Littérature scientifique sur le sujet « Histones méthyltransférase »

Le muscle strié squelettique adulte est composé de milliers de fibres (myofibres) capables de se contracter, permettant ainsi les mouvements volontaires. Après une lésion musculaire, les cellules souches musculaires localisées autour des myofibres s’activent, prolifèrent et se différencient pour former de nouvelles myofibres. Ces différentes étapes forment un processus appelé myogenèse. Cette dernière est rendue possible grâce à l’expression séquentielle de facteurs de transcription régulés par des facteurs épigénétiques qui agissent sur la chromatine afin de moduler l’expression génique et ainsi, le devenir de la cellule souche. Les histones méthyltransférases déposent des marques dites méthyl sur certaines histones afin d’induire la répression génique de régions spécifiques. Nous décrivons ici le rôle de SETDB1 au cours de la myogenèse adulte, et plus spécifiquement pendant la différenciation des cellules souches musculaires.

La réplication de l'ADN au cours de la phase S est initiée au niveau de sites spécifiques, appelés origines de réplication, qui sont distribués de manière adéquate le long des chromosomes et actifs une seule fois par cycle cellulaire. Les mécanismes qui contrôlent la position des origines de réplication restent énigmatiques chez les mammifères. Les travaux réalisés pendant cette thèse révèlent que la lysine méthyltransférase PR-Set7 humaine, responsable de la mono-méthylation de la lysine 20 de l'histone H4, induit un réarrangement chromatinien au niveau des nombreuses origines de réplication des gènes actifs. Celui-ci est caractérisé par la mono- et tri-méthylation de la lysine 20 de l'histone H4 et la tri-méthylation de la lysine 4 de l'histone H3. Ce profil de méthylation d'histones constituerait un signal épigénétique pour le recrutement sur la chromatine des facteurs nécessaires à la formation des origines de réplication, indépendamment d'un rôle sur la transcription. En effet, la présence d'une forme active de PR-Set7 en amont d'un gène rapporteur est suffisante pour induire cette cascade de méthylation et la formation d'une nouvelle origine de réplication au niveau de ce gène sans en modifier son expression. De la même manière, l'inactivation de l'enzyme dans une cellule conduit à l'inverse à une diminution du nombre total d'origines sans un effet majeur sur l'expression des gènes. Lors de la phase S, PR-Set7 est dégradée via le complexe E3 ligase CRL4Cdt2 et la protéine PCNA. Cette dégradation permet la disparition au niveau de la chromatine du signal de formation des origines, s'assurant ainsi qu'elles sont actives une seule fois par cycle. La mutation du domaine d'interaction avec PCNA est suffisante en effet pour empêcher la dégradation de PR-Set7, entraînant alors la formation et activation répétées des origines pendant la phase S (phénotype de sur-réplication). Ces résultats établissent la cascade de méthylation initiée par PR-Set7 pendant la mitose comme le mécanisme épigénétique contrôlant la mise en place et l'activation d'au moins la moitié des origines de réplication chez les mammifères
In order to ensure accurate inheritance of genetic information through cell proliferation, chromosomes must be precisely copied once and only once and then correctly distributed to daughter cells. Chromosome replication occurs during the S phase of the cell cycle and is initiated at discrete chromosomal sites called replication origins. However, the ability to activate replication origins occurs during mitosis of the previous cell cycle and continuing into early G1 phase. This crucial step, called DNA replication licensing, consists of the assembly of a multi-protein pre-Replicative Complex (pre-RC) onto origins, making them competent for replication. During S phase, pre-RC are inhibited by different ways, that ensures that origins are activated only once per cycle and prevents DNA rereplication (multiple initiations from the same origin). In metazoans, functional replication origins do not show defined DNA consensus sequences, thus evoking the involvement of chromatin determinants in the selection of these origins.During my thesis, I have discovered that that the onset of licensing in mammalian cells coincides with an increase in histone H4 Lysine 20 monomethylation (H4K20me1) at replication origins by the methyltransferase PR-Set7. By genome mapping of H4-20me1 signals during the cell cycle, we found that nearly half of origins that fire during S phase are associated with H4-K20me1 during mitosis, when the process of replication licensing is activated. This mitotic H4-K20me1 signature is highly significant for origins located near transcription start sites and promoters that are characterized by the presence of CpG islands and H3-K4me3 signals. Furthermore, tethering PR-Set7 methylase activity to an origin-free genomic locus is sufficient to promote a chromatin remodeling follow by a creation of a functional origin of replication and promotes replication initiation. PR-Set7 and H4K20me1 are cell-cycle regulated, with high levels during M and early G1 and very low in S phase. At the onset of S phase, PR-Set7 undergoes an ubiquitin-mediated proteolysis, which depends on its interaction with the sliding-clamp protein PCNA and involves the ubiquitin E3 ligase CRL4-Cdt2. Strikingly, expression of a PR-Set7 mutant insensitive to this degradation causes the maintenance of H4K20me1 and repeated DNA replication at origins. This photolytic regulation controls the initiation of replication origin.This suggests that a cascade of lysine methylation events, initiated by PR-Set7 during mitosis, would define the position of origins in open chromatin structures

La protéine CARM1 "Coactivator-Associated aRginine Methyltransferase 1" a été initialement identifiée pour sa fonction coactivatrice de la transcription impliquant différents récepteurs nucléaires des hormones. Cette voie d’activation de la transcription est un processus régulé par plusieurs étapes et différentes cascades de signalisation impliquant de nombreux corégulateurs. Dans ce contexte, deux cibles privilégiées ont été identifiées pour l'activité de méthylation de CARM1: l'histone H3 et la protéine CBP. CARM1 est également impliquée dans d’autres processus, comme la maturation des ARN et la transmission du signal cellulaire. Une dérégulation de ces différents processus pouvant induire certains cancers, CARM1 constitue une des nouvelles cibles potentielles en chimiothérapie. Les résultats obtenus durant cette thèse sont répartis en quatre chapitres. Le chapitre 3 présente les structures cristallographiques de domaines isolés de CARM1 résolues seules ou en complexe avec différents cofacteurs. Le chapitre 4 porte sur les études fonctionnelles en solution par la comparaison de différentes constructions et de mutants ponctuels. Ces études mettent en évidences des zones et des résidus cruciaux à l’activité de CARM1. Le chapitre 5 détaille l’étude des interactions entre CARM1 et différents substrats. Ceci a été fait par différentes approches : l’étude de protéines complètes (histone H3 et CBP), de fragments de ces protéines et une approche qui consiste à fixer de façon covalente des peptides de l’histone H3 à un complexe binaire CARM1-cofacteur. Le chapitre 6 porte sur la recherche d’inhibiteurs spécifiques de CARM1, travaux effectués dans le cadre de collaborations
The protein CARM1 "Coactivator-Associated aRginine Methyltransferase 1" was initially identified for its activity to coactivate transcription under the regulation of some nuclear receptors. This kind of activation process is regulated by a large number of coactivators involved at different stages. In this context, CARM1 was identified to methylates two major targets: histone H3 and CBP. CARM1 is also involved in other biological events like RNA processing and signal transmission. Disturbances of these different processes can induce cancers and CARM1 is by the way a new potential pharmacological target in chemotherapy. The results obtained during this thesis work are divided in four chapters. Chapter 3 presents the crystallographic structures of isolated domains of CARM1, alone or in complex with different cofactors. Chapter 4 describes the functional studies in solution by comparisons of different constructions and mutant forms. These studies highlight the crucial role of different areas and residues for the CARM1 activity. Chapter 5 details studies of interactions between CARM1 and selected target substrates (histone H3 and CBP). It has been done by three different approaches: interactions with full length proteins, fragments of these proteins and an approach consisting of covalently bind H3 peptides to a binary complex CARM1-cofactor. Chapter 6 presents a collaborative work done to discover CARM1 specific inhibitors

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le plus fréquent des cancers du foie et une importante cause de mortalité. Les modifications épigénétiques jouent un rôle essentiel dans ce cancer et sont des cibles thérapeutiques intéressantes. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à l‘histone méthyltransférase (HMT) EZH2, qui augmente dans le CHC et est liée à la résistance au traitement. En tant que sous-unité catalytique du complexe PRC2, EZH2 est responsable de la marque H3K27me3 et la répression de gènes (rôle canonique). Dans le cancer, EZH2 a d’autres fonctions indépendantes de PRC2 et peut contribuer à l’expression de gènes (rôle non canonique). Les inhibiteurs enzymatiques d’EZH2 ne sont pas efficaces sur les tumeurs solides, suggérant que l’activité non catalytique d’EZH2 joue un rôle dans ces cancers. EZH2 est régulé par des modifications post-traductionnelles, telle la O-GlcNAcylation par l’O-GlcNAc transférase (OGT) qui augmente dans le CHC. Nous avons montré que dans le CHC la fraction d’EZH2 associée à OGT est surtout impliquée dans l’expression de gènes. Notre but était de caractériser les mécanismes sous-tendant l’activation de gènes par EZH2/OGT et de déterminer le rôle du complexe PRC2 et c-Myc, qui peut être modulé par OGT et joue un rôle important dans le CHC, dans ces processus. Nous avons montré que EZH2 et c-Myc sont O-GlcNAcylés dans les cellules hépatocytaires et que l’O-GlcNAcylation de EZH2 est importante pour son recrutement aux gènes cibles. Nos données indiquent que c-Myc joue un rôle important dans la régulation de gènes par EZH2/OGT. De manière intéressante, nos résultats suggèrent qu’une partie des fonctions non canoniques d’EZH2 dans les cellules hépatocytaires humaines pourrait être dépendante du complexe PRC2. L’ensemble de nos résultats indiquent qu’OGT et c-Myc contribuent aux fonctions non canoniques d’EZH2 dans des cellules hépatocytaires humaines et apportent de nouvelles connaissances quant au potentiel des régulations épigénétiques comme cible thérapeutique dans le CHC. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires sous-tendant les dérégulations de gènes dans le CHC ouvrira des perspectives pour de nouvelles stratégies thérapeutiques
Hepatocellular carcinoma (HCC), the most common form of liver cancer and leading cause of death, is a heterogeneous disease with no unique driver mutation. Up to 50% of HCCs harbor alterations in epigenetic machineries that represent promising therapeutic targets. During my PhD, I focused on the histone methyltransferase (HMT) EZH2 that is upregulated in HCC and related to therapy resistance. EZH2 is the catalytic subunit of the PRC2 complex responsible for H3K27me3, a repressive epigenetic mark (canonical function). In cancer, EZH2/PRC2 represses the expression of tumor suppressor genes but EZH2 can also activate oncogenes and cell cycle genes in a mostly PRC2-independent manner (non-canonical function). EZH2 HMT inhibitors have demonstrated low efficacy in solid tumors suggesting that HMT independent functions of EZH2 are key in these cancers. EZH2 can be regulated by post-translational modifications, including O-GlcNAcylation by O-GlcNAc transferase (OGT) whose expression is increased in HCC. Our data show that EZH2 and OGT are co-recruited to defined gene promoters in HCC and predominantly promote gene expression. To decipher the molecular mechanisms underlying EZH2/OGT-mediated gene activation in HCC, we assessed the roles of PRC2 and c-Myc that plays an important role in HCC and can be modulated by OGT. We showed that EZH2 and c-Myc are O-GlcNAcylated by OGT in human hepatoma cells and that EZH2 O-GlcNAcylation plays a role in EZH2 target promoter recruitment. Our data also indicate that c-Myc plays an important role in EZH2/OGT-mediated gene regulation. Interestingly, our results suggest that part of the non-canonical functions of EZH2 in human hepatoma cells may be PRC2 dependent. Collectively, our data uncover that OGT and c-Myc promote non-canonical functions of EZH2 in transformed liver cells and provide important insights for epigenetic strategies as potential future anti-HCC therapies. A better understanding of the regulatory networks controlling gene expression in HCC will open perspectives for the design of novel therapeutic strategies for HCC

Les chondrosarcomes sont des tumeurs malignes osseuses, considérés comme radio- et chimio-résistants, du fait de leur environnement hypoxique. Dans ce contexte, cette étude vise à mieux comprendre le rôle de l’hypoxie dans la résistance de ces tumeurs à la chimiothérapie (cisplatine) et à la radiothérapie (rayons X) et à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de sensibiliser les chondrosarcomes aux traitements, par un ciblage épigénétique de la méthylation de la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27).Dans un premier temps, nous avons montré que, contrairement à ce qui est communément admis, l’hypoxie n’a pas d’effet sur la sensibilité au cisplatine ou aux rayons X dans certains chondrosarcomes alors qu’il augmente la résistance au cisplatine et la sensibilité aux rayons X uniquement dans une lignée de chondrosarcome. Dans un second temps, nous avons montré que le 3-deazaneplanocine A (DZNep) induit l’apoptose dans ces tumeurs, par un mécanisme indépendant de la méthylation de H3K27 et de sa méthylase EZH2 et semblerait agir par la voie Rhoβ/EGFR. Cependant, il provoque des effets secondaires sur la fertilité masculine. Par ailleurs, son association avec le cisplatine potentialise ses effets toxiques sur les chondrosarcomes. Le GSK-J4, quant à lui ralentit la croissance cellulaire des chondrosarcomes et son association avec le cisplatine augmente cet effet. Cette étude souligne que les chondrosarcomes possèdent des mécanismes de régulation cellulaires différents, d’où l’importance de mener des études sur plusieurs lignées cellulaires afin de mieux prédire la réponse aux traitements. De plus, ces travaux démontrent les propriétés anti-tumorales du DZNep et du GSK-J4 dans le traitement de ces tumeurs
Chondrosarcomas are bone malignant tumors, considered as radio- and chemo-resistant, due to their hypoxic environment. In this context, this study aimed to better understand the role of hypoxia in the resistance of these tumors to chemotherapy (cisplatin) and radiotherapy (X-rays) and to identify new therapeutic strategies to re-sensitize chondrosarcomas by epigenetic targeting of H3K27 methylation. First, we showed that, contrary to what is commonly accepted, hypoxia has differential effect on cisplatin or X-ray sensitivity in chondrosarcomas, while it increases cisplatin resistance and X-ray sensitivity only in one cell line. Secondly, 3-deazaneplanocin A (DZNep) induces apoptosis in these tumors by a mechanism independent of H3K27 methylation and its methylase EZH2 and seems to act through the Rhoβ / EGFR pathway. However, it causes side effects on male fertility. In addition, its association with cisplatin potentiates its toxic effects on chondrosarcomas. The GSK-J4, on the other hand, decreases cell growth and its association with cisplatin increases this effect.This study highlights that chondrosarcomas use different cellular regulation mechanisms, showing the importance of conducting studies on several cell lines in order to better predict the response to treatments. In addition, these studies demonstrate the anti-tumoral properties of DZNep and GSK-J4 in the treatment of these tumors

Les modifications post-traductionelles des histones contribuent à l’expression génique et à la stabilité du génome. La méthylation de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4me), une marque associée aux promoteurs de gènes transcrits, est déposé par les methyltransferases hautement conservées de la famille SET1, dans le contexte du complexe COMPASS. SET-2, l’homologue de SET1 chez Caenorhabditis elegans, est responsable de la déposition de H3K4me dans la lignée germinale, et son inactivation provoque une perte progressive de la fertilité. Le but de mon travail de thèse a été d’étudier comment SET-2 et la méthylation de H3K4 contribuent au maintien de la lignée germinale. J’ai montré que l’absence de SET-2 provoque une sensibilité accrue aux dommages à l’ADN. Cependant, les voies de signalisation et de réparation de ces dommages sont fonctionnelles dans le mutant set-2. Par séquençage de l’ADN, j’ai par ailleurs montré que la stérilité progressive observée en l’absence de set-2 n’est pas due à une capacité de réparation réduite. L’ensemble de mes résultats suggère que H3K4me pourrait agir en aval de la signalisation de dommages à l’ADN, en influençant l’organisation de la chromatine aux sites des cassures double brin. J’ai d’autre part mis en évidence une nouvelle fonction pour la méthylation de H3K4 dans l’organisation de la chromatine en montrant que set-2 interagit génétiquement avec le complexe Condensine II et la Topoisomérase II, facteurs clefs de l’organisation mitotique des chromosomes. Des expériences de microscopie par FLIM-FRET ont d’ailleurs validé une fonction de H3K4 méthylée dans l’organisation de la chromatine dans la lignée germinale. Enfin, j’ai montré par analyses transcriptomiques que la protéine CFP-1 du complexe COMPASS est impliquée dans la régulation du programme transcriptionnel de la lignée germinale et que cette fonction est indépendante de SET-2. L’ensemble de mes résultats montre comment la régulation chromatinienne impacte le maintien d’une lignée germinale fonctionnelle à plusieurs niveaux
Post-translational modifications of histones contribute to gene expression and genome stability. Methylation of lysine 4 of histone H3 (H3K4me), a mark associated with actively transcribed genes, is deposited by the highly conserved SET1 family methyltransferases acting in COMPASS related complexes. SET-2, the SET1 homologue in Caenorhabditis elegans, is responsible for the deposition of H3K4me in the germ line, and its inactivation causes progressive loss of fertility. The purpose of my PhD work was to study how SET-2 and the methylation of H3K4 contribute to the maintenance of the germ line. I have shown that the absence of SET-2 causes increased sensitivity to DNA damage. However, the DNA damage-induced signaling and repair pathways are functional in the set-2 mutant. By DNA sequencing, I have also shown that the progressive sterility observed in the absence of set-2 is not due to a reduced repair capacity. Together, my results suggest that H3K4 methylation may act downstream of DNA damage signaling, potentially by influencing the organization of chromatin at the sites of double-strand breaks. I have also described a new function for H3K4 methylation in the organization of chromatin by showing that set-2 genetically interacts with the Condensitin II complex and Topoisomerase II, key factors in mitotic chromosome organization. Moreover, FLIM-FRET microscopy experiments have validated a role for H3K4 methylation in germline chromatin organization. Finally, using transcriptomic analyses, I have described a function for CFP-1, a component of the COMPASS complex, in the regulation of the germline transcriptional program independent of SET-2. Altogether, my results show how chromatin regulation affects the maintenance of a functional germline through multiple mechanisms

Les mécanismes épigénétiques jouent un rôle essentiel dans la régulation de l’expression des gènes. L’enzyme du complexe répresseur Polycomb II EZH2, capable de triméthyler la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27me3) est impliquée dans la régulation de nombreux processus normaux, tels que le développement et la différenciation cellulaire. Les plasmocytes jouent un rôle majeur dans la réponse immunitaire humorale. La différenciation des lymphocytes B en plasmocytes (PCD) est finement régulée par un réseau de facteurs de transcription impliqué de l’induction et le maintien de l’identité de ces deux types cellulaires. Par ailleurs, peu de mécanismes épigénétiques ont été décrits dans la PCD. En utilisant un modèle in vitro de PCD développé dans notre laboratoire, nous avons mis en évidence une surexpression d’EZH2 dans le stade préplasmablaste (prePB) de la PCD. Grâce à l’analyse globale des séquences d’ADN associées à EZH2 et H3K27me3 dans ce type cellulaire, nous avons montré que l’enzyme était capable de réprimer l’expression de gènes impliqués dans différentes fonctions des lymphocytes B et des plasmocytes. EZH2 est également capable de se fixer sur le promoteur de gènes actifs dans les prePB, impliqués dans la régulation de la prolifération de ces cellules. En outre, nous avons montré que l’inhibition chimique d’EZH2 dans notre modèle résultent en une dérégulation transcriptionnelle associée à une accélération du processus de différenciation. Nos résultats suggèrent qu’EZH2 est impliqué dans le maintien de l’état transitoire, immature et prolifératif des prePBs via la régulation de gènes, dépendante et indépendante de H3K27me3, favorisant l’amplification des cellules à défaut de leur différenciation en plasmocytes. Des anomalies de séquence ou de l’expression d’EZH2 ont été mis en évidence de nombreux cancers hématologiques et solides. Le myélome multiple (MM) est une hémopathie caractérisée par l’accumulation de plasmocytes tumoraux dans la moelle osseuse. Nos travaux ont notamment permis d’identifier une surexpression des membres du complexe Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) dans les cellules de MM, en association avec leur prolifération. Afin de comprendre le rôle de PRC2 dans le MM, nous avons utilisé un inhibiteur de l’activité méthyltransférase d’EZH2 (EPZ-6438). L’effet de l’inhibiteur d’EZH2 sur la prolifération et la survie des cellules de MM est très hétérogène. En effet, les cellules sensibles présentent un arrêt du cycle cellulaire et entrent en apoptose. De manière intéressante, la résistance des cellules de MM à l’inhibiteur d’EZH2 pourrait être médiée induite par la méthylation des promoteurs des gènes cibles de PRC2. Nous avons ainsi établi un score (EZ-score), basé sur l’expression des gènes, permettant d’identifier des patients de mauvais pronostic pouvant bénéficier d’un traitement avec un inhibiteur d’EZH2. Nous avons également mis en évidence un effet synergique de EPZ-6438 et du Lenalidomide, un agent immuno-modulateurs utilisé en traitement conventionnelle du MM. Cette inhibition de la croissance cellulaire est notamment due à l’induction de l’expression de facteurs de transcription, spécifiques des lymphocytes B, et des suppresseurs de tumeurs en association avec la répression de l’expression de MYC. Aussi, un prétraitement avec l’inhibiteur d’EZH2 permet de surmonter la résistance des cellules tumorales au Lenalidomide. Ces données suggèrent que le ciblage de PRC2 pourrait avoir un intérêt thérapeutique chez les patients caractérisés par un mauvais pronostic et un fort EZ-score. Ainsi, l’inhibiteur d’EZH2 pourrait également permettre de resensibiliser les patients aux chimiothérapies basées sur des agents immuno-modulateurs
Epigenetic mechanisms play an essential role in gene expression regulation. EZH2, the catalytic sub-unit of PRC2, is able to trimethylate the lysine 27 of histone H3 (H3K27me3) and is involved in the regulation of numerous normal processes, such as development and cell differentiation. Plasma cells (PCs) play a major role in the defense of the host organism against pathogens, by producing antigen-specific antibodies. B cell differentiation into PC is mediated by a fine-tuned regulatory network of cell specific transcription factors involved in B and plasma cell identity. Although numerous key actors involved in plasma cell differentiation (PCD) have been described, most of the epigenetic mechanisms associated with this process are yet to be unveiled. Using an in vitro model of PCD developed in our laboratory, we showed that EZH2 is upregulated in the preplasmablast stage (prePB) of the PCD. By analyzing DNA sequences associated with EZH2 and H3K27me3 in this cell type, we highlighted that EZH2 is recruited to and represses through H3K27me3 a subset of genes involved in B cell and plasma cell identity. Interestingly, in prePBs and PBs, EZH2 was also found to be recruited to H3K27me3-free promoters of transcriptionally active genes known to regulate cell proliferation and DNA repair. Inhibition of EZH2 catalytic activity resulted in B to PC transcriptional changes associated with PC maturation induction together with higher immunoglobulin secretion. Altogether, our data suggests that EZH2 is involved in the maintenance of prePBs/PBs transitory immature proliferative state through H3K27me3-dependent and independent gene regulation supporting their amplification. Moreover, while EZH2 overexpression was previously shown to inhibit PCD in mice, this study highlights for the first time that EZH2 inhibition can accelerate normal human PCD by prematurely inducing a plasma cell transcriptional program.EZH2 mutations or abnormal expression were shown to be involved in numerous hematological malignancies and solid tumors. Multiple Myeloma (MM) is a malignant plasma cell disease with a poor survival, characterized by the accumulation of myeloma cells (MMCs) within the bone marrow. We identified a significant upregulation of the Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) core genes in MM cells in association with proliferation. We used EPZ-6438, a specific small molecule inhibitor of EZH2 methyltransferase activity, to evaluate its effects on MM cells phenotype and gene expression profile. PRC2 targeting results in cell growth inhibition due to cell cycle arrest and apoptosis together with Polycomb, DNA methylation, TP53 and RB1 target genes induction. EZH2 inhibitor induced toxicity was heterogeneous in human myeloma cell lines and primary MM cells from patients. Interestingly, we found that MM cell resistance to EZH2 inhibitor could be mediated by DNA methylation of PRC2 target genes. We established a gene expression-based EZ-score allowing to identify poor prognosis patients that could benefit from EZH2 inhibitor treatment. We also demonstrated a synergistic effect of EPZ-6438 and Lenalidomide, a conventional drug used for MM treatment, through the activation of B cell transcription factors and tumor suppressor gene expression in concert with MYC repression. Moreover, EPZ-6438 pre-treatment was able to overcome MM cells resistance to lenalidomide. These data suggest that PRC2 targeting could have a therapeutic interest in MM patients characterized by high-risk EZ-score values, reactivating B cell transcription factors and tumor suppressor genes. EZH2 inhibitor could also re-sensitize MM patients to chemotherapies based on immunomodulatory agents

Le substrat réel des enzymes impliquées dans les phénomènes ayant trait à l'ADN (transcription, réparation, réplication. . . ) est en fait la chromatine. Les modifications post-traductionnelles des histones jouent donc un rôle majeur dans le contrôle du devenir cellulaire. Une des modifications les plus étudiées est l'acétylation des lysines. Elle est mise en place par les histones acétyl transférases et enlevée par les histones déacétylases. Cette thèse s'attache à étudier les histones déacétylases de classe I. Dans un premier temps en regardant la relation entre les histones déacétylases de classe I et l'histone métyl transférase Suv39H1 et dans un deuxième temps le rôle de HDAC3 lors de l'apoptose des cellules lymphocytaires T
Chromatin is the real substrate of enzymatic reactions which uses DNA as a substrate. Thus, post-translational modifications of nucleosomal histones play major roles in the control of cell fate. One of the best known histone modifications is lysine acetylation. It is catalysed by histone acetyl transferases and removed by histone déacétylases. In a first study, I investigated the functional relationship between class I histone déacétylases and Suv39H1, a histone H3 K9 methyltransferase. In a second study, I investigated the involvement of the histone déacétylase HDAC3 in apoptosis of T lymphocytes

SetD2 est une enzyme épigénétique jouant un rôle important dans l’hématopoïèse et reconnue comme l’unique triméthyltransférase de la lysine 36 de l’histone 3. La marque H3K36me3 permet de recruter des effecteurs ayant des rôles clés dans des processus variés tels que la réparation de l’ADN, la répression de la transcription cryptique et l’épissage alternatif. SETD2 fait partie des 50 gènes les plus mutés dans les cancers, en particulier les carcinomes rénaux à cellules claires et les leucémies. Néanmoins, très peu d’études cherchent à caractériser en détail l’impact réel de ces mutations sur l’activité, la structure et la fonction de SetD2. Par ailleurs, certaines tumeurs exprimant une forme sauvage de SetD2 arborent un faible niveau global de la marque H3K36me3, suggérant des mécanismes pathologiques de régulation de l’activité méthyltransférase de l’enzyme. Dans un premier temps, nous avons cherché à évaluer les effets des métabolites du benzène sur l’activité et la structure de SetD2. En effet, le benzène est un composé indispensable pour l’industrie chimique reconnu comme leucémogène avéré pour l’Homme. Son hématotoxicité est liée à sa métabolisation dans la moelle osseuse en des composés très réactifs comme la 1,4-benzoquinone (BQ) dont les effets génotoxiques sont documentés. Néanmoins, les mécanismes moléculaires de la toxicité du benzène sont à ce jour peu caractérisés. Nous avons mis en évidence que la BQ inhibait de manière irréversible l’activité méthyltransférase de SetD2. Des approches biochimiques nous ont permis de comprendre que cette inhibition était due à la formation d’adduits quinoniques sur les résidus cystéines des doigts de zinc de SetD2, ces derniers ayant un rôle structural et régulateur. Dans un contexte cellulaire, l’inhibition de l’activité de SetD2 par la BQ se traduit par une baisse globale de la marque H3K36me3 dans des lignées hématopoïétiques comme les cellules K562 ou HL60. La seconde partie de notre projet a porté sur la caractérisation des effets de la mutation Y1666C sur l’activité et la structure de SetD2. La position Y1666 de SetD2 est reconnue comme un hotspot de mutation dans les cancers. De plus, cette tyrosine très conservée des enzymes à domaine SET joue un rôle important dans la catalyse enzymatique. Nous avons montré que la mutation Y1666C abroge totalement l’activité enzymatique de SetD2, à la fois sur des substrats histones et non-histones, dans un contexte in vitro ainsi que dans un modèle cellulaire. Afin d’apporter des réponses structurales à notre études, nous avons déterminé la première structure de SetD2 mutée en complexe avec son cofacteur, la SAM. L’analyse de cette dernière nous a permis de mettre en évidence que la perte de l’activité de l’enzyme mutée était due à la chaîne latérale du résidu C1666. En effet, cette dernière se loge directement dans le site de fixation de la lysine méthylable, empêchant ainsi toute interaction entre l’enzyme et son substrat protéique. Ces travaux visent à améliorer la compréhension des mécanismes de l’oncogénèse induite par le benzène et par des mutations d’une enzyme épigénétique clé
SetD2 is an epigenetic enzyme that plays a significant role in hematopoiesis and is recognized as the only trimethyltransferase of lysine 36 of histone 3. The H3K36me3 mark allows the recruitment of effectors with key roles in various processes such as DNA repair, cryptic transcription repression and alternative splicing. SETD2 is one of the 50 most mutated genes in cancers, especially clear cell renal cell carcinomas and leukaemias. However, very few studies attempt to characterize in detail the real impact of these mutations on the activity, structure and function of SetD2. In addition, some tumors expressing a wild type SetD2 have a low overall level of H3K36me3, suggesting that the methyltransferase activity of the enzyme can be regulated by pathological mechanisms. First, we tried to evaluate the effects of benzene metabolites on the activity and structure of SetD2. Indeed, benzene is an essential compound for the chemical industry and is recognized as a class 1 leukemogen for humans. Its hematotoxicity is due to its metabolism in bone marrow into highly reactive compounds such as 1,4-benzoquinone (BQ), whose genotoxic effects have been documented. However, the molecular mechanisms of benzene toxicity are not well characterized. We have shown that BQ irreversibly inhibits the methyltransferase activity of SetD2. Biochemical approaches have allowed us to understand that this inhibition was due to the formation of quinonic adducts on the cystein residues of SetD2 zinc fingers, which have a structural and regulatory role. In a cellular context, inhibition of SetD2 activity by BQ results in an overall decrease in the H3K36me3 mark in hematopoietic cell lines such as K562 or HL60 cells. The second part of our project focused on characterizing the effects of the Y1666C mutation on the activity and structure of SetD2. The position Y1666 of SetD2 is recognized as a mutation hotspot in cancers. In addition, this highly conserved tyrosine of SET domain enzymes plays an important role in enzymatic catalysis. We have shown that the Y1666C mutation completely abrogates the enzymatic activity of SetD2, both on histone and non-histone substrates, in an in vitro context as well as in a cellular model. In order to provide structural answers to our studies, we have determined the first structure of SetD2 in complex with its cofactor, the SAM. The analysis of the structure allowed us to highlight that the loss of activity of the mutated enzyme was due to the lateral chain of the C1666 residue. Indeed, the latter is located directly into the binding site of methylatable lysine, thus preventing any interaction between the enzyme and its protein substrate. This work aims to improve the understanding of oncogenesis mechanisms induced by benzene or mutations of a key epigenetic enzyme

Dans les cellules eucaryotes l’organisation de l’ADN en chromatine n’assure pas seulement la compaction de l’ADN dans le noyau mais sert aussi de structure dynamique qui permet la régulation des processus pour lesquels l’ADN est une matrice comme la transcription, la réplication et la réparation de l’ADN. L’unité de base de la chromatine est le nucléosome qui est constitué de 147pb d’ADN qui s’enroule autour d’un octamère d’histones. Le nucléosome possède une structure flexible régulée par les modifications post-traductionnelles d’histones. Les modifications d’histones contribuent à la régulation des fonctions du génome en modérant directement la structure de la chromatine ou bien via le recrutement de protéines spécifiques liant la chromatine. La lysine 20 de l’histone H4 (H4K20) peut être modifiée pour générer 3 niveaux de méthylation : mono- (me1), di- (me2), et tri-méthylation (me3), chaque niveau de méthylation est associé à des fonctions spécifiques. PR-Set7 (aussi appelée Set8, Setd8 ou KMT5A) est l’unique enzyme connue pour catalyser la mono-méthylation H4K20 alors que les niveaux de di- et tri-méthylation sont le résultat de l’activité des enzymes Suv4-20h qui requièrent la mono-méthylation H4K20 induite par PR-Set7 comme substrat. Ces enzymes sont essentielles puisque des études de Knock-Out ont montré que PR-Set7 et les Suv4-20h sont requises pour le développement de la souris et que leur perte dans des modèles cellulaires entraine des dommages ADN et des défauts de cycle cellulaire. Toutefois, les fonctions des différents niveaux de méthylation et des enzymes associées restent peu claires. Le travail réalisé pendant cette thèse a révélé que l’action concertée des enzymes PR-Set7 et Suv4-20h est requise pour le contrôle (i) de l’assemblage de l’hétérochromatine sur l’ADN naissant, (ii) de la liaison du pre-RC sur un groupe d’origines de réplication tardives nécessaires pour la réplication de régions d’hétérochromatine dans le cycle cellulaire suivant. Les deux fonctions dépendent de la conversion de la mono-méthylation H4K20 en tri-méthylation H4K20 et du recrutement spécifique de la protéine liant la méthylation H4K20 ORCA/LRWD1. Ainsi, la déplétion de PR-Set7 par siRNA entraine des défauts de compaction de la chromatine en interphase des cellules qui sortent de mitose, ce qui favorise la fixation non spécifique des sous-unités MCMs et ORCs des complexes pre-RC. Finalement et étant donné le rôle clé de la méthylation H4K20 dans la formation de l’hétérochromatine et la réplication, mon travail de thèse a contribué à révéler que la surexpression de PR-Set7 est un facteur de mauvais pronostic dans le myélome multiple et que l’inhibition de cette enzyme par des composés chimiques pourrait dans le futur avoir un grand intérêt pour le traitement du cancer
In eukaryotic cells, the organization of DNA into chromatin not only ensures its compaction into nucleus, but also serves as a dynamic structure that offers a range of possibilities for regulating DNA transactions, such as transcription, DNA replication and repair. The basic unit of chromatin is the nucleosome, which is constituted of 147 bp of DNA wrapped with an octamer composed of histone proteins. This nucleosome structure is versatile showing distinct variations, including post-translational modifications of histone proteins. Histone modifications contribute to the regulation of genome functions by altering directly the nucleosome structure or through the recruitment of specific chromatin-binding proteins. In this regard, the lysine 20 of histone H4 (H4K20) can be modified to generate three different methylation states: mono- (me1), di- (me2), and trimethylation (me3), with a unique activity being coupled to the specific extent of methylation on this lysine residue. PR-Set7 (also known as SET8 or SETD8) is the sole enzyme that catalyzes H4K20me1, whereas H4K20me2 and H4K20me3 occur through the action of Suv4-20h, which requires PR-Set7-induced H4K20me1 as a substrate. These enzymes are essential since knockout studies have shown that both PR-Set7 and Suv4-20h are required for mouse development and their loss causes DNA damage and cell cycle defects. However, the functions of different H4K20 methylation states and the associated enzymes still remain poorly understood.The work carried out during this thesis reveals that the concerted activity of PR-Set7 and Suv4-20h is required for the timely control of (i) heterochromatin assembly on nascent DNA and (ii) the licensing of a critical subset of late-firing origins necessary for the replication of heterochromatin regions in the following cell cycle. Both functions depend on the conversion of H4K20me1 to H4K20me3 and the specific recruitment of the H4K20me-binding protein LRWD1/ORCA. Accordingly, siRNA-mediated PR-Set7 depletion triggers a defective interphase chromatin compaction in cells that exit of mitosis, which in turn favor a non-specific chromatin loading of ORC and MCMs subunits of pre-replication complexes. Finally and consistent with a key role of H4K20 methylation in heterochromatin formation and replication, my thesis work contributes to reveal that up-regulation of PR-Set7 is a poor prognosis factor in multiple myeloma and that its inhibition by specific chemical compounds might be a great interest for cancer treatment in near future