Littérature scientifique sur le sujet « Glicosiltransferasi »

Bioproductos de la industria de la yuca: sustratos alternativos para la producción de ciclodextrina glucosiltransferasa por alcalófilo Bacillus trypoxylicola SM-02 En el presente trabajo estudiamos el uso licor de maíz fermentado (LMF), harina de cáscara de yuca (HCY) y aguas residuales de yuca para la producción de ciclodextina glicosiltransferasa (CGTase) por un nuevo aislado alcalófilo de Bacillus trypoxylicola SM-02 en fermentación sumergida. Los experimentos se realizaron por Diseño Central Compuesto Rotativo 22 totalizando 11 ensayos. La mayor actividad enzimática de 352.53 U/mL se obtuvo con 1.5 g de HCY y 0.6 g de LMF. La temperatura y el pH óptimos fueron 55 ºC y pH 8.0, respectivamente. CGTase mostró una actividad relativa superior al 50% durante 120 min. a la temperatura óptima. Solo el CaCl2 mostró actividad positiva para CGTasa. Los resultados apuntaron a un buen potencial de B. trypoxylicola SM-02 para la producción de CGTasa usando substratos residuales. In the present work was studied the use of cassava peel flour (CPF), corn steep liquor (CSL), and cassava wastewater as substrates to produce cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) from a new alkalophilic isolate of Bacillus trypoxylicola SM-02 by submerged fermentation. The experiments were performed as a Central Composite Design 22, totalizing 11 assays. An enzymatic activity of 352.53 U/mL was obtained using 1.5 g of CPF and 0.6 g of CSL. The optimum temperature and pH of CGTase was 55 °C and 8.0, respectively. The CGTase depicted a relative activity of more than 50% for 120 min at the optimum temperature. The only salt that positively influenced the CGTase activity was CaCl2. The results are indicative of a potential role of B. trypoxylicola SM-02 in the production of CGTase using residual substrates.

A presente revisão de literatura sobre ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) discute sua produção, ação e aplicação. Concluiuse que os produtos obtidos pela hidrólise do amido com CGTase apresentam grande utilidade e funcionalidade, muito embora sejam necessários estudos complementares para viabilizar sua produção em larga escala. Abstract The present review discuss about production, action, and application of the ciclodextrin glucosyltransferase (CGTase, E.C. 2.4.1.19). It was concluded that the products obtained by hydrolysis of the starch with CGTase showed great usefulness and functionality, whereas it is necessary complementary studies to make possible its production in wide scale.

O anticorpo monoclonal (Acmo) anti-Streptococcus mutans 56G foi analisado quanto ao efeito na aderência e crescimento da placa bacteriana in vitro, e quanto ao crescimento em caldo e no comprimento da cadeia do estreptococo. O Acmo foi purifi cado em proteína A - Sepharose e testado em ELISA frente a quatro cepas de S. mutans (ATCC 35668, SP, GS5, CD28A). O Acmo reconheceu com maior intensidade a cepa GS5. As placas bacterianas formadas in vitro na presença do Acmo apresentou menos carboidrato total (polissacarídeo extracelular) que o grupo controle e essa diferença foi signifi cante (p>0,001). A placa bacteriana do grupo tratado, formada sobre uma lamínula de vidro, era diferente da placa controle e apresentava agregados menores que cobriam a lamínula quase completamente. O Acmo 56G não infl uenciou o crescimento bacteriano, nem o comprimento da cadeia de S. mutans.Os resultados desse trabalho sugerem que o Acmo testado deve reconhecer a glicosiltransferase (GTF) de S. mutans presente na superfície bacteriana, interferindo na síntese de glucano por essa enzima.

Uma cultura de bactéria alcalofílica, bastonete Gram+, com alta capacidade de produção da enzima ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) foi isolada de amostras de solo da cidade Ouro Preto, Minas Gerais (Brasil). A produção máxima da enzima ocorreu a 37°C após 72 horas de incubação, sob agitação de 120 ciclos por minuto, em meio alcalofílico (pH 10,3) contendo 2% de amido solúvel, 0,5% de peptona, 0,5% de extrato de levedura, 0,1% de K2HPO4, 0,02% de MgSO4.7H2O e 1% de Na2CO3. A temperatura ótima de atividade hidrolítica da enzima situou-se entre 55 e 60°C. Na ausência de substrato, a CGTase mostrou-se 100% estável até 60°C por 30 min. A adição de 10 mmol/L de cloreto de cálcio aumentou sua termo-resistência, resultando em maior produção de ciclodextrinas. O pH ótimo em tampão borato 50 mmol/L foi 8,0. A atividade e a estabilidade em altas temperaturas indicam potencialidade industrial para essa CGTase. Assim, estudos complementares devem ser realizados para identificar a espécie microbiana, purificar a enzima, avaliar o efeito de inibidores enzimáticos, determinar o tipo de ciclodextrina produzida em maior proporção e a taxa de conversão do amido em ciclodextrinas. ISOLATION OF ALKALOPHILIC MICROORGANIMS PRODUCERS OF THE ENZYME CYCLODEXTRIN GLYCOSYLTRANSFERASE (CGTase) Abstract A culture of an alkalophilic bacterium, rod shaped Gram positive, with high production capacity of the enzyme CGTase was isolated from soil samples of the city of Ouro Preto, Minas Gerais state (Brazil). Maximum enzyme production occurred at 37º C after 72 h of incubation, under agitation of 120 cycles per minute, in alkalophilic medium (pH 10.3) containing 2% soluble starch, 0.5 % peptone, 0.1 % K2HPO4, 0.02 % MgSO4.7H2O and 1% Na2CO3. The optimum temperature of the enzyme hydrolytic activity was between 55 and 60º C. In the absence of substrate, the CGTase showed stability of 100% until 60º C per 30 min. The addition of 10 mmol/L of calcium chloride enhanced its thermal resistance, resulting in a higher production of cyclodextrins. The optimum pH in borate buffer 50 mmol/L was 8.0. The activity and the stability in high temperatures indicate industrial potential for this CGTase. Like this, complementary studies must be realized to identify the microbial species, to purify the enzyme, to evaluate the effect of enzymatic inhibitors, to determine the type of cyclodextrins produced in greater proportion and the conversion rate of starch in cyclodextrins.

Orientador: Yong Kun Park
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
Made available in DSpace on 2018-07-14T00:32:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sabioni_JoseGeraldo_D.pdf: 3233617 bytes, checksum: f2d7ad62d994826ba806053453d182f0 (MD5) Previous issue date: 1991
Resumo: Uma linhagem de Bacillus lentus, contendo alta atividade de ciclodextrina glicosiltransferase (E.C. 2.4.1.19) extracelular, foi obtida de uma coleção de microrganismos isolados de amostras de solos de Campinas (SP), usando-se um meio de cultivo alcalino, A enzima foi produzida cultivando-se o Bacillus lentus em meio líquido (pH 10,3) a 37°C por 4 dias, em aerobiose. A ciclodextrina glicosiltransferase foi purificada por fracionamento com sulfato de amônio, seguido de cromatografia em DEAE e CM-celulose. A enzima foi purificada 378 vezes. O pH ótimo da enzima purificada ficou entre 5,8 a 6,2 para a atividade dextrinisante, e entre 6,5 a 7,5 para a formação de cicladextrinas. A temperatura ótima para formação de ciclodextrinas situou-se entre 45 e 55°C. A enzima permanecia estável até 55°C por 30min de aquecimento em pH 7,5, e a estabilidade térmica era aumentada mediante a adição de 10mH de CaCl2 . O peso molecular foi estimado em 33.000, por filtração em gel SEPHABEX G-200. A análise das cicladentrinas por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE), mostrou uma proporção de 1:67:1,6 para a, ß e ý-ciclodextrina, respectivamente
Abstract: One strain of Bacillus lentus, having the highest extracellular cyclodextrin glycosyltransferase (E.G. 2.4.1.19) activity, was selected after a screening of microorganisms obtained from soil of the Campinas(SP) area, using alkalophilic culture medium. The enzyme was produced from Bacillus lentus in a liquid culture medium after 4 days at pH 10.3, at 37°C, under aeration. The extracellular cyclodextrin glycosyltransferase was purified through ammonium sulfate fractionation, followed by DEAE and CM cellulose column chromatography . A 378-fold purified enzyme was obtained . The optimum pH ranges for the purified enzyme were 5.8 to 6.2 and 6.5 to 7.5 considering dextrinizing activity and cyclodextrin formation, respectively. The optimum temperature range for the formation of cyclodextrin was from 45 to 55°C. The enzyme was stable for 30min. at 55°C at pH 7.5, and the stability was increased further by addition of 10mM CaCl2 . A molecular weight of 33.000 for the purified enzyme was obtained by Sephadex G-200 gel filtration. Analysis of cyclodextrins by High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC) showed the presence of a, ß and ý forms in the ratio 1:67:1.6.
Doutorado
Doutor em Ciência de Alimentos

Ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) é a enzima capaz de converter o amido e seus açúcares relacionados em ciclodextrinas (CDs) através da reação de ciclização. As CDs têm inúmeras aplicações na indústria farmacêutica, cosmética e de alimentos, devido à sua capacidade de encapsular moléculas hidrofóbicas dentro de sua cavidade. A CGTase de Thermoanaerobacter sp. é capaz de converter o amido em CDs sob condições de processo industrial, em temperaturas elevadas. A produção de CDs em escala industrial é feita, geralmente, em processos de batelada, nos quais é utilizada a enzima livre diretamente. No entanto, a imobilização da CGTase tem sido testada, com o propósito de permitir seu uso contínua e repetidamente, de modo a prevenir sua solubilização e promover uma forma molecular mais estável. Neste trabalho, buscouse imobilizá-la em microesferas de sílica-polietilenoglicol (sílica-PEG). O suporte foi silanizado com 3- aminopropiltrimetoxisilano (APTMS) e ativado com glutaraldeído para gerar condições de imobilização de enzimas, que foi realizada a 6ºC e pH 6, durante 15h. O rendimento de imobilização e a atividade recuperada foram 83% e 73%, respectivamente. Os resultados foram comparados com estudos anteriores sobre a imobilização covalente de CGTase. As propriedades enzimáticas da CGTase imobilizada foram investigadas e comparadas com as da enzima solúvel. CGTases solúveis e imobilizadas apresentaram valores similares de pH ótimo. Por outro lado, a temperatura ótima foi de 100ºC e 80ºC para as formas solúvel e imobilizada da enzima, respectivamente. Em comparação com a CGTase solúvel, a forma imobilizada apresentou maior Km (constante de Michaelis), menor Vmax (velocidade máxima de reação), a estabilidade de armazenamento diminuiu cerca de 15% e apenas um ligeiro decréscimo foi observado quando a estabilidade térmica estava sob avaliação. A estabilidade operacional foi medida em repetidos processos de batelada e a enzima imobilizada reteve cerca de 60% da atividade catalítica inicial, após 15 ciclos.
Cyclodextrin glicosyltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) is the enzyme able to convert starch and related sugars into cyclodextrins (CDs) via cyclization reaction. Cyclodextrins have numerous applications in the pharmaceutical, cosmetics, and food industry, because of their capacity to encapsulate hydrophobic molecules within their cavity. The CGTase from the Thermoanaerobacter sp. is able to degrade starch into CDs under industrial conditions (high temperature). For the industrial scale production of CDs, conventional batch production methods, which utilize soluble CGTase directly, have been mainly adopted. However the immobilization of CGTase has been pursued with the purpose of allow its reuse continuously and repeatedly by avoiding enzyme solubilization and promoting a more stable molecule form. In this research, Thermoanaerobacter CGTase was immobilized on silica-polyethyleneglycol (silica-PEG) microspheres. The support was silanized with 3- aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) and activated with glutaraldehyde to generate conditions for enzyme immobilization, which was carried out at 6ºC and pH 6, during 15h. The immobilization yield and recovery activity was around 83% and 73%, respectively. Results were compared with previous studies on covalent immobilization of CGTase. The enzymatic properties of immobilized CGTase were investigated and compared with those of the soluble enzyme. Soluble and immobilized CGTases showed similar values for optimum pH. On the other hand, the optimum temperature was 100ºC and 80ºC for the soluble and immobilized forms, respectively. In comparison with the soluble CGTase, the immobilized form exhibited higher Km (Michaelis constant), lower Vmax (maximal reaction rate), the storage stability was decreased about 15% and just a slight decrease was observed when thermal stability was under evaluation. The operational stability was evaluated in repeated batch process and the immobilized enzyme retained about 60% of the initial catalytic activity after 15 cycles.

A ciclodextrina glicosiltransferase (EC 2.4.1.19) é a única enzima capaz de converter amido e açúcares relacionados em ciclodextrinas através de reação de ciclização. Estes compostos podem formar complexos de inclusão com moléculas hidrofóbicas, tornando-se importante para aplicação nas indústrias alimentícias, farmacêuticas, agrícolas, químicas e de cosméticos. Um novo microorganismo produtor de CGTase foi encontrado entre bactérias isoladas do solo e foi identificado como Stenotrophomonas maltophilia. A enzima produzida por este microrganismo foi purificada em quatro etapas: precipitação por afinidade com amido, ultrafiltração, cromatografia de troca iônica e cromatografia de interação hidrofóbica. A CGTase assim purificada obteve, aproximadamente, atividade específica de 200.000 U/mg e fator de purificação de 2500. Com uma única banda, o peso molecular da enzima purificada foi estimado em 70kDa por SDS-PAGE. A temperatura ótima para atividade da enzima foi de 60 º C, enquanto que a atividade enzimática permaneceu praticamente estável entre pH 6 e 10, indicando natureza alcalotolerante. Km e Vmax para a enzima pura foram de 2,5 g/mL e 12,5 U/mg de proteína, respectivamente, usando amido solúvel como substrato.
Cyclodextrin glycosyltransferase (EC 2.4.1.19) is the unique enzyme able to convert starch and related sugars into cyclodextrins via cyclization reaction. These compounds can form inclusion complexes with hydrophobic molecules, becoming important for application in the food, pharmaceutical, agricultural, chemical and cosmetics industries. A new microorganism producing the CGTase was found among strains isolated from soil and identified as Stenotrophomonas maltophilia. The enzyme produced by this strain was purified by four steps: starch affinity precipitation, ultrafiltration, ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography. The CGTase thus obtaining specific activity 200,000 U.mg-1 and 2500-fold purification. With a single band, the molecular weight of the purified enzyme was estimated in 70kDa by SDS-PAGE. The optimum temperature for enzyme activity was 60ºC, whereas the enzyme activity remained almost stable between pH 6 to 10, indicating its alkalotolerant nature. Km e Vmax for the pure enzyme were 2.5 g/mL and 12.5 U/mg protein, respectively, using soluble starch as substrate.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-05-12T15:48:30Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ismail Es - 2015.pdf: 2836759 bytes, checksum: cf319655f2dc3d3d3163758c27aa8a40 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5)
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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
Production of a starch-degrading cyclodextrin glicosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) on solid-state culture and batch fermentation was evaluated by free and immobilized alkalophilic Bacillus sp on polymeric chitosan matrix. Immobilization procedure was performed by mixing bacterial cells with low molecular weight chitosan dissolved in HCl. Structure of free bacterial cell, polymeric chitosan matrix and immobilized cells were visualized by scanning electron microscopy (SEM). The images obtained from SEM showed that the procedure used for immobilization was easy, cheap and effective. Three different starch sources as substrate were used: potato, corn and cassava. Qualitative analysis of CGTase production was determined by colorless area formation on solid culture containing phenolphthalein. Enzymatic indices, which indicated the production of CGTase on solid culture, were calculated for both free and immobilized cells on different starch sources. Enzyme activity of CGTase was determined before and after each purification step: ammonium sulfate precipitation, starch adsorption and dialysis. Biomass growth and substrate consumption were analyzed by Flow cytometry and modified phenol-sulfuric acid assay, respectively. Free cells reached very high numbers (2.5 × 107 ml-1) during batch culture, besides; immobilized cells maintained initial inoculum concentration (2.5 × 105 ml-1) during enzyme production. The maximum enzyme activity achieved by free cells was 21.25 U (35 h), 14.65 U (40 h) and 19.16 U (33 h) on cassava, potato and cornstarch, respectively. During batch culture, immobilized cells produced CGTase with the enzyme activity of 24.375 U (16 h) for cassava, 24.375 U (9 h) for potato starch and 21.25 U (8.5 h) for cornstarch in a shorter cultivation time. Consequently, immobilization decreased the production time and increased enzyme activity of CGTase.
A produção e atividade enzimática da “Ciclodextrina glicosiltransferase” (CGTase, EC 2.4.1.19) em cultura sólida e fermentação por batelada por bactérias alcalifílicas livres e imobilizadas em matriz polimérica de quitosana foi avaliada. O procedimento de imobilização foi realizado através da mistura das células bacterianas com quitosana de baixa massa molecular dissolvida em HCl. A estrutura da célula bacteriana livre, a matriz polimérica de quitosana e as células imobilizadas foram visualizadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV). As imagens obtidas por MEV mostraram que o procedimento utilizado para a imobilização foi realizado com sucesso e pode ser considerado como um procedimento simples, barato, rápido e eficaz. Foram utilizados três diferentes fontes do amido como substrato: mandioca, batata e milho. A análise qualitativa da produção da CGTase foi determinada pela formação de área amarela em cultura sólida contendo fenolftaleína. Índices enzimáticos, que indicam a produção da CGTase pelas colônias bacterianas em cultura sólida, foram calculados para ambas as células livres e imobilizadas em diferentes fontes de amido. A atividade enzimática da CGTase foi determinada antes e depois de cada passo de purificação: precipitação com sulfato de amônio, adsorção no amido e diálise. O crescimento da biomassa e consumo do substrato foram analisados por citometria de fluxo e ensaio modificado de fenol - ácido sulfúrico, respectivamente. Células livres atingiram concentrações muito elevadas (2.5 × 107 ml-1) durante a fermentação por batelada, porém as células imobilizadas continuaram com a concentração do inóculo inicial (2.5 × 105 ml-1) durante a produção da enzima. A atividade máxima da enzima obtida por células livres foi 21.25 U (35 h), 14.65 U (40 h) e 19.16 U (33 h) utilizando amido de mandioca, batata e milho, respectivamente. Durante a fermentação batelada, as células imobilizadas produziram a CGTase com a atividade enzimática de 24.375 U (16 h) para a mandioca, 24.375 U (9 h) para fécula de batata e 21.25 U (8.5 h) para o amido de milho. Consequentemente, a imobilização diminuiu o tempo de produção e aumentou a atividade da CGTase.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T15:05:36Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Steffany Ferreira 2012.pdf: 970478 bytes, checksum: 8ca9a2d6fdbc3bdbf9c13613ab646b16 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5)
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O câncer de pele ou tumor cutâneo não-melanoma (TCNM), é a neoplasia maligna de maior incidência no Brasil. Os cânceres, em geral, apresentam padrão de glicosilação aberrante na estrutura de oligossacarídeos de superfície celular (fenótipo), determinada pela ação conjunta de glicosiltransferases (genótipo). O presente estudo objetiva avaliar o perfil glicofenotípico de glicoconjugados de superfície celular de TCNM e correlacionar com o padrão de expressão de sialiltransferases. Cortes (4μm) de biópsias de Carcinoma Basocelular (CBC), Carcinoma Espinocelular (CEC), Ceratose Actínica (CA) e Ceratoacantoma (KA) foram ensaiados com as lectinas SNA, Sambucus nigra agglutinin, (específica para ácidos siálicos ligados na posição α-2,6) e MAA, Maakia amurensis agglutinin (específica para ácidos siálicos na posição α-2,3). A inibição da ligação lectina-carboidrato foi realizada com o ácido siálico (300mM). As amostras também foram avaliadas com anticorpos monoclonais anti-ST3Gal I (específico para β-galactosideo α2,3 sialiltransferase) e anti- ST6Gal I (específico para β-galactosideo α2,6 sialiltransferase). Semelhanças no padrão de sialilação entre CEC, CA e KA foram encontradas na histoquímica com lectinas e, principalmente na imunohistoquímica. O CBC não apresentou marcação na maioria dos casos para ambas as técnicas, indicando que este tipo tumoral apresenta um padrão molecular próprio podendo estar associado ao seu comportamento biológico (baixo potencial invasivo e metastático). Os resultados indicam a importância da sialilação no desenvolvimento e manutenção de tumores cutâneos, sendo a histoquímica com lectinas e a imunohistoquímica ferramentas úteis na determinação deste tipo de glicosilação na superfície de células tumorais.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6472.pdf: 2357652 bytes, checksum: b48a2e541ddf343b775996e49d4e7f1f (MD5) Previous issue date: 2014-03-31
Financiadora de Estudos e Projetos
Cyclodextrins (CDs) are cyclic oligosaccharides that show the ability to encapsulate a large number of organic molecules at the molecular level. Thus, they have large application in pharmaceutical, food, and cosmetics industries. CDs may have different sizes; however the most common are formed by 6, 7, and 8 glucose units, called α, β and γ-CD, respectively. These compounds are produced from starch by hydrolysis catalyzed by cyclodextrin glycosyltransferase ( CGTase - EC 2.4.1.19 ) enzyme. CGTase is commonly produced from bacteria of the genus Bacillus and Klebsiella pneumoniae. Due to the commercial importance of this enzyme and of the microorganisms producing CGTase whose enzyme is capable to produce only one CD, this work aimed to evaluate the CGTase production by the bacterium Paenibacillus sp. F37. The experiments aimed to assess the potential for enzyme production by Paenibacillus sp. F37 strain and also the characterization and classification of the enzyme. Analysis of enzymatic activity was accomplished by cyclization activity of the supernatant of the culture medium, which was monitored by the production rate of β-CD at 50°C, pH 8.0 using a solution of dextrin as substrate. Initially it was evaluated the effect of the pH (6.0 to 10.0) over the microorganism growth into solid Horikoshi medium without starch. It was observed that the microorganism grew better at pH 8.0, being this pH adopted for assays using liquid Horikoshi medium without starch. In this step it was established the following conditions to the bacterium growth: 10h, 37oC, and agitation of 120 rpm in an incubator. The CGTase production step was performed into Horikoshi medium containing 1% (m/v) soluble starch (enzyme inducer), and pH and production time were evaluated. Under standard conditions (37oC, 120 rpm, 16h, and culture medium prepared in 0.1 M tris-HCl buffer pH 9.0) the volumetric activity from the culture medium achieved about 800 U/L, corresponding to a productivity of 50 U/L.h-1. The characterization of the crude enzyme showed that the CGTase from Paenibacillus sp. F37 strain has maximum cyclization activity around 50oC and pH 6.0. Under these conditions the enzyme showed to have a half-life time around 2 h. At the growth conditions (37oC, pH 9.0), the enzyme show to have a half-life time around 3h, being almost inactivated around 5h. Thus, the enzyme production in a medium where pH starts at 9.0 and is decreased to around 6.0 during the growth showed to be a good strategy to prevent denaturation of the enzyme. The CD production into batch reactor and their characterization by colorimetric and chromatographic methods allowed classifying the enzyme as a β-CGTase (ratio α-:β-:γ-CD of 0:1:0.26). At the CD-production conditions (50oC, pH 8.0, 50 g/L of dextrin, 1.6 U/g of dextrin, and 92 h) it was achieved β-CD productivity around 100 mg/L.h. These results showed that Paenibacillus sp. F37 strain is a promising microorganism for producing CGTase.
Ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos de grande importância comercial e que apresentam amplo emprego industrial nos setores farmacêutico, alimentício, de cosmético, dentre outros, por terem a capacidade de encapsulamento ao nível molecular de um grande número de moléculas orgânicas. CDs podem apresentar diversos tamanhos, sendo as que têm 6, 7 ou 8 unidades de glicose, denominadas α, β e γ-CD, respectivamente, são as mais conhecidas. Estas são obtidas a partir da hidrólise do amido pela ação da enzima ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase EC 2.4.1.19). A CGTase geralmente é produzida por bactérias do gênero Bacillus e Klebsiella pneumoniae. Levando em consideração a importância comercial desta enzima e a busca por microrganismos produtores de CGTase que produzam predominantemente uma CD de interesse, esse trabalho buscou avaliar a produção de CGTase a partir de Paenibacillus sp. F37. Os experimentos tiveram como objetivo a avaliação do potencial de produção da enzima por esse microrganismo, bem como a caracterização e a classificação da enzima. A análise de atividade enzimática foi realizada pela atividade de ciclização do sobrenadante do meio de cultivo, que foi monitorada pela taxa de produção de β−CD a 50°C, pH 8,0, usando uma solução de dextrina como substrato. Avaliou-se inicialmente a influência do pH (6,0 a 10,0) no crescimento do microrganismo em meio Horikoshi sólido, sem amido. Observou-se melhor crescimento em pH 8,0, definindo-se esse valor para ensaios de crescimento em meio Horikoshi líquido, sem amido. Nessa etapa definiram-se as condições de crescimento como 10 h, 37ºC e agitação de 120 rpm em câmara incubadora. A etapa de produção da CGTase foi realizada em meio Horikoshi com amido solúvel 1%, m/v (indutor da enzima), avaliando-se pH e tempo de cultivo. Sob condições padronizadas (37ºC, 120 rpm, 16 h e meio de produção preparado em tampão tris-HCl 0,1 M, pH 9,0) atingiu-se uma atividade volumétrica no meio de produção da ordem de 800 U/L, correspondendo a uma produtividade de aproximadamente 50 U/L.h-1. A caracterização da enzima bruta mostrou que a CGTase de Paenibacillus sp. F37 apresenta atividade máxima de ciclização em 50ºC, pH 6,0. Nessas condições a enzima apresentou meia-vida aproximada de 2 h. Nas condições de cultivo (37ºC, pH 9,0), a enzima apresentou baixa estabilidade, com meia-vida em torno de 3 h, sendo praticamente inativada em 5 h. Por isso, produzir a enzima em meio cujo pH inicial é 9,0 e esse reduz-se ao longo do cultivo para em torno de 6,0, mostrou-se uma boa estratégia para prevenir a desnaturação da enzima. A produção de CDs em reator batelada e a sua caracterização colorimétrica e por CLAE permitiram a classificação da enzima como uma β-CGTase (razão α-:β-:γ-CD de 0:1:0,26). Nas condições de produção de CDs (50ºC, pH 8,0, 50 g/L de dextrina, 1,6 U/g de dextrina e 92 h) atingiu-se uma produtividade de β-CD da ordem de 100 mg/L.h. Os resultados indicam, portanto, que Paenibacillus sp. F37 é um microrganismo promissor na produção de CGTase.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-10Bitstream added on 2014-06-13T20:35:51Z : No. of bitstreams: 1 blanco_kc_me_rcla.pdf: 835926 bytes, checksum: 46db69ad433dc1b354710697a08da977 (MD5)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Este trabalho tem como objetivo estudar a produção da enzima ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) empregando culturas de Bacillus sp subgrupo alcalophilus utilizando como fonte de carbono fécula de mandioca (polvilho) proveniente de uma fecularia de mandioca. Nos ensaios foram empregados Bacillus sp subgrupo alcalophilus, isolado de água residuária de uma fecularia de mandioca. Para avaliar a produção de CGTase mediante a atividade enzimática pelo Bacillus sp subgrupo alcalophilus foi utilizado um planejamento fatorial a dois (2) níveis, estudando como variáveis as concentrações da fonte de carbono (polvilho), de nitrogênio e de carbonato de sódio. Os experimentos foram realizados em Erlenmeyers de 300 mL de capacidade contendo 100 mL do meio de produção com pH inicial de 9,2, a 150 rpm e temperatura de 35 ± 1ºC durante 72 horas de fermentação. A produção de CGTase foi monitorada pela determinação da atividade enzimática (U/mL). Após os ensaios realizados em frascos foram realizados experimentos em biorreator de 5 L de volume útil, contendo 2 L do meio de produção, pH de 9,20, agitação de 150 rpm e temperatura de 35 ± 1ºC durante 72 h de fermentação, utilizando um planejamento fatorial a dois (2) níveis, estudando como variáveis as taxas de aeração e a velocidade de agitação. A otimização das concentrações da fonte de carbono, nitrogênio e carbonato de sódio foram obtidas a partir de um planejamento experimental composto central (PCC) e seus resultados analisados pelas superfícies de resposta. Os melhores resultados do planejamento encontrados no ponto central, corresponderam a 6,96 g/L da fonte de carbono, 8,07 g/L de nitrogênio e 9,45 g/L de carbonato de sódio. A maior produtividade obtida de CGTase após 72 horas de fermentação, foi 98,86 U/mL com valor teórico de 98,87 U/mL. A partir do melhor resultado obtido no PCC, determinou-se...
The aim of this study was to investigate the Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) enzyme production by Bacillus sp subgroup alcalophilus using cassava starch (manioc flour) as a carbon source. Bacillus sp subgroup alcalophilus was isolated from wastewater of cassava flour industry. To evaluate the assays results, two (2) levels of complete factorial experimental design was used, studying the variables: carbon source, nitrogen and sodium carbonate concentrations. The experiments were performed in 300 mL erlenmeyer flasks containing 100 mL of medium production with initial pH of 9.2, at 150 rpm and 35±1ºC, during 72 hour. CGTase production was monitored by measurements of enzymatic activity (U/mL). After the flasks experiments, assays was running in 5 L containing 2 L of medium production, pH 9.2, 35 ± 1ºC during 72-hours using a factorial design at two (2) levels for aeration and agitation rate. The optimization of carbon source, nitrogen and sodium carbonate concentrations was obtained by a central composite design and their results analyzed by surface response. The best results was located on the central point, 6.96 g/L of carbon source, 8.07 g/L of nitrogen and 9.45 g/L of sodium carbonate. The CGTase activity predicted by model was 98.86 U/mL and the experimental activity obtained was 98,87 U/mL. After the best results obtained by PCC, the conditions of aeration (vvm) and agitation (rpm) rates was determined in bioreactor using a complete factorial experimental design. The best conditions, of 2.18 vvm and agitation of 157.07 rpm gave a experimental predicted CGTase activity of 130.36 U/mL, which was very close to the theoric CGTase activity of 130.33 U/mL.

Resumo: Este trabalho tem como objetivo estudar a produção da enzima ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) empregando culturas de Bacillus sp subgrupo alcalophilus utilizando como fonte de carbono fécula de mandioca (polvilho) proveniente de uma fecularia de mandioca. Nos ensaios foram empregados Bacillus sp subgrupo alcalophilus, isolado de água residuária de uma fecularia de mandioca. Para avaliar a produção de CGTase mediante a atividade enzimática pelo Bacillus sp subgrupo alcalophilus foi utilizado um planejamento fatorial a dois (2) níveis, estudando como variáveis as concentrações da fonte de carbono (polvilho), de nitrogênio e de carbonato de sódio. Os experimentos foram realizados em Erlenmeyers de 300 mL de capacidade contendo 100 mL do meio de produção com pH inicial de 9,2, a 150 rpm e temperatura de 35 ± 1ºC durante 72 horas de fermentação. A produção de CGTase foi monitorada pela determinação da atividade enzimática (U/mL). Após os ensaios realizados em frascos foram realizados experimentos em biorreator de 5 L de volume útil, contendo 2 L do meio de produção, pH de 9,20, agitação de 150 rpm e temperatura de 35 ± 1ºC durante 72 h de fermentação, utilizando um planejamento fatorial a dois (2) níveis, estudando como variáveis as taxas de aeração e a velocidade de agitação. A otimização das concentrações da fonte de carbono, nitrogênio e carbonato de sódio foram obtidas a partir de um planejamento experimental composto central (PCC) e seus resultados analisados pelas superfícies de resposta. Os melhores resultados do planejamento encontrados no ponto central, corresponderam a 6,96 g/L da fonte de carbono, 8,07 g/L de nitrogênio e 9,45 g/L de carbonato de sódio. A maior produtividade obtida de CGTase após 72 horas de fermentação, foi 98,86 U/mL com valor teórico de 98,87 U/mL. A partir do melhor resultado obtido no PCC, determinou-se... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: The aim of this study was to investigate the Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) enzyme production by Bacillus sp subgroup alcalophilus using cassava starch (manioc flour) as a carbon source. Bacillus sp subgroup alcalophilus was isolated from wastewater of cassava flour industry. To evaluate the assays results, two (2) levels of complete factorial experimental design was used, studying the variables: carbon source, nitrogen and sodium carbonate concentrations. The experiments were performed in 300 mL erlenmeyer flasks containing 100 mL of medium production with initial pH of 9.2, at 150 rpm and 35±1ºC, during 72 hour. CGTase production was monitored by measurements of enzymatic activity (U/mL). After the flasks experiments, assays was running in 5 L containing 2 L of medium production, pH 9.2, 35 ± 1ºC during 72-hours using a factorial design at two (2) levels for aeration and agitation rate. The optimization of carbon source, nitrogen and sodium carbonate concentrations was obtained by a central composite design and their results analyzed by surface response. The best results was located on the central point, 6.96 g/L of carbon source, 8.07 g/L of nitrogen and 9.45 g/L of sodium carbonate. The CGTase activity predicted by model was 98.86 U/mL and the experimental activity obtained was 98,87 U/mL. After the best results obtained by PCC, the conditions of aeration (vvm) and agitation (rpm) rates was determined in bioreactor using a complete factorial experimental design. The best conditions, of 2.18 vvm and agitation of 157.07 rpm gave a experimental predicted CGTase activity of 130.36 U/mL, which was very close to the theoric CGTase activity of 130.33 U/mL.
Orientador: Antonio Carlos Simões Pião
Coorientador: Jonas Contiero
Banca: Heloiza Ferreira Alves do Prado
Banca: Sandra Regina Ceccato Antonini
Mestre

El objetivo de esta Tesis es el desarrollo de nuevas estrategias sintéticas para la síntesis de pirrolidinas y pirrolizidinas, aisladas de fuentes naturales, con actividad inhibidora de glicosidasas y glicosiltransferasas. En esta tesis se ha desarrollado una estrategia sintética estereoselectiva y versátil que ha permitido la síntesis de las broussonetinas C, D, M, O y P. Siendo el paso clave una reacción de metátesis cruzada entre un anillo de pirrolidina común a todas las broussonetinas sintetizadas, sintetizado a partir del aminoácido D-serina, y las diferentes cadenas laterales de cada una de las broussonetinas. Dicha reacción le confiere a la estrategia sintética una gran versatilidad. Dicha estrategia sintética se ha aplicado en la síntesis de otros alcaloides polihidroxilados inhibidores de glicosidasas, que son la radicamina B, la nectrisina y la hiacintacina A2. Dichos compuestos han sido sintetizados a partir de diversos intermedios en la síntesis del anillo pirrolidínico de las broussonetinas. Además se ha desarrollado una nueva estrategia sintética para la síntesis del alcaloide pirrolizidínico australina. Otro objetivo sintético en esta tesis ha sido la anhidrofitoesfingosina Jaspina B, sintetizada a partir del (R)-glicidol.

En aquesta tesi s'ha realitzat un estudi global, sobre les relacions seqüencia-estructura-funció de proteïnes glicosiltransferasa amb plegament GTA, mitjançant un enfocament bioinformàtic i de biologia computacional. La tesi està estructurada en quatre capítols principals. En els dos primers s'aborda aquest estudi per a un enzim essencial de Mycoplasma genitalium involucrada en la síntesi de glicolípids de membrana (MG517). En el tercer capítol s'estudien els canvis de conformació d'un bucle catalític, en el mecanisme d'una proteïna de Micobacterium tuberculosis (GpgS), que inicia la ruta biosintética dels lipopolisacáridos 6-O-metilglucosa (MGLPs) en aquest organisme. Finalment, en el capítol 4 s'aborda la relació entre una regió específica de les glicosiltransferasas amb plegament GTA, i l'especificitat pel substrat. Començant per l'estudi de proteïnes específiques, com la proteïna MG517 de Mycoplasma genitalium o GpgS de Micobacterium tuberculosi, passant pel de les estructures de totes les proteïnes cristal·litzades amb plegament GTA, fins a la utilització de totes les seqüències existents per aquesta superfamilia de proteïnes (més de 100000), s'han trobat característiques comunes a totes elles que relacionen la seqüència, amb l'estructura i la funció de cada proteïna. Tot això s'ha aconseguit utilitzant tècniques i mètodes bioinformàtics i computacionals, entre els quals destaquen: el modelatge per homologia, les simulacions de Dinàmica Molecular i Metadinámica, el Docking de ligandos, la superposició d'estructures tridimensionals, alineaments múltiples i la construcció d'arbres filogenètics. Gràcies a aquest estudi, s'ha pogut identificar una topologia consens comú a totes les GTAs, amb la qual s'ha construït un model tridimensional de la regió N-terminal de la proteïna MG517, de la qual fins ara no existia estructura coneguda. El model tridimensional ha estat validat per dinàmica molecular i experimentalment, la qual cosa ha permès identificar posicions catalítiques clau en MG517 com I193 base general, D40, I126, I169, I170 i I218 d'unió a substrats. A més, per a MG517 s'ha proposat un model d'interacció monotópica amb la membrana, mitjançant una hèlix amfipàtica a la seva regió C-terminal. La mateixa topologia consens, ha permès el refinament d'un alineament múltiple de GTAs, amb el qual s'ha generat un perfil Hidden Makov Model (HMM) per a la regió N-terminal d'aquest grup de proteïnes. Aquest perfil facilita l'alineament de noves proteïnes GTAs i la identificació de les seves estructures secundàries. També ha permès identificar, dins de la topologia consens, una regió de seqüència i estructura molt variable, fins i tot per a proteïnes de la mateixa família, on es posiciona l'acceptor específic de cada proteïna i que hem denominat “Regió Variable”. S'han descrit els canvis de conformació del bucle catalític en la proteïna GpgS mitjançant simulacions de dinàmica molecular de llarga durada i diferents càlculs de metadinámica utilitzant multitud de variables col·lectives. S'ha demostrat que les diferents conformacions són una propietat intrínseca de la proteïna, però estan desplaçades cap a la seva forma inactiva en absència de ligandos. La presència del substrat dador més el metall al centre actiu, promou el moviment de les cadenes laterals de dos residus del bucle, Arg256 i His258, que desplaça l'equilibri cap a la forma activa i l'estabilitza mitjançant la interacció de His258 amb el metall, proposant-se un mecanisme d'ajust induït per a aquesta proteïna. Completant aquests resultats amb càlculs de docking de ligandos, s'ha pogut proposar l'ordre d'entrada dels ligandos, sent l'acceptor el primer a arribar al centre actiu, seguit pel dador, moment en què succeeix el canvi conformacional en el bucle. Arran d'aquestes simulacions, s'ha observat que la interacció del metall amb un residu de histidina en el bucle catalític, és una característica comuna a la gran majoria de famílies GTAs, al costat de les ja conegudes del motiu DXD o la tètrada d'aspartats proposada en literatura D-DXD-D, que es proposa canviar a D-DXD-D-H. S'ha estudiat l'evolució de la superfamilia GTAs i la seva relació amb els substrats, trobant que el plegament global del domini GTA, defineix l'especificitat de l'acceptor i que l'homologia entre seqüències està més influïda per aquesta molècula aceptora del sucre que per la molècula dadora. La regió variable sembla sofrir una pressió evolutiva menor que la resta de la seqüència, la qual cosa explica la seva major variabilitat, no obstant això, conté residus altament conservats que interaccionen amb l'acceptor específic de cada proteïna. S'ha utilitzat aquesta regió per a la generació de perfils HMM específics per a cada acceptor i família de proteïnes. Aquests perfils s'han utilitzat amb èxit pel screening de proteïnes GTA de funció desconeguda i la predicció del seu acceptor.
En esta tesis se ha realizado un estudio global, acerca de las relaciones secuencia-estructura-función de proteínas glicosiltransferasa con plegamiento GTA, mediante un enfoque bioinformático y de biología computacional. La tesis está estructurada en cuatro capítulos principales. En los dos primeros se aborda este estudio para una enzima esencial de Mycoplasma genitalium involucrada en la síntesis de glicolípidos de membrana (MG517). En el tercer capítulo se estudian los cambios conformacionales de un bucle catalítico, en el mecanismo de una proteína de Micobacterium tuberculosis (GpgS), que inicia la ruta biosintética de los lipopolisacáridos 6-O-metilglucosa (MGLPs) en este organismo. Por último, en el capítulo 4 se aborda la relación entre una región específica de las glicosiltransferasas con plegamiento GTA, y la especificidad por el sustrato. Comenzando por el estudio de proteínas específicas, como la proteína MG517 de Mycoplasma genitalium o GpgS de Micobacterium tuberculosis, pasando por el de las estructuras de todas las proteínas cristalizadas con plegamiento GTA, hasta la utilización de todas las secuencias existentes para esta superfamilia de proteínas (más de 100000), se han encontrado características comunes a todas ellas que relacionan la secuencia, con la estructura y la función de cada proteína. Todo ello se ha conseguido utilizando técnicas y métodos bioinformáticos y computacionales, entre los que destacan: el modelado por homología, las simulaciones de Dinámica Molecular y Metadinámica, el Docking de ligandos, la superposición de estructuras tridimensionales, alineamientos múltiples y la construcción de árboles filogenéticos. Gracias a este estudio, se ha podido identificar una topología consenso común a todas las GTAs, con la que se ha construido un modelo tridimensional de la región N-terminal de la proteína MG517, de la que hasta ahora no existía estructura conocida. El modelo tridimensional ha sido validado por dinámica molecular y experimentalmente, lo cual ha permitido identificar posiciones catalíticas clave en MG517 como E193 base general, D40, Y126, Y169, I170 y Y218 de unión a sustratos. Además, para MG517 se ha propuesto un modelo de interacción monotópica con la membrana, mediante una hélice anfipática en su región C-terminal. La misma topología consenso, ha permitido el refinamiento de un alineamiento múltiple de GTAs, con el que se ha generado un perfil Hidden Makov Model (HMM) para la región N-terminal de este grupo de proteínas. Este perfil facilita el alineamiento de nuevas proteínas GTAs y la identificación de sus estructuras secundarias. También ha permitido identificar, dentro de la topología consenso, una región de secuencia y estructura muy variable, incluso para proteínas de la misma familia, donde se posiciona el aceptor específico de cada proteína y que hemos denominado “Región Variable”. Se han descrito los cambios conformacionales del bucle catalítico en la proteína GpgS mediante simulaciones de dinámica molecular de larga duración y distintos cálculos de metadinámica utilizando multitud de variables colectivas. Se ha demostrado que las distintas conformaciones son una propiedad intrínseca de la proteína, pero están desplazadas hacia su forma inactiva en ausencia de ligandos. La presencia del sustrato dador más el metal en el centro activo, promueve el movimiento de las cadenas laterales de dos residuos del bucle, Arg256 e His258, que desplaza el equilibrio hacia la forma activa y la estabiliza mediante la interacción de His258 con el metal, proponiéndose un mecanismo de ajuste inducido para esta proteína. Completando estos resultados con cálculos de docking de ligandos, se ha podido proponer el orden de entrada de los ligandos, siendo el aceptor el primero en llegar al centro activo, seguido por el dador, momento en que sucede el cambio conformacional en el bucle. A raíz de estas simulaciones, se ha observado que la interacción del metal con un residuo de histidina en el bucle catalítico, es una característica común a la gran mayoría de familias GTAs, junto a las ya conocidas del motivo DXD o la tétrada de aspartatos propuesta en literatura D-DXD-D, que se propone cambiar a D-DXD-D-H. Se ha estudiado la evolución de la superfamilia GTAs y su relación con los sustratos, encontrando que el plegamiento global del dominio GTA, define la especificidad del aceptor y que la homología entre secuencias está más influida por esta molécula aceptora del azúcar que por la molécula dadora. La región variable parece sufrir una presión evolutiva menor que el resto de la secuencia, lo que explica su mayor variabilidad, sin embargo, contiene residuos altamente conservados que interaccionan con el aceptor específico de cada proteína. Se ha utilizado esta región para la generación de perfiles HMM específicos para cada aceptor y familia de proteínas. Estos perfiles se han utilizado con éxito para el screening de proteínas GTA de función desconocida y la predicción de su aceptor.
This thesis has conducted a comprehensive study on the sequence-structure-function relations for glycosyltransferase proteins with GTA fold, through a bioinformatic computational biology approach and. The thesis is divided into four main chapters. In the first two, is approached this study by an essential enzyme in Mycoplasma genitalium involved in synthesis membrane glycolipids (MG517). In the third chapter, conformational changes of a catalytic loop are studied in the mechanism of a protein of Mycobacterium tuberculosis (GpgS), which starts the 6-O-methyl glucose biosynthetic pathway of lipopolysaccharide (MGLPs) in this organism. Finally, in chapter 4, the relationship between a specific region of the glycosyltransferase with GTA folding and substrate specificity is addressed. Starting with the study of specific proteins, such as Mycoplasma genitalium MG517 protein or Mycobacterium tuberculosis GpgS, through the structures of all proteins crystallized with GTA folding, and the use of all existing sequences for this protein superfamily (over 100000), it has found common characteristics to them all linking sequence, structure and function of each protein. All this, has been achieved using bioinformatics and computational techniques and methods, among which are: homology modeling, simulations of Molecular Dynamics and Metadinámica, the Docking of ligands, overlapping three-dimensional structures, multiple alignments and phylogenetic tree building. Thanks to this study, it has been possible to identify a consensus topology common to all GTAs, with which it has built a three-dimensional model of the N-terminus of the protein MG517, region which hitherto was known structure. The three-dimensional model has been validated experimentally by molecular and dynamic, which has identified key catalytic MG517 positions as general base E193, D40, Y126, Y169, Y218 I170 and substrate binding. Furthermore, for it has been proposed a MG517 monotopic membrane interaction model by an amphipathic helix in the C-terminal region. The same topology consensus has permitted the refinement of a multiple alignment of GTAs, with which we generate a profile Hidden Makov Model (HMM) for the N-terminal region of this group of proteins. This profile facilitates the alignment of GTAs new proteins and identifying their secondary structures. It has also enabled us to identify, within the consensus topology, a region of highly variable sequence and structure, even for proteins of the same family, where each protein specific acceptor is positioned that we have called "Variable Region". Have been described conformational changes in the catalytic loop GpgS protein, by long duration Molecular Dynamics simulations and different calculations of metadinámica using many collective variables. It has been shown that different conformations, are an intrinsic property of the protein, but are displaced towards its inactive form in the absence of ligands. The presence of the donor substrate plus metal in the active site, promotes the movement of the side chains of two residues of the loop, Arg256 and His258, which shifts the equilibrium to the active form and stabilizes by the interaction of His258 with metal, proposing an induced fit mechanism for this protein. Completing these results with docking of ligands calculations, it has been possible to propose the order of entry of the ligands, being the acceptor the first to reach the active site, followed by the donor, when that happens the conformation loop changes. Following these simulations, it has been observed that the interaction of the metal with a histidine residue in the catalytic loop, is a feature common to the vast majority of GTAs families, with the already known motif DXD or tetrad aspartates proposal in literature D-DXD-D, proposed switch to D-DXD-DH. We have studied the evolution of GTAs superfamily and their relationship with the substrates, finding that the overall folding of GTA domain, defines the acceptor specificity and the homology between sequences is more influenced by the acceptor molecule of sugar than the molecule donor. The variable region seems to suffer less evolutionary pressure than the rest of the sequence, which explains its greater variability, however, contain highly conserved residues that interact with the specific acceptor for each protein. This region has been used for profiling specific HMM for each acceptor and protein family. These profiles have been successfully used for screening GTA proteins of unknown function and predicting their acceptor.