentialisateur des fragments carboxy-terminaux de l'igfbp-4 sur la production de progesterone par les cellules de granulosa ovines cultivees en presence d'igf-i, suggerant que la degradation proteolytique de l'igfbp-4 aboutit a une amplification de l'action de l'igf-i en participant a l'augmentation de sa biodisponibilite et en potentialisant son action au niveau cellulaire.

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De, Angelis Fabien. « Characterization of proteins involved in RND-driven heavy metal resistance systems of Cupriavidus metallidurans CH34 ». Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 2010. http://hdl.handle.net/2013/ULB-DIPOT:oai:dipot.ulb.ac.be:2013/210154.

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Résumé :

Les systèmes d’efflux tripartite de type Resistance, Nodulation and cell-Division (RND) sont essentiels dans le maintien de phénotypes de résistance multidrogues et contre les métaux lourds dans nombreuses bactéries Gram-négatives. Le transport de ces composés toxiques hors de la cellule est permis par l’assemblage d’une protéine de type antiporteur cation/proton (unité RND) insérée dans la membrane interne, connectée à une protéine insérée dans la membrane externe, pour former un canal de sorti qui traverse l’entièreté de l’enveloppe cellulaire. Le troisième composant du système, la protéine de type membrane fusion protein (MFP) qui est aussi appelée periplasmic adaptor protein (PAP), est requis pour permettre l’assemblage de tout ce complexe à trois composants. Cependant, les MFPs sont supposées jouer un rôle important et actif dans le mécanisme d’efflux du substrat. Pour mieux comprendre le rôle des MFPs au sein des systèmes d’efflux de type RND, nous avons étudié les protéines ZneB (précédemment appelée HmxB) et SilB, les composants périplasmiques des systèmes ZneCBA et SilABC responsables de la résistance aux métaux lourds chez Cupriavidus metallidurans CH34. Nous avons identifié la spécificité de liaison au substrat de ces protéines, montrant leur capacité à fixer le zinc (ZneB), ou le cuivre et l’argent (SilB). De plus, nous avons résolu la structure cristalline de ZneB à une résolution de 2.8 Å dans la forme apo- et avec un ion zinc fixé. La structure de ZneB possède une architecture générale composée de quatre domaines caractéristiques des MFPs, et la présence du site de coordination au zinc dans une région très flexible à l’interface des domaines β-barrel et membrane proximal. Les modifications structurales que la protéine subit lors de la fixation du zinc on été observée dans le cristal mais aussi en solution, ce qui suggère un rôle actif des MFPs dans le mécanisme d’efflux des métaux, vraisemblablement via la fixation et le relargage de l’ion à l’antiporteur. Les études de sélectivité de transport des antiporteurs ZneA et SilA montre que ces dernières et leurs protéines périplasmiques respectives ont des affinités similaires pour les métaux lourds. De plus, les études de transport ont apportés des arguments en faveur de l’hypothèse de capture cytoplasmique du substrat par l’antiporteur, tandis que la capacité des protéines périplasmiques à fixer les métaux lourds a apporté des arguments en faveur de l’hypothèse de capture périplasmique du substrat par l’antiporteur. Les deux modes de capture pourraient en réalité coexister ;cependant, le débat autour du compartiment cellulaire de capture du substrat par l’antiporteur est complexe et requiert de plus amples efforts afin d’être cerné. / Tripartite resistance nodulation cell division (RND)-based efflux complexes are paramount for multidrug and heavy metal resistance in numerous Gram-negative bacteria. The transport of these toxic compounds out of the cell is driven by the inner membrane proton/substrate antiporter (RND protein) connected to an outer membrane protein to form an exit duct that spans the entire cell envelope. The third component, a membrane fusion protein (MFP) also called periplasmic adaptor protein, is required for the assembly of this complex. However, MFPs are also proposed to play an important active role in substrate efflux. To better understand the role of MFPs in RND-driven efflux systems, we studied ZneB (formerly HmxB) and SilB, the MFP components of the ZneCAB and SilABC heavy metal RND-driven efflux complexes from Cupriavidus metallidurans CH34. We have identified the substrate binding specificity of the proteins, showing their ability to selectively bind zinc (ZneB), or copper and silver cations (SilB). Moreover, we have solved the crystal structure of the apo- and the metal-bound forms of ZneB to 2.8 Å resolution. The structure of ZneB displays a general architecture composed of four domains characteristic of MFPs, and it reveals the metal coordination site at the very flexible interface between the β-barrel and the membrane proximal domains. Structural modifications of the protein upon zinc binding were observed in both the crystal structure and in solution, suggesting an active role of MFPs in substrate efflux possibly through binding and release. The selectivity assays of the antiporter proteins ZneA and SilA demonstrated similar specificities in relation to their cognate MFPs toward heavy metal cations. Moreover, antiporter transport assays provide evidence for cytoplasmic substrate capture by this protein, whereas MFP substrate binding provides evidence for periplasmic substrate capture. Therefore, both modes of capture might co-exist; nevertheless, the substrate capture issue is a complex topic still needing consequent efforts to understand it.
Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique
info:eu-repo/semantics/nonPublished

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Cann, Paul. « Étude des mécanismes de réception des phéromones mâles chez les petits ruminants ». Thesis, Lille, 2020. http://www.theses.fr/2020LILUS115.

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Résumé :

Chez les petits ruminants (mouton et chèvre) la reproduction est saisonnée, c’est-à-dire qu’il y a alternance de période de repos et d’activité sexuelle. Ces deux périodes se caractérises chez les femelles par deux états physiologiques différents : en période d’activité sexuelle, le cycle ovarien des femelles est actif (oestrus) et la reproduction est possible, alors qu’en période de repos sexuel elles sont en anoestrus profond. Dans le but d’induire l’oestrus chez des femelles en repos sexuelle, les éleveurs ont le plus souvent recours à des hormones exogènes. Ces hormones sont de moins en moins acceptable pour le bien-être de l’animal et du consommateur. Cependant la réception d’odeurs émises par un mâle sexuellement actif peut réactiver l’axe gonadotrope des femelles en anoestrus en fin de période de repos sexuel, aboutissant dans la majorité des cas à l’ovulation. Ce phénomène naturel est appelé effet mâle. Les odeurs des béliers et des boucs agissent alors comme des phéromones modificatrices. La plupart des études menée sur l’effet mâle se sont concentrées sur les modifications neuroendocrines induites par la réception des phéromones du mâle, mais l’importance de la plasticité du sécrétome olfactif a longtemps été sous-estimée. De précédentes recherche menée par notre équipe ont montré que chez le porc, le sécrétome olfactif (ensemble des protéines sécrétées dans le mucus nasal) est principalement composé d’isoformes d’OBP (Odorant-Binding Proteins) générées par des modifications post-traductionnelles de type phosphorylations et glycosylations. La composition du sécrétome olfactif est sous contrôle hormonal et dépend du stade physiologique des animaux. Le but de cette thèse est de déterminer sur le sécrétome olfactif de brebis et de chèvre est lui aussi modifié par des facteurs endogènes (hormones) et exogènes (odeurs du mâle), montrant ainsi une adaptation des outils sensoriel des femelles. Nous avons collecté de manière non invasive le mucus nasal des mêmes brebis et de chèvre en période de repos et d’activité sexuelle. Le sécrétome olfactif de 3 femelles de chaque espèce a été analysé par électrophorèses 2D puis par spectrométrie de masse haute résolution. Nos résultats suggèrent que le profil et la composition du sécrétome olfactifs est un marqueur du stade physiologique des femelles, et constitue un phénotype des capacités olfactives. De plus, la réception d’odeurs émise par un mâle induit des changements dans le sécrétome olfactif, démontrant l’effet de facteurs exogène sur celui-ci
Small ungulates (sheep and goat) display a seasonal breeding characterised by successive periods of sexual activity and sexual rest. During these two periods females are in two different physiological status: in sexual activity, the female ovarian cycle is active (oestrus) and ready for reproduction, whereas females are in deep anoestrus during the sexual rest period. In order to induce oestrus in female during the sexual rest periods, breeders are mostly using exogenous hormones. These hormones are less and less acceptable regardless to animal and consumer’s welfare. However, the perception of odours emitted by a sexually active male can reactivate the gonadotropic axis of anoestrus female in the late sexual rest period, leading in most cases to ovulation. This natural process is called “the male effect”. Ram and goat odours act as primer pheromones.Most of studies on male effect focused on the neuroendocrine modifications induced by the reception of male pheromones, but the plasticity of the olfactory system at the peripherical level was underestimated. Previous work of my research team has shown that in pig, the olfactory secretome (secreted proteome) is mainly composed of Odorant-Binding Proteins (OBP) isoforms generated by post-translational modifications, phosphorylation and glycosylation. The composition of this secretome is under hormonal control and depends on the physiological status of animals. The aim of my work is to determine whether the olfactory secretome of ewe and goat is also modified by endogenous factors (hormones) and exogenous factors (male odours), showing an adaptation of the sensory equipment of female. In a first step, we followed the same flocks of ewe and goat during several sexual cycles, and collected their nasal mucus by a non-invasive sampling method. The olfactory secretome of 3 females of each species was analysed by 2D-electrophoresis followed by high-resolution mass spectrometry. Our results suggest that the olfactory secretome profile and its composition is a marker of the physiological status, and constitutes a phenotype of the female receptivity. Furthermore, the males’ odours reception induces changes in the olfactory secretome, demonstrating that exogenous factors can modifies the olfactory equipment of females

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Lema, Ingrid. « Contrôle post-transcriptionnel de l'expression rénale du récepteur minéralocorticoide par les variations de tonicité extracellulaire : conséquences physiopathologiques ». Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS290.

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Résumé :

L’aldostérone et le Récepteur Minéralocorticoïde (MR) participent au contrôle de la balance hydrosodée et de la pression artérielle. Les altérations de l’expression du MR ou de la signalisation minéralocorticoïde sont associées à de nombreuses pathologies chez l’Homme. Dans ce travail, nous avons démontré, le rôle majeur de protéines de liaison à l’ARN, Tis11b et HuR, dans le contrôle post-transcriptionnel de l’expression du MR en réponse aux variations de tonicité extracellulaire dans un modèle de cellules principales rénales et chez la souris. L’hypertonicité (500 mOsmol/L) induit l’expression de la protéine Tis11b, qui lie la région 3’-non traduite du transcrit MR afin d’accélérer sa dégradation, diminuant ainsi l’expression rénale de la protéine MR et de la signalisation minéralocorticoïde. A l’opposé, l’hypotonicité (150 mOsmol/L) stimule la translocation nucléo-cytoplasmique de HuR, qui stabilise le transcrit MR, augmentant ainsi l’expression du MR et la sensibilité rénale à l’aldostérone. De plus, HuR est responsable de l’édition d’un nouveau variant d’épissage du MR, le variant MR Δ6, obtenu par l’exclusion de l’exon 6.Ce variant d’épissage exerce un effet dominant négatif sur la signalisation minéralocorticoïde. Enfin, l’identification de microARN modulés par l’hypertonicité suggère leur rôle potentiel dans le contrôle de la signalisation minéralocorticoïde rénale. La caractérisation de ces mécanismes inédits modulant l’action du MR améliore notre compréhension de la physiopathologie de la signalisation minéralocorticoïde, et pourrait aboutir, à terme, à de nouvelles stratégies thérapeutiques
Aldosterone and the Mineralocorticoid Receptor (MR) participate to the control of salt and water balance and the arterial pressure. Alteration of renal MR expression or mineralocorticoid signaling pathway contributes to the development of numerous human disorders. In this work, we have demonstrated the major role played by the RNA-Binding Proteins, Tis11b and HuR, in the control of MR expression in response to variations of extracellular tonicity in a model of principal tubular cells and in vivo. Hypertonicity (500 mOsmol/L) increases the expression ofTis11b, which binds the 3’-untranslated region of MR transcript and accelerates the degradation of MR transcript, leading to the reduction of the mineralocorticoid signaling. Conversely, hypotonicity (150 mOsmol/L) stimulates nuclear-cytoplasmic shuttling of HuR protein, which stabilizes MR transcript increasing its expression and renal sensitivity to aldosterone action. Furthermore, HuR participates to the editing of the novel MR Δ6 splice variant, which lacks exon 6, and exerts a dominant negative effect on mineralocorticoid signaling. Finally, we have provided evidence that hypertonicity modulates expression of microRNA, which may control mineralocorticoid signaling pathway. Characterization of these original mechanisms modulating MR action is pivotal for a better understanding of mineralocorticoid-related pathophysiology, and should ultimately lead to the development of new therapeutic strategies

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Ajjaji, Dalila. « Interaction de la protéine core du virus de l’hépatite C avec les corps lipidiques : mécanisme et fonction ». Thesis, Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019PSLEE056.

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Résumé :

Une étape majeure pour le maintien de l'état d'infection par le Virus de l'Hépatite C dans les cellules est la liaison de la protéine Core de la capside à la membrane des gouttelettes lipidiques formées dans le foie. Core se lie avec une hélice amphipathique à l’interface eau-huile des gouttelettes lipidiques. Le mécanisme de ce passage n'a pas encore été élucidé et la régulation du lien reste floue. Comprendre ce trafic intracellulaire nécessite, entre autres, une bonne connaissance de la biophysique des interactions protéine-membrane, en particulier des interfaces d'émulsion. Peu a été fait dans ce sens. Pour ce projet, nous étudions le mécanisme du trafic cellulaire de Core et ses partenaires entre le réticulum endoplasmique et les gouttelettes lipidiques. Nous adoptons une approche multidisciplinaire. Pour surmonter les complexités associées aux multiples interactions de Core et qui empêchent actuellement de comprendre la liaison de la protéine, nous avons reconstitué sa liaison sur des membranes modèles. Nous formons des gouttes d'émulsions huile dans eau imitant les gouttelettes lipidiques et des vésicules imitant le réticulum. Nous déterminons ainsi les conditions favorisant la liaison de Core sur la GL. Cette approche, associée à des expériences in vivo, est innovante et apporte une compréhension qui fait actuellement défaut
A major step for the maintenance of the hepatitis C infection state in the cells is the binding of the Core protein from the capsid to the lipid droplets membrane formed in the liver. Core binds with an amphipathic helix to use it from the bilayer membrane of the endoplasmic reticulum to the water-oil interface of the lipid droplets. The mechanism of this passage has not yet been elucidated and the regulation of the link remains unclear. Understanding this physical Core traffic requires, among other things, a good knowledge of the biophysics of protein-membrane interaction, especially on emulsion interfaces. Little has been done in this direction. For this project, we investigated the mechanism of cellular traffic of Core and its partners between endoplasmic reticulum and lipid droplets. We adopted a multidisciplinary approach. To overcome the complexities associated with the multiple interactions of Core, and which currently prevent an understanding of the binding of the protein, we reconstituted it binding on model membranes. We formed drops of oil-in-water emulsions, mimicking the lipid droplets, and vesicles mimicking the endoplasmic reticulum. We thus determined the conditions favoring the binding of Core on the lipid droplets. This approach, coupled with in vivo manipulations, is innovative and bring an understanding that is currently lacking

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Landron, Dorothée. « Interactions de l'hormone de croissance humaine avec les adipocytes de rats zucker genetiquement obeses : relations entre la liaison et les effets biologiques ». Paris 6, 1988. http://www.theses.fr/1988PA066344.

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Résumé :

L'objectif de ce travail est de comparer la liaison et les effets biologiques de l'hormone de croissance (gh) 1) dans les adipocytes du tissu inguinal de jeunes rats zucker obeses fa/fa et minces fa/fa; 2) dans les preadipocytes de rats zucker en culture primaire au cours de la differenciation adipocytaire. 1. Les etudes de liaison de la gh et les courbes dose-reponse pour le transport et le metabolisme du glucose sont realisees avec des adipocytes soit fraichement isoles (f) soit preincubes 3 h (p)

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Hapkova, Ilona. « Etude de l'expression et de la fonction de la protéine de liaison à l'ARN RBPMS2 dans les tumeurs stromales gastrointestinales (GISTs) ». Thesis, Montpellier 1, 2012. http://www.theses.fr/2012MON1T016/document.

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Résumé :

Les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) sont les tumeurs mésenchymateuses les plus fréquentes du système digestif. Elles ont pour origine les cellules interstitielles de Cajal (ICC) ou les cellules précurseurs mésenchymateuses communes aux ICCs et aux cellules musculaires lisses (SMC). Les GISTs sont des tumeurs qui sont chimiorésistantes et radiorésistantes. L'identification de mutations activatrices des gènes KIT (75-80%) ou/et PDGFRA (5-10%) a ouvert la voie à un traitement systémique chez les patients GIST sous forme d'Imatinib, un inhibiteur de tyrosine-kinase. Si ce traitement aboutit à une réponse clinique d'amélioration, un certain nombre d'effet secondaire sont néanmoins observés, comme les résistances au traitement. Afin d'améliorer le traitement initial, la physiopathologie du GIST doit progresser. La musculature de l'appareil digestif est une structure complexe composée de SMCs, de neurones entériques, de fibroblastes et d'ICCs. Au cours du développement, le mésoderme splanchnique donnera lieu au moins à deux types de cellules, les SMCs et les ICCs. Récemment, notre laboratoire a montré que la protéine de liaison à l'ARN RBPMS2 (pour RNA Binding Protein with Multiple Splicing 2) est impliquée dans le développement et le remodelage des SMCs digestives. Les travaux que j'ai réalisés au cours de ma thèse avaient pour objectifs d'étudier l'expression et la fonction de RBPMS2 dans les tumeurs GISTs humains. Nous avons analysé l'expression de RBPMS2 dans les GIST humains et nous avons démontré que RBPMS2 était fortement exprimé dans les tumeurs GISTs de manière indépendante de l'activité KIT. Nous avons également analysé la fonction de RBPMS2 en culture et avons montré que l'expression ectopique de RBPMS2 dans les SMCs humaines adultes et différenciées culture conduisaient à l'augmentation de leur taux de prolifération et altèreraient leur différenciation. Ces résultats suggèrent que RBPMS2 et les voies de signalisation qu´il contrôle pourraient être des cibles thérapeutiques potentielles dans la thérapie des tumeurs GISTs
Gastrointestinal stromal tumors (GIST) are the most common mesenchymal neoplasm of the GI tract. They are supposed to arise from the interstitial cells of Cajal (ICCs) or from a mesenchymal precursor cell, common of ICCs and smooth muscle cells (SMCs). GISTs are highly resistant to conventional chemotherapy and radiotherapy. However, a targeted therapy is now proposed. These tumors have activating mutations in two closely related genes, the KIT (75-80%) or/and the PDGFRA (5-10%). Targeting these mutated activated proteins with Imatinib mesylate, a small-molecule tyrosine kinase inhibitor, has proven efficient in GIST treatment. However, resistance to Imatinib finally develops and new-targeted therapies are necessary. The musculature of the gastrointestinal (GI) tract is a highly complex structure composed of visceral SMCs, enteric neurons, fibroblast-like cells and ICCs. During the development, the splanchnic mesoderm will give rise at least to two cell types, ICCs and SMCs. Recently our laboratory showed that the RNA Binding Protein with Multiple Splicing 2 (RBPMS2) is involved into the development and remodeling of SMC.My PhD works investigate the expression and function of RBPMS2 in human GISTs. We analyzed the expression of RBPMS2 in human GISTs and we found that RBPMS2 was abnormally highly expressed in the tumoral cells of GISTs. We also analyzed the function of RBPMS2 into human adult SMC cell culture and demonstrated that ectopic expression of RBPMS2 in mature and differentiated SMC cultures increases their proliferation rate and alters their differentiation. These findings suggest that RBPMS2 could be a potential target for cancer therapy

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