Thèses sur le sujet « Lipide de signalisation »

L’acide abscissique (ABA) est une phytohormone impliquée dans de nombreux processus de développement des plantes. L’ABA s’accumule également en réponse à des stress abiotiques et participe à l’établissement de la résistance à ces stress par la régulation de l’expression de gènes et des mouvements stomatiques. La signalisation cellulaire de l’ABA est très complexe et fait intervenir de nombreux partenaires protéiques et messagers secondaires. En particulier, le rôle des phospholipides a été démontré sur des cellules en suspension d’A. Thaliana. En effet, la forme phosphorylée de l’acide phosphatidique (PA), le diacylglycérol pyrophosphate (DGPP), s’accumule de façon transitoire en réponse à l’ABA et mime les effets de l’ABA sur l’induction de l’expression du gène RAB18. Mon travail de thèse apporte des éléments renforçant l’hypothèse d’un rôle de messager secondaire du DGPP dans la voie de signalisation de l’ABA. Des analyses transcriptomiques ont montré que le DGPP contrôle l’expression de nombreux gènes régulés par l’ABA. De plus, le DGPP mime les effets de l’ABA en induisant l’entrée de Ca2+ dans les cellules et en régulant l’activité de canaux anioniques membranaires. L’utilisation d’inhibiteurs de canaux calciques et anioniques nous a permis de proposer une séquence d’évènements précoces de la signalisation de l’ABA, nécessaires au contrôle de l’expression de gènes, impliquant le Ca2+, le DGPP et les courants anioniques. Afin de préciser le rôle du PA et du DGPP dans la signalisation de l’ABA, l’étude d’enzymes du catabolisme du PA et du DGPP, les Lipide Phosphate Phosphatases (LPP), a été entreprise. Les LPP déphosphorylent le DGPP en PA et le PA en diacylglycérol (DAG). Quatre gènes codent des LPP dans le génome d’A. Thaliana, AtLPP1, 2, 3 et 4. Des mutants d’insertion homozygotes ont été obtenus pour les gènes AtLPP1,2 et 3, et leurs réponses à l’ABA ont été étudiées au cours de tests physiologiques. Seul le mutant knock-out Atlpp2-2 présente un phénotype différent de celui du sauvage lors de l’inhibition de la germination, l’induction artificielle de la sénescence foliaire et l’induction de la fermeture stomatique par l’ABA. En outre, les teneurs en PA et DGPP d’Atlpp2-2 sont plus élevées que celles du sauvage. De plus, des études transcriptomiques ont révélé que la régulation de l’expression génique par l’ABA est perturbée chez Atlpp2-2. Tous ces résultats suggèrent que la protéine AtLPP2 est impliquée dans la signalisation de l’ABA, probablement en régulant les pools des deux messagers secondaires, DGPP et PA.

La neurosecrétion nécessite une coopération entre différents acteurs protéiques pour orchestrer le transport, la fusion et le recyclage de vésicules sécrétrices. Cependant les lipides, composants majeurs des membranes cellulaires, ont été moins étudiées lors de ce processus, principalement à cause d’un manque d’outils. Ainsi lors de ma thèse, j’ai implémenté deux approches pour étudier les fonction pléïotropiques d’un lipide de signalisation : l’acide phosphatidique (PA). L’utilisation d’analogues du PA modifié chimiquement m’a permis d’établir leur dynamique ainsi que leurs interactomes directement dans des cellules neurosécrétrices. Une seconde approche optogénétique permet de moduler les niveaux intracellulaires de PA avec une résolution spatiale et temporelle sans précédent pour établir les fonctions non-redondantes de différents pools de PA subcellulaires. Ainsi, grâce à cette nouvelle boite à outil moléculaire, j’ai pu approfondir notre compréhension des rôles du PA dans la neurosécrétion
Neurosecretion requires multiple proteins acting together to orchestrate transport, fusion and recycling of secretory vesicles. However, contribution of lipids, main components of cellular membranes, have been much less studied in these processes, primarily because of a lack of adequate tools. Hence, during my thesis, I implemented two novel approaches to study the pleiotropic functions of a peculiar signaling lipid: phosphatidic acid (PA). The use of chemically modified PA click-analogues enabled me to establish their dynamics as well as to characterize their interactome directly within neurosecretory cells. A second approach based on the optogenetic targeting of enzymes involved in the PA metabolism modulated its cellular levels with an unprecedented spatial and temporal resolution. This work allowed to unravel the non-redundant functions of various subcellular PA pools. Our novel molecular toolbox for PA, represents a breakthrough in lipid biology that will greatly improve our understanding of the roles of PA in the neurosecretory process

Le léiomyome utérin est la pathologie utérine la plus fréquente chez les femmes en âges de procréer. Des résultats précédent obtenus avec les cellules ELT3, une lignée de cellules de léiomyomes de rat, ont montré que l'acide lysophosphatidique (LPA) activait les MAP kinases ERK1/2 via le récepteur LPA1 couplé à la protéine Gi et l'activation de Raf, Ras et de MEK. Durant ce travail, nous avons caractérisé l'activité phosphatase responsable de la dégradation du LPA dans cette lignée de cellules ELT3. Nous avons montré que le LPA était dégradé exclusivement par la lipide-phosphate phosphatase 1 (LPP1), seule isoforme exprimé dans les cellules ELT3. Dans un deuxième temps nous nous somme intéressés aux effets du diacylglycerol pyrophosphate (DGPP). Le DGPP est un médiateur lipidique qui, sous sa forme dioctanoyl (DGPP8:0), est décrit comme un antagoniste des récepteurs LPA1 et LPA3 chez les mammifères. Dans cette étude, nous montrons que le DGPP8:0 n'a pas d'effet antagoniste sur l'activation du module MAP kinase ERK1/2 par le LPA mais qu'il induit une activation de ERK1/2 dans plusieurs lignées de cellules de mammifères. En effet le DGPP active ERK1/2 à travers l'activation des PKC, Raf et MEK. De plus, nous montrons que l'activation induite par le DGPP repose sur sa déphosphorylation catalysée par une LPP. Nous montrons également que l'inhibition de LPP1 par le VPC32183 ou l'utilisation de siRNA dirigé contre la lipide phosphate-phosphatase 1 (LPP1) réduit l'activation ERK1/2 induite par le DGPP. Ceci montre que le DGPP active ERK1/2 via sa déphosphorylation en acide phosphatidique (PA8:0), catalysée par la LPP1. Enfin dans une dernière partie nous montrons que le myomètre sain, contrairement aux cellules ELT3, exprime à la fois la LPP1 et la LPP3. En étudiant l'effet de la surexpression de la LPP3 dans les cellules ELT3, nous avons observé que la LPP3 interagissait avec la LPP1 et qu'elle pourrait la séquestrer dans des compartiments membranaires internes. Cette séquestration entraine une diminution de l'actvité ecto-LPP au profit de l'activité intracellulaire qui pourrait réguler négativement la production de seconds messagers phospholipidiques. Ces résultats montrent l'importance des LPP dans la régulation des effets des phospholipides bioactifs et suggère un lien entre le caractère tumorale des cellules de léiomyomes et l'absence de la LPP3.

Les nucléosides diphosphate kinases (NDPK) sont essentielles pour la génération des nucléosides triphosphates (NTPs) en utilisant l’ATP et des NDPs. L’isoforme mitochondriale de NDPK (NDPK-D), située dans l’espace intermembranaire des mitochondries, possède deux modes de fonctionnement. Dans le premier mode (« phosphotransfert »), la protéine a une activité de kinase comme les autres enzymes NDPK. Dans ce mode de fonctionnement, NDPK-D produit du GTP pour la protéine optique atrophy 1 (OPA1), une GTPase impliquée dans la fusion des mitochondries, et de l’ADP pour le translocateur à adénine (ANT) et l’ATPase mitochondriale pour la régénération d’ATP. Le second mode de fonctionnement est appelé « transfert de lipide » et est lié à la capacité de la protéine à se lier aux phospholipides anioniques, particulièrement la cardiolipine (CL). Dans ce mode NDPK-D peut réticuler les deux membranes mitochondriales et transférer CL de la membrane interne vers la membrane externe des mitochondries, pouvant servir de signal pour la mitophagie et l’apoptose. Ce travail a pour objectif d’étudier plus en détails ces différentes fonctions de NDPK-D. En utilisant des cellules HeLa exprimant de façon stable la protéine sauvage, kinase inactive (mutation H151N) ou incapable de se lier aux lipides (mutation R90D) et des cellules épithéliales de poumons de souris, nous montrons (i) une grande proximité entre NDPK-D et OPA1 qui conduit au channeling de GTP par NDPK-D pour OPA1, (ii) le rôle essentiel de NDPK-D pour l’externalisation de CL vers la surface des mitochondries pendant la mitophagie, servant de signal de reconnaissance pour le complexe LC3-II-autophagosomes afin d’éliminer les mitochondries endommagées, (iii) la possible inhibition de l’externalisation de CL par la présence de complexes NDPK-D/OPA1, et (iv) un phénotype pro-métastatique des cellules HeLa exprimant la NDPK-D mutée (H151N ou R90D), caractérisé par un fort potentiel invasif et migratoire, un profil protéique altéré, et des modifications au niveau structural et fonctionnel du réseau mitochondrial. Finalement, une première stratégie d’expression et de purification de la protéine OPA1 entière a été établie pour de futures études in vitro des complexes NDPK-D/OPA1
The nucleoside diphosphate kinases (NDPK) are essential for generation of nucleoside triphosphates (NTPs) using ATP and NDPs. The mitochondrial NDPK isoform (NDPK-D) located in the mitochondrial intermembrane space is found to have two modes of function. First, the phosphotransfer mode in which the protein has a kinase activity like other NDPK enzymes. In this mode, NDPK-D produces GTP for the optic atrophy 1 protein (OPA1), a GTPase involved in mitochondrial fusion, and ADP for the adenylate translocator (ANT) and the mitochondrial ATPase for ATP regeneration. The second mode of function is called lipid transfer and is related to the capacity of NDPK-D to bind anionic phospholipids, especially cardiolipin (CL). In this mode, the protein can cross-link the two mitochondrial membranes and transfer CL from the inner to the outer mitochondrial membrane, which can serve as a signal for mitophagy and apoptosis. This work aims to study these NDPK-D functions in more detail. With the use of HeLa cells stably expressing the wild-type, kinase inactive (H151N mutation) or lipid binding deficient (R90D mutation) NDPK-D and mouse lung epithelial cells, we show (i) the close proximity between NDPK-D and OPA1 that leads to GTP channeling from NDPK-D to OPA1, (ii) the essential role of NDPK-D for CL externalization to the mitochondrial surface during mitophagy, serving as a recognition signal for LC3-II-autophagosomes to eliminate damaged mitochondria, (iii) the possible inhibition of CL externalization due to the presence of NDPK-D/OPA1 complexes, and (iv) a pro-metastatic phenotype of HeLa cells expressing either of the NDPK-D mutants (H151N or R90D), characterized by high invasive and migratory potential, altered proteomic profile and changed mitochondrial network structure and function. Finally, a first bacterial expression and purification strategy for full-length OPA1 has been established for future in vitro studies of NDPK-D/OPA1 complexes

Les triacylglycérol (TAG) est un métabolite hautement énergétique qui peut être facilement converti en biodiesel. Les TAG peuvent être produits à partir de plantes et de microalgues. L'étude des voies de signalisation de l'énergie peut offrir de nouvelles stratégies pour améliorer l'accumulation de biomasse et de TAG sans compromettre la croissance. Dans cette thèse, j'ai étudié le rôle de deux voies principales de signalisation énergétique: la voie du de guanosine ppGpp (guanosine penta(tétra) phosphate) dans le chloroplaste et la voie de TOR (Target of rapamycin) dans le cytosol. J'ai choisi de travailler sur la mousse Physcomitrella patens, un modèle d'eucaryote photosynthétique en raison de sa position évolutive entre les algues et les plantes vasculaires. Pour étudier le rôle du ppGpp, nous avons créé des lignées transgéniques exprimant de manière inductible une ppGpp synthase et sur-accumulant le ppGpp. J'ai trouvé que l'induction de SYN provoque une forte inhibition de la capacité photosynthétique en raison de l'inhibition de l'expression des protéines clés codées par les chloroplastes et aussi une réorganisation des membranes thylakoïdes. Pour l’étude de TOR nous avons traité la mousse avec des inhibiteurs de TOR et montré que cela provoque l’inhibition de la croissance de manière dose dépendante et l’accumulation de TAG. L’utilisation des marqueurs lipidiques a révélé la perte de petites vésicules associées à la croissance et l'accumulation de plus grandes structures de corps lipidiques. Des études supplémentaires permettront de développer des stratégies pour améliorer la production de biocarburants chez les organismes photosynthétiques
Triacylglycerol (TAG) is a highly energetic metabolite that can be easily converted into biodiesel. TAG can be produced from both plants and microalgae. However, plants have low TAG yields in their dominant vegetative tissues. Microalgae can accumulate high amounts of TAG, but only under stress, leading to growth inhibition and limiting yield. The study and manipulation of stress and energy signaling pathways can offer new strategies to improve biomass and TAG accumulation without compromising growth. In this thesis, I studied the role of two major energy signaling pathways: the guanosine penta(tetra) phosphate (ppGpp) pathway in the chloroplast and the target of rapamycin (TOR) pathway in the cytosol. I chose to work on the moss Physcomitrella patens which is an interesting model of photosynthetic eukaryote because of its evolutionary position between algae and vascular plants. To study the role of ppGpp we created transgenic lines that inducibly express a ppGpp synthase and over-accumulate ppGpp. I found that ppGpp accumulation causes a strong inhibition of photosynthetic capacity due to the inhibition of the expression of key chloroplast encoded proteins, and also reorganization of the thylakoid membrane system into super grana. For the TOR pathway, we treated P. patens protonema with active site TOR inhibitors and showed that this cause growth inhibition in a dose dependent manner and is accompanied by TAG accumulation. The use of lipid dyes reveals a shift from small growth associated vesicles to a larger oil body structures after treatment. Further studies will allow the development of new strategies for improving biofuel production in photosynthetic organisms

Au cours de ces dernières années, des études ont montré l’existence d’une compartimentation latéraledes composants de la membrane plasmique végétale, de manière analogue à ce qui avait été montréchez les animaux et les levures. L’objectif de cette thèse était d’apporter de nouveaux éléments decaractérisation de cette compartimentation (propriétés physiques de domaines particuliers, mécanismesde mise en place de ces domaines, de contrôle de leur taille, etc…) et d’étudier son rôle dans laphysiologie de la cellule végétale.Le développement d’une méthodologie de microscopie confocale spectrale couplée à l’utilisationd’une sonde environnementale a permis d’apporter la première description à l'échellesubmicrométrique de l’organisation du plasmalemme en territoires aux propriétés physiquesdifférentiées. Ces domaines coexistent au sein de la membrane plasmique de cellules en suspension,comme à celle de membranes artificielles composées de lipides modèles ou de lipides de membranescellulaires, de vésicules géantes constituées de membrane plasmique purifiée, ou de protoplastes.Cependant, les différences de l’organisation latérale observées chez ces différentes membranes ontpermis de montrer l’importance des phytostérols qui seraient, par le biais d'interactions spécifiquesavec d’autres lipides végétaux tels que les GIPCs, des composés essentiels pour la formation locale dedomaines lipidiques ordonnés. La grande diversité des lipides végétaux organiserait ainsi lacompartimentation de la membrane plasmique permettant la ségrégation dynamique des composantsmembranaires. Si les stérols augmentent de manière importante le degré de compaction de la bicouche,les protéines le diminuent. Le cytosquelette et la paroi ne semblent, quant à eux, modifier ni laprésence, ni l’organisation des domaines ordonnés de la membrane plasmique. Nous avons égalementmontré que l’organisation de ces domaines évolue transitoirement lors des étapes précoces de lacascade de signalisation induite par des réactions de défense. De fait, nous avons identifié desmodifications des propriétés physiques globales et de l’organisation fine de la membrane provoquéespar différents éliciteurs de réactions de défense, dont la cryptogéine, une protéine sécrétée parl’oomycète Phytophthora cryptogea. Nous avons montré que ces modifications sont un élémentgénérique de la signalisation de défense, sous la dépendance de phénomènes de phosphorylation, leburst oxydatif étant également une étape clé de l’augmentation du degré d’ordre observé dans lesphases précoces de cette signalisation. La cryptogéine, qui présente une aptitude singulière pour piégerles stérols, a également montré une capacité spécifique à augmenter la fluidité membranaire, ceparamètre pouvant contrôler l’intensité de la cascade de signalisation, mesurée par la production deformes actives d’oxygène.Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension des interactions cellule-élicitineet apportent un nouvel éclairage sur le rôle des lipides végétaux dans l’organisation latérale de lamembrane plasmique végétale et positionne la dynamique membranaire comme un élément designalisation de défense des plantes
Recent studies have shown the existence of lateral sub-compartmentalization of plant plasmamembrane similar to that of animal cells and yeasts. The aim of this thesis was to provide newelements to characterize this compartmentalization (physical properties of specific domains,mechanisms of their formation, determination of their size, etc...) and to study its role in thephysiology of plant cells.The development spectral confocal microscopy coupled with the use of an environment-sensitiveprobe enabled to obtain the first description at the submicron scale of plasma membrane organizationinto domains exhibiting various physical properties. These domains coexist at the plasma membranesurface of tobacco suspension cells as well as the membrane of vesicles composed of models lipids orcell plasma membrane lipids, purified plasma membrane vesicles, and protoplasts. However,differences in the lateral organization observed in these membranes have shown the importance ofphytosterols which are, through specific interactions with neighboring plant lipids such as GIPCs,essential for local formation of ordered domains. The huge diversity of plant lipids drives thecompartmentalization of the plasma membrane allowing the dynamic segregation of membranecomponents. Sterols greatly increase membrane order, whereas proteins tends to decrease it.Cytoskeleton and cell wall do alter neither presence nor organization of ordered domains of the plasmamembrane. We have also shown that the organization of these domains is transiently modified duringthe early stages of defense signaling cascade. In fact, we have identified changes in overall physicalproperties and fine lateral organization of the membrane caused by various elicitors of defensereactions, including cryptogein, a protein secreted by the oomycete Phytophthora cryptogea. We haveshown that these changes are a generic element of defense signaling cascade and depend onphosphorylation processes; oxidative burst being also a major actor of the control of the increase ofmembrane order observed during the very early stages of the signalling process. Cryptogein, whichexhibits the particular ability to trap sterols, also showed a specific capacity to increase membranefluidity and amplify the intensity of the signalling cascade, as measured by the production of reactiveoxygen species.These results open new perspectives in the understanding of cell-elicitin interactions and provide anew view on the central role of sterol composition in the lateral organization of plant plasmamembrane. They also identify membrane dynamics as a new player in the signalling cascade occurringduring plant defense

Les personnes en surcharge pondérale semblent préférer une alimentation riche en graisse. Face à l'épidémie d'obésité qui touche nos Sociétés tant urbaines que rurales, élucider les mécanismes de la détection des lipides alimentaires devient un enjeu majeur. Il avait précédemment été admis que la glycoprotéine CD36 exprimée dans les papilles caliciformes de souris, est impliquée dans la perception oro-gustative des lipides alimentaires. Dans ce travail, nous avons montré que l'acide linoléique (LA), en activant les phospholipases A2, sPLA2, cPLA2 et iPLA2 via CD36, produit de l'acide arachidonique (AA) et la lyso-phosphatidylcholine (lyso-PC). LA déclenche un influx calcique dans les cellules CD36-positives et induit la production du facteur CIF (Calcium Influx Factor). CIF, AA et lyso-PC exercent différentes actions sur l'ouverture des canaux SOC (Stored Operated Calcium Channel) constitués de protéines Orai et contrôlés par STIM1. Stim1 est un senseur calcique situé sur la membrane du réticulum endoplasmique activé par la déplétion du calcium intracellulaire. Nous avons utilisé la technologie siRNA et des modèles de souris transgéniques pour montrer que CIF et lyso-PC activent des canaux calciques homodimériques composés de protéines Orai1 tandis qu’AA active des canaux hétéro-pentamériques composés d’Orai1 et Orai3. Nous avons également montré que STIM1 régule la production de CIF dans les cellules stimulées par la thapsigargine et l’acide linoléique ainsi que l'ouverture de deux types de canaux calciques. Par ailleurs les souris au phénotype Stim1-/- perdent la préférence spontanée pour les lipides observé chez les animaux de type sauvage. D’un autre côté les cellules CD36-positive de souris Stim1-/- sont incapables de libérer la sérotonine dans l'environnement extracellulaire. Nos résultats suggèrent que des acides gras à longue chaine (AGLC) induisent la signalisation calcique régie par STIM1 via CD36. La perception oro-gustative des lipides alimentaires détermine la préférence spontanée pour les lipides observée chez les mammifères
The lipid-binding glycoprotein CD36, expressed by circumvallate papillae (CVP) of the mouse tongue, has been shown to be implicated in oro-gustatory perception of dietary lipids. We demonstrate that linoleic acid (LA) by activating sPLA2, cPLA2 and iPLA2 via CD36, produced arachidonic acid (AA) and lyso-phosphatidylcholine (Lyso-PC) which triggered Ca2+ influx in CD36-positive taste bud cells (TBC), purified from mouse CVP. LA induced the production of Ca2+ influx factor (CIF). CIF, AA and Lyso-PC exerted different actions on the opening of store-operated Ca2+ (SOC) channels, constituted of Orai proteins and regulated by STIM1, a sensor of Ca2+ depletion in the endoplasmic reticulum. We used siRNA technology and transgenic mice models and observed that CIF and Lyso-PC opened Orai1 channels whereas AA-opened Ca2+ channels were composed of Orai1/Orai3. STIM1 was found to regulate LA-induced CIF production and opening of both kinds of Ca2+ channels. Furthermore, Stim1–/– mice lost the spontaneous preference for fat, observed in wild-type animals. The CD36-positive TBC from Stim1–/– mice also failed to release serotonin into extracellular environment. Our results suggest that fatty acid-induced Ca2+ signaling, regulated by STIM1 via CD36, might be implicated in oro-gustatory perception of dietary lipids and the spontaneous preference for fat

Les cellules eucaryotes possèdent un territoire membranaire dit « électrostatique » qui est définit par la présence de phospholipides négativement chargés sur la face cytosolique des membranes. Cette propriété permet le recrutement de protéine cytosolique contenant des motifs/domaines positivement chargés au niveau des membranes via des interactions électrostatiques. Nous nous sommes demandés si le territoire électrostatique est présent chez les cellules végétales et quel est son organisation ? Quels sont le(s) lipide(s) anionique(s) impliqués dans son maintien ? Et quel est son (ces) rôle(s) dans la signalisation et le développement des plantes ? Premièrement, nous avons mis en avant que la membrane plasmique est le compartiment intracellulaire le plus électronégativement chargé (Simon, Platre et al., 2016 Nature Plants). Ce champ électrostatique est gouverné par trois lipides anioniques différents, l’acide phosphatidique, la phosphatidylserine et le phosphatidylinositol-4-phosphate. Nous avons montré que cette propriété unique de la membrane plasmique permet de réguler des voies de signalisation hormonale, tel que celle de l’auxine et des brassinostéroïdes. Notamment, la phosphatidylserine régule la dynamique spatiotemporelle des petites GTPases de la famille Rho. En réponse à l’auxine, ce lipide permet de regrouper les protéines Rho dans des domaines membranaires. La formation de ces domaines est requise pour l’activité de ces protéines permettant de contrôler l’endocytose, la dynamique du cytosquelette mais également régule la morphogenèse cellulaire ainsi que la réponse gravitropique de la racine
The « electrostatic territory» is part of the eukaryotic membrane organization and is defined by the enrichment of negatively charged phospholipids at the membrane cytosolic face. This feature is involved in the membrane recruitment of cytosolic proteins, which contain positively charged motifs and/or domains. In this work, we used Arabidopsis thaliana as a model and explored the existence of an electrostatic territory in plant cells. We found that the plasma membrane is the most anionic intracellular membrane (Simon, Platre et al., 2016 Nature Plants). This electrostatic field is maintained by lipid cooperation between, phosphatidic acid, phosphatidylserine and phosphatidylinositol-4-phosphate. The cell surface unique feature is involved in the regulation of hormonal signalling such as auxin and brassinosteroids pathways. We found that phosphatidylserine tunes the spatiotemporal dynamics of small GTPases from the Rho family. During auxin response, PS is required to cluster Rho into specialized membrane domains. We show that nanocluster formation is required for Rho-mediated auxin signaling including the regulation of endocytosis, cytoskeleton organization, morphogenesis and the root gravitropic response

La maladie d’Alzheimer (MA) est une démence progressive caractérisée dans ses stades précoces par une perte synaptique et une dégénérescence neuronale. Aucun traitement efficace n’est disponible à ce jour et les mécanismes moléculaires impliqués sont encore mal connus. Des études récentes, menées notamment par notre équipe, indiquent que les oligomères de peptide amyloïde-ß (Aß) interagissent avec la membrane plasmique et y induisent un stress cellulaire impliquant des cascades apoptotiques. Ce travail a été consacré à l’étude de l’influence du statut lipidique sur la sensibilité des neurones au peptide Aß soluble et sur la signalisation pro-apoptotique. Nous avons montré que ce peptide induit un remodelage membranaire conduisant à la mort neuronale en activant des voies pro-apoptotiques et en inhibant des voies de survie. Par contre, la supplémentation du milieu en acide docosahexaénoïque (DHA), acide gras polyinsaturé de type ?3, protège les neurones de la mort induite par le peptide Aß. Cet effet préventif semble dépendre d’une incorporation du DHA pouvant localement induire un remodelage membranaire discret capable de préserver des voies de croissance et de survie cellulaire. Le DHA n’agit toutefois pas en inhibant l’activation de la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2) et le stress oxydant induits par le peptide Aß, mécanismes que nous avons observés être impliqués dans la voie pro-apoptotique menant à la production de céramides suite à l’activation des sphingomyélinases. Ces enzymes occupent une position essentielle dans la toxicité du peptide Aß, puisqu’un prétraitement par le DHA ou par la sphingosine-1-phosphate, connue pour son potentiel antiapoptotique, protège les neurones en inhibant la sphingomyélinase acide. Les travaux de cette thèse ont donc montré que les lipides, molécules structurales mais aussi médiateurs de signalisation, sont des acteurs essentiels à considérer pour le développement de stratégies préventives ou thérapeutiques contre la MA
Alzheimer’s disease (AD) is a progressive dementia characterised in the early stages by synaptic loss and neurodegeneration. Currently, no effective treatments are available and the molecular mechanisms implicated are still unknown. Recent studies, including ours, indicate that the direct interaction between soluble amyloid-ß (Aß) oligomers and the plasma membrane initiates a cellular stress involving apoptotic cascades. The present work focuses on the impact of lipid status on neuronal susceptibility to the toxicity of soluble Aß peptide and on the pro-apoptotic signalling pathways. We showed that this peptide induces membrane remodelling, thereby activating pro-apoptotic pathways and inhibiting survival signalling, which leads to neuronal cell death. This was however prevented in neurons cultured in a medium supplemented with docosahexaenoic acid (DHA), an ?3 polyunsaturated fatty acid. This protective effect seems to rely on subtle local membrane remodelling due to DHA incorporation, which maintains active survival and growth pathways. DHA did not prevent either cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) or oxidative stress upon soluble Aß peptide exposure. These two events have already been reported by our team to be implicated in a pro-apoptotic cascade leading to ceramide production due to the activation of sphingomyelinases. These enzymes very likely play a central role in Aß peptide toxicity, as pretreatments with DHA or sphingosine-1-phosphate, a well-known anti-apoptotic compound, lead to neuronal protection through the inhibition of acid sphingomyelinase. This PhD thesis demonstrates that lipids, as structural molecules as well as signalling mediators, are essential players that could be used to develop strategies for the prevention or treatment of AD

L'atrophie musculaire bulbo-spinale (SBMA) est une dégénérescence lente et progressive des motoneurones causée par l'élongation du triplet nucléotidique (CAG) dans le gène codant pour le récepteur aux androgènes (RA) localisé sur le chromosome X. Dans la SBMA, ce récepteur à extension polyglutaminique (polyQ) pathogène s'accumule de manière ligand dépendante dans le cytoplasme sous forme d'agrégats mais également dans le noyau y créant des corps d'inclusions nucléaires considérés comme la marque identitaire histologique, dont le caractère cytotoxique est aujourd'hui remis en question. Nous avons développé un modèle SBMA in vitro basé sur l'expression inductible d'un RA51Q dans la lignée hybride NSC34, qui est comparé au modèle normal NSC34 exprimant un RA contenant 20Q. Nous avons démontré que l'expression du RA51Q entraîne une diminution de la viabilité ainsi qu'une altération de la croissance neuritique sans formation d'agrégats insolubles dans le noyau ou le cytoplasme des cellules. Le RA en tant que membre de la superfamille des récepteurs nucléaires est un facteur de transcription mais peut également induire des voies de signalisation non génomiques via sa localisation membranaire. Après avoir montré une localisation du RA20Q et du RA51Q dans les « lipid rafts », nous avons corrélé la diminution de la viabilité et de la pousse neuritique induite par le RA51Q à une altération de la signalisation cellulaire non génomique. Les résultats obtenus mettent en évidence une dérégulation des voies de signalisation PI3K/Akt et JNK/c-jun induite par l'expression du RA muté dans notre modèle SBMA
Spinal Bulbar Muscular Atrophy (SBMA) is a progressive inherited motoneuron disease caused by the expansion of a trinucleotide (CAG) repeat in the gene coding for the androgen receptor (AR) located on the X chromosome. This rare disease causes muscle weaknesses, hypotonia, hyporeflexia, fasciculations of facial muscles in male patients. The androgen-dependent formation of cytoplasmic aggregates and nuclear inclusions are pathological hallmarks of this polyglutamine disease but their potential neurotoxicity is still under debate. We developed a SBMA model based on a doxycycline-inducible AR51Q expression system in the NSC34 hybrid cell line. We have shown that the expression of the mutated AR leads to a reduced viability and to an alteration of neurite outgrowth compared to cells expressing the normal AR20Q. The AR belongs to the nuclear receptor superfamily of transcription factors. However, recent data have put in evidence a membrane localization of AR initiating non-genomic signaling pathways. Because we have not observed insoluble aggregates, reduced viability and neurite outgrowth could not be correlated to AR aggregation. We hypothesized that motoneuron death is not only due to aggregate formation but also to the alteration of AR signaling pathways. We focused on a correlation between the AR localization in lipid rafts and the observed phenotypes. Our results highlight the deregulation of PI3K/Akt and JNK/c-jun signaling pathways induced by the expression of AR51Q in our SBMA model

La formation de métastases est la cause majeure des décès par cancer. Le développement de métastases est consécutif à une série d‟événements complexes tels que la migration, l‟invasion et la prolifération cellulaire. Le canal potassique SK3 (membre de la famille des SKCa) régule la migration des cellules cancéreuses du sein et favorise le développement de métastases osseuses. Le but du projet était d‟identifier et de caractériser les voies d‟entrées calciques associées à la migration cellulaire dépendante du canal SK3 dans différents cancers (sein, colon et prostate). Nous avons pu mettre en évidence que les canaux Ca2+qui étaient associés au canal SK3 variaient en fonction du cancer et régulaient la migration cellulaire dépendante du canal SK3. De plus, nous avons montré que la localisation de ces complexes KCa/Ca2+ dans les radeaux lipidiques était importante pour leur régulation et leur fonction. Ainsi, la délocalisation de ces complexes hors des radeaux lipidiques par des alkyl-phospholipides est un moyen permettant de moduler la migration des cellules exprimant le canal SK3 et le développement de métastases
In most cases of cancer, metastasis and not the primary tumor per se is the main cause of mortality. To establish secondary growth in distant organs cancer cells must develop an enhanced propensity to migrate. The key objective of this thesis proposes that some actors of Ca2+ signaling (Orai, and TRPC, STIM) coupled to SK3 channel would form complexes that play a critical role in cell migration of various cancers (breast, colon and prostate). Furthermore we showed that the localization of these channels complexes in lipid-rafts is essential to their regulation and function. Thus, the delocalization of these complexes of lipid-raft outside by alkyl-phospholipids could be a new way to modulate the SK3/Ca2+ dependent cell migration and metastasis development

Le stress engendre par l'irradiation active les voies de transduction du signal necessaires a l'arret du cycle cellulaire et a la reparation des lesions sur l'adn, ou alternativement, la mort cellulaire programmee. Nous avons caracterise le gene atpap2a dont la transcription est induite de facon transitoire et rapide apres irradiation d'arabidopsis thaliana. Atpap2a code pour une proteine presentant de fortes homologies avec une famille de proteines membranaires caracterisees chez les mammiferes et la levure : les lpp, qui interviennent dans la transduction du signal. Le sequencage systematique du genome d'arabidopsis a permis de mettre en evidence deux genes codant pour des proteines apparentees a atpap2a : atpap2b et atpap2c (que nous n'avons pas etudie). Les genes de plante atpap2a et atpap2b, exprimes chez la levure, restaurent effectivement les activites acide phosphatidique phosphatase et diacylglycerolpyrophosphate phosphatase du double mutant de levure dpp1lpp1. Atpap2a et atpap2b presentent, des proprietes enzymatiques differentes. L'expression des genes atpap2a et atpap2b, n'est pas regulee de la meme facon apres differents types de stress biotiques et abiotiques. L'expression d'atpap2a est induite apres le stress, alors que celle d'atpap2b ne l'est pas. Atpap2a est exprime essentiellement dans les feuilles d'arabidopsis, alors qu'atpap2b est exprime dans tous les organes vegetaux. Les fonctions de ces genes homologues structuraux pourraient donc etre differentes. Atpap2a interviendrait dans la reponse generale du vegetal au stress et atpap2b dans le metabolisme phospholipidique.

Outre leur rôle de constituants des membranes, les phospholipides participent de façon dynamique à de nombreux mécanismes de signalisation intracellulaire. C'est en particulier le cas des phosphoinositides qui exercent leur rôle en tant que précurseurs de seconds messagers ou en organisant directement de façon spatio-temporelle certaines grandes voies de signalisation. Leurs taux sont finement contrôlés par le jeu de kinases, phosphatases et phospholipases spécifiques dont la dérégulation peut conduire à des pathologies telles que cancers ou maladies génétiques. Récemment, un nouveau phosphoinositide, le phosphatidylinositol 5-phosphate (PI(5)P), a été identifié. Nous avons étudié son rôle en utilisant un modèle d'infection par le pathogène Shigella flexneri. Au cours de l'invasion, cette bactérie injecte dans la cellule hôte une PI(4,5)P2 4-phosphatase, IpgD, qui transforme alors une fraction importante de PI(4,5)P2 en PI(5)P. Cette conversion induit l'activation de la voie du proto-oncogène Akt. Des sondes spécifiques liant le PI(5)P ont permis de colocaliser ce dernier avec la forme activée d'Akt au niveau du foyer d'entrée de la bactérie. L'infection avec des Shigelles sauvages ou délétées d'IpgD, ou l'expression ectopique d'IpgD ont montré que la production de PI(5)P conduit à une augmentation des produits de la phosphoinositide 3-kinase (PI3K) responsables de l'activation d'Akt. L'implication spécifique du PI(5)P dans ce mécanisme a été déterminée par une série d'approches génétiques et biochimiques permettant de manipuler sélectivement les taux intracellulaires de PI(5)P ou d'autres phosphoinositides. .
Besides their structural role as membrane components, phospholipids play an active part in the regulation of many intracellular signalling pathways. This is particularly the case for phosphoinositides that act as precursors of second messengers or that govern signaling pathways in a spatio-temporal manner. Phosphoinositides levels are tightly controled by specific kinases, phosphatases and phopholipases, and deregulation of some of these enzymes have been linked to pathologies such as cancers or genetic diseases. Recently, a new phosphoinositide, the phosphatidylinositol 5-phosphate (PI(5)P), has been identified. We have studied the function of PI(5)P using an infection model with the pathogen Shigella flexneri. During invasion, the bacteria injects in the host cell the PI(4,5)P2 4-phosphatase, IpgD, that was shown to convert most of the PI(4,5)P2 into PI(5)P. This conversion induces the activation of the Akt oncogenic pathway. Specific probes that bind PI(5)P enable us to colocalize this lipid with activated Akt at entry foci. .

Le TNF alpha (Tumor Necrosis Factor alpha) est une cytokine pro-inflammatoire existant sous deux formes moléculaires, une forme transmembranaire étant clivée au niveau de la membrane pour générer une forme soluble. Le TNF alpha est impliqué dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques dont l'athérosclérose. Au sein de la plaque, le TNF alpha soluble semble jouer un rôle majeur : des souris génétiquement modifiées et exprimant exclusivement une forme membranaire non clivable du TNF alpha développent des plaques d'athérosclérose dont l'état inflammatoire est significativement réduit par rapport à celles des souris sauvages (Canault et al. , 2004). Le clivage de la forme membranaire du TNFalpha est médié par la métalloprotéase ADAM-17 (A Disintegrine and Metalloproteinase-17). A ce jour, la régulation de l'activité de clivage d'ADAM-17 est peu documentée. Nous avons émis l'hypothèse que la localisation membranaire d'ADAM-17 et de ses substrats participait à cette régulation. Nous montrons que la forme mature d'ADAM-17 est contenue dans des domaines particuliers de la membrane, les radeaux lipidiques (Tellier et al. , 2006), et que cette localisation conditionne son activité. Nous avons également montré que des modifications de l'homéostasie du cholestérol des cellules par des HDLs conduisaient à une perturbation du clivage des substrats d'ADAM-17 (Tellier et al. , 2007). Le TNF alpha induit de multiples voies de signalisation dans les cellules de la plaque d'athérosclérose, conduisant, entre autres, à la prolifération des CML (cellules musculaires lisses). La littérature montre que le TNF alpha induit l'activation de sphingomyélinases (SMase) neutres et que le rôle mitogène des SMases implique les métalloprotéinases MMP-2 et MT1-MMP (Auge et al. , 2004 ; Nègre-Salvayre et al. , 2005). Nous avons posé l'hypothèse que le TNF alpha pouvait induire la prolifération cellulaire par une voie impliquant l'activation des métalloprotéases et des sphingomyélinases neutres. Nos résultats montrent que le TNFalpha stimule la prolifération des cellules musculaires lisses et des fibroblastes par activation séquentielle de la pro-protéine convertase furine, des métalloprotéases MT1-MMP et MMP-2, puis de la voie sphingomyéline/céramide (Tellier et al. , 2007). En conclusion, nos résultats apportent des données nouvelles sur la régulation de la biodisponibilité du TNF alpha ainsi que sur son effet pro-athérogène via l'activation d'une voie mitogène de stress
TNF alpha (Tumor Necrosis Factor alpha) is a pro-inflammatory cytokine existing in two molecular forms, a transmembrane form cleaved to produced a soluble form. TNF alpha is implicated in numerous physiological and physiopathologicals processes such as atherosclerosis. Within the lesions, soluble TNF alpha seems to play a major role : genetically modified mice expressing exclusively a transmembrane form of TNF alpha develop atherosclerosis lesions with an inflammatory state which is significantly reduced compared to lesions of wild type mice (Canault et al. , 2004). Cleavage of TNF alpha transmembrane form is due to the metalloproteinase ADAM-17 (A Disintegrine and Metalloproteinase-17). Today, regulation of ADAM-17 cleavage activity is poorly documented. We have voiced hypothesis that the membrane localization of ADAM-17 and its substrates was implicated to its regulation. We show that ADAM-17 mature form is localized into membrane particular domains, the lipid rafts (Tellier et al. , 2006) and that this localization determined its activity. We also show that cell cholesterol homeostasis modifications by HDLs lead to a ADAM-17 substrates cleavage perturbations (Tellier et al. , 2007). TNF alpha induce number signaling pathways in atherosclerosis plaques cells, leading to several effects including SMC (smooth muscle cells) proliferation. Literature show that TNF alpha active neutral sphingomyelinase (nSMase) and that nSMase mitogene effect involve MMP2 and MT1-MMP (Auge et al. , 2004 ; Nègre-Salvayre et al. , 2005). We have postulated that TNF alpha could induce cell proliferation by a pathway implicating metalloproteinases and neutral SMase activation. Our results show that TNF alpha induced mesenchymal cells proliferation is due to pro-protein convertase furin, MT1-MMP ad MMP2 metalloproteinases sequential activation followed by sphingomyeline/ceramide pathway (Tellier et al. , 2008). In conclusion, our results give new data on the TNF alpha biodisponibility regulation as on pro-atherogene effect via stress mitogene pathway activation

Identification et caractérisation de la première N-acylphosphatidyléthanolamine synthase chez A. thaliana. Les N-acylphosphatidyléthanolamines (NAPE) sont des phospholipides complexes peu abondants au sein des membranes biologiques mais largement répandues dans différents organismes. Outre ses fonctions de stabilisation des membranes ce lipide est davantage connu pour être le précurseur des N-acyléthanolamines (NAE) qui sont impliquées dans de très nombreuses voies de signalisation chez les plantes (lors de la germination, du développement racinaire, de l’induction de gène de défense, etc.) comme chez les animaux (apoptose, ligand des récepteurs endocannabinoïdes, notion de satiété, etc.). Au début de ma thèse, les gènes codant pour les enzymes impliquées dans les différentes étapes de la voie métabolique des NAE (e.g NAPE-PLD, FAAH1 et 2) ont été caractérisées exceptées le ou les gène(s) codant pour l’enzyme catalysant la synthèse de NAPE précurseurs de ces lipides. Une étude bioinformatique a permis d’identifier de nouvelles séquences codantes pour des acyltransférases putatives chez A. thaliana dont celle du gène At1g78690. La caractérisation fonctionnelle de cette enzyme a été déterminée après son expression hétérologue chez E.coli sur fractions membranaires et protéines purifiées. Puis le profil d’expression génique, la localisation cellulaire de la protéine ainsi que son activité ont été étudiés chez les plantes à partir notamment de mutants d’A. thaliana (ADN-T et « 35S »). Les résultats obtenus au cours de cette étude ont permis d’identifier et de caractériser la première NAPE synthase chez les plantes
Discovery and characterization of an A. thaliana N-acylphosphatidylethanolamine synthase. N-acylphosphatidylethanolamine (NAPE) is a widespread, albeit minor, membrane phospholipid in various organisms. Besides its stabilizing properties to membranes bilayers, NAPE is known to be the precursor for N-acylethanolamine (NAE) synthesis. NAE have been shown to regulate a variety of physiological functions in both plants (germination, root development, gene induction, etc.) and animals (apoptosis, ligand for cannabinoid receptors, satiety properties, etc.) At the beginning of my PhD, the genes encoding the enzymes involved in the different steps of NAE metabolism were well characterized (e.g NAPE-PLD, FAAH 1 and 2), with the exception of the NAPE synthase gene(s). A bioinformatic study allowed the identification of coding sequences for putative new acyltransferases in A. thaliana, such as the At1g78690 gene. After expression in E. coli, the functional characterization of At1g78690p was carried out by analyses of the lipid content and by enzymatic assays using membrane fractions or purified proteins. The localisation of the protein and its activity were also studied in A. thaliana mutants (ADN-T and “35S”). This study shows the identification and characterization of the first NAPE-synthase in plants

Dans ce travail, nous démontrons que STIM1, un senseur calcique activé par la déplétion du Ca2+ intracellulaire du réticulum endoplasmique, est indispensable pour la signalisation calcique et la préférence oro-sensorielle du gras. Nous observons que l'acide linoléique (LA), en activant les phospholipases A2 via CD36, produit de l'acide arachidonique (AA) et de la lyso-phosphatidylcholine (lyso-PC). Cette activation déclenche un influx calcique dans les cellules CD36-positives, et induit la production du facteur CIF (Ca2+ Influx Factor). CIF, AA et lyso-PC exercent différentes actions sur l'ouverture des canaux SOC (Stored Operated Calcium Channel) constitués de protéines Orai et contrôlés par STIM1. Par ailleurs, les souris au phénotype Stim1-/- perdent la préférence spontanée pour les lipides et la libération de la sérotonine à partir des cellules gustatives dans le milieu extracellulaire chez les animaux sauvages. Nous demontrons aussi que la signalisation calcique médiée via CD36 est doublement modulée lors de l'obésité. L'augmentation de la [Ca2+]i dans les cellules gustatives observée chez le Psammomys obesus, un modèle d'obésité nutritionelle, est fortement diminuée chez les souris rendues obèses par un regime hyperlipidique. Nous avons constaté également que l'interaction de LA avec le CD36 induit l'activation des MAP Kinases de la voie MEK1/2/ERK1/2/Elk-1 qui est non seulement à l'origine de l'activation des aires cérébrales telles que le NTS, le noyau arqué, l'hippocampe mais aussi indispensable pour la préférence spontanée pour les lipides alimentaires. Nos résultats suggèrent pour la prémière fois, que la voie ERK1/2 des MAPK et la signalisation calcique lipidique controlée par STIM1 sont impliquées dans la perception oro-gustative des lipides

La thèse est consacrée à l'étude de la signalisation lipidique comme un mécanisme universel de médiation des réponses cellulaires à phytohormones et élicitors jouant ainsi un rôle clé dans la réorganisation de métabolisme cellulaire pendant l'adaptation de la plante aux changements environnementaux.Phospholipase D (PLD) et son produit acide phosphatidic (PA) ont étés impliqués au cascades de signalisation induites par l’acide salicylique (SA) dans les cellules de garde de Arabidopsis thaliana. On a trouvé une activation de PLD et la production de PA dans les feuilles des plantes après le traitement par SA. En utilisant le marquage radioactif des phospholipides, l'analyse histochimique, les inhibiteurs de la signalisation lipidique et des lignées transgénique des plantes, nous avons montré la participation de la PLD et la NADPH-oxidase RbohD à la formation du superoxyde dans les tissues d’Arabidopsis et à la fermeture des stomates induite par SA.La cooperation entre le SA et l’acide abscisic (ABA) dans la réorganisation de transcriptome induite par ces hormones a été examinée dans la culture de la suspension cellulaire. Tant SA que l'ABA ont inhibé l'activité basale in vivo de phospholipase C dépendante de phosphatidylinositol (PI-PLC), tandis que SA (mais pas ABA) a incité aussi le phosphorylation de phosphatidylinositols. Les transcriptomes de cellules après le traitement par SA ou ABA ont été comparé à ceux obtenus aprés le traitement avec U73122 ou wortmannin. Nous avons trouvé des groupes de gènes, pour qui l'effet d'ABA et des inhibiteurs était semblable; des gènes dependants du SA via l'équilibre des phosphoinositides et des gènes dependants du SA via l’activité de PLD. Basé sur l'analyse bioinformatique de toutes les groupes de gènes choisis, nous proposons le règlement du niveaux des phosphoinositides comme un facteur important dans la regulation du transcriptome basal et également dans les changements du profile transcriptomique induits par l'effet du SA ou d'ABA.L'effet du peptide bactérien flg22 sur l’équilibre des phospholipides a été détecté tant dans des cellules de suspension que dans des plantules. Flg22 a induit l'accumulation de PA par l'activation de PI-PLC couplée a la diacylglycerolkinase 5 (DGK5), et egalement la diminution de niveau de phosphatidylinositol-4,5-biphosphate, qui est un substrat de PI-PLC. L'analyse des effects des inhibiteurs a révélé la participation des DGK et PI-PLC dans la production des espèces d'oxygène réactive (ROS) induite par flg22. La production du PA a été placée dans la cascade de la signalisation en aval de la reconnaissance du flg22 par le complexe de récepteur FLS2-BAK1, mais aprés la formation du ROS par NADPH-oxydase RbohD. Le rôle de DGK5 a été caractérisé dans la regulation du transcriptome; dans l’accumulation du callose induite par flg22 dans l’apoplast et dans la résistance au pathogène biotrophique Pseudomonas syringae pv tomato DC3000. Finalement, nous avons proposé un nouveau modèle de perception du flagellin qui inclut PI-PLC et DGK5.Le rôle de phosphoinositides dans les cascades de la signalisation d’auxin et cytokinin a été révélé dans la morphogenesis racinaire dans le mutant d'Arabidopsis pi4kb1b2 (muté dans deux isoformes de PI4K) et pi4kb1b2sid2 (contient la mutation supplémentaire de l'enzyme de biosynthèse du SA, permettant de séparer les effets du mutation en PI4K qui dependent du SA). Nous avons analysé l'anatomie de la meristem des racines, l'allongement de cellules corticales, la réponse gravitropic, les réponses aux hormones exogènes et nous avons montré la connexion entre l'activité PI4K avec les effets d’auxin et de cytokinin pendant le morphogenesis racinaire et gravitropism. Nos résultats élargissent la connaissance de la nature de la signalisation phytohormonale dans les plantes et peuvent être utilisés comme une base pour augmenter la résistance de céréales agricolement importantes aux contraintes de l’environnement
Thesis is devoted to the investigation of lipid signaling processes as a universal mechanism mediating cellular responses to phytohormones and elicitors thus playing a key role in cell metabolism remodeling during plant adaptation to environmental changes. Phospholipase D (PLD) and its product phosphatidic acid (PA) were found to be involved to the SA-induced signaling cascades in Arabidopsis thaliana guard cells. Using radioactive labeling of phospholipids we found an activation of PLD and production of PA in leaves of 4-week old plants after salicylic acid (SA) treatment. Using histochemical assay, inhibitor assay and transgenic lines knock-out by different isoforms of NADPH-oxidases, we showed the involvement of PLD and NADPH-oxidase RbohD to PA-mediated superoxide formation in Arabidopsis tissues infiltrated by SA and SA-induced stomatal closure. SA- crosstalk with abscisic acid (ABA) in transcriptome remodeling induced by these hormones was investigated in suspension cell culture. Both SA and ABA inhibited basal activity of phosphatidylinositol dependent phospholipase C (PI-PLC) in vivo, while SA (but not ABA) also induced the phosphorylation of phosphatidylinositols. Total transcriptomes of suspension cells after SA or ABA treatment were compared to those obtained from suspension cells treated with U73122 (PI-PLC inhibitor) or wortmannin (inhibitor of phosphatidylinositol-4-kinases (PI4K) that provide the substrate for PI-PLC catalyzed reactions). We found a specific gene clusters, for those the effect of ABA and inhibitors was similar; SA-dependent genes, regulated via the balance of phosphoinositides, and SA-dependent genes, regulated via PLD-mediated pathway. Based on the bioinformatic analysis of the promoters of all selected gene sets, we claim a phosphoinositides level regulation to be an important factor mediating basal cell transcriptome and expression changes induced by SA and ABA.The effect of bacterial peptide flg22 on phospholipid turnover was detected in both suspension cells and seedlings. Flg22 induced accumulation of PA by the activation of PI-PLC coupled with diacylglycerolkinase (DGK) and a corresponding parallel increase of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate content, that is a substrate of PI-PLC. Inhibitor analysis revealed the involvement of Ca2+ ions in lipid signaling enzymes reaction to flagellin treatment. We showed the role of DGK and PI-PLC in production of reactive oxygen species (ROS) induced by flg22. PA-production was placed in signaling cascade downstream of flagellin recognition by FLS2-BAK1 receptor complex receptor, but upstream or ROS formation by NADPH-oxidase RbohD. DGK5 was found to be the main source of the detected PA. The role of DGK5 was characterized in basal transcriptome regulation and its flagellin-induced remodeling; in flg22-induced callose accumulation in apoplast and resistance to biotrophic pathogen Pseudomonas syringae pv tomato DC3000. We proposed a new model of flagellin perception that includes PI-PLC and DGK5. Role of phosphoinositides in auxin and cytokinin signaling cascades was revealed studying root morphogenesis in Arabidopsis mutant pi4kb1b2 deficient for two PI4K genes, and pi4kb1b2sid2 that had additional mutation it key enzyme of SA biosynthesis, thus allowing us to separate SA-dependent and independent effects of the PI4K deficiency. pi4kb1b2 mutant plants exhibit the dwarf phenotype both in leaf and root parts, while pi4kb1b2sid2 show the normal rosette growth compared to WT, but still shorter roots. We analyzed root meristem anatomy, cortical cells elongation, gravitropic response, responses to exogenic hormones and firstly showed the connection of PI4K activity with auxin and cytokinin effects during root morphogenesis and gravitropism. Our results broaden the knowledge about the nature of plant phytohormonal signaling and can be used as a basis for increasing the resistance of agriculturally important crop plants to environmental stresses

Depuis une décennie, GBF1 a émergé comme étant un facteur cellulaire essentiel à la réplication de plusieurs virus à ARN de polarité positive (ARN(+)), issus de différentes familles. GBF1 est un facteur d’échange nucléotidique de petites protéines G de la famille Arf, connu pour son action régulatrice des étapes précoces de la voie de sécrétion. En étudiant le virus de l’hépatite C (VHC) comme virus modèle, nous avons montré que le rôle de GBF1 dans la réplication virale est distinct de sa fonction régulatrice de la voie de sécrétion. En effet,GBF1 participe à la réplication du VHC par l’intermédiaire de la paire Arf4 et Arf5, alors que c’est la paire Arf1et Arf4 qui est impliquée dans la voie sécrétion. Pour déterminer si ce mécanisme d’action est conservé parmi les virus à ARN(+), nous avons d’abord montré que GBF1 est impliquée dans l’infection par le virus de la fièvre jaune (YFV), le virus sindbis (SINV), le coronavirus 229E humain (HCoV-229E) et le coxsackievirus B4(CVB4). Puis, nos résultats indiquent que les infections YFV, SINV et HCoV-229E dépendent, tout comme le VHC, des protéines Arf4 et Arf5. Toutefois, le YFV et le SINV utiliseraient également une autre paire d’Arf,Arf1 et Arf4, lors de leur cycle viral. Par ailleurs, l’infection par le coxsackievirus B4 (CVB4) est dépendante de GBF1 mais ne semble pas dépendre des protéines Arf. Bien que GBF1 soit un facteur crucial pour la réplication des virus ARN(+), son mécanisme d’action ne semble donc pas être conservé.La paire Arf4-Arf5 semble impliquée dans la réplication de plusieurs virus à ARN(+). Cependant, ces deux Arf ont été très peu étudiées, contrairement à la protéine Arf1. Nous faisons l’hypothèse que la paire Arf4-Arf5 agit en régulant une série d’effecteurs spécifiques qui sont importants pour la réplication virale. Nos résultats montrent que la déplétion simultanée de Arf4 et de Arf5 perturbe la morphologie de l’appareil de Golgi, qui devient condensé, et des gouttelettes lipidiques (GL), qui s’accumulent et grossissent en périphérie cellulaire.Toutefois, une analyse lipidomique de cellules déplétées de Arf4 et Arf5 montre une composition lipidique inchangée, ce qui suggère un effet sur la morphologie des GL et non pas sur le métabolisme des lipides. Une analyse transcriptomique nous a permis de mettre en évidence une série de protéines, dont l’expression est modulée, suite à la déplétion de Arf4 et Arf5. Nous avons évalué l’implication potentielle de certaines d’entre elles dans l’infection du VHC, mais aucune ne s’est révélée importante pour ce virus. En conclusion, nos résultats ont permis de mettre en évidence de nouvelles fonctions de GBF1, médiées par la paire de protéines Arf4 et Arf5. Arf4 et Arf5 sont impliquées dans la régulation de la morphologie de l’appareil de Golgi et des GL ainsi que dans la réplication de plusieurs virus à ARN(+). Il reste à évaluer si ces fonctions sont indépendantes les unes des autres ou liées entre elles et quels effecteurs spécifiques elles font intervenir
GBF1 has recently emerged as a cellular factor essential for the replication of single-stranded positive-sense RNA ((+)RNA) viruses from different families. GBF1 is a guanine-nucleotide exchange factor of small G proteins of the Arf family, known to regulate the early secretory pathway. By studying the hepatitis C virus (HCV) as a model, we have shown that the role of GBF1 in viral replication is distinct from its regulatoryfunction of the sercretory pathway. Indeed, GBF1 function in HCV replication is mediated by Arf4 and Arf5,whereas another pair, Arf1 and Arf4, mediates the regulation of the secretion. To determine if this mechanism ofaction is conserved among (+)RNA viruses, we showed that GBF1 is involved in yellow fever virus (YFV),sindbis virus (SINV), human coronavirus 229E (HCoV-229E) and coxsackievirus B4 (CVB4) infection. Our results indicate that YFV, SINV and HCoV-229E infections are Arf4 and Arf5 dependent, as we previouslyshowed for HCV. However, YFV and SINV would also use another Arf pair, Arf1 and Arf4, during their lifecycle. In addition, CVB4 infection depends on GBF1, but doesn’t seem to depend on any Arf. Although GBF1 is required for (+)RNA viruses replication, its mechanism of action appears not to be conserved.The Arf4-Arf5 pair appears to be involved in the replication of several (+)RNA viruses. However, these twoproteins have been poorly studied so far, contrary to Arf1. Our hypothesis is that the Arf4-Arf5 pair regulatesspecific effectors involved in viral replication. Our results indicate that Arf4 and Arf5 simultaneous depletionalters the morphology of the Golgi apparatus, which becomes condense, and of lipid droplets (LD), whichaccumulate and grow bigger at the cell periphery. However, a lipidomic analysis of Arf4 and Arf5 depleted cellsdisplayed an unaltered lipid composition, which suggests a morphologic impact on LD, rather than a disruptionof the lipid metabolism. A transcriptomic analysis identified proteins up- or down-regulated after Arf4 and Arf5 depletion. We assessed the function of some of these proteins in HCV replication, but none of them proved implicated.In conclusion, our results hightlighed new GBF1 functions, mediated by the pair Arf4-Arf5. Arf4 and Arf5 are involved in regulating the morphology of Golgi complex and of LDs, as well as the replication of (+) RNA viruses. It remains to assess if these functions are independent or related to each other, and which specific effectors they use

Les cellules sont composées de compartiments délimités par une membrane. Pour permettre aux protéines d’être associées aux membranes du bon compartiment, chaque membrane a une identité qui lui ait propre. Elle se définit par ses caractéristiques physiques et chimiques. Cependant, les compartiments d’une cellule échangent du matériel en permanence. Comment l’identité des membranes est maintenue malgré le flux constant d’échanges de protéines et de lipides lors des transports vésiculaires et non-vésiculaires ? Les phosphoinositides (PIPs) sont des lipides anioniques présents en faible quantité dans les membranes. Chaque PIP se localise différemment dans la cellule. Parmis les PIPs, le PI4P est présent à la membrane plasmique et au Golgi/trans-Golgi Network (TGN). Chez les plantes, PI4P est majoritairement trouvé à la membrane plasmique, contrairement aux animaux ou à la levure chez qui le PI4P se trouve principalement au niveau du TGN. Ainsi le gradient de PI4P le long de la voie d’endocytose est inversé chez les plantes par rapport aux autres eucaryotes. Chez les plantes, l’accumulation de PI4P à la membrane plasmique confère un champ électrostatique important qui recrute des protéines spécifiquement à cette membrane. Comment le gradient de PI4P est établi chez les plantes ? PI4Kα1 est capable de produire du PI4P à partir de phosphatidylinositol. PI4Kα1 se localise à la MP. Par ailleurs, PI4Kα1 est la sous-unité catalytique d’un complexe comprenant 3 autres protéines : NO POLLEN GERMINATION (NPG), EFR3 OF PLANTS (EFOP) et HYCCIN. Le complexe est ciblé à la membrane plasmique via une ancre lipidique au niveau de EFOP. Les orthologues de PI4Kα1 chez la levure et les animaux sont localisés à la membrane plasmique par des complexes protéiques similaires, démontrant une conservation des mécanismes de production des PIP chez l’ensemble des eucaryotes. L’absence du complexe PI4Kα1 entraine une létalité de la plantes au niveau du grain de pollen ou de l’embryon. Ainsi PI4Kα1 est essentiel à l’identité de la membrane plasmique et par conséquent au développement de la plante
Eukaryotic cells are composed of several membrane-surrounded compartments. Each compartment has a unique physicochemical environment delimited by a membrane with a specific biochemical and biophysical identity. The membrane identity includes the nature of the lipids, the curvature, the electrostaticity and the density of lipids at the membrane. The identity of each membrane allows the proper localization of membrane-associated proteins. Phosphoinositides are rare anionic lipids present in membranes. Five types of phosphoinositides exist in plants - PI3P, PI4P, PI5P, PI(4,5)P2 and PI(3,5)P2 - depending of the number and the position of phosphates around the inositol ring. They accumulate differently at the plasma membrane and in intracellular compartments and interact with proteins through stereo-specific or electrostatic interactions. Recent work uncovered that PI4P concentrates according to an inverted gradient by comparison to their yeast and animal counterpart. In plants, PI4P massively accumulates at the plasma membrane and is present in fewer amounts at the trans-Golgi Network (TGN). This PI4P accumulation at the cell surface drives the plasma membrane electrostatic field, which in turn recruits a host of signalling proteins to this compartment. Moreover the plant TGN is the place of vesicular secretion but is also involved in endocytic sorting and recycling, which might imply regulatory mechanisms of lipid exchanges or membrane identity maintenance between the plasma membrane and the TGN. Here, we characterized PI4Kα1 mutants and showed that pi4kα1 loss-of-function leads to pollen grain lethality and distortion in the allele transmission via the female gametophyte, while its knockdown displayed strong developmental phenotypes. Using yeast two hybrid screening and mass spectrometry, we identified that PI4Kα1 is part of an heterotetrameric complex composed of NO POLLEN GERMINATION (NPG), EFR3 OF PLANTS (EFOP) and HYCCIN (HYC). The interaction between PI4Kα1 and the structural subunits of the complex is essential to target PI4Kα1 at the plasma membrane. In addition, we showed that PI4Kα1 complex is anchored in immobile and predefined subdomains of the plasma membrane. This work opens new perspectives on the role of the PI4Kα1 complex in plasma membrane suborganization

L'organisation orientationnelle bio-moléculaire des lipides et des protéines dans la membrane plasmique constitue un facteur important dans les processus biologiques au cours desquelles les fonctions peuvent être reliées aux mécanismes d'orientation et d'organisation. Le concept de séparation transitoire des phases à l'échelle nanométrique dans les domaines ordonnés et désordonnés, aussi appelé « radeau lipidique », est maintenant largement accepté. De plus, les domaines ordonnés contiennent des protéines de signalisation, ce qui souligne l'importance des séparations de phase au cours des processus de signalisation. Dans cette thèse de doctorat, nous avons étudié l'ordre orientationnel moléculaire de la protéine de signalisation MHC Class I et de reporters lipidiques tels que di-8-ANEPPQ et DiI(C18). Nous avons étudié l'ordre orientationnel moléculaire de la protéine de signalisation MHC Class I et des reporters lipidiques par imagerie d'anisotropie de fluorescence résolue en polarisation. Nous avons observé l'influence du cytosquelette d'actine sur l'ordre orientationnel moléculaire de la protéine MHC et des reporters lipidiques dans la membrane plasmique. De plus, nous avons trouvé que l'ordre orientationnel moléculaire des reporters dépend de la morphologie cellulaire. Nous avons examiné les plis membranaires en modifiant la forme des cellules de façon mécanique ou pharmacologique
Biomolecular orientational organization of lipids and proteins in the plasma membrane is a crucial factor in biological processes where functions can be closely related to orientation and ordering mechanisms. The concept of transient nanosized phase separations in ordered and disordered domains, called "lipid rafts" is now widely accepted. Furthermore, the ordered domains are enriched in signaling proteins, which highlights the crucial impact of phase separation during the signaling processes. While this field has been so far largely addressed by studying the translational diffusion behavior of membrane proteins and lipid reporters by Single Molecule Tracking (SMT) or Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), only little is known about the orientational behavior of signaling proteins and lipid reporters in the plasma membrane. In this PhD thesis we investigated the molecular orientational order of the signaling molecule MHC Class I protein using fluorescence anisotropy imaging as well as of lipid reporter di-8-ANEPPQ using polarization-resolved fluorescence imaging. Fluorescence anisotropy imaging requires a fluorescent label rigidly attached to the system under study, able to report its orientational order behavior. Thus, MHC Class I protein has been successfully labeled in a rigid way. We analyzed the orientational order of MHC Class I protein quantitatively in the endomembrane and plasma membrane and we found that the orientational order of MHC Class I protein in both membranes depends primarily on the maturation state of the protein and its interaction with the cytoskeleton

Les exosomes sont des vésicules de 60-90nm sécrétées par différentes cellules immunitaires et capables d'induire une immunité anti-tumorale. Lors de ce doctorat, nous avons montré que les exosomes de mastocytes présentaient une composition lipidique spécifique. Leur membrane est particulièrement rigide et présente une vitesse de flip-flop élevée. D'autre part, l'inactivation de la phospholipase D2 (PLD2) - à l'origine d'un lipide fusogène, l'acide phosphatidique - diminue la sécrétion d'exosomes. La PLD2 est enrichie et active sur les exosomes eux-mêmes et pourrait intervenir dans l'interaction entre exosomes et cellules cibles. Enfin, nous avons observé que cette interaction menait à l'entrée des exosomes dans les cellules cibles. Ce doctorat a donc permis d'établir la structure lipidique des exosomes et de mieux comprendre leur biogenèse et leur interaction avec leurs cellules cibles. A posteriori, ces résultats pourraient contribuer à améliorer les thérapies anti-tumorales utilisant les exosomes
Exosomes are small vesicles (60-90nm) secreted by different immune cells and which are able to induce anti-tumoral immunity. During this PhD, we have shown that exosomes from mast cells displayed a special lipid composition. Their membranes are particularly rigid and display a high flip-flop speed. Then, inactivation of phospholipase D2 (PLD2), an enzyme producing a fusogenic lipid, phosphatidic acid, decreases exosomes secretion. Moreover, PLD2 is enriched and active on exosomes and could be involved in interaction mechanisms between exosomes and their target cells. Finally, we have shown that this interaction led to internalisation of exosomes by their target cells. Thus, this PhD allowed to establish lipid structure of exosomes and to better understand their biogenesis and their interaction with target cells. Later, these results could contribute to promote anti-tumoral therapies using exosomes

At the plasma membrane, both NGF receptors have been shown to localized to lipid rafts, specific subdomains that are enriched in cholesterol, sphingolipids and the presence of caveolin proteins (Cav1 and/or Cav2). The focus of this work is on this membrane microenvironment mediated modulation of NGF signaling which via two receptors: p75NTR and TrkA. In the present work we found that overexpression of Cav-1 in mouse dorsal root ganglia neurons significantly impacted neurite extension. Similarly, overexpression of Cav-1 in PC12 cells strongly inhibits their ability to grow neurites in response to NGF. It inhibits NGF signaling without, impairing transient MAPK pathway activation. Rather, it does so by sequestering NGF receptors in lipid rafts, which correlates with the cell surface localization of downstream effectors, and phosphorylated-Rsk2, resulting in the prevention of the phosphorylation of CREB. By contrast, overexpression of Cav-2 potentiates NGF induced differentiation, which is accompanied by sustained activation of downstream effectors, and standard internalization of the receptors. This differential effect could be due to the different localization of Caveolins, that modifies the microenvironment, thereby affecting NGF signaling. Furthermore, PC12 cells expressing the non-phosphorylatable Cav-1 mutant (S80V), neither TrkA trafficking or CREB phosphorylation are inhibited and the response resembles that observed in Cav-2 expressing PC12 cells. These studies underline the interplay between caveolins and NGF signalling, offering insight into the potential impact of Caveolin-1 and mutations thereof in certain cancers where NGF signaling is involved.

Des mutations dans les gènes codant pour des myotubularines (MTM) sont responsables de maladies neuromusculaires telles que la XLCNM (MTM1) ou la CMT4 (MTMR2 & MTMR13). Les MTMs sont des phosphatases à phosphosinositides (PPIn), des messagers lipidiques essentiels pour la régulation spatio-temporelle de fonctions cellulaires vitales.La présence de 14 paralogues de MTMs chez l'Homme complique l'analyse de la fonction cellulaire d'un seul membre de la famille. La levure Saccharomyces cerevisiae, dont l'organisation cellulaire est comparable à une cellule humaine, ne compte en revanche qu'un seul homologue de MTM (YMR1), pour lequel nous disposons de mutants de délétion viables.L'expression de MTM1 sauvage ou mutants de patients dans la levure montre seules les myotubularines enzymatiquement actives induisent une morphologie anormale du compartiment lysosomal et un défaut du trafic membranaires endocytique.Nos résultats suggèrent que l'activité phosphatase de MTM1 ne serait pas à elle seule responsable de la XLCNM mais que d'autres mécanismes, tels que les interactions protéiques, pourraient prendre part au développement de la maladie.

Le réticulum endoplasmique et la mitochondrie sont deux organites majeurs impliqués dans la régulation du métabolisme glucido-lipidique. Ces structures interagissent au niveau de points de contact étroits appelés Mitochondria-Associated Endoplasmique Reticulum Membranes (MAMs). Les MAMs sont une zone de communication et d’échanges, de lipides et de calcium entre autre, indispensables à l’activité des deux organites et au maintien de l’homéostasie cellulaire. Des connexions physiques sont assurées par l’interaction de protéines complémentaires, comme le canal anionique voltage-dépendant (VDAC)-1, la protéine chaperonne (Grp)-75 et le récepteur de l'inositol 1,4,5-triphosphate (IP3R)-1, constituant un complexe impliqué dans le transfert de calcium. D’autres acteurs comme les mitofusines 1 et 2 (MFN1/2) assurent également un rapprochement entre les deux organites et semblent jouer un rôle dans les échanges des lipides. Récemment, les MAMs sont apparues comme un nouveau carrefour de la signalisation de l’insuline dans le foie. Le monoxyde d’azote (NO) participe également au contrôle de la réponse à l’insuline hépatique et a une action spécifique sur la mitochondrie. Mes travaux de thèse ont montré que le NO à des concentrations physiologiques module les interactions entre le RE et la mitochondrie dans le foie et que son action sur les MAMs implique la voie de signalisation sGC/cGMP/PKG. J’ai également démontré que la modulation des MAMs par le NO semble jouer un rôle clé dans la régulation de la voie de signalisation à l’insuline (projet1). Par ailleurs, j’ai exploré l’importance des MAMs dans la régulation du métabolisme lipidique. Pour cela, j’ai modulé l’expression protéique de Grp75 et Mfn2 sur un modèle d’hépatocarcinome humain (Huh7). Mes résultats ont montré qu’une surexpression des deux protéines améliore les MAMs et la β-oxydation mitochondriale mais conduit à une accumulation intracellulaire de lipides. Ceci serait dû à un défaut de sécrétion des lipides dans les lipoprotéines VLDL et pourrait impliquer l’apparition d’un stress mitochondrial et une altération des échanges de phospholipides entre les deux organites (projet 2). Par conséquence mon travail confirme le rôle physiologique des MAMs et éclaire les mécanismes d’actions de cette plateforme cellulaire dans la régulation du métabolisme glucido-lipidique hépatique. A plus long terme ces connaissances participeront peut-être à l’identification de potentielles cibles thérapeutiques afin de prévenir la stéatose et la résistance à l’insuline hépatiques et leurs complications
The endoplasmic reticulum and mitochondria are two major organelles involved in the regulation of glucose and lipid metabolism. These structures interact at close contact points called Mitochondria-Associated Endoplasmic Reticulum Membranes (MAMs). MAMs constitute an area of communication and exchange, of lipids and calcium among others, essential for the activity of both organelles and the maintenance of cellular homeostasis. Physical connections are ensured by the interaction of complementary proteins, such as the voltage-dependent anionic channel (VDAC)-1, the chaperone protein (Grp)-75 and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R)-1, constituting a complex involved in calcium transfer. Other actors such as mitofusins 1 and 2 (MFN1/2) also connect the two organelles and are involved in lipid exchanges. Recently, MAMs have emerged as a new carrefour for insulin signaling in the liver. Nitric oxide (NO) also helps control the response to hepatic insulin and has a specific action on mitochondria. My thesis work showed that NO at physiological concentrations modulates the interactions between RE and mitochondria in the liver and that its action on MAMs involves the sGC/cGMP/PKG signalling pathway. I also demonstrated that NO modulation of MAMs plays a key role in regulating the insulin signaling pathway (project 1). In addition, I explored the importance of MAMs in the regulation of lipid metabolism. For that purpose, protein expression of Grp75 and Mfn2 was modulated in a human hepatocarcinoma model (Huh7). Results showed that overexpression of both proteins improves MAMs and mitochondrial β-oxidation but leads to intracellular lipid accumulation. This could be due to a defect in lipid secretion in VLDL lipoproteins and could imply the appearance of mitochondrial stress and an alteration of phospholipid exchanges between the two organelles (project 2). Consequently, my work confirms the physiological role of MAMs and sheds light on the mechanisms of action of this cellular platform in the regulation of glucose and lipid metabolism in the liver. In the longer term, this knowledge may contribute to the identification of potential therapeutic targets to prevent steatosis and hepatic insulin resistance and their complications

Widespread evidence indicates that exposure of cell cultures to α particles results in significant biological changes in both the irradiated and non-irradiated bystander cells in the population. The induction of non-targeted biological responses in cell cultures exposed to low fluences of high charge (Z) and high energy (E) particles is relevant to estimates of the health risks of space radiation and to radiotherapy. Here, we investigated the mechanisms underlying the induction of stressful effects in confluent normal human fibroblast cultures exposed to low fluences of 1000 MeV/u iron ions (linear energy transfer (LET) ~151 keV/µm), 600 MeV/u silicon ions (LET ~50 keV/µm) or 290 MeV/u carbon ions (LET ~13 keV/µm). We compared the results with those obtained in cell cultures exposed, in parallel, to low fluences of 0.92 MeV/u α particles (LET ~109 keV/µm).Induction of DNA damage, changes in gene expression, protein carbonylation and lipid peroxidation during 24 h after exposure of confluent cultures to mean doses as low as 0.2 cGy of iron or silicon ions strongly supported the propagation of stressful effects from irradiated to bystander cells. At a mean dose of 0.2 cGy, only ~1 and 3 % of the cells would be targeted through the nucleus by an iron or silicon ion, respectively. Within 24 h post-irradiation, immunoblot analyses revealed significant increases in the levels of phospho-TP53 (serine 15), p21Waf1 (also known as CDKN1A), HDM2, phospho-ERK1/2, protein carbonylation and lipid peroxidation. The magnitude of the responses suggested participation of non-targeted cells in the response. Furthermore, when the irradiated cell populations were subcultured in fresh medium shortly after irradiation, greater than expected increases in the levels of these markers were also observed during 24 h. Together, the results imply a rapidly propagated and persistent bystander effect. In situ analyses in confluent cultures showed 53BP1 foci formation, a marker of DNA damage, in more cells than expected based on the fraction of cells traversed through the nucleus by an iron or silicon ion. The effect was expressed as early as 15 min after exposure, peaked at 1 h and decreased by 24 h. A similar tendency occurred after exposure to a mean absorbed dose of 0.2 cGy of 3.7 MeV α particles, but not after 0.2 cGy of 290 MeV/u carbon ions.Analyses in dishes that incorporate a CR-39 solid state nuclear track detector bottom identified the cells irradiated with iron or silicon ions and further supported the participation of bystander cells in the stress response. Mechanistic studies indicated that gap junction intercellular communication, DNA repair, and oxidative metabolism participate in the propagation of the induced effects.We also considered the possible contribution of secondary particles produced along the primary particle tracks to the biological responses. Simulations with the FLUKA multi-particle transport code revealed that fragmentation products, other than electrons, in cells cultures exposed to HZE particles comprise <1 % of the absorbed dose. Further, the radial spread of dose due to secondary heavy ion fragments is confined to approximately 10-20 µm Thus, the latter are unlikely to significantly contribute to the stressful effects in cells not targeted by primary HZE particles.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) protège le système nerveux central (SNC) en contrôlant le passage des substances sanguines et des cellules immunitaires. La BHE est formée de cellules endothéliales liées ensemble par des jonctions serrées et ses fonctions sont maintenues par des astrocytes, celles ci sécrétant un nombre de facteurs essentiels. Une analyse protéomique de radeaux lipidiques de cellules endothéliales de la BHE humaine a identifié la présence de la voie de signalisation Hedgehog (Hh), une voie souvent liées à des processus de développement embryologique ainsi qu’au niveau des tissus adultes. Suite à nos expériences, j’ai déterminé que les astrocytes produisent et secrètent le ligand Sonic Hh (Shh) et que les cellules endothéliales humaines en cultures primaires expriment le récepteur Patched (Ptch)-1, le co-récepteur Smoothened (Smo) et le facteur de transcription Gli-1. De plus, l’activation de la voie Hh augmente l’étanchéité des cellules endothéliales de la BHE in vitro. Le blocage de l’activation de la voie Hh en utilisant l’antagoniste cyclopamine ainsi qu’en utilisant des souris Shh déficientes (-/-) diminue l’expression des protéines de jonctions serrées, claudin-5, occcludin, et ZO-1. La voie de signalisation s’est aussi montrée comme étant immunomodulatoire, puisque l’activation de la voie dans les cellules endothéliales de la BHE diminue l’expression de surface des molécules d’adhésion ICAM-1 et VCAM-1, ainsi que la sécrétion des chimiokines pro-inflammatoires IL-8/CXCL8 et MCP-1/CCL2, créant une diminution de la migration des lymphocytes CD4+ à travers une monocouche de cellules endothéliales de la BHE. Des traitements avec des cytokines pro-inflammatoires TNF-α and IFN-γ in vitro, augmente la production de Shh par les astrocytes ainsi que l’expression de surface de Ptch-1 et de Smo. Dans des lésions actives de la sclérose en plaques (SEP), où la BHE est plus perméable, les astrocytes hypertrophiques augmentent leur expression de Shh. Par contre, les cellules endothéliales de la BHE n’augmentent pas leur expression de Ptch-1 ou Smo, suggérant une dysfonction dans la voie de signalisation Hh. Ces résultats montrent que la voie de signalisation Hh promeut les propriétés de la BHE, et qu’un environnement d’inflammation pourrait potentiellement dérégler la BHE en affectant la voie de signalisation Hh des cellules endothéliales.
The blood-brain barrier (BBB), composed of tightly bound endothelial cells (ECs), regulates the entry of blood-borne molecules and immune cells into the CNS. Recent studies indicate that the Hedgehog (Hh) signaling pathway in adult tissues plays an important role in vascular proliferation, differentiation and tissue repair. Using a lipid membrane raft-based proteomic approach, I have identified the Hedgehog (Hh) pathway as a signaling cascade involved in preserving and upkeeping BBB functions. My study shows that human astrocytes express and secrete Sonic Hh (Shh) and conversely, that human BBB-ECs bear the Hh receptor Patched-1 (Ptch-1), the signal transducer Smoothened (Smo) as well as transcription factors of the Gli family. Furthermore, activation of the Hh pathway in BBB-ECs restricts the passage of soluble tracers in vitro. By blocking the Hh signaling in vitro and by using Shh knock-out (-/-) embryonic mice, I demonstrate a reduced expression of TJ molecules claudin-5, occludin and ZO-1. Hh activation also decreases the surface expression of cell adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1, and decreases BBB-ECs secretion of pro-inflammatory chemokines IL-8/CXCL8 and monocytes chemoattractant protein 1 MCP-1/CCL2, resulting in a reduction of migrating CD4+ lymphocytes across human BBB-EC monolayers. In vitro treatment with inflammatory cytokines TNF-α and IFN-γ, upregulates the production of astrocytic Shh and the BBB-EC surface expression of Ptch-1 and Smo. In active Multiple Sclerosis (MS) lesions, in which the BBB is disrupted, Shh expression is drastically upregulated in hypertrophic astrocytes, while Ptch-1 and Smo expression is down-regulated or left unchanged, suggesting that a deregulation in the Hh signaling pathway may prevent the barrier stabilizing properties of Hh. Our data demonstrate an anti-inflammatory and BBB-promoting effect of astrocyte-secreted Hh and suggest that a pro-inflammatory environment disrupt the BBB by impacting, at least in part, on Hh signaling in brain ECs.