Thèses sur le sujet « Glicosiltransferasi »

Orientador: Yong Kun Park
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
Made available in DSpace on 2018-07-14T00:32:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sabioni_JoseGeraldo_D.pdf: 3233617 bytes, checksum: f2d7ad62d994826ba806053453d182f0 (MD5) Previous issue date: 1991
Resumo: Uma linhagem de Bacillus lentus, contendo alta atividade de ciclodextrina glicosiltransferase (E.C. 2.4.1.19) extracelular, foi obtida de uma coleção de microrganismos isolados de amostras de solos de Campinas (SP), usando-se um meio de cultivo alcalino, A enzima foi produzida cultivando-se o Bacillus lentus em meio líquido (pH 10,3) a 37°C por 4 dias, em aerobiose. A ciclodextrina glicosiltransferase foi purificada por fracionamento com sulfato de amônio, seguido de cromatografia em DEAE e CM-celulose. A enzima foi purificada 378 vezes. O pH ótimo da enzima purificada ficou entre 5,8 a 6,2 para a atividade dextrinisante, e entre 6,5 a 7,5 para a formação de cicladextrinas. A temperatura ótima para formação de ciclodextrinas situou-se entre 45 e 55°C. A enzima permanecia estável até 55°C por 30min de aquecimento em pH 7,5, e a estabilidade térmica era aumentada mediante a adição de 10mH de CaCl2 . O peso molecular foi estimado em 33.000, por filtração em gel SEPHABEX G-200. A análise das cicladentrinas por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE), mostrou uma proporção de 1:67:1,6 para a, ß e ý-ciclodextrina, respectivamente
Abstract: One strain of Bacillus lentus, having the highest extracellular cyclodextrin glycosyltransferase (E.G. 2.4.1.19) activity, was selected after a screening of microorganisms obtained from soil of the Campinas(SP) area, using alkalophilic culture medium. The enzyme was produced from Bacillus lentus in a liquid culture medium after 4 days at pH 10.3, at 37°C, under aeration. The extracellular cyclodextrin glycosyltransferase was purified through ammonium sulfate fractionation, followed by DEAE and CM cellulose column chromatography . A 378-fold purified enzyme was obtained . The optimum pH ranges for the purified enzyme were 5.8 to 6.2 and 6.5 to 7.5 considering dextrinizing activity and cyclodextrin formation, respectively. The optimum temperature range for the formation of cyclodextrin was from 45 to 55°C. The enzyme was stable for 30min. at 55°C at pH 7.5, and the stability was increased further by addition of 10mM CaCl2 . A molecular weight of 33.000 for the purified enzyme was obtained by Sephadex G-200 gel filtration. Analysis of cyclodextrins by High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC) showed the presence of a, ß and ý forms in the ratio 1:67:1.6.
Doutorado
Doutor em Ciência de Alimentos

Ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) é a enzima capaz de converter o amido e seus açúcares relacionados em ciclodextrinas (CDs) através da reação de ciclização. As CDs têm inúmeras aplicações na indústria farmacêutica, cosmética e de alimentos, devido à sua capacidade de encapsular moléculas hidrofóbicas dentro de sua cavidade. A CGTase de Thermoanaerobacter sp. é capaz de converter o amido em CDs sob condições de processo industrial, em temperaturas elevadas. A produção de CDs em escala industrial é feita, geralmente, em processos de batelada, nos quais é utilizada a enzima livre diretamente. No entanto, a imobilização da CGTase tem sido testada, com o propósito de permitir seu uso contínua e repetidamente, de modo a prevenir sua solubilização e promover uma forma molecular mais estável. Neste trabalho, buscouse imobilizá-la em microesferas de sílica-polietilenoglicol (sílica-PEG). O suporte foi silanizado com 3- aminopropiltrimetoxisilano (APTMS) e ativado com glutaraldeído para gerar condições de imobilização de enzimas, que foi realizada a 6ºC e pH 6, durante 15h. O rendimento de imobilização e a atividade recuperada foram 83% e 73%, respectivamente. Os resultados foram comparados com estudos anteriores sobre a imobilização covalente de CGTase. As propriedades enzimáticas da CGTase imobilizada foram investigadas e comparadas com as da enzima solúvel. CGTases solúveis e imobilizadas apresentaram valores similares de pH ótimo. Por outro lado, a temperatura ótima foi de 100ºC e 80ºC para as formas solúvel e imobilizada da enzima, respectivamente. Em comparação com a CGTase solúvel, a forma imobilizada apresentou maior Km (constante de Michaelis), menor Vmax (velocidade máxima de reação), a estabilidade de armazenamento diminuiu cerca de 15% e apenas um ligeiro decréscimo foi observado quando a estabilidade térmica estava sob avaliação. A estabilidade operacional foi medida em repetidos processos de batelada e a enzima imobilizada reteve cerca de 60% da atividade catalítica inicial, após 15 ciclos.
Cyclodextrin glicosyltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) is the enzyme able to convert starch and related sugars into cyclodextrins (CDs) via cyclization reaction. Cyclodextrins have numerous applications in the pharmaceutical, cosmetics, and food industry, because of their capacity to encapsulate hydrophobic molecules within their cavity. The CGTase from the Thermoanaerobacter sp. is able to degrade starch into CDs under industrial conditions (high temperature). For the industrial scale production of CDs, conventional batch production methods, which utilize soluble CGTase directly, have been mainly adopted. However the immobilization of CGTase has been pursued with the purpose of allow its reuse continuously and repeatedly by avoiding enzyme solubilization and promoting a more stable molecule form. In this research, Thermoanaerobacter CGTase was immobilized on silica-polyethyleneglycol (silica-PEG) microspheres. The support was silanized with 3- aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) and activated with glutaraldehyde to generate conditions for enzyme immobilization, which was carried out at 6ºC and pH 6, during 15h. The immobilization yield and recovery activity was around 83% and 73%, respectively. Results were compared with previous studies on covalent immobilization of CGTase. The enzymatic properties of immobilized CGTase were investigated and compared with those of the soluble enzyme. Soluble and immobilized CGTases showed similar values for optimum pH. On the other hand, the optimum temperature was 100ºC and 80ºC for the soluble and immobilized forms, respectively. In comparison with the soluble CGTase, the immobilized form exhibited higher Km (Michaelis constant), lower Vmax (maximal reaction rate), the storage stability was decreased about 15% and just a slight decrease was observed when thermal stability was under evaluation. The operational stability was evaluated in repeated batch process and the immobilized enzyme retained about 60% of the initial catalytic activity after 15 cycles.

A ciclodextrina glicosiltransferase (EC 2.4.1.19) é a única enzima capaz de converter amido e açúcares relacionados em ciclodextrinas através de reação de ciclização. Estes compostos podem formar complexos de inclusão com moléculas hidrofóbicas, tornando-se importante para aplicação nas indústrias alimentícias, farmacêuticas, agrícolas, químicas e de cosméticos. Um novo microorganismo produtor de CGTase foi encontrado entre bactérias isoladas do solo e foi identificado como Stenotrophomonas maltophilia. A enzima produzida por este microrganismo foi purificada em quatro etapas: precipitação por afinidade com amido, ultrafiltração, cromatografia de troca iônica e cromatografia de interação hidrofóbica. A CGTase assim purificada obteve, aproximadamente, atividade específica de 200.000 U/mg e fator de purificação de 2500. Com uma única banda, o peso molecular da enzima purificada foi estimado em 70kDa por SDS-PAGE. A temperatura ótima para atividade da enzima foi de 60 º C, enquanto que a atividade enzimática permaneceu praticamente estável entre pH 6 e 10, indicando natureza alcalotolerante. Km e Vmax para a enzima pura foram de 2,5 g/mL e 12,5 U/mg de proteína, respectivamente, usando amido solúvel como substrato.
Cyclodextrin glycosyltransferase (EC 2.4.1.19) is the unique enzyme able to convert starch and related sugars into cyclodextrins via cyclization reaction. These compounds can form inclusion complexes with hydrophobic molecules, becoming important for application in the food, pharmaceutical, agricultural, chemical and cosmetics industries. A new microorganism producing the CGTase was found among strains isolated from soil and identified as Stenotrophomonas maltophilia. The enzyme produced by this strain was purified by four steps: starch affinity precipitation, ultrafiltration, ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography. The CGTase thus obtaining specific activity 200,000 U.mg-1 and 2500-fold purification. With a single band, the molecular weight of the purified enzyme was estimated in 70kDa by SDS-PAGE. The optimum temperature for enzyme activity was 60ºC, whereas the enzyme activity remained almost stable between pH 6 to 10, indicating its alkalotolerant nature. Km e Vmax for the pure enzyme were 2.5 g/mL and 12.5 U/mg protein, respectively, using soluble starch as substrate.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-05-12T15:48:30Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ismail Es - 2015.pdf: 2836759 bytes, checksum: cf319655f2dc3d3d3163758c27aa8a40 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5)
Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-05-12T15:50:26Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ismail Es - 2015.pdf: 2836759 bytes, checksum: cf319655f2dc3d3d3163758c27aa8a40 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5)
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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
Production of a starch-degrading cyclodextrin glicosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) on solid-state culture and batch fermentation was evaluated by free and immobilized alkalophilic Bacillus sp on polymeric chitosan matrix. Immobilization procedure was performed by mixing bacterial cells with low molecular weight chitosan dissolved in HCl. Structure of free bacterial cell, polymeric chitosan matrix and immobilized cells were visualized by scanning electron microscopy (SEM). The images obtained from SEM showed that the procedure used for immobilization was easy, cheap and effective. Three different starch sources as substrate were used: potato, corn and cassava. Qualitative analysis of CGTase production was determined by colorless area formation on solid culture containing phenolphthalein. Enzymatic indices, which indicated the production of CGTase on solid culture, were calculated for both free and immobilized cells on different starch sources. Enzyme activity of CGTase was determined before and after each purification step: ammonium sulfate precipitation, starch adsorption and dialysis. Biomass growth and substrate consumption were analyzed by Flow cytometry and modified phenol-sulfuric acid assay, respectively. Free cells reached very high numbers (2.5 × 107 ml-1) during batch culture, besides; immobilized cells maintained initial inoculum concentration (2.5 × 105 ml-1) during enzyme production. The maximum enzyme activity achieved by free cells was 21.25 U (35 h), 14.65 U (40 h) and 19.16 U (33 h) on cassava, potato and cornstarch, respectively. During batch culture, immobilized cells produced CGTase with the enzyme activity of 24.375 U (16 h) for cassava, 24.375 U (9 h) for potato starch and 21.25 U (8.5 h) for cornstarch in a shorter cultivation time. Consequently, immobilization decreased the production time and increased enzyme activity of CGTase.
A produção e atividade enzimática da “Ciclodextrina glicosiltransferase” (CGTase, EC 2.4.1.19) em cultura sólida e fermentação por batelada por bactérias alcalifílicas livres e imobilizadas em matriz polimérica de quitosana foi avaliada. O procedimento de imobilização foi realizado através da mistura das células bacterianas com quitosana de baixa massa molecular dissolvida em HCl. A estrutura da célula bacteriana livre, a matriz polimérica de quitosana e as células imobilizadas foram visualizadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV). As imagens obtidas por MEV mostraram que o procedimento utilizado para a imobilização foi realizado com sucesso e pode ser considerado como um procedimento simples, barato, rápido e eficaz. Foram utilizados três diferentes fontes do amido como substrato: mandioca, batata e milho. A análise qualitativa da produção da CGTase foi determinada pela formação de área amarela em cultura sólida contendo fenolftaleína. Índices enzimáticos, que indicam a produção da CGTase pelas colônias bacterianas em cultura sólida, foram calculados para ambas as células livres e imobilizadas em diferentes fontes de amido. A atividade enzimática da CGTase foi determinada antes e depois de cada passo de purificação: precipitação com sulfato de amônio, adsorção no amido e diálise. O crescimento da biomassa e consumo do substrato foram analisados por citometria de fluxo e ensaio modificado de fenol - ácido sulfúrico, respectivamente. Células livres atingiram concentrações muito elevadas (2.5 × 107 ml-1) durante a fermentação por batelada, porém as células imobilizadas continuaram com a concentração do inóculo inicial (2.5 × 105 ml-1) durante a produção da enzima. A atividade máxima da enzima obtida por células livres foi 21.25 U (35 h), 14.65 U (40 h) e 19.16 U (33 h) utilizando amido de mandioca, batata e milho, respectivamente. Durante a fermentação batelada, as células imobilizadas produziram a CGTase com a atividade enzimática de 24.375 U (16 h) para a mandioca, 24.375 U (9 h) para fécula de batata e 21.25 U (8.5 h) para o amido de milho. Consequentemente, a imobilização diminuiu o tempo de produção e aumentou a atividade da CGTase.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T15:05:36Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Steffany Ferreira 2012.pdf: 970478 bytes, checksum: 8ca9a2d6fdbc3bdbf9c13613ab646b16 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5)
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O câncer de pele ou tumor cutâneo não-melanoma (TCNM), é a neoplasia maligna de maior incidência no Brasil. Os cânceres, em geral, apresentam padrão de glicosilação aberrante na estrutura de oligossacarídeos de superfície celular (fenótipo), determinada pela ação conjunta de glicosiltransferases (genótipo). O presente estudo objetiva avaliar o perfil glicofenotípico de glicoconjugados de superfície celular de TCNM e correlacionar com o padrão de expressão de sialiltransferases. Cortes (4μm) de biópsias de Carcinoma Basocelular (CBC), Carcinoma Espinocelular (CEC), Ceratose Actínica (CA) e Ceratoacantoma (KA) foram ensaiados com as lectinas SNA, Sambucus nigra agglutinin, (específica para ácidos siálicos ligados na posição α-2,6) e MAA, Maakia amurensis agglutinin (específica para ácidos siálicos na posição α-2,3). A inibição da ligação lectina-carboidrato foi realizada com o ácido siálico (300mM). As amostras também foram avaliadas com anticorpos monoclonais anti-ST3Gal I (específico para β-galactosideo α2,3 sialiltransferase) e anti- ST6Gal I (específico para β-galactosideo α2,6 sialiltransferase). Semelhanças no padrão de sialilação entre CEC, CA e KA foram encontradas na histoquímica com lectinas e, principalmente na imunohistoquímica. O CBC não apresentou marcação na maioria dos casos para ambas as técnicas, indicando que este tipo tumoral apresenta um padrão molecular próprio podendo estar associado ao seu comportamento biológico (baixo potencial invasivo e metastático). Os resultados indicam a importância da sialilação no desenvolvimento e manutenção de tumores cutâneos, sendo a histoquímica com lectinas e a imunohistoquímica ferramentas úteis na determinação deste tipo de glicosilação na superfície de células tumorais.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6472.pdf: 2357652 bytes, checksum: b48a2e541ddf343b775996e49d4e7f1f (MD5) Previous issue date: 2014-03-31
Financiadora de Estudos e Projetos
Cyclodextrins (CDs) are cyclic oligosaccharides that show the ability to encapsulate a large number of organic molecules at the molecular level. Thus, they have large application in pharmaceutical, food, and cosmetics industries. CDs may have different sizes; however the most common are formed by 6, 7, and 8 glucose units, called α, β and γ-CD, respectively. These compounds are produced from starch by hydrolysis catalyzed by cyclodextrin glycosyltransferase ( CGTase - EC 2.4.1.19 ) enzyme. CGTase is commonly produced from bacteria of the genus Bacillus and Klebsiella pneumoniae. Due to the commercial importance of this enzyme and of the microorganisms producing CGTase whose enzyme is capable to produce only one CD, this work aimed to evaluate the CGTase production by the bacterium Paenibacillus sp. F37. The experiments aimed to assess the potential for enzyme production by Paenibacillus sp. F37 strain and also the characterization and classification of the enzyme. Analysis of enzymatic activity was accomplished by cyclization activity of the supernatant of the culture medium, which was monitored by the production rate of β-CD at 50°C, pH 8.0 using a solution of dextrin as substrate. Initially it was evaluated the effect of the pH (6.0 to 10.0) over the microorganism growth into solid Horikoshi medium without starch. It was observed that the microorganism grew better at pH 8.0, being this pH adopted for assays using liquid Horikoshi medium without starch. In this step it was established the following conditions to the bacterium growth: 10h, 37oC, and agitation of 120 rpm in an incubator. The CGTase production step was performed into Horikoshi medium containing 1% (m/v) soluble starch (enzyme inducer), and pH and production time were evaluated. Under standard conditions (37oC, 120 rpm, 16h, and culture medium prepared in 0.1 M tris-HCl buffer pH 9.0) the volumetric activity from the culture medium achieved about 800 U/L, corresponding to a productivity of 50 U/L.h-1. The characterization of the crude enzyme showed that the CGTase from Paenibacillus sp. F37 strain has maximum cyclization activity around 50oC and pH 6.0. Under these conditions the enzyme showed to have a half-life time around 2 h. At the growth conditions (37oC, pH 9.0), the enzyme show to have a half-life time around 3h, being almost inactivated around 5h. Thus, the enzyme production in a medium where pH starts at 9.0 and is decreased to around 6.0 during the growth showed to be a good strategy to prevent denaturation of the enzyme. The CD production into batch reactor and their characterization by colorimetric and chromatographic methods allowed classifying the enzyme as a β-CGTase (ratio α-:β-:γ-CD of 0:1:0.26). At the CD-production conditions (50oC, pH 8.0, 50 g/L of dextrin, 1.6 U/g of dextrin, and 92 h) it was achieved β-CD productivity around 100 mg/L.h. These results showed that Paenibacillus sp. F37 strain is a promising microorganism for producing CGTase.
Ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos de grande importância comercial e que apresentam amplo emprego industrial nos setores farmacêutico, alimentício, de cosmético, dentre outros, por terem a capacidade de encapsulamento ao nível molecular de um grande número de moléculas orgânicas. CDs podem apresentar diversos tamanhos, sendo as que têm 6, 7 ou 8 unidades de glicose, denominadas α, β e γ-CD, respectivamente, são as mais conhecidas. Estas são obtidas a partir da hidrólise do amido pela ação da enzima ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase EC 2.4.1.19). A CGTase geralmente é produzida por bactérias do gênero Bacillus e Klebsiella pneumoniae. Levando em consideração a importância comercial desta enzima e a busca por microrganismos produtores de CGTase que produzam predominantemente uma CD de interesse, esse trabalho buscou avaliar a produção de CGTase a partir de Paenibacillus sp. F37. Os experimentos tiveram como objetivo a avaliação do potencial de produção da enzima por esse microrganismo, bem como a caracterização e a classificação da enzima. A análise de atividade enzimática foi realizada pela atividade de ciclização do sobrenadante do meio de cultivo, que foi monitorada pela taxa de produção de β−CD a 50°C, pH 8,0, usando uma solução de dextrina como substrato. Avaliou-se inicialmente a influência do pH (6,0 a 10,0) no crescimento do microrganismo em meio Horikoshi sólido, sem amido. Observou-se melhor crescimento em pH 8,0, definindo-se esse valor para ensaios de crescimento em meio Horikoshi líquido, sem amido. Nessa etapa definiram-se as condições de crescimento como 10 h, 37ºC e agitação de 120 rpm em câmara incubadora. A etapa de produção da CGTase foi realizada em meio Horikoshi com amido solúvel 1%, m/v (indutor da enzima), avaliando-se pH e tempo de cultivo. Sob condições padronizadas (37ºC, 120 rpm, 16 h e meio de produção preparado em tampão tris-HCl 0,1 M, pH 9,0) atingiu-se uma atividade volumétrica no meio de produção da ordem de 800 U/L, correspondendo a uma produtividade de aproximadamente 50 U/L.h-1. A caracterização da enzima bruta mostrou que a CGTase de Paenibacillus sp. F37 apresenta atividade máxima de ciclização em 50ºC, pH 6,0. Nessas condições a enzima apresentou meia-vida aproximada de 2 h. Nas condições de cultivo (37ºC, pH 9,0), a enzima apresentou baixa estabilidade, com meia-vida em torno de 3 h, sendo praticamente inativada em 5 h. Por isso, produzir a enzima em meio cujo pH inicial é 9,0 e esse reduz-se ao longo do cultivo para em torno de 6,0, mostrou-se uma boa estratégia para prevenir a desnaturação da enzima. A produção de CDs em reator batelada e a sua caracterização colorimétrica e por CLAE permitiram a classificação da enzima como uma β-CGTase (razão α-:β-:γ-CD de 0:1:0,26). Nas condições de produção de CDs (50ºC, pH 8,0, 50 g/L de dextrina, 1,6 U/g de dextrina e 92 h) atingiu-se uma produtividade de β-CD da ordem de 100 mg/L.h. Os resultados indicam, portanto, que Paenibacillus sp. F37 é um microrganismo promissor na produção de CGTase.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-10Bitstream added on 2014-06-13T20:35:51Z : No. of bitstreams: 1 blanco_kc_me_rcla.pdf: 835926 bytes, checksum: 46db69ad433dc1b354710697a08da977 (MD5)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Este trabalho tem como objetivo estudar a produção da enzima ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) empregando culturas de Bacillus sp subgrupo alcalophilus utilizando como fonte de carbono fécula de mandioca (polvilho) proveniente de uma fecularia de mandioca. Nos ensaios foram empregados Bacillus sp subgrupo alcalophilus, isolado de água residuária de uma fecularia de mandioca. Para avaliar a produção de CGTase mediante a atividade enzimática pelo Bacillus sp subgrupo alcalophilus foi utilizado um planejamento fatorial a dois (2) níveis, estudando como variáveis as concentrações da fonte de carbono (polvilho), de nitrogênio e de carbonato de sódio. Os experimentos foram realizados em Erlenmeyers de 300 mL de capacidade contendo 100 mL do meio de produção com pH inicial de 9,2, a 150 rpm e temperatura de 35 ± 1ºC durante 72 horas de fermentação. A produção de CGTase foi monitorada pela determinação da atividade enzimática (U/mL). Após os ensaios realizados em frascos foram realizados experimentos em biorreator de 5 L de volume útil, contendo 2 L do meio de produção, pH de 9,20, agitação de 150 rpm e temperatura de 35 ± 1ºC durante 72 h de fermentação, utilizando um planejamento fatorial a dois (2) níveis, estudando como variáveis as taxas de aeração e a velocidade de agitação. A otimização das concentrações da fonte de carbono, nitrogênio e carbonato de sódio foram obtidas a partir de um planejamento experimental composto central (PCC) e seus resultados analisados pelas superfícies de resposta. Os melhores resultados do planejamento encontrados no ponto central, corresponderam a 6,96 g/L da fonte de carbono, 8,07 g/L de nitrogênio e 9,45 g/L de carbonato de sódio. A maior produtividade obtida de CGTase após 72 horas de fermentação, foi 98,86 U/mL com valor teórico de 98,87 U/mL. A partir do melhor resultado obtido no PCC, determinou-se...
The aim of this study was to investigate the Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) enzyme production by Bacillus sp subgroup alcalophilus using cassava starch (manioc flour) as a carbon source. Bacillus sp subgroup alcalophilus was isolated from wastewater of cassava flour industry. To evaluate the assays results, two (2) levels of complete factorial experimental design was used, studying the variables: carbon source, nitrogen and sodium carbonate concentrations. The experiments were performed in 300 mL erlenmeyer flasks containing 100 mL of medium production with initial pH of 9.2, at 150 rpm and 35±1ºC, during 72 hour. CGTase production was monitored by measurements of enzymatic activity (U/mL). After the flasks experiments, assays was running in 5 L containing 2 L of medium production, pH 9.2, 35 ± 1ºC during 72-hours using a factorial design at two (2) levels for aeration and agitation rate. The optimization of carbon source, nitrogen and sodium carbonate concentrations was obtained by a central composite design and their results analyzed by surface response. The best results was located on the central point, 6.96 g/L of carbon source, 8.07 g/L of nitrogen and 9.45 g/L of sodium carbonate. The CGTase activity predicted by model was 98.86 U/mL and the experimental activity obtained was 98,87 U/mL. After the best results obtained by PCC, the conditions of aeration (vvm) and agitation (rpm) rates was determined in bioreactor using a complete factorial experimental design. The best conditions, of 2.18 vvm and agitation of 157.07 rpm gave a experimental predicted CGTase activity of 130.36 U/mL, which was very close to the theoric CGTase activity of 130.33 U/mL.

Resumo: Este trabalho tem como objetivo estudar a produção da enzima ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) empregando culturas de Bacillus sp subgrupo alcalophilus utilizando como fonte de carbono fécula de mandioca (polvilho) proveniente de uma fecularia de mandioca. Nos ensaios foram empregados Bacillus sp subgrupo alcalophilus, isolado de água residuária de uma fecularia de mandioca. Para avaliar a produção de CGTase mediante a atividade enzimática pelo Bacillus sp subgrupo alcalophilus foi utilizado um planejamento fatorial a dois (2) níveis, estudando como variáveis as concentrações da fonte de carbono (polvilho), de nitrogênio e de carbonato de sódio. Os experimentos foram realizados em Erlenmeyers de 300 mL de capacidade contendo 100 mL do meio de produção com pH inicial de 9,2, a 150 rpm e temperatura de 35 ± 1ºC durante 72 horas de fermentação. A produção de CGTase foi monitorada pela determinação da atividade enzimática (U/mL). Após os ensaios realizados em frascos foram realizados experimentos em biorreator de 5 L de volume útil, contendo 2 L do meio de produção, pH de 9,20, agitação de 150 rpm e temperatura de 35 ± 1ºC durante 72 h de fermentação, utilizando um planejamento fatorial a dois (2) níveis, estudando como variáveis as taxas de aeração e a velocidade de agitação. A otimização das concentrações da fonte de carbono, nitrogênio e carbonato de sódio foram obtidas a partir de um planejamento experimental composto central (PCC) e seus resultados analisados pelas superfícies de resposta. Os melhores resultados do planejamento encontrados no ponto central, corresponderam a 6,96 g/L da fonte de carbono, 8,07 g/L de nitrogênio e 9,45 g/L de carbonato de sódio. A maior produtividade obtida de CGTase após 72 horas de fermentação, foi 98,86 U/mL com valor teórico de 98,87 U/mL. A partir do melhor resultado obtido no PCC, determinou-se... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: The aim of this study was to investigate the Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) enzyme production by Bacillus sp subgroup alcalophilus using cassava starch (manioc flour) as a carbon source. Bacillus sp subgroup alcalophilus was isolated from wastewater of cassava flour industry. To evaluate the assays results, two (2) levels of complete factorial experimental design was used, studying the variables: carbon source, nitrogen and sodium carbonate concentrations. The experiments were performed in 300 mL erlenmeyer flasks containing 100 mL of medium production with initial pH of 9.2, at 150 rpm and 35±1ºC, during 72 hour. CGTase production was monitored by measurements of enzymatic activity (U/mL). After the flasks experiments, assays was running in 5 L containing 2 L of medium production, pH 9.2, 35 ± 1ºC during 72-hours using a factorial design at two (2) levels for aeration and agitation rate. The optimization of carbon source, nitrogen and sodium carbonate concentrations was obtained by a central composite design and their results analyzed by surface response. The best results was located on the central point, 6.96 g/L of carbon source, 8.07 g/L of nitrogen and 9.45 g/L of sodium carbonate. The CGTase activity predicted by model was 98.86 U/mL and the experimental activity obtained was 98,87 U/mL. After the best results obtained by PCC, the conditions of aeration (vvm) and agitation (rpm) rates was determined in bioreactor using a complete factorial experimental design. The best conditions, of 2.18 vvm and agitation of 157.07 rpm gave a experimental predicted CGTase activity of 130.36 U/mL, which was very close to the theoric CGTase activity of 130.33 U/mL.
Orientador: Antonio Carlos Simões Pião
Coorientador: Jonas Contiero
Banca: Heloiza Ferreira Alves do Prado
Banca: Sandra Regina Ceccato Antonini
Mestre

El objetivo de esta Tesis es el desarrollo de nuevas estrategias sintéticas para la síntesis de pirrolidinas y pirrolizidinas, aisladas de fuentes naturales, con actividad inhibidora de glicosidasas y glicosiltransferasas. En esta tesis se ha desarrollado una estrategia sintética estereoselectiva y versátil que ha permitido la síntesis de las broussonetinas C, D, M, O y P. Siendo el paso clave una reacción de metátesis cruzada entre un anillo de pirrolidina común a todas las broussonetinas sintetizadas, sintetizado a partir del aminoácido D-serina, y las diferentes cadenas laterales de cada una de las broussonetinas. Dicha reacción le confiere a la estrategia sintética una gran versatilidad. Dicha estrategia sintética se ha aplicado en la síntesis de otros alcaloides polihidroxilados inhibidores de glicosidasas, que son la radicamina B, la nectrisina y la hiacintacina A2. Dichos compuestos han sido sintetizados a partir de diversos intermedios en la síntesis del anillo pirrolidínico de las broussonetinas. Además se ha desarrollado una nueva estrategia sintética para la síntesis del alcaloide pirrolizidínico australina. Otro objetivo sintético en esta tesis ha sido la anhidrofitoesfingosina Jaspina B, sintetizada a partir del (R)-glicidol.

En aquesta tesi s'ha realitzat un estudi global, sobre les relacions seqüencia-estructura-funció de proteïnes glicosiltransferasa amb plegament GTA, mitjançant un enfocament bioinformàtic i de biologia computacional. La tesi està estructurada en quatre capítols principals. En els dos primers s'aborda aquest estudi per a un enzim essencial de Mycoplasma genitalium involucrada en la síntesi de glicolípids de membrana (MG517). En el tercer capítol s'estudien els canvis de conformació d'un bucle catalític, en el mecanisme d'una proteïna de Micobacterium tuberculosis (GpgS), que inicia la ruta biosintética dels lipopolisacáridos 6-O-metilglucosa (MGLPs) en aquest organisme. Finalment, en el capítol 4 s'aborda la relació entre una regió específica de les glicosiltransferasas amb plegament GTA, i l'especificitat pel substrat. Començant per l'estudi de proteïnes específiques, com la proteïna MG517 de Mycoplasma genitalium o GpgS de Micobacterium tuberculosi, passant pel de les estructures de totes les proteïnes cristal·litzades amb plegament GTA, fins a la utilització de totes les seqüències existents per aquesta superfamilia de proteïnes (més de 100000), s'han trobat característiques comunes a totes elles que relacionen la seqüència, amb l'estructura i la funció de cada proteïna. Tot això s'ha aconseguit utilitzant tècniques i mètodes bioinformàtics i computacionals, entre els quals destaquen: el modelatge per homologia, les simulacions de Dinàmica Molecular i Metadinámica, el Docking de ligandos, la superposició d'estructures tridimensionals, alineaments múltiples i la construcció d'arbres filogenètics. Gràcies a aquest estudi, s'ha pogut identificar una topologia consens comú a totes les GTAs, amb la qual s'ha construït un model tridimensional de la regió N-terminal de la proteïna MG517, de la qual fins ara no existia estructura coneguda. El model tridimensional ha estat validat per dinàmica molecular i experimentalment, la qual cosa ha permès identificar posicions catalítiques clau en MG517 com I193 base general, D40, I126, I169, I170 i I218 d'unió a substrats. A més, per a MG517 s'ha proposat un model d'interacció monotópica amb la membrana, mitjançant una hèlix amfipàtica a la seva regió C-terminal. La mateixa topologia consens, ha permès el refinament d'un alineament múltiple de GTAs, amb el qual s'ha generat un perfil Hidden Makov Model (HMM) per a la regió N-terminal d'aquest grup de proteïnes. Aquest perfil facilita l'alineament de noves proteïnes GTAs i la identificació de les seves estructures secundàries. També ha permès identificar, dins de la topologia consens, una regió de seqüència i estructura molt variable, fins i tot per a proteïnes de la mateixa família, on es posiciona l'acceptor específic de cada proteïna i que hem denominat “Regió Variable”. S'han descrit els canvis de conformació del bucle catalític en la proteïna GpgS mitjançant simulacions de dinàmica molecular de llarga durada i diferents càlculs de metadinámica utilitzant multitud de variables col·lectives. S'ha demostrat que les diferents conformacions són una propietat intrínseca de la proteïna, però estan desplaçades cap a la seva forma inactiva en absència de ligandos. La presència del substrat dador més el metall al centre actiu, promou el moviment de les cadenes laterals de dos residus del bucle, Arg256 i His258, que desplaça l'equilibri cap a la forma activa i l'estabilitza mitjançant la interacció de His258 amb el metall, proposant-se un mecanisme d'ajust induït per a aquesta proteïna. Completant aquests resultats amb càlculs de docking de ligandos, s'ha pogut proposar l'ordre d'entrada dels ligandos, sent l'acceptor el primer a arribar al centre actiu, seguit pel dador, moment en què succeeix el canvi conformacional en el bucle. Arran d'aquestes simulacions, s'ha observat que la interacció del metall amb un residu de histidina en el bucle catalític, és una característica comuna a la gran majoria de famílies GTAs, al costat de les ja conegudes del motiu DXD o la tètrada d'aspartats proposada en literatura D-DXD-D, que es proposa canviar a D-DXD-D-H. S'ha estudiat l'evolució de la superfamilia GTAs i la seva relació amb els substrats, trobant que el plegament global del domini GTA, defineix l'especificitat de l'acceptor i que l'homologia entre seqüències està més influïda per aquesta molècula aceptora del sucre que per la molècula dadora. La regió variable sembla sofrir una pressió evolutiva menor que la resta de la seqüència, la qual cosa explica la seva major variabilitat, no obstant això, conté residus altament conservats que interaccionen amb l'acceptor específic de cada proteïna. S'ha utilitzat aquesta regió per a la generació de perfils HMM específics per a cada acceptor i família de proteïnes. Aquests perfils s'han utilitzat amb èxit pel screening de proteïnes GTA de funció desconeguda i la predicció del seu acceptor.
En esta tesis se ha realizado un estudio global, acerca de las relaciones secuencia-estructura-función de proteínas glicosiltransferasa con plegamiento GTA, mediante un enfoque bioinformático y de biología computacional. La tesis está estructurada en cuatro capítulos principales. En los dos primeros se aborda este estudio para una enzima esencial de Mycoplasma genitalium involucrada en la síntesis de glicolípidos de membrana (MG517). En el tercer capítulo se estudian los cambios conformacionales de un bucle catalítico, en el mecanismo de una proteína de Micobacterium tuberculosis (GpgS), que inicia la ruta biosintética de los lipopolisacáridos 6-O-metilglucosa (MGLPs) en este organismo. Por último, en el capítulo 4 se aborda la relación entre una región específica de las glicosiltransferasas con plegamiento GTA, y la especificidad por el sustrato. Comenzando por el estudio de proteínas específicas, como la proteína MG517 de Mycoplasma genitalium o GpgS de Micobacterium tuberculosis, pasando por el de las estructuras de todas las proteínas cristalizadas con plegamiento GTA, hasta la utilización de todas las secuencias existentes para esta superfamilia de proteínas (más de 100000), se han encontrado características comunes a todas ellas que relacionan la secuencia, con la estructura y la función de cada proteína. Todo ello se ha conseguido utilizando técnicas y métodos bioinformáticos y computacionales, entre los que destacan: el modelado por homología, las simulaciones de Dinámica Molecular y Metadinámica, el Docking de ligandos, la superposición de estructuras tridimensionales, alineamientos múltiples y la construcción de árboles filogenéticos. Gracias a este estudio, se ha podido identificar una topología consenso común a todas las GTAs, con la que se ha construido un modelo tridimensional de la región N-terminal de la proteína MG517, de la que hasta ahora no existía estructura conocida. El modelo tridimensional ha sido validado por dinámica molecular y experimentalmente, lo cual ha permitido identificar posiciones catalíticas clave en MG517 como E193 base general, D40, Y126, Y169, I170 y Y218 de unión a sustratos. Además, para MG517 se ha propuesto un modelo de interacción monotópica con la membrana, mediante una hélice anfipática en su región C-terminal. La misma topología consenso, ha permitido el refinamiento de un alineamiento múltiple de GTAs, con el que se ha generado un perfil Hidden Makov Model (HMM) para la región N-terminal de este grupo de proteínas. Este perfil facilita el alineamiento de nuevas proteínas GTAs y la identificación de sus estructuras secundarias. También ha permitido identificar, dentro de la topología consenso, una región de secuencia y estructura muy variable, incluso para proteínas de la misma familia, donde se posiciona el aceptor específico de cada proteína y que hemos denominado “Región Variable”. Se han descrito los cambios conformacionales del bucle catalítico en la proteína GpgS mediante simulaciones de dinámica molecular de larga duración y distintos cálculos de metadinámica utilizando multitud de variables colectivas. Se ha demostrado que las distintas conformaciones son una propiedad intrínseca de la proteína, pero están desplazadas hacia su forma inactiva en ausencia de ligandos. La presencia del sustrato dador más el metal en el centro activo, promueve el movimiento de las cadenas laterales de dos residuos del bucle, Arg256 e His258, que desplaza el equilibrio hacia la forma activa y la estabiliza mediante la interacción de His258 con el metal, proponiéndose un mecanismo de ajuste inducido para esta proteína. Completando estos resultados con cálculos de docking de ligandos, se ha podido proponer el orden de entrada de los ligandos, siendo el aceptor el primero en llegar al centro activo, seguido por el dador, momento en que sucede el cambio conformacional en el bucle. A raíz de estas simulaciones, se ha observado que la interacción del metal con un residuo de histidina en el bucle catalítico, es una característica común a la gran mayoría de familias GTAs, junto a las ya conocidas del motivo DXD o la tétrada de aspartatos propuesta en literatura D-DXD-D, que se propone cambiar a D-DXD-D-H. Se ha estudiado la evolución de la superfamilia GTAs y su relación con los sustratos, encontrando que el plegamiento global del dominio GTA, define la especificidad del aceptor y que la homología entre secuencias está más influida por esta molécula aceptora del azúcar que por la molécula dadora. La región variable parece sufrir una presión evolutiva menor que el resto de la secuencia, lo que explica su mayor variabilidad, sin embargo, contiene residuos altamente conservados que interaccionan con el aceptor específico de cada proteína. Se ha utilizado esta región para la generación de perfiles HMM específicos para cada aceptor y familia de proteínas. Estos perfiles se han utilizado con éxito para el screening de proteínas GTA de función desconocida y la predicción de su aceptor.
This thesis has conducted a comprehensive study on the sequence-structure-function relations for glycosyltransferase proteins with GTA fold, through a bioinformatic computational biology approach and. The thesis is divided into four main chapters. In the first two, is approached this study by an essential enzyme in Mycoplasma genitalium involved in synthesis membrane glycolipids (MG517). In the third chapter, conformational changes of a catalytic loop are studied in the mechanism of a protein of Mycobacterium tuberculosis (GpgS), which starts the 6-O-methyl glucose biosynthetic pathway of lipopolysaccharide (MGLPs) in this organism. Finally, in chapter 4, the relationship between a specific region of the glycosyltransferase with GTA folding and substrate specificity is addressed. Starting with the study of specific proteins, such as Mycoplasma genitalium MG517 protein or Mycobacterium tuberculosis GpgS, through the structures of all proteins crystallized with GTA folding, and the use of all existing sequences for this protein superfamily (over 100000), it has found common characteristics to them all linking sequence, structure and function of each protein. All this, has been achieved using bioinformatics and computational techniques and methods, among which are: homology modeling, simulations of Molecular Dynamics and Metadinámica, the Docking of ligands, overlapping three-dimensional structures, multiple alignments and phylogenetic tree building. Thanks to this study, it has been possible to identify a consensus topology common to all GTAs, with which it has built a three-dimensional model of the N-terminus of the protein MG517, region which hitherto was known structure. The three-dimensional model has been validated experimentally by molecular and dynamic, which has identified key catalytic MG517 positions as general base E193, D40, Y126, Y169, Y218 I170 and substrate binding. Furthermore, for it has been proposed a MG517 monotopic membrane interaction model by an amphipathic helix in the C-terminal region. The same topology consensus has permitted the refinement of a multiple alignment of GTAs, with which we generate a profile Hidden Makov Model (HMM) for the N-terminal region of this group of proteins. This profile facilitates the alignment of GTAs new proteins and identifying their secondary structures. It has also enabled us to identify, within the consensus topology, a region of highly variable sequence and structure, even for proteins of the same family, where each protein specific acceptor is positioned that we have called "Variable Region". Have been described conformational changes in the catalytic loop GpgS protein, by long duration Molecular Dynamics simulations and different calculations of metadinámica using many collective variables. It has been shown that different conformations, are an intrinsic property of the protein, but are displaced towards its inactive form in the absence of ligands. The presence of the donor substrate plus metal in the active site, promotes the movement of the side chains of two residues of the loop, Arg256 and His258, which shifts the equilibrium to the active form and stabilizes by the interaction of His258 with metal, proposing an induced fit mechanism for this protein. Completing these results with docking of ligands calculations, it has been possible to propose the order of entry of the ligands, being the acceptor the first to reach the active site, followed by the donor, when that happens the conformation loop changes. Following these simulations, it has been observed that the interaction of the metal with a histidine residue in the catalytic loop, is a feature common to the vast majority of GTAs families, with the already known motif DXD or tetrad aspartates proposal in literature D-DXD-D, proposed switch to D-DXD-DH. We have studied the evolution of GTAs superfamily and their relationship with the substrates, finding that the overall folding of GTA domain, defines the acceptor specificity and the homology between sequences is more influenced by the acceptor molecule of sugar than the molecule donor. The variable region seems to suffer less evolutionary pressure than the rest of the sequence, which explains its greater variability, however, contain highly conserved residues that interact with the specific acceptor for each protein. This region has been used for profiling specific HMM for each acceptor and protein family. These profiles have been successfully used for screening GTA proteins of unknown function and predicting their acceptor.

Orientador: Yong Kun Park
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
Made available in DSpace on 2018-07-21T20:55:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Yim_DongKoo_D.pdf: 5152213 bytes, checksum: 276fa3043ee1083d8eaa29e758031249 (MD5) Previous issue date: 1996
Resumo: Quinhentos e sessenta linhagens de microrganismos foram isoladas de amostras de solo brasileiro em meio alcalofilico. Oito linhagens apresentaram alta atividade enzimática de CGTase. Dentre estas, uma linhagem identificada como Bacillus firmus n° 324 apresentou alta produtividade de cic10dextrina glicosiltransferase (E.C. 2.4.1.19). A produção ótima da enzima CGTase de Bacillus firmus n° 324 foi obtida em meio de cultura composto de 1 % de amido solúvel, 5 % de água de maceração de milho (AMM), 0,1 de % K2HPO4, 0,02 % de MgSO4 e 1% de CaCO3, a 40°C após 16 horas de fermentação. A CGTase foi purificada até homogeneidade através de ultrafiltração em membrana de 30.000 daltons, p-hidróximercuribenzoato, p-mercaptoetanol e N-bromosuccinimida não inibiram cromatografia em colunas de DEAE-Sephadex e DEAE-Sepharose CL-6B. A CGTase de Bacillus firmus n° 324 apresenta atividade ótima de formação de cic10dextrina a 65°C na faixa de pH 7,5-8,5. A enzima mostrou-se estável na faixa de pH 6,0-9,5 e a 55°C. Na presença de CaCl 1 mM a enzima permaneceu estável após 30 minutos de tratamento a 70°C. A atividade enzimática não foi afetada por MgSO4. e KCl porém foi fortemente inibida por HgCl e ZnSO4 na concentração 1 mM de sal em relação ao volume final da mistura de reação. Os reagentes EDTA, a atividade de CGTase na concentração de 5 mM em relação ao volume final da mistura de reação. o peso molecular da enzima foi estimado em 75.000 daltons através SDSP AGE electroforese. A CGTase produziu a, ß e y -ciclodextrinas a partir de amido na proporção de 1:11:5 respectivamente. O rendimento de a, ? e ?- ciclodextrina a partir de 5 % de amido solúvel foi 50 %. O rendimento de J3 e ß-ciclodextrina a partir de 5 % de amido solúvel foi de 32 e 15 %, respectivamente. Maltosil (a-l,6) a, ß e y-ciclodextrina foram sintetizadas a partir de maltose e , ß e y-ciclodextrinas, respectivamente, utilizando-se pululanase de Klebsiella sp (E.C. 3.2.1.41). Verificou-se que a puIulanase de Klebsiella sp. produziu 50,4 % de maltosil (a-l,6) a-ciclodextrina, 35 % de maltosil (a-l,6) y- ciclodextrina e 55,4 % de maltosil (a -l,6) y -ciclodextrina, após 24 horas de reação. O pH e temperatura ótima para a formação de maltosil (a -l,6) ß-ciclodextrina foram 5 e 50°C, respectivamente. Observou-se que a concentração total de substrato de 70 % e a proporção molar de 18,8 : 1 de maltose : ß-ciclodextrina foram as condições mais adequadas para a formação de maltosil (a-1,6) ß-ciclodextrina
Abstract: Five hundred and sixty strains of microorganisms were isolated from soil of Brazil using aIkalophilic culture medium. Eight strains of bacteria produced high activity of cyclodextrin glycosyltransferase (E.C. 2.4.1.19). One of these was classified as Bacillus firmus n° 324, and it demonstrated the highest CGTase activity. Highest yield of the enzyme of Bacillus firmus n° 324 was obtained by using the following medium 1 % soluble starch, 5 % com steep liquor(w/v), 0,1 % K2HPO4, 0,02 % MgSO4. 7H2O and 1 % Na2CO3 at 40° C for 16 hours incubation. The enzyme was purified to electrophoretical homogenity by ultrafiltration membrane, DEAE-Sephadex and DEAE-Sepharose CL-6B. The CGTase of Bacillus firmus n° 324 showed optimum activity for formation of cyclodextrins at 65°C and range at pH 7,5-8,5. The enzyme was stable in the range of pH 6,0-9,5 and at temperature 55°C, and at 70°C in the presence of CaCl (1 mM) after 30 min treatment. The enzyme activity was not affected by MgSO4 and KCl but it was strongly inhibited by HgCl and ZnSO4 in the final reaction concentration in 1 mM. A concentration of 5 mM of the EDTA, p-hydroxymercuribenzoate, (3mercaptoethanol and N-bromosuccinimide in the final reaction volume not inhibited the CGTase activity. The molecuIar weight of the purified enzyme was estimated to be 75.000 daltons by sodium dodecylsuIfate polyacrylamide gel electrophoresis. This enzyme produced a, 13 and y -cyclodextrin in the ratio 1: 11:5 respectively. The Yield of a , ß and y-cyclodextrin using 5 % starch solution(w/v) was 50 %. The Yield of ß and y-cyclodextrin were 32 and 15 % respectively. Maltosyl (a-l ,6) a- 13 and y-cyclodextrin was synthesized from maltose and a, 13 and ? -cyclodextrin, respectively, using KZebsiella sp. pullulanase.(EC 3.2.1.41). It was found that KZebsiella sp. pullulanase produced 50,4 % maltosyl (a-l,6) a -cyclodextrin, 35,0 % maltosyl (a-l,6) ß-cyclodextrin and 55,4 % maltosyl (a-l,6) y -cyclodextrin per ml of reaction mixture during 24 hours reaction. The optimum pH and temperature for formation of maltosyl (a-l,6) ß-cyclodextrin were 5 and 50°C respectively. It was observed that the total substrate concentration of 70 o/o{w/v) and maltose: ß-cyclodextrin molar ratio of 18,8:1 are the most suitable conditions for the formation of maltosyl (a-l,6) ß-cyclodextrin
Doutorado
Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Helia Harumi Sato
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
Made available in DSpace on 2018-08-12T20:00:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Contesini_FabianoJares_M.pdf: 1094439 bytes, checksum: 9f9e34abfc4a94978b97e21b2b7168c1 (MD5) Previous issue date: 2009
Resumo: A isomaltulose é um dissacarídeo redutor, isômero da sacarose, com propriedades interessantes para a indústria de alimentos. Este açúcar apresenta propriedades similares às da sacarose, entretanto, apresenta baixo potencial cariogênico e baixo índice glicêmico. A isomaltulose é produzida industrialmente através da conversão enzimática da sacarose pela enzima glicosiltransferase produzida por certas linhagens de bactérias, como Protoaminobacter rubrum e Erwinia rhapontici. Este trabalho teve por objetivo purificar e caracterizar a glicosiltransferase produzida pela Erwinia sp. D12 e imobilizar a glicosiltransferase bruta em Celite e pectina de baixo teor de metoxilas (BTM). A glicosiltransferase foi purificada por cromatografia em coluna de troca catiônica SP-Sepharose Fast Flow, obtendo-se duas frações com atividade de glicosiltransferase. A enzima da fração n° 17 foi purificada cerca de 17,9 vezes, e a massa molecular foi estimada em 65 kDa, por SDS-PAGE. A glicosiltransferase bruta e as frações purificadas apresentaram atividade ótima em pH de 6,0 a 6,5 e em temperatura de 30 a 35°C e estabilidade na faixa de pH de 5,0 a 7,0 e em temperaturas inferiores a 30°C, sendo que as frações purificadas apresentaram menor estabilidade. As condições ótimas de imobilização da glicosiltransferase bruta em Celite foram pH 4,0 para adsorção da enzima no suporte, e quantidade de enzima de 1700 U. A glicosiltransferase bruta imobilizada em Celite, em processo de batelada e em coluna de leito empacotado, converteu cerca de 50% de sacarose em isomaltulose, porém a conversão diminuiu com o tempo. O tratamento da glicosiltransferase imobilizada em Celite com 0,1% de glutaraldeído não resultou em aumento da retenção e estabilidade da enzima. A glicosiltransferase imobilizada em gel de pectina BTM com adição de gordura manteve maior atividade de glicosiltransferase que as preparações de enzima imobilizada sem gordura e liofilizadas. Quando essa preparação foi aplicada em processo de batelada foi observada conversão inicial em torno de 30% com queda gradativa nas posteriores bateladas. Em colunas de leito empacotado foi observada conversão de sacarose em isomaltulose máxima de 10,5% em 2 horas, sendo que após 60 horas foi igual a 3%
Abstract: Isomaltulose is a reducing disaccharide and an isomer of sucrose. Because of its properties it is interesting for application in the food industry. This sugar shows similar properties to sucrose, but it has low cariogenic potential and low glycemic index. Industrially, isomaltulose is produced by conversion of sucrose using glucosyltransferase. This enzyme is produced by few bacterial strains such as Protoaminobacter rubrum and Erwinia rhapontici. The aims of this research were the purification and characterization of glucosyltransferase produced by Erwinia sp. D12 and the immobilization of the crude enzyme in Celite and low-metoxyl pectin. The glucosyltransferase was purified using cationic exchange column of SPSepharose Fast Flow and it was obtained two fractions with glucosyltransferase activity. The enzyme found in 17th fraction was purified 17.9-fold, and showed a molecular mass of 65 kDa, by SDS-PAGE. The crude glucosyltransferase and the purified fractions showed optimum activity in pH of 6.0 ¿ 6.5 and 30 ¿ 35°C and stability in pH 5.0 to 7.0 and under 30°C, and the purified preparation was less stable than the crude enzyme. The optimum condition of the immobilization of crude glucosyltransferase was using pH 4.0 for the adsorption of the enzyme into the support, and amount of enzyme of 1700 U. The glucosyltransferase immobilized on Celite was applied to the conversion of sucrose into isomaltulose in a batch system and packed-bed reactor. A conversion rate of 50% was observed, but this decreased over a period of hours. The treatment of the immobilized glucosyltransferase on Celite, with 0.1% glutharaldehyde did not increase the stability of the enzyme. The immobilization of crude glucosyltransferase in lowmetoxyl pectin with a fat addition, presented a higher activity when compared to microcapsules without fat or freeze dried. When this preparation was applied to the conversion of sucrose into isomaltulose, in a batch system, it was observed an initial conversion rate of 30%. However this value decreased in further batches. In the packed-bed reactors, the highest conversion value of sucrose to isomaltulose was 10.5% in 2 hours, but after 60 hours the conversion was 3%
Mestrado
Bioquimica de Alimentos
Mestre em Engenharia de Alimentos

A ciclodextrina glucosiltransferase (CGTase) é uma enzima industrialmente muito importante, capaz de converter o amido em ciclodextrinas (CDs). As CDs são capazes de formar complexos de inclusão com uma grande gama de compostos orgânicos e inorgânicos, podendo mudar suas propriedades químicas e físicas, propriedades estas que lhes confere extensiva aplicabilidade na indústria de alimentos, farmacêutica, química, cosmética e agrícola. Atualmente, diversas CGTases já foram isoladas e caracterizadas a partir de vários microrganismos, principalmente Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Xanthomonas, Thermococcus, Vibrio, Geobacillus e Thermoanaerobacterium. Neste trabalho, demonstramos o primeiro relato envolvendo a clonagem e expressão heteróloga da CGTase de Stenotrophomonas maltophilia, microrganismo isolado do solo brasileiro. O gene codificador da CGTase de S. maltophilia, foi amplificado com êxito através da técnica de PCR, clonado no vetor pET-23a(+) e expresso em Escherichia coli BL21(DE3). As células recombinantes necessitaram de aproximadamente 4 horas de cultivo em meio Luria Bertani (LB) após a adição de 0,1 mM de IPTG para a expressão elevada da proteína alvo. Porém, a CGTase recombinante foi expressa sob forma de corpos de inclusão permanecendo na fração insolúvel, sendo necessário utilizar protocolos para solubilização, incluindo diferentes concentrações de uréia, mas a precipitação não foi eficaz. Embora tenha sido observada uma expressão elevada da proteína com cerca de 60 kDa em SDS-PAGE 12%, que correspondeu ao tamanho esperado da proteína, a forma ativa da enzima não foi obtida. Uma análise bioinformática foi realizada, onde foi observou-se uma proteína conhecida como uma importante possível facilitadora transmembrana (PMFTP – putative Major Facilitator Transmembrane Protein) que ancora o gene cgt. Proteína esta que pode ser utilizada em novos estudos a fim de desenvolver um novo e mais eficaz sistema para expressão da CGTase, podendo facilitar a sua expressão extracelular. Assim, mais estudos são necessários para desenvolver um sistema de co-expressão de rCGTase::PMFTP em E. coli e obter mais informações desta proteína de Stenotrophomonas maltophilia.
Cyclodextrin glucosyltransferase (CGTase) is an industrially important enzyme, capable to convert starch into cyclodextrins (CDs). The CDs are able to form inclusion complexes with a wide range of organic and inorganic compounds, which can change their chemical and physical properties, that gives them extensive applicability in the food, pharmaceutical, chemical, cosmetics and agricultural. Currently, many CGTases have been isolated and characterized from various microorganisms, particularly Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Xanthomonas, Thermococcus, Vibrio, Geobacillus and Thermoanaerobacterium. This work demonstrates the first report involving cloning and expression of heterologous CGTase from Stenotrophomonas maltophilia, microorganism isolated from Brazilian soil. The gene encoding the S. maltophilia CGTase, was successfully amplified by PCR, cloned into the vector pET-23a (+) and expressed in Escherichia coli BL21(DE3). Recombinant cells required about 4 h of cultivation in Luria Bertani (LB) after addition of 0.1 mM IPTG for high expression of the target protein. However, the CGTase was expressed recombinant form of inclusion bodies remaining in the insoluble fraction, being necessary use protocols for solubilization, including different concentrations of urea, but the precipitation was not effective. Although it was observed a high expression of the protein about 60 kDa on SDS-PAGE 12%, corresponding to the expected size of the protein, but the active form of the enzyme was not obtained. Bioinformatic analysis was performed and observed a Putative Major Facilitator Transmembrane Protein (PMFTP) harboring the cgt gene. This protein can be used in further studies to develop a new and more effective system for expression of the CGTase, which may facilitate its extracellular expression. Thus, more studies are needed to develop a system of co-expression of rCGTase::PMFTP in E. coli and acquire more information about this protein of Stenotrophomonas maltophilia.

Estudis previs basats en l’alineament de seqüències, la predicció d’estructures i la superposició d’estructures resoltes, han demostrat que les glicogen sintases (GSs) d’animals i fongs de la família 3 de les glicosiltransferases (GTs), i les GSs de bacteris i midó sintases de plantes, membres de la família 5 de les GTs, tenen en comú un conjunt de característiques estructurals que fan suposar que tots aquests enzims operen a través d’un mecanisme catalític molt similar. Mentre que el mecanisme de desplaçament directe proposat per a les GTs que operen amb inversió de configuració ha obtingut suport experimental i teòric, el mecanisme catalític de les GTs que operen amb retenció de configuració no està gens clar i, fins al moment, diferents autors han arribat a proposar diversos mecanismes diferents, però cap d’ells ha obtingut alhora suport experimental i teòric, quedant moltes qüestions pendents per resoldre. Per obtenir més informació referent al mecanisme catalític de les GTs que operen amb retenció de configuració, en aquesta tesi és van seguir dues estratègies. Primerament, a partir de la co-cristal•lització de l’enzim glicogen sintasa de Pyrococcus abyssi (PaGS) amb UDP-glucosa com a donador de glicosil, en absència de substrat acceptor, es va observar que l’enzim descomponia el substrat donador. En aquesta tesi es s’ha identificar el producte obtingut en el centre actiu que és una molècula de d’1,5-anhidro-D-arabino-hexa-1-enitol que tautomeritza cap a la forma més estable 1,5-anhidro-D-fructosa. Malauradament, no s’ha pogut demostrar la competència catalítica de la 1,5-anhidrofuctosa com a intermedi de la reacció de transferència glicosil catalitzada per PaGS (família GT-5) i la glicogenina de múscul de conill (GGN, família GT-8). Una de les estratègies utilitzades per poder trobar evidències sobre el mecanisme catalític dels enzims, es fer ús de compostos que puguin unir-se de manera no covalent als centres actius i a la vegada no siguin fàcilment degradables pels enzims. Per tal de poder obtenir estructures tridimensionals de complexes ternaris que ens permetin descriure la geometria del centre actiu en el procés catalític. Però actualment hi ha escassos inhibidors de glicosiltransferases que compleixin aquestes característiques. Per aquest motiu, en la segona estratègia d’aquesta tesi, es van estudiar compostos glicomimetics i pseudosucres com a plausibles inhibidors de GTs que operen amb retenció de configuració i, posteriorment, es van determinar els mecanismes cinètics d’inhibició. A més, estàvem especialment interessats en identificar inhibidors de dues glicosiltransferases: la glicogen sintasa i la glicogen fosforilasa de mamífer. S’ha descrit la glicogen sintasa com un enzim clau en certes malalties causades pel mal funcionament del metabolisme de glicogen i, en particular, en aquelles on es produeix una acumulació de glicogen aberrant en les neurones. D’altra banda, la glicogen fosforilasa també s’ha proposat com a enzim diana per combatre la diabetis mellitus no dependent d’insulina o tipus 2 (NIDDM). Per aquesta part de la tesi és va decidir treballar amb la glicogen fosforilasa de múscul de conill a (RMGPa, família GT-35) com a model de GT de tipus no-Leloir que utilitza glicogen com a substrat acceptor, la glicogen sintasa d’Escherichia coli (EcGS, família GT-5) com a model de GT tipus Leloir que també utilitza glicogen com a substrat acceptor i, finalment, la isoforma 4 de la sacarosa sintasa (SuSy 4) de Solanum Tuberosum L. (família GT-4) com un altre model de GT tipus Leloir que enlloc d’utilitzar un polímer com a substrat acceptor fa ús d’una molècula de fructosa, un monosacàrid, en la direcció de síntesi de sacarosa.

Orientador : Helia Harumi Sato
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
Made available in DSpace on 2018-07-18T18:31:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Uekane_ReginaTomie_M.pdf: 2302155 bytes, checksum: de9881c4403e45e6079af16fb6f676fd (MD5) Previous issue date: 1993
Resumo: Duzentas e cinqüenta e oito linhagens de microrganismos foram isoladas de amostras de melaço de cana-de-açúcar, frutas e flores, e testadas quanto a capacidade de converter a sacarose em palatinose. Entre estes microrganismos foi selecionada uma linhagem identificada como Klebsiella sp produtora de glicosiltransferase, que catalisa a conversão de sacarose em palatinose. Estudou-se a produção e a caracterização bioquímica de glicosiltransferase intracelular da linhagem de Klebsiella sp n° 18. A enzima foi purificada através de fracionamento com sulfato de amônio, cromatografia eln colunas de DEAE-Sephadex A-50 e CM-celulose. A glicosiltransferase apresentou atividade ótima a 35°C e na faixa de pH 6,0 a 6,6. O tratamento térmico da enzima purificada durante 1 hora a 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C resultaram em 5,3%, 10,5%, 13,2%, 15,8%, 18,4%, 31,6%, 92,1% e 100% de inativação.respectivamente. A conversão máxima de sacarose em palatinose foi 86% quando a enzima foi incubada em solução 4% de sacarose em tampão citrato-fosfato 0,05 M pH 6,5 durante 64 horas a 25°C. A atividade enzimática não foi afetada por CuS04, KCI, MgS04, FeCl3 e Pb(CH3COO)2. Os sais MnCI2, CaC12, ZnCI2, BaCl2 e CoCI2, inibiram fracamente a atividade de glicosiltransferase, porém, a enzima foi totalmente inibida por HgC12 e AgN03 na concentração 1 mM. A atividade enzimática foi inibida pelo reagente iodo na concentração 0,1; 1,0 e 10 mM, sugerindo que resíduos tirosina podem estar envolvidos na atividade de glicosiltransferase. Os reagentes p-cloromercuribenzoato e iodoacetamida na concentração 0,1, 1,0 e 10 mM, não inibiram a atividade enzimática. Os valores de Km e Vmáx da enzima purificada foram respectivamente 120 mM e 0,090 µmol de palatinosel minuto.mg de proteína para o substrato sacarose. O peso molecular da glicosiltransferase foi estimado em 74.000 daltons, através de filtração em gel Sephadex G-200
Abstract: Two hundred and fifty eight strains of microorganisms were isolated from sugar cane molasses, fruit and flower samples and examined for their capacity to convert sucrose in palatinose. From these microorganisms, one strain was selected and classified as Klebsiella sp. This bacteria produces the glucosyltransferase enzyme which catalyzes the conversion of sucrose to palatinose. The production and biochemical characterization of intracellular glucosyltransferase of the strain Klebsiella sp n° 18 were studied. The enzyme was purified by fiactionation with ammonium sulfate and DEAE-Sephadex A-50 and CM-cellulose column chromatographies. The glucosyltransferase has optimum activity at 35°C and pH 6. O - 6.6. The thermal treatment of the purified enzyme for one hour at 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C and 55°C resulted in 5.3%, 10.5%, 13.2%, 15.8%, 18.4%, 31.6%, 92.1 % and 100% inactivation, respectively. The maximum conversion of sucrose to palatinose was 86% when 4% sucrose solution in citrate-phosphate buffer pH 6,5 was incubated with the enzyme at 25°C for 64 hours. The enzyme activity was not affected by CuS04, MgS04, FeC13 and Pb(CH3COO)2. MnC12, CaC12, ZnC12, BaCl2 and CoC12 salts slightly inhibited the glucosyltransferase activity but, 1 mM of either HgC12 or AgN03 totally inhibited the enzyme. The enzymatic activity was inhibited by iodine reagent in the concentration of 0,1; 1,0 and 10 mM, suggesting that tyrosine groups nlay be involved in the glucosyltransferase activity. The p-chloromercuribenzoate and iodoacetamide reagents did not inhibit glucosyltransferase activity. The kinetic parameters Km and Vmax in relation to sucrose were 120 mM and 0.090 µmol of palatinose/ minute.mg protein, respectively. A molecular weight of 74,000 for the glucosyltransferase was estimated by Sephadex G-200 gel filtration
Mestrado
Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador : Helia Harumi Sato
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
Made available in DSpace on 2018-08-03T02:23:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kawaguti_HaroldoYukio_M.pdf: 6446983 bytes, checksum: 322c35268d98115fc5103122648c562d (MD5) Previous issue date: 2003
Resumo: Isomaltulose é um dissacarídeo redutor, de baixo potencial cariogênico, utilizado comercialmente na produção de doces, confeitos e chocolates. A isomaltulose é obtida por conversão enzimática da sacarose e apresenta menor velocidade de hidrólise e formação de monossacarídeos no organismo, quando comparada com a sacarose. A isomaltulose é utilizada na produção de isomalte, uma mistura de açúcar-álcool de baixo valor calórico e não cariogênico, obtido por hidrogenação e empregada na formulação de produtos dietéticos e farmacêuticos. Neste trabalho, foi estudada a otimização do meio de cultivo de Erwinia sp D12 para a produção de glicosiltransferase, em frascos sob agitação, utilizando-se metodologia de planejamento experimental e análise de superfície de resposta, testando-se os componentes melaço de cana, peptona bacteriológica (Biobrás) e extrato de levedura (Prodex Lac SD®). A maior produção de glicosiltransferase foi obtida em meio de cultivo 2 composto por melaço de cana (160 g/L), peptona bacteriológica (Biobrás) (20 g/L) e extrato de levedura (Prodex Lac SD®) (15 g/L). Na fermentação da linhagem de Erwinia sp D12, neste meio de cultivo otimizado, em frascos sob agitação a 200 rpm, foi obtida 7,26 UA/mL após 15 horas de fermentação a 30°C, sendo que o custo deste meio de cultivo foi estimado em R$ 7,06 por litro. No estudo de otimização do meio de cultivo de Erwinia sp D12 para a produção de glicosiltransferase, em frascos sob agitação a 200 rpm, utilizando-se metodologia de planejamento experimental e análise de superfície de resposta, testando-se os componentes melaço de cana, água de maceração de milho e extrato de levedura (Prodex Lac SD®), a maior produção de glicosiltransferase foi obtida em meio de cultivo 3 composto por melaço de cana (100 g/L), água de maceração de milho (60 g/L), extrato de levedura (Prodex Lac SD®) (8 g/L) e K2HPO4 (0,1 g/L). Na fermentação da linhagem de Erwinia sp D12, neste meio de cultivo otimizado, em frascos sob agitação, foi obtida 6,65 UA/mL após 15 horas de fermentação a 30°C, sendo que o custo deste meio de cultivo foi estimado em R$ 0,20 por litro. No estudo da relação entre o tempo de fermentação, crescimento do microrganismo, alteração do pH do meio de cultivo e produção de glicosiltransferase pela linhagem Erwinia sp D12, em meio de cultivo 2 otimizado composto por melaço de cana (160 g/L), peptona bacteriológica (Biobrás) (20 g/L) e extrato de levedura (Prodex Lac SD®) (15 g/L), em fermentador de 5 litros, nas temperaturas de 24°C, 26°C, 28°C e 30°C, com agitação de 200 rpm e aeração de 1 vvm, a maior atividade de glicosiltransferase foi 14,61 UA/mL de meio de cultivo após 10 horas de fermentação, a 26°C. No estudo da conversão de sacarose em isomaltulose utilizando-se enzima livre, células livres e células imobilizadas em alginato de cálcio, de Erwinia sp D12, em processo em batelada, foram obtidas maiores taxas de conversão utilizando-se células livres e células imobilizadas. No estudo da imobilização de células de Erwinia sp D12, em alginato de cálcio, verificou-se que a solução 1,0% de alginato de sódio da marca Sigma, de alta viscosidade, pode ser substituído por solução 2,0% de alginato de sódio da marca Synth, de menor custo. Utilizando-se suspensão 40,0% (massa celular úmida/volume) de células de Erwinia sp D12 e solução 2,0% de alginato de sódio da marca Synth, para a imobilização de células, foi obtida 74,18% de conversão da sacarose em isomaltulose após 24 horas de reação, a 30°C
Abstract: Isomaltulose is a reducing disaccharide, of low cariogenic potential, used commercially in the production of candies and chocolates. Isomaltulose is produced by enzymatic conversion of sucrose and presents lower hydrolysis and monosaccharides formation in the organism, when compared with sucrose. Isomaltulose is used in the production of isomalte, a sugar-alcohol mixture of low caloric value that is not cariogenic and find application in to dietetics and pharmaceutical products. The optimization of culture medium for the production of glucosyltransferase by Erwinia sp D12, in shake flasks, was studied using experimental design methodology and surface response analysis. The medium components tested were sugar cane molasses, bacteriological peptone and yeast extract. The highest glucosyltransferase production was reached in culture medium 2 composed of 160 g/L of sugar cane molasses, 20 g/L of bacteriological peptone and 15 g/L of yeast extract. The cultivation of Erwinia sp D12 using the optimized medium under agitation at 30°C showed enzyme activity of 7,26 AU/mL after 15 hours, with estimated cost for the medium of R$ 7,06 per liter. A second medium optimization study was conducted using sugar cane molasses, com steep liquor and yeast extract. The culture medium 3 composition that showed highest glucosyltransferase production was composed of 100 g/L of sugar cane molasses, 60 g/L of com steep liquor, 8 g/L of yeast extract and 0,1 g/L of K2HPO4 after 15 hours of cultivation at 30°C, the enzyme activity on this medium was 6,65 AU/mL with the estimated medium cost around R$ 0,20 per liter. The relationship between fermentation time, growth of microorganism, change of medium pH and glucosyltransferase production was studied using 5 liters fermentation vessel, with culture medium 2 composed of 160 g/L of sugar cane molasses, 20 g/L of bacteriological peptone and 15 g/L of yeast extract, at 24ºC, 26ºC , 28ºC and 30ºC. The highest enzyme activity, 14,61 AU/mL, was reached after 10 hours, at 26ºC. The conversion of sucrose to isomaltulose, using free enzyme and also immobilized and free cells of Erwinia sp D12, was evaluated. The conversion rates were highest for free and immobilized cells. In the study of the immobilization of Erwinia sp D12 cells in calcium alginate, was verified that 1,0% sodium alginate solution (Sigma), that showed high viscosity, can be substituted to 2,0% sodium alginate solution (Synth) with lower cost. Using 40,0% cell suspension of Erwinia sp D12 and 2,0% sodium alginate solution for cell immobilization, the conversion rate from sucrose to isomaltulose was 74,18%, after 24 hours, at 30°C
Mestrado
Mestre em Ciência de Alimentos

As enzimas microbianas apresentam um elevado potencial biotecnológico e são utilizadas nas mais diversas áreas industrial. A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) é uma enzima com hablidade de converter amido em ciclodextrinas (CDs), sendo produzida por diversos microorganismos, principalmente por bactérias do gênero Bacillus, sendo principalmente aplicada nas industrias de alimentos e farmacêutica. A utilização da formulação de meios alternativos considerados econômicos, tem gerado diversos estudos no sentido de substituir componentes dos meios tradicionais de produção, por substratos de resíduos industriais e agroindustriais de baixo custo e com elevado valor agregado. Neste sentido, foi realizada inicialmente, a seleção de amostras produtoras da enzima CGTase, tendo sido selecionado Bacillus Licheniformis (UCP 1021), através da formação de halo característico em todas as condições testadas. EM seguida, estudos foram realizados para formulação de meios alternativos econômicos utilizando resíduos agroindustriais, casca da batata (Solanum tuberosum L) e soro de leite, na produção da CGTase. Na formulação dos meios em que a casca de batata substituiu o amido, foram utilizadas as concentrações de 2,5; 5 e 10 g/L, sendo denominados de A, A e A. No meio denominado B, foi substituído a peptona por casca de batata (10g/L), no meio C foi substituído extrato de levedura por soro de leite (5g/L), e no meio D foi substituído a peptona por soro de leite (5g/L). Todos os ensaios de produção da enzima, ocorreram a 37C, 150 rpm, 84 horas. Os resultados obtidos evidenciaram que o meio padrão de produção obteve uma atividade específica de 0,120 umol/mg em 24h, e verificou-se que todos os meios alternativos produziram a enzima, porém o meio denominado A apresentou a maior atividade específica para b-CD (0,823 umol/mg), em 12h, sugerindo assim que a utilização de meios econômicos contendo resíduos agroindustriais, é uma alternativa viável no processo de produção de diversos compostos bioativos utilizados na biotecnologia microbiana.
Microbial enzymes have a high biotechnological potential and are used in various industrial areas . The cyclodextrin glycosyltransferase ( CGTase , EC 2.4.1.19 ) is an enzyme with hablidade to convert starch into cyclodextrins ( CDs ) , being produced by various microorganisms , mainly bacteria of the genus Bacillus , being mainly applied in the food and pharmaceutical industries . Using the formulation of alternative means considered economical , has generated many studies to replace components of the traditional means of production , for substrates of industrial and agro-industrial residues of low cost and high value -added . In this connection , it was initially performed , selection of produce CGTase enzyme samples , Bacillus licheniformis (UCP 1021) were selected by halo formation characteristic in all conditions tested. Then , studies were conducted to formulate economic alternative means using agroindustrial waste , peel the potato ( Solanum tuberosum L ) and whey in the production of CGTase . In formulating means that the potato peel replaced starch , the concentrations used were 2.5 ; 5:10 g / L , being named A , A and The . In the middle called B was replaced by potato peel peptone ( 10g / L ) in medium C was replaced by yeast extract, whey (5 g / L) medium and peptone- D was replaced by whey ( 5g / L). All assays for enzyme production occurred at 37 C , 150 rpm , 84 hours . The results showed that the standard production medium achieved a specific activity of 0.120 umol / mg in 24 hours, and it was found that all alternative media produced the enzyme , however, the midst called A showed the highest specific activity for B- CD ( 0.823 umol / mg) at 12 hours , suggesting that the use of cheap media containing organic residues , is a viable alternative for the production of various bioactive compounds used in microbial biotechnology process.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-07-28Bitstream added on 2014-06-13T20:50:19Z : No. of bitstreams: 1 carneiro_aaj_me_sjrp.pdf: 580507 bytes, checksum: 4c1dad8d17aa4960b07b2f4da681cd4c (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) é uma enzima microbiana que converte o amido em ciclodextrinas (CDs). Estes compostos são moléculas cíclicas, formadas por monômeros de D-glicoses unidas por ligações glicosídicas do tipo a-1,4. As CDs podem ser uma alternativa para controlar o escurecimento de batatas e frutas devido a sua capacidade de formar complexo de inclusão com substratos da reação de escurecimento. Alimentos contendo amido, quando adicionados da CGTase são também, potencialmente capazes de sofrer a ação da enzima formando CD localmente. Esse trabalho teve por finalidade estudar a aplicação direta da enzima CGTase em batatas e a aplicação de ciclodextrina comercial em batatas, maçãs, bananas e pêras visando controlar as reações de escurecimento enzimático ou não enzimático, destes alimentos. A formação de complexos com ciclodextrina foi determinada por calorimetria diferencial de varredura (DSC). Este trabalho mostrou pela primeira vez que tanto a CGTase produzida por Bacillus clausii E16 quanto a CGTase comercial (Toruzyme., Novozymes), foram capazes de controlar o escurecimento químico de batata e enzimático de batata e maçã. A utilização da CD mostrou efeito similar a ação das CGTases para batata e maçã, reduzindo dessa forma o escurecimento enzimático causado pela enzima polifenoloxidase. Pode-se inferir que ocorreu a produção da CD pela ação da CGTase em presença do substrato natural (amido de batata e maçã) e por conseqüência sua ação complexante junto aos agentes responsáveis pelo escurecimento, inibindo assim a efetivação das reações. Essa possível encapsulação foi demonstrada pela análise de DSC referente à diminuição do pico da amostra de batata tratada com CGTase.
The cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) is a microbial enzyme that converts starch to cyclodextrins (CDs). These compounds are cyclical molecules, formed by D-glucose monomers linked by a-1,4-glycosidic linkages type. The CDs can be an alternative to control the potato and fruits browning due its capacity to form complexes of inclusion with substrate of the browning reaction. Foods containing starch, when added of the CGTase are also potentially able to the action from the enzyme, then forming CD. This work had the purpose to study the direct application of the CGTase enzyme in potatoes and the commercial cyclodextrin application in potatoes, apples, bananas and pears aiming to control the browning enzymatic or no enzymatic reactions of these foods. The cyclodextrin complexes formation was determined by differential scanning calorimetry (DSC). This work showed for the first time that as the CGTase produced for Bacillus clausii E16 as the commercial CGTase (Toruzyme., Novozymes), were capable to control the chemical browning of potato and enzymatic browning of potato and apple. The use of the CD showed to similar effect to the action of CGTases for potato and apple, reducing in both the enzymatic browning caused by polyphenoloxidase enzyme. It can be concluded that the production of CD occurred by CGTase action in presence of the natural substrate (starch of potato and apple) and for consequence it s action to form complexes next to the responsible agents for the browning, thus inhibiting effectively the reactions. This possible encapsulation was demonstrated by analysis of DSC referring to the reduction of the peak of the potato sample treated with CGTase.

Orientador: Roberto da Silva
Banca: Adriane Maria Ferreira Milagres
Banca: Heloisa Ferreira Alves do Prado
Resumo: A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) é uma enzima microbiana que converte o amido em ciclodextrinas (CDs). Estes compostos são moléculas cíclicas, formadas por monômeros de D-glicoses unidas por ligações glicosídicas do tipo a-1,4. As CDs podem ser uma alternativa para controlar o escurecimento de batatas e frutas devido a sua capacidade de formar complexo de inclusão com substratos da reação de escurecimento. Alimentos contendo amido, quando adicionados da CGTase são também, potencialmente capazes de sofrer a ação da enzima formando CD localmente. Esse trabalho teve por finalidade estudar a aplicação direta da enzima CGTase em batatas e a aplicação de ciclodextrina comercial em batatas, maçãs, bananas e pêras visando controlar as reações de escurecimento enzimático ou não enzimático, destes alimentos. A formação de complexos com ciclodextrina foi determinada por calorimetria diferencial de varredura (DSC). Este trabalho mostrou pela primeira vez que tanto a CGTase produzida por Bacillus clausii E16 quanto a CGTase comercial (Toruzyme., Novozymes), foram capazes de controlar o escurecimento químico de batata e enzimático de batata e maçã. A utilização da CD mostrou efeito similar a ação das CGTases para batata e maçã, reduzindo dessa forma o escurecimento enzimático causado pela enzima polifenoloxidase. Pode-se inferir que ocorreu a produção da CD pela ação da CGTase em presença do substrato natural (amido de batata e maçã) e por conseqüência sua ação complexante junto aos agentes responsáveis pelo escurecimento, inibindo assim a efetivação das reações. Essa possível encapsulação foi demonstrada pela análise de DSC referente à diminuição do pico da amostra de batata tratada com CGTase.
Abstract: The cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) is a microbial enzyme that converts starch to cyclodextrins (CDs). These compounds are cyclical molecules, formed by D-glucose monomers linked by a-1,4-glycosidic linkages type. The CDs can be an alternative to control the potato and fruits browning due its capacity to form complexes of inclusion with substrate of the browning reaction. Foods containing starch, when added of the CGTase are also potentially able to the action from the enzyme, then forming CD. This work had the purpose to study the direct application of the CGTase enzyme in potatoes and the commercial cyclodextrin application in potatoes, apples, bananas and pears aiming to control the browning enzymatic or no enzymatic reactions of these foods. The cyclodextrin complexes formation was determined by differential scanning calorimetry (DSC). This work showed for the first time that as the CGTase produced for Bacillus clausii E16 as the commercial CGTase (Toruzyme., Novozymes), were capable to control the chemical browning of potato and enzymatic browning of potato and apple. The use of the CD showed to similar effect to the action of CGTases for potato and apple, reducing in both the enzymatic browning caused by polyphenoloxidase enzyme. It can be concluded that the production of CD occurred by CGTase action in presence of the natural substrate (starch of potato and apple) and for consequence it’s action to form complexes next to the responsible agents for the browning, thus inhibiting effectively the reactions. This possible encapsulation was demonstrated by analysis of DSC referring to the reduction of the peak of the potato sample treated with CGTase.
Mestre

Orientador: Helia Harumi Sato
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
Made available in DSpace on 2018-08-03T21:41:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Orsi_DanielaCastilho_M.pdf: 1528781 bytes, checksum: 9b24bf02927103be3fb307e39fe0a720 (MD5) Previous issue date: 2004
Mestrado

Orientador : Helia Harumi Sato
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
Made available in DSpace on 2018-08-08T02:25:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kawaguti_HaroldoYukio_D.pdf: 24058276 bytes, checksum: a6cb1016d8d9d61e1418acf5a2867097 (MD5) Previous issue date: 2007
Resumo: A isomaltulose é um dissacarídeo redutor, isômero da sacarose, que possui um sabor adocicado suave e propriedades físicas e sensoriais muito similares, que tem sido considerado um substituto promissor da sacarose na indústria de alimentos, devido a algumas características como baixo potencial cariogênico e baixo índice glicêmico, promoção do crescimento de bifidobactérias benéficas da microbiota intestinal, e por apresentar maior estabilidade em relação à sacarose em alimentos e bebidas acidificados, além de poder ser convertido para isomalte, um açúcar álcool dietético e não cariogênico aplicado na indústria de alimentos e farmacêutica. Os objetivos deste trabalho foram otimizar um meio de cultivo, de menor custo, para a produção da enzima glicosiltransferase pela linhagem Erwinia sp. D12 e estudar a produção de isomaltulose a partir de sacarose utilizando-se células livres e células imobilizadas em alginato de cálcio. Na otimização do meio de cultivo, em frascos sob agitação, a máxima atividade obtida foi de 12,4 UA de glicosiltransferase/mL de meio de cultivo após 8 horas de fermentação a 30ºC, em meio composto de 150 g/L de melaço de cana-de-açúcar, 20 g/L de água de maceração de milho- Milhocina®, 15 g/L de extrato de levedura Prodex Lac SDÒ, e pH ajustado a 7,5. No estudo da produção de glicosiltransferase, em fermentador de 6,6 litros, utilizando-se o meio de cultivo otimizado foi obtida máxima atividade de 22,5 UA de glicosiltransferase/mL de meio de cultivo, após 8 horas de fermentação a 27oC. No estudo da produção de isomaltulose por células íntegras imobilizadas de Erwinia sp. D12 em alginato de cálcio foi verificado que o tratamento dos grânulos de células imobilizadas com 0,06% de glutaraldeído, promoveu uma maior taxa de conversão, sendo obtido cerca de 72,3% de isomaltulose, após 12 horas de incubação em frascos sob agitação a 30ºC. As células íntegras imobilizadas e tratadas com 0,06% de glutaraldeído, em colunas de leito empacotado, apresentaram maior estabilidade do que àquelas imobilizadas sem tratamento com o aditivo, e mantiveram a conversão de sacarose em isomaltulose entre 50-60% por 10 dias, a partir de solução de sacarose 35% e fluxo de 0,56 mL/min a 30ºC. Foram estudados diferentes tratamentos para a preparação de células íntegras, células lisadas e extrato enzimático bruto imobilizados em alginato de cálcio. Os métodos que mostraram melhores resultados, em processo em batelada, foi o extrato enzimático bruto imobilizado em alginato de cálcio (EEI), em que foram obtidas taxas de conversão entre 59,7% e 63,3%; e células lisadas por sonicação e imobilizadas (CSI), com taxas de conversão entre 47,6% e 62,3%. A coluna de leito empacotado contendo grânulos de células lisadas imobilizadas (CSI) apresentou maior estabilidade do que a coluna contendo os grânulos de extrato enzimático bruto imobilizado (EEI). A coluna de leito empacotado de CSI converteu 53-59% de sacarose em isomaltulose durante sete dias, posteriormente houve queda lenta e gradual da conversão não havendo mais transformação em isomaltulose após 21 dias. No estudo da produção de isomaltulose utilizando-se células livres de Erwinia sp. D12, em processo em batelada, foi verificado o efeito do pH, da temperatura, da concentração do substrato sacarose e da concentração de massa celular em frascos agitados a 150 rpm e 30ºC. A conversão de sacarose em isomaltulose foi favorecida utilizando-se temperaturas superiores a 30ºC, pH entre 6,0-6,5, massa celular entre 7,5- 12,5% e solução de sacarose de 20-35%, obtendo-se rendimentos de isomaltulose acima de 50%. No estudo da vida útil das células livres em escala de bancada, utilizando-se frascos Erlenmeyers sob agitação, foi verificado que os parâmetros de conversão fixados a: temperatura de 35ºC, pH 6,5, concentração de substrato sacarose 35% e concentração de massa celular 10% foram os mais favoráveis, promovendo um alto rendimento em isomaltulose entre 70-75%, por 16 bateladas. Os ensaios realizados em escala piloto demonstraram a viabilidade da conversão de sacarose em isomaltulose por células livres, em que foram obtidos cerca de 114 litros de xarope com alto teor de isomaltulose (63,40%). Os cristais de isomaltulose, após clarificação e purificação do xarope convertido, apresentaram pureza de 96,5%
Abstract: Isomaltulose is a reducing disaccharide and a structural isomer of sucrose. It has a mild sweet flavour and very similar physical and sensorial properties and has been considered as a promising substitute for sucrose in the food industry, due to some of its characteristics such as a low cariogenic potential and low glycemic index and the promotion of beneficial bifid bacteria in the intestinal microbial flora. It also shows greater stability than sucrose in acidified foods and drinks, and can be converted into isomalt, a dietetic sugar alcohol with no cariogenic potential for use in the food and pharmaceutical industries. The objectives of this research were the optimisation of a culture medium with reduced costs for the production of the enzyme glucosyltransferase by the strain Erwinia sp. D12, and the study of isomaltulose production from sucrose by free and immobilized cells. In the optimisation of the culture medium in shaken flasks, the highest glucosyltransferase activity achieved was 12.4 UA/mL of culture medium after 8 hours of fermentation at 30ºC, in a medium composed of 150 g/L of sugar cane molasses, 20 g/L of corn steep liquor- Milhocina® and 15 g/L of yeast extract Prodex Lac SD®, with the pH adjusted to 7.5. In the study for glucosyltransferase production in a 6.6-liter reactor using the optimised culture medium, the highest glucosyltransferase production achieved was 22.5 UA/mL of culture medium, after 8 hours of fermentation at 27ºC. In the study for isomaltulose production using Erwinia sp. D12 cells immobilized in calcium alginate, it was shown that the addition of 0.06% glutaraldehyde during the immobilization process, promoted a higher conversion rate, reaching about 72.3% isomaltulose after 12 hours of incubation at 30°C in shaken flasks. The immobilized whole cells treated with 0.06% glutaraldehyde, used in packed-bed reactors, presented greater stability than those immobilized without the addition of the additive, and maintained the conversion of sucrose into isomaltulose between 50-60% for 10 days, using a 35% sucrose solution with a flow rate of 0.56 mL/min at 30ºC. Different treatments were studied for the preparation of whole cells, lysed cells and a crude enzyme extract immobilized in calcium alginate. The methods that showed the best results in batch processes were the crude enzyme extract immobilized in calcium alginate (EEI), where conversion rates between 59.7% and 63.3% were achieved; and immobilized lysed cells (CSI), with conversion rates between 47.6% and 62.3%. The packed bed column containing granules of immobilized lysed cells (CSI) presented greater stability than that containing granules of immobilized crude enzymatic extract (EEI). The packed bed column with CSI converted 53-59% of sucrose into isomaltulose during seven days, and then showed a gradual decline in conversion, ceasing completely after 21 days. In the study of isomaltulose production using free Erwinia sp. D12 cells in a batch process, the effects of pH, temperature, sucrose substrate concentration and cell mass concentration were determined in shaken flasks at 150 rpm and 30ºC. The following conditions favoured the conversion of sucrose into isomaltulose: temperatures above 30ºC, pH between 6.0-6.5, cell mass between 7.5-12.5% and a sucrose concentration between 20-35%; when isomaltulose yields above 50% were obtained. The half-life of the free cells was studied on a bench scale in shaken Erlenmeyers flasks and it was shown that the following fixed conversion parameters were the most favourable: temperature of 35ºC, pH 6.5, 35% sucrose substrate concentration and 10% cell mass concentration; promoting high isomaltulose yields between 70-75%, for 16 batches. The pilot scale assays demonstrated the viability of the conversion of sucrose into isomaltulose by free cells, obtaining about 114 liters of high isomaltulose syrup (63.40%). The isomaltulose crystals, after clarification and purification of the converted syrup, showed a purity of 96.5%
Doutorado
Mestre em Ciência de Alimentos

A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) faz parte da família das α-amilases e se destaca por ser a única enzima capaz de produzir ciclodextrinas (CDs). Esses oligossacarídeos cíclicos possuem a capacidade de formar complexos de inclusão com uma variedade de moléculas, alterando suas características como, por exemplo, solubilidade, volatilidade e estabilidade. Desta forma, CDs tem encontrado aplicação nas mais diversas áreas. Na indústria de alimentos, se destacam por serem potenciais estabilizantes naturais. Buscando alternativas viáveis para produção destas ciclodextrinas, neste trabalho, a enzima CGTase foi imobilizada covalentemente em esferas de quitosana e posteriormente utilizada em um reator enzimático para uso contínuo. O rendimento da imobilização foi de aproximadamente 100 %, com uma carga de 20 mg de enzima por grama de suporte seco. O processo de imobilização foi capaz de manter o comportamento da enzima frente à variação de pH e temperatura de reação, apresentando pH ótimo em 5,0 e a faixa de temperatura ótima de 70 a 95 ºC, para ambos. A estabilidade conferida ao catalisador imobilizado possibilitou sua reutilização, 61 % da sua atividade inicial foi mantida após 100 ciclos de reação. Durante utilização contínua, realizada em um reator de leito fixo, analisou-se a influência da taxa de fluxo e da concentração do substrato na geração de β-CD. A máxima produção (1,32 g / L) foi alcançada utilizando-se 4 % de amido solúvel em uma taxa de fluxo de 3 mL / min. Além disso, o biocatalisador apresentou uma ótima estabilidade operacional a 60 °C, mantendo 100 % da atividade inicial após 100 h de uso contínuo. Estes resultados demonstram que o desempenho do reator é diretamente afetado pelos parâmetros analisados e que a produção pode ser otimizada por regulação simples na velocidade de fluxo, ou pela concentração do substrato; e sugerem a possibilidade de utilizar este biocatalisador imobilizado na produção contínua de CDs.
Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) is member of the family α-amylase and is known for being the only enzyme able to produce cyclodextrins (CDs). These cyclic oligosaccharides have the ability to form inclusion complexes with a variety of molecules, changing its characteristics, for example, solubility, volatility and stability. Therefore, CDs have found application in several fields. In the food industry stand out for being potential natural stabilizers. Seeking to alternatives for producing these cyclodextrins, in this work, the CGTase enzyme was immobilized covalently on chitosan beads and subsequently used in enzymatic reactor for continuous use. The immobilization yield was high, reaching about 100 %, representing a load of 20 mg enzyme per gram of dry support. The immobilization process was capable of maintaining the behavior of the enzyme to the variation of pH and temperature of reaction, with pH optimum at 5.0 and the optimal temperature range of 70 - 95 ° C, for both. The stability afforded to the immobilized catalyst made possible its reuse, maintaining 61 % of its initial activity after 100 cycles of reaction. During its continuous use, in a packed bed reactor, we analyzed the influence of flow rate and concentration of the substrate in the generation of β-CD. The maximum yield (1.32 g / L) was achieved using 4 % soluble starch at a flow rate of 3 mL / min. In addition, the biocatalyst showed a great operational stability at 60 ° C, maintaining 100 % of initial activity after 100 h of continuous use. These results demonstrate that the performance is directly affected by the parameters analyzed and that the production can be optimized by simple adjustment in flow rate through the reactor, or the substrate concentration used and suggests the possibility of using this biocatalyst immobilized to the continuous production of CDs.

Aquesta tesi se centra en l’estudi de les possibles glicosiltransferases de Micoplasma genitalium involucrades en la síntesi de glicolípids. Aquests compostos formen part de la membrana plasmàtica del microorganisme, únic envolcall que el protegeix del seu entorn ja que no disposa de paret cel•lular. La hipòtesi sobre la qual s’ha desenvolupat el treball és la possibilitat que aquests glicolípids i els enzims encarregats de la seva producció, les glicosiltransferases, siguin essencials per a la viabilitat del micoplasma i per tant, la seva inhibició sigui una forma d’eradicar les infeccions causades pel patògen. De les tres seqüències classificades com a glicosiltrasferases en el genoma de Mycoplasma genitalium, mg025, mg060 i mg517, s’ha determinat que mg025 és l’únic dels tres gens que no és essencial per al bacteri, tot i que s’ha observat que els tres s’expressen tant a la fase exponencial com a la fase estacionària del seu creixement. La funció de mg025 i mg060 és encara desconeguda, mentre que mg517 és la glicosiltransferasa encarregada de la síntesi dels dos principals glicolípids del micoplasma, el monoglicosildiacilglicerol (MGlcDG) i el diglicosildiacilglicerol (DGlcDG). En aquesta tesi s’ha desenvolupat un protocol d’expressió per a la glicosiltransferasa codificada per mg517, anomenada GT-MG517, el qual fa ús d’una coexpressió amb xaperones i solubilitza la proteïna amb detergents, glicerol i una elevada força iònica. Aquesta metodologia ha estat necessària ja que GT-MG517 és una proteïna associada a membrana i la seva expressió recombinant en E.coli presenta dificultats. La proteïna s’ha purificat mitjançant cromatografia d’afinitat per Ni, tot i que el grau de puresa assolit no ha estat suficient per a intentar la seva cristal•lització. Les diverses proves realitzades usant cromatografia d’exclusió molecular han permès determinar que GT-MG517 forma oligòmers d’alt pes molecular. A partir de la proteïna purificada s’ha realitzat un estudi cinètic de la seva doble activitat glicosildiacilglicerolsintasa. D’aquest estudi s’extreu que GT-MG517 pot transferir un sucre, Glc o Gal, a una molècula principalment hidrofòbica, com és el DOG, i a una molècula molt més hidrofílica, com el MGlcDG. Ambdós compostos però posseeixen un alcohol primari sobre el qual té lloc la transferència creant l’enllaç (16). Amb qualsevol dels substrats acceptors provats, l’enzim presenta activitats específiques superiors si el substrat donador és UDP-Gal. L’acceptor preferit de GT-MG517 és el lípid DOG, però la glicosiltransferasa és capaç d’elongar, ja sigui amb una Glc o amb una Gal, glicolípids com el MGlcDG i el MGDEG, preferint en aquest cas el compost amb una Gal a l’extrem no reductor. Tot i això, l’afinitat de l’enzim és superior per a donadors amb Glc (KM inferiors a les dels donadors amb Gal). D’altra banda, s’ha demostrat que el lípid aniònic DOPG es comporta com a activador de l’activitat enzimática. GT-MG517 posseeix un teòric domini d’unió d’UDP-Glc a l’extrem N-terminal. Aquesta zona presenta similitud de seqüència amb altres glicosiltransferases i permet la classificació de GT-MG517 dins de la família GT-2. En canvi, el seu extrem C-terminal presenta una seqüència particular que no s’alinea amb altres proteïnes. En aquesta tesi es formula la hipòtesi que aquesta zona podria ser d’interacció amb la membrana i, a més, que aquesta interacció podria regular l’activitat enzimàtica. Per això es preparen diverses formes truncades de GT-MG517, en les quals s’eliminen alguns aminoàcids de l’extrem C-terminal, i una forma en la qual només es conserva l’hipotètic domini d’unió d’UDP-Glc. Aquestes noves proteïnes s’expressen, solubilitzen i purifiquen aplicant el protocol establert per a la forma completa. Amb l’anàlisi dels glicolípids sintetitzats s’estableix que els deu últims aminoàcids de GT-MG517 són prescindibles per a la seva activitat, ja que les formes truncades corresponents continuen tenint la capacitat de sintetitzar glicolípids. No obstant, l’eliminació d’un nombre superior de residus, inactiva la proteïna. La purificació de l’hipotètic domini d’unió d’UDP-Glc posa de manifest que forma oligòmers, de la mateixa forma que ho fa la proteïna completa.
Esta tesis se centra en el estudio de las posibles glicosiltransferasas de Mycoplasma genitalium involucradas en la síntesis de glicolípidos. Estas moléculas constituyen parte de la membrana plasmática del miroorganismo, única estructura de protección frente al entorno ya que los micoplasmas carecen de pared celular. La hipótesis sobre la cual se ha desarrollado el trabajo es la posibilidad que los mencionados glicolípidos y las enzimas encargadas de su producción, las glicosiltransferasas, sean esenciales para la viabilidad del micoplasma y, por tanto, su inhibición sea una forma de erradicar las infecciones causadas por el patógeno. De las tres secuencias clasificadas como glicosiltransferasas en el genoma de Mycoplasma genitalium, mg025, mg060 y mg517, se determinó que mg025 es el único de los tres genes que no es esencial para la bacteria, aunque se observó que los tres se expresan tanto en la fase exponencial como en la fase estacionaria de su crecimiento. Se desconoce todavía la función de mg025 y mg060. En cambio, se conoce que mg517 es la glicosiltransferasa responsable de la síntesis de los dos principales glicolípidos del micoplasma, el monoglicosildiacilglicerol (MGlcDG) y el diglicosildiacilglicerol (DGlcDG). En esta tesis se desarrolló un protocolo de expresión para la glicosiltransferasa codificada por mg517, llamada GT-MG517, el cual emplea una coexpresión con chaperonas y solubiliza la proteína con detergentes, glicerol y una fuerza iónica elevada. Dicha metodología fue necesaria ya que GT-MG517 es una proteína asociada a membrana y su expresión recombinante en E.coli presenta dificultades. La proteína se purificó mediante cromatografía de afinidad por Ni pero el grado de pureza obtenido no fue suficiente para intentar su cristalización. Distintas pruebas realizadas usando cromatografía d’exclusión molecular permitieron determinar que GT-MG517 forma oligómeros de alto peso molecular. Con la proteína purificada se realizó un estudio cinético de su doble actividad glicosildiacilglicerolsintasa. De este estudio se extrae que GT-MG517 puede transferir un azúcar, Glc o Gal, a una molécula principalmente hidrofóbica, como es el DOG, y a una molécula mucho más hidrofílica, como el MGlcDG. Pese a su diferencia, los dos compuestos poseen un alcohol primario sobre el que tiene lugar la transferencia creándose el enlace (16). Con cualquiera de los sustratos aceptores probados, la enzima presenta actividades específicas superiores si el sustrato dador es UDP-Gal. El aceptor preferido de GT-MG517 es el lípido DOG, aunque la glicosiltransferasa es capaz de elongar, ya sea con una Glc o con una Gal, glicolípidos como el MGlcDG y el MGDEG, prefiriendo en este caso el compuesto con una Gal en el extremo no reductor. Aún así, la afinidad de la enzima es superior para dadores con Glc (KM inferiores a las de los dadores con Gal). Por otro lado, se demostró que el lípido aniónico DOPG se comporta como activador de la actividad enzimática. GT-MG517 posee un dominio teórico de unión de UDP-Glc en su extremo N-terminal. Esta zona presenta similitud de secuencia con otras glicosiltransferasas y permite la clasificación de GT-MG517 dentro de la familia GT-2. En cambio, su extremo C-terminal presenta una secuencia particular que no se alinea con otras proteínas. En esta tesis se formula la hipótesis que dicha zona podría ser de interacción con la membrana y, además, que dicha interacción podría regular la actividad enzimática. Por eso se prepararon distintas formas trucadas de GT-MG517, en las cuales se eliminaron algunos aminoácidos del extremo C-terminal, y una forma en la cual sólo se conservó el hipotético dominio de unión de UDP-Glc. Las nuevas proteínas se expresaron, solubilizaron y purificaron aplicando el protocolo establecido para la forma completa. Con el análisis de los glicolípidos sintetizados se determinó que los diez últimos aminoácidos de GT-MG517 eran prescindibles para su actividad, ya que las correspondientes formas truncadas conservaban su capacidad de sintetizar glicolípidos. No obstante, la eliminación de un número superior de residuos inactiva la proteína. La purificación del hipotético dominio de unión de UDP puso de manifiesto que forma oligómeros, de la misma forma en que lo hace la proteína completa.
This thesis is focused on the glycolipid producing glycosyltransferases from Mycoplasma genitalium. Glycolipids are part of the microorganism plasma membrane, which is the external covering of mycoplasmas since they lack a cell wall. Our working hypothesis is that glycolipids and the enzymes responsible for their production are essential to mycoplasma. Thus, glycosyltransferase inhibition could be a way to eradicate this pathogen caused infections. There are three genes described as putative glycosyltransferases in Mycoplasma genitalium genome, mg025, mg060 and mg517. We determined that mg025 is the only one essential to the bacteria, although the three of them are expressed both during the exponential and stationary growth phases. The function of mg025 and mg060 still remains unknown, whereas mg517 codifies for the glycosyltransferase responsible for monoglycosyldiacylglycerol (MGlcDG) and diglycosyldiacylglycerol (DGlcDG) synthesis, main mycoplasma glycolipids. In this work an expression protocol for mg517 codified glycosyltransferase was designed. The protocol included chaperone coexpression and protein solubilization with detergents, glycerol and high ionic strength. This methodology was necessary since GT-MG517 is a membrane associated protein and its recombinant expression in E.coli presents some difficulties. GT-MG517 was purified by Ni affinity chromatography. However, a suitable purity degree to attempt protein crystallization was not achieved. Some experiments using size exclusion chromatography revealed that GT-MG517 forms high molecular weight oligomers. A kinetic study of the protein double glycosyldiacylglycerol synthase activity was performed. From this study we learned that GT-MG517 is able to transfer a sugar moiety, Glc or Gal, both to a hydrophobic molecule such as DOG or to a more hydrophilic compound such as MGlcDG. These acceptor substrates share a primary alcohol where the sugar transfer takes place forming a (16) bond. The enzyme presents higher specific activities when UDP-Gal acts as reaction donor, regardless of the acceptor tested. DOG is the preferred acceptor although the enzyme is able to transfer Glc or Gal moieties to glycolipids such as MGlcDG and MGDEG. In this case, the reaction is faster with acceptors with Gal in the non-reducing end. As for donor substrate, enzyme’s affinity is higher for Glc containing molecules, with lower KM values than for Gal donors. In addition, our study proved the anionic lipid DOPG to act as an enzymatic activity enhancer. GT-MG517 has a putative binding domain for UDP-Glc in the N-terminal end. This sequence is similar to other glycosyltransferases and allows its classification in Cazy’s GT-2 family. On the contrary, the C-terminal end has a particular sequence which does not match up with any other protein. Our hypothesis was that this C-terminal end of GT-MG517 could contain a membrane interaction sequence, which could at the same time modulate enzymatic activity. To test this hypothesis some truncated forms of GT-MG517, where C-terminal aminoacids had been removed, were prepared. Moreover, a form where only the putative UDP-Glc binding domain was conserved was also expressed. All these proteins were expressed, solubilized and purified with the same protocol used for the full-length form of GT-MG517. Glycolipids produced by truncated forms were analysed and results implied that the last ten aminoacids were not involved in the enzyme’s activity. Elimination of a higher number of aminoacids caused protein inactivation. When the putative UDP-binding domain was purified, it showed high molecular weight oligomers such as those developed by the complete form of the protein.

A ciclodextrina glicosiltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] é uma enzima industrialmente importante, usada para produzir ciclodextrinas. Neste trabalho foi utilizado o planejamento experimental e a metodologia de superfície de resposta a fim de identificar as melhores condições para a produção de CGTase pela bactéria alcalófila Bacillus circulans. As melhores condições de temperatura e pH, para a produção de CGTase foram, respectivamente, 36 ºC e 9,7. Em seguida, utilizando estes parâmetros otimizados, a produção de CGTase foi avaliada em cultivos submersos, batelada e batelada alimentada, e em cultivo semi-sólido (CSS), usando um resíduo fibroso de soja (SIFR) como substrato. Nos cultivos em batelada, a atividade máxima de CGTase obtida foi de 1155 U.mL-1, em aerobiose. A produção de CGTase foi bastante influenciada pelo fluxo de ar e pela agitação, sendo que uma alta produtividade enzimática (155 U.(mLh)-1) foi obtida em condições de aeração moderada (400 rpm para a velocidade de agitação e 1,7 vvm para o fluxo de ar). Com estes parâmetros otimizados, a produtividade de CGTase obtida em cultivo em batelada alimentada foi de 137 U.(mLh)-1, com uma taxa de alimentação de 0,17 g.(Lh)-1. O crescimento celular e a síntese de CGTase, usando o resíduo fibroso de soja como substrato apresentou um rendimento de 32.776 U.g(SIFR) -1. As diferentes abordagens utilizadas neste trabalho poderão ser aplicadas para a produção de outras enzimas amilolíticas e também para a produção de CGTase com outros substratos.
Cyclodextrin glycosyltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] is an industrially important enzyme, which is used to produce cyclodextrins. In this study we report the use of experimental factorial design and response surface methodology to find the best conditions for CGTase production by alkaliphilic Bacillus circulans. The optimized calculated values for the tested variables were pH 9.7 and temperature 36oC. The CGTase production was further studied with the optimized process parameters on submerged cultivations (SC), batch or fedbatch, and solid-state cultivations (SSC) using soybean industrial fibrous residue (SIFR). The maximum CGTase activity obtained on batch cultivation was 1,155 U.mL-1 under aerobic conditions. The CGTase production was strongly affected by air flow rate and agitation speed, showing high enzyme productivity (155 U.mL-1h-1) under moderate conditions of aeration (400 rpm for speed agitation and 1.7 vvm for air flow rate). With these optimized process parameters, CGTase productivity obtained on fed-batch cultivations was 137 U.mL-1h-1, with feeding rate at 0.17 g.L-1h-1. Cell growth and CGTase synthesis in SSC using soybean industrial fibrous residue as substrate was excellent, with CGTase yield of 32,776 U.g(SIFR) -1. The different approaches used in this study may also find applications for the production of other starch-converting enzymes and also for other CGTase-producing substrates.

A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) é a única enzima capaz de catalisar a reação de ciclização a partir do amido e, assim, formar oligossacarídeos cíclicos conhecidos como ciclodextrinas (CDs). Através desta reação é produzida uma mistura de α-, β- e γ-CD que, respectivamente, contém 6, 7 e 8 resíduos de glicose. As CDs têm atraído enorme atenção devido ao seu grande potencial de aplicação em diversas áreas da indústria. Potencial este proporcionado por sua estrutura cônica, com interior hidrofóbico, capaz de encapsular sólidos, líquidos e gases, conferindo propriedades importantes e protegendo-os. Neste trabalho foi estudada a imobilização de uma CGTase em sílica mesoporosa de forma direcionada às cisteínas presentes em sua superfície, alterando a exposição do sítio ativo. A ligação via cisteínas nativas da proteína aumentou em quatro vezes a eficiência da imobilização, quando comparada a ligação via grupamento amino. Esta, no entanto, apresentou maior atividade enzimática em faixas mais amplas de temperatura e pH, além de maior estabilidade operacional, mantendo 100 % de sua atividade após 200 h de reação contínua a 60 °C e pH 4. Ainda que apresentando menor estabilidade da ligação, o derivado obtido por ligação dissulfeto manteve 40 % da atividade inicial durante 200 h e então, o suporte pôde ser recarregado e reutilizado por igual período. Os suportes desenvolvidos apresentaram estabilidade satisfatória, possibilitando o uso do derivado imobilizado em reator de leito fixo operado de forma contínua. Quando avaliado em relação a produção das três ciclodextrinas principais, o derivado cuja imobilização da enzima ocorreu via grupamento amino, evidenciou a possibilidade de modulação da produção apenas variando as condições de reação. α- e β-CD foram produzidas preferencialmente em pH 8,0 e 2 min (3,44 mg mL-1 e 3,51 mg mL-1, respectivamente), enquanto que pH mais ácido (4,0) e maior tempo de reação (141 min) favoreceram a formação de γ-CD (3,35 mg mL-1), com baixa formação α-CD (0,75 mg mL-1). Por fim, os resultados deste estudo evidenciam a importância da imobilização da CGTase para a estabilização de sua estrutura a fim de aplicá-la em sistemas contínuos de produção de CDs onde é possível modular o perfil dos produtos gerados em função das condições de reação, aumentando assim a produtividade do biocatalisador.
Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) is the only enzyme capable of catalyzing the cyclization reaction from the starch and thus forming cyclic oligosaccharides known as cyclodextrins (CDs). Through this reaction, is produced a mixture of α-, β- and γ-CD containing, 6, 7 and 8 glucose residues respectively. Cyclodextrins (CD) have been attracting considerable attention because of its great potential for application in various areas of industry. This potential is provided by its conical structure with hydrophobic interior, capable of encapsulating solids, liquids and gases, changing important features and protecting them. In this work, the immobilization of CGTase in mesoporous silica was studied in a way directed to cysteines present on its surface, altering the exposure of the active site. The connection via native cysteine of the protein increased by four times the efficiency of immobilization compared to amino groups connection. The binding of amino groups, however, showed greater enzymatic activity in wider ranges of temperature and pH, and higher operational stability, while maintaining 100 % of its activity after 200 h of continuous reaction at 60 °C and pH 4. Although showing less stable connection, the derivative obtained by disulfide bond retained 40 % of the initial activity for 200 h and then, the support could be reloaded and reused for the same period. Developed supports showed satisfactory stability, enabling the use of the derivative assets in a packed bed reactor and operated continuously. It was demonstrated the possibility of modulating the CDs production just varying the reaction conditions, using the derivative of which the enzyme immobilization occurred via amino group, to evaluate the production of three main cyclodextrins. α- and β-CD were produced preferentially at pH 8.0 and 2 min (3.44 mg mL-1 and 3.51 mg mL-1, respectively), whereas the more acid pH (4.0) and longer reaction (141 min) favored the formation of γ-CD (3.35 mg mL-1 and 0.75 mg mL-1 of α-CD). Finally, the results of this study show the importance of the immobilization of CGTase to the stabilization of its structure in order to apply it in continuous CD production systems, where it is possible to modulate the profile of the products generated as a function of the reaction conditions, thus increasing the productivity of the biocatalyst.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-08-09T13:55:42Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Tese_ Lúcia Patrícia Bezerra Gomes da Silva_BC.pdf: 3239380 bytes, checksum: b1ea56aef2722e25e56b20be8995ccbd (MD5)
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FACEPE
O câncer está associado a alterações na glicosilação de glicoproteínas e glicolipídios de superfície celular que podem afetar as interações entre esses glicanos de superfície celular e lectinas endógenas determinando o potencial metastático do tumor. Este trabalho teve como objetivo avaliar o glicofenótipo de tecidos de próstata normal, Hiperplasia Prostática Benigna (HPB) adenocarcinoma próstatico (AP) e investigar se estrógeno regula a glicosilação alterada no câncer da próstata andrógeno refratário usando as linhagens DU-145 e PC-3. As lectinas Concanavalin A (Con A), Ulex europaeus agglutinin (UEA-I) e Peanut agglutinin (PNA) foram conjugadas ao éster de acridina (EA-lectinas). As amostras de tecido foram incubadas com lectinas-EA e a quimiluminescência do complexo lectina-tecido-EA foi expressa em unidades relativas de luz (URL). Tecidos transformados demonstraram uma expressão estatisticamente significativa inferior de α-D-glucose / manose e Gal-β (1-3) -GalNAc que os tecidos normais. No entanto, uma maior expressão de α-L-fucose foi observada em AP em relação a tecidos normais e a BHP. Observou-se uma diminuição da expressão dos valores de URL por inibição da interação entre tecidos e lectinas-AE utilizando os seus carboidratos específicos. A relação entre URL e a área de tecido mostrou uma correlação linear para todos lectinas-AE em ambos os tecidos transformados. Nos estudos in vitro utilizando linhagens de câncer de próstata andrógeno refratário, DU-145 e PC-3 tratadas com estradiol ou estradiol associado à fulvestranto, foi observado na linhagem PC-3 aumento de expressão de CMP-Neu5Ac: GalNAc-R α-2,6sialiltransferase (ST6GALNac-I) quando exposta a estradiol e uma diminuição de expressão na presença do antagonista fulvestranto. Esse comportamento não foi observado na linhagem DU-145. O receptor de estrógeno ERα apresentou diminuição de expressão em células PC-3 tratadas com fulvestranto, não sendo observada diferença de expressão do receptor de estrógeno β em nenhuma das linhagens. Lectin blotting usando as lectinas VVA (Vicia Villosa Lectin) e SNA (Sambucus nigra aglutinin) possibilitou identificar a sialilação do antígeno Tn nas células PC-3 tratadas com estradiol, bem como a expressão do antígeno Tn não sialilado na linhagem DU-145 nas mesmas condições de tratamento. A capacidade de migração de células PC-3 tratadas com estradiol, estradiol combinado a fulvestranto e estradiol combinado a SNA foi avaliada através do ensaio migração (cicatrização de ferida), sendo observado que estradiol induz migração celular enquanto que fulvestranto e SNA reduzem a capacidade migratória. Portanto, podemos inferir que no câncer de próstata há uma alteração na glicosilação e que estrógeno possivelmente pode atuar regulando a expressão de glicosiltransferases responsáveis pela alteração da glicosilação conferindo um potencial metastático tumoral.
Cancer is associated with glycosylation alterations in cell-surface glycoproteins and glycolipids that can affect interactions between those glycans and endogenous lectins, determining the metastatic potential of the tumor. This study aimed to evaluate the glycophenotype in normal prostate, benign prostatic hyperplasia (BPH) and prostatic adenocarcinoma (PCa) tissues and investigate as estrogen regulates the altered glycosylation in prostate cancer androgen refractory using DU-145 and PC-3 cells. Concanavalin A (Con A), Ulex europaeus agglutinin (UEA-I) and Peanut agglutinin (PNA) lectins were conjugated to acridinium ester (lectins-AE). Tissue samples were incubated with lectins-AE. The chemiluminescence of the tissue-lectin-AE complex was expressed in relative light units (RLU). Transformed tissues showed statistical significant lower α-D-glucose/mannose and Gal-β(1-3)-GalNAc expression than normal tissues. However, higher α-L-fucose expression was observed in PCa in relation to normal and BHP tissues. We observed an expressive decreasing of the values of RLU by inhibition of the interaction between tissues and lectins-AE using their specific carbohydrates. The relationship between RLU and tissue area showed a linear correlation for all lectin-AE in both transformed tissues. In vitro studies using DU-145 and PC-3 androgen-refractory cell lines treated with estradiol or estradiol associated to fulvestrant was observed in PC-3 cell line increased α 2,6-sialyltransferase (ST6GALNac-I) expression when exposed to estradiol and decreased of expression in presence of the fulvestrant antagonist. This behavior was not observed in DU -145 cells. The estrogen receptor ERα presented decreased expression in PC-3 cells treated with fulvestrant, not seen difference in estrogen receptor β expression in any of the cells lines. Through lectin blotting using the VVA lectins (Lectin Vicia villosa) and SNA (Sambucus nigra aglutinin) was identified sialylation Tn antigen (sTn) in PC-3 cells treated with estradiol as well as the Tn antigen in DU-145 under the same conditions of treatment. Migration capacity of the PC-3 cells treated with estradiol, fulvestrant and SNA was measured by wound-healing assay (n=2). We observed that estradiol induced cell migration while fulvestrant (ICI) and SNA lectin reduced migration capacity into the wounds. Representative image of the cell cultures with scratches at 24 h are shown. Therefore, we can infer that there is change in glycosylation in prostate cancer and that estrogen can act regulating the expression of glycosyltransferase responsible for the glycosylation altered conferring tumor metastatic potential.

Les glicogen i midó sintases són glicosiltransferases que catalitzen la transferència de residus glucosil a l'extrem no reductor d'una cadena creixent d'un glucà α-1,4, retenint la configuració del carboni anomèric del sucre transferit. Aquest procès és central en el metabolisme energètic de la majoria d'èssers vius.

En aquest treball presentem l'estructura cristal·logràfica de la glicogen sintasa de Pyrococcus abyssi (PaGS). Aquest enzim és termoestable i presenta una activitat màxima a 80ºC i és capaç d'utilitzar indistintament ADPG i UDPG com a donadors de glucosil. La PaGS forma de cossos d'inclusió en totes les condicions d'expressió en E.coli assajades. Amb el mètode de renaturalització en columna hem aconseguit que la PaGS es replegui correctament i ens ha permès obtenir la quantitat de proteïna pura necessària per encetar estudis de cristal·lització i de caracterització en solució.

D'altra banda, el domini C-terminal de la PaGS s'expressa de forma soluble i la seva purificació ens ha permès disposar de quantitat suficient de proteïna per a realitzar estudis de cristal·lització. Aquest domini és monomèric tant en solució com en el cristall. La resolució de l'estructura del domini C-terminal a 1.7 Å a partir de reemplaçament molecular utilitzant el domini homòleg de la GS d'Agrobacterium tumefaciens (AtGS) ha permès utilitzar-lo com a model inicial per a resoldre l'estructura de la PaGS a 2.8 Å.

La PaGS és un trímer tant en solució com en el cristall, amb una disposició triangular plana. Cadascuna de les seves subunitats està formada per dos dominis αβα tipus plegament de Rossmann separats per un solc molt profund on es troba el centre catalític de l'enzim. L'estructura global és molt similar a la de la resta d'estructures resoltes del grup GT-B que actuen amb retenció de la configuració anomèrica. La trimerització de la PaGS implica exclusivament els dominis N-terminals de l'enzim, quedant els dominis C-terminals lliures per a poder realitzar la transició d'obertura i tancament necessària per a la catàlisi.
El domini C-teminal conté la cavitat d'unió a nucleòtid, mentre que la majoria d'interaccions amb l'oligosacàrid acceptor es produeixen a través de residus del domini N-terminal. L'elevada similitud del centre actiu entre les GS i les GP suggereix que ambdues operen a través d'un mecanisme catalític similar, si be no idèntic.

L'estructura de la PaGS i la seva comparació amb l'estructura de l'AtGS ofereixen les bases per a entendre l'especificitat de les GS eucariotes per UDPG, com a substrat donador de glucosil, i la promiscuïtat de les GS d'arqueons per unir tant UDPG com ADPG.

La localització d'una molècula de glucosa en la superfície de la PaGS i la comparació amb les GP eucariotes permeten suggerir un possible lloc d'emmagatzematge del glicogen en les GS.

Orientador: Helia Harumi Sato
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
Made available in DSpace on 2018-07-24T10:49:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Celestino_EricaMarcondes_M.pdf: 11335011 bytes, checksum: 3f2ff33ca438910d6a2f4f959aaad1df (MD5) Previous issue date: 1998
Resumo: Trezentas e quatorze linhagens de microrganismos foram isoladas de amostras de mel, flores, frutas, caldo, melaço e mosto de usina de álcool e açúcar e testadas quanto a capacidade de produção de glicosiltransferase, que catalisa a conversão de sacarose em isomaltulose (6-O-8-Dglicopirano sil-D-frutofuranose). A isomaltulose também conhecida como palatinose apresenta baixo potencial cariogênico e tem sido utilizada na produção de balas, gomas de mascar e produtos de confeitaria. A linhagem D-12 produtora de glicosiltransferase foi selecionada e identificada como Erwinia sp. pelas características morfológicas e bioquímicas. Estudou-se a produção, purificação e a caracterização bioquÚ1lica da glicosiltransferase intracelular da linhagem de Erwinia sp. D-12. No estudo da produção de glicosiltransferase de Erwinia sp. D-12, em meio de cultura composto de 6% de sacarose, 6% de peptona e 0,4% de extrato de carne, em fermentador de 2L verificou-se que a enzima é produzida na fase exponencial de crescimento, sendo que a produção máxima foi obtida após 3 horas de fermentação a 28°C e, após 4 horas de incubação a 30°C e 35°C. A enzima foi purificada através da cromatografia em colunas de DEAE-Sephadex A-50 e DEAE-Sepharose CL-6B. A glicosiltransferase purificada apresentou atividade ótima em pH 6,0 e a 40ºC. A glicosiltransferase purificada de Erwinia sp. D-12 é termo sensível sendo inativada após 1 hora de tratamento a temperaturas superiores a 39°C e após 3 horas a 35°C na ausência de substrato. A enzima mostrou-se estável na faixa de pH 5,7 a 6,3 após 24 horas de incubação a 5°C. Os valores de Km e Vmáx da enzima purificada foram respectivamente, 138mM de sacarose e 9,81 µmol de isomaltulose/minuto/mg de proteína. A atividade de glicosiltransferase não foi afetada por KCL MgS04, CaCh, NaCI, Na2HAsO4 na concentração 10mM, em relação ao volume final da mistura de reação, enquanto que os sais de CoCh, ZnCh, FeCh e CUSO4 não afetaram sua atividade nas concentrações de O,lmM e 1,0mM. Os sais MnCl2 e Pb(CH3COO)2 na concentração de 0,1mM não inibiram a atividade de glicosiltransferase. A atividade residual de glicosiltransferase na presença de MnCl2, nas concentrações 1mM e 10mM, foi respectivamente 93,0% e 73,7% enquanto que na presença de Pb(CH3COO)2, nestas concentrações, a atividade residual foi 98,3% e 93,3%. O sal BaCl2 não inibiu a atividade da glicosiltransferase na concentração de 0,1mM. O sal AgNO3 inibiu cerca de 37% a atividade de glicosiltransferase na concentração de 0,1mM e inibiu completamente na concentração 1,0mM enquanto que o HgCl2 inibiu completamente a enzima na concentração 1mM em relação ao volume final de reação. Os reagentes ácido etilenodiaminotetracético e L-cisteína nas concentrações 0,1mM, 1,0mM e 10mM em relação ao volume final da mistura de reação não inibiram a atividade de glicosiltransferase. A atividade de glicosiltransferase não foi inibida pelos reagentes azida de sódio e dietilditiocarbamato de sódio nas concentrações 0,1mM e 1,0mM. O reagente p-cloromercuribenzoato inibiu a atividade de glicosiltransferase nas concentrações 0,1mM e 1,0mM e a atividade residual na presença do inibidor foram respectivamente 79,8% e 60,7%. O reagente N-bromosuccinimida inibiu cerca de 6% a atividade de glicosiltransferase na concentração 0,1mM e inibiu completamente a enzima na concentração 1,0mM. A iodoacetamida inibiu a atividade de glicosiltransferase na concentração final 1,0mM e 10,0mM e a atividade na presença do inibidor foram respectivamente 65,5% e 21,3%. O peso molecular da glicosiltransferase purificada da linhagem Erwinia sp. D- 12 foi estimado em 63.000 daltons através da filtração em gel Sephadex G -200. No estudo da aplicação da glicosiltransferase de Erwinia sp. D-12 na conversão de sacarose em isomaltulose utilizando-se solução 5% e 10% de sacarose foram obtidos rendimento de 73,5% e 72,3% de isomaltulose respectivamente, após 4 horas de reação a 40°C
Abstract: Three hundred and fourteen strains of microorganisms were isolated from honey, flowers, fruit, sugar cane juice, sugar cane molasses and must samples obtained from alcohol and sugar producing plants and examined for their capacity to produce glycosyltransferase, which converts sucrose to isomaltulose (6-0-a-D-glucopyranosll-D-fructofuranose). Isomaltulose, also known as palatinose, has low cariogenic activity and has been used in the production of candies, chewing gums and confectionary products. The glucosiltransferase producing strain was selected and identified as Erwinia sp. according to its morphological and biochemical characteristics. The production, purification and biochemical characterization of intracellular glucosyltransferase from the strain Erwinia sp. D-12 was studied. The production of glucosyltransferase was performed in a 2L jar fermentor using the following medium: 6% sucrose, 6% peptone and 0.4% meat extract. It was shown that the enzyme was produced during the exponential growth phase and maximum activity was verified after three hours of fermentation at 28°C or after 4 hours fermentation at 30°C or 35°C. The enzyme was purified by DEAE-Sephadex A-50 and DEAE-Sepharose CL-6B column chromatography. The purified glucosyltransferase showed optimum activity at pH 6.0 and 40°C. The purified glucosyltransferase is thermosensitive and was inactivated after one hour of treatment at temperatures above 39°C or after 3 hours at 35°C in the absence of substrate. The enzyme was stable between pH 5.7 and pH 6.3 after 24 hours incubation at 5°C. The kinetic parameters Km and Vmax with respect to sucrose were 138mM and 9.81µmol of isomaltulose/minute/mg protein respectively. The glycosyltransferase activity was not affected by KCI, MgSO4, CaCl2, NaCl, NaHAsO4 at concentrations of 10mM with respect to the [mal volume ofthe reaction mixture while the salts CoCh, ZnCl2, FeCl2 and CUS04 did not affect its activity at concentrations of O.lmM and 10mM: The salts MnCh and Pb(CH3COO)2 did not inhibit glucosyltransferase activity at a concentration of 0.1mM. The residual activity of glucosyltransferase in the presence of 1mM and 10mM MnCl2 was respectively 93.0 and 73.7%, whereas in the presence of Pb(CH3COO)2 at the same concentrations it was 98.3 and 93.3%. The salt BaCl2 did not inhibit glucosyltransferase activity at a concentration of 0,1mM. The salt AgNO3 inhibited about 37% of the glucosyltransferase activity at a concentration of 0.1 mM and completely inhibited it at a concentration of 1.0mM. The salt HgCl2 completely inhibited the enzyme activity at a concentration of 1mM with respect to the final volume of the reaction mixture. Ethylenediaminetetraacetic acid and L-cystein at concentrations of 0.1, 1.0 and 10mM with the respect to the final volume of the reaction mixture did not inhibit glucosyltransferase activity. The enzyme was not inhibited by sodium azide or sodium diethyldithyocarbamate at concentrations of 0.1 and 1.0mM. The p-chloromercuribenzoate reagent at concentrations of 0.1mM and 1.0mM inhibited glucosyltransferase activity, resulting in residual activity of 79.8 and 60.7% respectively. The N-bromosuccinimide reagent inhibited about 6% of the glucosyltransferase activity at a concentration of 0.lmM and completely inhibited it at a concentration of 1.0mM. Iodoacetamide inhibited glucosyltransferase activity at concentrations of 1.0 and 10.0 mM, resulting in residual activity of 65.5 and 21.3% respectively. The molecular weight of purified glucosyltransferase was determined as being 63.000 daltons by Sephadex G-200 gel filtration. The application of glucosyltransferase from Envinia sp. D-12 in the conversion of sucrose to isomaltulose was studied using 5 and 10% sucrose solutions, giving yields of 73.5 and 72.3% after 4 hours of reaction at 40°C
Mestrado
Mestre em Ciência de Alimentos

A parede celular de plantas é formada basicamente por celulose, hemicelulose e lignina. A formação dos polímeros de hemicelulose depende do suprimento de precursores chamados de açúcares-nucleotídeos. A biossíntese das diferentes estruturas de hemicelulose da parede celular envolve a participação de enzimas pertencentes às famílias das glicosiltransferases (GTs). Estudos feitos em Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon, Oryza sativa (arroz) e Zea mays (milho) auxiliaram na descoberta de 11 enzimas da via de interconversão nucleotídeo-açúcar e de enzimas da família das glicosiltransferases (GTs), como as GT2, GT8, GT43, GT47, GT61 e GT75, envolvidas na biossíntese de hemicelulose. O presente trabalho visa a identificação de genes da via de biossíntese de hemicelulose da parede celular de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) e análise filogenética entre Arabidopsis thaliana (planta modelo de eudicotiledôneas), Oryza sativa, Brachypodium distachyon, Zea mays, Sorghum bicolor e Saccharum spp. Foram identificados os genes das famílias GT2, GT8, GT43, GT47, GT61, GT75, CSL, Epimerase e UDPG em cana-de-açúcar a partir da busca em sete bibliotecas de RNA-Seq utilizando as sequências de O. sativa, Z. mays e S. bicolor como referência. Os domínios específicos de cada família gênica foram confirmados através do programa PFAM e consequentemente anotados. A identificação e anotação das sequencias possibilitou a construção de bancos de sequências das famílias envolvidas na biossíntese de hemicelulose para as espécies A. thaliana, B. distachyon, O. sativa, Z. mays e S. bicolor. Foram identificadas para cada espécie, respectivamente, um total de 67, 49, 49, 60 e 56 genes bona fides. O presente trabalho, além da identificação de genes nas diferentes espécies, permitiu a identificação e seleção de 27 genes candidatos envolvidos na biossíntese de hemicelulose em cana-de-açúcar e possivelmente envolvidos na recalcitrância da parede celular nas diferentes bibliotecas de RNA-Seq de cana-de-açúcar.
The plant cell wall is mainly composed of cellulose, hemicellulose and lignin. The formation of hemicellulose polymers lies on the supply of the so-called sugar-nucleotide precursors. The diverse hemicellulose structures biosynthesis of cell wall involves the participation of enzymes belonging to the families of glycosyltransferases (GTs). Studies in Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon, Oryza sativa (rice) and Zea mays (corn) aid the discovery of 11 enzymes of the nucleotide sugar interconversion pathway and enzymes of the GT family, as GT2, GT8, GT43, GT47, GT61 e GT75, involved in the hemicelluloses biosynthesis. This study aims to the identification of hemicellulose biosynthesis pathway genes from the cell wall of sugarcane (Saccharum spp.) and phylogenetic analysis of Arabidopsis thaliana (eudicotyledonous plant model), Oryza sativa, Brachypodium distachyon, Zea mays, Sorghum bicolor and Saccharum spp. The genes of the GT2, GT8, GT 43, GT47, GT61, GT75, CSL, epimerase and UDPG families were identified in sugarcane from a search in seven RNA-Seq libraries using the sequences of O. sativa, Z. mays and S. bicolor as reference. The specific domains of each gene family have been confirmed through the PFAM program and consequently noted. The identification and annotation of the sequences enabled the construction of sequences banks of the families involved in hemicellulose biosynthesis in the species A. thaliana, B. distachyon, O. sativa, Z. mays and S. bicolor. It was identified for each species, respectively, a total of 67, 49, 49, 60 and 56 bona fides genes. This work, in addition to the identification of genes in different species, allowed the identification and selection of 27 candidate genes involved in the biosynthesis of hemicelluloses in sugarcane and possibly involved in cell wall recalcitrance in the different sugarcane RNA-Seq libraries.

As Distrofias Musculares Progressivas constituem um grupo heterogêneo de doenças genéticas caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. Recentemente, associaram-se defeitos do mecanismo de glicosilação da proteína α-DG com diversos tipos de distrofias musculares graves. Alterações nesse processo constituem, portanto um novo mecanismo patogenético nas doenças neuromusculares, abrindo novas possibilidades de estudo. Neste sentido, foram objetivos deste trabalho avaliar o perfil de expressão dos genes envolvidos na glicosilação da proteína α-DG em modelos murinos e em pacientes, e tentar relacionar com os diferentes processos distróficos. Verificamos que tanto camundongos normais como distróficos expressam os genes codificantes das glicosiltransferases na seguinte ordem: Pomgnt1>Large>Fkrp>Pomt1, em todas as idades e em todas as linhagens estudadas, sugerindo um mecanismo constante de regulação gênica, independente do crescimento, envelhecimento ou processo distrófico. Também observamos que a sua expressão não é influenciada pelo processo de degeneração/regeneração, uma vez que não houve concordância entre os animais com músculos mais afetados e degenerados (Largemyd e Lama2dy2J/J) e aqueles com músculos menos degenerados (Dmdmdx e SJL/J), e esse padrão se mantém quando se comparam músculos com graus de degeneração diferentes. Nos animais recém-nascidos, verificou-se um aumento de expressão significativo nas linhagens Dmdmdx e Largemyd e uma queda nas linhagens Lama2dy2J/J e SJL/J. Já nos animais adultos, verificou-se maior semelhança ao perfil dos camundongos controles normais da mesma idade, com exceção do gene Large que apresentou expressão diminuída em quase todos os animais em estudo. No músculo humano, observamos uma ordem do nível de expressão diferente do observado em camundongos, com POMT1>POMGnT1>FKRP>LARGE. Os pacientes com DMD apresentaram um aumento da expressão de todos os genes estudados, de forma similar ao observado no grupo de camundongos Dmdmdx recém-nascidos, sugerindo uma associação com a falta de distrofina. Os pacientes LGMD 2I não apresentaram redução significativa da expressão de FKRP, sugerindo que o processo de transcrição é normal, mas a tradução ou a função/atividade da enzima deve estar comprometida. Nos pacientes CMD 1A, onde a deficiência primária da α2-laminina não está associada a defeito de glicosilação da α-DG, observou-se redução na expressão de POMT1 e FKRP, sugerindo que, a deficiência dessas enzimas possivelmente não altera este processo. Na análise de proteínas, não se observou uma correlação direta com os resultados da expressão gênica das glicosiltrasferases, sugerindo mais uma vez que, por serem enzimas, essas proteínas funcionam de forma diferenciada quando comparadas a proteínas estruturais. Entretanto, nas reações com os anticorpos Anti-POMT1 e Anti-FKRP, os camundongos recém-nascidos apresentaram bandas adicionais de peso molecular maior, sugerindo que essas enzimas estão ligadas a outras proteínas ou entre si nos estágios iniciais de desenvolvimento muscular
Muscular Dystrophies (MD) are a heterogeneous group of genetic diseases characterized by progressive and irreversible degeneration of skeletal muscle. Recently, defects in α-DG glycosylation have been associated with different types of severe forms of muscular dystrophies. Therefore, alteration in this mechanism has been considered an important pathogenetic cause of muscle degeneration, opening new avenues for therapies. The main objective of this study is to evaluate the expression cascade of genes involved in the glycosylation of α-DG in murine models and in patients with different molecular defects causing MD. We found that both normal and dystrophic mice express the glycosyltransferases genes in the following quantitative order: Pomgnt1>Large>Fkrp>Pomt1, in all ages and in all studied strains, suggesting a constant mechanism of gene regulation, independent of growth, aging or dystrophic process. We also observed that this pattern of expression is not related to the degeneration/regeneration process, since there was no concordance between the animals with the most degenerated muscles (Largemyd and Lama2dy2J/J) or the less degenerated muscles (Dmdmdx and SJL/J). Additionally, both gastrocnemius (less degenerated in Dmdmdx) and diaphragm (more degenerated in Dmdmdx) presented the same pattern of expression. In newborn animals, a significant increased expression was observed in Dmdmdx and Largemyd and a decrease in Lama2dy2J/J and SJL/J. In adult animals, the expression profile of Pomt1, Pomgnt1 and Fkrp was similar in normal and affected mice, while Large showed a decreased expression in almost all affected animals. In human muscle, the quantitative order of expression of the 4 genes was: POMT1>POMGnT1>FKRP>LARGE, different from the mice. DMD patients showed an increased expression of all the studied genes, in a pattern similar as the observed in the newborns group of the murine Dmdmdx model, suggesting an association with the lack of protein dystrophin. LGMD 2I patients showed no significant reduction in FKRP expression, indicating a normal transcriptional process. In CMD 1A patients, there was a reduction in POMT1 and FKRP expression, in spite of a normal α-DG glycosylation observed in this disease, suggesting that the deficiency of these enzymes may not alter this process. At the protein level, we did not observe a direct correlation between protein quantities of glicosiltrasferases and gene expression, suggesting that enzymes regulation functions differently as compared with structural proteins. Interestingly, antibodies for POMT1 and FKRP detected, in newborn mice, additional bands of higher molecular weight, suggesting that these enzymes are linked to each other or with other proteins in the early stages of muscle development

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-03-10T13:25:39Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) tese juliana vasconcelos.pdf 2.pdf: 2676689 bytes, checksum: 3be9c8d80ebc1f51f2479aaec4fe30ce (MD5)
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CNPQ
O câncer de mama é o tipo de tumor que mais acomete as mulheres no mundo. No Brasil estimam-se para 2016/2017, 57.960 novos casos de câncer de mama por ano. O desenvolvimento destes tumores envolve um mecanismo complexo e multifatorial, onde glicosiltransferases e microRNAs (miRNAs) desempenham papeis importantes. O objetivo deste estudo foi avaliar a galactosiltransferase 7 (GALNAC7) e o miRNA 30c no carcinoma ductal invasivo mamário (CDI). Nosso estudo demonstrou, uma baixa expressão do antígeno Tn nos tumores mamários, diante da baixa expressão da GalNAC7 e do seu carboidrato-substrato N-acetil-galactosamina (GalNAc). O estudo evidenciou, também, que o gene GALNT7 não apresenta influência significativa quanto a um prognostico reservado para CDI, diante de sua baixa expressão gênica e proteica, demostrando que o mecanismo de O-glicosilação na formação de mucinas pode ser estimulado, também, por outros genes da família GALNT, porém observamos que o gene GALNT7 pode ser modulado pelo o miRNA 30c frente ao aumento de sua expressão nos tumores estudados, levantando a hipótese de um novo alvo diagnóstico e terapêutico via modulação da expressão de genes da glicosilação. A análise dos dados clínicopatologicos, não demonstrou correlação significativa, com exceção da expressão de GalNAc e tamanho do tumor. Diante da análise do segmento clínico de cada paciente, na curva de sobrevida, não houve resultados significativos quando comparados com os subtipos moleculares, estadiamento clínico, idade e tamanho do tumor. Assim, nossos resultados sugerem que o miRNA 30c pode ser um potencial regulador da expressão do gene GALNT7 e que assim favorece a menor expressão da enzima GALNAC7 levando a uma menor inserção do carboidrato GalNAc nos glicoconjugados de superfície de células de carcinoma ductal invasivo.
Breast cancer is the most common cancer in women in world. In Brazil, it is estimated 57,960 new cases of mammary cancers per year in 2016/2017. The development of these tumors comprises a complex and multifactorial mechanism where glycosyltransferase and microRNAs (miRNAs) play important roles. This study aimed to evaluate the galactosyltransferase 7 (GALNAC7) and the miRNA-30c in mammary invasive ductal carcinoma (IDC). Our results showed a low expression of Tn antigen in mammary tumors resulting from the low expression of GALNAC7 which leads to a low insertion of its saccharidesubstrate N-acetyl-galactosamine (GalNAc) in tumor cell glycoconjugates. The study also evidenced that the gene GALNT7 did not influenced the poor prognostic of IDC, since a low gene expression and, consequently, a low protein expression was observed. Such fact indicates that other genes of the GALNT family may stimulate the O-glycosylation. However, we observed that miRNA-30c might modulate GALNT7 expression and can be a new potential target for diagnosis and therapeutic via modulation of the expression of glycosylation genes. Among the clinocopathologic data, only GalNAc expression and tumor size present a correlation. Patient’s survival curve did not present correlation with tumor molecular subtyping, clinic staging, age and tumor size. Our results suggest that miRNA-30c may be a potential regulator of the GALNT7 gene expression and so favoring a lower expression of the enzyme GALNAC7 leading to a lower insertion of the saccharide GalNAc in glycoconjugates of cell surface in invasive ductal carcinoma.

Orientador: Helia Harumi Sato
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
Made available in DSpace on 2018-08-12T13:27:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Orsi_DanielaCastilho_D.pdf: 2624783 bytes, checksum: add51ff0035724efe97b8947a93c9d67 (MD5) Previous issue date: 2008
Resumo: A sacarose é o principal açúcar utilizado no processamento de alimentos, contudo, o consumo excessivo e não balanceado de alimentos com alto teor de sacarose contribui para a prevalência de doenças como obesidade e cáries dentárias. Nas últimas décadas, tem ocorrido um aumento do interesse pela produção de novos açúcares como alternativa para substituir a sacarose. A isomaltulose (O-a-D-glicopiranosil-1,6-frutofuranosídeo) é um açúcar pouco cariogênico e isômero estrutural da sacarose, encontrada naturalmente no mel em pequenas quantidades. A bactéria Serratia plymuthica ATCC 15928 produz a enzima glicosiltransferase e catalisa a conversão da sacarose em isomaltulose. Neste trabalho, utilizou-se a metodologia de superfície de resposta para estudar o efeito dos componentes do meio de cultivo na produção de glicosiltransferase pela bactéria Serratia plymuthica em frascos sob agitação a 200 rpm e 30ºC. Foi obtida alta produção de glicosiltransferase (14,26 UA/mL, média dos pontos centrais) utilizando-se o meio de cultivo 1, composto de 40 g/L de melaço de cana de açúcar, 15 g/L de peptona bacteriológica da BiobrásÒ e 20 g/L de extrato de levedura Prodex Lac SDÒ. O meio de cultivo 2 (40 g/L de melaço de cana de açúcar e 20 g/L de extrato de levedura Prodex Lac SDÒ), além de render ótima produção de glicosiltransferase (13,54 UA/mL, média dos pontos centrais), teve seu custo reduzido por ser formulado sem a adição do componente peptona bacteriológica da BiobrásÒ. Foi estudado o efeito da temperatura (26ºC, 28ºC e 30ºC) na fermentação da bactéria Serratia plymuthica para produção de massa celular e de glicosiltransferase em fermentador de 6,6 L. A maior produção de glicosiltransferase ocorreu após 6 horas de fermentação na temperatura de 26ºC, sendo obtida atividade enzimática de 25,97 UA/mL. As células livres da bactéria Serratia plymuthica foram utilizadas para a conversão de sacarose em isomaltulose. Utilizando-se concentração de massa celular úmida de 20% (p/v) e concentração de solução de sacarose de 25% (p/v) obteve-se alta porcentagem de isomaltulose (84,33%, valor médio dos meios de cultivo 1 e 2) após 2 horas de reação a 27ºC, em frascos sob agitação a 180 rpm. As células livres cultivadas em meio de cultivo 2 (sem adição de peptona bacteriológica da BiobrásÒ) foram reutilizadas por nove bateladas sucessivas e obteve-se eficiente conversão de sacarose em isomaltulose (75,20%, média das bateladas). Foi estudada a produção de isomaltulose a partir de sacarose por células da bactéria Serratia plymuthica imobilizadas em alginato de cálcio. A conversão de sacarose em isomaltulose pelas células imobilizadas foi feita em bioreatores de leito empacotado mantidos a temperatura de 25°C. O tratamento das células imobilizadas em alginatoSynthÒ 2% com glutaraldeído aumentou a atividade enzimática, sendo obtida conversão de sacarose em isomaltulose acima de 64% por 15 dias. A goma gelana KELCOGELÒ F foi utilizada como suporte para imobilização das células de Serratia plymuthica. As células imobilizadas em goma gelana tratadas com glutaraldeído foram secas por 36 horas, sob refrigeração a 10°C. As células imobilizadas foram transferidas para bioreatores mantidos a 25ºC e usadas na conversão contínua de sacarose em isomaltulose. Quando as células imobilizadas secas foram utilizadas no processo contínuo, a conversão de sacarose em isomaltulose manteve-se acima de 69% por 15 dias. Esse estudo demonstrou a possibilidade do uso da goma gelana KELCOGELÒ F como suporte para imobilização das células de Serratia plymuthica. O suporte utilizado combina a simplicidade na técnica de imobilização celular, boa estabilidade operacional e altas taxas de bioconversão
Abstract: Sucrose is the main sweetener used in food processing, but, the excessive and imbalanced consumption of high-sucrose foods is a contributory factor in obesity and dental caries. In the last few decades, the production of new sweeteners as alternatives to sucrose has aroused great interest. Isomaltulose (O-a-D-glucopyranosyl-1,6- fructofuranose) is a low cariogenic sweetener and a structural isomer of sucrose, naturally present in honey in small quantities. The bacteria Serratia plymuthica ATCC 15928 produces the enzyme glucosyltransferase and catalyses the conversion of sucrose into isomaltulose. In this work, response surface methodology was applied to study the effect of culture medium components in the production of glucosyltransferase by Serratia plymuthica in shaken flasks at 200 rpm and 30ºC. Higher glucosyltransferase production (14.26 UA/mL, average of the central points) was obtained in culture medium 1, composed of 40 g/L of sugar cane molasses, 15 g/L of BiobrásÒ bacteriological peptone and 20 g/L of Prodex Lac SDÒ yeast extract. Culture medium 2 (40 g/L of sugar cane molasses and 20 g/L of Prodex Lac SDÒ yeast extract, formulated without the component BiobrásÒ bacteriological peptone, resulted in a low cost medium and optimized glucosyltransferase production (13.54 UA/mL, average of the central points). The influence of temperature (26ºC, 28ºC and 30ºC) on the growth of the bacterium Serratia plymuthica for cell mass and glucosyltransferase production in a 6.6 L bioreactor, was also studied. The highest production of glucosyltransferase (25.97 UA/mL) was obtained in culture medium 1 after 6 hours at 26ºC. Free Serratia plymuthica cells were used for the conversion of sucrose into isomaltulose. A higher isomaltulose production (84.33%, mean value for culture media 1 and 2) was obtained at a temperature of 27ºC, 20% (w/v) wet cell mass and 25% (w/v) sucrose solution after 2 hours of reaction in shaken flasks at 180 rpm. The free cells cultivated in the culture medium 2 (without BiobrásÒ bacteriological peptone) were reused for nine successive batches, with efficient conversion of sucrose into isomaltulose (75.20%, average of the batches). Furthermore, the conversion of sucrose into isomaltulose using Serratia plymuthica cells immobilized in calcium alginate was also studied. The continuous production of isomaltulose by immobilized cells was accomplished in packed bed bioreactors maintained at 25°C. The treatment of cells immobilized in 2% SynthÒ alginate with glutaraldeyde increased enzyme activity obtaining an isomaltulose production of over 64% for 15 days. The gellan gum KELCOGELÒ F was also used as a support in the immobilization of Serratia plymuthica cells. The cells immobilized in gellan gum and treated with glutaraldeyde, were dried for approximately 36 hours at 10°C and used for the continuous production of isomaltulose. The immobilized cells were packed into bioreactors maintained at 25°C. When dry immobilized cells were used in the continuous process, the conversion of sucrose into isomaltulose was over 69% for about 15 days. This study demonstrated the feasibility of using KELCOGELÒ F gellan gum as a support in the immobilization of Serratia plymuthica cells. This support used combines the simplicity of the immobilization technique with good operational stability and high levels of bioconversion
Doutorado
Doutor em Ciência de Alimentos

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Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq
Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) is an important industrial enzyme for being the only one able to convert starch and related glucans in cyclic oligosaccharides called cyclodextrins (CDs). The arrangement of the glucose units in the formation of CD results in a molecule with the shape of a cone, with hydrophobic interior and hydrophilic surface. This arrangement of glucose molecules in CDs allows its use as a host molecule in the formation of inclusion complexes with organic and inorganic compounds. This mechanism is advantageous in protecting the guest molecule from light, heat and oxidizing conditions and also enable the "dissolution" of compounds of low solubility in aqueous media. Cyclodextrins are used from the food industry to the pharmaceutical, in controlled drug delivery systems and immobilization of toxic compounds for environmental protection. The CGTases are mainly produced by bacteria of the genus Bacillus, found degrading starch rich substrates. The aim of this study was to identify, isolate, select and characterize strains of CGTase-producing bacteria from soil samples from different regions of Brazil as well as calculate the enzymatic production of these bacteria on low-cost substrates. With this work, it was possible to identify 17 bacteria producing cyclodextrin glycosyltransferase enzyme, with nine of them had values above 1.5 for enzymatic production. Of these, all were characterized as gram positive Bacillus. Bioprospecting of bacteria in soils of different cultures led to the identification of bacteria that may be used in studies for the production of cyclodextrin glycosyltransferase and subsequent implementation by various industries.
Ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) é uma enzima industrial importante, sendo a única capaz de converter o amido e glucanos afins em oligossacarídeos cíclicos chamados ciclodextrinas (CDs). O arranjo das unidades de glicose na formação da CD resulta em uma molécula com a forma de cone, com interior hidrofóbico e superfície hidrofílica. Este arranjo das moléculas de glicose permite seu uso como molécula hospedeira na formação de complexos de inclusão com compostos orgânicos e inorgânicos. Este mecanismo é vantajoso na proteção de moléculas contra luz, calor e condições oxidantes e também possibilita melhorar a solubilidade de compostos hidrofóbicos. Ciclodextrinas são utilizadas desde a indústria de alimentos até a farmacêutica, em sistemas de liberação controlada de drogasse e imobilização de compostos tóxicos para proteção ambiental. As CGTase são principalmente produzidas por bactérias do gênero Bacillus, encontradas degradando substratos ricos em amido. O objetivo deste estudo foi identificar, isolar, selecionar e caracterizar linhagens de bactérias produtoras de CGTase a partir de amostras de solo de diferentes regiões do Brasil bem como calcular o índice enzimático destas bactérias em substratos de baixo custo. Com a realização deste trabalho, foi possível identificar 17 bactérias produtoras da enzima ciclodextrina glicosiltransferase, sendo que nove delas apresentaram valores para índice enzimático acima de 1,5. Destas, todas foram caracterizadas como sendo Bacillus gram positivos. A bioprospecção de bactérias em solos de diferentes culturas possibilitou a identificação de bactérias que poderão ser usadas em estudos para a produção da ciclodextrina glicosiltransferase e posterior aplicação pelas mais diversas indústrias.

El ácido salicílico (SA) juega un papel fundamental en la respuesta defensiva de las plantas. Este compuesto se acumula en las mismas como consecuencia de infecciones patogénicas de tipo incompatible, y su aplicación exógena induce resistencia. Asimismo, plantas transgénicas incapaces de acumularlo presentan una mayor susceptibilidad a patógenos de distinta naturaleza. Por otra parte, el ácido gentísico (GA, ácido 2,5-dihidroxibenzoico) se acumula en plantas en infecciones compatibles no necrotizantes. La aplicación exógena de GA induce un conjunto de proteínas de defensa PR (Pathogenesis related) distintas a las que induce el SA, por lo que podría tener un papel complementario en la señalización frente a patógenos en plantas. Ambos compuestos se acumulan en plantas en forma de glicósidos, es decir, conjugados a una o más moléculas de azúcar. Estas reacciones de conjugación son catalizadas por proteínas denominadas glicosiltransferasas. En plantas de tomate el SA se acumula como SA 2-O-ß-glucósido, unido a una molécula de glucosa, mientras el GA lo hace en forma de GA 5-O-ß-xilósido, unido a xilosa. GAGT (Gentisic Acid Glycosyl Transferase) ha sido descrita como la proteína que conjuga GA en tomate. Dado que la glicosilación de metabolitos es una forma rápida de inactivarlos, la existencia de esta proteína con actividad conjugadora de GA refuerza la idea del ácido gentísico (GA) como molécula señal complementaria al SA en la interacción planta-patógeno. Por otra parte, la proteína Twi1 (Tomato wound inducible), descrita en tomate como una posible glicosiltransferasa debido a sus características comunes con este grupo de proteínas, presenta inducción por SA y otros compuestos de naturaleza fenólica, además de herida e interacciones de tipo incompatible. Trabajos en los que se ha llevado a cabo la sobreexpresión o el silenciamiento de una GT han puesto de manifiesto cómo ello conlleva la aparición de resistencia o susceptibilidad frente a una infección patogénica. Por tanto, las GTs tienen un papel fundamental en la respuesta defensiva de la planta, modulando los niveles de moléculas que intervienen en dicha respuesta. Por otra parte, se han realizado estudios dirigidos a elucidar la implicación de compuestos del metabolismo secundario en la interacción de plantas de tomate con distintos patógenos. Ello ha permitido detectar cambios concretos de los niveles de un número determinado de metabolitos a lo largo de las infecciones, como son cuatro amidas derivadas del ácido hidroxicinámico (HCAAs) que se acumulan en plantas de tomate infectadas con la bacteria Pseudomonas syringae pv. tomato. Las HCAAs son un conjunto de metabolitos, pertenecientes al grupo de los fenilpropanoides, de bajo peso molecular y que se caracterizan por la presencia de nitrógeno en su estructura. En su ruta de biosíntesis participan diversos enzimas tales como la fenilalanina amonio liasa (PAL), la tirosina descarboxilasa (TYDC) o la tiramina hidroxicinamoil transferasa (THT). La acumulación en tomate de las cuatro amidas como consecuencia de la infección bacteriana va acompañada de la inducción del isoenzima THT1-3. La obtención de plantas transgénicas que sobreexpresen o silencien las proteínas GAGT, Twi1 y THT1-3 permitirá llevar a cabo ensayos de resistencia frente a infecciones patogénicas que contribuyan al conocimiento del sistema defensivo de las plantas, tanto en sus aspectos de señalización como en los referidos a componentes de la respuesta final de la planta. Al mismo tiempo, esta estrategia puede constituir, en sí misma, un medio de obtención de plantas más resistentes frente a ataques patogénicos de diversa naturaleza.
Campos Beneyto, L. (2014). Metabolitos secundarios de naturaleza fenólica: papel en la respuesta defensiva de plantas de tomate [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/44236
TESIS

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-04-08Bitstream added on 2014-06-13T19:40:50Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_ds_dr_sjrp.pdf: 1933738 bytes, checksum: baca389347279bb3f5a0eea7681d038d (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
O desenvolvimento da tecnologia de pães é um fenômeno de grande impacto na indústria de alimentos. Ao longo dos anos vários aditivos foram incorporados à tecnologia de panificação, elevando a qualidade destes produtos e fazendo crescer a sua aceitação pela população em geral. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos sobre a qualidade do pão e sobre o processo de envelhecimento, da adição de enzimas na massa. As enzimas usadas foram xilanase produzida pelo fungo Thermoascus aurantiacus CBMAI 756 nas concentrações de 20, 35 e 50U/100 g de farinha de trigo e/ou da ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) produzida pela bactéria Bacillus clausii E16 nas concentrações de 15 e 30U/100 g de farinha de trigo, parcialmente purificadas. O mecanismo de ação dessas enzimas sobre os seus respectivos substratos arabinoxilana e amido, respectivamente, também foram avaliadas. Os pães adicionados de xilanase, CGTase e xilanase/CGTase foram produzidos em três etapas distintas. Para o estudo do envelhecimento os pães foram mantidos a temperatura de 4ºC durante 10 dias, e foram avaliados quanto à perda de água, a textura e a retrogradação da amilopectina. Os produtos obtidos pela ação da xilanase e CGTase sobre as arabinoxilanas e o amido, respectivamente, isolados da farinha de trigo, foram analisados por HPAEC-PAD e HPLC. O fungo T. aurantiacus exibiu uma variação no perfil enzimático de acordo com cada substrato usado no seu cultivo. O substrato que resultou no melhor perfil enzimático para o uso em panificação foi o sabugo de milho, porque esse extrato enzimático exibiu alta atividade xilanolítica e baixa atividade amilolítica e proteolítica. A adição de xilanase, CGTase e xilanase/CGTase aumentou o volume da massa e o volume específico dos pães. Quanto ao...
The development of bread technology is a phenomenon of great impact on food industry. For years, many additives were used on bread technology, increasing the bread quality and improving the acceptance of general population. The aim of this work was to study the effects on the bread quality and on the staling process, by adding enzymes to the dough. The enzymes used were xylanase from the fungus Thermoascus aurantiacus CBMAI 756 in the concentrations 20, 35 and 50U/100 g wheat flour and/or cyclodextryn glycosiltransferase (CGTase) from the bacteria Bacillus clausii E16 in the concentration 15 and 30U/100 g wheat flour, partially purified. The action mechanisms of these enzymes under the substrates arabinoxylan and starch, respectively, were also evaluated. The breads added of xylanase, CGTase and xylanase/CGTase were produced in three distinct stages. For bread staling study, the breads were stored at 4ºC for 10 days, and they were analyzed regarding to the moisture content, texture and amylopectin retrogadation. The products obtained by the action of xylanase and CGTase on arabinoxylans and starch, respectively, isolated from wheat flour, were analyzed by using HPAEC-PAD and HPLC. The fungus T. aurantiacus exhibited a variation on the enzymatic profile according to each substrate used on its cultivation. The substrate which resulted in a better enzymatic profile for using on breadmaking was corncob, since this enzymatic extract exhibited high xylanolytic activity and low amylolytic and proteolytic activities. The addition of xylanase, CGTase and xylanase/CGTase increased the dough volume and the specific volume of the breads. Regarding to the staling study, the enzymes added separated or together reduced amylopectin retrogradation and firmness of the crumb during storage, when compared... (Complete abstract click electronic access below)

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CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Cáries dentárias resultam de um desequilíbrio metabólico do biofilme dental, formado por bactérias, principalmente estreptococos e lactobacilos. Uma das formas de prevenir o processo carioso seria inibir a formação deste biofilme cariogênico. Este trabalho, portanto, objetiva verificar a inibição da formação de biofilme dentário formado por Streptococcus mutans (S. mutans) através da ação de quatro substâncias (epigalocatequina, clorexidina, xilitol e resveratrol), e verificar o provável mecanismo de ação a partir da expressão gênica das enzimas glicosiltransferase (GTF) e frutosiltransferase (FTF). O ensaio de reação de cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) foi realizado para quantificar a expressão dos genes. Foram realizados ainda, ensaios de viabilidade celular e para verificação de formação de biofilme após tratamento com as substâncias testes para determinar concentrações em que houvesse inibição da formação de biofilme em condições de viabilidade celular. As concentrações de xilitol, resveratrol e clorexidina que se mostraram eficazes foram 100 mg/mL, 0,1 mg/mL e 0,001 mg/mL, respectivamente, ou seja, concentrações nas quais houve inibição da formação de biofilme sem modificação da viabilidade bacteriana. A epigalocatequina não apresentou uma concentração que proporcionasse inibição de biofilme sem a consequente morte bacteriana. Os tratamentos foram realizados com o xilitol, o resveratrol e a clorexidina, e após realização de RT-qPCR (reação de cadeia de polimerase quantitativa em tempo real de transcrição reversa) foram obtidos os resultados referentes à expressão dos genes ftf e gtfb. Houve uma diminuição significativa (72,8%) na expressão gênica do ftf após o tratamento com xilitol. O resveratrol não interferiu na expressão deste gene e a clorexidina provocou redução da expressão do gene de controle (housekeeping gene), inviabilizando a avaliação da expressão do ftf na concentração avaliada. Não houve modificação significativa na expressão de gtfb após o tratamento com o resveratrol e a clorexidina nas concentrações definidas. O xilitol reduziu a expressão do housekeeping gene 16S rRNA, indicando morte celular na concentração testada. Os resultados nos levaram a concluir que as três substâncias - resveratrol, xilitol e clorexidina - atuam como potenciais agentes inibidores de biofilme dentário formado por S. mutans. Verificou-se, entretanto, que o xilitol inibe a expressão do gene ftf, indicando que o provável mecanismo de ação de tal inibição da formação do biofilme foi através da redução da expressão deste gene do S. mutans. A clorexidina já possui reconhecida ação bactericida, entretanto neste trabalho verificamos uma concentração desta substância em que houve inibição de biofilme sem a consequente morte celular. Diante dos achados podemos propor outras formas de aplicação do xilitol e da clorexidina, em odontologia, e também a utilização do resveratrol como um agente inibidor do processo carioso, já que o mesmo é capaz de inibir a formação de biofilme dentário. A inibição do biofilme por estas substâncias seria interessante de modo que não geraríamos um desequilíbrio na flora bacteriana, mantendo, portanto, bactérias que atuam de forma positiva na cavidade bucal. Desta forma, outros estudos laboratoriais e clínicos são necessários 16 para demonstrar a eficácia de tais substâncias para prevenção ou até mesmo tratamento de cáries dentárias.
Dental caries results from a metabolic imbalance in the biofilm, formed by bacteria, especially streptococci and lactobacilli. One way of preventing caries process would be inhibit cariogenic biofilm formation. This work therefore aims to verify the possible inhibition of biofilm formation by Streptococcus mutans (S. mutans) after the treatment with four substances (epigallocatechin, chlorhexidine, xylitol and resveratrol), and to investigate the action mechanism through the expression of the genes glycosyltrasferase (GTF) and fructosyltransferase (FTF). The test of quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was carried out to quantify the expression of these enzymes. Cell viability assays as well as tests for verification of biofilm formation were also carried out after the treatment with the test substances to determine the concentration when the inhibition of biofilm formation occurred under conditions of cell viability.The xylitol, resveratrol and chlorhexidine concentrations that proved effective were 100 mg/ml, 0.1 mg/ml and 0.001 mg/mL, respectively, concentrations in which there was inhibition of biofilm formation without modification of the bacterial viability. The epigallocatechin didn’t demonstrate a concentration that would provide biofilm inhibition without the consequent inhibition of bacterial viability. The treatments were performed with xylitol, resveratrol and chlorhexidine, and after completion of RT-qPCR (reverse transcription real time polymerase chain reaction), they’re obtained the results for enzyme expression of FTF and GTFB. There was a significant decrease (72.8%) in the enzyme FTF expression after treatment with xylitol. The resveratrol didn’t affect the expression of this enzyme and chlorhexidine caused reduced gene expression control (housekeeping gene), precluding to evaluate the FTF gene expression in the assessed concentration. There was no significant change in GTFB expression after treatment with resveratrol and chlorhexidine in defined concentrations. Xylitol reduced housekeeping gene 16S rRNA expression, indicating cell death in the concentration tested. The results led us to conclude that the three substances (resveratrol, xylitol and chlorhexidine) act as potential dental biofilm inhibitors formed by S. mutans. It was found, however, that xylitol inhibits FTF gene expression, indicating that the probable mechanism of action of such inhibition of biofilm formation was by reducing the expression of this S. mutans gene. Chlorhexidine has already recognized bactericidal action, however this work we see a concentration of this substance that was inhibiting biofilm without subsequent cell death. Considering those findings may suggest other ways of applying the xylitol and chlorhexidine in dentistry and also the use of resveratrol as an inhibitory agent of the carious process, since it is capable of inhibiting dental plaque formation. Biofilm inhibition these substances would be interesting to such an extent that there would generate an imbalance in the bacterial flora, thus keeping bacteria that act in a positive manner in the oral cavity. Thus, clinical studies are necessary to demonstrate the efficacy of these substances to prevent or even caries treatment.

A soja (Glycine max (L.) Merrill) é considerada a principal fonte de proteína vegetal disponível e sua cultura é de grande importância mundial. O Brasil é o segundo maior produtor e exportador mundial. A elevada importância sócio-econômica da soja é atribuído principalmente a sua combinação de elevado teor de proteína e óleo juntamente com o rendimento de grãos. Embora a soja seja considerada uma fonte de proteína e óleo de alta qualidade para o alimento e alimentação, os grãos de soja possuem pelo menos três isoenzimas de lipoxigenase, lipoxigenase 1, 2 e 3. Essa três isoenzimas são responsáveis pela produção de odores e sabores desagradáveis nos grãos de soja limitando o desenvolvimento de produtos a base de proteína de soja para o consumo humano. A melhoria desse sabor foi conseguido através de tratamentos térmicos, extração com solventes orgânicos ou decomposição desse sabor por aldeino desidrogenase. Entretanto, estes tratamentos são caros e não enteiramente satisfatórios para matérias alimentícios porque podem diminuir consideravelmente a solubilidade da proteína. A eliminação genética das isoenzimas de lipoxigenase (Lox 1, Lox 2 e Lox 3) dos grãos de soja é uma maneira de superar os problemas associados com o sabor indesejável e a eliminação genética deste sabor pode ser acelerada atráves do uso de marcadores moleculares ligados a Lox. O objetivo do estudo foi mapear os locus L1, L2 e L3 utilizando marcadores moleculares e conseguir marcadores para realizar a seleção assistida de plantas de soja com ausência das três isoenzimas de lipoxigenases na semente. Foi contruido um mapa baseado em marcadores microssatélites (SSR) usando a população F2, oriundas do cruzamento entre as variedades BR 36 e BRS 213. Para análise da segregação de F2 foram considerados apenas dois genes, devido à forte ligação entre o locus L1 e L2. Os resultados foram confirmados pelos valores do teste de qui-quadrado, quando a segregação não foi estatisticamente significativa, ocorrendo de acordo com a segregação esperada, isto é, na disposição de 9:3:3:1 (9 ? presença de L1, L2 e L3; 3 ? ausência de L1 e L2; 3 ? ausência de L3; e 1 ? ausência de L1, L2 e L3). A segregação ocorreu também de forma esperada quando considerado os genes separadamente, isto é, na disposição de 3:1 (3 ? presença de L1, L2 e L3; 1 ? ausência de L1 e L2 ou L3). Os marcadores testados para Lox 1 e 2 apresentaram polimorfismo para os parentais, mas quando testados na população F2 não apresentaram polimorfismo. Foram encontrados oito marcadores polimorficos para Lox 3 nos grupos de ligação E e M. Baseado no resultado da análise de ligação entre Lox 3 e os marcadores SSR, Lox 3 foi posicionado no grupo de ligação E. Embora os marcadores do grupo de ligação M ter aprensentado polomofismo na estava ligado ao locus L3. Dessa forma, podemos dizer que o locus que controla a produção da isoenzima Lox 3 está localizado no grupo de ligação E. O marcador Satt 212 (SSR) foi integrado ao mapa de ligação obtido para o locus L3 definido a partir da população F2. Esse marcador está a uma distância de 24,1 cM da Lox 3.
Soybean (Glycine max (L. ) Merrill has been considered the main available source of vegetable protein and its culture has a worldwide relevance. Brazil is the second biggest producer and wordwide exporter. The high socioeconomic importace of soybean is mainly attributed to its much favorable combination of high protein and oil contents together with appropriate seed yield. Although soybean is considered a high quality source of oil and protein for food and feed, the soybean seeds contain at least three lipoxygenase isozymes, lipoxygenases 1, 2, and 3 (L1, L2, and L3). These isozymes are responsible or he production of unpleasant grassy and beany flavors in soybean seeds that have limited the development of soybean protein products for human consumption. Flavor improvement of soybean has been achieved through heat treatment, extraction with organic solvents or decomposition of beany flavor by aldehyde dehydrogenase. However, these treatments are expensive and not entirely satisfactory for food materials, because it may considerably decrease protein solubility. The genetic elimination of lipoxygenase (Lox 1, Lox 2 and Lox 3) enzymes from soybean seeds is a way to overcome the problems associated with the undesirable beany flavor of soybean seeds and genetic elimination of this flavor can be accelerated by using of molecular markers linked to Lox. The objective of this study was to map the L1, L2 and L3 loci and identify any markers to achieve in marker-assisted selection of plants lacking the three lipoxygenases in the seeds. A frame map based on simple sequence repeat (SSR) markers was constructed using a F2 population of BR 36 X BRS 213. To the segregation analysis of F2 was considered only two genes, due to the strong link between L1 and L2 loci. It was considered two genes segregating , due to the strong link between L1 and L2 loci. The results were confirmed by the chi-square test values, when the segregation was not statistically significant, occurring in accordance with the waited segregation and disposal 9:3:3:1 (9 - L1, L2 and L3 presence; 3 - L1 and L2 absence; 3 - L3 absence; and 1 - L1, L2 and L3 absence). When the genes were considered separately the segregation also occurred in waited pattern 3:1 disposal (3 - L1, L2 and L3 presence; 1 - L1 and L2 or L3 absence). Although the parental lines showed polymorphism for the tested markers for Lox 1 and 2 the F2 population did not presented polymorphism. Eight polymorphic markers were found for Lox 3 in the linkage group E and M. Based on the results of linkage analysis between Lox3 and the SSR markers, Lox 3 was found to be positioned on Linkage group E. Although markers from linkage group M had presented polymorphism they remained unlinked to locus L3. Regarding this, we can say that the locus responsible for the control of the isozyme Lox 3 is placed on the E link group. The Satt 212 marker (SSR) was integrated into the frame map obtained for locus L3 defined from the F2 population. This marker is 24.1 cM from locus Lox 3.

Cosmomicina é um antibiótico antitumoral produzido pela bactéria Streptomyces olindensis DAUFPE 5622. Estudos de expressão gênica demonstraram que genes cuja expressão esta relacionada a condições de estresse (dnaJ e 18hsp), assim como genes associados a via biossintética de cosmomicina, são expressos sob condições de produção do antibiótico. Genes que ainda tinham a função desconhecida foram selecionados (cosS e cosY) e foram realizados análises bioinformáticas destes atribuindo-lhes a função de regulador transcricional e ornitina ciclodesaminase, respectivamente. Um cassete para inativação desses genes foi construído visando a futura obtenção de mutantes nulos. Genes de glicosiltransferase (cosK e cosG) também apresentaram diferenças na expressão na presença do antibiótico. Neste trabalho, foi revelada a presença de uma hipotética glicosiltransferase que tem homologia com a B-daunosamine daunomy, glicosiltransferase envolvida na transferência de açúcares na biossíntese do antibiótico daunomicina.
Cosmomycin is an antitumoral antibiotic produced by the soil bacteria Streptomyces olindensis DAUFPE 5622. Gene expression studies established that stress condition genes like dnaJ and 18hsp, and cosmomycin biosynthetic pathways genes are expressed under antibiotic production. Also the genes cosS and cosY (unknowns function), were selected and analyzed by bioinformatics techniques attributing a transcriptional regulator and ornithine cyclodeaminase functions, respectively. A cassette was constructed in order to inactivate these two selected genes and generating void mutants. Another gene cosK, with glycosiltransferase function, also presented differences in its expression when the antibiotic is produced. We described in this work the presence of a hypothetical glycosiltransferase related with B-daunosamine daunomy, which transfers sugar molecules in the biosynthesis of daunomycin antibiotic.

La α-1,3-galactosiltransferasa (α3GT) està involucrada en la biosíntesis d'oligosacàrids antigènics responsables del rebuig immunològic hiperagut (HAR) en el xenotransplant d'òrgans d'animals a humans, per la qual cosa aquesta enzima té un particular interès en biomedicina. Per altra banda, la α3GT constitueix un model enzimàtic per a estudis mecanístics i estructurals de glicosiltransferasas. L'enzim transfereix galactosa (Gal) del UDP-Gal a la N-acetillactosamina (LacNAc), o a la lactosa (Lac).

Actualment, els estudis cristalogràfics han mostrat dos tipus d'estructures amb diferents conformacions en la zona C-terminal (aa.358-368). En la forma I, aquesta zona està altament desordenada, però en la forma II està ben definida, la qual cosa suggereix que funciona com a tapa que tanca el lloc catalític. Aquests canvis conformacionals suggereixen que l'extrem C-terminal podria tenir un rol clau en l'activitat catalítica.

En la present tesis doctoral es va abordar l'estudi estructural/funcional de l'extrem C-terminal des d'un enfocament d'anàlisi cinètic d'estabilitat de mutants d'alanina de cadascun dels aminoàcids de les posicions 358-368. D'aquesta manera, la comparació entre eficiència catalítica i estabilitat enzimàtica proporcionen un mètode que permet identificar els aminoàcids que tenen un paper important en la unió de lligand o en l'empaquetament estructural.

Pels mutants K359A, Y361A, V363A y R365A no s'ha detectat activitat, per la qual cosa aquestes posicions són fonamentals per a l'activitat α3GT. K359, Y361 i R365 interaccionen amb els fosfats del UDP-Gal, a més, K359A també interacciona amb l'hidroxil 3 de la lactosa segons modelització molecular, per la qual cosa s'ha proposat un paper d'àcid/base general a la lisina 359. Per altra banda, els mutants N367A i V368A van resultar ser de 2 a 3 vegades més actius que wt, respectivament.

Els estudis d'estabilitat revelen que wt i mutants de residus no involucrats directament en la interacció amb els substracts, presenten major estabilitat que aquells que segons els models moleculars i les estructures cristal·logràfiques interaccionen directament amb el UDP o UDP-Gal. Per altra banda, es va trobar que la presència de UDP disminueix en mutants de residus directament implicats en les interacciones amb el UDP-Gal.
La α-1,3-galactosiltransferasa (α3GT) está involucrada en la biosíntesis de oligosacáridos antigénicos responsables del rechazo inmunológico hiperagudo (HAR) en el xenotransplante de órganos de animales a humanos, por lo que esta enzima tiene un particular interés en biomedicina. Por otra parte, la α3GT constituye un modelo enzimático para estudios mecanísticos y estructurales de glicosiltransferasas. La enzima transfiere galactosa (Gal) del UDP-Gal a la N-acetillactosamina (LacNAc), o a la lactosa (Lac).

Actualmente, los estudios cristalográficos han mostrado dos tipos de estructuras con diferentes conformaciones en la zona C-terminal (aa.358-368). En la forma I, esta zona está altamente desordenada, pero en la forma II está bien definida, lo cual sugiere que funciona como tapa que cierra el sitio catalítico. Estos cambios conformacionales sugieren que el extremo C-terminal podría tener un rol clave en la actividad catalítica.

En la presente tesis doctoral se abordó el estudio estructural/funcional del extremo C-terminal desde un enfoque de análisis cinético y de estabilidad de mutantes de alanina de cada uno de los aminoácidos de las posiciones 358-368. De esta manera, la comparación entre eficiencia catalítica y estabilidad enzimática proporcionan un método que permite identificar los aminoácidos que tienen un rol importante en la unión de ligando o en el empaquetamiento estructural.

Para los mutantes K359A, Y361A, V363A y R365A no se ha detectado actividad, por lo cual estas posiciones son fundamentales para la actividad de α3GT. K359, Y361 y R365 interaccionan con los fosfatos del UDP-Gal, además, K359A también interaccionan con el hidroxilo 3 de la lactosa según modelización molecular, por lo cual se ha propuesto un rol de ácido/base general a la lisina 359. Por otra parte, los mutantes N367A y V368A resultaron ser de 2 a 3 veces más activos que wt, respectivamente.

Los estudios de estabilidad revelan que wt y mutantes de residuos no involucrados directamente en la interacción con los sustratos, presentan mayor estabilidad que aquellos que según los modelos moleculares y las estructuras cristalográficas interaccionan directamente con el UDP o UDP-Gal. Por otra parte, se encontró que la presencia de UDP disminuye en mutantes de residuos directamente implicados en las interacciones con el UDP-Gal.
Mammalian α-1,3-Galactosyltransferase (α3GT) is involved in the biosynthesis of the oligosaccharide antigen responsible for hiperacute (vascular) rejection (HAR) in xenotransplantation of animal organs to humans [1]. α3GT is also used as a model enzyme for studies of glycosyltransferase structure and mechanisms, as well as biocatalyst in enzymatic oligosacaride synthesis. The enzyme catalyzes the transfer of galactose (Gal) from UDP-Gal a la N-acetyllactosamyne (NAcLac), or to lactose.

Currently, there are two types of α3GT 3-dimensional structure. The previously reported form I [2] is similar to the form II [3,4], except at the C-terminal residues 358-368. The C-terminal region is highly disordered in form I but well defined in form II, suggesting that it functions as a lid that closes the active site. The conformational change at the C-terminus and the sequence conservation among other α3GT suggest that this region could have key role in the catalytic action [4].

In the present Doctoral Thesis, the study structure/function of the end C-terminal was approached by a kinetic analysis and by stability analysis of alanine mutants for each one of the amino acids at positions 358-368. This way, the comparison of catalytic efficiency and enzymatic stability provides a method that allows identification of the amino acids that have an important role in the substrate binding or in structural packaging.

For mutants K359A, Y361A, V363A and R365A no activity was detected, therefore these positions are fundamental for α3GT activity. K359, Y361 and R365 interact with the UDP-Gal phosphates, also, K359A interacts with the 3-hydroxyl of the lactose according to molecular modeling, thereby it has been proposed to have the role as the general acid/base. On the other hand, the mutants N367A and V368A turned out to be 2 or 3 times more active than wt, respectively.

The studies of stability reveal that amino acids mutants (wt including) which don't directly interact with the substrates do not present higher stability than the amino acid mutants which directly interact with the substrate UDP or UDP-Gal. On the other hand, the presence of UDP stabilizes de wt enzyme and the mutants of the amino acids that don't directly interact with the substrates, while this UDP stabilizing effect diminishes in mutants of amino acids directly implied in the interactions of UDP or UDP-Gal.

La α-1,3-galactosiltransferasa (α3GT) està involucrada en la biosíntesis d'oligosacàrids antigènics responsables del rebuig immunològic hiperagut (HAR) en el xenotransplant d'òrgans d'animals a humans, per la qual cosa aquesta enzima té un particular interès en biomedicina. Per altra banda, la α3GT constitueix un model enzimàtic per a estudis mecanístics i estructurals de glicosiltransferasas. L'enzim transfereix galactosa (Gal) del UDP-Gal a la N-acetillactosamina (LacNAc), o a la lactosa (Lac).Actualment, els estudis cristalogràfics han mostrat dos tipus d'estructures amb diferents conformacions en la zona C-terminal (aa.358-368). En la forma I, aquesta zona està altament desordenada, però en la forma II està ben definida, la qual cosa suggereix que funciona com a tapa que tanca el lloc catalític. Aquests canvis conformacionals suggereixen que l'extrem C-terminal podria tenir un rol clau en l'activitat catalítica.En la present tesis doctoral es va abordar l'estudi estructural/funcional de l'extrem C-terminal des d'un enfocament d'anàlisi cinètic d'estabilitat de mutants d'alanina de cadascun dels aminoàcids de les posicions 358-368. D'aquesta manera, la comparació entre eficiència catalítica i estabilitat enzimàtica proporcionen un mètode que permet identificar els aminoàcids que tenen un paper important en la unió de lligand o en l'empaquetament estructural. Pels mutants K359A, Y361A, V363A y R365A no s'ha detectat activitat, per la qual cosa aquestes posicions són fonamentals per a l'activitat α3GT. K359, Y361 i R365 interaccionen amb els fosfats del UDP-Gal, a més, K359A també interacciona amb l'hidroxil 3 de la lactosa segons modelització molecular, per la qual cosa s'ha proposat un paper d'àcid/base general a la lisina 359. Per altra banda, els mutants N367A i V368A van resultar ser de 2 a 3 vegades més actius que wt, respectivament. Els estudis d'estabilitat revelen que wt i mutants de residus no involucrats directament en la interacció amb els substracts, presenten major estabilitat que aquells que segons els models moleculars i les estructures cristal·logràfiques interaccionen directament amb el UDP o UDP-Gal. Per altra banda, es va trobar que la presència de UDP disminueix en mutants de residus directament implicats en les interacciones amb el UDP-Gal.
La α-1,3-galactosiltransferasa (α3GT) está involucrada en la biosíntesis de oligosacáridos antigénicos responsables del rechazo inmunológico hiperagudo (HAR) en el xenotransplante de órganos de animales a humanos, por lo que esta enzima tiene un particular interés en biomedicina. Por otra parte, la α3GT constituye un modelo enzimático para estudios mecanísticos y estructurales de glicosiltransferasas. La enzima transfiere galactosa (Gal) del UDP-Gal a la N-acetillactosamina (LacNAc), o a la lactosa (Lac).Actualmente, los estudios cristalográficos han mostrado dos tipos de estructuras con diferentes conformaciones en la zona C-terminal (aa.358-368). En la forma I, esta zona está altamente desordenada, pero en la forma II está bien definida, lo cual sugiere que funciona como tapa que cierra el sitio catalítico. Estos cambios conformacionales sugieren que el extremo C-terminal podría tener un rol clave en la actividad catalítica.En la presente tesis doctoral se abordó el estudio estructural/funcional del extremo C-terminal desde un enfoque de análisis cinético y de estabilidad de mutantes de alanina de cada uno de los aminoácidos de las posiciones 358-368. De esta manera, la comparación entre eficiencia catalítica y estabilidad enzimática proporcionan un método que permite identificar los aminoácidos que tienen un rol importante en la unión de ligando o en el empaquetamiento estructural.Para los mutantes K359A, Y361A, V363A y R365A no se ha detectado actividad, por lo cual estas posiciones son fundamentales para la actividad de α3GT. K359, Y361 y R365 interaccionan con los fosfatos del UDP-Gal, además, K359A también interaccionan con el hidroxilo 3 de la lactosa según modelización molecular, por lo cual se ha propuesto un rol de ácido/base general a la lisina 359. Por otra parte, los mutantes N367A y V368A resultaron ser de 2 a 3 veces más activos que wt, respectivamente. Los estudios de estabilidad revelan que wt y mutantes de residuos no involucrados directamente en la interacción con los sustratos, presentan mayor estabilidad que aquellos que según los modelos moleculares y las estructuras cristalográficas interaccionan directamente con el UDP o UDP-Gal. Por otra parte, se encontró que la presencia de UDP disminuye en mutantes de residuos directamente implicados en las interacciones con el UDP-Gal.
Mammalian α-1,3-Galactosyltransferase (α3GT) is involved in the biosynthesis of the oligosaccharide antigen responsible for hiperacute (vascular) rejection (HAR) in xenotransplantation of animal organs to humans [1]. α3GT is also used as a model enzyme for studies of glycosyltransferase structure and mechanisms, as well as biocatalyst in enzymatic oligosacaride synthesis. The enzyme catalyzes the transfer of galactose (Gal) from UDP-Gal a la N-acetyllactosamyne (NAcLac), or to lactose.Currently, there are two types of α3GT 3-dimensional structure. The previously reported form I [2] is similar to the form II [3,4], except at the C-terminal residues 358-368. The C-terminal region is highly disordered in form I but well defined in form II, suggesting that it functions as a lid that closes the active site. The conformational change at the C-terminus and the sequence conservation among other α3GT suggest that this region could have key role in the catalytic action [4]. In the present Doctoral Thesis, the study structure/function of the end C-terminal was approached by a kinetic analysis and by stability analysis of alanine mutants for each one of the amino acids at positions 358-368. This way, the comparison of catalytic efficiency and enzymatic stability provides a method that allows identification of the amino acids that have an important role in the substrate binding or in structural packaging. For mutants K359A, Y361A, V363A and R365A no activity was detected, therefore these positions are fundamental for α3GT activity. K359, Y361 and R365 interact with the UDP-Gal phosphates, also, K359A interacts with the 3-hydroxyl of the lactose according to molecular modeling, thereby it has been proposed to have the role as the general acid/base. On the other hand, the mutants N367A and V368A turned out to be 2 or 3 times more active than wt, respectively. The studies of stability reveal that amino acids mutants (wt including) which don't directly interact with the substrates do not present higher stability than the amino acid mutants which directly interact with the substrate UDP or UDP-Gal. On the other hand, the presence of UDP stabilizes de wt enzyme and the mutants of the amino acids that don't directly interact with the substrates, while this UDP stabilizing effect diminishes in mutants of amino acids directly implied in the interactions of UDP or UDP-Gal.

En esta tesis se ha investigado el mecanismo catalítico de las glicosiltransferasas que retienen la configuración a través de simulaciones híbridas de mecánica cuántica/mecánica molecular (QM/MM) y dinámicas moleculares (MD). La investigación se centra en la evaluación de las propuestas mecanísticas, además de la identificación de los principales factores que contribuyen a la eficiencia catalítica. Para esto usamos dos enzimas, α1,4-N-Acetilhexosaminiltransferasa (EXTL2) y Glucosil-3-fosfoglicerato Sintasa (GpgS) de Mycobacterium Tuberculosis. Además, se llevaron a cabo simulaciones adicionales de modelos in silico construidos en base a la enzima nativa o mutante para desvelar los roles de los residuos que se encuentran en una de las caras del sustrato transferible (cara β del azúcar). Los resultados de GpgS se exponen en el Capítulo 4 y los resultados de EXTL2 se presentan a lo largo de los Capítulos 5 y 6. En el Capítulo 7, otras dos glicosiltransferasas retenedoras investigadas en una tesis previa del grupo (LgtC y α3GalT), junto a EXTL2 y GpgS son estudiadas y comparadas para analizar con mayor profundidad las características estructurales de la cara β del azúcar y sus implicaciones en el mecanismo catalítico. En este capítulo también se incluye una discusión general sobre los principales factores que modulan la eficiencia catalítica en cada enzima, dando de esta manera, una visión más completa y general acerca de las estrategias catalíticas realizadas por las glicosiltransferasas retenedoras. Finalmente, las conclusiones generales de este trabajo se resumen en el Capítulo 8. Parte de los resultados presentados en esta tesis pueden ser encontrados en las siguientes publicaciones: • Albesa-Jove, D.; Mendoza, F.; Rodrigo-Unzueta, A.; Gomollon-Bel, F.; Cifuente, J. O.; Urresti, S.; Comino, N.; Gómez, H.; Romero-Garcia, J.; Lluch, J. M.; Sancho-Vaello, E.; Biarnes, X.; Planas, A.; Merino, P.; Masgrau, L.; Guerin, M. E. Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 9898-9902. • Gomez, H.; Mendoza, F.; Lluch, J. M.; Masgrau, L. Advances in protein chemistry and structural biology 2015, 100, 225-254. • Mendoza, F.; Gomez, H.; Lluch, J. M.; Masgrau, L. Acs Catalysis 2016, 6, 2577-2589.
In the present thesis the catalytic mechanism of retaining glycosyltransferases has been investigated by means of hybrid quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) and molecular dynamics (MD) simulations. The research is focused on the evaluation of the mechanistic proposals, as well as the identification of the main factors that contribute to the catalytic efficiency. For that we use two enzymes, α1,4-N-Acetylhexosaminyltransferase (EXTL2) and Mycobacterium Tuberculosis Glucosyl-3-phosphoglycerate Synthase (GpgS). Moreover, further simulations using in silico models built based on the native or mutant enzymes were carried out to unveil the roles of the residues located in one of the faces of the transferable substrate (β-face of the sugar). The results for GpgS are exposed in Chapter 4 and the results for EXTL2 are presented through Chapters 5 and 6. In Chapter 7, two other retaining glycosyltransferases investigated in a previous thesis of the group (LgtC and α3GalT), along with EXTL2 and GpgS are studied and compared to further analyse the structural features in the β-face of the sugar and its implications on the catalytic mechanism. A general discussion around the main factors modulating the catalytic efficiency in each enzyme is also included in this Chapter, providing in this way a more complete and general picture about the catalytic strategies performed by retaining glycosyltransferases. Finally, the general conclusions of this work are outlined in Chapter 8. Part of the results presented in this thesis is already published and can be found in the following papers: • Albesa-Jove, D.; Mendoza, F.; Rodrigo-Unzueta, A.; Gomollon-Bel, F.; Cifuente, J. O.; Urresti, S.; Comino, N.; Gómez, H.; Romero-Garcia, J.; Lluch, J. M.; Sancho-Vaello, E.; Biarnes, X.; Planas, A.; Merino, P.; Masgrau, L.; Guerin, M. E. Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 9898-9902. • Gómez, H.; Mendoza, F.; Lluch, J. M.; Masgrau, L. Advances in protein chemistry and structural biology 2015, 100, 225-254. • Mendoza, F.; Gómez, H.; Lluch, J. M.; Masgrau, L. Acs Catalysis 2016, 6, 2577-2589.

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Introduction. ABO histo-blood group system is the most important transfusional system and the identification of its phenotypes is often performed by means of direct and reverse typing, which must always present concordant results. However, some genetic factors such as natural chimerisms and point mutations in the ABO gene may affect the expression of the antigens and antibodies of this system, contributing to the discrepancy in the phenotyping, requiring investigations to define the correct phenotype of receptors and blood donors. Objectives. The main objective of this study was to investigate the variations in the expression of the antigens of the ABO histo-blood group system. Its specific objectives were: 1. Selection of recipients and blood donors that presented discrepancies between the results of the direct and reverse phenotyping of the ABO histo-blood group system; 2. Investigation, using serological and molecular methods, of the causes of phenotypic changes and discrepancies between the results of direct and reverse phenotypes in the ABO histo-blood group system in the recipients and donors of blood. Material and Methods. Samples of recipients (n = 2) and blood donors (n = 7) presenting discrepancies between the direct and reverse phenotyping were selected. Phenotyping were performed using conventional and modified hemagglutination methods in tubes and gel columns with commercial antisera and lectins. Molecular investigations were performed using PCR-RFLP method and sequencing of exons 6 and 7 of the ABO gene and exon 2 of the FUT2 gene. Results. Four cases with poor expression of antigen A and absence of expected antibody, observed in hemagglutination, were identified as A2B, Ael and Aw. Four cases without antigenic alteration but carrying an irregular antibody anti-A1 or absence of expected antibody were characterized as AB, A1 and O and presented common ABO alleles. A case of non-dizygotic twins, phenotyped as AB and with double red blood cell population was characterized as hematopoietic chimera after extensive family analysis. The DNA extracted from buccal swab revealed the ABO (A101/B101) and FUT2 (SE*25.01.01/SE*25.01.01) genotypes in the male twin and the ABO (O01/O02) and FUT2 (SE*01.04.01/SE*01.06.03) genotypes in the female twin. Sequences of two new ABO (ABO*Aw.38; KT906366.1) and FUT2 (SE*01.06.03; KX550421) allele sequences were deposited on GenBank. Conclusions. Our results demonstrate that the use of serum and salivary serological assays combined with molecular methods are good tools to solving discrepancies between the direct and reverse phenotyping of the ABO histo-blood group system as well as elucidate cases of twin chimerism in humans, with a double population of red blood cells. In addition, they contribute to the identification of new alleles of the ABO and FUT2 genes.
Introdução. O sistema histo-sanguíneo ABO é o de maior importância transfusional e a identificação de seus fenótipos é frequentemente realizada por meios das tipagens direta e reversa as quais sempre devem apresentar resultados concordantes. Entretanto, alguns fatores genéticos como quimerismos naturais e mutações pontuais no gene ABO, podem afetar a expressão dos antígenos e anticorpos deste sistema, contribuindo com a discrepância nas fenotipagens, requerendo investigações para se definir o correto fenótipo de receptores e doadores de sangue. Objetivos. O objetivo geral deste estudo foi investigar as variações na expressão dos antígenos do sistema histo-sanguíneo ABO. Seus objetivos específicos compreenderam: 1. Seleção de receptores e doadores de sangue que apresentaram discrepâncias entre os resultados das fenotipagens direta e reversa do sistema histo-sanguíneo ABO; 2. Investigação, com o uso de métodos sorológicos e moleculares, das causas das alterações fenotípicas e discrepâncias entre os resultados das fenotipagens direta e reversa no sistema histo-sanguíneo ABO nos receptores e doadores de sangue. Material e Método. Foram selecionadas amostras de receptores (n=2) e doadores (n=7) de sangue com discrepâncias entre as fenotipagens direta e reversa. As fenotipagens foram realizadas com o uso dos métodos de hemaglutinação convencional e modificada, em tubos e colunas de gel, com antissoros comerciais e lectinas. As investigações moleculares foram realizadas com o uso dos métodos PCR-RFLP e sequenciamento dos exons 6 e 7 do gene ABO e do exon 2 do gene FUT2. Resultados: Quatro casos com fraca expressão do antígeno A e ausência do anticorpo esperado, observados na hemaglutinação, foram identificados como A2B, Ael e Aw. Quatro casos sem alteração antigênica, mas com presença de anticorpo irregular ou ausência do anticorpo esperado, foram caracterizados como AB, A1 e O e apresentaram alelos comuns. Um caso de gêmeos não dizigóticos, fenotipados como AB e com dupla população de hemácias foi caracterizado como quimera hematopoiética, após extensa análise familiar. O DNA extraído de swab bucal revelou os genótipos ABO (A101/B101) e FUT2 (SE*25.01.01/SE*25.01.01) no gêmeo masculino e os genótipos ABO (O01/O02) e FUT2 (SE*01.04.01/SE*01.06.03) no gêmeo feminino. As sequências de dois novos alelos dos genes ABO (ABO*Aw.38; KT906366.1) e FUT2 (SE*01.06.03; KX550421) foram depositadas no GenBank. Conclusões: Nossos resultados demonstram que o uso de análises sorológicas eritrocitárias e salivares combinadas a métodos moleculares são fundamentais na resolução de discrepâncias entre as fenotipagens direta e reversa do sistema histo-sanguíneo ABO bem como no esclarecimento de casos de quimerismo gemelar em humanos, contendo dupla população de hemácias. Além disso, contribuem para a identificação de novos alelos dos genes ABO e FUT2.

El patró específic d'expressió de glicosiltransferases i antígens Lewis observat a la mucosa gàstrica normal es perd durant el procés de la carcinogènesi gàstrica. Aquí descrivim que canvis en l'expressió dels antígens Lewis en cèl·lules HT-29/M3 de càncer de còlon induïts per la transfecció del cDNA de FUT1 resulten en un fenotip menys invasiu i menys metastàtic.
La gastritis crònica produïda per la infecció per Helicobacter pylori és un dels principals determinants en la patogènesi del càncer gàstric, i comporta nivells elevats de citoquines proinflamatòries com TNF-α, IL-1β o IL-6, que poden regular l'expressió de gens implicats en la transformació neoplàsica gàstrica. Vam analitzar l'efecte de citoquines proinflamatòries en l'expressió de glicosiltransferases i antígens Lewis en cèl·lules de càncer gàstric va ser analitzat i vam observar que el tractament d'aquestes cèl·lules amb IL-1β augmentava l'expressió d'antígens Lewis de tipus 2. A més, vam observar que tumors gàstrics amb inflamació crònica presentaven nivells més elevats d'estructures glicosídiques de tipus 2, suggerint que determinades glicosiltransferases podrien estar regulades per la inflamació.
Els adenocarcinomes gàstrics de tipus intestinal s'originen a partir d'una sèrie successiva de lesions precanceroses que porten a una transdiferenciació intestinal de la mucosa gàstrica. En aquest procés s'activa l'expressió de diferents gens intestinals a les cèl·lules gàstriques, com és el cas dels gens de les mucines intestinals MUC2 i MUC4 i del factor de transcripció intestinal CDX2. Nosaltres vam estudiar l'efecte de citoquines inflamatòries i de les seves vies de senyalització associades en l'expressió d'aquests gens va ser estudiat. El primer que vam constatar va ser que IL-6 regulava l'expressió de MUC4 a través de la via de gp130/STAT3 a línies cel·lulars de càncer gàstric, mentre que l'expressió de MUC2 era induïda per TNF-α a través de la via de senyalització de NF-κB. A més, vam observar que l'expressió de CDX2 no era regulada per citoquines inflamatòries. Finalment, vam trobar que les diferències en l'expressió de les mucines intestinals MUC2 i MUC4 a tumors gàstrics podien ser explicades per diferències en el tipus d'inflamació predominant.
De tots aquests resultats podem concloure que la inflamació i les vies de senyalització associades modulen l'expressió de gens associats a la carcinogènesi gàstrica.
In the gastric carcinogenetic process the specific expression pattern of glycosyltransferases and Lewis antigens displayed by the normal gastric mucosa is lost. We detected that changes in the expression of Lewis antigens induced by the transfection of FUT1 cDNA in HT-29/M3 cells determined a less invasive and metastatic phenotype.
Chronic gastritis caused by H. pylori infection is a major determinant in the pathogenesis of gastric cancer, and present increased levels of the pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and IL-6, which can regulate the expression of genes involved in the gastric neoplastic transformation. We analysed the effect of pro-inflammatory cytokines on the expression of glycosyltransferases and Lewis antigens in gastric cancer cells. IL-1β treatment increased the expression of type 2 Lewis antigens, and, in addition, we observed that gastric tumours with chronic inflammation displayed increased levels of type 2 glycan structures, suggesting that specific glycosyltransferases may be regulated by inflammation.
Intestinal-type gastric adenocarcinomas develop from successive pre-cancerous lesions that lead to an intestinal transdifferentiation of the gastric mucosa. In this process many intestinal genes are activated in gastric cells, such as the intestinal mucin MUC2 and MUC4 genes and the transcription factor CDX2. We studied the effect of pro-inflammatory cytokines and their associated signalling pathways on the expression of these genes. IL-6 regulated the expression of MUC4 through the gp130/STAT3 signalling pathway in gastric cancer cell lines, while MUC2 expression was induced by TNF-α through the NF-κB signalling pathway. No effects on CDX2 expression were observed after cytokine treatment in gastric tumour cells. Finally, we found that the differences observed in the expression of the intestinal mucins MUC2 and MUC4 in gastric tumours could be explained by differences in the predominant type of inflammation present in gastric adenocarcinomas.
In conclusion, our results suggest that inflammation and its associated signalling pathways modulate the expression of genes associated with gastric carcinogenesis.

Tese de mestrado, Química (Química) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018
A glicosilação é a modificação pós-traducional mais prevalente nas proteínas e outras biomoléculas, sendo crucial no correto funcionamento de muitos processos fisiopatológicos, tais como a adesão celular, ativação de recetores, resposta imunológica.1–7 As glicosiltransferases são as enzimas responsáveis pela glicosilação de mono-, oligo- e polissacáridos, proteínas ou lípidos, formando glicanos e outros glicoconjugados. No cancro, mudanças nos padrões de glicosilação são prevalentes nos seus vários estágios, sendo que este fenómeno é considerado uma das características do cancro.5 Logo a inibição de certas glicosiltransferases é uma estratégia promissora na terapia contra o cancro.8 No âmbito desta Dissertação foram sintetizados quatro compostos análogos de açúcares de nucleósido difosfato, substratos naturais das glicosiltransferases, contendo grupos (triazolil)metilamida como miméticos mais estáveis, tanto hidroliticamente como enzimaticamente, e neutros do grupo difosfato. Estes compostos contêm variações na unidade glicosílica do fragmento nucleósido, existindo nucleósidos de piranose e furanose, e na regioquímica da ligação N-glicosídica, existindo nucleósidos com ligações N7 e N9.9 Os compostos foram obtidos com rendimentos que variam entre 25% e 73%. Estes compostos foram depois estudados quanto à sua solubilidade em meio biológico, verificando-se uma boa solubilidade quando co-solubilizados em DMEM contendo até 0,5% de DMSO. Estudos preliminares relativos à sua ação citotóxica sobre células da linha MDA-MB-231 foram também realizados. A viabilidade celular das células MDA-MB-231 foi testada pelo método de exclusão com azul tripano e por observação fotográfica das células. Após a realização dos testes, verificou-se uma ligeira diminuição na viabilidade celular.
Glycosylation is the most common post-translational modification present in proteins and other biomolecules, playing a crucial role in the regulation of many physiopathological processes, such as cell-cell adhesion, receptor activation and immune response.1–7 Glycosyltransferases are the enzymes responsible for glycosylation of mono-, oligo- and polysaccharides, proteins or lipids, leading to the formation of glycans and other glycoconjugates. In cancer, changes in glycosylation patterns are ubiquitous in its stages, which can be considered as one of its hallmarks.5 Therefore, inhibition of certain glycosyltransferases is a promising therapeutic strategy in cancer therapy.8 In this Dissertation, four sugar diphosphate nucleoside analogues, natural substrates for glycosyltransferases, were synthesised, containing a (triazolyl)methylamide moiety as a more enzymatic/hydrolytic stable and neutral bioisostere of the diphosphate moiety. These compounds have variations on the glycosyl unit of the nucleoside fragment, containing either a pyranose or a furanose ring, and on the regiochemistry of the N-glycosidic bond, forming both N7 and N9 nucleosides.9 The compounds were synthesised in yields ranging from 25% to 73%. These four compounds were further evaluated for their solubility in biological media and showed good solubility when co-solubilized in DMEM containing up to 0,5% of DMSO. Preliminary studies on their cytotoxic activity in MDA-MB-231 breast cancer cells were also performed. Cell viability assays were conducted using two methods: Trypan blue exclusion and by photographic cell observation. After testing, these molecules showed a slight decrease in cell viability.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016
La glicosilación de proteínas es la modificación postraduccional más abundante en las células. La biosíntesis de glicanos, a diferencia de la síntesis de ADN, se lleva a cabo de manera independiente de un templado. Los mecanismos que controlan y resguardan la fidelidad de los glicanos aún son poco conocidos. El objetivo general de esta tesis es contribuir al conocimiento de los mecanismos de regulación de glicosiltransferasas que inician la biosíntesis de glicanos de tipo O-GalNAc. La glicosilación de tipo O-GalNAc es iniciada por la familia de polipeptidil N-acetilgalactosaminil transferasas (ppGalNAc-Ts) constituída por 20 miembros, los cuales incorporan un residuo de N-acetilgalactosamina sobre residuos serina/treonina (αGalNAc-Ser/Thr) de un polipéptido aceptor. Estas glicosiltransferasas son proteínas de membrana tipo II que presentan en su porción luminal un dominio catalítico y en el extremo carboxilo terminal un dominio tipo lectina con un plegamiento característico de tipo β-trefoil. Uno de los objetivos específicos de esta tesis fue estudiar la influencia de estos dominios tipo lectina en la actividad enzimática de glicosiltransferasas que inician la glicosilación de tipo O-GalNAc. En primer lugar, se demostró que los dominios lectina de ppGalNAc-T3 y T4 (T3lec y T4lec) inhiben la actividad enzimática de las isoformas ppGalNAc-T2 y T3. Este efecto inhibitorio pudo ser corroborado in vivo utilizando la línea celular CHO ldlD. Los resultados mostraron que se trata de una interacción proteína-proteína en donde el dominio lectina de una ppGalNAc-T interacciona con el dominio catalítico de otra isoforma. A su vez, tanto T3lec como la enzima ppGalNAc-T3 (incluyendo el dominio catalítico y lectina) fueron capaces de activar la actividad de C1GalT, enzima que cataliza la incorporación de galactosa sobre αGalNAc-Ser/Thr. Esto pone de manifiesto el rol regulatorio diferencial de los dominios lectina sobre enzimas que catalizan reacciones consecutivas en esta biosíntesis de glicanos. Por otro lado, la acetilación de lisinas está emergiendo como un mecanismo de control postraduccional cada vez más frecuente que puede ocurrir en todos los compartimentos subcelulares. Múltiples glicosiltransferasas residentes en Golgi se han informado como enzimas blanco de la acetilación entre ellas las isoformas ppGalNAc-T2 y T9. Por eso, la segunda parte de esta tesis está abocada a estudiar el efecto de la acetilación de lisinas sobre las propiedades biológicas de las ppGalNAc-Ts. En particular, se focalizó en el efecto de una mutación puntual que simula acetilación en la K626 localizada en un motivo estructural conservado (QKW) del dominio lectina de ppGalNAc-T3. Esta mutación (K626Q) disminuyó la actividad catalítica de la enzima y su capacidad de interacción con glicanos de tipo O-GalNAc. En ensayos de interacción con el glicopéptido (MUC1-αGalNAc) y péptidos derivados de mucinas, la mutante incrementó su unión a los mismos en presencia de glicósidos de GlcNAc. En conclusión, ambos mecanismos de regulación estudiados en la presente tesis muestran al plegamiento β-trefoil de los dominios lectinas de ppGalNAc-Ts como estructura clave para la regulación de la glicosilación de tipo O-GalNAc dadas sus propiedades de interacción con múltiples moléculas.
Lorenz, Virginia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Irazoqui, Fernando José. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.
Chiabrando, Gustavo Alberto. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.
Nores, Gustavo Alejandro. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.
Nicotra, Viviana Estela. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Orgánica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal; Argentina.
Iglesias, Alberto Alvaro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; Argentina.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2021
Resumen: La S-acilación es una modificación postraduccional de proteínas que se caracteriza por el agregado de un ácido graso de cadena larga a una cisteína. El ácido graso que más frecuentemente es añadido es el palmítico por lo cual esta modificación también se conoce como palmitoilación. Una de sus principales características es la reversibilidad, la cual le confiere capacidad regulatoria. La S-acilación ha sido relacionada a importantes procesos como la transducción de señales, la transmisión sináptica y el ciclo visual. La S-acilación es catalizada por una familia de enzimas llamadas S-aciltransferasas o palmitoiltransferasas (PATs). Son proteínas politópicas de membrana con entre 4 y 6 pasos transmembrana y se caracterizan por tener un dominio conservado denominado DHHC (Asp, His, His, Cys), rico en cisteínas. Fueron descriptas inicialmente en la levadura Saccharomyces cerevisiae donde se encontraron 7 miembros de la familia, pero están conservadas en todos los organismos eucariotas. A pesar de que existe un creciente interés en estas enzimas debido a que cada vez hay más evidencia de su rol en la salud humana, el campo aún carece de inhibidores específicos para las palmitoiltransferasas. Obtenerlos permitiría avanzar en el entendimiento de los mecanismos de acción y las funciones de estas enzimas, pero también podrían ser de importancia para el tratamiento de algunas enfermedades. Durante el desarrollo de esta tesis se trabajó en el diseño, implementación y optimización de dos métodos biológicos “in vivo” para la búsqueda de inhibidores de estas enzimas. Utilizando como organismo modelo a la levadura S. cerevisiae se trabajó en generar nuevas cepas que tuvieran un crecimiento diferenciado en presencia o ausencia de una de las PATs endógenas, Akr1. Posteriormente se pusieron a punto dos ensayos diferentes para rastrear a gran escala posibles inhibidores de esta PAT. El primer ensayo tuvo como objetivo identificar péptidos inhibidores, mientras que el segundo estuvo dirigido a conseguir drogas inhibitorias. Además, confirmamos que estos sistemas biológicos también pueden ser utilizado para la búsqueda de inhibidores de PATs de otros organismos cuya inhibición pueda revestir mayor interés para la salud humana. A lo largo de la tesis se realizó un desarrollo biotecnológico que sienta las bases para continuar la búsqueda de inhibidores, que aquí se inicia, pero que aún no ha finalizado. Nuestra meta es obtener un inhibidor plenamente funcional y una profunda caracterización del mismo.
2023-07-31
Fil: Coronel, Consuelo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Fil: Valdez Taubas, Javier. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.
Fil: Valdez Taubas, Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.
Fil: Barra, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.
Fil: Barra, José Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.
Fil: Canavoso, Lilian Etelvina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina.
Fil: Canavoso, Lilian Etelvina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.
Fil: Villarreal, Marcos Ariel. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Teórica y Computacional; Argentina.
Fil: Villarreal, Marcos Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Fisicoquímica de Córdoba; Argentina.
Fil: Biondi, Ricardo Miguel Instituto de Investigaciones en Biomedicina de Buenos Aires (IBIOBA). Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016
Las glicosiltransferasas residentes en el complejo de Golgi, son proteínas transmembrana tipo II encargadas de catalizar la adición de residuos de azúcar sobre lípidos o proteínas. La función de estas enzimas es crucial, ya que determina desde el correcto plegamiento de las proteínas, hasta la síntesis de los glicoesfingolípidos que componen la membrana plasmática. La síntesis de glicoesfingolípidos sialilados o gangliósidos ha sido ampliamente estudiada, ya que éstos se han visto involucrados en procesos fisiológicos relevantes, como la diferenciación celular y la transducción de señales pero también han sido relacionados a la patogénesis de trastornos neurológicos como el síndrome de Guillain-Barré. Observaciones realizadas en nuestro laboratorio sugirieron la presencia de residuos de cisteínas que podrían estar S-aciladas en numerosas glicosiltransferasas, lo que impulsó el estudio de esta modificación ya que, hasta el momento, no ha sido reportado ningún tipo de modificación lipídica en miembros de esta familia. La S-acilación de proteínas es una modificación post-traduccional que consiste en la adición de una molécula lipídica de cadena larga sobre residuos de cisteína, a través de un enlace tioéster. Esta es la única modificación lipídica reversible y, por lo tanto, susceptible a ser regulada. En los últimos años el interés por la S-acilación ha incrementado ya que esta modificación se ha visto involucrada en numerosos procesos de gran relevancia biológica, como la transducción de señales y la transmisión sináptica pero también en procesos patológicos, como el retardo mental y distintos tipos de cáncer. Esta modificación permite el anclaje estable de proteínas solubles a las membranas biológicas pero para proteínas transmembrana, el rol de la S-acilación no es tan claro y en muchos casos se desconoce. La S-acilación de otras proteínas transmembrana tipo II, como las SNAREs transmembrana, ha sido identificada en la levadura Saccharomyces cerevisiae pero solo para una de ellas se ha determinado el rol de esta modificación. Las SNAREs transmembrana también están S-aciladas en mamíferos pero la información respecto a la función de esta modificación es muy escasa. Si bien no está descripta una secuencia consenso para la S-acilación, la modificación de este tipo de proteínas ocurre sobre cisteínas que se encuentran localizadas en el borde citoplasmático, adyacentes al dominio transmembrana. Mediante ensayos in silico evidenciamos la presencia de cisteínas conservadas en el dominio N-terminal de numerosas glicosiltransferasas, cercanas al borde transmembrana. Esta localización característica, sugirió que podrían ser sustratos de la S-acilación. Nuestros resultados experimentales indican que miembros de esta familia son modificados sobre esos residuos conservados, lo que nos permite postular a la S-acilación como una modificación lipídica novedosa en la familia de las glicosiltransferasas. Además, encontramos que la modificación de GalNAc-T y muy posiblemente la de otros miembros, ocurre en el retículo endoplásmico. Esto es importante ya que no se conoce la palmitoiltransferasa que cataliza la S-acilación de proteínas transmembrana tipo II en células de mamíferos y nuestros estudios apuntan como principal candidato a DHHC4, una Palmitoiltransferasa localizada en el retículo endoplásmico. En este trabajo mostramos que DHHC4 es capaz de reconocer y S-acilar a cisteínas con la localización característica en SNAREs transmembrana, por lo cual, es muy posible que sea la aciltransferasa encargada de modificar otras proteínas transmembrana tipo II, incluyendo las glicosiltransferasas.
Chumpen Ramirez, Sabrina Vanesa.Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Valdez Taubas, Javier. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.
Hallak, Marta Elena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.
Oliva, Fabiana Yolanda. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Fisicoquímica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Fisicoquímica de Córdoba; Argentina.
Alvarez, Cecilia Inés. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.
Corvi, María. Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Parasitología Molecular. Sede Chascomús; Argentina.