Thèses sur le sujet « Inibitore chinasico »

Presso l’azienda Rottapharm Biotech è emersa una nuova piccola molecola chiamata CR13626 che è stata identificata come un inibitore tirosin chinasico innovativo caratterizzato da un buon tropismo cerebrale e in grado di inibire alcune chinasi rilevanti nello sviluppo del glioblastoma (GBM), la più comune e maligna forma di tumore primario cerebrale nell’uomo, quali le chinasi EGFR, VEGR2, Fyn, Yes, Lck, HGK e RET. Inoltre, CR13626 non è risultato essere un substrato dei trasportatori di membrana implicati nel processo di resistenza multifarmaco e che in un contesto tumorale contribuiscono alla resistenza del tumore ad uno specifico trattamento farmacologico. Così, lo scopo del mio progetto di tesi è stato quello di caratterizzare l’attività di CR13626, sia in vitro che in vivo, in modo da sondare il suo potenziale per la terapia del glioblastoma. Con questo scopo per prima cosa ho valutato l’abilità di CR13626 di inibire l’attivazione indotta da ligando dei recettori EGFR e VEGFR2 in cellule di glioblastoma U87MG e in cellule endoteliali HUVEC-C, rispettivamente, attraverso esperimenti di immunoblotting. Inoltre, per definire meglio la potenza di CR13626 nell’inibire la chinasi Fyn in un modello cellulare, ho valutato la capacità del composto nel ridurre i livelli di fosforilazione di Tau mediati da Fyn utilizzando cellule HEK-239 co-transfettate per esprimere sia Fyn e Tau e un saggio ELISA messo a punto ad hoc. Inoltre, dal momento che VEGFR2 è ampiamente coinvolto nel promuovere il processo di angiogenesi, il quale a sua volta contribuisce a fornire un appropriato sostentamento al tumore, ho valutato la capacità di CR13626 di ridurre la formazione di strutture rappresentative di nuovi vasi come indicazione di eventuali proprietà antiangiogenetiche del composto in un saggio volto a investigare la formazione di queste strutture mediante l’utilizzo di cellule HUVEC-C. Successivamente ho verificato l’effetto di CR13626 sulla proliferazione cellulare in diverse linee cellulari di glioblastoma coltivate in 2D, ed in particolare nelle seguenti linee: U87MG, U373, U87MG vIII e T98G. Ciascuna di esse possiede infatti alterazioni e mutazioni genetiche presenti anche nelle cellule tumorali di GBM. Con lo scopo di verificare un’eventuale tossicità di CR13626 nei confronti di cellule non tumorali, ho verificato l’effetto di CR13626 sulla linea non tumorale di cellule HEK-293. Inoltre, dal momento che gli sferoidi 3D sono considerati più rappresentativi della complessità del microambiente tumorale rispetto alle colture 2D, costituendo quindi un modello più attendibile per verificare la risposta cellulare ad un trattamento farmacologico, ho valutato l’efficacia di CR13626 nel ridurre la proliferazione di cellule U87MG coltivate in 3D. Infine, l’attività antitumorale in vivo di CR13626 è stata valutata in un modello murino ortotopico eterologo di glioblastoma basato sull’impianto di cellule U87MG-Luciferate nel cervello di topi nudi (esperimento condotto presso i laboratori della società Accelera Srl, Nerviano, Italia). Gli animali sono stati trattati oralmente con CR13626 alla dose di 50 mg/kg/giorno o con il rispettivo veicolo per 10 giorni, partendo al giorno 9 dall’impianto delle cellule tumorali. La progressione del tumore è stata valutata tramite la misura di bioluminescenza (BLI) alla fine del trattamento (giorno 19) e durante i successivi giorni di osservazione (giorni 26 e 33) e la sopravvivenza degli animali è stata successivamente monitorata. In parallelo, in un gruppo satellite di animali con analogo impianto tumorale e trattati oralmente con CR13626 per 5 giorni alla dose di 50 mg/kg/giorno, sono state determinate le concentrazioni cerebrali e plasmatiche del composto.
At Rottapharm Biotech, a novel small molecule compound called CR13626 has emerged as a novel tyrosine kinase inhibitor with a good tropism for the brain and the ability to inhibit EGFR, VEGR2, Fyn, Yes, Lck, HGK and RET kinases relevant for the development of glioblastoma (GBM), the most common and malignant type of primary brain tumor. In addition, CR13626 resulted to be not a substrate of multidrug transporters involved in tumour resistance. Thus, the aim of my project is to characterize the activity of the compound, both in vitro and in vivo, to investigate the potential of CR13626 for glioblastoma therapy. To this purpose, I firstly investigated the ability of CR13626 to inhibit the ligand-induced activation of EGFR and VEGFR2 receptors in U87MG GBM and HUVEC-C cells, respectively, through western blot experiments. To better define the potency of CR13626 on Fyn kinase in a cellular model, I exploited the Fyn-mediated phosphorylation levels of Tau in Fyn/Tau co-transfected HEK-293 cells through a customized indirect-ELISA. Because of VEGFR2 is largely involved in promoting angiogenesis process, which contributes to tumor sustenance, I evaluated the ability of CR13626 to reduce the formation of new vessel-like structures in a HUVEC-C tube formation assay, as an indication of its antiangiogenic properties. Then I verified the effect of CR13626 on cellular proliferation in different 2D human GBM cell lines such as U87MG, U373, U87MG vIII and T98G, each harboring some of the genetic alterations/mutations present in GBM tumor cells. I also evaluated the activity of CR13626 on HEK-293 cells to assess the effect of the compound on a non-tumoral human cell line and to exclude a potential toxicity on healthy cells. Since 3D cell spheroids are more representative of the complexity of tumor environment with respect to 2D cultures and represents a more reliable model to assess cellular response to a drug treatment, I also investigated the efficacy of CR13626 in reducing cellular proliferation in U87MG cells cultured as 3D spheroids. Finally, the antitumor activity of CR13626 was investigated in vivo in an orthotopic xenograft mouse model of GBM based on the injection of U87MG-Luciferase cells in nude mice (experiment performed at Accelera Srl, Nerviano, Italy). Animals were orally treated with CR13626 (50 mg/kg/daily) or vehicle for 10 days, starting on day 9 post-implantation. Tumour progression was evaluated through the measurement of bioluminescence (BLI) at the end of dosing (day 19) and during follow-up (days 26 and 33). The survival of animals was also evaluated. In addition, the plasma and brain concentrations of CR13626 in tumour-bearing mice were determined in a satellite group of animals orally treated for 5 days with CR13626 (50 mg/kg/daily).

In Europa, la sopravvivenza a 5 anni dei pazienti affetti da leucemia mieloide acuta (LMA) è solo del 20%. La duplicazione interna in tandem del gene FLT3 (FLT3-ITD), che codifica per il recettore della tirosina chinasi FLT3, è la mutazione più frequente (~ 25%) nella LMA con cariotipo normale, dove porta all'attivazione costitutiva della chinasi FLT3. Nonostante risultati iniziali molto promettenti con inibitori di FLT3 (FLT3i) nei pazienti con questa mutazione, pochi pazienti hanno remissioni prolungate, evidenziando la necessità di nuove e più efficaci terapie. La persistenza delle cellule staminali leucemiche guida la leucemogenesi della LMA ed è responsabile della resistenza ai farmaci e della ricaduta dopo chemioterapia convenzionale. L'attivazione costitutiva di FLT3 porta all’attivazione del signaling a valle, e in particolare della via PI3K/AKT/mTOR, una cascata di segnale fortemente associata alla sopravvivenza delle cellule staminali leucemiche e al crosstalk tra le cellule staminali leucemiche e le cellule stromali associate al microambiente tumorale midollare. La nicchia midollare fornisce protezione alle cellule leucemiche FLT3-ITD nei confronti degli inibitori FLT3. Pertanto, la via PI3K/AKT/mTOR può rappresentare un bersaglio terapeutico nella AML FLT3-ITD. Questo studio mira a verificare l'ipotesi che l'inibizione di PI3K/AKT/mTOR sensibilizzi le cellule AML FLT3-ITD alla terapia mirata con RTKi utilizzando linee cellulari AML umane e blasti di pazienti primari. In particolare, ho definito il profilo fenotipico delle linee cellulari FLT3-ITD rispetto a quelle FLT3 wildtype dopo trattamento con un pannello di FLT3i o PI3K/AKT/mTORi che non hanno dimostrato sufficiente efficacia clinica se utilizzato come monoterapia. Successivamente, ho valutato l’effetto del farmaco sulla crescita cellulare e sul ciclo cellulare e l'apoptosi. I risultati ottenuti dimostrano che BAY-806946 (pan PI3Ki) e PF-04691502 (inibitore duale PI3K/mTORi) sono in grado di inibire la crescita poiché causano arresto del ciclo cellular in fase G1 e apoptosi, un effetto che appare indipendente dallo stato mutazionale di FLT3. Dimostrano inoltre che l’arresto della crescita cellulare indotto dall’inibitore di FLT3 (FLT3i) quizartinib è causato principalmente dall’induzione di apoptosi. Tuttavia l’efficacia rimane inferiore rispetto al trattamento con chemioterpia convenzionale (AraC). Inoltre, la proof of concept per l’utilizzo della combinazione del quizartinib con BAY-806946 è stata ottenuta in linee cellulari AML FLT3-ITD e blasti primari da paziente. Nel valutare i blasti primari da paziente, è stato considerato il ruolo protettivo delle cellule stromali mesenchimali in co-coltura, e dei fattori di crescita per riprodurre le condizioni del microambiente midollare. Pertanto, blasti primari da paziente LAM sono stati mantenuti in co-coltura con cellule stromali MS5 in presenza di concentrazioni fisiologiche di fattori di crescita quali IL-3, TPO e GM-CSF. Come atteso, il BAY-806946 potenzia l’effetto citostatico e citotossico del quizartinib nelle cellule MOLM-13 e nei blasti primari da paziente con mutazione FLT3-ITD in condizione di co-coltura. E’ importante sottolineare l’incremento di apoptosi osservato anche nella sottopopolazione staminale leucemica CD34+CD38-. Infine, ho valutato il profilo delle citochine e delle fosfoproteine persistenti come bersagli putativi dopo il trattamento di combinazione. Complessivamente, questo studio dimostra il potenziale di PI3Ki per migliorare l'efficacia di RTKi quizartinib nel trattamento della LMA FLT3-ITD.
Acute myeloid leukemia (AML) has a very poor 5-year survival of ~20% in Europe. The internal tandem duplication (ITD) mutation of the Fms-like receptor tyrosine kinase 3 (FLT3) (FLT3-ITD) is the most frequent mutation (~25%) in normal karyotype AML. In recent clinical studies, few patients display prolonged remissions with receptor tyrosine kinase (RTK) inhibitors, such as FLT3 inhibitors (FLT3i) therapy, highlighting a substantial unmet need for novel effective treatment. Persistence of leukemia stem cells (LSC) drive AML leukemogenesis, responsible for drug resistance and disease relapse following conventional chemotherapy. Growing evidence recognizes that FLT3-ITD mutation leads to the constitutive activation of FLT3 kinase and its downstream pathways, including PI3K/AKT/mTOR signaling, strongly associated with LSC survival and crosstalk between LSC and stromal cells associated bone marrow (BM) tumor environment (TME). The TME provides protection of FLT3-ITD AML cells against FLT3 inhibitors. Thus, the PI3K/AKT/mTOR pathway may represent as a putative target for FLT3-ITD AML. This study aims to test the hypothesis that PI3K/AKT/mTOR inhibition could sensitize FLT3-ITD AML cells to RTKi-lead targeted therapy using human AML cell lines and primary patient blasts. First, I uncover the phenotypic profile of FLT3-ITD versus FLT3 wildtype cell lines following treatment with selected FLT3i or PI3K/AKT/mTORi that have failed treatment of AML as monotherapy in clinical studies. More specifically, I determine the drug efficacy by means of cell growth measurement and assessment of cell cycle status and apoptosis. I was able to demonstrate that BAY-806946 (pan PI3Ki) and PF-04691502 (dual PI3K/mTORi) exerted growth inhibitory activity caused by G1 cell cycle arrest and apoptosis, and this effect was irrespective of FLT3 status. Quizartinib (FLT3i) selectively inhibited cell growth in FLT3-ITD AML and this effect was mainly caused by apoptosis. The observed drug-induced apoptotic effect was however not as efficient as chemotherapy. Next, I provide proof-of-concept for the combination of quizartinib and BAY-806946 using both FLT3-ITD AML cell lines and primary patient blasts. When evaluating on primary patient blasts, I take into consideration the protective role of mesenchymal stromal cells and physiological growth factors to mimic the BM microenvironment. Hereby, I co-cultured FLT3-ITD AML blasts with stromal cell line MS-5 and added growth factors essential for AML survival and differentiation such as IL-3, TPO and G-CSF at physiological concentration. As expected, treatment with BAY-806946 enhanced both cytostatic and cytotoxic effect of quizartinib in FLT3-ITD AML cell line MOLM-13 as well as primary patient blasts in co-culture. More importantly, enhanced apoptosis was measured in the stem cell like CD34+CD38- population. Lastly, I elucidate the cytokine profile and persistent phosphoproteins as putative targets following combination treatment. Ultimately, this study demonstrates the potential of PI3K/AKT/mTORi to enhance the efficacy of RTKi quizartinib for the treatment of FLT3-ITD AML.

I tumori gastrointestinal stromali (GIST) sono caratterizzati dalle mutazioni gain-of-function di KIT o PDGFRA, che portano alla attivazione costitutiva della via di segnalazione. L’attivazione di questi recettori rappresenta il razionale del trattamento con inibitori dei recettori tirosin-chinasici (TKI) nei GIST, e lo stato mutazionale è predittivo della risposta. Circa il 10-15% dei casi presenta però resistenza primaria ai TKI, in quanto non aventi mutazioni nei recettori (GIST-WT) o avendo mutazioni resistenti (PDGFRA-D842V). Inoltre, durante la progressione, l’acquisizione di ulteriori mutazioni può portare a fenomeni di resistenza secondaria. La necessità di aumentare l’aspettativa di vita dei pazienti anche con malattia progressiva, porta al bisogno di sviluppare nuove strategie terapeutiche. Lo scopo della tesi è di identificare e caratterizzare tutte le alterazioni genomiche dei GIST resistenti ai TKI attraverso il Next generation sequencing (NGS). Abbiamo analizzato il profilo mutazionale dei GIST secondariamente resistenti, valutando il possibile ruolo delle alterazioni acquisite come target di terapie alternative, come Palbociclib, gli inibitori di Hedgehog e BYL719. La delezione di DMD è stata identificata ricorrente nei casi metastatici. Inoltre, è stato considerato il ruolo del genotipo dei geni legati al drug-metabolism. Abbiamo poi caratterizzato i GIST primariamente resistenti: mentre per il trattamento dei GIST PDGFRA D842V esistono nuove formulazioni di TKI (eg.Crenolanib) che potrebbero superare la resistenza, per i GIST-WT non esistono alternative terapeutiche. Recentemente, i GIST-WT sono stati divisi in più sottogruppi, tra cui i quadrupli-WT sono i più scarsamente caratterizzati. Ci siamo focalizzati sull’analisi di questi casi, scoprendo diverse mutazioni oncogeniche rilevanti (MEN1, MAX, TP53, and FGF1R) e identificando un profilo di espressione tipico del lineage neurale-neuroendocrino. Questi dati suggeriscono che i quadrupli WT sono geneticamente simili ai tumori neuroendocrini, con i quali condividono la grossa variabilità di geni driver alterati, e supportano lo sviluppo di approcci terapeutici specifici per questo gruppo di GIST.
Gastrointestinal stromal tumors (GIST) are characterized by KIT or PDGFRA gain of function mutations, leading to constitutive activation of their signaling pathways. Nowadays, the activation of these two receptors represents the rationale of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) treatment of GIST, and their mutational status could be predictive of responsiveness. However, about 10-15% of GIST are primary resistant to TKIs, lacking mutations on these receptors (WT-GIST) or carrying a resistant mutation (eg. PDGFRA-D842V). Moreover, also secondary acquired mutations during disease progression could lead to resistance. Patients’ prolonged life expectancy associated with the complex biology involved in progressive disease, led to a growing the urgency and interest in developing new strategies to overcome resistance. The aim of the present thesis was to identify and characterize all the genomic alterations of GIST resistant to TKI, through Next Generation Sequencing (NGS). We analyzed the mutational landscape of secondary resistant KIT-mutated GIST, evaluating the potential of the acquired mutations as target of alternative drugs in the treatment of GIST, such as Palbociclib, hedgehog inhibitors and BYL719. DMD deletion was found recurrent in metastatic GIST. The role of genotype of drug-metabolism related genes was also considered. Then, we characterized primary resistant GIST: while new formulation of TKI (eg. Crenolanib) are available and could overcome PDGFRA D842V resistance, no other alternative therapies are available for WT-GIST. Recently, WT-GIST were divided in several subgroup, of which “quadruple WT” were the most molecularly unknown. So we concentrated on characterizing quadruple WT GIST, discovering relevant somatic oncogenic mutations (including MEN1, MAX, TP53, and FGF1R) and a peculiar overexpression of genes involved in neural and neuroendocrine lineage. These findings indicated that quadruple WT GIST have genetic similarity with neuroendocrine tumors, with whom they share also the great variability in oncogenic genes, and should promote the development of specific therapeutic approaches.

L evidenza che l attività tirosin-chinasica costitutiva dell oncoproteina BCR-ABL fosse responsabile della patogenesi della Leucemia Mieloide Cronica (LMC) ha portato allo sviluppo di Inibitori delle Tirosin-Chinasi (TKIs) in grado di inibire il funzionamento del dominio catalitico di BCR-ABL. Tuttavia, circa il 30% dei pazienti di LMC sviluppa resistenze al trattamento farmacologico, in alcuni casi dovute alla generazione di mutazioni puntiformi nel dominio tirosin-chinasico di BCR-ABL. Ad eccezione della mutazione T315I, che genera un oncoproteina resistente al trattamento con TKIs di prima e seconda generazione, quali Imatinib (IM) e Dasatinib (DAS), ma è sensibile all inibitore di terza generazione Ponatinib (PON), non sono mai state riportate sostituzioni amminoacidiche a livello dei quattro residui E286, M318, I360 e D381 che, insieme alla T315, sono responsabili delle interazioni con i TKIs mediante la formazione di legami a idrogeno. In questo progetto sono stati, quindi, valutati gli effetti di mutazioni conservative e non conservative a livello di questi quattro residui sull attività oncogenica di BCR-ABL. È stato osservato che, ad eccezione della mutazione conservativa I360T, qualunque sostituzione che coinvolga questi residui abolisce completamente l attività catalitica e la capacità trasformante dell oncoproteina. Inoltre, la ridotta attività chinasica di BCR-ABLI360T è soppressa da tutti gli inibitori attualmente disponibili. Mediante simulazioni di dinamica molecolare, sono state inoltre caratterizzate le interazioni fra IM, DAS e PON con i cinque residui di BCR-ABLI360T e BCR-ABLT315I con cui formano legami a idrogeno. È stato dimostrato che, la perdita del legame col residuo mutagenizzato T360 non influenza la sensibilità di BCR-ABLI360T al trattamento con i tre inibitori. Inoltre, sono state fornite ulteriori spiegazioni strutturali della diversa efficacia dei tre farmaci nel trattamento di BCR-ABLT315I. Infine, avendo osservato che i residui E286, M318, I360 e D381 sono conservati in diverse tirosin-chinasi umane, coinvolte nella patogenesi di alcuni tipi di tumori, questi risultati possono contribuire alla progettazione di nuovi inibitori contro queste chinasi, che possano prevenire lo sviluppo di resistenze dovute a mutazioni puntiformi.

Lo screening e la gestione clinica del carcinoma mammario si sono considerevolmente evoluti negli ultimi decenni. Purtuttavia, questa patologia tumorale costituisce a tutt’oggi una condizione potenzialmente letale, che rappresenta il 27% di tutti i tumori femminili, e una quota non trascurabile di casi progredisce o si presenta a stadi avanzati alla diagnosi. Circa il 75% dei carcinomi mammari metastatici sono ormono-dipendenti e possono essere trattati con la terapia endocrina ma la risposta al trattamento si riduce nel tempo a causa di fenomeni di resistenza al farmaco. Palbociclib, ribociclib e abemaciclib sono composti di una nuova classe di composti denominata inibitori di chinasi ciclina-dipendenti (CDKi), e sono somministrati in associazione alla terapia endocrina per il trattamento del carcinoma mammario localmente avanzato o metastatico ormono-dipendente (HR+) che non presentano recettori per il fattore di crescita dell’epidermide di tipo 2 (HER2-). La ristretta finestra terapeutica di questi farmaci e la variabilità inter-individuale nella farmacocinetica portano ad un profilo di tossicità non omogeneo nella popolazione trattata. In molti casi, l’insorgenza di reazioni avverse gravi comporta la necessità di ridurre la dose somministrata o di discontinuare la terapia. Per quanto riguarda la relazione tra esposizione al farmaco e la risposta terapeutica, sia per ribociclib che per abemaciclib, studi di farmacocinetica e farmacodinamica affermano che l’efficacia della terapia dipenda da un’esposizione sostenuta al farmaco, mentre per quanto riguarda il profilo di tollerabilità, è stato osservato che la tossicità ematologica derivante da palbociclib e ribociclib è correlata ai livelli di esposizione al farmaco. In letteratura inoltre è stata riportata una chiara relazione tra l’esposizione e l’efficacia terapeutica per il letrozolo, un farmaco antiormonale prescritto in associazione a palbociclib, ribociclib, and abemaciclib. Questi dati supportano l’ipotesi di una necessaria personalizzazione della dose per mezzo del monitoraggio terapeutico del farmaco (TDM) sia necessario ma per queste terapie attualmente non è stato ancora identificato un target farmacocinetico a cui fare riferimento, ad eccezione del letrozolo. Lo studio qui presentato ha avuto come obiettivo quello di sviluppare e validare metodi analitici basati sulla tecnica LC-MS da impiegare in studi sul TDM e nel suo impiego clinico. Secondariamente, si è considerato che il sistema di campionamento tradizionale impiegato nel TDM comporta un prelievo venoso, il che richiede l’intervento di personale sanitario per il campionamento e di tecnici ed adeguata strumentazione di laboratorio per il processamento e la conservazione del campione, nonché implica che il paziente debba recarsi presso una struttura sanitaria. Per ovviare a questi aspetti che rendono tale pratica costosa e difficilmente accessibile ai pazienti, si è analizzata la fattibilità di impiegare il TDM di questi farmaci su campioni di sangue essiccato (DBS). A questo scopo, sono stati raccolti, processati e quantificati sia campioni plasmatici che DBS da pazienti arruolate in un protocollo clinico dedicato. Dopo aver analizzato i DBS, diversi modelli di calcolo sono stati testati per tradurre il dato ottenuto dal DBS stesso in concentrazioni plasmatiche. A livello preliminare, è stato dimostrato che il DBS possa costituire un’alternativa alla matrice plasmatica per il TDM di palbociclib, ribociclib e letrozolo. In questo studio le evidenze a favore di un’elevata variabilità nell’esposizione al farmaco sono limitate a causa della ridotta numerosità del campione. Ciononostante, una quota considerevole di pazienti ha mostrato un’inadeguata esposizione a palbociclib, ribociclib, abemaciclib e letrozolo.
Breast cancer screening and management have had a great evolution in the past decades. Despite that, this tumor disease still remains a life-threatening condition, representing about 27% of all cancers in women, and a non-negligible percentage of cases progresses to or has an advanced stage at diagnosis. About 75% of metastatic breast cancers are hormone-dependent and can be treated with endocrine therapy but the response to treatment decreases over time due to drug resistance. Palbociclib, ribociclib, and abemaciclib are members of a novel family of compounds, named cyclin-dependent kinase inhibitors (CDKi), which are given in association to endocrine therapy to treat hormone receptor-positive (HR+), human epidermal growth factor 2 negative (HER2-) locally advanced or metastatic breast cancer. The narrow therapeutic window of these new drugs and the inter-patient variability in pharmacokinetics lead to a non-homogeneous toxicity profile in the treated population. In some cases, due to the occurrence of high-grade adverse reactions, dose reduction or therapy discontinuation are required. As regards exposure-response relationship for ribociclib and abemaciclib, pharmacokinetic-pharmacodynamic studies suggest that treatment efficacy relies on sustained drug plasma levels, while concerning treatment tolerability analyses, both palbociclib and ribociclib plasma exposure seem to be related to hematologic toxicity. Further, a clear relationship between drug exposure and efficacy is reported for letrozole, an anti-hormonal drug associated to palbociclib, ribociclib, and abemaciclib. These data support the necessity of dose personalization by means of therapeutic drug monitoring (TDM) but a pharmacokinetic target has not yet been identified, except for letrozole. The here presented study aimed to develop and validate LC-MS analytical methods to be employed in TDM studies and practice. Secondly, sample collection for TDM is traditionally based on a blood drawn, which requires healthcare personnel for sampling and technicians and laboratory tools for sample processing and storage, and therefore the patient to move to a health facility. To overcome these pitfalls, increase patient autonomy and reduce costs, the feasibility of performing TDM by dried blood spot (DBS) sampling was investigated. With this aim, both DBS and plasma samples from patients enrolled in a clinical protocol were collected, processed and quantified. After DBS analysis, different calculation protocols to translate DBS to plasma levels have been developed and applied to patients’ samples showing that DBS approach is a suitable alternative to plasma sampling for palbociclib, ribociclib, and letrozole TDM. Finally, in this study, the evidence in favor of a high inter-individual variability in drug exposure is limited by the low number of collected samples but these preliminary data showed that a non-negligible share of patients was not adequately exposed to palbociclib, ribociclib, abemaciclib, and letrozole.

The concept of "druggable genome" limits the molecular targets for which commercially viable compounds can be developed. In humans, whose genome accounts for about 30,000 genes, it has been calculated that a subset of no more than 3,000 genes express proteins able to bind drug-like molecules. This limit derives from the fact that the ability of a protein to bind a small molecule with the appropriate chemical properties does not necessarily make it a potential drug target, this latter feature being only applied to proteins that are also linked to disease. Among these, it has become evident that the proteins participating in intra- or intercellular communication represent the largest family with about 20-25% of the druggable genome consisting of kinases followed by G-protein coupled receptors (15%) and cation channels (5%), three of the fundamental groups of proteins implicated in signal transduction. For this reason, protein kinases have turned out to be one of the richest target mines, since drugs inhibiting specific kinases are in constant development, and some of them are currently investigated in clinical trials such as Gleevec and Iressa. Most of the structural information currently available about protein kinases is resulting from the continuously growing number of crystallographic structures solved. These studies suggest that the overall architecture of the kinases is quite similar, however, since the ATP-binding site possesses some distinct subsites, different kinases can be targeted by quite selective drugs. Two main objectives will be pursued: a) a search for new potent and selective inhibitors and b) an analysis of the interactions between kinases and related substrates. a) Our laboratory has a long-lasting expertise in targeting the human kinome, especially the protein kinase CK1, CK2 and Aurora-A, all implicated in carcinogenesis; we performed a new virtual screening approach searching for new potent and selective scaffolds against the three kinases. Virtual screening involves the rapid assessment of large libraries of chemical structures in order to guide the selection of potential drug candidates. The results obtained was really encouraging; in fact new good inhibitors for all the three kinases where obtained from the virtual screening strategy. b) The interaction of protein kinases with their substrates and/or effectors represents a key event in the overall picture of cellular regulation. In the case of CK2 more than 300 substrates have been identified the majority of which are phosphorylated both in vitro and in vivo. Our purpose is to highlight the molecular features underlying the interaction between CK2 and its peptides or protein substrates by using our protein-protein docking approach. Protein-protein docking is a computational tool for the prediction of three-dimensional structure of protein complexes from the coordinates of the component's structure.

La leucemia a cellule capellute è una sindrome linfoproliferativa rara caratterizzata dalla mutazione V600E del gene B-raf, il cui prodotto proteico sostiene il processo di leucemogenesi. La lesione genica è stabilmente riscontrata in tutte le fasi della malattia, comprese le successive ricadute, e differenzia la leucemia a cellule capellute da sindromi linfoproliferative croniche con un’espressione clinica simile, ove risulta assente. Il ruolo centrale giocato dalla proteina B-Raf nella patogenesi della malattia fa di essa un potenziale efficace bersaglio terapeutico. Il farmaco inibitore di B-Raf mutato, vemurafenib, è stato impiegato come agente singolo in pazienti con malattia ricaduta o refrattaria e pesantemente pretrattati con analoghi purinici (il gold standard del trattamento di prima linea), mostrando un tasso di risposta globale del 96%, con risposte complete nel 35% dei casi circa. Una terapia di combinazione di vemurafenib con rituximab incrementa l’efficacia degli agenti singoli nel medesimo contesto di pazienti, con risposte complete fino al 100% dei casi. La specificità della lesione genetica B-raf V600E la rende inoltre un marcatore di neoplasia attiva in tutte le fasi di malattia. È possibile dunque misurare il burden allelico di B-raf V600E alla diagnosi (a scopo di diagnostica differenziale), al termine di qualsiasi linea di trattamento (per stabilire la profondità della remissione clinica integrando i criteri di risposta attualmente vigenti) e nel follow-up per confermare la diagnosi di ricaduta o per seguire l’andamento della malattia nel tempo (su sangue periferico). Un saggio molecolare allestito su campioni di sangue periferico e midollare, con ricerca della mutazione B-raf V600E mediante droplet digital PCR, correla strettamente con i dati clinici ed emocromocitometrici del paziente in ciascuna fase di malattia.
Hairy cell leukemia (HCL) is a rare chronic lymphoproliferative disorder characterized by the V600E mutation of the B-raf gene, whose product is responsible of the leukemic transformation. This genetic lesion is invariably found at both disease diagnosis and relapse, and it helps distinguish HCL from other similar lymphoproliferative diseases in which the mutation is absent. Given the pivotal role of the B-Raf protein in the pathogenesis of HCL, this might appear as a suitable treatment target. Vemurafenib, a specific inhibitor of mutated B-Raf, has been tested in patients with HCL relapsed or refractory after previous treatment(s) with purine analogues (at present regarded as the front-line treatment standards): responses were seen in 96% of cases, with complete responses in 35% of treated patients. A combination of rituximab and vemurafenib was able to produce even higher response rates, with up to 100% of complete responses. The presence of the B-raf V600E mutation in HCL may also be regarded as a marker of disease activity. This means that the allelic burden of the mutation can be measured (in both peripheral blood and bone marrow) at disease onset, to rule out a differential diagnosis; at the end of any lines of treatment, thus integrating the histological criteria now applied to establish the depth of the response; and during follow-up, to confirm the response status or to early detect a disease relapse. A molecular assay based on droplet digital PCR analysis of the B-raf V600E mutation has been developed and directly correlates with clinical and hematological data of patients in each phase of the disease.

Gli enzimi coinvolti nel metabolismo del NAD(P) rappresentano interessanti target per la ricerca di farmaci antitubercolari. La fosforilazione diretta del NAD da parte della NAD chinasi è l’unica via ad oggi conosciuta per la produzione di NADP in cellule sia procariotiche che eucariotiche. La validità di questo enzima come target farmacologico è basata sulla sua essenzialità nella vitalità di Mycobacterium tuberculosis, e sulle differenti caratteristiche fra gli enzimi batterico e umano. Allo scopo di trovare un inibitore selettivo per la NAD chinasi di M. tuberculosis, sono state eseguite analisi strutturali di quest’enzima, per il design di analoghi modificati del NAD e del poli(P). Gli analoghi dinucleoside disolfuro del NAD sono risultati inibitori innovativi selettivi per il sito attivo delle NAD chinasi. Gli analoghi dei dinucleotidi polifosfato invece, e del poli(P), hanno mostrato una debole selettività per la mtNADK in quanto, mentre l’enzima umano è strettamente ATP-dipendente, quello micobatterico è in grado di utilizzare anche il poli(P) come donatore di fosfato. Le differenze esistenti nel comportamento catalitico e nella specificità di substrato fra i due enzimi saranno sfruttate per l’identificazione di farmaci antitubercolari innovativi. Anche gli inibitori dell’enzima umano sono interessanti in quanto possono essere usati per ridurre l’apporto di NADPH esogeno durante stress ossidativo e in cellule tumorali. Recentemente, è stato proposto che le specie reattive all’ossigeno (ROS) derivanti dalla NADPH ossidasi svolgono un ruolo importante nell’angiogenesi fisiologica e patologica, rendendo quest’enzima un eccellente target per la terapia anticancro. La soppressione della NADPH ossidasi tramite l’inibizione della NAD chinasi potrebbe quindi mostrare effetti antitumorali. Infine è stata indagata l’esistenza di un altro gene umano codificante per una NAD chinasi. La proteina C5orf33, una putativa NAD chinasi, è stata clonata ed espressa in Escherichia coli e parzialmente purificata per indagarne l’attività chinasica.
Enzymes involved in NAD(P) metabolism are attractive targets for drug discovery against human diseases such as tuberculosis. NAD kinase catalyzes a phosphorylation of NAD using ATP or inorganic polyphosphates (poly(P)) as phosphoryl donors to give NADP. No other pathway of NADP biosynthesis has been found in the procariotic or eukaryotic cells. The validation of this enzyme as drug target is based on its essentiality in Mycobacterium tuberculosis, as well as on differential structural features between mycobacterial and human enzyme. In order to find a compound able to selectively inhibit the M. tuberculosis NAD kinase, structure-based analyses of this enzyme, resulted in the design of the several modified NAD and poly(P) analogues. We found that dinucleoside disulfide mimics of NAD analogues are novel selective inhibitors of NAD kinases that bind at the NAD-binding domain of NAD kinases, but do not affect the majority of other NAD-dependent enzymes such as NAD dehydrogenase. Instead, the dinucleotide polyphosphates and poly(P) analogs showed a weak selectivity against mtNAD kinase because, while the human enzyme is strictly ATP-dependent, the mycobacterial can use polyphosphates as phosphoryl donors. The differences existing in the catalytic behaviour or in the substrate specificity between the mycobacterial and human enzyme, will be exploited for future design of new potent and selective antitubercular drugs. Inhibitors of human enzyme are also of interest as they can be used to reduce the critical supply of exogenous NADPH during oxidative stress and in cancer cells. Recently, it was suggested that reactive oxygen species (ROS) derived from NADPH oxidase plays important roles in physiological and pathological angiogenesis making this enzyme an excellent target for anticancer therapy. The suppression of NADPH oxidase by inhibition of NAD kinase may show some anticancer effects. Finally, we search for another human NAD kinase gene. C5orf33, a putative NAD kinase, has been cloned and expressed in Escherichia Coli and partially purified to check the kinase activity.

Le infezioni fungine invasive rappresentano un'importante causa di morbilità e mortalità nei pazienti affetti da malattie linfoproliferative. Negli ultimi anni, l'introduzione di nuovi farmaci, in particolare gli inibitori della Bruton tirosin-chinasi (BTK), ha permesso di migliorare drasticamente la prognosi dei pazienti affetti da leucemia linfatica cronica (LLC) e da altri disordini clonali delle cellule B. Sebbene queste molecole fossero inizialmente considerate meno immunosoppressive rispetto alla classica chemio-immunoterapia, un numero crescente di segnalazioni hanno descritto l'insorgenza di infezioni fungine opportunistiche inattese, in particolare l'Aspergillosi invasiva, nei primi 6 mesi di trattamento. La BTK rappresenta una molecola cruciale nella trasmissione della cascata del segnale da diversi recettori, come i pathogen-associated molecular patterns (PAMP), cioè β-glucani, chitina e mannani, CD11b/CD18, triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) e Toll-like receptors (TLR), che permettono il riconoscimento dei funghi da parte del braccio innato dell'immunità. Tuttavia, i meccanismi immunopatogenetici alla base dello sviluppo di infezioni fungine invasive in pazienti trattati con inibitori della BTK non sono stati ancora completamente delucidati. Il nostro studio, basato su diversi saggi funzionali immunologici in vitro, mira a caratterizzare gli effetti specifici degli inibitori della BTK sulla risposta immunitaria innata contro i funghi mediata da neutrofili, monociti, macrofagi e piastrine, ottenuti da pazienti con linfomi a cellule B. L'inibizione farmacologica della BTK si è associata a una ridotta trasmissione delle vie di segnale attivate da Aspergillus fumigatus, determinante un difetto significativo nella secrezione di citochine infiammatorie nei neutrofili, nei macrofagi e nei monociti, isolati da pazienti e donatori sani. Nei neutrofili, l'inibizione della BTK ha ridotto in modo significativo l'attività fagocitaria (decremento medio del 51,6% e del 37,6% con due diversi farmaci inibitori della BTK). Allo stesso modo, si è riscontrata una notevole riduzione della funzione fagocitaria dei macrofagi associati alla LLC (dette nurse-like cells, NLC), così come dei monociti circolanti CD14+ (sia nei pazienti affetti da LLC che nei volontari sani). Concordemente, la secrezione di TNF-α da parte delle NLC, valutata con il saggio di secrezione citochinica (cytokine secretion assay, CSA), è stata fortemente indotta dalla stimolazione con i conidi di Aspergillus fumigatus, mentre è risultata notevolmente soppressa da due diversi inibitori della BTK. Inoltre, per la prima volta, abbiamo dimostrato che l'esposizione agli inibitori della BTK compromette diverse funzioni immunitarie delle piastrine, quali l'attivazione (come indicato dai bassi livelli di espressione della P-selectina), l'attività di uccisione diretta e la capacità di aderire ai conidi. Il test di danno ifale (hyphal damage test), eseguito su neutrofili, monociti, macrofagi e piastrine in presenza di inibizione farmacologica della BTK, ha documentato una notevole riduzione dell'attività litica antimicotica in tutti i suddetti tipi di cellule, sia nei pazienti che nei volontari sani. Nel complesso, questi effetti concorrono all’inefficacia nel contrastare completamente la germinazione dei conidi. I nostri risultati hanno rivelato specifiche modifiche nella risposta innata indotte dall'inibizione della BTK in pazienti con neoplasie delle cellule B, dimostrando il ruolo di questa chinasi come "guardiano" dell'immunità innata.
Invasive fungal diseases (IFDs) represent an important cause of morbidity and mortality in patients affected by lymphoproliferative diseases. In the recent years, the introduction of new drugs, in particular those targeting Bruton tyrosine kinase (BTK), has allowed dramatic improvement in the prognosis of patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) and other B-cell clonal disorders. Although these small molecules were initially considered less immunosuppressive than chemo-immunotherapy, an increasing number of reports have described the occurrence of unexpected opportunistic fungal infections, in particular invasive aspergillosis, in the first 6 months of treatment. BTK represents a crucial molecule in the transmission of signaling cascade from several immune receptors, such as pathogen-associated molecular patterns (PAMPs, i.e. β-glucans, chitin and mannans), CD11b/CD18, triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) and Toll-like receptors (TLRs), that allow the recognition of fungi by the innate arm of the immunity. However, the immunopathogenetic mechanisms underlying the development of IFDs in patients treated with BTK inhibitors are not fully elucidated, and multiple pathways might be involved. Our in vitro study, based on different immunological functional assays, aimed at characterize the specific off-target effects of BTK inhibitors on anti-mold innate immune response mediated by neutrophils, monocytes, macrophages, as well as platelets, obtained from patients with B-cell neoplasms. Pharmacological inhibition of BTK reduced signaling pathways activated by Aspergillus fumigatus, determining an exacerbation of an immunosuppressive signature and a significant defect in the secretion of inflammatory cytokines, either in neutrophils, macrophages and monocytes isolated from patients and healthy donors. In neutrophils, the inhibition of BTK significantly hampered the phagocytic activity (mean reduction of 51,6% and 37,6%, with two different BTK-inhibitors). Similarly, we found a remarkable reduction in the phagocytic function of CLL-associated macrophages (nurse-like cells, NLC), as well as of CD14+ circulating monocytes (either in CLL patients and healthy volunteers). Concordantly, secretion of TNF-α by NLC, assessed by cytokine secretion assay (CSA), was strongly induced by pulsing the cells with Aspergillus fumigatus conidia and was markedly reduced by two different drugs targeting BTK. Furthermore, we demonstrated, for the first time, that the exposure to BTK-inhibitors impairs several immune functions of platelets, i.e. activation (as indicated by the low levels of P-selectin expression), direct killing activity and ability to adhere to conidia. Hyphal damage test, performed on neutrophils, monocytes, macrophages and platelets in the presence of pharmacological BTK-inhibition, documented a striking reduction of the anti-hyphal lytic activity in all aforementioned cell types, either in patients and healthy volunteers. Overall, these effects concur to a failure in completely counteracting conidia germination. Our results revealed specific modifications in the innate response in patients with B-cell neoplasms induced by the inhibition of the BTK pathway, underlying the importance of this targetable kinase as a “guardian” of the innate immunity.

Protein kinase CK2, constituted by two catalytic (a and/or a’) and two regulatory (b) subunits, is a highly conserved kinase which phosphorylates a huge number of substrates and is involved in different cellular pathways and functions. It has a major anti-apoptotic role, it enhances the apoptosis resistance (MDR) phenotype, and it is abnormally expressed in a wide variety of cancers, where it operates as a “cancer driver” by creating a cellular environment favorable to the development, growth and propagation of malignancy. Since CK2 expression is not linked to a specific type of cancer, its targeting could be a successful strategy, because of its very general applicability and widespread effects. Importantly, tumor cells are more sensitive to CK2 inhibition than normal ones, probably because they rely more on CK2 for their survival, accordingly to the concept of cancer addition to CK2 (Ruzzene and Pinna, 2010). Therefore, CK2 represents a suitable target for developing anticancer drugs. Different compounds have been developed so far as CK2 inhibitors, useful not only for investigating CK2 physiological functions, but also as possible therapeutic tools. The majority of them act targeting the ATP-binding site of CK2; some compounds have shown high potency and specificity toward the kinase, and have disclosed a proapoptotic effect in cancer cells more evident than in normal ones. The research presented in this thesis provides examples of different strategies to target protein kinase CK2, in order to selectively reduce its activity in tumor cells and to produce cellular effects which can counteract the malignant transformation. In particular, we used: 1) CX-4945 and CX-5011, ATP-competitive CK2 inhibitors (Pierre et al. 2011); 2) K137-E4, a bi-functional inhibitor designed to compete with both the ATP and the peptide binding sites of CK2; 3) a compound called CRIBI-300, derived from CIGB-300, designed to prevent the phosphorylation of specific CK2 substrates (Perea et al., 2004). The three studies are summarized below. A fourth study is also described, which exploited a compound, TBID, developed from a CK2 inhibitor but modified to become selective toward another protein kinase, HIPK2. Effects of the ATP-competitive CK2 inhibitors CX-4945 and CX-5011 in apoptosis-resistant cells CX-4945 and CX-5011 inhibitors (developed by Cylene Pharmaceuticals) act competing with ATP for the binding to the catalytic pocket of the CK2. These compounds are very potent and selective in inhibiting CK2 (Pierre at al., 2011; Battistutta et al., 2012): CX-4945, in particular, has shown good pharmacological features and has advanced in clinical trials with promising outcomes. However, the CX compounds had never been used in apoptosis-resistant cells. In this work we demonstrate that CX-4945 and CX-5011 are efficient in reducing endogenous CK2 activity and in inducing apoptosis in several pairs of apoptosis-sensitive and resistant tumor cell lines. Furthermore, we also observed that resistant cells which express the drug-extruding pump P-gp are sensitized by CX-4945 towards conventional antitumor drugs. In fact, we found that doxorubicin uptake in resistant cells is increased, and that combined treatment with CX-4945 and vinblastine produces synergistic effects on cell death. In summary, our data suggest that CX inhibitors can be considered as a valid therapeutic strategy also in case of pharmacological resistance. Effects of CK2 bi-functional inhibitors in tumor cells A very new strategy to target CK2 is based on compounds denoted as bi-functional or bi-substrate inhibitors, designed to hit both the ATP and the substrate sites of the kinase at the same time, in order to improve selectivity toward CK2. Among these compounds, K137-E4 has been recently developed in our laboratory and characterized by in vitro studies; it was found to strongly inhibit recombinant CK2 (IC50=0.025 uM) and to be very selective. In the study presented in this thesis, we had the aim of investigating the employment of this compound in cells. We first demonstrated that it is also able to inhibit the activity of native CK2 towards cellular substrates. However, this was performed by means of in vitro phosphorylation assay, while, when we used K137-E4 for cell treatment we did not observed any effect on CK2 activity and cell viability. We therefore supposed that the compound, quite hydrophilic, is not cell permeable. Studies are under investigation to modify the molecule structure in order to improve its cell permeability, without significantly decreasing its inhibitory capacity. At present, we found that the K137-E4 molecule, in virtue of its impossibility to cross plasma membrane, can be useful to study CK2 ecto-kinase, that portion of this enzyme that resides at the external surface of cells (Kubler et al., 1989). We demonstrated that it is able to inhibit CK2 ecto-kinase, but this has not effect on cell viability of tumor and non-tumor cells. This finding, in conjunction with the observation that CK2 ecto-kinase activity seems to be similar in tumor and not-tumor cells, suggests that CK2 ecto-kinase is not implied in cell survival and tumor-related events. In vitro and in cell effects of peptides targeting CK2 substrates A recently introduced approach to target CK2 is based on the development of a cyclic peptide called CIGB-300, which interferes with the phosphorylation site of specific CK2 substrates, rather than inhibiting the enzyme per se (Perea et al., 2004). CIGB-300 is already employed in clinical trials (Perea et al., 2011), however, its mechanism of action is only partially understood. We therefore exploited a new synthetized peptide, denoted as CRIBI-300, with the same functional domain of the parental CIGB-300, and we performed in vitro and in cell studies, comparing it with CIGB-300 and several other derivatives. We found that CK2 activity in vitro is affected by CRIBI-300 peptide, but with different effects accordingly to the type of substrate used: inhibition is observed only towards substrates which are strictly dependent on the presence of CK2 b for their phosphorylation by CK2, while the activity towards substrates which are preferentially phosphorylated by the CK2 monomeric a is rather stimulated by CRIBI-300. This suggests that CRIBI-300 could interfere with the CK2 holoenzyme structure, producing an unstable and/or unfunctional tetrameric conformation which prevents the phosphorylation of b-dependent substrates. When we performed cell treatment experiments, we also found that CRIBI-300 induces a strong reduction of endocellular CK2 activity, but this is accompanied by an early and rapid loss of CK2 protein amount. In parallel, cell death was also induced by CRIBI-300, but it was not due to apoptosis. Moreover, we observed a loss in the amount of also other proteins beside CK2; alteration in the activity of proteolytic systems occurs as well, with the activation of lysosomal proteases and the blockage of proteasome machinery. All the effects appear more evident in tumor than in non-tumor cells. We then analyzed the effects of CRIBI-300 derived peptides, with single aminoacid substitutions or large sequence differences. Interestingly, we found that the Tat sequence (the portion of CRIBI-300 introduced to render it cell permeable (Holm et al., 2006)) is essential for its activity towards CK2 in cells, but not sufficient per se, being specific aminoacids in the remaining part of CRIBI-300, crucial for producing effects. Of the many effects evoked by CRIBI-300, we wondered if and which ones are mediated by its action on CK2. We found that the reduction of CK2 expression (obtained by RNA-interference cellular experiments) also attenuates some of the CRIBI-300 effects, although not all. Moreover, those CRIBI-300 sequence alterations which prevent in vitro effects on CK2 are also able to reduce cellular effects. We therefore concluded that CK2 is indeed an early and important target of CRIBI-300. However, additional mechanisms of action of this compound should exist to explain all the observed effects, and this suggests that extreme caution is required for its employment at a clinical level. Effects of TBID inhibitor on cellular HIPK2 activity A collateral study presented in this thesis concerns a compound, TBID, derived from a CK2 inhibitor (TBI) but modified in structure to become selective for a different kinase, HIPK2 (homeodomain-interacting protein kinase 2), a Ser/Thr kinase controlling cell proliferation and survival (D’Orazi et al., 2012), whose investigation has been hampered by the lack of specific inhibitors able to dissect its cellular functions. TBID is an ATP-competitive inhibitor very potent towards HIPK2 in vitro (IC50= 0.33 μM) and very selective. Here we show that it is also cell permeable, being able to inhibit endocellular HIPK2 activity, and to reduce the phosphorylation state of a HIPK2 target, Ser46 of p53 protein. Since TBID is not cytotoxic under the conditions used to check its effects on cellular HIPK2 activity, we propose TBID as the only tool presently available to down regulate cellular HIPK2. Altogether, the results presented in this thesis demonstrate that kinase inhibition is an extremely versatile tool to be used in cells, exploitable either to investigate on the role of a specific kinase or to block an unwanted hyperactivity. In particular, in the case of CK2 inhibitors, we analyzed different strategies. Although for the moment the more effective and convincing one is still that represented by the classical ATP-site directed compounds, other approaches are also presented, which need further investigation but could be promising in term of improved specificity or more targeted effects.
La proteinchinasi CK2, costituita da due subunità catalitiche (a e/o a ') e due subunità regolatorie (b), è un enzima altamente conservato, che fosforila un gran numero di substrati ed è coinvolto in diverse vie di segnale e funzioni cellulari. CK2 svolge un importante ruolo anti-apoptotico, è coinvolta nel fenomeno della farmacoresistenza all’apoptosi, ed è altamente espressa in un'ampia varietà di tumori, dove opera come un "promotore cancerogeno" creando un ambiente cellulare favorevole alla sviluppo, alla crescita, e alla propagazione della malignità. Poiché la sua sovraespressione non è direttamente connessa ad uno specifico tipo di tumore, colpire CK2 può diventare un’ interessante strategia di successo data la sua generale applicabilità e suoi diffusi effetti. È importante sottolineare che le cellule tumorali sono più sensibili all'inibizione di CK2 rispetto a quelle normali, probabilmente perché sono più dipendenti da CK2 per la loro sopravvivenza, e questo va in accordo con il recente concetto di “cancer addiction” a CK2 (Ruzzene e Pinna, 2010). Pertanto, CK2 rappresenta un obiettivo adatto per lo sviluppo di farmaci antitumorali. Finora sono stati sviluppati diversi inibitori di CK2, utili non solo per indagare il suo ruolo fisiologico, ma sfruttati anche come possibili strumenti terapeutici. La maggior parte di questi composti agisce bloccando il sito di legame per l’ATP dell’enzima; alcuni di questi hanno dimostrato elevato potere inibitorio e specificità verso la chinasi, e si sono rivelati più efficaci nell’indurre apoptosi in cellule tumorali rispetto a quelle normali. La ricerca presentata in questa tesi fornisce esempi di diverse strategie di inibizione mirate a bloccare CK2, al fine di ridurre selettivamente la sua attività nelle cellule tumorali e di produrre effetti cellulari che possono contrastare la trasformazione maligna. In particolare, abbiamo utilizzato: 1) CX-4945 e CX-5011, inibitori di CK2 ATP- competitivi (Pierre et al., 2011); 2) K137-E4, un inibitore bifunzionale progettato per competere simultaneamente con ATP e con il sito di legame per il peptide substrato di CK2; 3) CRIBI-300, un composto derivato da CIGB-300, progettato per impedire la fosforilazione di substrati specifici da parte di CK2 (Perea et al., 2004). Questi tre argomenti di ricerca sono riassunti di seguito. Viene presentato anche un quarto studio che ha riguardato un composto, TBID, sviluppato partendo da un inibitore di CK2, modificandolo per renderlo selettivo nei confronti di un'altra proteinchinasi, HIPK2. Effetti degli inibitori di CK2 ATP-competitivi CX-4945 e CX-5011 in cellule resistenti all’apoptosi Gli inibitori CX-4945 e CX-5011 (sviluppati dalla Cylene Pharmaceuticals) agiscono competendo con l’ATP per il legame nella tasca catalitica di CK2. Questi composti sono molto potenti e selettivi nell’inibire CK2 (Pierre et al., 2011; Battistutta et al., 2012), il CX-4945 in particolare ha mostrato buone proprietà farmacologiche ed è in sperimentazione clinica nell’uomo con promettenti risultati. Tuttavia, i composti CX non sono mai stati utilizzati in cellule resistenti all’apoptosi. In questo lavoro dimostriamo come CX-4945 e CX-5011 siano efficaci nel ridurre l’attività endogena di CK2 e nell’indurre apoptosi in diverse linee cellulari tumorali sensibili e resistenti all’apoptosi. Abbiamo inoltre trovato che le cellule resistenti che esprimono una pompa di estrusione dei farmaci, la P-gp, vengono rese sensibili a farmaci antitumorali convenzionali grazie all’uso di CX-4945. Infatti abbiamo trovato che l’accumulo di doxorubicina viene incrementato in cellule resistenti e che il trattamento combinato con CX-4945 e vinblastina produce effetti sinergici sulla morte cellulare. Pertanto, i nostri dati suggeriscono che gli inibitori CX possono essere considerati come una valida strategia terapeutica anche nei casi di resistenza farmacologica. Effetti di inibitori di CK2 bifunzionali in cellule tumorali Una nuova strategia per inibire CK2 è basata su composti definiti come inibitori bifunzionali o bisubstrato, disegnati per legarsi contemporaneamente ai siti di legame per l’ATP e per il substrato di CK2, con lo scopo di aumentarne la selettività per CK2. Tra questi composti il K137-E4 è stato recentemente sviluppato e caratterizzato in vitro nel nostro laboratorio: è stato dimostrato che è molto potente nell’inibire la CK2 ricombinante (IC50 = 0,025 uM) e che ha buona selettività. Nello studio presentato in questa tesi, ci siamo proposti di analizzare la possibilità di utilizzo di questo composto anche in cellule. Innanzitutto abbiamo dimostrato che il K137-E4 è in grado di inibire l’attività di CK2 nativa nei confronti di substrati cellulari. Tuttavia, questo si riferisce ad esperimenti in vitro, mentre quando abbiamo trattato le cellule con il K137-E4 non abbiamo osservato alcun effetto né sull’attività di CK2 né sulla vitalità cellulare. Abbiamo pertanto ipotizzato che il composto, essendo piuttosto idrofilico, non fosse in grado di attraversare la membrana cellulare. Sono tuttora in corso modifiche strutturali della molecola mirate ad aumentarne la permeabilità cellulare senza diminuirne significativamente la sua capacità inibitoria. Ad oggi, abbiamo pensato che il K137-E4, in virtù della sua impossibilità di attraversare la membrana plasmatica, può essere utile per studiare l’attività ectochinasica di CK2, cioè di quella porzione di enzima che risiede sulla superficie esterna delle cellule (Kubler et al., 1989). Abbiamo infatti dimostrato che questo composto è capace di inibire CK2 ectochinasica, ma che ciò non ha alcun effetto sulla vitalità cellulare né di cellule tumorali né di cellule non tumorali. Questa scoperta, assieme all’osservazione che l’attività ectochinasica di CK2 sembra essere simile in cellule tumorali e non, suggerisce che la CK2 ectochinasica non è implicata nella sopravvivenza cellulare e negli eventi correlati alla tumorigenesi. Effetti in vitro e in cellule di peptidi mirati a legare substrati di CK2 Un nuovo approccio recentemente introdotto per colpire CK2 è basato sullo sviluppo di un peptide ciclico, chiamato CIGB-300, che interferisce con la fosforilazione di specifici substrati di CK2 piuttosto che inibire con l’enzima per se (Perea et al., 2004). CIGB-300 è già impiegato in studi clinici (Perea et al., 2011), tuttavia il suo meccanismo d’azione è solo parzialmente conosciuto. Abbiamo dunque sfruttato un nuovo peptide sintetico, chiamato CRIBI-300, con lo stesso dominio funzionale del CIGB-300, e abbiamo effettuato studi in vitro ed in cellule, comparandolo con il CIGB-300 e altri suoi derivati. Abbiamo scoperto che l’attività di CK2 in vitro può essere influenzata dal peptide CRIBI-300, ma con effetti differenti a seconda del tipo di substrato utilizzato: abbiamo osservato inibizione solo per quei substrati la cui fosforilazione da parte di CK2 è strettamente dipendente dalla presenza della subunità regolatoria b, mentre troviamo stimolazione da parte del CRIBI-300 nei confronti di substrati che sono fosforilati preferenzialmente dalla subunità catalitica a. Questi dati suggeriscono che il CRIBI-300 potrebbe interferire con la struttura dell’oloenzima CK2, dando luogo ad una conformazione tetramerica instabile e non funzionale e impedendo la fosforilazione di substrati b-dipendenti. Anche in esperimenti di trattamento cellulare, abbiamo trovato che CRIBI-300 induce una forte riduzione dell’attività cellulare di CK2, che è però accompagnata da una precoce e rapida perdita della quantità proteica di CK2. In parallelo, CRIBI-300 induce anche morte cellulare, ma non per apoptosi. Inoltre, abbiamo osservato diminuzione delle quantità di altre proteine, oltre a CK2, e un’alterazione dell’attività dei sistemi proteolitici con l’attivazione di proteasi lisosomiali e il blocco del proteasoma. Tutti questi effetti appaiono più evidenti in cellule tumorali che in cellule non tumorali. Abbiamo poi analizzato gli effetti di derivati peptidici del CRIBI-300, con sostituzioni di singoli aminoacidi o con sequenze diverse. E’ interessante il fatto che abbiamo trovato che la sequenza Tat (la porzione del CRIBI-300 introdotta per renderlo permeabile alla cellula (Holm et al., 2006)) è essenziale per la sua attività su CK2 in vitro e in cellula, ma non è sufficiente di per se dal momento che specifici amminoacidi nella parte funzionale del CRIBI-300 (la sequenza non corrispondente a Tat) risulta essere cruciale per produrre gli effetti. Dei molti effetti causati dal CRIBI-300, abbiamo cercato di capire quali fossero mediati dalla sua azione su CK2. Abbiamo trovato che la riduzione dell’espressione di CK2 (ottenuta mediante esperimenti di “RNA interference”) attenua alcuni degli effetti del CRIBI-300, sebbene non tutti. Inoltre, quelle modifiche della sequenza del CRIBI-300 che impediscono i suoi effetti in vitro su CK2 sono anche capaci di ridurne gli effetti a livello cellulare. Possiamo perciò concludere che CK2 è sicuramente uno dei più importanti bersagli di CRIBI-300. Tuttavia altri meccanismi d’azione di questo composto devono esistere per spiegarne tutti gli effetti osservati, e ciò suggerisce quindi che un’estrema cautela è richiesta per l’utilizzo di questo composto. Effetti dell’inibitore TBID sull’attivita’ cellulare di HIPK2 Uno studio collaterale presentato in questa tesi riguarda il composto TBID, che deriva da un inibitore di CK2, il TBI, ma che è stato modificato nella struttura per renderlo selettivo nei confronti di un’altra chinasi, HIPK2 (Homeodomain-interacting protein kinase 2), una Ser/Thr chinasi che controlla la proliferazione e sopravvivenza cellulare (D’Orazi et al., 2012) il cui studio è stato rallentato dalla mancanza di inibitori specifici capaci di svelarne le funzioni cellulari. TBID è un inibitore ATP-competitivo molto potente nei confronti di HIPK2 in vitro (IC50 = 0,33 uM) e molto selettivo. In questa tesi mostriamo che TBID è anche in grado di entrare nelle cellule, dimostrando che inibisce l’attività di HIPK2 intracellulare e riduce la fosforilazione della Ser46 di p53, un sito fosforilato da HIPK2. Dal momento che TBID non è citotossico nelle condizioni utilizzate per analizzarne gli effetti sull’attività di HIPK2 cellulare, proponiamo TBID come l’unico strumento attualmente disponibile per inibire HIPK2 in cellule. I risultati presentati in questa tesi dimostrano che l’inibizione di chinasi rappresenta uno strumento estremamente versatile per l’utilizzo nelle cellule, sia per analizzare il ruolo di una specifica chinasi, sia per bloccarne una non desiderata iperattività. In particolare, nel caso di inibitori di CK2 abbiamo analizzato diverse strategie. Sebbene al momento la più efficace e convincente rimanga quella rappresentata dai classici composti ATP-competitivi, abbiamo presentato altri approcci che, pur necessitando di ulteriori studi, potranno in futuro dimostrarsi promettenti in termini di aumentata specificità o di maggiore selettività degli effetti prodotti.

Il gene EGFR e' un marcatore molecolare fondamentale per determinare la sensibilita' o meno ai farmaci inibitori delle tirosin-chinasi (TKI) in pazienti affetti da adenocarcinoma polmonare. Lo scopo del lavoro e' di determinare se la percentuale di cellule neoplastiche mutate in EGFR correli con la risposta ai farmaci TKI. Sono stati analizzati 18 casi; di ogni caso e' stato analizzato il gene EGFR (esoni 18, 19, 20 e 21) mediante Next Generation Sequencing (NGS). La quantita' di cellule neoplastiche presenti nell'area analizzata e' stata valutata da un patologo, su un vetrino colorato con Ematossilina-Eosina, e tale quantita' e' stata normalizzata alla percentuale di alleli mutati rilevata mediante NGS. E' stata rilevata una correlazione fra la percentuale di cellule neoplastiche mutate in EGFR e la risposta ai TKI, ed e' stato osservato che pazienti con una percentuale di cellule neoplastiche mutate al di sopra del 56% presentano una migliore "overall survival" rispetto ai pazienti con una percentuale inferiore. I dati suggeriscono che, oltre al valore predittivo, la definizione della percentuale di cellule neoplastiche mutate in EGFR potrebbe avere un valore prognostico.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) ranks as the 4th/5th leading cause of cancer death worldwide. KRAS is mutated (mut) in 90% of human PDAC and results in the constitutive activation of multiple signaling cascades (MAPK, PI3K, NFκB, etc). Hitting a single point along the RAF/MEK/ERK cascade disrupts intra-pathway negative feedback loops, thereby causing paradoxical pathway activation and functional resistance. Thus, combining agents simultaneously inhibiting RAF and MEK represents a potential strategy to synergistically inhibit tumor growth and delay resistance. Molecular and functional effects of single and combined MEK (trametinib, T), BRAF (dabrafenib, D), and RAF (using the pan-RAF inhibitor RAF265, R) inhibition were dissected by WB and conservative isobologram analysis to assess functional synergism. In HPAFII cells (but not in the BRAF-mut M14 melanoma) D and R induced the formation of BRAF/CRAF complexes, as assessed by immunoprecipitation. In a panel of PDAC cell lines selective BRAF inhibition with D induced hyperphosphorylation of MEK, ERK, and p90RSK (paradox effect) and the combination of D+T suppressed cell growth with highly synergistic effects in 6/9 cell lines tested (CI 0.05-0.8); conversely, R did not induce paradox MAPK activation and did not result in growth inhibitory synergism when combined with T. Specific proteins and their phosphorylation states were also analyzed using Kinexus Antibody Microarray and preliminary results show that the different treatments cause upregulation of EGFR family, wnt/ß-catenin and c-KIT signaling, suggesting potential new strategies for both “horizontal” and “vertical” combinations of agents to achieve synergistic PDAC killing. Overall, our data indicate that, in appropriate cellular contexts,vertical RAF/MEK inhibition-based combination strategies exert highly synergistic antitumor effects.