Thèses sur le sujet « La Petite Sirène »

Notre travail concernant Disney s’inscrit dans le champ de la musique de film, et même si le studio a fait l’objet de nombreuses recherches tant sur des questions esthétiques que culturelles, il reste intéressant à étudier, car il peut ainsi devenir l’objet de recherche, non sur l’originalité d’un corpus, mais sur un déplacement de la méthode, nous permettant d’interroger l’idéologie à l’œuvre. Notre thèse concentre son attention sur La Petite Sirène (1989), La Belle et la Bête (1991) et Aladdin (1992) où il nous semble que, en recourant à la recomposition de la musique de certaines séquences des films, nous puissions faire jouer à la part de virtualité du texte filmique un rôle dans cette entreprise critique : retrouver la voix des héroïnes Ariel, Belle et Jasmine. Si un geste de recomposition musicale peut nous aider à penser ce rapport au personnage, c’est parce que nous pensons que la musique peut faire entendre la virtualité d’un film (et plus précisément de ses personnages), et devenir par cela un geste d’analyse critique de son idéologie. La recomposition musicale met en acte les allers-retours indispensables à la compréhension des séquences que nous travaillerons : elle redonne corps aux espaces de résonance du film et compose les affleurements d’une promesse initiale proposée par le film vis-à-vis de son héroïne. Ces allers-retours nous permettent de retrouver l’importance des numéros musicaux. En prolongeant notre analyse par le prisme de l’intermédialité, nous réfléchissons à la porosité avec la scène de Broadway (ou plus précisément ici avec le off-Broadway) qui permettent des doubles lectures issues des numéros musicaux
From aesthetics to cultural studies, Disney has been the subject of many studies. Thanks to this prolific research, it is possible de study it by another methodological angle to understand the ideology of and within the movies. Within the academic field of film music, our thesis will draw its attention on The Little Mermaid (1989), Beauty and the Beast (1991) and Aladdin (1992). It seems that, thanks to an alternative version of the original score that we would compose, we may bring the potentiality inscribed in the movie to be a part of our critical study: find the heroines’ voice Ariel, Belle and Jasmine. We think that this method will enable us to take account of the character’s consistency for the music can be a way to hear the potentiality of a movie (and specifically here, the characters), so it will be an opportunity to discuss Disney ideology. The musical recomposition enact the back and forth inside the different moments of the movie to help us understand what is at stake: it enlightens the resonances between the sequences and compose the surfacing promise initially build-up by the movie towards the heroine. It also helps us thinking about the movie’s interactions while getting to the surface the aforementioned promise the movie was trying to stop from actualising. By extending our analysis through the prism of intermediality, we consider the porosity of theses musical numbers with the Broadway stage (and more accurately the off-Broadway) whose enable us to do dual readings of the movie. All the music in its connexion to the rest of the audio-visual complex enable us to think about the power relations which occurs in the movie

Cette thèse traite des transformations de la monstruosité et de la matérialité dans la Grande-Bretagne victorienne du dix-neuvième siècle, ainsi que du lien que ces transformations entretiennent avec la notion de sujet désirant, masculin et victorien. Elle met en lumière un changement au sein du langage victorien (le langage étant ici compris comme un système de signes, et non comme une langue spécifique) alors que, à la ‘perpendicularité [foucaldienne] de la représentation,’ se substitue une structure signifiante différentielle. Une particule non-représentable et inatteignable est apparue dans le langage – un double désir de mort et de cohérence sémiotique – qui donne naissance à un sujet fondamentalement divisé. Parcourant le langage labyrinthique de la culture victorienne et post-victorienne, ce sujet divisé, et sa quête métaphysique de complétude, s’exprime en diverses formes monstrueuses. Cette thèse éclaire la transformation du langage victorien de la représentation en combinant les théories foucaldienne (l’historicité du langage) et lacanienne (la division du sujet et le stade du miroir) pour analyser des récits articulés autour de la figure du miroir et de la sirène. Contrairement aux théories les plus répandues de la monstruosité, qui situent celle-ci aux marges du possible, cette thèse affirme que, sollicitée et marquée par l’incohérence du langage victorien, la monstruosité de l’époque se retrouve au cœur même du sujet désirant masculin. Bien qu’il ait été représenté pendant des millénaires comme l’Autre de la rencontre périlleuse, le monstre des récits analysés – la sirène victorienne – devient ici le protagoniste de sa propre (et triste) histoire. En lisant les corps monstrueux comme des topologies du sujet qui les a créés, cette thèse pense la sirène victorienne non pas comme limite/frontière du sujet et de ses possibles, mais comme l’expression même de ce sujet créateur et désirant qu’est le sujet masculin victorien
The thesis discusses changes in monstrosity and materiality in the Victorian, nineteenth-century, Britain and the relationship of these changes to the notion of a male Victorian desiring subject. It argues that a change happened at the level of the Victorian language (language understood as a system of signs, not a specific language), and that previous Foucaldian ‘perpendicularity of representation’ was substituted by a differential structure of meaning. An unrepresentable and unattainable particle appeared inside of language – a desire for death and semiotic coherence – giving birth to a fundamentally split subject. This subject expressed himself, and his metaphysical search for wholeness, in many different monstrous forms, entering a labyrinth of language specific to the Victorian and post-Victorian culture. By combining Foucaldian (the historicity of language) and Lacanian (the split subject and the mirror stage) theoretical frameworks, the thesis deals with the change in Victorian representational language by analyzing mirror and siren narratives of the nineteenth century. Contrary to popular theoretical approach to monstrosity as something dwelling on the margins of the possible, the thesis argues that, called upon and marked by the incoherence of the Victorian language, the monstrosity of the age emerges as the male desiring subject himself. Though for millennia represented as the Other to be encountered, the monster of the analyzed narratives – the Victorian siren – becomes the protagonist of its own sad stories. Reading siren bodies as topologies of the subject who created them, the Victorian sirens are understood in this thesis not as limits/outskirts of the subject’s possibility, but as expressions of the very subject who created them – the male Victorian desiring subject

Au cours de cette thèse, j’ai utilisé des complexes composés d’acides nucléiques, d’un polymère cationique et de liposomes cationiques appelés Lipopolyplexes pour formuler des siRNA (LPRi) et un leurre ADN (LPD) afin inhiber la croissance des cellules 4T1, un modèle murin de carcinome mammaire. Dans une première étude, des injections systémique ou endotrachéale de LPRi avec des siRNA anti-luciférase n’ont pas permis d’inhiber l’expression de la luciférase dans des métastases pulmonaires induites par des cellules 4T1-luciférase. A partir de ces résultats, les LPRi ont été améliorés en ciblant les cellules 4T1 avec le peptide uPA et/ou RGDc ou l’acide folique incorporés aux liposomes selon diverses approches. Les formulations obtenues ont été caractérisées, leur endocytose et l’effet siRNA mesurés in vitro. Cette deuxième partie a permis d’établir que les LPRi décorés avec du folate étaient la meilleure formulation ciblée. Dans une troisième partie, l’inhibition de la prolifération des cellules 4T1 a été recherchée en ciblant le facteur de transcription STAT3. Des LPRi anti-STAT3 ont montré une très bonne efficacité pour inhiber STAT3, mais sans effet antiprolifératif significatif. Des LPD anti-STAT3 ont montré un très bon effet antiprolifératif, celui-ci étant renforcé lorsqu’une co-délivrance siRNA/leurre ADN (LPRiD) a été réalisée. In vivo, un délai de la croissance des tumeurs 4T1 a été observé après co-délivrance siRNA/leurre ADN. Cette thèse a permis de montrer l’efficacité des lipopolyplexes pour la délivrance combinée de siRNA et de leurre ADN dans les cellules tumorales 4T1. Ils indiquent que des études sont cependant nécessaires pour augmenter leur délivrance in vivo dans la tumeur
During this thesis, I used complexes made with nucleic acids, cationic polymer and cationic liposomes called Lipopolyplexes to formulate siRNA (LPRi) and DNA molecular decoy (LPD) in order to inhibit the growth of 4T1 cells, a murine model of mammary carcinoma. In a first study, systemic or endotracheal injections of LPRi comprising anti-luciferase siRNA did not allow luciferase inhibition in pulmonary metastases induced by 4T1-Luc cells. From these results, LPRi were improved by targeting 4T1 cells using incorporation, by different means, of uPA and/or RGDc peptide or folic acid in liposomes. Resulted formulations were characterized, their internalization and siRNA transfection efficiency were measured in vitro. This second part showed that folate targeting of LPRi was the best formulation. In a third part, proliferation inhibition of 4T1 cells was investigated by targeting the STAT3 transcription factor. Anti-STAT3 siRNA LPRi showed very good efficacy in inhibiting STAT3, but without significant antiproliferative effect. Anti-STAT3 decoy LPD showed a very good antiproliferative effect, the latter being reinforced when co-delivery siRNA/DNA decoy (LPRiD) was performed. In vivo, a growth retardation of 4T1 tumors was observed after co-delivery siRNA/DNA decoy. This thesis demonstrated the effectiveness of lipopolyplexes for combined delivery of siRNA and DNA decoy in the 4T1 tumor cells. Some studies are however required to increase their in vivo delivery into the tumor

Morbillivirus est un genre de virus à ARN simple brin de polarité négative de la famille des Paramyxoviridae. Actuellement, il est composé de sept espèces responsables de maladies hautement contagieuses. Les infections par morbillivirus causent une forte mortalité chez l’Homme, les petits ruminants, les carnivores et chez certains mammifères marins. Les vaccins disponibles contre les morbillivirus exigent généralement 7-10 jours pour développer une immunité protectrice. Après la Peste Bovine, première maladie animale éradiquée avec succès, la peste des petits ruminants (PPR) est la prochaine cible pour l'éradication au niveau mondial d’ici 2030. Le vaccin actuel basé sur la souche PPR Nigeria 75/1 est adéquat pour la campagne d'éradication. Cependant, certaines améliorations peuvent être envisagées pour accroître son efficacité, raccourcir le temps nécessaire pour l’éradication et réduire les coûts. Par exemple, l’introduction d’un vaccin marqué positif/négatif permettrait la différenciation entre animaux infectés et vaccinés (DIVA stratégie), permettant ainsi en temps réel la surveillance de l'infection, la vaccination et l’élimination rapide des animaux infectés. Une autre amélioration pourrait être la modification du vaccin actuel par génétique inverse pour insérer une cassette exprimant des ARN interférents capables de cibler les souches virulentes PPRV. Ce vaccin thérapeutique serait utile en situation d'urgence pour contrôler l’infection le temps que l’immunité protectrice se mette en place après vaccination. Afin de développer et tester ces nouveaux vaccins et outils thérapeutiques, il est nécessaire d’utiliser des modèles petit animal et cellulaire pour limiter les expérimentations avec les animaux d'élevage Dans ce travail, nous avons contribué au développement d’un modèle cellulaire in vitro et d’un modèle murin in vivo pour étudier la pathogenèse des morbillivirus. Le présent document est divisé en trois principaux chapitres : « Identification d’un modèle cellulaire pour les études de pathogenèse du PPRV » ; « Construction d’un clone PPR marqué le gène luciférase rapporteur » ; et « Évaluation in vivo d’un petit ARN interférent (siRNA) contre les morbillivirus ». Dans le premier chapitre, la ligne cellulaire murine 10T1/2 a été éprouvée avec des souches atténuées et virulentes du PPRV dans des conditions différentes d’expression du récepteur SLAM de la chèvre et de la réponse interféron type I. Les résultats ont montré une permissivité des cellules 10T1/2 limitée aux souches virulentes du PPRV, laquelle est indépendante du récepteur SLAM de la chèvre et de la réponse interféron type I. Le deuxième chapitre visait à développer un PPRV recombinant capable d’exprimer une luciférase par la génétique inverse. Diverses stratégies d’assemblage du génome entier du PPRV ont été établies pour l’obtention du clone d’ADNc avec le génome complet du PPRV. Cependant, le rescue a été impossible à réaliser et les raisons en sont discutées. Le dernier chapitre englobait l’évaluation des siRNA comme outils thérapeutiques contre un autre morbillivirus recombinant capable d’exprimer la luciférase, le virus de la rougeole (MV). Alors que sur les lignées cellulaires nous avons observé 100% d’activité antivirale des siRNA contre le rMV-luc, la validation in vivo, utilisant le modèle souris transgénique CD46 humain sensible à la rougeole, a échoué. Pour conclure, ce travail apporte des avancées sur le développement d’outils pour étudier la pathogenèse non seulement du PPRV mais aussi d’autres morbillivirus
Morbillivirus genus, a non-segmented negative single-strand RNA (ssRNA) group of viruses, belongs to the Paramyxoviridae family and is currently composed of seven species responsible to highly contagious diseases. Morbillivirus infections cause significant mortality in humans, small ruminants, carnivores and in some marine mammals. The available vaccines against morbillivirus infections require usually 7-10 days to induce a protective immunity. After Rinderpest, the first animal disease successfully eradicated, peste des petits ruminants (PPR) is the next target for global eradication by 2030.The current vaccine based on the Nigeria 75/1 is fit for purpose for the eradication campaign. However, some improvements can be envisaged to increase efficacy, shorten the time to complete the eradication and reduce costs. For instance, the introduction of a positive/negative marker in the vaccine could allow the Discrimination between Infected and Vaccinated Animals (DIVA strategy), thus enabling the real-time parallel monitoring of infection and vaccination, and rapid elimination of infected animals. Another improvement could be the modification of the current vaccine by reverse genetics to insert a cassette expressing interfering RNA targeting virulent strains of PPR. This therapeutic vaccine would be useful in emergency situations to control the infection over the delay necessary for the acquisition of an efficient vaccine protection. In order to develop and test these new vaccine tools, there is a need for new cell or small animal models to limit experiments with farm animals. In this work, we contributed in the development of in vitro and in vivo murine models to study morbillivirus pathogenesis. The present document is divided in three main chapters: “Identification of a cell model to PPRV pathogenesis studies”; “Construction of a full-length cDNA clone of PPRV with a luciferase reporter gene” and “In vivo evaluation of small interfering RNA (siRNA) against morbilliviruses”. In the first chapter the mouse cell line 10T1/2 was challenged with attenuated and wild type PPRV strains using different conditions of goat SLAM expression and type I IFN response. The results showed a restricted permissiveness of 10T1/2 to wild type PPRV, which was independent of goat SLAM receptor and type I IFN response. The second chapter aimed to develop a recombinant PPRV expressing luciferase through reverse genetics methodology. Various strategies to assembling the PPRV genome were established reaching up to the full-length cDNA PPRV-luciferase construction. However, the rescue could not be achieved and the reasons for that are discussed. The last chapter encompassed the evaluation of siRNA as a prophylactic tool against another luciferase recombinant morbillivirus, the measles virus. In vitro and in vivo studies were performed with the recombinant MV (rMV-luc). Whereas in cell lines siRNA showed 100% of antiviral activity against rMV-luc, the validation in vivo, using a human CD46 transgenic mouse model susceptible to measles, failed. In conclusion, this work provides advancements in the development of tools for the study of the pathogenesis of PPRV and other morbilliviruses

L'interférence ARN est un processus biologique permettant la dégradation d'un ARN messager par un ARN double brin de courte taille spécifique de cet ARNm. Elle a un potentiel d'application en thérapie antivirale pour peu que les ARN interférents (ARNi) soient délivrés efficacement in vivo. Dans le genre Morbillivirus, on trouve des pathogènes importants en santé publique et vétérinaire tels que le virus de la rougeole et les virus de la peste des petits ruminants (PPR) et de la peste bovine. Il n'existe aucun traitement contre les infections à morbillivirus. L'objectif de ce travail était d'évaluer la possibilité d'administrer in vivo un ARNi actif contre le virus PPR in vitro. Une formulation basée sur des liposomes complexés avec des ARNi ou un adénovirus non réplicatif exprimant des ARN courts en tête d'épingle (shARN) ont été testés chez des chèvres dans un modèle d'épreuve infectieuse avec une souche virulente de PPR. Les différences observées n'étaient cependant pas significatives au plan statistique. Pour améliorer la délivrance par vecteur viral, nous avons comparé un autre vecteur de type baculovirus qui s'est avéré plus efficace in vitro que l'adénovirus précédent. Par ailleurs, nous avons testés in vitro également deux peptides capables de pénétrer dans les cellules. L'un d'entre eux, le Perfect 6 (PF6) a presque complètement inhibé l'expression du gène de la nucléoprotéine par le virus PPR. En revanche, l'autre (PF14) a été moins efficace mais a relativement mieux résisté à l'inhibition de son activité par la présence de fortes concentrations de sérum dans le milieu. Dans le but d'évaluer in vivo ces nouveaux systèmes de délivrance en s'affranchissant du modèle chèvre lourd et couteux à mettre en œuvre, nous avons initié une stratégie de mise au point d'un modèle non infectieux de suivi dynamique de l'interférence ARN chez la souris par imagerie in vivo. Dans ce travail, nous montrons qu'il est possible de mesurer et de standardiser l'expression d'un gène rapporteur comprenant une séquence du virus PPRV et ensuite de quantifier le niveau de dérégulation de l'expression induit par un ARNi dirigé contre le virus PPR. Après calibration, ce modèle est désormais pour tester différents systèmes de délivrance de siRNA chez la souris
RNA interference (RNAi) is the process of mRNA degradation that is induced by double-stranded RNA in a sequence-specific manner. RNAi has a potential of developing into an effective and specific antiviral therapy if small interfering RNAs (siRNAs) can be efficiently delivered in vivo. Morbillivirus genus includes important pathogens of humans and animals, which include measles virus, peste des petits ruminants virus (PPRV) and rinderpest virus. No treatment exists for morbillivirus diseases. The aim of this work was the in vivo delivery of siRNA against PPRV infection. The delivery of siRNA by a liposome and short hairpin RNA (shRNA) by means of a replication deficient adenovirus was tested in goats which were later challenged with PPRV. However, significant therapeutic effects were not obtained. To find more efficient vectors, the PPRV inhibition efficiency of recombinant replication deficient adenovirus and a baculovirus expressing shRNA against nucleoprotein of PPRV were compared in vitro. The baculoviral vector was found to be more efficient. Similarly, two cell penetrating peptides (CPPs) were also compared and PepFect6 (PF6) could deliver siRNA NPPRV1 effectively in vitro resulting in an almost complete inhibition of N gene expression by PPRV. Another CPP, the PF14 though with lower transfection efficiency in vitro, was found to be relatively serum resistant compared to PF6. A small animal model for PPRV infection does not exist. Due to economic, ethical, and biosecurity issues involved with use of small ruminants, a strategy based on the use of a non-infectious mouse model and a dynamic follow up of siRNA treatment by live imaging was developed. We show in this work that it is possible to measure and standardize the expression of a bioluminescent reporter gene containing a PPRV sequence and thus, to quantify a down-regulation of such gene by siRNA against PPRV. After some calibration, siRNA delivery can now be tested in this mouse model for comparing various delivery vectors in vivo

Chez la plupart des eucaryotes, la présence d'ARN double brin induit la mise en place de mécanismes qui peuvent inhiber l'expression de gènes sur la base d'une complémentarité de séquence. L'exemple le mieux connu est le cas de l'interférence par l'ARN telle qu'elle a été décrite initialement chez C. elegans, où les ARN double brin génèrent une endonucléase spécifique de séquence qui dégrade tout ARN parfaitement complémentaire du petit ARN guide contenu dans le complexe RISC. En plus de cette activité post-transcriptionnelle, il a été observé chez de nombreux eucaryotes l'existence de mécanismes apparentés à l'interférence par l'ARN et qui inhibent la transcription en agissant au niveau de la chromatine. Si ces mécanismes ont été clairement mis en évidence chez les plantes et les champignons il n'existe que quelques exemples de ce type de régulation chez les mammifères. De manière inattendue, le fait de cibler le promoteur d'un gène avec de petits ARN double brin peut conduire à une augmentation de son expression. Cette réponse paradoxale n'a été observée jusqu'à présent que dans des cellules de mammifère, et si elle suscite un intérêt en particulier pour stimuler l'expression de gènes suppresseurs de tumeurs, son mécanisme est encore inconnu.Mes travaux ont porté sur l'étude de l'induction de l'expression par des petits ARN. Ils reposent tout d'abord sur le développement d'une approche expérimentale qui permet de suivre l'activité du promoteur du gène ciblé. Pour cela, j'ai utilisé des constructions indicatrices organisées autour d'un promoteur bidirectionnel qui contrôle l'expression de deux protéines fluorescentes. Lorsque l'on cible le messager de l'une de ces protéines, l'expression de l'autre est augmentée et j'ai pu montrer que ceci corrèle avec la quantité d'ARN messager et de polymérase II présente sur le promoteur bidirectionnel. Ainsi, l'utilisation d'un promoteur bidirectionnel permet effectivement de suivre le niveau de transcription du gène ciblé par le petit ARN.Cette induction de l'expression détectée de manière " controlatérale " n'est pas due à un effet hors cible des petits ARN car elle nécessite la présence de la séquence cible sur l'un des transcrits de la construction indicatrice. L'induction peut être observée avec de nombreux petits ARN différents, y compris s'ils interagissent comme des micro ARN. Les constructions indicatrices que j'ai développées sont donc biaisées en faveur d'une réponse de type induction transcriptionnelle enréponse à un silencing. L'utilisation d'un promoteur bidirectionnel est probablement à l'origine de ce biais à travers la possibilité d'induire une transcription convergente sur les plasmides lorsqu'ils sont circulaires. De fait, la linéarisation de la construction indicatrice supprime l'induction, du moins pour les constructions les plus simples.Si le coeur du complexe RISC, la protéine Ago2, est nécessaire au silencing et à l'induction, j'ai pu montrer que dans le deuxième cas c'était en fait pour guider le complexe RISC sur les transcrits et non pas pour les couper. En effet, le silencing des protéines TNRC6A et B diminue fortement l'induction sans toucher au silencing s'il procède en mode siRNA. De plus l'ancrage sur le transcrit EGFP induit une réponse de même type que le petit ARN (silencing et induction). Cette approche d'ancrage m'a permis d'identifier les domaines nécessaires au silencing et à l'induction et de montrer qu'ils sont distincts.Ce travail permet donc de mettre en évidence que l'induction transcriptionnelle observée sur nos constructions indicatrices est due à une activité des partenaires des protéines Argonaute, la famille GW182/TNRC6. Cette observation ouvre la voie à une caractérisation du mécanisme de cette induction en montrant qu'elle relève d'une activité spécifique du complexe RISC.

Le développement de thérapies géniques ciblées représente un défi majeur en cancérologie qui se heurte souvent à des problèmes de délivrance. Les systèmes de délivrance actuels génèrent de nombreux effets indésirables, dont beaucoup sont dus à des interactions non spécifiques. Ainsi, l’utilisation de nano-vecteurs pour la délivrance ciblée de siRNA devrait permettre de répondre à ces besoins cliniques. L’objectif général de cette thèse porte sur la conception et l’étude de nano-vecteurs de siRNA pour cibler et traiter des pathologies cancéreuses. Le premier axe de recherche est consacré à l’étude de peptides modifiés pour la délivrance du siRNA. Ce travail de thèse visait à améliorer la vectorisation et l’internalisation du siRNA dans les cellules cibles. Pour cela, deux types de peptides ont été développés : i) des CPP (Cell Penetrating Peptides) fonctionnalisés par une séquence de ciblage dérivée de la laminine ̶ ciblant les cellules du cancer du sein̶ et ii) des peptides agrafés qui contraignent une structure secondaire en hélice α permettant d’augmenter la résistance à la protéolyse et favoriser l'internalisation cellulaire. Le deuxième axe s’est orienté vers le développement d’une nouvelle génération de vecteurs obtenus par auto-assemblage. Deux stratégies ont été explorées: i) une approche d’assemblage dynamique covalent pour développer des polymères dynamiques covalents (PDC) obtenus par un processus d’adaptation à la cible siRNA et ii) une approche d’assemblage supramoléculaire de porphyrines cationiques induits par le siRNA. La première stratégie a permis, via la fonctionnalisation des PDC par du D-mannose, de démontrer une vectorisation ciblée de cellules du cancer colorectal et la seconde stratégie a conduit au premier exemple de thérapie duale combinant siRNA et thérapie photo-dynamique basé sur des petites molécules
The development of targeted gene therapies represents a major challenge in oncology that is hampered by delivery issues. Current delivery systems generate many side effects, many of which are due to off-target interactions, and the use of nano-vectors for targeted delivery of siRNA is a promising approach to tackle this challenge. The general objective of this thesis was to design and study original nano-vectors of siRNA for targeting and treating cancer. The first line of research was dedicated to the study of modified peptides for the siRNA delivery. This work aimed to improve the internalization of siRNA in target cells. For this, two types of peptides have been developed: i) CPPs (Cell Penetrating Peptides) functionalized with a targeting sequence derived from laminin ̶ targeting breast cancer cells, and ii) stapled peptides enforcing an α helical secondary structure which endow enhanced stability towards proteolysis and improved cell uptake. The second axis focused on the development of a new generation of nano-vectors obtained by self-assembly. Two strategies have been described: i) a dynamic covalent self-assembly approach to develop Dynamic Covalent Polymers (DCPs) through a siRNA-templated process, and ii) ii) a supramolecular self-assembly approach of cationic porphyrins directed by the templating siRNA. The first strategy led, via functionalization of the DCPs with D-mannose, to the targeted delivery of colorectal cancer cells and the second strategy led to the first example of dual therapy combining siRNA and photodynamic therapy achieved using small molecules

Cette thèse a démontré la capacité des nanocapsules à cœur aqueux à délivrer des oligonucléotides antisens et des siRNAs in vitro et in vivo. Dans un première partie de ce travail, la technique de fractionnement cellulaire a été utilisée pour étudier le trafic intracellulaire des nanocapsules chargées d'oligonucléotides (ODNs) doublement marqués. Les résultats ont montrés que ces nanocapsules sont capables non seulement d'augmenter considérablement la pénétration cellulaire des oligonucléotides, mais aussi de délivrer leur contenu dans les compartiments subcellulaires ciblés (cytoplasme, noyau). Ces résultats ont été confirmés par la microscopie confocale. De plus, les nanocapsules à cœur aqueux chargés d'ODNs anti-EWS-Fli1 se sont révélées efficace pour induire une réversion phénotypique des cellules NIH/3T3 EWS-Fli1 exprimant l'oncogène EWS-Fli1 en phénotype NIH/3T3. Cet effet est du à une inhibition spécifique et significative de l'expression de l'oncogène EWS-Fli1 détectée par la technique RT-PCR. Enfin, l'application récente de ces nanocapsules aux siRNAs, révèle pour la première fois, une inhibition significative d'une tumeur apparentée au sarcome d'Ewing, et ce en utilisant des doses très faibles en siRNAs non modifiés chimiquement. L'inhibition spécifique de l'oncogène ciblé a pu être, à nouveau, mise en évidence par la méthode RT-PCR. Des études complémentaires de microscopie confocale ont démontré la localisation cytoplasmique des siRNAs
The dream of modern drug research is to discover a biologically active molecule or a class of biologically active molecules, totally specific, able to act efficiently only on the function responsible of the disease. If this dream became a reality, treatment of fatal illness (AIDS, cancer, etc. . . ) would be possible without the severe side effect and toxicities that are the main limitations of these treatments. Many drugs work by interfering with critical proteins, which have been identified as responsible for dysfunction of cells or tissues. However, conventional therapeutics agents now on the market, which tend to act on proteins in the body also often bind to non-target proteins, or exert an effect through unknown interactions. Fortunately, progress in genetics and genomics has enabled definitive studies on some of the fundamental molecular mechanisms that regulate the expression of genes, as well as the dysfunction of these mechanisms. From this mass of knowledge, the idea has emerged of drugs that may turn off genes by targeting the RNA that codes for the protein instead of the protein product. This strategy displays several advantages: (1) an active oligonucleotides (ODNs) or siRNA can be identified in a shirt time. (2) The cellular location of the proteins is not important. First results do not show any antigenicity of these nucleic acids. However, despite exciting potential for selectively modulating the expression of an individual gene, nucleic acids are still far from becoming drugs. Nucleic acids drugs are anionic macromolecules and cannot transit biological cell membranes. Additionally, they are rapidly degraded by nucleases. To overcome these limitations, various chemical modifications of nucleic acids (phosphorothioate ODNs) were synthesized. These modifications possess disadvantages, like a decreased mRNA hybridisation, higher cytotoxicity and increased unspecific effects. Therefore, a strong need for the development of unmodified acid nucleic drug delivery systems exists. The therapeutic performance of nucleic acid based drug significantly depends on the capability of carrier systems because of their fragility, impermeability to the cellular membrane and undesirable biodistribution. These delivery systems might be no viral, biocompatible and biodegradable. Carrier systems (liposomes, nanoparticles) protect these nucleic acids based drug in the harsh environment of the extracellular fluids, while inside the cells they should release incorporated drugs at a reasonable rate to remain intracellular concentration sufficient to form a complex with a target molecules such as mRNA. Actually, many academic and industrial laboratories are working on drug delivery based on nanotechnology (liposomes, nanoparticles). Our interest is based on development (unfurl) of polymeric nanocapsules with an aqueous core for nucleic acids delivery. Polyisobutylcyanoacrylate (PIBCA) nanocapsules specially designed for delivery of fragile and anionic molecules (ODNs). These nanocapsules containing in their aqueous core an active ODN induced 60% of inhibition of Ewing's sarcoma tumour after 8 I. T injections in nude mice, but the mechanism by which acts these nanocapsules remain unknown. As described in this report, our gaol was firstly focused on subcellular studies of the fate of ODNs when vectorized by nanocapsules using cellular fractionation and confocal microscopy methods (publication N°2), results showed that nanocapsules permitted enhancement of cellular penetration of oligonucleotides with a specific delivery in the targeted compartments (cytoplasm and nucleus). After fundamental mechanism investigation of delivery of oligonucleotides by nanocapsules following endocytosis way, we tested then their specific effect at cellular level in sarcoma Ewing model. Nanocapsules loaded ODNs have been proven to be highly effective tools for the specific inhibition of sarcoma Ewing's oncogene with a perfect correlation both in vitro and in vivo results in the same model (publication N°3). Recently, the discovery of RNA interference (siRNA), acting into a natural mechanism based on endogenous regulatory system that employs to silence gene expression has generated enthusiasm for cancer treatment, this new therapeutics approach more effective at low doses than other types of nucleic acid-based therapy such like oligonucleotide. But despite advantages of siRNA, obstacles to effective siRNA-based drugs remain without drug delivery systems. Finally, treatment of grafted tumor Ewing's sarcoma in nude mice using unmodified siRNA vectorized by nanocapsules leads to 80% of specific inhibition of tumor growthing after 5 I. T injection using a very low dose of siRNA (publication N°4). Nanocapsules thus appears to be an interesting system for administration of nucleic acid therapy. Further developments are now in progress in order to design such nanocapsules with specific ligands capable to recognize targets after intravenous administration

L’utilisation de siRNA est une nouvelle approche thérapeutique très prometteuse. Néanmoins leur transfection à visée thérapeutique est un réel défi. Les obstacles à franchir pour élaborer des agents de transfection sûrs et fiables sont nombreux. Afin de les contourner nous nous sommes attachés à la construction d’un système dynamique qui, à l’image des virus, est constitué de briques moléculaires, s’emboitant et interagissant avec des acides nucléiques selon des interactions supramoléculaires. Ainsi, nous avons élaboré des polymères supramoléculaires polycationiques à base de monomères de cyclodextrines pontées, fonctionnalisées par un groupement adamantyle. Ce type de conjugué pallie un problème manifeste dans la littérature concernant les assemblages de β-CD souvent insolubles ou bien auto-inclus. L’ajout éventuel d’une autre fonction cationique pour améliorer l’interaction avec les siRNA a aussi été réalisé. Ainsi, la capacité à s’auto-assembler de quatre composés a été étudiée par RMN-1H, RMN-ROESY, ITC, RMN-DOSY, et SANS. Par ailleurs, ces composés ont montré une certaine capacité à complexer et à protéger les siRNA. L’un de ces composés a de plus montré une bonne aptitude à transfecter des siRNA in vitro, sans induire de toxicité. Les assemblages CD-siRNA ont finalement été observés par cryo-TEM et ont montré la formation de fibres, organisées de manière hiérarchique et hautement coopérative. Nous avons ainsi créé des assemblages supramoléculaires uniques à base d’acides nucléiques, rappelant la structure, la taille et la fonction d’un virus
SiRNA based therapeutics are very promising. A key challenge for their development is the design of sophisticated, safe and effective delivery methods. To address all the biological obstacles for the conception of such therapeutics, we focused on the construction of a virus-like dynamic system, built with molecular bricks, able to self assemble and to interact with nucleic acid through supramolecular interactions. Bridged cyclodextrin based supramolecular polymers were developed to form host-guest interactions. To do so, cyclodextrins were conjugated with cationic and hydrophobic moiety in a spatially controlled way. These conjugates solved problems well known in the literature about the self-inclusion and the solubility in water of such molecules. The ability to self-assemble of 4 compounds were studied by RMN-1H, RMN-ROESY, ITC, RMN-DOSY and SANS. All these compounds showed a good capability to complex and protect siRNA. Moreover, one of these compounds is able to transfect siRNA in vitro without any toxicity, and therefore, to induce gene silencing. Assembly of CD and siRNA were finally observed by cryo-microscopy, which showed long fibres organised in a hierarchical and cooperative manner. This unique system is therefore strongly reminiscent of the structure, size and function of a virus

Les siRNA comptent parmi les outils biotechnologiques les plus efficaces pour inhiber spécifiquement l’expression des gènes. Leur utilisation in vivo se heurte cependant aux médiocres propriétés pharmacologiques des oligonucléotides (molécules peu stables dans les organismes, rapidement éliminées, franchissant mal les membranes cellulaires). Afin d’augmenter la biodisponibilité et la délivrance de ces molécules, il est possible d’introduire au niveau des nucléotides différentes modifications chimiques, ou de coupler les siRNAs à des systèmes de vectorisation. Ces différentes modifications, développées généralement in vitro, peuvent provoquer des changements majeurs du comportement in vivo des siRNAs. La mise en place de méthodes d’analyse permettant de suivre le comportement in vivo de ces molécules est donc impérative. L’imagerie moléculaire non invasive est particulièrement adaptée à l’étude de la biodistribution dynamique des molécules thérapeutiques. Nous avons préparé différents siRNAs modifies chimiquement, ou couplés à une protéine vectrice et nous avons étudié (1) leur activité in vitro, (2) leur métabolisme in vivo par HPLC, leur biodistritribution et leurs propriétés pharmacocinétiques par imagerie TEP, après les avoir marqué au Fluor-18, et (3) évalué leur activité in vivo par imagerie optique. Les propriétés pharmacologiques des siRNAs sont grandement améliorées par rapport aux antisens simple-brin. Les méthodes développées peuvent être appliquées à de nombreuses modifications des siRNAs et fournissent des informations nécessaires pour orienter et évaluer le développement des siRNAs comme molécules thérapeutiques
RNA interference is a powerful tool to specifically inhibit the expression of a gene. In vivo, the use of oligonucleotides is limited by their poor bioavailability and delivery (molecules rapidly degraded and eliminated, which do not cross easily the cell membranes). It is possible to introduce chemical modifications in the siRNAs, or to conjugate them with vectorisation system, to improve their pharmaceutical properties. However, these modifications could reduce the biological effect of the siRNAs, or induce non specific interactions or biodistributions. Therefore tools are needed to carefully evaluate the effect of the oligonucleotide modifications in their in vivo behaviour. Here we used molecular imaging to evaluate the pharmacokinetics, and the in vivo activity, of modified siRNAs. We prepared chemically modified siRNAs and (i) evaluated their in vitro RNAi efficiency, (ii) labelled them with Fluorine-18 and analyzed their in vivo biodistribution by Positron Emission Tomography Imaging and plasmatic metabolism by HPLC, and (iii) evaluated their in vivo RNAi activity by Optical Imaging. Our results show that the siRNAs pharmaceutical properties are really improved compared to single-stranded antisens. The developed methods are applicable to several siRNAs chemical modifications, or vectorisation strategies, and give useful information for the development of siRNAs as new therapeutic reagents

La présence de fortes interactions électrostatiques entre les acides nucléiques tel que l’ADN, l’ARN et des polycations permet l’élaboration de particules colloïdales appelées complexes de polyélectrolytes (PECs). Cette approche permettant la formation de vecteurs non-viraux pour la délivrance de matériel génétique a fait l’objet de nombreuses études basées sur l’utilisation de chitosane comme polycation. Dans le cadre de cette thèse, ce dernier a été étudié pour ses propriétés de complexation avec des petits ARN interférents (small interfering RNA, siRNA). Dans un premier temps, des oligosaccharides de chitosane (COS) ont fait l’objet d’une étude quant à leurs propriétés en solution et de complexation avec des siRNA. L’effet de longueur de chaîne sur la solubilité du chitosane et leur comportement complexant a pu être étudié. Par la suite, la stabilité colloïdale en conditions physiologiques des PECs formés à partir de chitosane et de siRNA a été abordée. La déprotonation du chitosane étant un élément rédhibitoire quant à la stabilité des complexes, l’introduction d’ions zinc lors de la formulation des complexes a permis une amélioration de la stabilité à pH physiologique. De plus, l’augmentation du degré d’acétylation du chitosane a également permis une nette amélioration de la stabilité des complexes à des concentrations physiologiques en sel. Avec l’introduction de zinc, une étude portant sur les interactions entre des ions métalliques et le siRNA a également été menée. Finalement, une nouvelle synthèse menant à la formation d’un nouveau copolymère à base de chitosane a été réalisée, permettant d’obtenir des structures encore inexplorées à base de chitosane telles que des micelles ou des structures de type conjugués
The presence of strong electrostatic interactions between nucleic acids such as DNA, RNA and polycations leads to the formation of colloidal particles called polyelectrolyte complexes (PECs). This approach, which allows the formation of non-viral vectors for genetic material delivery, has been the subject of numerous studies based on the use of chitosan as polycation. In the framework of this thesis, the latter was studied for its complexing properties towards small interfering RNA (siRNA). First, chitosan oligosaccharides (COS) were studied for their solution properties and complexation properties with siRNA. The effect of chain length on the solubility of chitosan and their complexing behaviour was demonstrated. Subsequently, the colloidal stability of PECs formed between chitosan and siRNA under physiological conditions was addressed. As the deprotonation of chitosan is redhibitory for the stability of the complexes, it was shown that the introduction of zinc ions in the formulation of complexes allowed to improve their stability at physiological pH. Moreover, the increase in the degree of acetylation of chitosan also allowed a clear improvement in the stability of the complexes at physiological salt conditions. With the introduction of zinc, a study of the interactions between metal ions and siRNA was also carried out and was able to highlight the strong interactions involved between metal ions and siRNA. Finally, a new synthesis leading to the formation of a new chitosan-based copolymer was carried out, making it possible to obtain as yet unexplored chitosan-based structures such as micelles or conjugate-type structures

Le Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) est un mécanisme dirigé contre les acides nucléiques invasifs endogènes (transposons) et exogènes (pathogènes, transgènes). Dans le cas des virus, le PTGS peut s’attaquer aux ARNs double-brin (dsRNAs) intermédiaires de la réplication virale et aux ARNs simple-brin viraux, mais il est souvent inhibé par des protéines virales appelées Viral Suppressor of RNAi (VSR). Chez la plante modèle Arabidopsis thaliana, une enzyme appelée RNase THREE-LIKE 1 (RTL1) est induite en réponse à l'infection virale et détruit les dsRNAs de manière non sélective. Cette enzyme devrait assurer à la plante une seconde ligne de défense en clivant les dsRNAs viraux, mais les VSR qui inhibent le PTGS inhibent généralement RTL1, indiquant que les virus ont mis en place des outils capables de combattre simultanément ces deux mécanismes de défense. Toutefois, un virus, le Turnip yellow mosaic virus (TYMV), est incapable d’inhiber RTL1 et semble même tirer profit de RTL1 pour réussir à infecter A. thaliana (Shamandi et al., 2015).Au cours de cette thèse, nous avons approfondi l’étude de l’interaction Arabidopsis-TYMV. Nous avons montré que le TYMV est incapable d’inhiber l’exécution du PTGS, mais est toutefois capable d’inhiber l’étape d’amplification du PTGS. Cette action est due à la protéine virale P69, et nous avons montré que P69 est retrouvée dans des corpuscules cytoplasmiques appelés siRNA-bodies qui sont le siège de l’amplification du PTGS. Par ailleurs, nous avons généré des mutants rtl1 et montré que l’absence de RTL1 retarde l’infection par le TYMV et augmente la quantité de siRNAs dirigés contre le virus, tandis que la surexpression de RTL1 favorise l’infection et inhibe la production des siRNAs anti-viraux. Nous avons observé que RTL1 était retrouvée dans les siRNA-bodies, et nous avons montré que RTL1 était capable de détruire non seulement les dsRNAs mais également les siRNAs. Ces résultats indiquent donc que le TYMV réussit à infecter A. thaliana en : i) se répliquant dans des invaginations de la membrane chloroplastique (Prod’homme et al., 2003) qui mettent vraisemblablement les dsRNAs intermédiaires de la réplication à l’abri du PTGS et de RTL1, ii) en induisant l’expression de RTL1 qui s’attaque aux dsRNAs et siRNAs induits par le PTGS dans les siRNA-bodies en réponse à l’infection, et iii) en exprimant la protéine P69 qui complète l’action de RTL1 en inhibant l’amplification du PTGS résiduel.Malgré un effet neutre ou négatif pour la plante vis-à-vis des virus, RTL1 est conservé dans toutes les accessions d’Arabidopsis, et l’étude du ratio des mutations synonymes et non synonymes dans les gènes RTL1 de 42 Eucotylédones suggère que RTL1 subit une pression de sélection de conservation, suggérant un rôle essentiel. Chez A. thaliana, RTL1 est exprimé faiblement dans la racine, les tissus en sénescence, et au cours du développement de la graine. Le phénotypage des plantes sauvages et des mutants rtl1 n’a pas révélé de différences morphologiques notables, mais nous avons observé que le poids des graines était supérieur chez les mutants rtl1. Par ailleurs, nous avons observé une senescence accrue chez le mutant rtl1, en particulier dans l’accession Ler. Cette différence entre Ler et Col nous a poussé à examiner si RTL1 pouvait contribuer à la variabilité naturelle du PTGS des transgènes entre les accessions Ler (PTGS peu efficace) et Col (PTGS très efficace). Nous avons observé que la mutation rtl1 n’affectait pas sensiblement l’efficacité du PTGS chez Col mais augmentait celle de Ler au niveau de Col, ce qui pourrait s’expliquer par une plus forte expression de RTL1 chez Ler que chez Col. L’effet de l’absence de RTL1 devra donc être précisé en condition normale et en condition d’infection en privilégiant Ler plutôt que Col
Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) is a defense mechanism that targets invading nucleic acids of endogenous (transposons) or exogenous (pathogens, transgenes) origins. During virus infection, PTGS theoretically targets double-stranded (ds)RNA intermediates of viral replication and viral single-stranded RNAs; however, most viruses encode proteins, referred to as viral suppressor of RNAi (VSR), which inhibit PTGS. In the model plant Arabidopsis thaliana, an enzyme referred to as RNase THREE-LIKE 1 (RTL1) is induced in response to viral infection and cleaves dsRNAs in a non-specific manner. This enzyme should provide a second line of defense by cleaving viral dsRNAs, but VSR that inhibit PTGS generally inhibit RTL1, indicating that viruses had put in place tools that simultaneously counteract these two defense mechanisms. Nevertheless, at least one virus, Turnip yellow mosaic virus (TYMV), is not able to inhibit RTL1 and in fact seems to take advantage of RTL1 to successfully infect A. thaliana (Shamandi et al., 2015).In this thesis, we deepened the study of Arabidopsis-TYMV interaction. We show that TYMV is not able to inhibit PTGS execution but is able to inhibit PTGS amplification. This effect is due to the viral protein P69, and we show that P69 localizes in cytoplasmic foci called siRNA-bodies, where PTGS amplification takes place. Furthermore, using in house-generated rtl1 mutants, we show that the lack of RTL1 delays TYMV infection and promotes the production of siRNAs directed against the virus, whereas RTL1 overexpression enhances viral symptoms and suppresses the production of anti-viral siRNAs. We show that RTL1 is found in siRNA-bodies, and we show that RTL1 attacks not only dsRNAs but also siRNAs. These results indicate that, TYMV successfully infect A. thaliana by : i) replicating in chloroplast membrane invaginations (Prod’homme et al., 2003), which likely shelter dsRNAs intermediates of replication from PTGS and RTL1, ii) inducing RTL1 expression, which promotes the destruction of dsRNAs and siRNAs produced by PTGS in siRNA-bodies in response to TYMV infection, and iii) expressing the P69 protein to inhibit residual PTGS amplification.Despite a neutral or detrimental effect on plant anti-viral PTGS, RTL1 is conserved in all Arabidopsis accessions, and the study of synonymous and non-synonymous substitutions ratios in RTL1 genes from 42 dicotyledonous plant reveals that RTL1 is under the control of a conservative selection, suggesting an essential role. In A. thaliana, RTL1 is weakly expressed in roots, in senescent tissues and during seed development. Phenotyping wild-type plants and rtl1 mutants did not revealed any significant morphological differences, but we observed that seeds weight is enhanced in rtl1 mutants. Moreover, we observed an increased senescence in rtl1 mutants, in particular in the Ler accession. This difference between Ler and Col prompted us to determine if RTL1 could participate in the natural variability of transgene PTGS efficiency between Ler (weak PTGS) and Col (strong PTGS). We observed that rtl1 mutations have no significant effect on PTGS efficiency in Col, but enhances PTGS efficiency in Ler, up to the level of Col, which could be explained by a strongest RTL1 expression in Ler compared to Col. These results indicate that the effect of RTL1 impairment should be further examined in normal and infectious contexts by focusing on Ler rather than Col

L'oxyde de graphène (GO) a attiré un intérêt croissant comme vecteur potentiel pour la délivrance de gènes, en particulier pour l’inhibition de gènes spécifiques. Le but principal de ce travail est le développement de nouvelles plateformes complexant de petits ARN interférents (siRNA) et la rationalisation des interactions supramoléculaires entre la surface du GO et l'ARN double brin. L'étude s'est concentrée d'abord sur la synthèse de GO avec divers groupes oxygénés, puis sur la fonctionnalisation covalente du GO avec des amines et des polymères. De plus, j'ai étudié les facteurs qui pourraient affecter la structure double hélice du siRNA. Enfin, la question que je me suis posé: « l’oxyde de graphène peut-il devenir une plateforme appropriée pour la complexation d’acides nucléiques ?» a été résolue à l’aide d’expériences biologiques prouvant la capacité du GO à délivrer du siRNA dans les cellules
Graphene oxide (GO) has attracted increasing interest as a prominent potential vector in gene delivery and in particular in gene silencing. The main goal of this work is to develop novel platforms to complex small interfering RNA (siRNA) molecules and to rationalize the supramolecular interactions between GO surface and the double strand RNA. The study focused first on the synthesis of GO with various oxygenated groups, subsequently chemically covalently modified with amines and polymers. Moreover, I investigated on the factors that could affect the double helix siRNA structure. Finally, the question of the thesis, « Can graphene oxide be a suitable platform for complexation of nucleic acids? » could be answered from the biological tests proving the ability of graphene derivatives as a carrier of siRNA into the cells

Le Sarcome d'Ewing est un cancer pédiatrique rare, principalement dû à l'expression de l'oncogène de jonction EWS-Fli1, et dont les traitements médicamenteux ont peu évolué au cours des dernières décennies. Nous nous intéressons à une nouvelle approche thérapeutique utilisant des siRNA, ciblant spécifiquement l'oncogène EWS-Fli1, et permettant l'inhibition de la croissance tumorale. Durant mon travail de thèse, j'ai utilisé des nanocristaux de diamant issus soit de détonation (DND), soit de synthèse haute pression-haute température (NDHPHT) pour vectoriser les siRNA, accrochés par interaction électrostatique. Pour ce faire, les NDs ont été rendus cationiques par différentes méthodes: (i) hydrogénation assistée par plasma, (ii) par recuit thermique, ou (iii) par traitement chimique pour les DNDs, ou (iv) greffage covalent d'un polymère cationique sur des NDHPHT (COP-NDHPHT).Mes travaux ont comporté deux axes: (i) étude in vitro des complexes ND:siRNA (caractérisations physico-chimiques des NDs et étude de l'efficacité d'inhibition de l'oncogène par les complexes); (ii) distribution tissulaire de COP-NDHPHT, injectés dans des souris, grâce à des NDHPHT fluorescents, contenant des défauts azote-lacune. Pour les détecter individuellement dans des coupes d'organes de souris portant une tumeur xénogreffée sous-cutanée, nous avons développé un système d'imagerie en épifluorescence à grande ouverture numérique, et résolu en temps afin de rejeter l'autofluorescence tissulaire (de durée de vie plus courte que celle des NDs). Nous avons quantifié le nombre, l'état d'agrégation et la localisation cellulaire de ces vecteurs (grâce à un marquage histopathologique imagé simultanément) 24h après injection. Les NDs ont été clairement détectés dans les différents organes, dont la tumeur, ouvrant la voie à un contrôle de la progression tumorale grâce au siRNA
Ewing Sarcoma is a rare pediatric cancer, caused in the majority of the cases by the expression of the fusion oncogene EWS-Fli1. Current treatments have not much evolved over the past decades. We are investigating a new therapy based on siRNA specifically targeting the oncogene and inhibiting the tumor growth. During my PhD thesis, I have tested different types of synthetic nanodiamonds (ND) used to vectorize siRNA electrostatically bound at their surface: ND produced by detonation (DND) or by High Pressure-High Temperature synthesis (NDHPTH). Their surfaces have been cationized by various processes: (i) plasma or (ii) thermal hydrogenation, (ii) chemical treatment, or (iv) covalent grafting of a copolymer (COP-NDHPHT).My PhD work included two main axis: (i) in vitro study of ND:siRNA complexes (NDs physico-chemical characterization and oncogene inhibition efficacy by the complexes); (ii) tissue distribution of COP-NDHPHT, injected into mice, using fluorescent NDHPHT containing nitrogen-vacancy defects. To detect them individually in sections of mouse organs carrying a subcutaneous xenograft tumor, we developed an epifluorescence imaging system with large numerical aperture and resolved in time to reject tissue autofluorescence (of a shorter lifetime than NDs). We quantified the number, the aggregation state and the cell localization (thanks to simultaneous histopathological imaging) of these vectors 24 hours after injection. NDs have been clearly detected in different organs, including the tumor, paving the way for tumor progression control with siRNA

Les membres du genre Morbillivirus, famille Paramyxoviridae sont responsables de graves maladies chez l'homme et les animaux, comme la rougeole, la peste bovine (RP) et la peste des petits ruminants (PPR). Malgré l'existence de vaccins efficaces contre ces maladies, des traitements spécifiques sont souhaitables. L'inhibition de la réplication de ces virus peut-être acquise par interférence ARN (ARNi), un mécanisme d'inhibition post-transcriptionnel déclenché par des séquences courtes d'ARN double-brin (siARN). Le CIRAD a précédemment identifié 3 siARNs ciblant des régions conservées du gène de la nucléoprotéine virale capables d'inhiber au moins 80% de la réplication in vitro des virus de la rougeole, de la RP et de la PPR. Cependant, un problème majeur dans la stratégie d'ARNi est le risque d'apparition de virus résistants. Dans cette étude, nous avons évalué le risque d'apparition de mutants d'échappement du virus de la PPR sous pression de sélection de 3 siARNs appliqués seul ou en association après plusieurs transfections successives in vitro. Excepté pour la combinaison des 3 siARNs, le virus a échappé à l'ARNi après 3 à 20 passages consécutifs, avec des mutations simples ou multiples (synonymes ou pas) ou une délétion de 6 nucléotides dans la zone cible des siARN. Ces résultats mettent en évidence une plasticité génomique inattendue des morbillivirus surtout illustrée par cette délétion non-délétère d'une partie significative d'un gène viral essentiel, qui devrait être considérée comme un obstacle à l'utilisation de l'ARNi comme thérapie antivirale. Cependant, l'utilisation combinée de 3 siARNs peut être proposée pour diminuer le risque d'échappement aux siARNs
Viruses in the genus Morbillivirus, within the family Paramyxoviridae are responsible for severe humans and animal diseases, including measles, rinderpest (RP) and peste des petits ruminants (PPR). In spite of the existence of efficient vaccines against these diseases, specific treatments to be applied when the infection is already present are desirable. Inhibition of morbillivirus replication can be achieved by RNA interference (RNAi), a mechanism of post-transcriptional gene silencing triggered by small double-stranded RNA (siRNA). The CIRAD previously identified three siRNAs that target conserved regions of the essential gene encoding the viral nucleoprotein and are able to prevent in vitro at least 80% of the replication of measles, RP and PPR viruses . However, a major problem in RNAi is the important risk of emergence of escape mutants. In this study, we investigated the ability of PPR virus to escape the inhibition conferred by single or multiple siRNAs after several consecutive transfections in vitro. Except with the combination of the three different siRNAs, the virus systematically escaped RNAi after 3 to 20 consecutive passages. The mutations were characterized by either single or multiple punctual nucleotide mutations (synonymous or not) or a deletion of a stretch of 6 nucleotides into the siRNA target. These results demonstrate that the genomic plasticity of morbilliviruses, illustrated maily by this significant and no-deleterious deletion in an essential viral gene, should be considered as an obstacle to the use of RNAi in antiviral therapy. However, the combined use of three siRNAs can be proposed to prevent treatment failure with siRNAs

Les pDC représentent la première ligne de défense de l’organisme contre les pathogènes et établissent le lien essentiel entre l’immunité innée et adaptative. Les pDC endocytent et détruisent les particules virales et ainsi détectent leur matériel génétique grâce à des senseurs antiviraux de la famille des Toll-Like Receptors (TLR). L’activation des TLR7/9 induit la production massive d’interféron de type I (IFN-I), un antiviral puissant indispensable au contrôle de la propagation virale lors des phases aigues de l’infection. Cependant, l’IFN-I peut s’avérer avoir des effets délétères dans un grand nombre d’infections chroniques et de maladies auto-immunes. Ainsi, il semble indispensable de découvrir les mécanismes régulateurs des pDC ainsi que des modulateurs de l’activation des pDC. Nous avons ainsi montré que les monoamines (histamine, dopamine, sérotonine) et les polyamines (spermine et spermidine) inhibent l’activation complète des pDC stimulées par divers virus. Par la suite, nous avons identifié CXCR4 comme étant le récepteur des amines sur les pDC. Ainsi nous avons pu montrer que les amines pouvaient réguler les pDC en passant par CXCR4 et que ce récepteur était un interrupteur d’activation potentiel des pDC lors des infections virales. Afin de comprendre le mécanisme des amines, nous avons développé une nouvelle technologie : la transfection de siRNA dans les pDC primaires humaines. D’autre part, nous avons détecté des cellules géantes multinucléées en forme de roue de bicyclette lorsque les pDC sont cultivées in vitro avec de grandes quantités de virus VIH. Ainsi, comme les monocytes et les macrophages, les pDC peuvent former in vitro des cellules géantes multinucléées exprimant de hauts niveaux de protéines virales p24 de VIH-1. Cependant, les pDC ne sont que très peu infectées (moins de 5%). Nous nous sommes alors demandé si le corécepteur CXCR4 du virus VIH était aussi important que le récepteur CD4 pour la reconnaissance de ce dernier lors de l’activation des pDC
PDC are the first line of defense of our organism against pathogens and establish the essential link between the innate and adaptive immunity. pDC endocyte and destroy the viral particles and thus, detect the genetic material with their antiviral sensors from the Toll-Like Family (TLR). The activation of TLR7/9 induces massive production of type I interferon (IFN-I), a powerful antiviral molecule, essential to control viral propagation during the acute phases of the infection. However, type I IFN can have deleterious effects in a large number of chronic infections and autoimmune diseases. Thus, it seems essential to discover the regulatory mechanism of pDC as well as pDC activation modulators. We showed that monoamines (histamine, dopamine and serotonin) and polyamines (spermine and spermidine) inhibit completely the activation of virus-stimulated pDC. Thus, we showed that amines regulated pDC activation through CXCR4 engagement and that this receptor was a potential switch "on-off" for pDC during viral infections. To better understand the mechanism of action by which amines inhibit pDC activation, we developed a new technology: siRNA transfection in human primary pDC. Furthermore, we detected multinuclear giant cells bearing the shape of a bicycle wheel when pDC are cultured in vitro with high quantities of HIV virus. Thus, on top of monocytes and macrophages, pDC can form in vitro multinuclear giant cells with high levels of p24 viral protein of HIV-1. However, pDC barely get infected (less than 5%). We then wondered if the receptors and co-receptors of the virus were important for the viral recognition during HIV-activation of pDC

En nanomédecine, une nouvelle approche consiste à développer des vecteurs synthétiques pour co-délivrer au sein d’une cellule tumorale, un anticancéreux ainsi qu’un siARN, capable de supprimer l’expression d’une protéine impliquée dans les mécanismes de résistance. Les travaux décrits dans ce manuscrit ont été consacrés à la synthèse de nano-vecteurs micellaires pour la délivrance simultanée de ces deux agents thérapeutiques. Une première partie décrit la synthèse et la formulation de micelles nanométriques diacétyléniques photopolymérisables conçues pour délivrer efficacement un siARN. Les propriétés d’encapsulation et de délivrance de ces micelles ont ensuite été étudiées in vitro et in vivo pour une application en thérapie combinatoire. Enfin, une dernière partie présente la fonctionnalisation par interaction électrostatique de ces vecteurs cationiques avec des anticorps préalablement modifiés par des oligonucléotides anioniques pour réaliser un ciblage actif des cellules tumorales
In the nanomedecine field, a new approach consists in developing synthetic vectors able to co-deliver into a cancer cell, an antitumoral drug and siRNAs that target protein(s) involved in MDR. The work described in this manuscript was dedicated to the development of micellar nanovectors for the intracellular co-delivery of these two therapeutic agents. The first part details the synthesis and the formulation of nanometric photopolymerized diacetylenic micelles adapted for the delivery and intracellular release of the siRNA. Then, the encapsulation and delivery properties of these micelles, bearing histidine polar heads have been investigated in vitro and in vivo for the application of combination therapy. Finally, the last part presents the functionalization by electrostatic interaction of these cationic vectors with antibodies, priorly modified by anionic oligonucleotides. This original and versatile system allowed achieving an active targeting of tumoral cells

Le cancer papillaire de la thyroïde (PTC) représente 70-80% des cas de cancers de la thyroïde. Il est principalement caractérisé par des réarrangements chromosomiques affectant le gène RET. Le réarrangement RET/PTC1, dans lequel RET est réarrangé avec un gène proapoptotique H4, représente 30% des cas sporadiques et jusqu’à 60% des cas survenus après irradiation. Afin d’inhiber l’oncogène de fusion RET/PTC1, nous avons utilisé un siRNA ciblant la zone de jonction RET/PTC1 (siRNA RET/PTC1) au niveau de l’ARN messager des cellules tumorales et montré sa spécificité et son efficacité. Néanmoins, le développement des siRNAs comme molécule d’intérêt thérapeutique se heurte in vivo à des difficultés liées à leur administration. Sous forme libre, ces molécules sont, en effet, très vite dégradées par les nucléases extracellulaires et leur pénétration intracellulaire est limitée. C’est la raison pour laquelle il est nécessaire de les vectoriser. Nous avons choisi de le faire par la méthode de « squalénisation » et avons couplé d’une manière covalente le squalène, un lipide naturel précurseur de la biosynthèse du cholestérol, au siRNA RET/PTC1. Le bioconjugué formé s’autoassemble spontanément en milieu aqueux sous forme de nanoparticules stables de 170 nm de diamètre. L’efficacité et la toxicité des nanoparticules siRNA RET/PTC1-squalène ont été étudiées in vitro dans deux lignées de PTC exprimant RET/PTC1 (BHP10-3 et TPC-1) et l’activité antitumorale a été évaluée in vivo sur des souris athymiques xénogreffées par BHP10-3 puis traitées en i.v. par ces nanoparticules. Les nanoparticules siRNA RET/PTC1-squalène ont montré une bonne efficacité antitumorale. En revanche, aucune activité inhibitrice n’a été retrouvée in vitro. En conclusion, nous avons réussi à vectoriser le siRNA RET/PTC1 par la méthode de squalénisation. Cette étude ouvre des perspectives thérapeutiques pour certains patients atteints de PTC et réfractaires au traitement conventionnel
The papillary thyroid carcinoma (PTC) is the most common type of thyroid malignancy. This tumour is associated with somatic mutations of the RET proto-oncogene, due to gene rearrangements of the proto-RET. RET/PTC1 rearrangement is the most common genetic alteration identified to date, it is formed by an intra chromosomic rearrangement which leads to the juxtaposition of the RET Tyrosine Kinase domain of the proto-RET with the gene H4. The fusion RET/PTC1 oncogene represents an interesting target for small interfering RNA (siRNA) strategies since it is present only in the tumour cells and not in the surrounding normal cells. However, the biological efficacy of the siRNAs is hampered by their short plasma half-life due to poor stability in biological fluids and low intracellular penetration. In order to protect siRNA from degradation, and to improve their intracellular capture, we applied the concept of “squalenoylation”, ie. The bioconjugation of a drug substance to squalene, for the delivery of siRNA targeted toward the RET/PTC1 fusion oncogene. The acyclic isoprenoid chain of squalene was covalently coupled with RET/PTC1 siRNA at the 3’-terminus of the sense strand via a stable thioether linkage. The linkage of RET/PTC1 siRNA to squalene leads to an amphiphilic molecule that self-organise in water as RET/PTC1 siRNA-SQ nanoassemblies of 170 nm and Zeta potential of -26.4 mV. These RET/PTC1 siRNA-SQ NPs did not showed any cytotoxicity in vitro. Interestingly, in vivo, in a mouse xenografted RET/PTC1 experimental model, RET/PTC1 siRNA-SQ nanoparticles inhibited tumour growth, RET/PTC1 oncogene and oncoprotein expression, after intravenous injections of 2.5 mg/kg cumulative dose. In the last of this work, GALA-cholesterol combination with siRNA-SQ NPs further enhanced nucleic acid internalization, promoted their escape into the cytosol and consequently their gene silencing efficiency in vitro. In conclusion, these results showed that the “squalenoylation” offers a new non cationic plate-form for the siRNA delivery

Dans cette thèse, j'ai étudié le rôle des sRNAs dérivés de l'hôte et du virus lors de l'infection du colza (Brassica napus, Canola) par la souche UK1 du virus de la mosaïque du navet (TuMV-UK1). En utilisant un dérivé de TuMV fusionné avec un gène codant pour la protéine fluorescente verte (TuMV-GFP), deux cultivars de colza (‘Drakkar’ et ‘Tanto’) qui diffèrent par leur susceptibilité à ce virus ont été identifiés. Le profil transcriptionnel des foyers d'infection locale, dans les feuilles de Drakkar et de Tanto, par séquençage nouvelle génération (NGS) a révélé de nombreux gènes exprimés de manière différentielle. Les mêmes échantillons d'ARN provenant de feuilles de Drakkar et de Tanto, traitées par des virus ou utilisées en contrôle, ont également servi à établir le profil NGS des sRNAs (sRNAseq) et de leurs cibles potentielles d'ARN (PAREseq). Les analyses bioinformatiques et leur validation in vivo, ont permis d’identifier les événements de clivage de transcrits impliquant des micro ARN (miRNA) connus et encore inconnus. Fait important, les résultats indiquent que TuMV détourne la voie du RNA silencing de l’hôte avec des siRNAs issus de son propre génome (vsiRNA) pour cibler les gènes de l’hôtes. Le virus déclenche également le ciblage à grande échelle des ARN messagers (ARNm) de l’hôte par l’activation de la production de siRNAs secondaires en phase, à partir de locus PHAS. À leur tour, les vsiRNAs et les siRNAs dérivés de l'hôte (hsRNAs) ciblent et clivent l'ARN viral par le complexe RISC. Ces observations éclairent le rôle des siRNAs dérivés de l'hôte et du virus dans la coordination de l'infection virale. Un autre chapitre de cette thèse est consacré à l'analyse des maladies induites par des virus en utilisant comme modèle de plante Arabidopsis, infectée par un tobamovirus, le virus de la mosaïque du colza (ORMV). De plus, ces observations ont permis de proposer un modèle dans lequel cette guérison dépend d’un adressage important de vsiRNAs secondaires antiviraux depuis leur source de production jusqu’à leurs tissus de destination, et l'établissement d'un apport en vsiRNAs capable de bloquer l'activité VSR impliquée dans la formation des feuilles symptomatiques
In this thesis, I investigated the role of host- and virus-derived sRNAs during infection of Rapeseed (Brassica napus, Canola) by the UK1 strain of Turnip mosaic virus (TuMV-UK1). By using a TuMV derivative tagged with a gene encoding green fluorescent protein (TuMV-GFP), two rapeseed cultivars (‘Drakkar’ and ‘Tanto’) that differ in susceptibility to this virus were identified. Transcriptional profiling of local infection foci in Drakkar and Tanto leaves by next generation sequencing (NGS) revealed numerous differentially expressed genes. The same RNA samples from mock- and virus- treated Drakkar and Tanto leaves were also used for the global NGS profiling of sRNAs (sRNAseq) and their potential RNA targets (PAREseq). The bioinformatic analysis and their in vivo validation led to the identification of transcript cleavage events involving known and yet unknown miRNAs. Importantly, the results indicate that TuMV hijacks the host RNA silencing pathway with siRNAs derived from its own genome (vsiRNAs) to target host genes. The virus also triggers the widespread targeting of host messenger RNAs (mRNAs) through activation of phased, secondary siRNA production from PHAS loci. In turn, both vsiRNAs and host-derived siRNAs (hsRNAs) target and cleave the viral RNA by the RISC-mediated pathway. These observations illuminate the role of host and virus-derived sRNAs in the coordination of virus infection. Another chapter of this thesis is dedicated to the analysis of virus-induced diseases by using Arabidopsis plants infected with the Oilseed rape mosaic tobamovirus (ORMV) as a model. Initially, the infected plants develop leaves with strong disease symptoms. However, at a later stage, disease-free, “recovered” leaves start to appear. Analysis of symptoms recovery led to the identification of a mechanism in which the VSR and virus derived-siRNAs play a central role. I used Arabidopsis mutants impaired in transcriptional and post-transcriptional silencing pathways (TGS and PTGS respectively) and a plant line carrying a promoter-driven GFP transgene silenced by PTGS (Arabidopsis line 8z2). Using various techniques able to monitor virus infection, small and long viral RNA molecules, VSR activity, as well as phloem-mediated transport with in these lines, this study led to the identification of genes required for disease symptoms and disease symptom recovery. Moreover, the observations allowed to propose a model in which symptoms recovery occurs upon robust delivery of antiviral secondary vsiRNAs from source to sink tissues, and establishment of a vsiRNA dosage able to block the VSR activity involved in the formation of disease symptoms

Ce travail concerne le développement d'un système de vectorisation nanoparticulaire pour l'interférence ARN, constituant une nouvelle proposition thérapeutique applicable à des pathologies virales ou tumorales, et possiblement complémentaire aux traitements existants. La vectorisation de siRNA est ici basée sur l'enrobage multicouche de nanoparticules de phosphate de calcium, la multicouche étant constituée de dépôts alternés de PEI modifié et de siRNA. Ce système permet d'obtenir une efficacité de transfection des cellulaires cibles supérieure à celle des procédés conventionnels et une rémanence fonctionnelle in vitro jusqu'à neuf jours. Les résultats d'interférence ARN obtenus ont permis notamment d'inhiber l'infection par le virus de l'hépatite C jusqu'à 99,95%, l'inhibition de l'expression d'une protéine intrinsèque jusqu'à90,5%, et le ralentissement de la croissance cellulaire dans un modèle 3D mimant une tumeur hépatique jusqu'à 46,5%. Ces nanoparticules pourraient présenter un intérêt majeur, en offrant une action à long terme et en résolvant la plupart des difficultés rencontrées en utilisant des siRNA en thérapie.

Les travaux de recherche que présente cette thèse sont le fruit de collaborations fructueuses entre mon entreprise d’accueil, l’Institut de Recherches SERVIER, mon laboratoire d’accueil, la plateforme BioPhenics de l’Institut Curie, et moi-même préparant mon doctorat à l’Ecole Doctorale CBMS de l’Université Paris-Saclay. Des partenariats internationaux ont également permis de générer et d’enrichir de multiples données dans un même but : identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement du cancer du sein triple-négatif (TNBC, Triple-negative breast cancer). Le cancer TNBC est une forme de cancer mammaire caractérisée par l’absence des récepteurs aux œstrogènes (ER, Estrogen Receptor), à la progestérone (PR, Progesterone receptor), et du récepteur de facteur de croissance épidermique humain 2 (HER2, Human epidermal growth factor receptor 2), touchant près de 20% des femmes diagnostiquées avec un cancer mammaire. Par l’absence de ces récepteurs, les patientes ne sont éligibles ni aux thérapies hormonales ni aux thérapies ciblées anti-HER2. Alors que le cancer TNBC est enrichi en cellule-souches cancéreuses (CSC) et que des dérégulations épigénétiques ont été identifiées dans les voies de signalisation des CSC des TNBC, nous avons émis l'hypothèse que les mécanismes épigénétiques pourraient être modulés et aboutir à deux phénotypes : un impact sur la viabilité des cellules d'une part, et un effet sur l'expression de HER2 de façon à sensibiliser les cellules aux thérapies anti-HER2 existantes d'autre part. Afin de vérifier ces hypothèses, nous avons réalisé des cribles de génomique fonctionnelle en siRNA ciblant 863 modulateurs épigénétiques par des approches à haut débit et haut contenu. Bien que l’utilisation de siRNA représente une approche puissante, le risque d’effets hors cible est important. Afin de renforcer la découverte de hits spécifiques et de limiter l’identification de hits non-spécifiques, différentes stratégies ont été mises en place pour les deux études. Alors que l’identification de gènes impliqués dans l’expression de HER2 est toujours à l’étude, nous avons identifié 3 gènes clés pour la viabilité des cellules TNBC, parmi lesquels CHAF1A, dont le rôle dans la viabilité des cellules TNBC est identifié pour la première fois. Aussi, suite à des analyses bioinformatiques réalisées à partir des résultats générés en viabilité, les effets non spécifiques à la cible initiale ont été considérés comme sources de hits potentiels, permettant d’envisager de nouvelles approches de génomique fonctionnelle
Research presented in this thesis manuscript is the result of a fruitful collaboration between my host company, Institut de Recherches SERVIER, my host laboratory, BioPhenics Laboratory at Institut Curie, and I, preparing my PhD at the doctoral school CBMS at Université Paris-Saclay. International partnerships also led to the generation of numerous data towards the same purpose: identifying novel therapeutic targets in triple-negative breast cancer (TNBC) treatment. TNBC is a breast cancer subtype characterized by its ER(Estrogen receptor)-, PR(Progesterone receptor)- and HER2(Human epidermal growth factor receptor 2)-negative phenotype, affecting almost 20% of breast cancer diagnosed women. In the absence of these receptors, patients cannot respond neither to hormone therapy nor anti-HER2 targeted therapies. While TNBC is enriched in cancer-stem cells (CSC) and epigenetic deregulations were identified in TNBC CSC signaling pathways, we supposed that epigenetic mechanisms could be modulated to result in two phenotypes : an impact on TNBC cell viability, and an impact on HER2 expression in order to sensitize cells to existing anti-HER2 therapies. To investigate these hypotheses, we performed siRNA functional genomics screening targeting 863 epigenetic modulators through high-throughput and high-content approaches. Although using siRNA represents a powerful approach, the risk of off-target effects is important. In order to reinforce on-target hits discovery and to prevent the identification of non-specific hits, various strategies were used for the two studies. While the identification of genes involved in HER2 expression is currently in progress, we identified 3 key genes for TNBC cell viability, including CHAF1A for which the role in TNBC cell viability was never revealed. Also, following bioinformatic analyses performed from viability data, off-target effects were considered as sources of potential hits, highlighting the potential of a new functional genomics screening approach

Les protéines TCP constituent une famille de facteurs de transcription spécifiques des végétaux impliqués dans la régulation de la morphologie des plantes. Ce travail a pour objectif d'étudier l'évolution et la fonction de ces protéines. Dans la première partie, une étude structurelle et évolutive de la famille TCP permet de dater l'apparition de la famille avant la divergence du groupe d'algues des Zygnémophytes, il y a entre 650 et 800 millions d'années et indique une expansion permanente de la famille TCP au cours de l'évolution des Phragmoplastophytes. Dans la seconde partie, une analyse fonctionnelle in planta du gène AtTCP9 d'Arabidopsis a été entreprise. Le gène rapporteur de la glucuronidase (GUS) en fusion transcriptionnelle avec le promoteur d'AtTCP9 s'exprime tout au long du développement de la plante, majoritairement dans les vaisseaux. La protéine AtTCP9 est détectée par western dans les feuilles et les fleurs d'Arabidopsis mais pas dans les siliques. La caractérisation de mutants d'insertion ainsi que l'analyse de plantes transformées avec des fusions AtTCP9-domaine répresseur (EAR) ou activateur (VP16) sous contrôle d'un promoteur inductible (XVE) n'ont pas permis d'identifier de fonction mais suggèrent l'intervention d'une régulation post-transcriptionnelle de l'expression de AtTCP9. Un ARN antisens naturel (cis-NAT: cis-Natural Antisense Transcript) codé au même locus qu'AtTCP9 ainsi qu'un siRNA (small interfering RNA) correspondant à ce locus ont été caractérisés. Les résultats préliminaires semblent indiquer une possible régulation par inhibition traductionnelle d'AtTCP9 dans les siliques ainsi que l'existence d'un mécanisme de régulation inhabituel par un NAT et un siRNA
TCP proteins are plant-specific transcription factors involved in plant morphogenesis control. The objective of this work was to determine the evolution and the function of the TCP family transcription factors. In the first part, we made a structural and evolutionary study of the TCP family that indicated appearance of the family before the divergence of Charophytes, 650 to 800 mya. Phylogenetics indicated permanent expansion of the family during the evolution of the Phragmoplastophytes. In the second part, we undertook a functional study of a TCP Arabidopsis thaliana gene (AtTCP9). Plants bearing transcriptional fusion between AtTCP9 promoter and GUS reporter gene revealed an expression during the plant growth, especially in the vasculature. AtTCP9 protein was detected by western in leaves and flowers but not in siliques. Analysis of insertion mutant lines and plants bearing chimeric fusions between AtTCP9 and a repressor (EAR) or an activator (VP16) domain, under control of an inducible promoter (XVE) didn't allow us to identify the function of this gene, but the results suggest the involvement of a post-transcriptional regulation on AtTCP9. A Natural Antisense Transcript expressed at the same locus than AtTCP9 (cis-NAT) and an associated small interfering RNA (siRNA) were characterised. Preliminary results seem to indicate a translational inhibition of AtTCP9 in siliques and an unusual mechanism of regulation involving a NAT and a siRNA

Les études d’association pangénomique (GWAS) ont permis la mise en évidence de nouvelles voies putativement importantes dans la physiopathologie du diabète de type 2, par l’identification de variants génétiques fréquents (SNP) de susceptibilité au diabète de type 2, mais souvent avec peu ou pas d'informations sur le mécanisme sous-jacent expliquant le lien entre ces variants génétiques et le phénotype diabétique. En effet ces SNP sont souvent non codants et ont un effet modeste sur le risque de diabète de type 2, ce qui rend difficile leur étude d’un point de vue fonctionnel. Dès le début des GWAS, il a été suggéré que ces gènes associés au diabète de type 2, étaient des « gènes de la cellule β pancréatique » sans que des études fonctionnelles n’aient été faites de manière systématique. Dans ce contexte, nous avons mené une étude de fishing pour déblayer cette quantité importante de données provenant des GWAS et d’identifier des gènes potentiellement importants, pouvant être de nouvelles cibles thérapeutiques. Le premier objectif de ma thèse a été l’étude de l’expression des gènes de susceptibilité au diabète de type 2 dans un panel de tissus humains comprenant des tissus pancréatiques et des tissus sensibles à l’insuline. Pour cela nous avons utilisé une technique de quantification non biaisée de l’expression génique dans le but de montrer si ces gènes associés au diabète de type 2 avaient une expression enrichie (proportion de gènes de susceptibilité au diabète de type 2 surexprimés dans les cellules β versus les autres tissus) dans les cellules β pancréatiques. Nous avons ensuite réalisé des études fonctionnelles sur la trentaine de gènes de susceptibilité au diabète de type 2 les plus exprimés dans notre modèle cellulaire par des tests de sécrétion d’insuline, des études de la viabilité cellulaire, du séquençage d’ARN (RNA-seq) et du western blotting dans la lignée de cellules β pancréatiques humaines EndoC-βH1. Les EndoC-βH1 sont des cellules en mesure de sécréter de l’insuline en réponse au glucose et à d’autres sécrétagogues. Nous les avons utilisé afin d’étudier le rôle de ces gènes de susceptibilité au diabète de type 2 dans la fonction de la cellule β pancréatique, en particulier dans la sécrétion insulinique. Notre étude d’expression a montré que l’expression des gènes de susceptibilité au diabète de type 2 est enrichie de manière significative dans les cellules β pancréatiques et la lignée EndoC-βH1. Pour cinq gènes du diabète de type 2 (TBC1D4, TCF19, KCNK16, CDKN2A et SLC30A8) ayant une présence et un effet déjà connus dans la fonction des cellules β, nous avons démontré une variation significative de la sécrétion d’insuline après extinction génique, en concordance avec la littérature. Par ailleurs, nous avons pu mettre en évidence quatre gènes de susceptibilité au diabète de type 2 (PRC1, SRR, ZFAND3 et ZFAND6) montrant une baisse significative de la sécrétion d’insuline après extinction génique et dont la présence ou la fonction dans la cellule β était pour l’heure inconnue. Les analyses RNA-seq ont montré une association significative de l’extinction de ces gènes avec des réseaux moléculaires liés à la physiopathologie du diabète de type 2 (par exemple : l’apoptose des cellules pancréatiques, l’insulinémie, la glycolyse, le stress du réticulum endoplasmique…). Et l’évaluation de l’expression de nos quatre gènes dans des îlots de souris obèses (ob/ob) ou traitées à la streptozotocine a montré une corrélation positive de leur expression avec celle de l’insuline. Notre étude a démontré que les études fonctionnelles post-GWAS sont importantes et permettent de définir le lien de causalité des gènes de susceptibilité avec la maladie, et ainsi de mener à des progrès sur la compréhension de la physiopathologie de la maladie [...]
Genome-wide association studies (GWAS) have identified a plethora of single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with the risk of type 2 diabetes, but most often with little information about the mechanism underlying the relationship between these genetic variants associated with type 2 diabetes and the diabetic phenotype. Indeed, these SNPs are often noncoding and have a modest effect on the risk of type 2 diabetes, making difficult their functional study. At the beginning of the GWAS era, it has been suggested that susceptibility genes for type 2 diabetes are strongly involved in pancreatic β cell gene function, while no functional studies had been systematically performed. In this context, we conducted a “fishing” study to decipher this large amount of data generated by GWAS and to pinpoint potentially important genes that may be new therapeutic targets. The first objective of my thesis was to study the expression of type 2 diabetes susceptibility genes in a panel of human tissues comprising pancreatic and insulin-sensitive tissues using an unbiased technique of quantification of genes expression in order to show that these genes associated with type 2 diabetes were enriched in pancreatic β-cells. We then performed functional studies on the thirty mostly expressed genes in our cell model by insulin secretion tests, cell viability test, RNA sequencing (RNA-seq) and Western blotting in the human pancreatic β cell line (EndoC-βH1). These cells are able to secrete insulin in response to glucose and other secretagogues. Our goal was to study the role of these type 2 diabetes susceptibility genes in pancreatic β cell function, particularly in insulin secretion. Our expression study of type 2 diabetes susceptibility genes showed that their expression is significantly enriched in pancreatic β cells and the EndoC-βH1 cell line. For five genes associated with type 2 diabetes (TBC1D4, TCF19, KCNK16, CDKN2A and SLC30A8) with an already known presence and function in pancreatic β cell, we showed a significant variation in glucose-stimulated insulin secretion after gene silencing, in agreement with the literature. In addition, we identified four type 2 diabetes associated genes (PRC1, SRR, ZFAND3 and ZFAND6), with a significant decrease in insulin secretion after gene silencing without already know function in pancreatic β cell. RNA-seq has shown a significant association between the extinction of these genes and molecular networks related to the pathophysiology of type 2 diabetes (e.g. apoptosis of pancreatic cells, insulinemia, glycolysis, endoplasmic reticulum stress response...). The assessment of the expression of our four genes in the islets of obese mice (ob/ob) or treated with streptozotocin shows a positive correlation between their expression and the expression of insulin. Our study has shown that post-GWAS functional studies are important and can help to define the causal link between these genes and the disease, and therefore to make progress in the understanding of the pathophysiology of type 2 diabetes. This study allowed us to identify genes whose function in β cell was not anterior known and which are involved in pancreatic β cell function and the pathophysiology of type 2 diabetes

Dendrimers are synthetic macromolecules with branches-upon-branches structures, nanoscale dimensions and a high density of surface groups. Presence of multiple cationic sites in dendrimers permits their efficient nucleic acid complexation and cellular internalization through endocytic pathways. PETIM dendrimers of are characterized by tertiary amine branch points, and ether linkages. A third generation PETIM dendrimer, G3(NH2)24, with nitrogen at the core and twenty four peripheral primary amines was synthesized through alternate Michael addition and reduction reactions. The ability of G3(NH2)24 to interact with DNA was ascertained by spectroscopic and bio-physical techniques. These studies established the formation of dendrimer-DNA, and complex formation was also shown to protect the plasmid DNA from nucleases. Toxicity studies in cell culture, as well as, in female Balb/c mice established the non-toxic properties of the dendrimer. G3(NH2)24 was able to mediate efficient transfection in mammalian cells and in vivo. Targeted delivery of small interfering RNA (siRNA) to hepatocytes, in order to combat hepatitis C virus (HCV) infection was undertaken to expand the scope of PETIM dendrimer based gene delivery. Functionalization of the dendrimer periphery with galactose units ensured preferential delivery to the liver through multivalent interactions with the asialoglycoprotein receptors on the liver cell surface. The delivery of siRNA to the perinuclear region, in close proximity to the HCV RNA replication site resulted in ~75% decrease in viral RNA levels in replicon containing cells, as well as, JFH-1 infectious virus systems. The dendrimer-siRNA complexes were preferentially delivered to mice liver and were active in vivo. Physico-chemical studies of the protonation pattern of PETIM dendrimer indicated that the protonation of the dendrimer amines proceeded in a shell-wise pattern from the periphery to the core. The primary amines of the dendrimer as well as the outer shell tertiary amines with pKa values ~7-10 were protonated at physiological pH and were cationic sites for nucleic acid condensation. The inner shell tertiary amines with a pKa of ~4-6 were protonated at endosomal pH and aided ‘endosomal escape’ due to the high buffering capacity of 3.5. Work described in the Thesis establish a new synthetic dendrimer vector, namely, the series of PETIM dendrimers, as a high value gene delivery vector, making in-roads towards pre-clinical and possible clinical trials in future studies.

Dendrimers are synthetic macromolecules with branches-upon-branches structures, nanoscale dimensions and a high density of surface groups. Presence of multiple cationic sites in dendrimers permits their efficient nucleic acid complexation and cellular internalization through endocytic pathways. PETIM dendrimers of are characterized by tertiary amine branch points, and ether linkages. A third generation PETIM dendrimer, G3(NH2)24, with nitrogen at the core and twenty four peripheral primary amines was synthesized through alternate Michael addition and reduction reactions. The ability of G3(NH2)24 to interact with DNA was ascertained by spectroscopic and bio-physical techniques. These studies established the formation of dendrimer-DNA, and complex formation was also shown to protect the plasmid DNA from nucleases. Toxicity studies in cell culture, as well as, in female Balb/c mice established the non-toxic properties of the dendrimer. G3(NH2)24 was able to mediate efficient transfection in mammalian cells and in vivo. Targeted delivery of small interfering RNA (siRNA) to hepatocytes, in order to combat hepatitis C virus (HCV) infection was undertaken to expand the scope of PETIM dendrimer based gene delivery. Functionalization of the dendrimer periphery with galactose units ensured preferential delivery to the liver through multivalent interactions with the asialoglycoprotein receptors on the liver cell surface. The delivery of siRNA to the perinuclear region, in close proximity to the HCV RNA replication site resulted in ~75% decrease in viral RNA levels in replicon containing cells, as well as, JFH-1 infectious virus systems. The dendrimer-siRNA complexes were preferentially delivered to mice liver and were active in vivo. Physico-chemical studies of the protonation pattern of PETIM dendrimer indicated that the protonation of the dendrimer amines proceeded in a shell-wise pattern from the periphery to the core. The primary amines of the dendrimer as well as the outer shell tertiary amines with pKa values ~7-10 were protonated at physiological pH and were cationic sites for nucleic acid condensation. The inner shell tertiary amines with a pKa of ~4-6 were protonated at endosomal pH and aided ‘endosomal escape’ due to the high buffering capacity of 3.5. Work described in the Thesis establish a new synthetic dendrimer vector, namely, the series of PETIM dendrimers, as a high value gene delivery vector, making in-roads towards pre-clinical and possible clinical trials in future studies.