Littérature scientifique sur le sujet « GlicoproteinaP »

We demonstrated through several immunochemical tests the presence of GP-43 from P. brasiliensis in extracts of cutaneous lesions from Jorge Lobo's disease. This glicoprotein is one of the immunodominant antigens in this species, and is used to identify it. The demonstration of GP-43 tissues infected by the agent of Jorge Lobo's disease is an additional evidence for classifying it in the genera Paracoccidioides, species loboi

Este trabalho teve como objetivo determinar o perfil imunoquímico de três exoantígenos, obtidos de amostras clínicas de Paracoccidioides lutzii procedentes do estado de Mato Grosso. Para a obtenção dos exoantígenos, seguiu-se o protocolo padronizado por Camargo et al. e o perfil imunoquímico foi obtido com o emprego da técnica de SDS Page. As frações observadas demonstraram pesos moleculares de 20, 30 e 130 kDa; a glicoproteina de 130 kDa foi evidenciada tendo por base os três exoantígenos utilizados. A detecção desta fração de alto peso molecular sugere um perfil imunoquímico distinto, o que pode contribuir para elucidar as reações falso-negativas obtidas com o antígeno usualmente utilizado (obtido da cepa de referência B-339 de P. brasiliensis). Este achado assume grande importância no sentido de aumentar a especificidade das reações sorológicas utilizadas, para monitorar o prognóstico dos pacientes acometidos pela paracoccidioidomicose.

Foram examinados 20 eqüinos adultos portadores de abdômen agudo e submetidos à laparotomia. Dez recuperaram-se sem intercorrência pós-operatória (G1) e 10 foram a óbito sete a 10 dias após a cirurgia, com sinais de choque séptico (G2). Avaliaram-se temperatura retal, freqüências cardíaca e respiratória, tempo de preenchimento capilar e teores plasmáticos das proteínas de fase aguda - fibrinogênio, ceruloplasmina, proteína C-reativa, antitripsina, haptoglobina e glicoproteína ácida -, antes e até sete dias após a laparotomia. As leucometrias às 72h e no sétimo dia pós-operatório dos eqüinos que foram a óbito foram, respectivamente, 34,6% e 57,1%, mais altas que a dos animais curados. Os maiores valores de proteína de fase aguda ocorreram no sétimo dia após a cirurgia; os percentuais de elevação de fibrinogênio, antitripsina, glicoproteina ácida, proteína C-reativa, ceruloplasmina e haptoglobina de eqüinos do G2 em relação ao G1 foram 46,8%, 67,9%, 91,9%, 112,2%, 126,9% e 186,2%, respectivamente.

A alfa-1-glicoproteina ácida (AGP) e a mucoproteína são proteínas de fase inflamatória que aumentam suas concentrações plasmáticas quando apresentam um quadro de resposta ao estado inflamatório, representando um mecanismo de defesa do organismo. O objetivo do estudo foi avaliar o perfil dessas proteínas em pacientes com PCM crônica tratados com sulfametoxazol-trimetoprim (SMX-TMP) e associar os resultados encontrados com dados epidemiológicos, fatores de risco, sintomas, evolução da doença, e desfecho do tratamento. Nos métodos adotados foram analisados os prontuários de 244 pacientes com PCM crônica no período de 1998 a 2014. Destes, 134(54,92%) pacientes fizeram exames bioquímicos das proteínas inflamatórias durante o curso da doença. Predominaram pacientes adultos de 30 a 50 anos 73(54,48%), tabagistas 123(91,79%), alcoólicos 60(44,78%). Como resultado obteve-se a diminuição das proteínas inflamatórias após o tratamento (p= 0,01803). Concluindo que a AGP e a mucoproteínas são úteis como marcadores do efeito de terapia e da involução inflamatória.

Histochemical studies on the mandibular condyle of the human fetus at gestational ages 12, 14, and 16 weeks were performed. Methods. Histological sections were stained with Schiff’s periodic reaction for glicoproteins, hematoxiline eosine detects mesenchymal tissue and trichhromic stain for collagen. The ANOVA one-way test was used to evaluate the differences during stained zones in the three fetus groups. Results. The percentage of glycoproteins and mesenchymal tissue was denser at 12 weeks. This percentage decreases at 14 weeks and is less at 16 weeks. An increase in the amount of collagen in the studied weeks was observed. The percentages of glycoproteins, mesenchymal tissue, and collagen were significantly different; f = 4373, 9624.8, and 3674, P<0.0001 for the three studied groups. Conclusion. The endochondral bone formation of the mandibular condyle includes modifications of the quantities of glycoproteins, mesenchymal tissue, and collagen.

AbstrakVirus dengue (DENV) telah menyebabkan sekitar 50 juta kasus infeksi demam berdarah setiap tahunnya, akan tetapi hingga saat ini belum terdapat vaksin maupun antivirus yang mampu mencegah atau mengobati penyakit tersebut. Selama pengembangan vaksin dan antivirus, diperoleh berbagai informasi tentang struktur protein DENV yang dapat dimanfaatkan sebagai target obat. Makalah membahas tentang struktur proteomik pada DENV, yaitu glikoprotein pada envelope, NS3 protease, NS3 helikase, NS5 metiltransferase, dan NS5 RNA-dependent RNA polimerase.AbstractDengue virus (DENV) has caused over 50 millions infection every year. However, to date neither vaccine nor medicine could be used to prevent or cure the illness. During researches in finding the vaccine or antiviral for DENV, information on DENV protein structure has been obtained which is potentially used as drug target. This paper disscuss DENV proteomic structure that consist of envelope glicoprotein, NS3 protease, NS3 helicase, NS5 methyl-transferase, and NS5 RNA-dependent RNA polymerase.

The present study concern on mycologic and immunochemical data obtained from two samples of a fungus considered as belonging to the species Paracoccidioides cerebriformis described by Moore in 1935, and maintained since then on Sabouraud’s agar in the mycology collection of the Instituto de Medicina Tropical de São Paulo. After 60 years, the samples exhibited the same characteristics described by Moore (1935). However, experimental lesions did not resulted in guinea-pigs inoculated intratesticularly. The dominant antigen in Paracoccidioides brasiliensis, 43 kDa glicoprotein (gp43), could not be demonstrated by SDS PAGE and Western blotting. Immunoelectrophoresis did not demonstrated the E arch of cathodic migration using a policlonal anti gp43 serum. According to these findings, it is concluded that the fungus described by Moore (1935) as P. cerebriformis does not belong to the genus Paracoccidioides. Paracoccidioidomycosis should therefore be considered as resulting from infection by a single species, Paracoccidioides brasiliensis (Splendore, 1912) as asserted by Almeida (1930). Further studies, through molecular biology methods, could identify the mentioned fungus

O desenvolvimento de técnicas complementares a métodos experimentais clássicos, tais como a cristalografia de raios-X e a ressonância magnética nuclear (RMN), capazes de descrever e prever a diversidade estrutural e conformacional de carboidratos e glicoconjugados, consiste em um potencial impacto no entendimento dos processos biológicos em que estas moléculas estão envolvidas. Neste sentido, o presente trabalho tem por objetivo: 1) a validação de um conjunto de parâmetros, desenvolvidos no nosso grupo de pesquisas, na reprodução de dados de RMN descrevendo a conformação de uma série de glicoproteínas em solução aquosa, e 2) a avaliação do emprego de geometrias de dissacarídeos em solução como modelo para a construção de glicanas complexas, na ausência de dados experimentais. Através do emprego de técnicas de modelagem molecular como cálculos ab initio, construção de mapas de contorno para dissacarídeos e simulações de dinâmica molecular (DM) em escalas de tempo de até 0.1 ms, os resultados obtidos confirmam a adequação dos parâmetros gerados na descrição da conformação de carboidratos e glicoproteínas. Adicionalmente, sugerem que o emprego de populações de confôrmeros de dissacarídos em solução, obtidos através de simulações de DM, constitui-se em uma estratégia promissora na obtenção de modelos de glicanas condizentes com condições biológicas. Esperamos, a partir destas observações, que os resultados obtidos na presente dissertação possam contribuir no crescimento do número de trabalhos de DM abordando carboidratos e glicoproteínas biológicas e, assim, no crescimento do entendimento de processos biológicos nos quais estas biomoléculas estejam envolvidas.
The development of novel techniques, capable of describing and predicting the structural and conformational diversity of carbohydrates and glycoconjugates, in complement to experimental methods as X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance (NMR), might bring a potential impact in the comprehension of the biological processes in which such molecules are involved. In this context, this work aims to: 1) validate a set of parameters, developed by our research group, to reproduce NMR data describing the conformation of a series of glycoproteins in aqueous solutions; and 2) evaluate the use of solution geometries of disaccharides to assemble complex glycans, in the absence of experimental data. Employing molecular modelling techniques as ab initio calculations, construction of energy contour plots for disaccharides and molecular dynamics (MD) simulations with time scales up to 0.1 ms, the obtained results confirm the adequacy of the studied parameters to describe the conformation of carbohydrates and glycoproteins. Additionaly, such data suggest that the use of solution conformations of disaccharides, as obtained through MD simulations, consists in a promissing strategy to obtain glycans representation in accordance to biological conditions. We expect, with such observations, that the obtained results contribute to increase the number of works employing MD simulations of biological carbohydrates and glycoproteins and, thus, to raise the comprehension of the biological processes in which such molecules are involved.

Background. Antiphospholipid (aPL) antibodies are a heterogeneous group of autoantibodies directed against plasma protein-phospholipid complexes or single plasma proteins. Their presence in patients with thrombosis and/or pregnancy morbidity defines antiphospholipid syndrome (APS). APS is considered as primary (PAPS) if present alone, or secondary if associated with other systemic autoimmune diseases, particularly with systemic lupus erythematosus (SLE). Laboratory criteria for APS classification include lupus anticoagulant (LA) and/or medium-high levels of IgG/IgM anticardiolipin (aCL) and/or medium-high levels of IgG/IgM anti-Beta2glycoprotein I (anti-Beta2GPI) antibodies, all confirmed no earlier than 12 weeks later. Currently, ELISA assay for detection of aCL and anti-Beta2GPI antibodies, despite several attempts, is not a standardized technique. Recently, few studies have compared the performance of ELISA with that of other technologies also fully automated including the fluorescence enzyme immunoassay (FEIA) and the chemiluminescence immunoassays (CLIA), but they have produced debatable results. The search for new markers of APS through the use of laboratory techniques alternatives to ELISA, such as FEIA and CLIA methods is currently under interest. IgA aCL and IgA anti-Beta2GPI antibodies are not considered one of the recommended laboratory criteria for APS classification, and their clinical relevance is as yet controversial. Moreover, aPL are not only considered as a tool for APS classification, but they could be useful parameters to stratify the risk for developing clinical manifestations of the disease. In particular, anti-anti-Beta2GPI antibodies directed against the Domain I (anti-DI) of the molecule, were reported to be associated to thrombotic risk in antiphospholipid syndrome (APS), so correlating them with a more severe clinical picture. Objectives. The aim of the study was to compare the performance of a home-made ELISA with that of FEIA and CLIA assays in detecting aCL and anti-Beta2GPI antibodies in a large, homogeneous cohort of PAPS patients and in a group of subjects with clinical criteria for APS classification but ELISA negative for laboratory criteria. The results were compared with those obtained in a control group including healthy blood donors and patients with autoimmune diseases different from APS. Subsequently, the clinical relevance of IgA aCL, IgA anti- Beta2GPI antibodies and of IgG anti-DI antibodies was evaluated in a large homogeneous cohort of PAPS patients. Their diagnostic sensitivity was investigated in a group of seronegative patients for conventional aPL but with clinical manifestations of APS. Moreover, prognostic value of these antibodies in APS patients was studied. Methods. IgG/IgM/IgA aCL and IgG/IgM/IgA anti-Beta2GPI antibodies were determined using FEIA, (EliA TM, Phadia AB, Sweden). aCL/anti-Beta2GPI of IgG isotype and IgG anti-DI antibodies were assayed using CLIA (HemosIL AcuStar®, Inova, USA). The manufacturer's recommendations were followed carefully for both techniques. A home-made ELISA performed following the European Forum on aPL recommendations was used for the comparison between methods. All sera were also tested for LA following updated guidelines using diluted Russell viper venom time and diluted activated partial thromboplastin time as screening tests. Results and Conclusions. (1) Comparison between an ELISA home made and FEIA technique. The sensitivities of the ELISA and FEIA tecniques were similar with the exception of IgM aCL which was found to be significantly higher in the PAPS patients using the ELISA method. The two assays had a comparable specificity, a high significant agreement and a significant correlation between the antibody levels. FEIA testing uncovered no significant prevalence of any antiphospholipid antibody in the ELISA negative patients. In conclusion, our results suggest that FEIA tecnique is comparable to a home-made ELISA. If confirmed by large scale studies on PAPS patients, these results could support FEIA's routine use in detecting aCL and anti-Beta2GPI antibodies. Results and Conclusions. (2) Comparison between an ELISA home made and CLIA technique. When compared with the ELISA technique, it came to light that the CLIA method had a significantly lower sensitivity for IgM aCL and IgG/IgM anti-Beta2GPI antibodies; while, its specificity was higher with respect to ELISA for IgM aCL and IgM anti-Beta2GPI antibodies. The two techniques showed a high, significant agreement and a significant antibody titer correlation. CLIA also detected IgG/IgM aCL and IgG anti-Beta2GPI antibodies in the seronegative patients using ELISA method. There was a significantly higher prevalence of IgG aCL and IgG anti- Beta2GPI antibodies in those patients with respect to that in the control population. In conclusion, despite a lower sensitivity, CLIA showed a higher specificity for some aPL and a good level of agreement and correlation with a home made ELISA. CLIA also detected some aCL and anti-Beta2GPI antibodies in the seronegative patients not usually identified by home made ELISA. If confirmed by further studies, CLIA could be considered a valuable method to assess patients with clinical manifestations of APS but testing negative for aPL using a home made ELISA. Results and Conclusions. (3) ACL and anti-Beta2GPI antibodies of IgA isotype. Present respectively in 19% and 50% of the PAPS patients studied, IgA aCL and IgA anti- Beta2GPI antibody frequencies were both statistically significant .The mean titers of both IgA aCL and IgA anti-Beta2GPI antibodies were higher in the thrombotic patients, but only the latter were significantly associated with thrombosis. When analyzed, the patients FEIA negative for conventional IgG/IgM aPL, but with the clinical features of APS, in 10.6% of cases were tested positive for anti-Beta2GPI IgA, this data was found to be significant. In conclusion, positivity to IgA anti-Beta2GPI antibody detected using FEIA was found to be clinically relevant in PAPS patients. Moreover, the prevalence of isolated IgA anti- Beta2GPI antibody positivity was significant in the seronegative patients. These results suggest that patients with clinical signs/symptoms of APS but who do not meet conventional antiphospholipid antibody laboratory criteria could undergo at least of IgA anti-Beta2GPI antibody testing using FEIA technique. Results and Conclusions. (4) IgG anti-DI antibodies. The sensitivity and specificity of IgG anti-DI antibodies were comparable to those of IgG aCL and IgG anti-Beta2GPI antibodies. There was a significant agreement, association and antibody titre correlation between IgG anti-DI and IgG aCL as well as IgG anti-Beta2GPI antibodies. IgG anti-DI antibody showed lesser prevalence and mean titres in the pregnancy morbidity than in thrombotic and PAPS patients with both involvements. Regarding the conventional aPL antibody profiles, the triple positivity group had higher prevalence and mean titres than single and double positivity ones. In conclusion, as regards the anti-DI antibodies this study provides further evidence that these antibodies detected by CLIA, can be considered a promising biomarker for risk assessment particularly in patients having vascular thrombosis and triple conventional aPL positivity, which is considered an antibody profile associated to the most severe features of APS. Thus, anti-DI antibodies might constitute an additional useful tool in clinical and therapeutic decisions.
Introduzione. Gli anticorpi antifosfolipidi (aPL) sono un gruppo eterogeneo di autoanticorpi specifici per complessi fosfolipide-proteina o proteine leganti i fosfolipidi. La loro presenza in pazienti con trombosi e/o complicanze ostetriche definisce la sindrome da anticorpi antifosfolipidi (APS). L'APS viene considerata primaria (PAPS) se presente in forma isolata, altrimenti secondaria se associata ad altra malattia autoimmune sistemica che solitamente e' il lupus eritematosus sistemico (LES). I criteri di laboratorio per la classificazione di APS includono la presenza di tre aPL ed in particolare del lupus anticoagulant (LA) e/o di livelli medio-alti di anticorpi anticardiolipina (aCL) IgG/IgM e/o di livelli medio-alti di anticorpi anti-Beta2glycoproteina I (anti-Beta2GPI) IgG/IgM, tutti confermati non prima di 12 settimane. Attualmente, le metodiche ELISA per la determinazione degli aCL e anti-Beta2GPI di classe IgG/IgM, nonostante svariati tentativi, non sono ancora standardizzate. Di recente, alcuni studi hanno confrontato le performance dei test ELISA con quelle di altre tecnologie anche completamente automatizzate tra le quali rientrano sia il fluorescence enzyme immunoassay (FEIA) che il chemiluminescence immunoassay (CLIA). Questi lavori, tuttavia, hanno prodotto risultati non concordanti. Gli anticorpi aCL e anti-Beta2GPI di classe IgA non sono ancora considerati criterio di laboratorio per la classificazione dell'APS e la loro rilevanza clinica e' al momento oggetto di dibattito. Inoltre gli aPL non sono considerati soltanto strumenti di classificazione dell'APS, ma anche parametri per la stratificazione del rischio di sviluppare le manifestazioni cliniche della malattia. In particolare, gli anticorpi anti-Beta2GPI specifici per un preciso epitopo situato nel Dominio I della molecola sembrano essere associati maggiormente al rischio di trombosi piuttosto che all'impegno ostetrico e di conseguenza sarebbero correlati a un quadro clinico piu' severo dell'APS. Obiettivi. Lo scopo della tesi e' stato di confrontare la performance di un ELISA home made con quella delle tecniche FEIA e CLIA nel rilevamento degli anticorpi aCL IgG/IgM e anti-Beta2GPI IgG/IgM in un'ampia e omogenea coorte di pazienti affetti da sindrome da anticorpi antifosfolipidi primaria (PAPS) e in un gruppo di soggetti con i criteri clinici per la classificazione di APS ma ELISA negativi per i criteri di laboratorio. I risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti in un gruppo di controllo comprendente donatori sani e pazienti con malattie autoimmuni diverse dall'APS. Successivamente e' stata valutata la rilevanza clinica degli aCL e anti-Beta2GPI di classe IgA e degli anticorpi anti-Dominio I (anti-DI) di isotipo IgG in un'ampia ed omogenea coorte di pazienti affetti esclusivamente da PAPS. Inoltre, la sensibilita'  diagnostica di questi anticorpi e' stata valutata in un gruppo di pazienti sieronegativi per gli aPL convenzionali, ma con manifestazioni cliniche di APS. Di entrambi gli anticorpi e' stato anche indagato il valore prognostico nell'ambito dell'APS. Metodi. Gli aCL e gli anti-Beta2GPI di classe IgG/IgM/IgA sono stati determinati usando il metodo FEIA (EliA TM, Phadia AB, Sweden). Inoltre gli aCL e anti-Beta2GPI di classe IgG/IgM sono stati anche analizzati assieme gli anticorpi anti-DI IgG utilizzando il metodo CLIA (HemosIL AcuStar®). Le raccomandazioni del produttore sono state seguite scrupolosamente per entrambe le tecniche. Per il confronto dei risultati ottenuti con le diverse metodiche e' stato usato un test ELISA home made, eseguito seguendo le raccomandazioni del Forum europeo sugli aPL. Tutti i sieri sono stati testati anche per LA seguendo le linee guida aggiornate utilizzando il tempo di veleno di vipera Russell ed il tempo di protrombina parziale attivata, entrambi con fosfolipidi diluiti, come tests di screening. Risultati e Conclusioni. (1) Confronto ELISA home made con FEIA. Le sensibilita'  delle tecniche ELISA home made e FEIA sono risultate essere simili ad eccezione degli aCL di classe IgM che sono risultati significativamente piu' frequenti nei pazienti PAPS con il metodo ELISA. I due metodi avevano una specificita' simile, un'elevata concordanza e una correlazione significativa tra i livelli anticorpali. Inoltre il metodo FEIA non ha rilevato alcuna significativa prevalenza degli anticorpi antifosfolipidi nei pazienti ELISA negativi, ma con manifestazioni cliniche di APS. In conclusione, questi risultati suggeriscono che il metodo FEIA e' paragonabile al test ELISA home made. Se confermato da altri studi su ampie casistiche di pazienti affetti da PAPS, questi risultati potrebbero supportare l'uso del FEIA nella determinazione degli aCL e anti-Beta2GPI nell'analisi di routine. Risultati e Conclusioni. (2) Confronto ELISA home made con CLIA. Quando e' stata confrontata la tecnica ELISA home made con la tecnica CLIA, e' emerso che il metodo CLIA aveva una sensibilita' significativamente piu' bassa per gli aCL IgM e gli anti-Beta2GPI IgG/IgM rispetto a quella dell'ELISA; invece la sua specificita' e' risultata significativamente piu' alta per gli anticorpi aCL IgM e anti-Beta2GPI IgM. Le due tecniche hanno mostrato un'alta e significativa concordanza e una significativa correlazione dei titoli anticorpali. Inoltre il CLIA ha rilevato gli anticorpi aCL IgG/IgM e anti-Beta2GPI IgG nei pazienti sieronegativi in ELISA. Vi era infatti una prevalenza di aCL IgG e di anti-Beta2GPI IgG significativamente maggiore nei pazienti sieronegativi con i criteri clinici di APS che nella popolazione sana di controllo. In conclusione, il metodo CLIA, nonostante una minore sensibilita', ha mostrato una specificita' piu' alta per alcuni aPL e un buon livello di concordanza e di correlazione con la metodica ELISA home made. Il CLIA, inoltre, e' stato in grado di rilevare gli aCL IgG e gli anti-Beta2GPI IgG nei pazienti sieronegativi non identificati dall'ELISA. Se confermato da ulteriori studi, il CLIA potrebbe essere considerato un metodo valido per la valutazione di pazienti con manifestazioni cliniche di APS, ma con gli aPL negativi al test ELISA home made. Risultati e Conclusioni. (3) Gli aCl e gli anti-Beta2GPI di classe IgA: Gli aCL e gli anti-Beta2GPI di classe IgA sono stati testati con il metodo FEIA e sono risultati sgnificativamente presenti rispettivamente nel 19% e nel 50% dei pazienti affetti da PAPS. I loro titoli medi erano piu' elevati nei pazienti con impegno trombotico rispetto alle pazienti con impegno ostetrico. Tuttavia solo gli anti-Beta2GPI IgA erano significativamente associati alla trombosi. Quando sono stati analizzati i pazienti FEIA negativi per aCL IgG/IgM e per anti-Beta2GPI IgG/IgM ma con le caratteristiche cliniche di APS, nel 10,6% di essi sono stati trovati gli anticorpi anti-Beta2GPI IgA. Questo dato e' risultato essere significativo nel confronto con la popolazione sana di controllo. In conclusione, la positivita' per gli anticorpi anti-Beta2GPI IgA definita con il metodo FEIA e' risultata clinicamente rilevante nei pazienti PAPS. Inoltre la presenza di anticorpi anti-Beta2GPI IgA era significativa nei pazienti sieronegativi per gli isotipi IgG e IgM. Questi risultati suggeriscono che nei pazienti con segni/sintomi clinici di APS, ma che non soddisfano i criteri di laboratorio per gli anticorpi antifosfolipidi convenzionali si potrebbero determinare gli anticorpi anti-Beta2GPI di classe IgA al fine di incrementare la sensibilita'  diagnostica per APS. Risultati e Conclusioni. (4) Gli anti-DI IgG: La sensibilita' e la specificita' degli anticorpi anti-DI IgG rilevati con il metodo CLIA erano paragonabili a quelle degli anticorpi aCL IgG e anti-Beta2GPI IgG. Si e' riscontrata una significativa concordanza, un'associazione e una correlazione dei titoli anticorpali degli anti-DI IgG con gli aCL IgG e gli anti-Beta2GPI IgG. Inoltre gli anticorpi anti-DI IgG hanno mostrato una minore prevalenza e titoli medi piu' bassi nelle complicanze ostetriche rispetto ai pazienti con trombosi e ai pazienti con entrambi i coinvolgimenti clinici. Per quanto riguarda i profili anticorpali degli aPL convenzionali, il gruppo con la triplice positivita' antifosfolipidica ha mostrato una maggiore prevalenza e maggior titoli medi degli anticorpi anti-DI, rispetto ai gruppi con singola e duplice positivita'. In conclusione, gli anti-DI, rilevati con la tecnica CLIA, possono essere considerati dei promettenti biomarkers per la valutazione del rischio clinico di trombosi vascolare e di triplice positivita' per gli aPL convenzionali, solitamente associata ai quadri clinici piu' severi di APS. Pertanto, essi possono costituire uno strumento aggiuntivo utile per eventuali decisioni cliniche e terapeutiche.

L'activitat de grup sanguini A en els eritròcits, quan aquesta ha estat referida a substàncies no lipídiques, s'ha assignat de forma concreta a la glicoforina A, la glicoproteïna més gran present en la membrana, i també a l'anomenada banda 3 la principal proteïna de l'eritròcit. En altres casos l'activitat de grup sanguini ha estat relacionada amb altres glicoproteïnes sense especificar-ne els trets més característics.

En base a aixó, l'objectiu de la tesi ha estat la caracterització fisico-química i estructura d'una molècula que químicament tingui naturalesa glicoproteïnica, anant acompanyada aquesta d'activitat de grup sanguini A.

Així, a partir de sang de 18 donants sans s'han obtingut les membranes de l'eritròcit per mitjà de la lisi hipotònica. La presència d'activitat acetilcolinesterasa en les membranes indica que les vesícules s'han tancat amb la mateixa orientació que tenien els eritròcits abans de la lisi. Les membranes, un cop homogenitzades, dialitzades i liofilitzades, s'han sotmes al procés de solublització, és a dir, el procés que converteix l'estat complexe de la membrana intacta en un estat més senzill que permeti l'anàlisi dels components de la membrana per mètodes que no poden aplicar-se a la membrana intacta.

Després de realitzar un estudi comparatiu amb tres tècniques solubilitzadores, s'ha escollit la fonamentada amb l'extracció dels lípids per la mescla cloroform-metanoI (2:1, v/v). A continuació, les glicoproteïnes es precipiten de la fase aquosa per adició d'etanol (concentración final del 60 %) i manteniment durant 48 h a -20°C en presència de clorur sòdic.

Les glicoproteïnes es purifiquen per cromatografia de filtració per gel (Sephadex G-75) i per cromatografia d'afinitat fent passar les glicoproteïnes a través d'un gel que contenia la lectina Helix pomatia (Helix pomatia Lectin - Sepharose 6MB), que específicament uneix les glicoproteïnes que porten com a sucre terminal la N-acetil-D-galactosamina, glúcid característic de les glicoproteïnes amb activitat de grup sanguini A.

La glicoproteïna eluïda de la columna per una concentración 0.1 M de N-acetil-D-galactosamina té una capacitat inhibitòria de l'hemaglutinació de 38.82 micrograms/mL, amb una forquilla de 39.43 i 38.21 micrograms/mL, per un Iímlt de confiança alfa=90. L'anàlisi dels aminoàcids i glúcids corresponents ha proporcionat uns percentatges respectius de proteïna i sucres del 41.05 i 58.95. Cal destacar l'alta presència de serina i treonina (aminoàcids que en una glicoproteïna són els que uneixen la cadena glucídica al nucli peptídic), la molt baixa proporció d'aminoàcids cromòfors (triptofan i tirosina), la qual cosa explica que la molècula no presenti una marcada absorció pels voltants dels 280 nm i també justifica el baix valor del coeficiente d'absorció específica (0.4324 L/g. cm). La molècula no conté cisteïna i, per tant, no poden existir enllaços disulfuro intramoleculars. Pel que fa als glúcids, la meitat d'aquestos corresponen a hexosamines, trobant-s'hi també hexoses neutres i àcid siàlic.

La valoració de la glicoproteïna pel mètode clàssic de Lowry presenta una gran pèrdua de sensibilitat envers la que el mètode presenta quan hom valora una proteïna estàndard, com és ara el cas de I'albúmina sèrica bovina.

Per aixó, s'ha desenvolupat un mètode per a quantificar les glicoproteïnes basat en determinar per espargiment de la llum ("light scattering") la turbidesa produïda per l'adició d'etanol a la solució de glicoproteïna. Aquest mètode per l'afició d'etanol a la solució de glicoproteïna. Aquest mètode, a més de precís, no és destructiu.

El valor de la masa molecular calculat per a la glicoproteïna ha estat de 53500 ±4280 Da (per light scattering), de 41500 Da (per anàlisi d'aminoàcids) i de 76000 la forma dimèrica i 43000 la monomèrica (per PAGE-SDS). La cromatografia de filtració per gel no és adient per a determinar la masa molecular atès que proporciona valors molt superiors als reals a causa de l'efecte distorsionant de l'àcid siàlic i de la possible capacitat d'autoagregació.

Entre les propietats físico-químiques estudiades (absorció a l'espectre U.V., dependència de la turbidesa amb la longitud d'ona, espectroscòpia derivativa, variación de l'espectre d'absorció a l'U.V. en funció del pH, ionització dels grups fenòlics, absorció a l'espectre I.R., dispersió rotatòria òptica (D.R.O.), comportament cromatogràfic, viscositat, punts isoelèctric i isoiònic, volum específic parcial, increment de l'índex de refracció i solubilitat), destaquen aquelles que proporcionen una més gran informació sobre la molècula, cas de la D.R.O. i de la viscositat. L'espectre de D.R.O. de la glicoproteïna presenta una vall negativa de feble magnitud a 234 nm, mentre que els valors de la viscositat intrínseca i de la constant d'Huggins apunten vers una estructura de la molècula en cabdell monoestadístic ("random coil").

A partir de les característiques estructurals determinades s'ha pogut obtenir que la glicoproteïna té una estructura molt expandida (37.70 nm de radi de gir), que presenta un 50 % de cabdell monoestadístic, un 30 % d'alfa-helix i un 20 % de beta-fulla (segons els valors obtinguts entre 220 i 250 nm, aplicant els tractaments de Greenfield et al. i Chen et al.), i que els aminoàcids cromòfors es troben tant en l'interior com en l'exterior de la molècula (estudi de l'acció dels agents pertorbants no polars: urea, d,ioxà i polietilenglicol).

Finalment, s'ha estudiat per diferents tècniques l'estabilitat estructural de la glicoproteïna enfront del clorhidrato de guanidina, la urea i la calor. Amb els resultats obtinguts pot arribar-se a la conclussió que la glicoproteïna és molt estable; que, a més, l'acció desnaturalitzant és reversible i que el procés de desnaturalització és complexe, no podent ésser identificat amb un procés en dos estats, natiu i desnaturalitzant, com succeeix en moltes proteïnes.
"DETERMINATION OF ESTRUCTURAL PARAMETERS FROM A GLYCOPROTEIN BEARING BLOOD GROUP A ACTIVITY"

TEXT:
A physicochemical, structural study about a human blood group-A glycoprotein (GP) has been carried out. GP was purified through an affinity column, which contains the lectin Helix pomatia. The main chemical characteristics are: low content of chromophores aminoacids, Jack of cysteine, high content of serine and threonine, and of hexosamines, too.

Owing to the chemical properties of the GP, the Lowry's method valoration is not suitable, and for this reason, it has been developed a new method based on quantifying by light scattering the turbidity that is produced by the addition of absolute ethanol.

The molecular mass of GP is 53500 (determined by light scattering), or 41500 (amino acid analysis), while it presents a 76000 Da dimer form and a 43000 Da monomer form by PAGE-SDS.

The following physicochemical parameters have been determined: absorption in the U.V. spectrum, derivative spectroscopy, variation of spectrum as pH function, ionization of phenolic groups, absorption in the I.R. spectrum, optical rotatory dispersion, viscosity, isoionic and isoelectric points, partial specific volume, solubility and increase of index refraction. Beyond that, the gyration radius, conformation and the action of disturbing agents (urea, dioxane and polyethyleneglycol) have been studied.

Eventually, the structural stability of GP has been determined in front of guanidine hydrochloride, urea and heat.

The results show the GP has a mainly random coil structure, and in this fact, there is a great concordance among the values obtained with O.R.D., viscosity... On the other hand, the molecule is very stable and the denaturalization process is reversible and not involves a mechanism in two steps.

Antitrombina (AT), uma proteína membro da família dos inibidores de serino proteases, é uma glicoproteína que co-existe em duas isoformas, a e b, que se diferenciam pelo conteúdo de glicosilação e pela afinidade por glicosaminoglicanos (GAG), um grupo de polissacarídeos polisulfatados, dentre as quais se destaca a heparina. AT é ativada quando ligada a GAGs, tornando-se assim capaz de inibir, com alta eficiência, proteases da cascata de coagulação como trombina e fXa. Essas enzimas formam complexos ternários com heparina e AT, sendo cada uma subsequentemente inibidas preferencialmente por um mecanismo de ação distinto: [1] baseado em mudanças conformacionais (fXa), ou pelo [2] mecanismo de ponte (trombina). Adicionalmente, já foi observado que heparina isoladamente pode modular a atividade catalítica de fIIa e fXa. Considerando a falta de dados estruturais a respeito dos efeitos da glicosilação sobre a estrutura e flexibilidade de AT, bem como sobre o reconhecimento heparina-AT, e que as bases moleculares da inibição alostérica de fIIa e fXa por GAGs não é bem compreendida, o presente trabalho visa caracterizar o reconhecimento molecular de heparina por essas proteínas, através de dinâmica molecular (DM). Os resultados obtidos indicam que a heparina interage de forma diferente nas glicoformas de AT devido a uma interferência da glicana ligada à Asn135. Da mesma forma, diferentes arranjos do GAG na superfície de trombina e fXa podem estar relacionadas às suas diferentes susceptibilidades aos mecanismos de ação de heparina, uma vez que sua orientação na superfície de fIIa, mas não fXa, permite uma interação adequada com AT em complexos ternários. Nesse contexto, foi observado, durante as simulações, que heparina inibiu alostericamente trombina e fXa, promovendo mudanças na conformação da tríade catalítica das proteases, e ativou AT, promovendo rearranjos intramoleculares entre seus elementos de estrutura secundária. Em ambos os casos, as vias de transmissão de sinal associadas a essas mudanças de atividade foram traçadas pela primeira vez nesse trabalho. De forma geral, os resultados obtidos conferem novas evidências de que a glicosilação tem um papel crucial na ativação diferencial de a- e b-AT por heparina, e que a orientação de GAGs na superfície de trombina e fXa é o que determina o mecanismo de sua modulação por heparina.
Antithrombin (AT), a member of the serpin protease inhibitors family, is a glycoprotein that co-exists in two isoforms, a and b, which differ in their amount of glycosylation and affinity for glycosaminoglycans (GAG), a group of sulphated polysaccharides, as heparin. AT is activated when bound to GAGs, becoming capable to inhibit coagulation cascade serine proteases like thrombin and fXa. Such enzymes form ternary complexes with heparin and AT, being subsequently inhibited by two distinct mechanisms of action: [1] the conformational change-based mechanism or the [2] bridge mechanism. In addition, heparin binding itself was also observed to modulate the catalytic activity of both fIIa and fXa. Considering the lack of structural information regarding the effect of glycosylation over the structure and flexibility of AT, as well as in heparin-AT recognition, and that the molecular basis of the allosteric inhibition of fIIa and fXa, promoted by such GAG, is not fully understood, the current work intends to characterize the molecular recognition of heparin by such proteins through molecular dynamics (MD) simulations. The obtained results indicate that heparin binds differently on AT glycoforms due to an interference of Asn135-linked glycan. As well, distinct arrangements of the polysaccharide on the surface of thrombin and fXa may be related to their diverse susceptibilities to heparin mechanisms of action, as heparin orientation observed on the surface of fIIa, but not fXa, allows for an adequate long chain heparin binding to AT in ternary complexes. In this context, heparin was observed to allosterically inhibit thrombin and fXa by promoting changes in the proteases catalytic triad conformation, but to activate AT by promoting intramolecular rearrangements on its secondary structure elements. In both cases, the signal transmission pathways associated with such activity changes were traced by the present work for the first time. Altogether, the obtained results provide new evidences that glycosylation play a central role on the differential activation of a- and b-AT by heparin, and that GAGs orientation on the surface of thrombin and fXa determine the mechanism of their modulation by heparin.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2009.
Made available in DSpace on 2012-10-24T10:34:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 267109.pdf: 2512191 bytes, checksum: e295f900d947bb3205275b90dad59fb5 (MD5)
A proteína prion celular (PrPC) é uma glicoproteína ancorada aos neurônios que tem sido associada a diversas funções no sistema nervoso central (SNC) como: neuroplasticidade, formação de placas senis e controle de mecanismos de estresse oxidativo. O processo de envelhecimento é um estado frequentemente acompanhado por um declínio em diversos aspectos sensorimotores e cognitivos. No presente estudo, investigamos o envolvimento da PrPC em alterações comportamentais e neuroquímicas relacionadas ao envelhecimento em camundongos selvagens (wild-type) (Prnp+/+), nocautes para PrPC (Prnp0/0) e camundongos que apresentam expressão aumentada de PrPC (Tg-20). Os animais destas linhagens com 3 ou 11 meses de idade foram submetidos a uma bateria de testes comportamentais incluindo os testes do campo aberto, caixa de atividade, labirinto em cruz elevado, memória social e a esquiva inibitória do tipo step-down. Camundongos Prnp+/+ e Prnp0/0 de 11 meses de idade exibiram prejuízos na atividade locomotora e na capacidade de reconhecer um camundongo jovem após um curto período de tempo assim como aumento nas respostas relacionadas à ansiedade. De forma interessante, camundongos Tg-20 não apresentaram os mesmos prejuízos comportamentais relacionados à idade e a infusão intracerebroventricular do peptídeo 230-245 da STI1, que inclue a porção de ligação a PrPC, reverteu estes distúrbios de memória de curto prazo relacionados a idade em camundongos Prnp+/+. Camundongos Tg-20 também exibiram níveis reduzidos de acetilcolinesterase sérica em comparação com os outros dois genótipos. Análises de imunohistoquímica revelaram expressão aumentada de proteínas hipocampais associadas à morte celular apoptótica e de plasticidade neuronal, respectivamente, caspase-3 e sinaptofisina, em camundongos Tg-20. Os resultados do presente estudo reforçam a hipótese da PrPC apresentar papel neuroprotetor e sugerem o seu envolvimento em algumas alterações comportamentais e neuroquímicas relacionadas ao xvi envelhecimento via sistema colinérgico e modulação da sinaptogênese e morte celular apoptótica.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015.
Made available in DSpace on 2016-03-15T04:05:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337678.pdf: 8258436 bytes, checksum: 67a6ef5115efff20ad348e0c04dc547b (MD5) Previous issue date: 2015
A chegada dos neutrófilos até o foco da inflamação desenvolve papelessencial na resposta inflamatória. Além de serem uma populaçãocelular fundamental para conter e eliminar o patógeno, seu acúmulo levaao dano tecidual uma vez que essas células não são capazes dediscriminar entre as células do hospedeiro e o agente causador dainflamação Neutrófilos se acumulam no local da inflamação através deuma série de eventos sequenciais, entre eles a quimiotaxia. Aquimiotaxia é responsável por guiar os neutrófilos até o foco exato dainflamação. Estudos experimentais demonstram que a proteína de faseaguda Alfa-1-glicoproteína ácida (AGP) é capaz de interferir nesseprocesso, pois inibe o rolamento, a adesão e a migração dos neutrófilosin vivo, assim como a quimiotaxia in vitro. Altamente glicosilada,aproximadamente 12% dos carboidratos da AGP são de ácido siálico.Dentre os receptores que reconhecem os ácidos siálicos estão as lectinasdo tipo Siglecs (Sialic acid binding Ig-like lectins). Siglecs apresentamem sua estrutura um domínio inibitório capaz de interferir na respostaintracelular ativada por outros receptores. Assim, a hipótese deste estudoé de que os resíduos de ácido siálico presentes na estrutura da AGPseriam responsáveis pela ativação de Siglec-5 e/ou 9, inibindo aquimiotaxia dos neutrófilos. Para investigar essa hipótese, foi geradauma AGP desialilada sem a presença desse carboidrato. Neutrófilostratados com essa proteína foram submetidos a um ensaio dequimiotaxia em câmara de Boyden. Esse ensaio revelou que a retiradado ácido siálico reverteu o perfil inibitório induzido pela proteínasialilada. Ainda mais, os resultados demonstram que o ácido siálico emsua forma livre também foi capaz de inibir a quimiotaxia de maneiraequivalente à AGP. Sabendo que a AGP é capaz de ligar-se à superfíciedos neutrófilos, procurou-se investigar se essa interação ocorre atravésda ligação do ácido siálico à Siglec-5 ou 9. Para isso foi feita umacitometria de fluxo e avaliada a intensidade de fluorescência emitidapela AGP ou por anticorpos fluorescentes anti-hSiglec-5 e 9, quando napresença de anticorpos neutralizantes hSiglec-5 e 9 ou da AGP nãomarcada, respectivamente. No entanto nenhuma diferença na média deintensidade de fluorescência foi observada. Em conjunto nossoresultados sugerem que o reconhecimento do ácido siálico é necessáriona inibição da quimiotaxia induzida pela AGP.

Abstract : Neutrophil recruitment has a central role in host response and inresolution of inflammation, but if uncontrolled can lead to severe tissuedamage. Overwhelming activation of neutrophils result in aninappropriate infiltration of neutrophils known to elicit cell and tissuedamage that can lead to an organ dysfunction. The acute phase proteinAlpha-1-acid glycoprotein (AGP) was shown to inhibit neutrophilmigration, rolling and adhesion in vivo. AGP also inhibits neutrophilchemotaxis in vitro, and evidence suggests that AGP terminal sialic acidresidues interact with an inhibitory receptor known as Siglec (Sialicacid-binding immunoglobulin-like). However, how AGP affectsneutrophil-response is not completely understood. In this study, weexamine mechanisms related to the effect of AGP on neutrophilchemotaxis responses, and we hypothesized that Alpha-1-acidglycoprotein inhibits neutrophil chemotaxis in vitro by Siglec-5 e/or 9activation. AGP 6µM inhibits neutrophil migration in vitro, as does6µM of sialic acid, when compared with control neutrophils.Neuraminidase treatment of AGP reversed the suppressive effect of theprotein. To investigate how AGP interacts with neutrophils, flowcytometry analyses using AGP labeled with Alexa Fluor 488 andhSiglec-5 and 9 neutralizing antibodies, or AGP and hSiglec-5 and 9fluorescent antibodies were used. Although no difference in the MFIwas observed. Taken together these results suggest that sialic acidrecognition is required for its inhibitory function, and that the interactionof AGP with neutrophils depend on this carbohydrate. However, thisstudy was not able to determine if this interaction was due to the ligationof AGP sialic acid to the receptor Siglec-5 and/or -9.

O conhecimento da glicobiologia estrutural se mantém como a parte menos explorada do estudo de estrutras tridimensionais. Considerando que a glicosilação pode estar envolvida em processos biológicos como crescimento celular e inflamação o descrever das bases moleculares da interação proteína-carboidrato pode auxiliar na compreensão destes eventos. Neste sentido considerando o pequeno número de trabalhos avaliando o perfil conformacional de glicoproteínas por simulação de dinâmica molecular e RMN este trabalho demonstrou que o campo de força GROMOS43a1 é capaz de representar adequadamente um conjunto de glicoproteínas tendo como conformação inicial as estrutras determinadas por RMN. O próximo desafio foi simular dissacarídeos isolados em solução e comparar o seu perfil aos estudos anteriores, o que demonstrou que o conjunto de conformações de cada dissacarídeo representa as conformações obtidas em ambos os métodos. Para validar o uso de conformações de dissacarídeos como unidades de construção de glicanas em glicoproteínas foi descrita a forma glicosilada das enzimas Cox-1 e Cox-2, que não possuíam a estrutura da glicosilação, e as conformações das glicanas nestas simulações foram similares as dos dissacarídeos, comprovando que as conformações de dissacarídeos podem ser extrapoláveis para construção de glicoproteínas. Finalmente foi construída a forma glicosilada da AGP humana, uma proteína que possui diferenças funcionais associadas ao perfil das glicanas ligadas. Sabe-se que em casos de resposta inflamatória a concentração plasmática da AGP pode ser aumentada em até cinco vezes a concentração normal e durante este aumento há uma diferença no número de ramificações das glicanas e presença de resíduos de fucose. Foram simuladas três estrutras AGP, sem glicosilação e glicosilada com a presença e ausência de fucoses,. A flexibilidade da estrutura não glicosilada é muito maior que das glicoproteínas, mostrando o papel estrutural da glicosilação. Adicionalmente foi estudada a interação que a AGP com selectinas, proteínas envolvidas nos processos inflamatórios, fornecendo dados preeliminares do papel molecular da interação AGP-selectina.
The knowning of strucutural glycobiology still the less explored area in threedimensional structures. Considering the envolviment of glycosylation in biological process such cellular grown and inflammation describe the molecular basis interactions of protein-carbohidrate may facilitate understanding of these events. In this way considering the small number of works evaluated the conformational profile of glycoproteins by molecular dynamics simulations and NMR this work demonstrate that the GROMOS96 43a1 force field adequately represent a glycoprotein’s conformational ensemble taking as the starting geometries, the NMR determined structures. The next step is simulate isolated disaccharides in solution and compare these proflite with previous work, which demonstrate that the conformational ensamble of disaccharides represents the conformations obtain in both methods. To validate the use of disaccharides conformations such construct units of glycans in glycoproteins, the glycosylated form of Cox-1 and Cox-2 with no previous structure were simulated, and the conformations of glycans were similar to disaccharides, proving that disaccharides conformations can be extrapolated to construct glycoproteins. Finaly it was construct the glycosylated form of human AGP, a protein with functional differentces associated to glycan linked profile. In cases of inflammatory response the the plasma concentration can rise up to fivefold and in this case the glycans differ in the branching and presence of fucose residues. Three structures of AGP were construct, unglycosylated and glycosylated with and without fucoses. The structural flexibility of unglycosylated form was higher than the glycosylated forms, demonstrated the structural role of glycans. Additionally it was study the interaction of AGP with selectins, proteins envolved in inflammatory process, supply preliminary data to molecular role of AGP-selectin interaction.

Aim of this work is to clarify the human herpervirus 8 vOX2 activity in monocytes-macrophages in order to define its funtional role in Kaposi Sarcoma pathogenesis. Kaposi’s Sarcoma (KS) is an inflammatory cytokines-mediated angioproliferative disease triggered by human herpesvirus 8 (HHV-8) infection. This virus is unique because of its extensive molecular piracy of host critical cell regulatory and immune modulatory genes encoding proteins that could contribute to viral immune evasion and tumorigenesis. Among them we can find the vOX2 glycoprotein. Cellular homologous OX2 is a member of the immunoglobulin superfamily. This glycoprotein is expressed by several cell types in vivo and it down-modulates inflammatory response through the interaction with a specific receptor of the myeloid cells, the CD200R. By this mechanism, cellular OX2 prevents autoimmune disease, displaying immune modulatory functions. This latter feature is also present in the HHV-8 vOX2. Indeed, several reports suggest that the vOX2 has an anti-inflammatory and immunosuppressive activity in basophil and neutrophil cells, but its effect on monocytes-macrophages is still controversial. The aim of our work is to clarify the vOX2 activity in monocytes-macrophages in order to define its functional role in KS pathogenesis. The relevance of monocytesmacrophages relies on the fact that this cell type is infected by HHV-8 in vivo, it is present in KS lesions and it expresses CD200R that functions as a receptor for vOX2 exactly like it does for cellular OX2. We decided to express the viral glycoprotein into two different monocyticmacrophagic cell lines (U937 and THP1) and/or into PBMC-derived macrophages (primary MØ) for our study. Compared to chemical and physical methods, the viral transduction has resulted the most efficient system to transfer transgenes into the target cells; based on this finding, the HHV-8 orf K14 encoding vOX2 has been cloned into HIV-1 based lentiviral vector that has been used to transduce the cells. After verifying the vOX2 expression in the transduced target cells, we evaluated the glycoprotein effect on the transcription level and secretion of two inflammatory cytokines involved in the KS development, TNF? and IL-1?. Our data show that the vOX2 up-regulates both TNF? and IL-1? in U937 and THP1 cell lines and in primary MØ kept in basal conditions. In addition, the TNF? and IL-1? up-regulation was observed in the IFN?-activated U937 cell line. By contrast, in the IFN?-activated THP1 cell line and primary MØ the viral glycoprotein inhibits TNF? and IL-1? gene expression. Taking into account these controversial data in the different cell types, in order to carry on our research in a model more representative of the physiological condition, we checked the expression of vOX2 receptor on U937 and THP1 cell line and on primary MØ. Since the primary MØ resulted to be the only cell type expressing CD200R, we decided to evaluate the vOX2 activity employing this cellular system. However, being the level of viral protein expression in primary MØ low compared to the one obtained in the cell lines, we performed coculture between THP1 CD200R¯ cell line expressing vOX2 and primary MØ CD200R+ in order to confirm the results on inflammatory-cytokines modulation by vOX2. Our data show that the vOX2 promotes TNF? secretion in the primary MØ in basal conditions; on the contrary, in the IFN?-activated cells the viral glycoprotein induces a significant reduction of cytokine production as we observed in monoculture of primary MØ expressing vOX2. Starting from these data, we next evaluated the vOX2 effect on the transcription level of IL-10, an inhibitory cytokine of the TNF? and IL-1?-mediated inflammatory responses. Our data show that IL-10 expression profile is the opposite with respect to TNF? and IL-1?, as we expected. Moreover, these results are in agreement with the CD200R mRNA down-modulation that we observed in basal conditions and with its up-regulation in the IFN?-activated cells. In addition, we were able to show that vOX2 promotes the phagocytosis of the primary MØ in basal conditions while it inhibits this activity in the IFN?-activated cells. Our results suggest that the immune modulatory activity of vOX2 is tightly dependent on the activation state of the cells. This conclusion is also supported by the analysis of vOX2 effect on the global gene expression profile in the primary MØ. Finally, we observed that the antigen presentation to T cells by primary MØ is compromised by vOX2 expression regardless of the activation state of the cells. This effect seems to be related to the down-modulation of HLA expression on cell surface. Overall, our results lead to the conclusion that vOX2 may be involved in viral immune evasion because of its anti-inflammatory and immunosuppressive effect in the activated monocytes-macrophages. At the same time, in basal conditions, vOX2 can also stimulate monocytes-macrophages contributing to the inflammatory state that is important for the KS development. This finding would imply the presence of at least one unknown receptor that would compete with the “inhibitory receptor” CD200R for the binding to vOX2. An immune modulatory activity of vOX2, linked to cell activation state, could explain the contradictory results reported in literature.

Orientador: Jaime Aparecido Cury
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Made available in DSpace on 2018-07-14T07:59:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_CelsoPaulinoda_D.pdf: 4369740 bytes, checksum: cd49f02fe75b95d94f51aac52e00a458 (MD5) Previous issue date: 1989
Resumo: Lectinas são prot.einas que se ligam a açúcares especifiicos de macromoléculas. Foram descritas inicialmente em plantas, porém de outras fontes já foram isolados como bactérias, animais e até mesmo mamíferos. As lectinas apresentam várias propriedades como hemaglutinação, aglutinação, de bactérias, protozoários, leucocitos, estímulo mitogênico para linfócitos e entre outras a reação e precipitação de glicoproteinas, incluindo imunoglobulinas. As glicoproteinas constituem um grande grupo de substâncias presentes na saliva e soro, dentre elas a imunoglobulina A. Tem sido descrito que lectina de semente de jaca reage com IgA presente no soro e secreções humanas. Neste t.rabalho procuramos verificar se a lectina de semente de jaca, específica para galactose, reagia com imunoglobulina A, salivar, e se era especlfica para esta glicoproteina, comparando as reações com as glicoproteinas do soro. Através de técnicas de dupla difusão em gel de agarose, eletroforese em gel de agarose e poliacrilamida, com saliva e soro deficiente em imunoglobulina A, verificamos que esta lectina reage com outras glicoproteinas da saliva e do soro além da imunoglobulina A. Após o fracionamento do extrato bruto de semente de jaca, por cromatografia de afinidade em agarose-D-galactose, verificamos a existência de outra lectina neste extrato, não específica para galactose, com atividade precipitante para várias proteinas do soro humano. As proteinas da saliva e soro separadas eletroforeticamente em géis de poliacriamida ragem com soluções de lectina. A reação é especifica, pois as proteinas que apresentam afinidad para as lectinas ficam imobilizadas, enquanto que outras se difundem do gel quando em soluções tampões. Est.a t.écnica mostrou-se adequada para o estudo de glicoproteinas da saliva e soro humano normal e patologico
Abstract: Interaction of lectins of jack seeds Artocarpus integrifolia, with salivay and human serum glycoproteins. Lectins are proteins which bind to specific saccharides in polysacharides, glycoproteins or glycolipds. Although originally described in plants, they have been isolated from many diverse sources like bacterias and animal including smails, sponges, fish and others. The lectins have many biological activities like erythrocyte bacterial, protozoal, leukocytes aglutination, produce mitogenic effect on lymphocyte culture, and precipitate glycoproteins, as the immunoglobulins. The gycoproteins are important group in t.he salivary and serum components, included immunoglobulin A. Our aim was determine if the lectin of jack seed (galactose specific) reacts specifically with salivary immunoglobin A when compared with serum glycoprotelns. Through double agar diffusion and electrophoretic separation in agarose and polyacrylamide gels of Ig-A deficient saliva and serrum, we observed that other glycoproteins present in saliva and serum react with this lectin. The fractioned crude extracts of jack seeds by affinty chromatography with agarose-D-ga!actose resulted in a lectin specific to galactose. The other proteins that didn't bind to galactose, also react and precipitate various serum proteins. The salivary and serum proteins separated in disc polyacrylamide gels react with lectins solutions. The reaction is specific because only some proteins are retained into gel after repeated wash in buffer. This procedure was shown to be useful for study normal and pathological human salivary and serum glycoproteins
Doutorado
Biologia e Patologia Buco-Dental
Doutor em Odontologia

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-04-04Bitstream added on 2014-11-10T11:58:06Z : No. of bitstreams: 1 000785503_20150404.pdf: 497224 bytes, checksum: a459a5b949a60edee526c57ea3fc8d80 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-04-13T18:26:26Z: 000785503_20150404.pdf,Bitstream added on 2015-04-13T18:27:06Z : No. of bitstreams: 1 000785503.pdf: 1639502 bytes, checksum: 2fca464d3fcaa51a719adf9dfb1cd8d2 (MD5)
Interferons (IFNs) são pequenas proteínas conhecidas por suas atividades antiproliferativa e imunorregulatória e por seu envolvimento crucial na ação antiviral celular. Os IFNs do tipo I incluem os IFN-α, β e ω e são utilizados terapeuticamente no tratamento de diversos tipos de cânceres e hepatites B e C. Sabe-se que dentre os efeitos adversos causados pelo IFN-α estão as disfunções endócrinas. Pouco se sabe sobre os efeitos dos IFNs na reprodução. Assim, o presente estudo objetivou investigar, em ratos adultos, os efeitos da exposição subcrônica a diferentes doses de IFN-α sobre parâmetros reprodutivos masculinos. No experimento 1, ratos Wistar adultos (90 dias/350-470g) foram distribuídos em três grupos experimentais (n=10), sendo um controle, cujos animais receberam o veículo, e dois tratados, subcutaneamente, com as doses de 5x104 unidades/Kg e 10x104 unidades/Kg, diluídas em salina. Após 30 dias de tratamento os animais foram pesados e eutanasiados para coleta dos órgãos do sistema genital. Testículo e epidídimo direitos, próstata ventral e glândula seminal (sem a glândula coaguladora) de cada animal foram retirados e pesados. Testículos e epidídimos direitos foram utilizados para determinação do número de células germinativas e os epidídimos esquerdos para a coleta de espermatozoides para avaliação da motilidade e morfologia espermática e para serem usados nas inseminações artificiais intrauterinas. Os níveis séricos de testosterona também foram mensurados. No experimento 2, outro lote de animais, seguindo o mesmo design experimental, foi utilizado para a coleta dos testículos e epidídimos esquerdos para avaliações histopatológica e morfométrica. Os pesos corpóreos e dos órgãos reprodutores foram semelhantes entre os grupos, bem como a produção espermática diária, tempo de trânsito espermático através do epidídimo, motilidade e morfologia ...
Interferons (IFNs) are small proteins known their antiproliferative and immunoregulatory activities and their crucial involvement in the cellular antiviral. Type I IFNs include the IFN-α, β e ω and are used therapeutically in the treatment of several kinds of cancers and hepatitis B and C. Endocrine dysfunction is among the adverse side effects of IFN-α. Little is know about the effects of IFNs on reproduction. Therefore, the present study aimed to investigated, in adult rats, the effects of subchronic exposure to different doses of IFN-α on male reproductive parameters. In the experiment 1, adult male Wistar rats (90 days/350-470g) were distributed in three experimental groups (n=10), one control, which received the vehicle, and two treated, subcutaneously, with 5x104 units/Kg e 10x104 units/Kg of IFN-α, diluted in saline. After 30 days of treatment the animals were weighed and euthanized for collection of reproductive organs. Right testis and epididymis, ventral prostate and seminal gland (without coagulating gland) of each animal were removed and weighed. Right testis and epididymis were used for the determination of sperm number and left epididymis for collection of sperm to evaluate of sperm motility and morphology and for intrauterine artificial insemination. The serum testosterone levels were also measured. In the experiment 2, another lot of animals, following the same experimental design, were used for collection of left testis and epididymis for to histopathological and morphometric evaluation. The body and reproductive organ weights were unchanged, as well as the daily sperm production, sperm transit time through the epididymis, sperm motility and morphology and fertility potential of animals. The histopathological and morphometric evaluation did not reveal injuries related to treatment. Thus, our results show that subchronic exposure to IFN-α did not interfere with levels of serum testosterone ...