Thèses sur le sujet « Glicosidi »

Contesto scientifico. I glicani rivestono un ruolo cruciale nel sistema nervoso centrale (SNC) e il loro studio è fondamentale per un'accurata comprensione della neurochimica, ma la conoscenza scientifica riguardo ai glicani presenti nel SNC è ancora limitata. Lo scopo di questa tesi è fornire nuovi strumenti al glicochimico e al glicoanalista per condurre studi di neurochimica, funzionali all'esplorazione del ruolo dei glicani nel SNC. Questa tesi presenta un nuovo metodo analitico per lo studio degli N-glicani da tessuti cerebrali (LSD); lo stato dell'arte di un lavoro in corso riguardante l'investigazione di N-glicani e N-glicoproteine differentemente espresse in tessuti cerebrali appartenenti a diverse specie; un efficiente metodo di marcatura chimica per (glico)proteine, applicato con successo a una N-glicoproteina, Neuroserpina (NS), che polimerizza nel SNC con conseguenze patologiche; e le sintesi di glicosidi e glicodendrimeri con potenziali applicazioni in studi neurochimici. Metodi. LSD si sviluppa a partire dalla lisi chimica di tessuti cerebrali (tc), con conseguente precipitazione del proteoma (i.e., metanolo/cloroformio), deglicosilazione enzimatica (i.e., PNGase F), purificazione degli N-glicani, marcatura chimica (i.e., amminazione riduttiva su N-acetilglucosammina terminale) e analisi tramite approcci LC-MS. LSD è stato ottimizzato su campioni di tc e accuratamente validato (i.e., sensibilità, precisione, linearità, range dinamico, selettività, robustezza). L'analisi degli N-glicani è stata anche effettuata tramite deglicosilazione enzimatica in-gel da elettroforesi di proteine, mentre un protocollo di digestione con Tripsina in-gel è stato usato per l'identificazione di N-glicoproteine e siti di N-glicosilazione tramite approcci LC-MS su peptidi. NS è stata dimetilata chimicamente (i.e., amminazione riduttiva su lisina), nella sua forma monomerica (mhNS) e polimerica (phNS) e l'esito della reazione è stato valutato tramite MS, per l'investigazione dei determinanti molecolari coinvolti nel meccanismo di polimerizzazione. I glicosidi sono stati sintetizzati usando una reazione di glicosilazione di tipo Fischer, condotta su monosaccaridi deprotetti, usando alcol allilico e decenolo come accettori glicosidici, mentre i glicodendrimeri sono stati ottenuti sfruttando la chimica delle ossime per la decorazione con gruppi maltosilici di dendrimeri sintetizzati tramite metatesi delle olefine. Risultati. LSD presenta il più basso limite di rivelabilità (1 mg di tc) rispetto a molti altri lavori riportati in letteratura ed è attualmente il metodo di neuro-N-glicomica più accuratamente validato. La deglicosilazione in-gel per l'analisi degli N-glicani cerebrali ha prodotto cromatogrammi informativi per ogni frazione del proteoma con elevata risoluzione (e.g., sensibilità fino a 100 EU da una singola banda di gel), permettendo l'analisi dei peptidi deglicosilati dallo stesso campione (i.e., un totale di 1200 peptidi, 570 proteine, 57 N-glicoproteine, e nuovi siti di N-glicosilazione identificati). La marcatura chimica di NS si è dimostrata efficiente (i.e., 80-90% di resa), compatibile con la struttura nativa della proteina, e funzionale all'uso designato, in quanto capace di evidenziare differenze statisticamente significative nel profilo di marcatura di mhNS e phNS (i.e., 9 lisine). La sintesi di glicosidi ha fornito prodotti con buona resa (e.g., 70%) e alfa-stereoselettività, mentre quella dei glicodendrimeri ha generato molecole esponenti gruppi maltosilici, utilizzabili nel contesto di studi di neurochimica. Conclusioni. I metodi e le molecole contenuti in questa tesi apporteranno beneficio alla comunità scientifica glicochimica, incrementando il numero di strumenti che il glicochimico e il glicoanalista possono utilizzare per portare avanti lo studio degli effetti dei glicani in contesto neurologico e neuromedico.
Background. Glycans play crucial roles within the central nervous system (CNS) and their study is essential for a thorough comprehension of neurochemistry, but the scientific knowledge about CNS glycans remains scarce. The aim of this thesis is to provide the glycochemist and glycoanalyst with novel tools for neurochemistry studies, towards the exploration of glycan roles in the CNS. This thesis presents a novel analytical method for brain N-glycans investigation (LSD); the state of the art of an ongoing work for the investigation of N-glycans and N-glycoproteins differentially expressed in brain tissues of different species; an efficient chemical labelling method for (glyco)proteins, successfully applied on Neuroserpin (NS), a pathologically-polymerising CNS N-glycoprotein; and the syntheses of glycosides and glycodendrimers with potential room for neuromedical studies. Methods. LSD comprised brain tissue (bt) chemical lysis, proteome precipitation (i.e., methanol/chloroform), enzymatic deglycosylation (i.e., PNGase F), N-glycans purification, chemical labelling (i.e., reductive amination on terminal N-acetylglucosamine), and LC-MS bioanalysis. The method has been optimised on bt and thoroughly validated (i.e., sensitivity, precision, linearity, range, selectivity, robustness). N-glycans analysis has also been carried out through protein electrophoresis in-gel deglycosylation, while in-gel trypsinisation was used for the LC-MS identification of N-glycoproteins and N-glycosylation sites. NS has been dimethylated (i.e., reductive amination on lysine) in its monomeric (mhNS) and polymeric (phNS) forms, and the reaction outcome has been evaluated using MS, towards the investigation of NS polymerisation-driving molecular features. Glycosides were synthesised with a Fischer- type glycosylation reaction on unprotected monosaccharides using either allyl alcohol or decenol as glycosyl acceptors, while glycodendrimers were obtained decorating olefin-metathesis-synthesised dendrimers with maltose moieties, exploiting oxime chemistry. Results. LSD displayed the lowest detection limit (1 mg of bt) in comparison to many other works reported in the literature and is the most thoroughly validated neuro-N-glycomic method reported to date. In-gel deglycosylation for brain N-glycans analysis furnished informative chromatograms for every proteome fraction with high resolution (e.g., sensitivity up to 100 EU from a single gel band), permitting the analysis of deglycosylated peptides from the same sample (i.e., a total of 1200 peptides, 570 proteins, 57 N-glycoproteins, and novel N-glycosylation sites identified). NS chemical labelling displayed high efficiency (i.e., 80-90% yield), compatibility with the protein folding, and suitability towards the intended purpose, being able to highlight statistically significant differences in mhNS and phNS labelling patterns (i.e., 9 lysines). The syntheses of glycosides furnished products with good yield (i.e., 70%) and a- stereoselectivity, while that of glycodendrimers afforded molecules exposing several maltose moieties, employable in the context of neurochemistry studies. Conclusions. Methods and molecules delivered within this thesis will benefit the glycochemistry community, by enlarging the glycochemist and glycoanalyst toolkits to carry on the investigation of glycans- related effects in neurological and neuromedical context.

O transporte de α-metil glicosídio ( α-MG) em Saccharomyces cerevisiae foi recentemente reportado como transporte ativo, do tipo simporte de &$945;-MG com H+ mediado pela permease Agt1p. A cepa AP77-11B (cepa selecionada em nosso laboratório) 14C-α-MG pelo mecanismo descrito como difusão facilitada porque não existe co-transporte de H+ durante o transporte de α-MG. Os genes HXT1-HXT17 pertencem à família dos transportadores de hexoses em Saccharomyces cerevisiae. Então, nós decidimos investigar a possibilidade que o transporte de α-MG poderia ser mediado pelos transportadores de hexoses. Nós demonstramos que cepa MC966A (tipo selvagem), KY73 (isogênica com MC966A mas deletada nos HXT1-7), BSY08 (isogênica com KY73 com o AGT1 deletado), BSY09 (isogênica com MC966A com o AGT1 deletado) e a EBY.VW4000 (hxt1-17 agt1 gal2-null), não cresceram em α-MG como fonte de carbono. Além disso, estas cepas não transportaram α-MG por difusão facilitada quando as células foram cultivadas em meio com maltose, levando-nos a concluir que os transportadores de hexoses não estavam envolvidos no transporte de α-MG. Nós observamos que a cepa AP77-11B apresentou alta atividade de α-metilglicosidase periplásmica quando as células foram cultivadas em α-MG. Esta atividade enzimática foi ensaiada usando um método descrito primeiramente para invertase periplásmica, no qual as células eram incubadas com fluoreto de sódio, um inibidor da enolase, antes da incubação com α-MG. Então, a glicose produzida durante a hidrólise do -MG poderia ser determinada. A atividade extracelular só está presente em células cultivadas em -αMG. Células de-reprimidas não mostraram atividade de alpha-metilglicosidase. Os parâmetros cinéticos determinados para α-metilglicosidase, indicaram que esta enzima tem baixa afinidade para o alpha-MG. Além do mais, a atividade específica da alpha-metilglicosidase periplásmica aumentou ao longo da curva de crescimento em α-MG. Os resultados reportados mostraram que existem duas vias de utilização de α-MG em Saccharomyces cerevisiae. Uma via é mediada pela Agt1p, responsável pelo transporte ativo de α-MG. Na outra via, a α -metilglicosidase é secretada para o espaço periplásmico das células. Então, a glicose produzida pela hidrólise do α-MG é transportada pelos transportadores de hexoses por difusão facilitada.
Alpha-Methyl glucoside ( alpha-MG) transport in Saccharomyces cerevisiae was previously reported to be an active transport, a H+ -symport mediated by the Agt1p permease. Strain AP77-11B (a strain obtained in our laboratory) takes up 14C- alpha-MG by a mechanism which was ascribed to be facilitated diffusion since there is no H+-cotransport during the alpha-MG uptake. The HXT1-HXT17 there is no H genes belong to a family of hexose transporters in Saccharomyces cerevisiae. Therefore, we decided to investigate the possibility that -MG transport could be mediated by hexose transporters. We demonstrated that strains MC966A (w.t.), KY73 (isogenic to MC966A but hxt1-hxt7-null), BSY08 (isogenic to KY73 with AGT1 deleted), BSY09 (isogenic to MC966A with AGT1 deleted) and even strain EBY.VW4000 (hxt1-hxt17 agt1 gal2-null), were not able to grow on alpha-MG as the sole carbon source. Moreover, none of them presented alpha-MG transport by facilitated diffusion when the strains were grown on maltose leading us to conclude that the HXT glucose transporters were not involved in alpha-MG transport. We found that strain AP77-11B displayed a high periplasmic alpha-methylglucosidase activity when cells were grown on alpha-MG. This enzymatic activity was assayed using a method first described for periplasmic invertase in which cells were incubated with sodium fluoride, an inhibitor of enolase, prior to the incubation with alpha-MG. Then the glucose produced during alpha-MG hydrolysis could be accurately measured. The extracellular activity was present only in cells grown on alpha-MG. Glucose derepressed cells did not show periplasmic alpha-methylglucosidase activity.

Protein-carbohydrate interactions are at the heart of many important biological processes as the adesion of bacteria and viruses to the cell surfaces. It is widely accepted that nature compensates for the low intrinsic affinity of carbohydrate for proteins through the cooperative binding between multiple copies of ligands and receptors so that a strong adhesion results. This important concept, termed cluster effect, has stimulated the search for the construction of highly glycosylated ligands to inhibit polyvalent processes as well as probe for cell-surfaces-binding events. The aim of this PhD research work was the synthesis of calix[4]arene-based glycoclusters via Cu(I)-catalyzed azide-alkyne coupling reaction (CuAAC), as well as the investigation of their biological proprieties. The first research conducted dealt with the synthesis of sialoside clusters as potential inhibitors of viruses infectivity. Tetra- and octavalent sialoside clusters were prepared exploiting the multiple copper-catalyzed cycloaddition of a propargyl thiosialoside with calix[4]arene polyazides. It was demonstrated that these unnatural motifs did not hamper the desired biological activity of the sialoclusters. In fact, they were able to inhibit, at submillimolar concentrations, the hemagglutination and the viral infectivity mediated both by BK and influenza A viruses. Then, this thesis focused on the possibility to support C-glycoside clusters on microarrays to study their affinity against lectins. To this aim C-glycosylated calix[4]arenes have been synthesized in which four galactose residues are linked through a triazole tether to the upper rim of the macrocycle cavity while an azido group is present on the opposite side. Next the calixsugars were grafted through CuAAC on mono or dipropargyloxymethyl-propanediol moieties allowing the synthesis of oligonucleotides bearing one or two calixarene glycoclusters, respectively. Finally, their affinity for lectins PA-IL and RCA 120, galactose specific lectins from Pseudomonas aeruginosa and Ricinus communis, respectively, were compared to that displayed by linear and antenna-type glycoclusters. During the last period of the PhD work it was performed the immobilization of calix[4]arenebased glycoclusters on TiO2 nanoparticles via Cu(I)-catalyzed azide-alkyne coupling reaction. The strategy that has been followed involved first the grafting of bis-functionalized calix[4]arenes (azido groups at upper rim and fenolic or carboxylic groups at the lower rim) onto TiO2 and then multiple click copper(I)-catalyzed cycloaddition to propargil glycosides. The glyconanoparticles obtained were characterized by thermogravimetric analysis (TGA) and infrared spectroscopy. This constitutes the first example of TiO2 nanoparticles coated by a monolayer of calix[4]arene-based glycoclusters.

Mestrado em Química Orgânica e Produtos Naturais
As 2-estirilcromonas, uma pequena classe de compostos heterocíclicos naturais, têm vindo a cativar o interesse dos químicos orgânicos devido às suas actividades biológicas, nomeadamente a actividade antioxidante. Por outro lado, nos últimos anos, a química dos compostos C-glicosilados, ainda pouco explorada, tem sofrido avanços muito significativos motivados pelo carácter hidrofílico e a estabilidade hidrolítica que a ligação C-glicosídica pode conferir a potenciais agentes farmacológicos, suscitando um promissor impacto medicinal. Nesta dissertação, e no seguimento da química dos compostos naturais explorada pelo grupo de investigação de química orgânica, é apresentado o estudo da rota sintética linear que permitiu a obtenção da (E)-3’,4’,5,7-tetra-hidroxi-2-estirilcromona, pelo método de Baker-Venkataraman. É também estudado o processo de C-glicosilação de compostos polifenólicos através da adopção de dois métodos distintos de C-glicosilação, o uso de D-glucose e o uso de fluoreto de 2,3,4,6-tetra-O-benzil--D-glucopiranosilo. Na elucidação estrutural dos compostos sintetizados recorreu-se essencialmente à espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) [espectros de 1H, 13C e estudos bidimensionais de correlação espectroscópica heteronuclear – HSQC e HMBC], mas também à espectrometria de massa (EM) e à análise elementar.
2-Styrylchromones, a small class of heterocyclic natural compounds, have been attracting the organic chemist’s interest due to their known biological activities, namely the antioxidant activity. On the other hand, in the latter years, the chemistry of C-glycosylated compounds, still little explored, has gained important and significant advances motivated by the electrophilic character and hydrolytic stability that C-glycoside linkage may confer to potential pharmacological agents, arising a promising medicinal impact. In this dissertation, and following the chemistry of natural compounds explored by the organic chemistry group, it is presented the study of the synthetic linear route leading to (E)-3’,4’,5,7-tetra-hydroxy-2-styrylchromone, by the Baker-Venkataraman method. It is also studied the process towards the C-glycosylation of polyphenolic compounds, following two distinct C-glycosylation methods, the use of D-glucose and the use of 2,3,4,6-tetra-O-benzyl--D-glucopyranosyl fluoride. In the structural elucidation of the synthesized compounds the mainly used technique was the nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) [1H, 13C and 2D-NMR techniques HSQC and HMBC], but also mass spectrometry (MS) and elemental analysis.

Dalla lavorazione industriale degli agrumi derivano i sottoprodotti di scarto, essenzialmente scorza e polpa residua denominati in gergo "pastazzo". Il lavoro di ricerca e' stato incentrato sull'utilizzo di pastazzo come fonte energetica e come induttore per funghi del genere Aspergillus, per la produzione di enzimi glicosidici quali à à à ±-L-ramnosidasi (Rha; EC 3.2.1.40) e à à à ²-D-glucosidasi (à à à ²G; EC 3.2.1.21). Sono stati scelti quattro ceppi di Aspergillus: Aspergillus aculeatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger e Aspergillus terreus, scelti in base alla loro capacita' di sintetizzare glicosidasi in presenza di esperidina. Tutti i ceppi sono stati coltivati in terreno liquido utilizzando come induttore il pastazzo, e Aspergillus terreus e' stato scelto come ceppo migliore, in quanto ha presentato un'alta attivita' ±-L-ramnosidasica. Lo scopo ultimo e' quello di applicare tali enzimi nelle bevande di origine vegetale, soprattutto succhi di agrumi, in quanto là à ¢ à à à ±-L-ramnosidasi e la à à à ²-D-glucosidasi agiscono come idrolasi andando a scindere i legami glicosidici dei disaccaridi presenti nei polifenoli naturali come ad es. l'esperidina e convertendola rispettivamente in esperitina-7-glucoside ed esperitina, il corrispettivo aglicone. E' stata effettuata la caratterizzazione chimico-fisica e cinetica della Rha e della à à à ²G, al fine di determinare le relative Km e vmax, temperatura e pH ottimale, e le inibizioni in presenza di zuccheri. L'enzima e' stato parzialmente purificato tramite inattivazione termica, che ha permesso di eliminare l'attivita' à à à ²-D-glucosidasica. Sono anche state effettuate prove di immobilizzazione su silice MS3030. Dai risultati ottenuti emerge una possibile applicazione nel campo dei succhi di frutta.

La hidrólisis de celulosa a azúcares fermentables es una de las etapas clave que deben ser optimizadas para disminuir el costo de producción de bioetanol producido a partir de lignocelulosa, materia prima abundantemente disponible en Chile en desechos agrícolas y forestales. La hidrólisis de celulosa es catalizada por enzimas celulasas, pertenecientes al grupo de las glicosil hidrolasas. Este Trabajo de Memoria de Título tiene como objetivo la identificación y clonación de glicosil hidrolasas, con énfasis en enzimas potencialmente útiles en procesos de producción de bioetanol. La estrategia general de trabajo consistió en la identificación y selección de cepas capaces de degradar celulosa cristalina, a las cuales se dirigió un método de obtención de fragmentos de DNA codificantes de glicosil hidrolasas, enfocado a la actividad exoglucanasa. Un análisis in sílico de la secuencia de los fragmentos de DNA obtenidos indicó que se obtuvieron fragmentos de genes con actividades putativas β-1,3(4)-glucanasa y α-glucosidasa provenientes de cepas de Lentinula edodes y Peniophora gigantea, respectivamente. Estos resultados poseen altos niveles de confianza (con e-values del orden de 10-9 y 10-30, respectivamente). El fragmento correspondiente a la β-1,3(4)-glucanasa contiene el dominio catalítico conservado característico de este tipo de enzimas. Se estima que los fragmentos encontrados representan un 38% de una β-1,3(4)-glucanasa y un 12% de una α-glucosidasa. El método también produjo la obtención de fragmentos de DNA que codificarían enzimas con otras actividades no relacionadas con glicosil hidrolasas, específicamente una transcriptasa reversa y un transportador de urea. Las enzimas β-1,3(4)-glucanasas y α-glucosidasas son potencialmente aplicables en la etapa de pretratamiento de lignocelulosa en la producción de bioetanol de segunda generación y en la etapa de degradación de almidón en la producción de bioetanol de primera generación, respectivamente, entre otras aplicaciones industriales de menor interés para este trabajo. En conclusión, se logró clonar fragmentos de dos glicosil hidrolasas potencialmente aplicables en un proceso de producción de bioetanol. La estrategia utilizada deberá ser perfeccionada para hacerla más específica, logrando el diseño de partidores degenerados más específicos o bien considerando una estrategia global alternativa, tal como utilizar una genoteca de cDNA como templado del método en lugar de DNA genómico.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:05:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005
Objetivo: detectar as alterações macroscópicas e microscópicas do mesentério e do peritônio parietal, quando se administra a solução aquosa de glicose hipertônica a 10% e a 25% na cavidade peritoneal de rato. Métodos: Utilizou-se as amostras de 90 ratas (n=90) “Wistar”, adultas jovens, variando entre 180 – 250 g e enumeradas de 1 a 90, constituindo grupo único e distribuído aleatoriamente em três sub-grupos: A, B e C, contendo cada sub-grupo 30 animais com procedimentos idênticos diferindo apenas no período de observação: 6h; 24h; 48h. Em todos os animais praticou-se incisão longitudinal de pele na linha média ventral. As ratas do sub-grupo A ou grupo-controle, receberam 2 ml de uma solução de cloreto de sódio a 0,9% (NaCl 0,9%) distribuída diretamente na cavidade peritoneal. Usou-se, para isso, seringas descartáveis de 3 ml e posteriormente, seguiu-se de uma síntese em massa da parede abdominal anterior com fio de mononylon 3-0 e excluiu-se o peritônio parietal. Para as ratas dos grupos B e C, (grupo-glicose 10% e grupo-glicose 25%) respectivamente, realizou-se a introdução de 2 ml de soluções de glicose a 10% e 25% na cavidade peritoneal com síntese em massa das paredes abdominais, semelhantes a do grupo A. Resultados: Esses animais foram reoperados nas 6h, 24h e 48h e definiu-se a avaliação macroscópica. Na cavidade peritoneal, observou-se a presença de líquido com uniformidade da serosa e com coloração rósea em toda extensão da área e local estudado. Evidenciou-se presença de congestão vascular. Completou-se a retirada de 90 fragmentos de mesentério e 90 fragmentos de peritônio parietal bilateralmente, totalizando 180 fragmentos. Nenhum animal apresentou necrose e na microscopia do mesentério, as alterações histológicas foram assim distribuídas: 16 casos (17,8%) com inflamação crônica inespecífica; 30 casos (33,4%) com linfonodos hiperplásicos; 10 casos (11,1%) com intensa congestão vascular; 6 casos (6,6%) com fibrose reacional e 28 casos (31,1%) sem alteração, além de ausência de células gigantes, comprovouse uma reação inflamatória de leve intensidade. Nas alterações microscópicas do peritônio parietal, apenas 6 casos apresentaram fibrose reacional (3,3%). Os demais, sem alteração histológica (96,7%). Na análise estatística, não há existência de diferença significativa entre os grupos analisados e as alterações observadas (p>0,05). Conclusões: Concluiu-se, portanto, com base na presente pesquisa, que o uso das soluções de glicose hipertônica e de cloreto de sódio a 0,9% no mesentério e no peritônio parietal não causa necrose tecidual e que o processo inflamatório é de igual intensidade.
Purpose: The objective is to detect the macroscopic and microscopic alterations of the mesenterium and parietal peritoneum when hypertonic glucose aqueous solution 10%- 25% is administrated into the peritoneal cavity of the rat. Methods: Were used 90 Wistar females young rats with weight between 180-250 g, enumerated of 1 to 90, establishing unique group and divided in three groups (A, B, C) of 30 animals chosen aleatory manner. Was used 0,9% saline solution called control group, or group A, 10% glucose solution named group B, and in the others 30 was used 25% glucose solution named group C, differing as soon as in the observation period, (06h, 24h and 48h), but with the same procedure. Was realized a midline abdominal laparotomy wall and in the animals of the control group was injected 2 ml of a 0,9% saline solution into the peritoneal cavity. After, we made a suture in mass without to include the peritonium for the others groups (B, C) the rats received 10% glucose solution and 25% glucose solution injected into the peritoneal cavity respectively. Results: A new surgery was realized in 6h, 24h and 48h, and we observed in macroscopic avaluation presence of fluid and serous uniforme and rosy in all over the cavity. The vascular congestion was present. We made dry out of 90 fragments of mesenterium and 90 fragments of parietal peritonium bilateral. In the microscopic study necrosis doesn´t was present. For the mesenterium histological study we observed 16 cases (17,8%) unspecific chronic inflammation, 30 cases (33,4%) hiperplasic linfonod, 10 cases (11,1%) high vascular congestion, 6 cases (6,6%) reaction fibrosis and 28 cases (31,1%) no alteration. For the parietal peritonium histological study we observed 6 cases (3,3%) reaction fibrosis and 174 cases (96,7%) no alteration. Giant cell was not present. In the analisys statistic there is no significance between the groups (p>0,05). Conclusions: So, we concluded, according to the present research, that hypertonic glucose solution and NaCl 0,9% on the mesenterium and parietal peritonium don´t produce tissue necrosis in a rat`s model and the inflammation process has the same intensity
BV UNIFESP: Teses e dissertações

A química de carboidratos têm sido um importante link entre a síntese orgânica, a biologia e a química medicinal devido ao papel fundamental que açúcares apresentam na glicobiologia. Neste contexto, a ligação amida glicosídica é uma importante conexão encontrada na natureza, sendo uma das formas de ligar um núcleo de carboidrato a outras biomoléculas e produtos naturais, como glicopeptídeos e N-glicosil amidas. Dessa forma, o desenvolvimento de métodos sintéticos para a introdução de núcleos de carboidratos em diferentes estruturas é fundamental. Tendo em vista o interesse do nosso grupo de pesquisa em desenvolver novas estratégias utilizando a química de selênio na funcionalização de derivados de carboidratos, o presente projeto descreve uma metodologia de síntese de N-glicosil amidas e de glicoconjugação via formação de ligação amida, envolvendo a reação entre selenocarboxilatos, gerados in situ, com azidas glicosídicas. Foi possível sintetizar com sucesso uma série de derivados de carboidratos, para uma variedade de substratos que incluíram: N-glicosil amidas furanosídicas (20 exemplos), piranosídicas (13 exemplos) e também N-glicoconjugados graxos (10 exemplos). A metodologia foi baseada na geração in situ de selenocarboxilatos de lítio, a partir de Se0/ LiEt3BH e derivados de ácidos carboxílicos, e suas reações com azidas derivadas de açúcares. Um aspecto importante deste protocolo é que a reação se inicia com selênio elementar e apresenta como subprodutos N2 e Se0. O isolamento e manipulação de espécies intermediárias reativas de selênio são evitadas durante o curso reacional, conferindo ao selenocarboxilato o status de reagente traceless.
Carbohydrate chemistry has been an important link between organic synthesis, biology and medicinal chemistry due to the fundamental roles that sugars play in glycobiology. In this context, the glycosyl amide linkage is an important connection found in nature, since it is one of the ways in which a sugar unit can be found attached to other biomolecules and natural products, such as N-glycosyl amides and glycopeptides that are known for possessing a wide range of bioactivities. Therefore, the development of synthetic methods for the introduction of sugar moieties into various different scaffolds is of paramount importance. In connection with our interest on the development of new strategies using selenium chemistry for the functionalization of carbohydrate derivatives, we describe herein an efficient synthesis of glycosyl amides and glycoconjugation methodology via amide bond-formation, enabled by the reaction of in situ generated selenocarboxylates with glycosyl azides. Carbohydrate-derived amides were successfully prepared in good yields for a broad range of substrates, including: furanosyl (20 examples), pyranosyl (13 examples) N-glycosil amides derivatives and also fatty acids glycoconjugates (10 examples). The methodology relied in the in situ generation of lithium selenocarboxylates, from Se/LiEt3BH and acyl chlorides or carboxylic acids and their reaction with sugar azides. A key aspect of the present protocol is that we start from elemental selenium and as by-products we have harmless gaseous nitrogen and elemental selenium. Isolation and handling of all reactive and sensitive seleniumcontaining intermediates is avoided, therefore assigning to the selenocarboxylate the status of a traceless reagent.

Orientadores: Everson Alves Miranda, Sindélia Freitas Azzoni
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química
Made available in DSpace on 2018-08-25T03:57:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MarinoBohorquez_MayraAlejandra_M.pdf: 2274078 bytes, checksum: b43b1a849020cc996eb872607460441e (MD5) Previous issue date: 2014
Resumo: O crescente interesse pelo aproveitamento da matéria-prima renovável vem demandando novas tecnologias eficientes na produção de etanol de segunda geração a fim de reduzir os altos custos associados com as enzimas envolvidas na sacarificação. Este estudo teve como objetivo principal concentrar, através de precipitação com etanol, glicosil hidrolases responsáveis pelas atividades de endoglucanase, ?-glicosidase, FPase e xilanase produzidas por Trichoderma harzianum P49P11. As variáveis de precipitação testadas foram temperatura, concentração de etanol e pH do fermentado. O etanol demonstrou potencial para recuperar ao redor de 98% da atividade de xilanase correspondente a 17,6 U/mL através de precipitações com 90% de etanol (v/v) em todas as temperaturas testadas (5,0, 15 e 25°C) e pH 5,0. Sob estas mesmas condições de precipitação, 90% de etanol (v/v) e pH 5,0, porém a 5°C, foi obtida a máxima recuperação da atividade de celulase (FPase) sendo 77% correspondente a 0,08 U/mg. Esta última formulação causou precipitação instantânea. Desta forma, a precipitação com etanol pode ser considerada uma técnica eficiente para concentrar xilanase e, em certa medida, para o complexo de celulase
Abstract: Growing interest in the use of renewable raw materials for the production of second generation ethanol has led to the need of new efficient technologies to reduce the high costs associated with saccharification enzymes. This study aimed to concentrate by ethanol precipitation glycosil hydrolases responsible for FPase, ?-glicosidase, endoglucanase and xylanase activities produced by Trichoderma harzianum P49P11. The precipitation variables tested were temperature, ethanol concentration and pH of the fermentation broth. The results showed that the precipitation by ethanol recovered more than 98% of the total xylanase activity using ethanol at concentration of 90% (v/v) at all temperatures tested (5.0, 15 e 25°C) and pH 5.0. The maximum recovery of cellulose activity as FPase was 77% by precipitation carried out at this same ethanol concentration and pH (90% v/v and pH 5.0) but at 5.0°C. This last set of conditions caused almost instantaneous precipitation. Therefore, ethanol precipitation can be considered an efficient technique for xylanase concentration and, to a certain extent, for the cellulase complex
Mestrado
Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos
Mestra em Engenharia Química

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6663.pdf: 3464569 bytes, checksum: 56765698cbf2bedabdd5b1e555a404ae (MD5) Previous issue date: 2015-03-20
Financiadora de Estudos e Projetos
Currently the great challenge for the production of second generation ethanol is to reduce thecost of the enzymes. It is possible to reduce part of this cost by carrying out an optimization ofthe process fermentation using sources of cellulase-induction that allow further growth of fungalbiomass, and increased secretion of proteins. The use of a mutant strain with overexpression ofhemicelulolytics activators could increase expression of the enzymes of interest and therebycontribute to cost reduction. This work aimed to study the production of enzymes involved inthe degradation of biomass by the newly isolated strain of Trichoderma harzianum P49P11focusing on the improvement of the submerged fermentation processes and on the use molecularbiology tools to improve the fungal strain. Regarding the fermentation process, the effects ofdifferent inducing sources were evaluated in flasks and bioreactor using statistical experimentaldesign tools and strategies to enhance biomass in the pre-culture step. For fungal strainimprovement, it was used molecular biology tools for the overexpression of two activators ofcellulases (xyr1 and lae1). A proteomic analysis of the T. harzianum enzymatic extract obtainedusing sugarcane bagasse pretreated by steam explosion followed by delignification (BED) wasperformed. The results showed that the best source for inducing cellulase was BED + sucrose(3: 1), reaching values of 1.21 FPU/mL 80.0U/mL of xylanase and 17.30 U/mL of β-glucosidase. The proteomic analyis identificated 24 different glycoside hydrolases and fourCBM proteins, within 12 different CAZy families. From this study, the enzymatic cocktailproduced "on site" could be supplemented using two accessory enzymes, pectinase and α-Larabinofuranosidase,leading to an increase of 100% of the hydrolysis yield. Regarding thestudy of carbon sources in the pre-culture step, it was possible to increase cellulases productionin 2 times using glycerol as the initial carbon source, followed by inducing carbon source(BED). The xyr1 and lae1 overexpression influencied positively the FPase, CMCase, xylanaseand β-glucosidase production, representing a new approach to increase production of theseenzymes.
Atualmente o grande desafio para a produção de etanol de segunda geração consiste emdiminuir o custo das enzimas degradantes da fibra lignocelulósica. Uma alternativa quepode levar a redução de parte desse custo é a otimização do processo fermentativoutilizando fontes indutoras das enzimas (hemi)celulolíticas que permitam um maiorcrescimento da biomassa fúngica e maior secreção de proteínas. A utilização de umalinhagem mutante com a superexpressão dos ativadores dessas enzimas também podecontribuir nesse sentido. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar a produção deenzimas envolvidas na degradação da biomassa pelo fungo recém-isolado Trichodermaharzianum P49P11 com foco no melhoramento dos processos fermentativos submersose no uso de ferramentas de biologia molecular para o melhoramento da linhagemfúngica. Em relação ao processo fermentativo foi avaliado o efeito de diferentes fontesindutoras em frascos agitados e em biorreator utilizando ferramentas estatísticas deplanejamento de experimentos e estratégias de aumento de biomassa na fase de préinóculo.Em relação ao melhoramento da linhagem fungica foram utilizadas ferramentasde biologia molecular para a superexpressão de dois ativadores de celulases (xyr1 elae1). Para um melhor entendimento das proteínas produzidas em cultivo submerso foirealizado o proteôma do extrato enzimático secretado pelo fungo selvagem em bagaçode cana pré-tratado. Os resultados mostraram que a melhor fonte de carbono indutora decelulases foi o bagaço de cana explodido e deslignificado (BED) + sacarose naproporção 3:1, alcançando valores de 1,21 FPU/mL, 80.0U/mL de xilanse e 17,30 U/mL de β-glicosidase. O proteôma do extrato enzimático de T. harzianum resultou naidentificação de 24 hidrolases glicosídicas diferentes, 4 proteínas CBM dentro de 12diferentes famílias do CAZy. A partir deste estudo pode-se suplementar o coquetelenzimático on site com duas enzimas acessórias, pectinase e α-L-arabinofuranosidaseque aumentaram o rendimento de hidrólise em mais de 100%. Em relação ao estudo dasfontes de carbono na fase de pré-inóculo foi possível aumentar a produção de celulasesem 130% utilizando o glicerol como fonte de carbono inicial, seguida de fonte de18carbono indutora (BED). A aplicação de técnicas de biologia molecular para a mutaçãodo T. harzianum visando a superexpressão de xyr1 e lae teve influência positiva naprodução das enzimas FPase, CMCase, xilanase e β-glicosidase, representando umanova abordagem para aumentar a produção dessas enzimas.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-16Bitstream added on 2014-06-13T20:30:22Z : No. of bitstreams: 1 dourado_gkzs_me_arafcf.pdf: 2109934 bytes, checksum: 79ddf2b14ea1fc3f4779c4b22b8e7f81 (MD5)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Tem sido mostrado que a hesperidina, um flavonóide encontrado nas frutas cítricas e especialmente no suco de laranja, apresenta atividade antiinflamatória e imunomodulatória, entre outras. O presente estudo avaliou os efeitos da ingestão do suco de laranja (SL) como fonte natural da hesperidina, da glicosil hesperidina isolada (GH) e da mistura de ambos (SL-GH), sobre o sistema imune inato de camundongos. Para tanto, foram medidos os parâmetros de produção e inibição da produção de óxido nítrico (NO), e de liberação das citocinas IL-10, IL-12 e TNF- em culturas de macrófagos peritoneais ex vivo. Os macrófagos foram obtidos de grupos de animais previamente tratados com GH, SL, SL-GH ou solução salina (SS). Em seguida as células foram tratadas com GH e lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) in vitro. Os resultados mostraram que o tratamento com suco de laranja estimulou a produção de NO de forma moderada (60μmol de NO- 2) pelos macrófagos, aumentou a liberação da citocina IL-10 e diminuiu significativamente a produção de TNF- . O tratamento com G-hesperidina inibiu completamente a produção de NO em macrófagos mesmo na presença de LPS, aumentou a produção da citocina IL-12 e diminuiu a produção de IL-10. Estes resultados sugerem que a ingestão de suco de laranja é benéfica ao sistema imune, podendo apresentar ação contra possíveis agentes infecciosos. A flavanona Ghesperidina isolada pode ser considerada um composto anti-inflamatório nos casos onde ocorre a intensa liberação de óxido nítrico, tais como as doenças inflamatórias
It has been shown that hesperidin, a flavonoid found in citrus fruits and especially in the orange juice, has anti-inflammatory and immunomodulatory, among others. This study evaluated the effects of ingestion of orange juice (SL) as a natural source of hesperidin, isolated glucosyl hesperidin (GH) and a mixture of both (SL-GH) on the innate immune system of mice. To this end, it was measured the parameters of production and inhibiting the production of nitric oxide (NO), and release of cytokines IL-10, IL-12 and TNF-α in cultures of peritoneal macrophages ex vivo. Macrophages were obtained from groups of animals previously treated with GH, SL, SL-GH or saline solution. Then the cells were treated with GH and bacterial lipopolysaccharide (LPS) in vitro. The results showed that treatment with orange juice stimulated the production of NO in a moderate (60µmol NO- 2) by macrophages, increased the release of cytokine IL-10 and significantly decreased the production of TNF-α. Treatment with G-hesperidin completely inhibited NO production in macrophages, even in the presence of LPS, increased the production of cytokine IL-12 and decreased production of IL-10. These results suggest that ingestion of orange juice is beneficial to the immune system, may bring suit against possible infectious agents. The isolated G-flavanone hesperidin can be considered an anti- inflammatory compound in cases where it occurs intense release of nitric oxide, such as inflammatory diseases

Orientador: Thais Borges César
Banca: Iracilda Zeppone Carlos
Banca: Telma Maria Braga Costa
Resumo: Tem sido mostrado que a hesperidina, um flavonóide encontrado nas frutas cítricas e especialmente no suco de laranja, apresenta atividade antiinflamatória e imunomodulatória, entre outras. O presente estudo avaliou os efeitos da ingestão do suco de laranja (SL) como fonte natural da hesperidina, da glicosil hesperidina isolada (GH) e da mistura de ambos (SL-GH), sobre o sistema imune inato de camundongos. Para tanto, foram medidos os parâmetros de produção e inibição da produção de óxido nítrico (NO), e de liberação das citocinas IL-10, IL-12 e TNF- em culturas de macrófagos peritoneais ex vivo. Os macrófagos foram obtidos de grupos de animais previamente tratados com GH, SL, SL-GH ou solução salina (SS). Em seguida as células foram tratadas com GH e lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) in vitro. Os resultados mostraram que o tratamento com suco de laranja estimulou a produção de NO de forma moderada (60μmol de NO- 2) pelos macrófagos, aumentou a liberação da citocina IL-10 e diminuiu significativamente a produção de TNF- . O tratamento com G-hesperidina inibiu completamente a produção de NO em macrófagos mesmo na presença de LPS, aumentou a produção da citocina IL-12 e diminuiu a produção de IL-10. Estes resultados sugerem que a ingestão de suco de laranja é benéfica ao sistema imune, podendo apresentar ação contra possíveis agentes infecciosos. A flavanona Ghesperidina isolada pode ser considerada um composto anti-inflamatório nos casos onde ocorre a intensa liberação de óxido nítrico, tais como as doenças inflamatórias
Abstract: It has been shown that hesperidin, a flavonoid found in citrus fruits and especially in the orange juice, has anti-inflammatory and immunomodulatory, among others. This study evaluated the effects of ingestion of orange juice (SL) as a natural source of hesperidin, isolated glucosyl hesperidin (GH) and a mixture of both (SL-GH) on the innate immune system of mice. To this end, it was measured the parameters of production and inhibiting the production of nitric oxide (NO), and release of cytokines IL-10, IL-12 and TNF-α in cultures of peritoneal macrophages ex vivo. Macrophages were obtained from groups of animals previously treated with GH, SL, SL-GH or saline solution. Then the cells were treated with GH and bacterial lipopolysaccharide (LPS) in vitro. The results showed that treatment with orange juice stimulated the production of NO in a moderate (60µmol NO- 2) by macrophages, increased the release of cytokine IL-10 and significantly decreased the production of TNF-α. Treatment with G-hesperidin completely inhibited NO production in macrophages, even in the presence of LPS, increased the production of cytokine IL-12 and decreased production of IL-10. These results suggest that ingestion of orange juice is beneficial to the immune system, may bring suit against possible infectious agents. The isolated G-flavanone hesperidin can be considered an anti- inflammatory compound in cases where it occurs intense release of nitric oxide, such as inflammatory diseases
Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-08-31Bitstream added on 2014-06-13T19:40:48Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_dm_dr_arafcf.pdf: 276092 bytes, checksum: b56a8545762b42f4928ba92f1fe5ee46 (MD5)
Universidade Estadual Paulista (UNESP)
Foram estudados os efeitos da natação contínua e intervalada combinada à suplementação com glicosyl - hesperidina (G - hesperidina) sobre os biomarcadores bioquímico se estresse oxidativo em ratos. Os animais (n = 60) foram aleatóriamente divididos em seis grupos, como segue: controles negativos (C) e positivo (CH) para a suplementação com G -hesperidina; e natação contínua ou intervalada, sem (CS e IS , respectivamente) ou com G -h esperidina (CSH e ISH, respectivamente). A G- hesperidina foi a dministrada por método de gavagem durante quatro semanas (1 00 m g /kg de massa corporal) juntamente com os exercício s. A natação contínua foi realizada durante 50 min com uma carga de 5 a 8% da massa corporal da primeira à quarta semana, e a natação intervalada foi realizada durante 50 min, com 1 min de natação seguido por 2 min de repouso, com uma carga de 10 % a 15, 20 e 25% do peso corporal que foi aumentada da primeira à quarta semana. Foi observado um declínio contínuo da glicose sérica em todos os grupos em relação ao controle negativo, como se segue : C (1 00 %) > CH (97 % )> CS (94 % )> CSH (9 1% , p <0, 05 )> IS (8 7% , p <0, 05 )> ISH (80 %, p <0,0 5) . Além disso, a natação contínua ou intermitente associada à G - hesperidina resultou em menor colesterol total ( -16 %, p <0 ,05 ), LD L -C (- 50 %, p <0 ,05 ) e...
We investigated the effects of continuous and interval swimming with glicosyl-hesperidin (G-hesperidin) supplementation on the biochemical and oxidative biomarkers in rats. The animals (n=60) were randomly divided into six groups as follows: negative (C) and positive controls (CH) for G-hesperidin supplementation; and continuous or interval swimming without (CS and IS, respectively) or with G-hesperidin supplementation (CSH and ISH, respectively). G-hesperidin was given by gavage for four weeks (100 mg/kg body mass) together with the exercises. Continuous swimming was performed for 50 min with a load from 5 to 8% of body weight from the first to fourth week, and interval swimming training was performed for 50 min with 1 min of swimming followed by 2 min of resting carrying a load from 10% to 15, 20 and 25% from the first to fourth week. A continuous decline of serum glucose was found with a combined effect of G-hesperidin and swimming as follows:... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Thais Borges César
Banca: Jair Rodrigues Garcia Junior
Banca: Nancy Preising Aptekmann
Banca: Ellen Cristini Freitas
Banca: Enrico Fuini Puggina
Resumo: Foram estudados os efeitos da natação contínua e intervalada combinada à suplementação com glicosyl - hesperidina (G - hesperidina) sobre os biomarcadores bioquímico se estresse oxidativo em ratos. Os animais (n = 60) foram aleatóriamente divididos em seis grupos, como segue: controles negativos (C) e positivo (CH) para a suplementação com G -hesperidina; e natação contínua ou intervalada, sem (CS e IS , respectivamente) ou com G -h esperidina (CSH e ISH, respectivamente). A G- hesperidina foi a dministrada por método de gavagem durante quatro semanas (1 00 m g /kg de massa corporal) juntamente com os exercício s. A natação contínua foi realizada durante 50 min com uma carga de 5 a 8% da massa corporal da primeira à quarta semana, e a natação intervalada foi realizada durante 50 min, com 1 min de natação seguido por 2 min de repouso, com uma carga de 10 % a 15, 20 e 25% do peso corporal que foi aumentada da primeira à quarta semana. Foi observado um declínio contínuo da glicose sérica em todos os grupos em relação ao controle negativo, como se segue : C (1 00 %) > CH (97 % )> CS (94 % )> CSH (9 1% , p <0, 05 )> IS (8 7% , p <0, 05 )> ISH (80 %, p <0,0 5) . Além disso, a natação contínua ou intermitente associada à G - hesperidina resultou em menor colesterol total ( -16 %, p <0 ,05 ), LD L -C (- 50 %, p <0 ,05 ) e... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: We investigated the effects of continuous and interval swimming with glicosyl-hesperidin (G-hesperidin) supplementation on the biochemical and oxidative biomarkers in rats. The animals (n=60) were randomly divided into six groups as follows: negative (C) and positive controls (CH) for G-hesperidin supplementation; and continuous or interval swimming without (CS and IS, respectively) or with G-hesperidin supplementation (CSH and ISH, respectively). G-hesperidin was given by gavage for four weeks (100 mg/kg body mass) together with the exercises. Continuous swimming was performed for 50 min with a load from 5 to 8% of body weight from the first to fourth week, and interval swimming training was performed for 50 min with 1 min of swimming followed by 2 min of resting carrying a load from 10% to 15, 20 and 25% from the first to fourth week. A continuous decline of serum glucose was found with a combined effect of G-hesperidin and swimming as follows:... (Complete abstract click electronic access below)
Doutor

Orientador : Nelson E. Duran Caballero
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica
Made available in DSpace on 2018-08-03T23:39:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro_JulianoSouza_M.pdf: 3174279 bytes, checksum: 2cc9319f05aa72b5f4ab3d2f02b5efa6 (MD5) Previous issue date: 2004
Mestrado

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-02-14T12:52:21Z No. of bitstreams: 1 arquivo total.pdf: 1993500 bytes, checksum: afc116c8137450f5a4f1743f6804afd0 (MD5)
Made available in DSpace on 2017-02-14T12:52:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivo total.pdf: 1993500 bytes, checksum: afc116c8137450f5a4f1743f6804afd0 (MD5) Previous issue date: 2016-03-22
Changes in serum triglycerides and lipoproteins are called dyslipidemias, and are directly related to the risk of cardiovascular disease. The fiber intake has positive effects on the control of serum lipoproteins, among them, cholesterol. Chitosan is a biopolymer originated from the alkaline deacetylation of chitin. It is a natural, non-toxic and considered a dietary fiber. The goat meat has excellent lipid profile, as well as essential amino acids, iron and B vitamins Considering the quality of goat meat and chitosan, associated with the potential use of both in product formulation meat was held this objetivando- search to evaluate the effect of the use of goat sausage added chitosan or chitosan glycosylated in dyslipidemic mice. Sausage three formulations were used with similar fat content, differing in the addition or not of 2% chitosan or chitosan derivative. The animals were housed individually in metabolic cages for 42 days and randomly assigned into five groups (n = 10) Control Group (CONT) received water by gavage; Dyslipidemic Group (DLG), received high fat diet; Sausage Group (SG), was added fat diet of goat sausage; Group sausage with Chitosan (SQG), was added fat diet of goat sausage and chitosan; and Group sausage with Chitosan glycosylated (SQGG) received diet-fat adiconada of goat sausage and glycosylated chitosan. During experimeno was accompanied feed intake and weight of the animals and held two colestas stool (21 and 35 days). It was performed oral glucose tolerance test and the end of the experiment were performed murinométricas measurements, checked the weight of visceral fat, dosed biochemical parameters quantified liver fat and cholesterol from the feces and liver. The serum total cholesterol showed lower levels (p <0.05) in the group treated with chitosan glycosylated (82.0 ± 20.7 mg / dl) compared to other treatment groups and higher levels (p <0, 05) for the group that received only caprine sausage (138.9 ± 14.0 mg / dL), as well as the dosage of HDL-c, where SG had 49.8 ± 11.8 mg / dL. For the oral glucose tolerance test, only SQGG (101.5 ± 13.06 mg / dl) showed low glycemic levels at the start of the test. Quantification of liver fat between treatment groups showed a higher content of DLG (6.48 ± 0.66%) and lower content SQG 4.65 ± 0.65%) among treatment groups. SQGG achieved a reduction of visceral fat by up to 46.6% (p <0.05) compared to the control group and showed a reduction of up to 40% of hepatic cholesterol compared to other dyslipidemic groups (p <0.05). All dyslipidemic groups showed elevated fecal cholesterol levels (p <0.05) compared to the control group in both the first and second collection of stools (p <0.05). The consumption of goat sausage provided biochemical benefits to rats, and the sausage added to chitosan and chitosan glycosylated, especially reduction of hepatic cholesterol. Thus, this product can benefit the health of the consumer dyslipidemic.
Alterações nos níveis séricos de triglicerídios e lipoproteínas são denomidadas de dislipidemias, e estão diretamente relacionadas ao risco de doenças cardiovasculares. A ingestão de fibras tem efeitos positivos no controle dos níveis séricos de lipoproteínas, dentre elas, o colesterol. A quitosana é um biopolímero originado da desacetilação alcalina da quitina. É um produto natural, não tóxico e considerado uma fibra dietética. A carne caprina possui excelente perfil lipídico, além de aminoácidos essenciais, ferro e vitaminas do complexo B. Considerando a qualidade da carne caprina e da quitosana, associado ao potencial de utilização de ambos na formulação de produto cárneo, realizou-se esta pesquisa objetivando-se avaliar o efeito da utilização de salsicha caprina adicionada de quitosana ou quitosana glicosilada em ratos dislipidêmicos. Foram utilizadas três formulações da salsicha, com teor de gordura similares, diferenciando na adição ou não de 2% de quitosana ou derivado de quitosana. Os animais foram mantidos individualmente em gaiolas metabólicas durante 42 dias e randomizados em cinco grupos (n=10), Grupo Controle (CONT), recebeu água por gavagem; Grupo Dislipidêmico (DLG), recebeu dieta hiperlipídica; Grupo Salsicha (SG), recebeu dieta hiperlipídica adicionada de salsicha caprina; Grupo Salsicha com Quitosana (SQG), recebeu dieta hiperlipídica adicionada de salsicha caprina e quitosana; e Grupo Salsicha com Quitosana Glicosilada (SQGG), recebeu dieta hiperlipídica adiconada de salsicha caprina e quitosana glicosilada. Durante o experimeno foi acompanhado o consumo de ração e peso dos animais e realizada duas colestas de fezes (21º e 35º dias). Foi realizado teste de tolerância oral à glicose e ao final do experimento foram realizadas aferições murinométricas, verificado o peso da gordura visceral, dosado parâmetros bioquímicos, quantificado gordura hepática e colesterol das fezes e fígado. Os níveis de colesterol total sérico mostraram menor níveis (p<0,05) para o grupo tratado com quitosana glicosilada (82,0 ± 20,7 mg/dL) em relação aos outros grupos tratados e níveis mais elevados (p<0,05) para o grupo que recebeu apenas a salsicha caprina (138,9 ± 14,0 mg/dL), assim como a dosagem de HDL-c, onde SG apresentou 49,8 ± 11,8 mg/dL. Para o teste de tolerância oral a glicose, apenas SQGG (101,5 ± 13,06 mg/dL) mostrou níveis glicêmicos reduzidos no início do teste. A quantificação de gordura hepática entre os grupos tratados revelou maior teor em DLG (6,48 ± 0,66 %) e menor teor em SQG 4,65 ± 0,65 %) dentre os grupos tratados. SQGG obteve redução de gordura visceral em até 46,6% (p<0,05) comparado ao grupo controle e demonstrou redução de até 40% de colesterol hepático comparando aos demais grupos dislipidêmicos (p<0,05). Todos os grupos dislipidêmicos apresentaram elevados teores de colesterol fecal (p<0,05) comparado ao grupo controle tanto na primeira como na segunda coleta de fezes (p<0,05). O consumo da salsicha caprina proporcionou benefícios bioquímicos aos ratos, assim como a salsicha adicionada de quitosana e quitosana glicosilada, com destaque para redução do colesterol hepático. Sendo assim, este produto pode beneficiar a saúde do consumidor dislipidêmico.

Orientador: Michel Georges Albert Vincentz
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-11T18:45:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DelBem_LuizEduardoVieira_M.pdf: 9371325 bytes, checksum: 4720605c3fed6784b51b26b99feff19c (MD5) Previous issue date: 2008
Resumo: Introdução: Os xiloglucanos são os polímeros de açúcar mais abundantes na hemicelulose da maioria das espécies de plantas terrestres, em especial nas eudicotiledôneas. Possuem papel estrutural na parede celular vegetal, interagindo com os filamentos de celulose, e podem ser utilizados como reserva em sementes de várias espécies de eudicotiledôneas, como o Jatobá (Hymenaea courbaril), onde correspondem a quase 50% do peso seco da semente. Este polímero é formado por uma cadeia central de ß-glucano com ramificações que contêm xilose, galactose e fucose. O mecanismo de degradação deste polímero é realizado por cinco hidrolases: XTH, ß-Galactosidase, ß-Glucosidase,? a-Xilosidase e? a-Fucosidase. Estas enzimas são codificadas por genes que constituem famílias multigênicas nos genomas de plantas, e sua atividade na degradação seletiva de xiloglucano têm papel central na regulação do crescimento e morfogênese da célula vegetal. O Jatobá (Leguminosae) é uma árvore tropical, nativa do Brasil, que vem sendo utilizada como modelo vegetal para estudos de impacto ambiental por efeito estufa e estresses abióticos oriundos do aquecimento global. Foi observado que mudas de Jatobá, crescidas numa atmosfera com 720 PPM de CO2 (dobro da concentração atual), apresentam até 50% de aumento de biomassa aos 100 dias. O entendimento das respostas transcripcionais desta planta, em resposta a estes estresses, pode levar a conclusões à cerca de como as florestas tropicais responderão ao aumento inexorável na concentração de CO2, num quadro de aquecimento global. Resultados: Construímos bibliotecas de cDNA de folhas, caule, cotilédones e raízes de plântulas de 45 dias de Jatobá. Um seqüenciamento amostral dos ESTs levou à obtenção de 103 seqüências, parciais ou completas, de proteínas de Jatobá. São os primeiros dados de ESTs numa árvore tropical brasileira. Análises filogenéticas das enzimas que constituem o mecanismo de degradação de xiloglucano foram conduzidas ao longo de 13 genomas completos e 27 bancos de ESTs de espécies dos mais diversos grupos no reino Viridiplantae. Isso nos permitiu organizar a diversidade destas cinco famílias multigênicas em possíveis grupos de ortólogos (PoGOs). As XTHs foram divididas em seis grupos de genes homólogos e 19 PoGOs. As ß-Galactosidases foram divididas em dois grupos de genes homólogos e 10 PoGOs. As ß-Glucosidases foram divididas em dois grupos de genes homólogos e dois PoGOs. As? a-Xilosidase foram divididas em três PoGOs e as a-Fucosidase em dois PoGOs não relacionados evolutivamente. Conclusões e Perspectivas: As 103 seqüências peptídicas obtidas de Jatobá foram anotadas por comparação e serão disponibilizadas nos bancos de dados internacionais. A perspectiva de seqüenciar mais clones poderá levar à montagem do transcriptoma do Jatobá, algo inédito para uma árvore tropical. Concluímos, com as análises filogenéticas, que as XTHs, que formam um grupo monofilético de genes em Streptophyta, surgiram antes da conquista do ambiente terrestre. Estes genes foram progressivamente amplificados ao longo da evolução das plantas terrestres, o que sugere um ganho progressivo de complexidade, que teve seu auge nas Angiospermas. Apresentamos evidências que podem unir evolutivamente as XTHs exclusivas de plantas a enzimas transglicosiladoras de cadeias de ß -glucano em fungos, o que sugere uma origem comum do processo de transglicosilação de cadeias de ß-glucano como mecanismo de controle do crescimento e formato celular em eucariotos com parede celular. As ß-Galactosidases formam um grupo monofilético em Embryophytas com nove PoGOs, no entanto sua grande diversificação (seis PoGOs) ocorreu apenas em Angiospermas. As ß -Glucosidases formam um grupo monofilético em Embryophytas, seqüências similares em bactérias fotossintetizantes podem sugerir uma origem no ancestral dos cloroplastos. As a -Xilosidase, que são monofiléticas nas Spermatophytas, derivaram das ?a-Glucosidases que se encontram dispersas entre todos os eucariotos, é um caso de neofuncionalização. Duas linhagens distintas evolutivamente de a-Fucosidases foram encontradas, uma delas é monofilética em Embryophytas e a outra pertence a uma grande família multigênica (GDSL-motif) da qual pouco se sabe. Mostramos que o mecanismo completo (cinco hidrolases) de degradação de xiloglucano existia no ancestral comum das Spermatophytas (plantas com semente). Como perspectivas este trabalho permite a racionalização de estudos funcionais destas hidrolases o que, em longo prazo, pode contribuir com processos biotecnológicos que passem pela modificação seletiva da parede celular vegetal.
Abstract: Introduction: Xyloglucans are the main hemicelulose in most of land plants, especially in eudicots. It is a structural compound of plant cell-wall that interacts with cellulose and can be used as seed's energy storage of many species, like Jatoba (Hymenaea courbaril). Xyloglucan structure is composed of a ß-glucan backbone that it branched with xylose, galactose and fucose. Its degradation machinery is composed by five glycosil hydrolases: XTH, ß-Galactosidase, ß-Glucosidase,?a-Xylosidase and? a- Fucosidase. These enzymes are codified by multigenic families in plant's genomes and it plays a central role in key processes like growth and morphogenesis of plant cells. Jatoba (Leguminosae) is a tropical tree, native of Brazil. It's been used as a model tree in researches of plant's responses to stresses caused by global warming and high atmospheric CO2 concentration. It was observed a 50% increase in biomass of a 100 days Jatoba seedling when grown in a 720 PPM of CO2 atmosphere (two times bigger than today's atmospheric concentration). Understand the transcriptional responses to these stresses can lead to conclusions about how tropical forests will respond to high concentrations of CO2 and global warming. Results: We made cDNA libraries of leaves, stem, cotyledons and roots of 45 days seedlings of Jatoba. A preliminary sequencing of these libraries reveled 103 predict protein sequences (most partial sequences). Phylogenetic analyses of xyloglucan hydrolytic enzymes were conducted using 13 completed genomes and 27 ESTs assemblies, from a wild range of taxonomic groups in the Viridiplantae kingdom. It allowed us to divide XTH's diversity of genes into six homology groups and 19 possible groups of orthologues (PoGOs). ß-Galactosidases were divided into two groups of homologues and 10 PoGOs. ß -Glucosidases were divided into two groups of homologues and two PoGOs. a-Xylosidase were divided into three PoGOs and a-Fucosidase into two PoGOs evolutionarily unrelated. Conclusions and Perspectives: The 103 protein sequences of Jatoba were annotated by comparison to known proteins and will be deposited in international sequences assemblies. As a perspective, the sequencing of Jatoba ESTs will lead to the assembly of its transcriptome, something never done before in a tropical tree. We concluded that XTHs are monophyletic group o genes in Streptophyta, what means they emerged before lands conquest by plants. These genes were progressively amplified in land plants evolution, especially in Angiosperms, what suggests a progressive gain in complexity. We showed evidences of a possible evolutionary relation between plant's XTHs and fungus hydrolases/transglycosylases enzymes. It suggests a eukaryotic ancestral mechanism to control cell expansion and shape based in ß -glucan transglycosylation and its interaction to cellulose (in plants) or chitin (in fungus). The ß -Galactosidases are a monophyletic group in Embryophytas that were divided into nine PoGOs, six PoGOs only appeared in Angiosperms. The ß -Glucosidases belongs to a monophyletic group in Embryophytas that has sequence similarity to bacterial proteins, especially ones from photosynthetic bacteria species. The a-Xylosidases are a PoGO in Spermatophyta that probably emerged from a-Glucosidases presents in all eukaryotes. It's probably a neofunctionalization process. Two evolutionary distinct lineages of a-Fucosidases where found, one monophyletic in Embryophytas and another that belongs to the poorly understood multigenic family "GDSL-motif proteins". We showed that the complete machinery (all the five hydrolases) of Xyloglucan degradation already exists in Spermatophytas common ancestor. As a perspective, we expect to rationalize the functional characterization works among these multigenic families and to contribute in biotechnology processes that pass through cell-wall modification and selective control.
Mestrado
Genetica Vegetal e Melhoramento
Mestre em Genética e Biologia Molecular

[EN] Human milk contains a large number of oligosaccharides, either free or bound to proteins and lipids, and their physiological role is mostly unknown. These oligosaccharides are resistant to host gastrointestinal digestion and therefore, a significant proportion reaches the infant colon, where they can be substrates for the resident microbiota. Lacto-N-biose (LNB) and galacto-N-biose (GNB) are the core type-1 sugar structures in HMO and mucin glycoproteins, respectively. They are fermented by species of the genus Bifidobacterium, but, there is no data about their utilization by the genus Lactobacillus. There is also no information for this genus about the metabolism of N-acetyllactosamine (LacNAc), which constitutes the type-2 sugar core in HMO, and lacto-N-triose, which forms part of the structure of lacto-N-tetraose, one of the most abundant HMOs. Lactobacillus casei is a lactic acid bacteria isolated from several environmental niches such as milk, meat, and reproductive and gastrointestinal tracts of animals and humans. In addition, some strains are used as starter cultures in the dairy industry and also as probiotics. The capability of L. casei species to survive in the gastrointestinal tract would depend in part of its ability to metabolize the available carbohydrates. In this Thesis we have shown that this strain is able to grow using LNB, GBN, LacNAc, and lacto-N-triose as carbon sources, and we have characterized the corresponding metabolic pathways. L. casei contains a gene cluster, gnbREFGBCDA, involved in the metabolism of GNB, LNB and also N-acetylgalactosamine. Transcriptional analysis showed that the gnb operon is regulated by substrate-specific induction mediated by the transcriptional repressor GnbR. Upstream of the gnb operon, there are two genes, bnaG and manA, encoding a b-N-acetylglucosaminidase precursor and a mannose-6P isomerase. It has been shown that BnaG is an extracellular wall-attached enzyme and that it is involved on lacto-N-triose metabolism. ManA enzyme is involved in the utilization of the mannose moiety of 3'-N-acetylglucosaminyl-mannose, which is a carbon source for L. casei BL23. Finally, in this strain, LacNAc is transported and phosphorylated by the lactose PTS and it is intracellularly hydrolyzed by the phospho-b-galactosidase LacG into galactose-6P and GlcNAc. Transcriptional analysis showed that the lac operon, in addition to lactose, is also induced by LacNAc. In an effort to better understand the metabolism and bioactive potential of HMO, sufficient quantities are required. In order to have enough amounts of LNB and GNB to test their biological activities, both disaccharides have been synthesized in vitro using the transglycosylation activity of the GnbG glycosyl hydrolase isolated from L. casei. Transglycosylation reactions were scaled and the resulting products were purified, and the yields obtained were 10.7 ± 0.2 g/L of LNB and 10.8 ± 0.3 g/l of GNB. Both disaccharides were used in vitro to determine their potential prebiotic properties using 33 Lactobacillus strains corresponding to 13 different species. It was determined that 21 strains, corresponding to the species L. casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus zeae, Lactobacillus gasseri and Lactobacillus johnsonii were able to metabolize both GNB as LNB. Recently, some scientific evidences suggest an immunomodulatory function for HMO. In vitro analyses to assay this function have been performed for LNB and GNB, and for two fucosyloligosaccharides (Fuc-a-1,3-GlcNAc and Fuc-a-1,6-GlcNAc) previously synthesized in our laboratory. The four disaccharides were able to significantly increase IFN-g production in Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Fuc-a-1,6-GlcNAc was also able to significantly reduce the production of IL13. These results suggest a stimulatory effect on the immune system, and in the particular case of Fuc-a-1,6-GlcNAc, a polarizing effect of immune response Th1 / Th2 towards Th1 populations.
[ES] La leche humana contiene una gran cantidad de oligosacáridos, libres o unidos a lípidos y proteínas, y su función fisiológica es mayoritariamente desconocida. Estos oligosacáridos son resistentes a la digestión y una gran proporción llega al intestino del lactante, donde pueden ser substratos para la microbiota. La lacto-N-biosa (LNB) y la galacto-N-biosa (GNB) son las estructuras tipo-1 que forman el núcleo de los oligosacáridos de la leche humana (OLH) y de las glicoproteínas de la mucina, respectivamente. Los dos azúcares son fermentados por especies del género Bifidobacterium, pero no hay datos acerca de su utilización por el género Lactobacillus. Tampoco hay información para este género acerca del metabolismo de la N-acetil-lactosamina (LacNAc), que constituye la cadena de azúcar tipo-2 en los OLH, y de la lacto-N-triosa, que forma parte de la estructura de la lacto-N-tetraosa, uno de los OLH más abundantes. La capacidad de Lactobacillus casei, de prevalecer en el sistema gastrointestinal dependerá en parte de su versatilidad metabólica para utilizar los carbohidratos disponibles. En la presente Tesis Doctoral se ha demostrado que la cepa L. casei BL23 se puede cultivar en presencia de LNB, GBN, LacNAc, y lacto-N-triosa como fuentes de carbono. En el metabolismo de la LNB, GNB y también N-acetilgalactosamina (GalNAc) está implicado el operon gnbREFGBCDA. Análisis transcripcionales demostraron que el operon gnb está regulado por inducción del substrato mediada por el represor transcripcional GnbR. Por encima del operon gnb, hay dos genes bnaG y manA, que codifican para el precursor de una b-N-acetilglucosaminidasa y una manosa-6P isomerasa. Se ha demostrado que BnaG es un enzima extracelular unido a la pared celular y que está implicado en el metabolismo de la lacto-N-triosa. El enzima ManA está implicada en el metabolismo de la manosa presente en el disacárido 3'-N-acetilglucosaminil-manosa, el cual es también una fuente de carbono para L. casei BL23. Por último, en esta cepa se ha demostrado que la LacNAc es transportada y fosforilada por el PTS de la lactosa e hidrolizada intracelularmente por la fosfo-b-galactosidasa LacG en galactosa-6P y GlcNAc. Análisis transcripcionales demostraron que el operon lac, además de por lactosa, está también inducido por LacNAc. Para intentar comprender mejor el metabolismo y potencial bioactivo de los OLH se necesitan cantidades adecuadas de éstos. Con el objeto de disponer de LNB y GNB en cantidad suficiente para ensayar su actividad biológica, se han sintetizado in vitro ambos disacáridos utilizando para ello la capacidad de transglicosidación de la glicosil hidrolasa GnbG aislada de L. casei. Las reacciones de transglicosidación se escalaron, los productos resultantes se purificaron, y se obtuvieron rendimientos de 10.7 ± 0.2 g/l de LNB y 10.8 ± 0.3 g/l de GNB. Ambos disacáridos fueron utilizados in vitro para determinar sus propiedades prebióticas potenciales con 33 cepas de Lactobacillus correspondientes a 13 especies diferentes. Se determinó que 21 de las cepas, correspondientes a las especies L. casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus zeae, Lactobacillus gasseri y Lactobacillus johnsonii fueron capaces de metabolizar tanto GNB como LNB. Existen evidencias científicas recientes que les atribuyen a los OLH propiedades inmunomoduladoras, así que se han determinado éstas in vitro para LNB y GNB, y para dos fucosiloligosacáridos (Fuc-a-1,3-GlcNAc y Fuc-a-1,6-GlcNAc) sintetizados anteriormente en nuestro laboratorio. Se ha demostrado que los cuatro disacáridos son capaces de incrementar significativamente la producción de IFN-g en Células Mononucleares de Sangre Periférica. El Fuc-a-1,6-GlcNAc además fue capaz de reducir significativamente la producción de IL13. Estos resultados sugieren un efecto estimulante del sistema inmune y en el caso particular del Fuc-a-1,6-GlcNAc un efecto polarizador de la respuesta inmune Th1/Th2
[CAT] La llet humana conté una gran quantitat d'oligosacàrids, lliures o conjugats amb lípids o proteïnes i la seua funció fisiològica és majoritàriament desconeguda. Aquests oligosacàrids són resistents a la digestió i una gran proporció arriba a l'intestí dels lactants, on poden ser substrat per a la microbiota. La lacto-N-biosa (LNB) i la galacto-N-biosa (GNB) són les estructures tipus-1 que conformen el nucli dels oligosacàrids de la llet humana (OLH) i de les glicoproteïnes de la mucina, respectivament. Els dos sucres són fermentats per espècies del gènere Bifidobacterium, però no existeixen dades sobre l'ús pel gènere Lactobacillus. Tampoc no hi ha informació per a aquest gènere sobre el metabolisme de la N-acetil-lactosamina (LacNAc), que cosntitueix la cadena de sucre tipus-2 als OLH i de la lacto-N-triosa, que forma part de l'estructura de als OLH tipus-1 i 2. La capacitat de L. casei, una bactèria làctica aïllada de múltiples nínxols ambientals, de prevaler al sistema gastrointestinal dependrà en part de la seua versatilitat metabòlica per a utilitzar els carbohidrats disponibles. A la present tesi doctoral s'ha demostrat que la soca L. casei BL23 es pot cultivar en presència de LNB, GBN, LacNAc i lacto-N-triosa com a fonts de carboni. Al metabolisme de la LNB, GNB i també de la N-acetilgalactosamina (GalNAc) està implicat l'operó gnbREFGBCDA. Anàlisi transcripcionals demostraren que l'operó gnb està regulat per inducció del substrat mitjançant el repressor transcripcional GnbR. A sobre de l'operó gnb, hi ha dos gens bnaG i manA, que codifiquen per al precursor d'una b-N-acetilglucosaminidasa i una manosa-6P isomerasa. S'ha demostrat que BnaG és un enzim extracel·lular unit a la paret cel·lular i que està implicat en el metabolisme de la lacto-N-triosa. Aquesta és hidrolitzada per BnaG en lactosa i N-acetilglucosamina (GlcNAc). L'enzim ManA està implicada en el metabolisme de la manosa present al disacàrid 3-N-acetilglucosaminil-manosa, el qual també representa una font de carboni per a L. casei BL23. Per concloure, en aquesta soca s'ha demostrat que la LacNAc és transportada i fosforilada pel PTS de la lactosa i hidrolitzada intracel·lularment per la fosfo-b-galactosidasa LacG en galactosa-6P i GlcNAc. Anàlisi transcripcionals demostraren que l'operó lac, a més de per lactosa està induït per LacNAc. Per intentar comprendre millor el metabolisme i potencial bioactiu dels OLH es necessiten quantitats adequades d'aquests. A fi de disposar de LNB i GNB en quantitats suficients per a assajar la seua activitat biològica, s'han sintetitzat in vitro ambdós disacàrids utilitzant per a tal la capacitat de trasglicosidació de la glicosil hidrolasa GnbG aïllada de L. casei. Les reaccions de transglicosidació s'escalaren, els productes resultants es purificaren i s'obtingueren rendiments de 10.7 ± 0.2 g/l de LNB y 10.8 ± 0.3 g/l de GNB. Ambdós disacàrids foren utilitzats in vitro per a determinar les seues propietats prebiòtiques potencials amb 33 soques de Lactobacillus corresponents a 13 espècies diferents. Es determinà que 21 de les soques, corresponents a les espècies L. casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus zeae, Lactobacillus gasseri i Lactobacillus johnsonii foren capaces de metabolitzar tant GNB com LNB. Existeixen evidències científiques recents que atribueixen als OLH propietats immunomoduladores, així que s'han determinat aquestes in vitro per a LNB i GNB i per als dos fucosiloligosacàrids (Fuc-a-1,3-GlcNAc y Fuc-a-1,6-GlcNAc) sintetitzats anteriorment al nostre laboratori. S'ha demostrat que els quatre disacàrids són capaços d'incrementar significativament la producció de IFN-g en Cèllules Mononuclears de Sang Perifèrica. El Fuc-a-1,6-GlcNAc a més, fou capaç de reduir significativament la producció de IL13. Aquests resultats suggereixen un efecte estimulant del sistema immune i en el cas particular del Fuc-a-1,6-GlcNAc un efecte pol
Bidart Costoya, G. (2016). Metabolismo y síntesis de oligosacáridos de la leche humana mediante la utilización de enzimas glicosil hidrolasas de Lactobacillus casei [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/70898
TESIS

MEDEIROS, Suelen Carneiro de. Expressão heteróloga de uma glicosil hidrolase da Família 18 (cv2736) de Chromobacterium violaceum em Pichia pastoris com potencial antibacteriano. 2012. 122 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012.
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Chitinases are enzymes capable of hydrolyzing chitin, a polysaccharide composed of units of N-acetyl-D- glucosamine, which is abundant in nature. The genome sequence of C. violaceum ATCC 12472 has revealed some genes encoding proteins with potential applications in agriculture and medicine, such as those encoding chitinases. This study aimed to express the protein CV2736 in Pichia pastoris KM71H and to evaluate its antimicrobial potential against microorganism of medical importance. To this purpose, the full ORF (encoding rCV2736 PS+) and a partial sequence of it, encoding a truncated protein without its putative signal peptide (rCV2736PS‒), were cloned into the vector pPICZ α A for expression in P. pastoris. The protein rCV2736 PS+ was detected in the cell-free culture medium of P. pastoris cells harboring the corre sponding expression cassete. The recombinant CV2736PS+ was produced in a heterogeneous manner, and when analyzed by SDS-PAGE, three protein bands with apparent molecular masses of 41. 3, 38.1 and 36. 2 kDa were detected. The protein band with the highest molecular mass (41.3 kDa) was stained with the Periodic acid - Schiff’s reagent, thus showing that this band corresponds to N-glycosylated rCV2736PS+. Furthermore, tryptic peptides identified by mass spectrometry (ESI-MS) confirmed the identity of the expressed protein. The recombinant protein produced without the first 22 amino acids(rCV2736PS‒) showed higher chitinase activity than that found for th e fraction containing rCV2736PS+, despite not being detected by SDS-PAGE. The recombinant protein CV2736PS+, present in the fraction F0/95 from the culture medium of induced cells, was active after heat treatment at 50 °C and its maximum chitinolytic activity was recorded at pH 3.0. This fraction was also able to degrade the synthetic substrates 4-nitrophenyl N,N'-diacetyl -β-D-chitobioside and 4-nitrophenyl N,N',N''-triacet yl chitotrioside, which characterizes an endochitinase activity. Abinitio molecular modeling demonstrated that the polypeptide of CV2736 likely folds as a(β/α)8 barrel (also known as TIM barrel), which is typical of the GH18 family proteins. The fraction F0/95 showed antimicrobial activity against Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and growth inhibition against Salmonella cholera-suis. The same fraction were evaluated against the yeast Candida albicans, but was not detectable inhibition of this microorganism in the assay. These results suggest that rCV2736 should be further studied as a new anti-bacterial agent.
Quitinases são enzimas capazes de hidrolisar quitina, um polissacarídeo formado por unidades de N-acetil-β-D-glucosamina, que é extremamente abundante na natureza. Após o sequenciamento do genoma de C. violaceum ATCC 12472, alguns genes referentes a proteínas com potencial biotecnológico foram encontrados, dentre eles os que codificam para quitinases. Este trabalho teve como objetivos expressar a proteína CV2736 de C. violaceum ATCC 12472 de forma recombinante em células de Pichia pastoris KM71H e avaliar seu potencial antimicrobiano frente a microrganismos de importância médica. Para isto, a sequencia completa da ORF (CV2736PS+), bem como uma sequencia parcial, codificando uma proteína truncada, sem um possível peptídeo sinal N-terminal (CV2736PS‒), foram clonadas no vetor de expressão pPICZαA, para expressão em P. pastoris KM71H. A proteína completa (rCV2736PS+) foi detectada em uma fração proteica, contendo as proteínas secretadas para o meio de cultura, por células de P. pastoris transformadas com o respectivo cassete de expressão recombinante. A rCV2736PS+ apresentou-se de forma heterogênea, quando analisada por SDS-PAGE, exibindo três bandas com massas moleculares aparentes de 41,3, 38,1 e 36,2 kDa, respectivamente, sendo uma delas (41,3 kDa) maior do que se poderia deduzir a partir da sequencia de aminoácidos. Após coloração com reagente de Schiff para revelação de glicoproteínas, constatou-se que essa banda (41,3 kDa) correspondia a rCV2736PS+ na sua forma N-glicosilada. Além disso, rCV2736PS+ teve seus peptídeos identificados por espectrometria de massas, na fração F0/95 do meio de cultura livre de células. A proteína recombinante produzida sem os 22 aminoácidos iniciais (rCV2736PS‒) apresentou atividade quitinásica maior que a encontrada para a fração contendo rCV2736PS+, apesar de não ter sido detectada por SDS-PAGE. A fração F0/95 do meio de cultura contendo rCV2736PS+ mostrou-se termoestável até 50°C e com pico de atividade quitinolítica em pH 3,0. A mesma fração apresentou maior atividade endoquitinásica e ativa contra os substratos sintéticos 4-nitrofenil N,N’–diacetil-β-D-quitobiosídeo e 4-nitrofenil N,N’,N’’–triacetilquitotriose. A modelagem molecular evidenciou o dobramento na forma de barril (β/α)8 (barril TIM), típico das proteínas da família GH18. Do mesmo modo, a fração F0/95 foi testada contra seis espécies de bactérias, apresentando atividade microbicida contra Pseudomona aeruginosa, Escherichia coli e Staphylococcus aureus, e foi capaz de inibir o crescimento de Salmonella choleraesuis. A mesma fração foi testada contra a levedura Candida albicans, mas não foi detectada inibição do crescimento contra este microrganismo no ensaio. Portanto, a proteína recombinante rCV2736 pode, assim, ser considerada uma molécula com potencial antibacteriano. Palavras-chave: Quitinase; Pichia pastoris; antimicrobiano; Expressão heteróloga.

Stereoselective Synthesis of 2-Deoxyoliogosaccharides
Autor: Omar Boutureira Martín


La tesi s'emmarca dins el camp de la síntesis de carbohidrats i glicoconjugats i mes concretament sobre la síntesi de 2-desoxi-glicòsids i oligosacàrids, que son unitats estructurals presents en substàncies biològicament actives i/o productes naturals com antitumorals, antibiòtics, agents antiparasitaris, cardiotònics...i a més a més són difícils d'obtenir a partir de carbohidrats naturals.
D'aquesta forma en aquesta tesi s'aborda la síntesis de 2-desoxi-2-iodo-1-tiopiranósids com a nous dadors de glicosil i la seva aplicació en la síntesis estereoselectiva d'oligosacàrids i glicòsids. Aquest dadors de glicosil es caracteritzen per la presència d'un grup fenilsulfanil com a grup sortint en la posició anomèrica (C1) i un grup iode en el C2 que actua com element de control en la reacció de glicosilació.
La memòria s'ha organitzat en una introducció general un capítol d'objectius, i quatre capítols on s'exposen i discuteixen els resultats obtinguts amb les seves corresponents conclusions.
La introducció (Capítol 1) tracta sobre els mètodes de síntesi de 2-desoxiglicòsids de configuracions  i ,. D'aquesta forma es fa una revisió dels mètodes desenvolupats fins avui per la síntesis d'aquest glicòsids. Lligat amb aquests mètodes anteriors, en els objectius (Capítol 2) es posa de manifest la necessitat d'arribar a un nou mètode de síntesis de 2-desoxicarbohidrats que permeti assolir totes les configuracions de piranòsids possibles.
En el Tercer capítol es desenvolupa el nou mètode d'obtenció de 2-desoxi-2 iodo-1-tioglicòsids que després es faran servir com a dadors de glicosil. A partir de pentoses de totes les configuracions i diferentment protegides es van estudiar diferent mètodes d'olefinació per tal d'obtenir polihidroxihexenilsulfurs. El mètode més eficaç en termes de rendiment i estereoselectivitat fou la olefinació amb òxid de fosfina (reacció de Wittig-Horner-WH). Aquests alquenols es van ciclar amb electròfils de iode, conduint de forma regioselectiva als 2-desoxi-2-iodo-1 tiopiranòsids. Aquest compostos es van utilitzar com dadors de glicosil i es van fer reaccionar amb colesterol com a model d'aglicona de diferents compostos bioactius i amb un glucòsid com a model de síntesi d'oligosacàrid.
Donat que la reacció de ciclació i la de glicolació eren activades per el mateix tipus de reactiu, es va pensar en realitzar la síntesi dels 2-desoxi-2-iode-glicòsids de forma consecutiva sense aïllar el tioglicòsid intermedi. Aquest procediment va resultar un èxit conduint al producte final con rendiments mol millors amb estereoselectivitats similars.
En el Quart capítol se estudia las mateixes reaccions que abans però emprant seleni en lloc de sofre i/o iode. Així, en primer lloc s'estudia la reacció de ciclació dels alquenols obtinguts en Capítol 3, però induïda per reactius electròfils de seleni. Se estudia com l'estructura del substrat afecta a la reacció. S'observa que en funció del substrat es formen principalment glicals o inclús selenoglicals. Solament s'obtenen els corresponents 2-desoxi-2-fenilselenenil-tioglicòsids quan existeixen grups protegits amb grups isopropilidé. En aquestos casos però els productes de ciclació amb seleni à la posició 2 son també excel.lents glicosil dadors, i el control de l'estereoselectivitat de la reacció es similar a quan s'utilitza iode.

En la segona part d'aquest Capítol s'estudien mètodes de síntesi de selenoalquens, concluint que la reacció es particularment difícil en el cas dels sucres i que també la reacció de W-H es la més apropiada.
En Capítol 5, aborda el estudi d'un nou mètode de síntesi de sulfanilalquens derivats de carbohidrats mitjançant la reacció de metatesi creuada amb catalitzadors de ruteni amb lligands carbè. La reacció es conegut que presenta elevada dificultat quan s'utilitzen alquens rics en densitat de càrrega com es el cas dels vinilèters o vinilsulfurs, però s'han aconseguit rendiments moderats dels compostos objectiu utilitzant microonas com font de calor i el ús de catalitzadors comercials.
En el Capítol 6 s'exposa la síntesi de glicals a partir del 1-tio-2-desoxi-2 iodo-piranosids. El glicals són compostos molt versàtils i útils en la síntesis de carbohidrats i amb el procediment desenvolupat en aquest capítol s'arribà a obtenir glicals de configuracions difícils d'obtenir per altres mètodes, com el D-allal i el D-gulal. A més, en una segona part del capítol tercer, aplicant un procediment de glicosilació estàndard per a com el de Gin ("dehydrative glycosylation") s'obtenen a partir de 2 iodolactols diversos compostos com a 2 iodoglicals, glicals o 1,1'-disacàrids.
En conjunt i com resultat del treball de recerca desenvolupat s'han posat a punt un nou mètode de síntesi de 2-desoxiglicòsids i 2-desoxi-oligosacàrids, compatible amb totes les configuracions dels sucres i que consta de tres reaccions olefinació de pentoses, ciclació intramolecular induïda per electròfils i glicosilació. Les dues ultimes etapes poden ser realitzades en un sol matràs de forma consecutiva.
El estudi d'aquest mètode ha suposat el posar a punt reaccions d'obtenció de sulfanil i selenenil alquens, els primer per dos procediments diferents (W-H i metatesi creuada), ciclació intramolecular regio i estereoselectiva induïda per electròfils de iode i seleni, y la glicosilació a partir de nous dadors de glicosil (2-deoxi-2-iodo-tioglicòsids i 2-desoxi-2-fenilselenenil-tioglicòsids).

Finalment, El sulfanil alquens preparats han estat utilitzats per posar a punt un nou mètode de síntesi de glicals que permet acce3dir a glicals de totes les configuracions. Els glicals per altra banda son intermedis de síntesi estratègics in síntesi orgànica. Així doncs es pot considerar que els objectius científics plantejats per aquesta Tesi ha sigut àmpliament assolits.
Stereoselective Synthesis of 2-Deoxyoliogosaccharides
Autor: Omar Boutureira Martín

The research described in this thesis aims to investigate a new method for the stereoselective synthesis of 2-deoxyglycosides and oligosaccharides based on a new access to 2-deoxy-2-iodo- and 2-deoxy-2-phenylselenenyl glycosyl donors that would not be limited by the availability of pyranoid glycals and by the stereoselective addition of electrophiles.
Chapter 3 describes our investigation into the application of the general procedure for the stereoselective synthesis of 2-deoxy-2 iodo-hexopyranosyl glycosides from furanoses. The procedure involves three reactions: Wittig-Horner olefination to give alkenyl sulfanyl derivatives, electrophilic iodine-induced cyclization to give phenyl 2-deoxy-2-iodo-1-thiopyranosides, a new type of glycosyl donor, and glycosylation. The olefination reaction afforded alkenyl sulfanyl derivatives in good to excellent yields, except in cases where the conformational freedom is constrained by cyclic protecting groups such as 3,4-O-isopropylidene. The cyclization reaction proceeds with complete regio- and stereoselectivity. The reaction proceeds exclusively as 6-endo cyclization to give phenyl 1-thiopyranoside derivatives. The stereochemistry of the iodine at C-2 is always cis to the neighboring alkoxy group, except for lyxo derivatives which lack cyclic protecting groups. This is a key point in the overall process because the iodine controls the stereoselectivity of the glycosylation reaction. The yield of the cyclization depends on the configuration of the starting material; it is very good for substrates with a ribo or xylo configuration, but more modest for those with an arabino or lyxo configuration. The glycosylation reaction proceeded with good yields and good to excellent stereoselectivities. The glycosidic bond created in the major isomers was always trans to the iodine at C-2. Although phenyl 2-deoxy-2-iodo-1-thioglycosyl donors of all configurations can be accessed using the proposed procedure, it is particularly effective in providing 2-deoxy-2 iodo-β-D-gulo- and -β-D-allo-glycosides. These glycosides are precursors of 2-deoxyglycosides of ribo and xylo configuration, which are difficult to obtain by the classical methodology starting from glycals.
Since 2-deoxy-2-iodo-1-thioglycosides are activated in conditions similar to those used to induce the cyclization, 2-deoxy-2-iodopyranosides were synthesized from sulfanyl alkenes using a "one pot" consecutive cyclization and glycosylation process. The "one pot" procedure has the advantage that it starts directly from the very stable acyclic alkenyl sulfide precursors and does not require isolation of the glycosyl donors. The overall strategy is fairly straightforward and operationally simple. Compared with the stepwise procedure, the "one pot" process gave significantly improved yields with similar or slightly lower selectivities. Furthermore, the "one pot" procedure was successfully applied to the synthesis of 2-deoxy- and 2,6-dideoxyglycosides.
Chapter 4 describes our investigation into the application of the general procedure for the stereoselective synthesis of 2-deoxy-2 phenylselenenyl-hexopyranosyl glycosides from furanoses. We developed 2-deoxy-2-phenylselenenyl-1-thioglycosides as a new class of glycosyl donors that provide access to 2-deoxyglycosides. The cyclization reaction proceeds with complete regio- and stereoselectivity enhanced by employing 3,4-O-isopropylidene as a cyclic bifunctional protecting group. We have also demonstrated that the glycosylation of 2-deoxy-2-phenylselenenyl-1-thioglycosides is highly substrate dependent. Although glycosylation products of all configurations can be accessed by employing the present methodology, it is particularly effective in providing 2-deoxy-2-phenylselenenyl--D-gulo- and --D-allo-glycosides. In particular, regardless of the nature of the solvent employed, the high β-selectivity observed in gulo (α/β ratio 1:14) and more modest in allo (α/β ratio 1:4) series is comparable to that previously observed for analogous glycosylation reactions of 2-deoxy-2-iodo-1-thio-D-gulo- (α/β ratio 1:16) and -D-allo-glycosyl donors (α/β ratio 1:6). Furthermore, the use of phenylselenenyl group at C-2 gave us some insight into the likely pathway of glycosylation reactions by using 2-deoxy-2-phenylselenenyl-1-thioglycosyl donors. Since the stereoselectivity observed is similar to that obtained using 2-deoxy-2-iodo-1-thioglycosides it can be concluded that this explanation is general for the different glycosylations assisted by chalcogens and halogens at C-2.
Since 2-deoxy-2-iodo- and 2-deoxy-2-phenylselenenyl-1-thioglycosides have been evaluated as a new class of glycosyl donors, we became interested in the preparation of other useful glycosyl donors such as 2-deoxy-2-iodo-1-selenoglycosides, and exploit their higher reactivity in developing milder and orthogonal stereoselective glycosylation protocols by using this methodology. Thus, carbohydrate-based vinyl selenides of arabino, ribo, and 2-deoxy-ribo configurations were prepared by Wittig-type reactions of various protected furanoses. Moderate yields were always obtained due to nature and reactivity of both carbohydrate lactols and selenium-based olefinating reagents under the conditions tested. The reaction with electrophiles proved to be challenging and no cyclization products were obtained. The preparation of vinyl selenides proved to be much more difficult than the related vinyl sulfides, which can be prepared in good yields using Wittig-Horner reaction.
Chapter 5 reports olefin cross metathesis reaction between carbohydrate-derived hydroxy alkenes and electron-rich olefinic partners with commercially available ruthenium-based catalysts. Microwave irradiation effectively accelerates the cross metathesis reaction of electron-rich olefins although some of the conversions remained low. Cross metathesis can only be achieved with hydroxy alkenes derived from 2-deoxysugars. In contrast, the hydroxy alkenes bearing an allylic alkoxy group neither isomerizes nor couples under similar conditions.
Chapter 6 reports a new method for accessing pyranoid glycals of different configurations by a short route that uses readily available starting materials, and conventional transformations. Our method is particularly valuable for the synthesis of non-readily accessible glycals such as D-allal and D-gulal that are valuable products to prepare some oligosaccharide molecules with biologically interesting properties.
A series of 2-deoxy-2-iodopyranoses were evaluated as precursors that provide access to pyranoid glycals and 2-iodoglycals from sulfanyl alkenes. This synthetic route involves consecutive cyclization and hydrolysis reactions followed by treatment of the resulting lactol under Gins' dehydrative glycosylation conditions. Despite the fact that this procedure has proved to be an efficient and general glycosylation method, its application to 2-deoxy-2-iodopyranoses did not afford the expected products. Although the observed product distribution (glycals, 2-iodoglycals, and 1,1'-disaccharides) revealed that this reaction is very sensitive to the configuration of the 2-deoxy-2-iodopyranose, 2-iodo pyranoid glycals can be almost exclusively obtained in good yields by employing 3,4-O-isopropylidene as a cyclic bifunctional protecting group.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico
Estudos com extrato de origem vegetal tÃm crescido muito nos Ãltimos anos devido ao aumento da demanda mundial para fins medicinais. Dentre as matÃrias-primas utilizadas, a casca do caule de Amburana cearensis tem sido objeto de estudos devido sua utilizaÃÃo ao combate a doenÃas respiratÃrias. Compostos presentes na casca do caule, tais como, isocampferÃdio, campferol e amburosÃdio sÃo responsÃveis pela atividade broncodilatadora, analgÃsica e anti-inflamatÃria. Neste contexto, o objetivo deste trabalho consiste em otimizar o processo de extraÃÃo de amburosÃdio A presente na casca do caule de Amburana cearensis. Inicialmente, conduziram-se experimentos para avaliar o efeito de diferentes processos (Soxhlet, MaceraÃÃo DinÃmica e ExtraÃÃo Assistida por Ultrassom) na extraÃÃo de amburosÃdio A. Diferentes solventes, (Ãgua, etanol e Ãgua + etanol 1:1) foram utilizados. TambÃm foi realizado um planejamento experimental para avaliar a influÃncia de algumas variÃveis (PotÃncia e Tempo) sobre a extraÃÃo e analisado a remoÃÃo de aÃÃcares do extrato por dois processos: adsorÃÃo e fermentaÃÃo. Cromatografia LÃquida de Alta EficiÃncia acoplada a EspectrÃmetro de Massa (CLAE-MS) foi utilizada para quantificar o teor de amburosÃdio A extraÃdo. De acordo com os resultados, os extratos obtidos pelo processo de maceraÃÃo dinÃmica apresentaram maiores quantidades do composto. Extratos obtidos por ExtraÃÃo Assistida por Ultrassom apresentaram valores de concentraÃÃo prÃximos ao obtido por maceraÃÃo dinÃmica. ExtraÃÃo realizada com Ãgua + etanol (1:1) apresentou teor de amburosÃdio A maiores em relaÃÃo aos outros solventes. As variÃveis potÃncia e interaÃÃo potÃncia x tempo foram significativas no processo de ExtraÃÃo Assistida por Ultrassom. Analisando a relaÃÃo das variÃveis, a melhor condiÃÃo encontrada para obter amburosÃdio A por Ultrassom foi potÃncia de 100% durante 6 minutos. O processo de adsorÃÃo mostrou-se mais eficiente, na remoÃÃo de aÃÃcar, em relaÃÃo ao processo de fermentaÃÃo. PorÃm ambos os processos reduziram a concentraÃÃo de amburosÃdio durante a remoÃÃo de aÃÃcares.
Studies with extracts of vegetable origin have grown tremendously in recent years due to increased global demand for medicinal purposes. Among the raw materials used, the stem bark of A. cearensis A. Smith C has been studied because of its use to combat respiratory diseases. Compounds present in the bark, such as isocampferÃdio, kaempferol and amburosÃdio are responsible for the bronchodilator, analgesic and anti - inflammatory activity. In this context, the aim of this work is to optimize the extraction process of the present amburosÃdio A stem bark of A. cearensis. Initially, experiments were conducted to evaluate the effect of different processes ( Soxhlet , Maceration Dynamic and Ultrasound Assisted Extraction ) in extracting amburosÃdio A. Different solvents (water, ethanol and water + ethanol 1:1) were used. An experimental design was also performed to evaluate the influence of some variables (power and time) on the extraction and removal of sugars analyzed the extract by two processes: adsorption and fermentation. High Performance Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometry (HPLC -MS) was used to quantify the amount of the extracted amburosÃdio. According to the results, the extracts obtained by dynamic steeping process showed higher amounts of the compound. Extracts obtained by extraction Assisted Ultrasound showed concentration values close to that obtained by dynamic steeping. Extraction made with water + ethanol (1:1) showed greater amburosÃdio A content compared to other solvents. The variable power and power x time interaction were significant in Ultrasound Assisted Extraction process. Analyzing the relationship of the variables, the best condition found for amburosÃdio A Ultrasonic was 100% power for 6 minutes. The adsorption process was more efficient in the removal of sugar compared to the fermentation process. But both processes have reduced the concentration of amburosÃdio during removal of sugars.

LIMA, M. V. Avaliação de diferentes técnicas de extração do glicosídio fenólico bioativo amburosídio A a partir da casa do caule de camuru (Amburana cearensis). 2014. 56 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) - Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014.
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Studies with extracts of vegetable origin have grown tremendously in recent years due to increased global demand for medicinal purposes. Among the raw materials used, the stem bark of A. cearensis A. Smith C has been studied because of its use to combat respiratory diseases. Compounds present in the bark, such as isocampferídio, kaempferol and amburosídio are responsible for the bronchodilator, analgesic and anti - inflammatory activity. In this context, the aim of this work is to optimize the extraction process of the present amburosídio A stem bark of A. cearensis. Initially, experiments were conducted to evaluate the effect of different processes ( Soxhlet , Maceration Dynamic and Ultrasound Assisted Extraction ) in extracting amburosídio A. Different solvents (water, ethanol and water + ethanol 1:1) were used. An experimental design was also performed to evaluate the influence of some variables (power and time) on the extraction and removal of sugars analyzed the extract by two processes: adsorption and fermentation. High Performance Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometry (HPLC -MS) was used to quantify the amount of the extracted amburosídio. According to the results, the extracts obtained by dynamic steeping process showed higher amounts of the compound. Extracts obtained by extraction Assisted Ultrasound showed concentration values close to that obtained by dynamic steeping. Extraction made with water + ethanol (1:1) showed greater amburosídio A content compared to other solvents. The variable power and power x time interaction were significant in Ultrasound Assisted Extraction process. Analyzing the relationship of the variables, the best condition found for amburosídio A Ultrasonic was 100% power for 6 minutes. The adsorption process was more efficient in the removal of sugar compared to the fermentation process. But both processes have reduced the concentration of amburosídio during removal of sugars.
Estudos com extrato de origem vegetal têm crescido muito nos últimos anos devido ao aumento da demanda mundial para fins medicinais. Dentre as matérias-primas utilizadas, a casca do caule de Amburana cearensis tem sido objeto de estudos devido sua utilização ao combate a doenças respiratórias. Compostos presentes na casca do caule, tais como, isocampferídio, campferol e amburosídio são responsáveis pela atividade broncodilatadora, analgésica e anti-inflamatória. Neste contexto, o objetivo deste trabalho consiste em otimizar o processo de extração de amburosídio A presente na casca do caule de Amburana cearensis. Inicialmente, conduziram-se experimentos para avaliar o efeito de diferentes processos (Soxhlet, Maceração Dinâmica e Extração Assistida por Ultrassom) na extração de amburosídio A. Diferentes solventes, (água, etanol e água + etanol 1:1) foram utilizados. Também foi realizado um planejamento experimental para avaliar a influência de algumas variáveis (Potência e Tempo) sobre a extração e analisado a remoção de açúcares do extrato por dois processos: adsorção e fermentação. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrômetro de Massa (CLAE-MS) foi utilizada para quantificar o teor de amburosídio A extraído. De acordo com os resultados, os extratos obtidos pelo processo de maceração dinâmica apresentaram maiores quantidades do composto. Extratos obtidos por Extração Assistida por Ultrassom apresentaram valores de concentração próximos ao obtido por maceração dinâmica. Extração realizada com água + etanol (1:1) apresentou teor de amburosídio A maiores em relação aos outros solventes. As variáveis potência e interação potência x tempo foram significativas no processo de Extração Assistida por Ultrassom. Analisando a relação das variáveis, a melhor condição encontrada para obter amburosídio A por Ultrassom foi potência de 100% durante 6 minutos. O processo de adsorção mostrou-se mais eficiente, na remoção de açúcar, em relação ao processo de fermentação. Porém ambos os processos reduziram a concentração de amburosídio durante a remoção de açúcares.

Orientadores: Glaucia Maria Pastore, Fábio Márcio Squina
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
Made available in DSpace on 2018-08-22T10:16:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_JunioCota_D.pdf: 6755717 bytes, checksum: 8ce3ba1fb6b01179b70462bf26349499 (MD5) Previous issue date: 2013
Resumo: Atualmente há uma crescente demanda para o desenvolvimento de combustíveis não-fósseis alternativos. Assim, como a biomassa lignocelulósica é uma das fontes de energia mais abundantes na natureza, pode ser estabelecida uma economia verde e sustentável, com o objetivo de processar a grande quantidade de energia estocada nessas matérias-primas. O etanol de cana-de-açúcar é uma das melhores opções em biocombustíveis e sua produção pode mais que dobrar, se os açúcares constituintes da parede celular vegetal forem utililizados. No entanto, o alto custo de produção das enzimas para hidrolisar e processar os materiais lignocelulósicos é um fator altamente limitante para o uso de tecnologias verdes. Este trabalho se propôs a avaliar novos biocatalisadores e construir uma enzima quimérica na tentativa de obter glicosidases com melhor desempenho que as já relatadas. Enzimas despolimerizadoras de ß-1,3-glucanos têm consideráveis aplicações biotecnológicas, incluindo produção de biocombustíveis, insumos químicos e farmacêuticos. No segundo capítulo, mostramos a caracterização funcional e a estrutura de baixa resolução da laminarase hipertermofílica de Thermotoga petrophila (TpLam), além de seu modo de operação por eletroforese capilar de zona, mostrando que ela cliva especificamente ligações ß-1,3-glucosídicas internas. O dicroismo circular (CD) UV-distante demonstrou que TpLam é formada principalmente por elementos estruturais do tipo beta, e a estrutura secundária é preservada após incubação por 16 horas a 90 º C. A forma determinada pelo pequeno espalhamento de raios-X a baixo ângulo revelou uma arquitetura de multi-domínio da enzima, com um arranjo de envelope em forma de V, no qual os dois módulos de ligação de carboidrato estão ligados ao domínio catalítico. A engenharia de enzimas multifuncionais pode melhorar coquetéis enzimáticos para tecnologias emergentes de biocombustíveis. Dinâmica molecular através de modelos baseados em estrutura (SB) é uma ferramenta eficaz para avaliar a disposição tridimensional das enzimas quiméricas, bem como para inferir a viabilidade funcional antes da validação experimental. No terceiro capítulo, descrevemos a montagem computacional de uma quimera bifuncional xilanase-liquenase (XylLich), usando os genes xynA e bglS de Bacillus subtilis. As análises in silico da área de superfície acessível ao solvente (SAS) e da raiz quadrada média das flutuações (RMSF) previram uma quimera completamente funcional, ou seja, uma enzima cujo substrato tem acesso ao seu sítio catalítico com pequenas flutuações e variações ao longo das cadeias polipeptídicas. A quimera preservou as características bioquímicas das enzimas parentais, com exceção de uma pequena variação na temperatura de operação e na eficiência catalítica (kcat / Km). Também foi verificado ausência de mudanças significativas no modo de operação catalítico. Além disso, a produção de enzimas quiméricas pode ser mais rentável do que a produção de uma única enzima separadamente, comparando-se o rendimento da produção de proteína recombinante e a atividade hidrolítica da enzima quimérica com as enzimas parentais. ß-Glicosidases (BGLs) são enzimas muito úteis e com grande potencial para serem empregadas em diversos processos industriais. Entretanto, algumas características são essenciais para tornar viáveis as aplicações, como por exemplo estabilidade à temperatura e ao pH, bem como baixa inibição por íons e outros compostos químicos. Assim, no quarto capítulo buscamos estudar três BGLs dos organismos extremófilos Pyrococcus furiosus e Thermotoga petrophila. Os genes PfBgl1, TpBgl1 and TpBgl3 foram clonados no vetor pET28a e as proteínas expressadas em Escherichia coli e posteriormente purificadas em duas etapas cromatográficas. As enzimas purificadas foram avaliadas quanto ao pH e temperatura de atividade, sendo que as BGLs da família GH1 (PfBgl1 e TpBgl1) apresentaram faixas mais largas de pH e temperatura de operação do que a família GH3 (TpBgl3). As BGLs mostraram grande estabilidade ao pH e o maior tempo de meia-vida (a 99 ° C) foi verificado no pH 6, e além disso, não foram significativamente afetadas pela presença de EDTA ou de íons, exceto a TpBgl1 que foi inibida por Hg2+ e Fe2+. As atividades específicas para um conjunto de diferentes substratos sugeriram que TpBgl3 é mais específica que as BGLs GH1. O kcat e kcat / Km em 4-nitrofenol-ß-D-glicopiranosídeo (pNPG) indicam que TpBgl3 é a mais eficiente para hidrólise do substrato, embora seja a enzima que foi inibida com a menor concentração de glicose (30.1 mM). Além disso, as BGLs foram analisadas quanto à influência de seis monossacarídeos na catálise, e demonstraram serem fracamente inibidas pela maioria dos açúcares testados. Os ensaios de CD UV-distante revelaram que a estrutura secundária das BGLs não é afetada pelas variações de pH, e os estudos de desnaturação térmica evidenciaram que as BGLs são proteínas hipertermofílicas
Abstract: There is an increasing demand for the development of alternative non-fossil fuels. Thus, since the lignocellulosic biomass is the most abundant source in nature, it may be settled a green and sustainable economy, aiming to process the great amount of energy stocked in these raw materials. The ethanol from sugarcane is one of the best options concerning biofuels and its productivity could be raised more than double if the use of sugars constituents of plant cell wall is considered. However the high production cost of the enzymes to hydrolyze and process lignocellulose is a great limiting factor for green technologies. In this way, this work proposed to evaluate new enzymes and engineer a chimeric enzyme in the attempt to prospect glycosyl hydrolases with better performance than those reported up to date. 1,3-ß-Glucan depolymerizing enzymes have considerable biotechnological applications including the production of biofuels, feedstock-chemicals and pharmaceuticals. In the first chapter we showed the comprehensive functional characterization and low-resolution structure of hyperthermophilic laminarase from Thermotoga petrophila (TpLam), besides its mode of operation through capillary zone electrophoresis, which specifically cleaves internal ß-1,3-glucosidic bonds. Far-UV circular dichroism demonstrated that LamA is formed mainly by beta structural elements, and the secondary structure is maintained after incubation up to 16 hours at 90ºC. The structure determined by small angle X-ray scattering revealed a multi-domain structural architecture of the enzyme with a V-shape envelope arrangement of the two carbohydrate binding modules in relation to the catalytic domain. Multifunctional enzyme engineering can improve enzyme cocktails for emerging biofuel technology. Molecular dynamics through structure-based models (SB) is an effective tool for assessing the tridimensional disposal of chimeric enzymes as well as for inferring the functional practicability before experimental validation. In the second chapter we describe the computational design of a bifunctional xylanase-lichenase chimera (XylLich) using the xynA and bglS genes from Bacillus subtilis. In silico analysis of the average surface accessible area (SAS) and the root mean square fluctuation (RMSF) predicted a fully functional chimera, i.e. the substrate has access to the catalytic pocket with minor fluctuations and variations along the polypeptide chains. The chimera preserved the biochemical characteristics of the parental enzymes, with the exception of a slight variation in the temperature of operation and the catalytic efficiency (kcat/Km). The absence of substantial shifts in the catalytic mode of operation was also verified. Furthermore, the production of chimeric enzymes could be more profitable than producing a single enzyme separately, based on comparing the recombinant protein production yield and the hydrolytic activity achieved for XylLich with that of the parental enzymes. ß-Glucosidases (BGLs) are very useful enzymes with a great potential to be employed in several industrial processes. However, some features are required to become viable the enzyme applications, such as temperature and pH stability as well, low ions and chemicals inhibition. Thus this work aimed to study three BGLs from the extremophiles organisms Pyrococcus furiosus and Thermotoga petrophila. The genes PfBgl1, TpBgl1 and TpBgl3 were cloned into pET28a vector and the proteins were expressed in Escherichia coli and further purified in two chromatographic steps. The purified enzymes were evaluated for pH and temperature of activity, which showed that BGLs from the glycosyl hydrolases family 1 (PfBgl1, TpBgl1) presented a wider range of pH and temperature operation than BGL from family 3 (TpBgl3). The BGLs showed great stability to a range of pH (4-10) and the highest time of half-life (at 99 °C) was at pH 6, besides they were not significantly affected by the presence of EDTA or ions, except TpBgl1 that was inhibited by Hg2+ and Fe2+. The specific activities in a set of different substrates suggested that TpBgl3 is more specific than GH1 BGLs. The kcat and kcat/Km in pNPG indicate that TpBgl3 is the most efficient among BGLs characterized herein, although this enzyme is inhibited with the lowest glucose concentration (30.1 mM). Furthermore, the BGLs were assayed for influence of six monosaccharides in catalysis, which the results suggested a weak inhibition by the most of those carbohydrates tested. The CD experiments revealed that the secondary structure of BGLs is not affected by the pH variations and the denaturation studies evidenced that the BGLs are indeed hyperthermophilic
Doutorado
Ciência de Alimentos
Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-08T20:09:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Valerio_AmandaAbdalla_D.pdf: 3553304 bytes, checksum: 97ba97062f1c23d4b29447c0b9a7316d (MD5) Previous issue date: 2007
Resumo: Glicosídeo hidrolases (EC 3.2.1.-) são enzimas que hidrolisam ligações glicosídicas. Neste trabalho realizamos estudos funcionais e estruturais de duas glicosídeo hidrolases: a celulase XF0810 de Xylella fastidiosa e a lisozima digestiva 1 de Musca domestica (MdL1). A celulase XF0810 está anotada no genoma da X. fastidiosa como membro da família 5 das glicosídeo hidrolases (EC 3.2.1.4). Após a amplificação, clonagem, expressão e purificação da mesma; prosseguimos com os experimentos de filtração em gel analítica, dicroísmo circular, DLS, ensaio enzimático e cristalização desta proteína. Foi feito um estudo de modelagem onde ficou evidenciado que a XF0810 não pertenceria à família 5 pois quatro dos sete resíduos conservados que caracterizam esta família foram substituídos, incluindo os dois resíduos catalíticos de glutamato essenciais para o mecanismo de clivagem de retenção. Isto foi comprovado através da ausência de atividade nos ensaios feitos com a proteína purificada. A MdL1 pertence à família 22 das glicosídeo hidrolases (EC 3.2.1.17) e foi cristalizada com o ligante Nacetilquitotetraosídeo para a difração de raios X. A resolução da estrutura (2H5Z no PDB) foi realizada por meio do método de substituição molecular tendo como modelo a estrutura nativa. A análise comparativa da MdL1 com outras lisozimas de quatro classes diferentes de animais mostrou grande semelhança e pequenas diferenças apenas na região das voltas. Estas diferenças foram utilizadas para explicar as características especiais de uma lisozima com função digestiva. A volta na região definida pelos resíduos 98-100 apresenta uma deleção na MdL1, tornado-a menos exposta ao solvente, podendo justificar a resistência à proteólise. O resíduo Gln100 participa de uma interação com o ligante. Os resíduos Thr107 e Asn46 são apontados como responsáveis pelo decréscimo dos pKa dos grupos carboxilas dos resíduos catalíticos Glu32 e Asp50, respectivamente. A diminuição dos pKa explica o pH ótimo mais ácido característico de lisozimas digestivas
Abstract: Glycoside hydrolases (EC 3.2.1.-) are enzymes that hydrolyze glycoside bonds. In this work we studied functional and structural features of two glycoside hydrolases: the cellulase XF0810 of Xylella fastidiosa and the digestive lysozyme 1 of Musca domestica (MdL1). The cellulase XF0810 is annotated in the genome of X. fastidiosa as member of family 5 of glycoside hydrolases (EC 3.2.1.4). After the amplification, cloning, expression and purification of XF0810; we continued with the experiments of analytical gel filtration, circular dichroism, DLS, enzymatic assay and crystallization of this protein. A homology model was built which showed that XF0810 did not belong to family 5 because four of seven conserved residues that characterize the family were substituted, including the two catalytic residues of glutamate that are essential for the retention hydrolysis mechanism. This was further confirmed by the absence of activity in the assays (exocellulase with PNPc) performed with the purified protein. The MdL1 belongs to the family 22 of glycoside hydrolases (EC 3.2.1.17) and was crystallized with the ligand N-acetilchitotetraose for X-ray diffraction. The resolution of the structure (2H5Z in PDB) was accomplished by molecular replacement with the native structure as the searching model. The comparative analysis of MdL1 with other lysozymes of four different classes of animals showed a high similarity and few differences appeared only in the loops¿ regions. These differences were used to explain the special characteristics of the lysozyme with a digestive function. The loop in the region defined by residues 98-100 presents one deletion in the MdL1, becoming less exposed to the solvent, this might justify the proteolysis resistance. The residue Gln100 participates directly in an interaction with the ligand. The residues Thr107 and Asn46 are pointed out as responsible for a reduction in the pKa of the carboxyl groups of catalytic residues Glu32 e Asp50, respectively. The reduction in pKa explains the more acidic pH optimum that characterizes the digestive lysozymes
Doutorado
Bioquimica
Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Els 2-desoxi i 2,6-didesoxi glicòsids són unitats estructurals importants en multitud de productes naturals entre els que es troben fàrmacs antitumorals (antraciclines com Ia ciclamicina 0), antibiòtics (eritromicines, anguciclines) i fàrmacs emprats en el tractament de Ia insuficiència cardíaca (glicòsids cardíacs com Ia digitoxina), etc.
La necessitat de disposar de mètodes per a Ia construcció eficient i estereoselectiva d'unions glicosídiques continua sent un repte actual que té implicacions molt importants en química mèdica i bioorgànica, les quals fan ús de Ia síntesi química per disposar d'aquests productes i poder investigar en Ia comprensió dels mecanismes biològics i en l'elaboració de nous fàrmacs menys tòxics.
Per altra banda, en el camp dels nucleòsids, alguns 2'-desoxi i 2',3'-didesoxi-nucleòsids són inhibidors de Ia transcriptassa inversa del virus de Ia SIDA, i són habitualment utilitzats en el seu tractament.
En ambdós casos però, Ia falta d'un grup estereodirector adjacent al centre anomèric fa de Ia síntesi de 2-desoxi-glicòsids i 2'-desoxi-nucleòsids un repte sintètic especialment interessant. Tanmateix, l'absència d'un substituent electroatractor en C-2 fa que l'enllaç glicosídic sigui molt més làbil front als medis àcids facilitant ('hidròlisi o l'anomerització.
En aquest context, l'objectiu d'aquest treball és desenvolupar nous mètodes de síntesi estereoselectiva de 2-desoxi-oligosacàrids i nucleòsids a partir de 2-desoxi-2iodo-piranòsids i furanòsids. Aquests dadors de glicosil es pretenen obtenir per ciclació intramolecular i estereoselectiva induïda per iode electròfil de polihidroxipentenilsulfurs, i polihidroxi-hexenilsulfurs. Aquest mètode permetria l'accés a dadors de glicosil dadors amb iode a Ia posició 2 per un procediment que no requereix partir de glicals.
Com a conclusió general podem dir que s'han sintetitzat nous dadors de glicosil de configuració mano i alo. Aquests s'han preparat per ciclació amb I+ de trahidroxi-hexenilsulfurs, els quals es poden obtenir fàcilment per olefinació de pentoses. Per altra banda s'ha preparat 2-fluoro-furanòsids per ciclació d'hidroxi-enolèters emprant reactius de fluor elctròfil.
S'han preparat diferents polihidroxi-alquenilsulfurs seguint dues estratègies sintètiques diferents, partint en tots els casos de productes quirals (2,3-diisopropiliden-D-gliceraldehid, (R)-glicidol, D-arabinosa o D-ribosa). Aquestes estratègies es resumeixen en:
a) Incorporació d'una unitat d 2-fenilsulfanil etè. Emprant PhSCΞCH com a sintó, i posterior reducció amb LiAIH4.
b) Introducció d'una unitat monocarbonada junt amb el grup fenilsulfanil (SPh).
Emprant carbanions en reaccions d'olefinació.
En les reaccions d'olefinació s'ha observat un comportament diferent segons els reactius emprats i les condicions de reacció, però sense diferències segons el sucres de partida. En Ia reacció de Wittig-Horner s'han obtingut els millors resultats amb rendiment superiors al 70% essent I'isòmer E majoritari.
S'ha estudiat les reaccions de ciclació de dihidroxi-pentenilsulfurs de fenil, amb diferents grups protectors, induïda per electròfils de iode, i s'han extret les següents conclusions:
a) La reacció és completament regioselectiva donant Iloc a productes de ciclació endo per tancament del cicle sobre el carboni adjacent a l'àtom de S.
b) Sempre s'obtenen mescles de 1-hidroxi-2-iodo-tetrahidrofurans resultat de les ciclacions 5-endo amb activació del grup SPh, i un tetrahidropirà resultat de Ia ciclació 6-endo.
S'han estudiat les reaccions de ciclació de tetrahidroxi-hexenilsulfurs de fenil induïda per electròfils de iode que han proporcionat 2-iodo-1-tio-glicòsids, i s'han extret les següents conclusions:
a) La ciclació transcorre de forma exclusiva pel camí 6-endo.
b) La ciclació és esteroselectiva quan es parteix d'un únic isòmer E o Z.
c) L'estereoselectivitat de Ia reacció ve governada per un efecte estereoelectrònic que s'anomena efecte "inside-alkoxy".
Els 2-iodo-1-tioglicòsids s'han emprat com a dadors de glicosil en reaccions de glicosidació amb diferents alcohols, Ia qual cosa ha permès obtenir α-mano-2-iodoglicòsids i β-alo-2-iodo-glicòsids amb bons rendiment i excel.lents estereoselectivitats, especialment en Ia sèrie mano.
De Ia mateixa manera s'han preparat hidroxi-enolèters seguint les mateixes estratègies sintètiques abans comentades.
Les reaccions de ciclació d'hidroxi-enolèters amb reactius electròfils de fluor, ha proporcionat els compostos fluorats de ciclació, com va ser el cas d'un 2-etoxi-3-fluoro-tetrahidrofurà, el qual es pot considerar com un 2-fluoro-furanòsid precursor de 2-fluoro-nucleòsids.
En el cas d'existir substítució al.lílica, no s'obté el producte de ciclació sinó d'eliminació d'un grup OBn i hidròlisi de l'enolèter, per donar un aldehid α,β-insaturat.
2-Deoxy and 2,6-dideoxy glycosides are frequently found as single structural elements or, more frequently, as components of oligosaccharides, in antibiotics and anticancer agents such as antracyclines (cyclamicine 0), active antibiotics (erytromicines, angucyclines) and pharmacological compounds used in cardiac insufficiency treatment (cardiac glycosides such as digitoxine), etc.
Therefore, methods for the efficient and stereoselective construction of deoxyglycosidic linkages will have useful applications in medicinal and bioorganic chemistry by allowing to understand biological mechanisms and elaborate new and less toxic drugs.
On the other hand, in the nucleoside field, some 2'-deoxy and 2',3'-dideoxy-nucleosides are inhibitors of inverse transcriptase of AIDS virus, and they are often used in its treatment.
In two cases, the lack of a stereodirecting neighbouring group adjacent to the anomeric center makes 2-deoxyglycoside synthesis a particular challenge. Moreover, the absence of electron-withdrawing substituent at C-2 makes the glycosidic bond much more acid labile, giving rise to easy hydrolysis or anomerization.
In this context, the goal of this work is develop new synthetic methods for the stereoselective synthesis of 2-deoxy-oligosaccharides and nucleosides starting from 2-deoxy-2-iodo-pyranosides and furanosides. These glycosil donors are trying to obtain by intramolecular and stereoselective cyclization induced by electrophilic iodine and starting from polihydroxi-pentenylsulfides and polihydroxi-hexenylsulfides as substrates. This method would allow to prepare glycosil donors with iodine at position 2 by means of a procedure that does not require the use of glycals.
It has been prepared different polihydroxi-alkenylsulfides following two different synthetic strategies, starting from quiral products in all cases (2,3-diisopropiliden-D-glyceraldehide, (R)-glycidol, D-arabinose o D-ribose). These strategies are summarized:
a) 2-Fenilsulfanil ethene unit incorporation. Using PhSCΞCH as sinthon, and after LiAIH4 alkyne reduction.
b) Introduction of a monocarbonated unit together the fenilsulfanil group (SPh). Using carbanions in olefination reactions.
In olefination reactions it has been observed a different behaviour depending on the reagents used and the reaction conditions, but without differences depending on the starting sugar. In Wittig-Horner reaction, it has been obtained the best results, yields over 70% for the majority E isomer.
It has been studied cyclization reactions of phenyl dihidroxy-pentenylsulfydes, with different protecting groups, induced by iodine electrophiles, and the conclusions are:
a) The reaction is completely regioselective giving endo cyclization products by closing the cycle over the carbon which is adjacent to sulphur atom.
b) Cyclization reaction is quimioselective, and it's always obtained 1-hydroxi-2iodo-tetrahydrofuranes mixtures by means of 5-endo cyclizations and SPh group activation, and a tetrahydropyrane by mans of 6-endo cyclization.
It has been studied cyclization reactions of phenyl tetra hydroxi-hexenylsuIfides induced by iodine electrophiles that have provided 2-iodo-1-thio-glycosides, and the conclusions are:
a) The cyclization takes place exclusively trough 6-endo path.
b) The cyclization is steroselective starting from one isomer E or Z.
c) The stereoselectivity of the reaction is governed by a stereoelectronic effect
called "inside-alkoxy".
d) It's very difficult to avoid the SPh group activation on the obtained thioglicosydes.
2-lodo-1-thioglicosides has been used as a glycosil donors in glycosidation reactions with different alcohols. That has allowed to obtain a-manno-2-iodo-glycosides and β-alo-2-iodo-glycosides with good yields and excellent stereoselectivities, specially on the manno derivatives.
By the same way it has been prepared hydroxi-enolethers following the same synthetic strategies.
The cyclization reactions of hydroxi-enolethers with fluorine electrophilic reagents has provided fluorinated compounds, such as a 2-ethoxy-3-fluoro-tetrahydrofurane, which could be assembled as a 2-fluoro-furanoside precursor of 2-fluoro-nucleosides.
In the case of hydroxi-enolethers with alilic substitution, it's not obtained the cyclated product, but an α,β-insaturat product is obtained as a result of an OBn group elimination.

Fungos de podridão branca e fungos de podridrão parda são capazes de degradar a biomassa lignocelulósica utilizando diferentes mecanismos. Os fungos de podridão parda degradam a celulose e a hemicelulose enquanto modificam a lignina, sendo, portanto, as enzimas hidrolíticas ativas em substrato rico em lignina. O arsenal enzimático diferenciado desses fungos torna-os alvos para prospecção de enzimas que podem ser aplicadas em diversos processos biotecnológicos. O fungo Gloeophyllum trabeum é uma das espécies mais compreendidas deste grupo, e sabe-se que é capaz de degradar a celulose sem produzir CBHs. Além disso já foi reportado uma GH5 proveniente desse organismo com caraterísticas processivas. Nossa tentativa de clonagem dessa enzima (GtGH5) em A. nidulans A773 não foi bem sucedida, todavia nosso grupo esta repetindo os passos de clonagem e expressão. No genoma desse organismo esta presente um gene que codifica uma GH45. A GtGH45 foi a clonada e expressa com alto rendimento em A. nidulans cepa A773. A expressão, secreção e acumulaçao da GtGH45 foi positiva após 72 h de incubação em meio líquido (maltose como indutor), confirma por eletroforese SDS-PAGE do extrato enzimático concentrado e dialisado. A massa molar de 18,4 kDa foi consistente com a predição da sequência de 204 amino-ácidos obtída apartir da sequência gênica e corrobora com a caracterização por espectometria de massas (18,9 kDa). A análise filogenética é consistente com estudos anteriores, agrupando a proteína alvo com outras GH45s de basidiomicetos na subfamília C. A enzima purificada foi testada para determinação da especificidade pelo substrato apresentando maior atividade em arabinoxilana, xilana, arabinoxilana e CMC e foi capaz de gero celo-oligômeros a partir da hidrólise de PASC. O pH ótimo em CMC foi 2,5, além se demonstrar ser temoestável em ensaio de Thermoflour. A hidrólise enzimática de substratos lignocelulósicos derivados de cana-de-açúcar mostrou que a GtGH45 foi eficiente para suplementar coqueteis enzimáticos comerciais, principalmente na conversão de xilana.
White-rot and brown-rot basidiomycetes are able to transform lignocellulosic materials through different mechanisms. The brown-rot fungi are able to degrade cellulose and hemicellulose meanwhile modifies lignin. The hydrolytic enzymes of these fungi act on a lignin-enriched substrate, which makes them targets to prospect new enzymes for polysaccharides hydrolysis. Gloeophyllum trabeum is one of the best understood fungal species in this group. An interesting processive GH5-endoglucanase (EG) has been described in this species suggesting an unusual pathway for lignocellulosic degradation without cellobiohydrolases (CBH). Our first attempt to clone this GtGH5 was default but our grup is trying a new attempt of heterologous expression of this protein. Furthermore, G. trabeum genome points out for a low molar mass GH45-EG. Here we report on a recombinant high-yield G. trabeum ATCC 11539 GtGH45 production system. Expression and secretion of endoglucanase GtGH45 was positive after 72 h incubation of the transformed A. nidulans stain A773 in stationary liquid cultures (maltose as inductor). The SDS-PAGE electrophoresis of ultra-filtrated extract showed a single-band GtGH45 over expressed band. The molar mass of 18,4 KDa was consistent with the predicted 204 amino acids sequence derived from gene sequence analyses and corroborates with mass spectometry characterization (18,9 KDa). Even more, the phylogenetic analyze is consistent to previews studies, clustering the target protein with others GH45 from basidiomycetes at subfamily C. The purified protein was assayed for substrate specificity showing activity against xylan, arabinoxylan and PASC. GtGH45 was able to produce cello-oligomers from PASC. The optimum pH was 2.5 with CMC as the substrate. Xylan conversion was enhanced when GtGH45 was mixed with commercial enzymes in enzymatic hydrolysis of alkaline-sulfite pretreated sugar cane bagasse.

Una línea celular de B. cordata fue cultivada en dos biorreactores agitados mecánicamente operados a 120 y 400 rpm; uno equipado con un difusor en anillo (codificado como B2-DA), mientras que el otro con difusor sinterizado (codificado como B3-DS). El biorreactor B2-DA operado a 400 rpm fue en el que se obtuvo la mayor producción de biomasa (13.62 g PS/L), así como de metabolitos secundarios tipo fenólico (MSTF: fenoles, flavonoides y feniletanoides glicosilados totales, 63.63 mg Equivalentes de Ácido Gálico/g, 5.02 mg Equivalentes de Quercetina/g y 119.24 mg Equivalentes de Verbascósido/g, respectivamente). Este sistema potenció tanto la producción de biomasa como la de MSTP, al compararse con el cultivo de CCS de B. cordata en matraz.
Los recursos vegetales son utilizados día a día por la población. Los usos son variados desde la alimentación, hasta la obtención de productos, como insecticidas, cosméticos, pigmentos y productos de importancia y uso medicinal. En México, el uso de plantas en la medicina tradicional está arraigado entre la población; dicho conocimiento recibe el nombre de herbolaria. Las plantas medicinales generalmente son recolectadas de su hábitat natural, lo que puede generar sobreexplotación. Además, las actividades antropogénicas contribuyen al deterioro de los recursos vegetales. Por lo tanto, es necesario encontrar alternativas sustentables que permitan la conservación de especies medicinales. El cultivo de tejidos vegetales (CTV) en biorreactor representa una alternativa eco sustentable para la obtención de metabolitos secundarios (MS) bioactivos, ya que es una herramienta biotecnológica que permite obtener los compuestos activos de las plantas sin socavar los recursos naturales. Un cultivo en biorreactor representa un paso importante hacia la producción comercial de compuestos de importancia industrial. Buddleja cordata es una planta utilizada en la medicina tradicional mexicana, la cual produce metabolitos secundarios del tipo fenólico (MSTF) a los cuales se les atribuye su propiedad curativa. Los cultivos de células en suspensión de B. cordata en matraces fueron capaces de producir verbascósido en alta concentración (116 mg/g~1.44 g/L), además de tener un tiempo de duplicación de 3.56 días, biomasa máxima de 12.9 g/L demostrado ser viable para su establecimiento en biorreactor. El objetivo del presente trabajo fue establecer un cultivo de células en suspensión (CCS) de B. cordata en biorreactor, como estrategia al manejo sustentable del recurso natural. Una línea celular de B. cordata fue cultivada en dos biorreactores agitados mecánicamente operados a 120 y 400 rpm; uno equipado con un difusor en anillo (codificado como B2-DA), mientras que el otro con difusor sinterizado (codificado como B3-DS). El biorreactor B2-DA operado a 400 rpm fue en el que se obtuvo la mayor producción de biomasa (13.62 g PS/L), así como de metabolitos secundarios tipo fenólico (MSTF: fenoles, flavonoides y feniletanoides glicosilados totales, 63.63 mg Equivalentes de Ácido Gálico/g, 5.02 mg Equivalentes de Quercetina/g y 119.24 mg Equivalentes de Verbascósido/g, respectivamente). Este sistema potenció tanto la producción de biomasa como la de MSTP, al compararse con el cultivo de CCS de B. cordata en matraz.
Universidad Autónoma del Estado de México

In this thesis, we have studied and synthesized new class of C-glycosly amino acids whose structure features a hetrocycle ring holding the carbohydrate and the amino acid fragments. Pyridine and tetrazole rings were used as hetrocycle linkers in this project. This class of C-glycosyl amino acids is of interest as new chealtors and as building building blocks for cotranslational glycopeptides synthesis. In the first part, C-Glycosylmethyl pyridylalanines were synthesized via thermally induced Hantzsch-type cyclocondensation using an aldehyde-ketoester-enamino ester system. To one of these reagents was attached a C-glycosyl residue, while to another was bound an amino acid fragment. In a one-pot optimized methodology, the dihydropyridine was not isolated while its purification was carried out by removal of unreacted material and side products using polymer-supported scavengers. Then the dihydropyridine (mixture of diastereoisomers) was oxidized by a polymer-bound oxidant to give the target pyridine bearing the two bioactive residues. In this way, a range of eight compounds (58-68% yield) was prepared in which the elements of diversity were (i) the gluco and galacto configurations of the pyranose ring, (ii) the α- and β-configurations at the anomeric center, and (iii) the positions of the carbohydrate and amino acid sectors in the pyridine ring. The orthogonal functional group protection in these amino acids allowed their easy incorporation into oligopeptides via sequential amino and carboxylic group coupling. In the second part, tetrazole moiety was constructed via Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition between nitriles and organic azides. Two sets of compounds have been prepared, one being constituted of C-galactosyl and C-ribosyl O-tetrazolyl serines, while the other contains S-tetrazolyl cysteine derivatives. In both cases, the synthetic scheme involved a twostep route: the first one being the thermal cycloaddition of a sugar azide with p-toluensulfonyl cyanide (TsCN) to give a 1-substituted 5-sulfonyl tetrazole and the second the replacement of the tosyl group with a serine or cysteine residue. For the high efficiency and operational simplicity, the azide-TsCN cycloaddition appears to be a true click process. Finally, one of the amino acids prepared was incorporated into a tripeptide

A resistência das paredes celulares vegetais à hidrólise enzimática é um dos grandes gargalos tecnológicos para a obtenção do etanol celulósico. Acredita-se que as modificações nas paredes celulares em processos como a mobilização de reservas, formação de aerênquima, amadurecimento de frutos e senescência, por exemplo, envolvam a ativação de módulos funcionais que culminam em alterações nas paredes celulares. Estes módulos são: 1) recepção de um sinal para início do processo; 2) Morte Celular Programada (PCD); 3) separação celular; 4) expansão celular; 5) hidrólise de hemiceluloses e 6) hidrólise de celulose. No caso da formação de aerênquimas lisígenos o processo que se inicia com a PCD e é seguido pela liberação de glicosil hidrolases que atuam a na degradação e/ou modificação da parede celular, formando espaços de ar no córtex radicular. A formação de aerênquima nas raízes de cana de açúcar é constitutiva e pouco se sabe sobre os mecanismos de modificação que ocorrem na parede celular durante este processo. Este estudo buscou compreender os padrões de variação expressão gênica, proteínas e de atividades enzimáticas associados à formação do aerênquima em raízes de cana de açúcar, com ênfase no papel das hidrolases de parede celular e em algumas proteínas relacionadas à PCD. Foram utilizados 5 segmentos de raízes de 1 cm cada, a partir do ápice radicular. No material coletado observou-se a formação gradual de aerênquima. Foram realizadas análises transcricional, proteômica e atividade enzimática das glicosil hidrolases e outras proteínas que atuam na modificação da parede celular, os quais foram identificados e quantificados ao longo da formação do aerênquima. As glicosil hidrolases pertencentes às famílias Cazy GH1, GH3, GH17, GH18 bem como expansinas, celulose sintase, lacase, calreticulina, calmodulina e proteínas relacionadas a degradação de pectinas, foram encontradas ao longo dos segmentos, principalmente após o segmento 2. De acordo com a atividade transcricional e dados da proteômica, sugere-se que os polissacarídeos seriam atacados por enzimas nos estágios iniciais da formação do aerênquima (seg 2 e 3). O ataque ocorre principalmente sobre as pectinas e o β-glucano. Contudo, os dados apontam para a deposição de xiloglucano, xilanos e celulose (após seg 3), que formam um compósito ao redor dos espaços de ar. Isto sugere que parte dos polissacarídeos das paredes não sejam degradados ao longo do processo, embora enzimas específicas detectadas possam atuar na modificação dos mesmos, como verificado para algumas pectinases e membros de GH17. Além disso, nos pré-tratamentos com água foi possível observar que há maior sacarificação da parede nos seg. 1 e 2. Contudo quando retira-se a maior parte das pectinas e hemiceluloses após pré-tratamento com NaOH, a sacarificação é maior nos segmentos 2, 3 e 4, devido ao maior acesso e a maior quantidade de celulose. As glicosil hidrolases encontradas neste trabalho sugerem que estas atacam a parede de um específico conjunto de células do córtex que dá origem ao aerênquima. Já no fim do processo, quando há lise celular, algumas paredes de células remanescentes são recalcitrante à hidrólise, provavelmente devido a sua arquitetura e composição. Este trabalho traz informações para o desenvolvimento de futuras tecnologias para a produção do etanol do etanol celulósico de cana-de-açúcar
The resistance of plant cell walls to enzymatic hydrolysis is one of the main bottlenecks of the development of technology of production of cellulosic ethanol. It is believed that the modifications in cell walls related to processes of storage mobilization, aerenchyma formation, fruit ripening and senescence, for instance, involve the activation of functional moduli that culminate in alterations of cell walls. These moduli are: 1) signal perception to start the process; 2) Programmed Cell Death (PCD); 3) cell separation; 4) cell expansion; 5) hydrolysis of hemicelluloses and 6) hydrolysis of cellulose. In the case of the formation of lysigenous aerenchyma, the process starts with PCD and is followed by the release of glycosil hydrolases that act on the degradation and/or cell wall modifications, forming air spaces in the cortex of the root. The formation of aerenchyma in the roots of sugarcane is a constitutive phenomenon and little is known about the mechanisms of modification that occur in cell walls during its development. Thus, the present study focused on the visualization of the patterns of variation of gene expression, proteins and enzyme activities associated to the formation of aerenchyma in roots of sugarcane in order to understand the role of the cell wall hydrolases and some proteins related to PCD in cell wall modifications along the process. Five root segments of 1cm each, starting from root apex, were used. A gradual centripetal formation of aerenchyma was recorded in the cortex of developing roots. Analyses of the transcriptional, proteomic and enzyme activity profiles during the process revealed that several enzymes act on cell wall modifications. The glycosil hydrolases belonging to the Cazy families GH1. GH3, GH17, GH18, as well as expansins, cellulose synthase, laccase, calreticulin, calmodulin and other proteins related to pectin degradation have been found along the segments, mainly after segment 2. According to the data on transcriptomics and proteomics, it is suggested that enzymes attack polysaccharides during the initial stages of aerenchyma formation (seg. 2 and 3). The attack of the enzymes occurs mainly on pectins and β-glucan. Conversely, the data point out to the deposition (or maintenance) of xyloglucan, xylan and cellulose (after seg. 3), which form a composite that surrounds the air spaces. This suggests that part of the polysaccharides present in cell walls are not degraded during the process, although specific enzymes have been detected that could act on polysaccharide mobilization, such as the GH17 family. Further, under pretreatment with water, it has been observed that cell wall saccharification was higher at segments 1 and 2. On the other hand, when most of the pectins and hemicelluloses are retrieved by pretreatment with NaOH, saccharification is higher of segments 2, 3 and 4, probably due to the higher access to the wall and also to the higher proportion of cellulose. The profiles related to the glycosil hydrolases found in this work, suggest that these enzymes attack the cell wall. Initially, they are probably kept within a group of cells that will originate the aerenchyma. At the end of the process, when there is cell lysis, the remaining walls of some cells are recalcitrant to hydrolysis probably due to changes in their architecture and composition. Our findings bring promising information that could be used in the future to improve efficiency of hydrolysis for cellulosic ethanol production from sugarcane

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
The genus Trichoderma includes species that have the ability to antagonize plant pathogens in a complex process ranging from antibiosis, competition for nutrients, mycoparasitism and induction of defense mechanisms in plants or a combination of these. Trichoderma species are known for their ability to produce lytic enzymes such as exoglucanases, endoglucanases, chitinases, and proteases that is essential for phytopathogen cell wall degradation. In the development and differentiation processes of Trichoderma, β-glucanases contributes significantly to the morphogenetic-morphological process that lead to the presence of β-glucans as the main component of fungi wall. In this work, we studied the functional role of the gluc31 gene that encodes an endo β-1,3-glucanase of the GH16 family of Trichoderma harzianum ALL42 through the deletion of this gene. This study demonstrated that the absence of Δgluc31 gene did not affect the in vivo mycoparasitism ability of the mutant T. harzianum ALL42, however the involvement of this gene in cell wall remodeling and synthesis were demonstrated. In the absence of the gluc31 gene, a higher deposition of chitin polymers on the cell wall of the mutant hyphae was observed. The absence of the gluc31 gene in T. harzianum also demonstrated an effect on the expression of other genes belonging to the family 16 of glycosyl hydrolases, due to the function redundancy found among the glucanases.
O gênero Trichoderma inclui espécies que possuem habilidade de antagonizar patógenos de plantas em um processo complexo que vão desde antibiose, competição por nutrientes, micoparasitismo, indução de mecanismos de defesa em plantas ou ainda uma combinação desses. Espécies de Trichoderma são conhecidas por sua capacidade de produzir enzimas líticas tais como exoglucanases, endoglucanases, quitinases e proteases que desempenham papéis importantes na degradação da parede de fitopatógenos. Nos processos de desenvolvimento e diferenciação de Trichoderma, as β-glucanases contribuem de forma significativa no processo morfogenéticomorfolítico uma vez que a β-glucanas é o componente principal da sua parede. Nesse trabalho, realizou-se o estudo do papel funcional do gene gluc31 que codifica uma endo β-1,3-glucanase da família GH16 de Trichoderma harzianum ALL42, através da deleção deste gene. Observamos que a ausência do gene gluc31 não afetou a capacidade de micoparasitismo, in vitro, da espécie mutante de T. harzianum ALL42, entretanto, o envolvimento deste gene na síntese e remodelamento da parede celular foi demonstrado. Na ausência do gene gluc31, uma maior quantidade de polímero de quitina na parede celular das hifas da linhagem mutante Δgluc31 foi observado. A ausência do gene gluc31 em T. harzianum demonstrou ainda um efeito sobre a expressão dos outros genes pertencentes à família 16 de glicosil hidrolases em ensaios de RT-qPCR, devido a redundância de função entre as glucanases.

Els hidrats de carboni presenten una elevada variabilitat estereoquímica i els organismes s'aprofiten d'aquesta elevada variabilitat utilitzant oligosacàrids i polisacàrids per a una multitud de diferents funcions biològiques. A part de les típiques funcions estructurals i d'emmagatzematge energètic, tenen important rellevància en altres funcions molt més específiques, com per exemple en senyalització cel·lular. Aquesta funcionalitat desperta l'interès de multitud d'aplicacions biotecnològiques, que són el fruit d'un nombre creixent d'estudis en glicobiologia.

L'enllaç glicosidic, en especial entre dues unitats de glucosa, és un dels enllaços més estables que es troben en biopolímers naturals. El temps de vida mitja de la hidròlisi espontània d'aquest enllaç en cel·lulosa i en midó és de l'ordre dels 5 milions d'anys. Les glicosil hidrolases son els enzims responsables de la hidròlisi enzimàtica d'aquests biopolímers. Aquests enzims aconsegueixen portar a terme la hidròlisi en escales de temps de l'ordre de 1000 cicles per segon. Donada aquesta elevada activitat, les glicosil hidrolases són considerades un dels catalitzadors biològics més eficients.

La present tesi centra el seu principal interès en l'estudi de la formació del complex de Michaelis entre una glicosil hidrolasa de la família 16 (la 1,3-1,4-β-glucanasa) i el seu corresponent substrat. Entendre el procés en el que el substrat s'uneix a l'enzim és un punt clau de cara a raonar les següents etapes de qualsevol mecanisme enzimàtic. Sovint aquest procés ja porta associats canvis conformacionals tant a nivell d'enzim com de substrat que contribueixen a la catàlisi, fent variar les diferències energètiques en el pas de reactius a productes. Per a les β-glicosil hidrolases, existeixen diferents evidències experimentals que recolzen aquest fet. Així, s'observen estructures distorsionades a nivell de substrat respecte les que correspondrien a les estructures més estables en solució. De totes maneres, es desconeixen els factors que determinen que el substrat prefereixi unir-se a l'enzim en una conformació o una altra, i les implicacions mecanístiques que això té. La present tesi tracta de donar resposta a algunes d'aquestes qüestions emprant diferents tècniques de dinàmica molecular (clàssica i de primers principis) en combinació amb mètodes que permeten l'acceleració d'esdeveniments al llarg d'una simulació.

La present tesi està estructurada en tres grans blocs: un bloc introductori (capítols I i II) on s'introdueix la família d'enzims a la qual pertany la 1,3-1,4-β-glucanasa i s'estableixen els objectius generals del present estudi; al capítol II es resumeixen els fonaments de la metodologia computacional emprada. En un segon bloc (capítols III a VII) es descriuen les simulacions portades a terme per tal de donar resposta a les preguntes obertes plantejades al bloc introductori. Els resultats són analitzats i discutits en cinc capítols diferents: al capítol III s'analitza l'estructura del complex de Michaelis de la 1,3-1,4-β-glucanasa amb un substrat tipus metilumbeliferil-tetrasacàrid; al capítol IV s'avalua i es descriu el mapa d'energia lliure conformacional de l'anell de β-D-glucopiranosa, i s'analitzen les propietats estructurals i electròniques de cada conformació per tal de trobar una correlació amb les distorsions presents en diferents glucosidases; al capítol V s'avalua i es descriu el mapa d'energia lliure conformacional del substrat un cop unit a la 1,3-1,4-β-glucanasa, i s'analitza l'efecte de diferents mutacions puntuals del substrat; al capítol VI es porta a terme una simulació del primer pas de la reacció enzimàtica de la 1,3-1,4-β-glucanasa i s'analitza l'itinerari conformacional seguit pel substrat; al capítol VII es porta a terme una simulació del procés d'entrada del substrat a la cavitat enzimàtica i s'analitzen les reorganitzacions a nivell de substrat i de proteïna que tenen lloc al llarg del procés. Cada capítol conté una breu introducció específica de cada cas concret, informació sobre els detalls computacionals emprats, i la descripció i discussió dels resultats obtinguts. Finalment al darrer bloc (capítol VIII) es resumeixen els resultats més rellevants obtinguts en la present tesi i s'enumeren les principals conclusions. Addicionalment, s'han adjuntat tres annexes que complementen la informació dels diferents capítols.
Carbohydrates exhibit a high stereo chemical diversity. Living organisms take benefit of it by using oligosaccharides and polysaccharides for a large number of biological functions. In addition to the typical structural and energetic functions, carbohydrates play an important role in other more specific functions such as cellular signalling. This functionality is of special interest in different biotechnological applications as a result of an increasing number of studies in glycobiology.

The glycosidic bond, specially the one between two glucose units, is one of the most stable bonds found in natural biopolymers. The half life time for the spontaneous hydrolysis of this bond in cellulose and starch is of the order of 5 million years. Glycosil hydrolases (GHs) are the enzymes responsible for the enzymatic hydrolysis of these biopolymers. GHs are able to hydrolyze the glycosidic bond in a time scale of the order of 1000 cycles per second. Due to this extremely high activity, GHs are considered some of the most efficient biological catalysts.

This thesis is focused on the formation of the Michaelis complex in 1,3-1,4-β-glucanase, a family 16 glycosil hydrolase. Understanding the substrate binding process is a key point to rationalize the subsequent steps of any enzymatic process. Usually, this process involves conformational changes of both the enzyme and the substrate. These changes contribute to the catalysis by changing the relative energies of reactants and products. Recent experiments on β-glycosil hydrolases give evidence of a distorted structure of the substrate with respect to its structure in solution. However, the factors that dictate the preference of the substrate to be bound to the enzyme in one or another conformation remain unknown, as well as their mechanistic implications. This thesis tries to answer some of these questions using different techniques based on molecular dynamics (both classical and first principles) in combination with methods aimed to accelerate the simulation of rare events.

Submitted by Aelson Maciera (aelsoncm@terra.com.br) on 2017-05-25T18:55:01Z No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5)
Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-30T12:35:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5)
Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-30T12:35:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5)
Made available in DSpace on 2017-05-30T12:40:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) Previous issue date: 2017-02-15
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Metagenomics studies allow the direct analysis of a genetic material in an environmental sample and when linked to bioinformatics it gives a powerful tool to explore the role of new genes and proteins not studied before. Constant decreases in the quantity of fossil fuels and their effects in the global economy and natural environment has accelerated researches in alternative fuels such as the second generation ethanol, which can be produced by vegetation biomass. However, this process demands previous hydrolysis of the lignocellulolytic material by hydrolytic enzymes to provide fermentable sugar. β-glucosidases are enzymes which plays an important role at the final step of cellulose breakdown to glucose, thus being considered the rate limiting enzyme in this process of biomass degradation. Many β-glucosidases are already known, however there is an interest to find new enzymes which are tolerant to glucose inhibition and which exhibits high activity at lower temperatures. In this study we searched for β-glucosidases (GH1) using sequences from a metagenomics database from rivers and lakes in the Amazon region developed in our laboratory. We found 3 complete open reading frames (ORFs) related to β-glucosidases and one of them was selected to be produced in E.coli in a heterologous way and to be biochemically characterized. The coding sequence of the protein named AmBgl1-LP was cloned in the plasmid pET-28a and produced an enzyme which has a molecular mass of 53,7 kDa. The enzymatic assays showed that the enzyme was active with an optimum pH of 5.5, optimum temperature of 35 °C and had a Ki for glucose of 23 mM. The enzyme does not apparently perform transgycosylation, according to the assays for pNPβGlu substrate. Supposedly, AmBgl1-LP suffers inhibition by pNPβGlu on concentrations higher than 10 mM. The enzyme showed to be capable of hydrolyzing cellobiose, pNPβGal and pNPβFuc. Thus, the enzyme is promising for use in cocktails for degradation of biomass.
A metagenômica permite estudar diretamente o material genético presente em uma amostra ambiental e quando aliada à bioinformática possibilita explorar o papel de novos genes e proteínas. A constante diminuição na quantidade de combustíveis fósseis e seus efeitos na economia global e no meio ambiente têm acelerado as pesquisas sobre combustíveis alternativos como, por exemplo, o etanol de segunda geração, o qual pode ser obtido a partir de biomassa vegetal. No entanto, o processo necessita que o material lignocelulolítico seja hidrolisado previamente por enzimas, para o fornecimento de açúcares fermentescíveis. As β-glicosidases são enzimas que participam da etapa final de degradação de celulose em glicose e são, portanto, consideradas passo limitante no processo. Muitas β-glicosidases já foram descritas, entretanto ainda há o interesse em encontrar enzimas que sejam resistentes à inibição por glicose e que exerçam sua atividade em temperaturas mais baixas. Neste sentido, o presente trabalho tratou da busca por β-glicosidases da família GH1 utilizando sequências obtidas a partir de um estudo metagenômico de rios e lagos da Amazônia, realizado em nosso laboratório. Foram encontradas 3 fases abertas de leitura (ORFs) correspondentes à esta classe de enzimas e uma delas foi selecionada para ser produzida em E.coli de forma recombinante e ser caracterizada bioquimicamente. A sequência que codifica a proteína denominada AmBgl1-LP foi clonada em vetor pET-28a e expressa em E.coli, rendendo uma enzima com massa molecular de 53,7 kDa. Os ensaios de atividade enzimática revelaram que a enzima é ativa em pH ótimo de 5,5 e temperatura ótima de 35 °C. Além disso, a enzima possui um Ki para glicose de 23 mM. A enzima aparentemente não realiza transglicosilação, frente aos ensaios com o substrato pNPβGli. Aparentemente a enzima sofre inibição por este substrato em concentrações maiores que 10 mM. A AmBgl1-LP mostrou-se capaz de hidrolisar celobiose, além de pNPβGal e pNPβFuc. Desta forma, a enzima mostra-se promissora para utilização em coquetéis para degradação de biomassa.

En esta tesis se ha investigado el mecanismo catalítico de las glicosiltransferasas que retienen la configuración a través de simulaciones híbridas de mecánica cuántica/mecánica molecular (QM/MM) y dinámicas moleculares (MD). La investigación se centra en la evaluación de las propuestas mecanísticas, además de la identificación de los principales factores que contribuyen a la eficiencia catalítica. Para esto usamos dos enzimas, α1,4-N-Acetilhexosaminiltransferasa (EXTL2) y Glucosil-3-fosfoglicerato Sintasa (GpgS) de Mycobacterium Tuberculosis. Además, se llevaron a cabo simulaciones adicionales de modelos in silico construidos en base a la enzima nativa o mutante para desvelar los roles de los residuos que se encuentran en una de las caras del sustrato transferible (cara β del azúcar). Los resultados de GpgS se exponen en el Capítulo 4 y los resultados de EXTL2 se presentan a lo largo de los Capítulos 5 y 6. En el Capítulo 7, otras dos glicosiltransferasas retenedoras investigadas en una tesis previa del grupo (LgtC y α3GalT), junto a EXTL2 y GpgS son estudiadas y comparadas para analizar con mayor profundidad las características estructurales de la cara β del azúcar y sus implicaciones en el mecanismo catalítico. En este capítulo también se incluye una discusión general sobre los principales factores que modulan la eficiencia catalítica en cada enzima, dando de esta manera, una visión más completa y general acerca de las estrategias catalíticas realizadas por las glicosiltransferasas retenedoras. Finalmente, las conclusiones generales de este trabajo se resumen en el Capítulo 8. Parte de los resultados presentados en esta tesis pueden ser encontrados en las siguientes publicaciones: • Albesa-Jove, D.; Mendoza, F.; Rodrigo-Unzueta, A.; Gomollon-Bel, F.; Cifuente, J. O.; Urresti, S.; Comino, N.; Gómez, H.; Romero-Garcia, J.; Lluch, J. M.; Sancho-Vaello, E.; Biarnes, X.; Planas, A.; Merino, P.; Masgrau, L.; Guerin, M. E. Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 9898-9902. • Gomez, H.; Mendoza, F.; Lluch, J. M.; Masgrau, L. Advances in protein chemistry and structural biology 2015, 100, 225-254. • Mendoza, F.; Gomez, H.; Lluch, J. M.; Masgrau, L. Acs Catalysis 2016, 6, 2577-2589.
In the present thesis the catalytic mechanism of retaining glycosyltransferases has been investigated by means of hybrid quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) and molecular dynamics (MD) simulations. The research is focused on the evaluation of the mechanistic proposals, as well as the identification of the main factors that contribute to the catalytic efficiency. For that we use two enzymes, α1,4-N-Acetylhexosaminyltransferase (EXTL2) and Mycobacterium Tuberculosis Glucosyl-3-phosphoglycerate Synthase (GpgS). Moreover, further simulations using in silico models built based on the native or mutant enzymes were carried out to unveil the roles of the residues located in one of the faces of the transferable substrate (β-face of the sugar). The results for GpgS are exposed in Chapter 4 and the results for EXTL2 are presented through Chapters 5 and 6. In Chapter 7, two other retaining glycosyltransferases investigated in a previous thesis of the group (LgtC and α3GalT), along with EXTL2 and GpgS are studied and compared to further analyse the structural features in the β-face of the sugar and its implications on the catalytic mechanism. A general discussion around the main factors modulating the catalytic efficiency in each enzyme is also included in this Chapter, providing in this way a more complete and general picture about the catalytic strategies performed by retaining glycosyltransferases. Finally, the general conclusions of this work are outlined in Chapter 8. Part of the results presented in this thesis is already published and can be found in the following papers: • Albesa-Jove, D.; Mendoza, F.; Rodrigo-Unzueta, A.; Gomollon-Bel, F.; Cifuente, J. O.; Urresti, S.; Comino, N.; Gómez, H.; Romero-Garcia, J.; Lluch, J. M.; Sancho-Vaello, E.; Biarnes, X.; Planas, A.; Merino, P.; Masgrau, L.; Guerin, M. E. Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 9898-9902. • Gómez, H.; Mendoza, F.; Lluch, J. M.; Masgrau, L. Advances in protein chemistry and structural biology 2015, 100, 225-254. • Mendoza, F.; Gómez, H.; Lluch, J. M.; Masgrau, L. Acs Catalysis 2016, 6, 2577-2589.

Submitted by Kelson Anthony de Menezes (kelson@ucb.br) on 2016-12-19T18:17:11Z No. of bitstreams: 1 LuisFelipeSchroederDissertacao2014.pdf: 2932891 bytes, checksum: 9867ac60d140318b946ef45528984bca (MD5)
Made available in DSpace on 2016-12-19T18:17:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LuisFelipeSchroederDissertacao2014.pdf: 2932891 bytes, checksum: 9867ac60d140318b946ef45528984bca (MD5) Previous issue date: 2014-09-30
There are different process being developed for cellulosic ethanol production, with possible different pretreatments with varying temperatures and pH, in addition to several biomasses can be used as the source of fermentable sugars. Among the important enzymes for deconstruction of plant biomass, stand out xylanases. These enzymes are responsible for deconstruction of the hemicellulose present in the structure of the plant cell walls. There are several ways to accomplish the identification of these enzymes: purification from an isolated microorganism is one. In this study, genomic and metagenomic approaches were used to carry out the prospection of the genes responsible for coding these enzymes. Clones from two libraries were used for detection and evaluation of activity on solid medium, supplemented with xylan and acid pretreated sugarcane bagasse. Nineteen clones of a goat rumen metagenomic library and five clones from an AB60 bacterium genomic library, with 15,000 clones constructed in this study, were selected initially. Fourteen clones from the metagenomic library were completely sequenced and their ORFs were analyzed. Four clones from the genomic library were partially sequenced and one clone had its sequence completely determined and 104 ORFs were obtained for all clones completely or partially sequenced ORFs were analyzed. Eleven ORFs showed some similarity to genes of importance for the degradation of complex polysaccharides. Among the most important ORFs and most likely to be related to the detected activity, are genes coding for ??-glucosidase, ??-xylosidase and ??-glucuronidase. Furthermore, also other ORFs with lower probability of relation with the activity or necessity to full sequencing of the clones for a few more conclusive analysis were identified. About 40% of the ORFs present in the rumen clones and 37.8% of the ORFs present in Acidobacteria clones showed similarity with hypothetical or uncharacterized proteins, which could be important in the activity detected. A ??-glucuronidase gene detected in a clone from the goat rumen metagenomic library was synthesized, its sequence was optimized for expression in Escherichia coli. However, in the present work, it was not possible to sub-cloning, made expression and purification of this enzyme. Some ORFs detected can be used for future studies of expression and characterization in order to improve knowledge about biotechnological potential present in the rumen and acidobacteria AB60, besides the ecological role of these microorganisms in their environment.
Existem diversos processos em desenvolvimento para a produ????o de etanol celul??sico, havendo diferentes poss??veis pr??-tratamentos, com temperaturas e pH variados, al??m das diversas biomassas que podem ser utilizadas como fonte de a????cares ferment??veis. Dentre as enzimas importantes para a desconstru????o de biomassa vegetal, destacam-se as xilanases. Estas enzimas s??o respons??veis pela desconstru????o da estrutura hemicelul??sica presente na parede celular das plantas. H?? diversas maneiras para alcan??ar a identifica????o destas enzimas: purifica????o a partir de micro-organismo isolado sendo uma delas. No presente trabalho, foram utilizadas abordagens gen??mica e metagen??mica a fim de realizar a prospec????o dos genes respons??veis pela codifica????o para estas enzimas. Foram utilizados clones oriundos de duas bibliotecas para a detec????o e avalia????o da atividade em meio s??lido suplementado com xilana e baga??o de cana-de-a????car pr??-tratado com ??cido. Dezenove clones de uma biblioteca metagen??mica de r??men de caprinos e cinco clones de uma biblioteca gen??mica da bact??ria AB60, com 15.000 clones constru??da no presente trabalho, foram selecionados inicialmente. Quatorze clones da biblioteca metagen??mica foram sequenciados completamente e tiveram as suas ORFs analisadas. Quatro clones da biblioteca gen??mica foram parcialmente sequenciados e um clone teve a sua sequ??ncia completa determinada e as ORFs analisadas. Das 104 ORFs obtidas de todos os clones completamente ou parcialmente sequenciados, onze ORFs apresentaram alguma similaridade com genes de import??ncia para a degrada????o de polissacar??deos complexos. Dentre as ORFs de maior import??ncia e com maior probabilidade de estarem relacionadas com a atividade detectada, est??o genes codificantes para ??-glicosidase, ??-xilosidase e ??-glicuronidase. Al??m disso, tamb??m foram identificadas outras ORFs com menor probabilidade de rela????o com a atividade ou necessidade de sequenciamento completo de alguns dos clones para uma an??lise mais conclusiva. Cerca de 40% das ORFs presentes nos clones selecionados de r??men e 37,8% das ORFs presentes nos clones selecionados de Acidobacteria apresentaram similaridade com prote??nas hipot??ticas ou prote??nas n??o caracterizadas que podem ter import??ncia na atividade detectada. Um gene de ??-glicuronidase detectado em um clone da biblioteca metagen??mica de r??men de caprino foi sintetizado, otimizando-se sua sequ??ncia para express??o em Escherichia coli . Entretanto, n??o foi poss??vel a sub-clonagem, express??o e purifica????o desta enzima no presente trabalho. Algumas ORFs detectadas podem ser utilizadas para estudos futuros de express??o e caracteriza????o a fim de aprimorar o conhecimento a respeito do potencial biotecnol??gico presente no r??men e na Acidobact??ria AB60, al??m do papel ecol??gico destes micro-organismos em seu ambiente.

Introdução e objetivos: β-glicosidases da família GH1 das glicosil-hidrolases possuem um dobramento do tipo barril (β/α)8. Propõe-se que proteínas com este dobramento, que usualmente classificam-se como tendo um único domínio, na verdade são compostas por dois domínios, cada um deles correspondendo a um \"meio barril\" (β/α)4. Assim, as proteínas com dobramento barril (β/α)8 seriam provenientes de uma duplicação e fusão gênica de um ancestral \"meio barril\" (β/α)4. O objetivo geral deste projeto é investigar a existência de dois domínios (β/α)4, as metades N- e C-terminal, na estrutura (β/α)8 barril da β-glicosidase A de Thermotoga maritima (bglTm) e β-glicosidase B de Paenibacillus polymyxa (bglB) por meio de análise da desnaturação térmica e química dessas enzimas. Resultados: Para atingir esse objetivo foram introduzidas mutações que rompem contatos não covalentes entre os supostos domínios destas β-glicosidases. Os segmentos de DNA que codificam as enzimas selvagem e mutantes foram clonados em plasmídeo de expressão pLATE51 e as enzimas recombinantes expressas em Escherichia coli BL21(DE3). Foram purificadas com sucesso as enzimas selvagens e duas mutantes de bglTm, denominadas T1 e T2, que possuem 2 e 4 mutações respectivamente em resíduos na interface inter-metades. Para confirmar o enovelamento destas proteínas recombinantes foi empregada a análise de estruturas secundárias por dicroísmo circular, também o espectro de fluorescência intrínseca de triptofano e sua supressão por acrilamida e finalmente foram determinados parâmetros cinéticos. Observou-se que não houve mudanças significativas na exposição dos triptofanos das proteínas recombinantes, sugerindo que se encontram enoveladas, o que está de acordo com a observação de que as proteínas recombinantes mantêm sua atividade catalítica. Já pela análise de dicroísmo circular concluiu-se que a mutante T1 possui dobramento semelhante à selvagem bglTm e que T2 apresenta diferenças significativas, sendo as porcentagens de α-hélice de 21%, 22% e 10% para bglTm, T1 e T2, respectivamente. Em seguida demonstrou-se que T1 mantém a termo estabilidade semelhante à selvagem, enquanto que T2 tem termo estabilidade reduzida, apresentando kobs de 0,3 min-1 em 80°C e de 0,06 min-1 em 75 °C.. O cálculo de Tm através de Differential Scanning Fluorimetry foi feito para bglB e T2 (42 e 81.7 °C respectivamente), enquanto que bglTm e T1 mantiveram-se estáveis na faixa de temperatura analisada (até 95°C). Na análise do efeito da temperatura sobre a estrutura das mutantes T1 e T2 não se observou nenhuma evidência da presença dos dois supostos domínios (β/α)4. A análise da desnaturação por cloreto de guanidina mostrou que o c50 diminuiu para T2 (2,4 M), mas não mostrou alteração para T1 (4,5 M) em comparação à bglTm (4,3 M). Coerentemente, a estabilidade da enzima selvagem e de T1 na ausência de desnaturante é a mesma (ΔGH2O = 5,2 kcal/mol), mas se reduziu para a T2 (ΔGH2O = 3,5 kcal/mol). Os cálculos do parâmetro m mostraram uma cooperatividade semelhante na desnaturação de bglTm, T1 e T2, não evidenciando independência entre os dois supostos domínios (β/α)4. Em conclusão, a análise estabilidade da β-glicosidase bglTm frente à temperatura e ao cloreto de guanidina não revelaram a presença dos domínios (β/α)4 que correspondem às metades N- e C-terminal desta β-glicosidase.
Introduction and Aims: β-glucosidases from the family GH1 of the glycosil-hidrolases presents a (β/α)8 barrel folding. These proteins are usually classified as single domain, however it has been alternatively proposed that they actually are formed by two \"half barrel\" (β/α)4. Thus, (β/α)8 barrel proteins had evolved from an \"half barrel\" ancestor that underwent a duplication-fusion event. The general goal of this project is the search for the two putative (β/α)4 domains, which form the N- and C-terminal ends of the β-glucosidase A from Thermotoga maritima (bglTm) and β-glucosidase B from Paenibacillus polymyxa (bglB), detecting their presence through the thermal and chemical stability of these (β/α)8 barrel proteins. Results: Site-directed mutagenesis was employed to replace residues forming non-covalent interaction between the putative (β/α)4 domains. DNA segments coding for bglB, bglTm and mutant bglTm were cloned into the pLATE51 expression vector and produced as recombinant proteins in E. coli BL21(DE3). The bglB, bglTm and two mutant bglTm, hereafter called T1 and T2, with 2 and 4 mutations respectively on residues in the interface between the protein halves, were purified. They were stable folded as shown by detecting their catalytic activity upon two different substrates and also by circular dichroism (CD) and tryptophan fluorescence analysis. Nevertheless, T2 showed a decrease in the α-helix content (10 %) in the CD analysis, whereas bglTm and T1 are similar (22 %). The wild-type bglTm and T1 are thermostable, whereas T2 was inactivated after pre-incubation at high temperature (kobs = 0,3 min-1 at 80 °C and 0,06 min-1 at 75 °C). The Differential Scanning Fluorimetry experiments revealed Tm of 42 e 81.7 °C for bglB and T2, respectively, whereas wild-type bglTm and mutant T1 did not showed any thermal transition up to 95 °C. Indeed, the analysis of the thermal stability of T1 and T2 did not reveal any evidence of the putative (β/α)4 domains. Following that, the analysis of the protein denaturation by guanidine hydrochloride showed that the c50 for T2 was reduced (2.4 M), whereas no modification was observed for bglTm and T1 (4,3 and 4,5 M, respectively). In agreement the stability of bglTm and T1 (ΔGH2O = 5,2 kcal/mol) is similar, but it was reduced for T2 (ΔGH2O = 3,5 kcal/mol). The m parameter showed a similar cooperative denaturation for wild-type bglTm and mutants T1 and T2, but no evidence of the independent unfolding of the putative (β/α)4 domains was found. Conclusion: In conclusion, the analysis of the thermal and chemical stability of the bglTm did not reveal the presence of the putative (β/α)4 domains that form the N- and C-terminal end of these β-glucosidase.