Littérature scientifique sur le sujet « Epotiloni »

Lo scopo di questo lavoro è stato quelli di studiare la neurotossicità periferica indotta da due differenti farmaci antitubulinici (epotilone B e sagopilone) in modelli sperimentali in vitro e in vivo In particolare lo studio è stato articolato in due fasi consecutive: la prima fase ha previsto lo studio della tossicità periferica indotta dalla somministrazione di epotilone B attraverso la messa a punto di un modello in vitro su colture organotipiche di gangli delle radici dorsali e un successivo modello in vivo che ha visto l’utilizzo di ratti Fischer; nella seconda fase è stato studiata la tossicità periferica indotta dalla somministrazione di sagopilone attraverso la messa a punto di un modello in vitro su colture organotipiche di gangli delle radici dorsali e due successivi modelli in vivo che hanno visto l’utilizzo di ratti Wistar e sono stati svolti per ricercare la massima dose tollerata di farmaco e la corretta scheda di somministrazione.

Rozprawę doktorską stanowi cykl 5 powiązanych tematycznie publikacji.
Nowotwór jajnika charakteryzuje się najwyższą śmiertelnością spośród wszystkich nowotworów ginekologicznych. Tak złe statystyki związane są z trudnościami z postawieniem prawidłowej diagnozy oraz częstym rozwojem lekooporności. Czynniki te sprawiają, że choroba wykrywana jest najczęściej w III i IV stopniu zaawansowania, kiedy występują już przerzuty do innych narządów, a dostępne obecnie metody leczenia są nieskuteczne. Z tego względu poszukiwanie nowych i efektywniejszych metod terapeutycznych jest wyzwaniem dla współczesnej onkologii. W niniejszej rozprawie doktorskiej oceniano skuteczność kombinacji WP 631 i epotilonu B (Epo B) w komórkach SKOV-3. WP 631 jest bisantracykliną złożoną z dwóch cząsteczek daunorubicyny połączonych łącznikiem p-ksylenowym, wykazującą plejotropowy mechanizm działania, obejmujący przede wszystkim interkalację do DNA. Jej efektywność w komórkach raka jajnika jest dobrze udokumentowana. Epo B z kolei wykazuje działanie zbliżone do taksanów: stabilizuje mikrotubule i hamuje ich depolimeryzację. Wykazano, że w komórkach raka jajnika epotilony przejawiają wyższą aktywność niż paklitaksel, najczęściej stosowany przedstawiciel taksanów. Celem niniejszej rozprawy doktorskiej było stwierdzenie, czy WP 631 i Epo B, zastosowane łącznie, będą działały skuteczniej niż w przypadku ich pojedynczego podania w komórkach raka jajnika SKOV-3, oraz poznanie molekularnego mechanizmu skojarzonego działania związków. Badania te podjęto w oparciu o dane literaturowe, wskazujące na znaczną przewagę terapii skojarzonej nad monoterapią w leczeniu nowotworu jajnika. Wykazano, że WP 631 i Epo B działają synergistycznie w komórkach raka jajnika, a najbardziej optymalnym połączeniem jest to, w którym stosunek bisantracykliny do Epo B wynosi 1 : 1. Tę kombinację związków stosowano w kolejnych eksperymentach, w których oceniano jej właściwości proapoptotyczne, prooksydacyjne i genotoksyczne. Stwierdzono, że kombinacja WP 631 i Epo B, w większym stopniu niż związki stosowane pojedynczo, indukuje apoptozę w komórkach SKOV-3. Na podstawie analizy aktywności kaspaz -9, -8 oraz -3 wykazano, że połączone działanie związków aktywuje zarówno mitochondrialną, jak i receptorową ścieżkę programowanej śmierci komórki. Udowodniono też, że kombinacja przejawia silne działanie prooksydacyjne, a reaktywne formy tlenu zaangażowane są w jej mechanizm działania. WP 631 i Epo B stosowane w połączeniu generowały również uszkodzenia DNA, znacznie silniejsze niż w przypadku działania związków pojedynczych. Co istotne, genotoksyczne działanie kombinacji okazało się w minimalnym stopniu odwracalne. Uszkodzenia materiału genetycznego powstałe w wyniku działania samego WP 631 czy Epo B były mniej trwałe. Przedstawione wyniki dowodzą, że kombinacja WP 631 i Epo B wykazuje w komórkach SKOV-3 wyższą efektywność niż związki stosowane pojedynczo. W celu poznania molekularnego mechanizmu skojarzonego działania związków przeanalizowano ich wpływ na cykl komórkowy oraz regulujące go białka. Wykazano, że WP 631 nie powoduje zmian w rozkładzie faz cyklu, Epo B działa proapoptotycznie oraz zatrzymuje cykl w fazie G2/M, natomiast kombinacja związków prowadzi do poślizgu mitotycznego, czyli wyjścia komórek z bloku G2/M, oraz ich śmierci na drodze apoptozy. Zahamowanie aktywności białek regulujących cykl komórkowy: cykliny B, cyklinozależnej kinazy 1 (CDK1), EpCAM i HMGB1 za pomocą specyficznych inhibitorów pozwoliło ustalić, że białka HMGB1 i EpCAM nie są zaangażowane w mechanizm działania żadnego ze związków, a kompleks cyklina B/ cyklinozależna kinaza 1 pośredniczy w mechanizmie działania Epo B. Na podstawie analizy PCR stwierdzono ponadto, że kombinacja związków istotnie wpływała także na poziom ekspresji mRNA kodujących analizowane białka. Pod wpływem jej działania ekspresja mRNA kodujących cyklinę B i CDK1 istotnie spadła, co stanowi dowód na wystąpienie poślizgu mitotycznego. Kombinacja związków, w odróżnieniu od WP 631 i Epo B stosowanych pojedynczo, obniżała także ekspresję mRNA kodujących dwie pozostałe proteiny: EpCAM i HMGB1. Są one czynnikami prognostycznymi, których wysoka ekspresja koreluje ze stopniem zaawansowania choroby i złymi rokowaniami. Dlatego też obniżanie ich ekspresji może się przełożyć na lepsze rezultaty terapii. Przeprowadzone eksperymenty dowiodły, że WP 631 i Epo B działają synergistycznie w komórkach SKOV-3, a najefektywniejszym połączeniem jest to, w którym stosunek WP 631 do Epo B wynosi 1 : 1. Wytłumaczeniem wyższego potencjału kombinacji związków jest jej wpływ na białka EpCAM i HMGB1, które pośredniczą w mechanizmie skojarzonego działania WP 631 i Epo B.
Praca była finansowana z grantu MNiSW Nr N N405 100939 pt. Indukcja apoptozy przez epotilon B i analog doksorubicyny WP 631 w komórkach raka jajnika wrażliwych i opornych na leki przeciwnowotworowe, realizowanego w latach 2010–2013 (kierownik: dr hab. Agnieszka Marczak, prof. nadzw. UŁ), projektu Doktoranci – Regionalna Inwestycja w Młodych Naukowców nauk przyrodniczych i technologicznych – Akronim – D-RIM BIO, realizowanego przez Uniwersytet Łódzki, współfinansowanego przez Unię Europejską ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, Priorytet VIII Regionalne Kadry Gospodarki, Poddziałanie 8.2.1 Wsparcie dla współpracy sfery nauki i przedsiębiorstw oraz z indywidualnych stypendiów stanowiących dofinansowanie badań mieszczących się w temacie Molekularne mechanizmy interakcji WP 631 i epotilonu B w komórkach raka jajnika.

Choroby nowotworowe stanowią obecnie znaczący odsetek chorób cywilizacyjnych i oprócz chorób układu krążenia są głównymi przyczynami zgonów w krajach rozwiniętych. Opracowywanie nowych, skuteczniejszych terapii przeciwnowotworowych jest zatem zadaniem priorytetowym, w realizację którego zaangażowanych jest wiele koncernów farmaceutycznych. Wzrost mocy obliczeniowej komputerów oraz udoskonalenie technik informatycznych sprawiły, że możliwe stało się wykorzystanie ich do wspomaganego komputerowo projektowania leków. W niniejszej pracy wykorzystano współczesne osiągnięcia w dziedzinie mechaniki molekularnej oraz semiempirycznej mechaniki kwantowej do modelowania oddziaływań receptor-ligand w dwóch odmiennych, ale jednakowo ważnych z punktu widzenia współczesnej terapii przeciwnowotworowej układach: β-tubulinie oraz ludzkim receptorze witaminy D (VDR). Przedstawiona praca doktorska podzielona została na dwie części. W pierwszej, przeprowadzono analizę miejsca wiązania epotilonów, promotorów polimeryzacji tubuliny, znajdującego się na podjednostce β dimeru α,β-tubuliny. Główną przyczyną zainicjowania tych badań było nieistnienie spójnego modelu wiązania cząsteczki epotilonu z β-tubuliną, pomimo wielu przeprowadzonych badań eksperymentalnych. Określenie sposobu wiązania liganda – epotilonu - do β-tubuliny znacznie ułatwiłoby projektowanie jego skuteczniejszych i mniej toksycznych analogów. Następnym etapem było stworzenie modelu wiązania cząsteczki epotilonu A do β-tubuliny. W drugiej części pracy obliczono energię swobodną wiązania 1,25 dihydroksywitaminy D3 i jej wybranych analogów do receptora witaminy D. Następnie porównano wartości obliczonych energii ze sobą oraz skorelowano je z danymi eksperymentalnymi, a także oszacowano wartość względnego powinowactwa do receptora VDR dla jednego z najsilniej działających analogów 1,25 dihydroksywitaminy D3. Określono ponadto liczbę i rodzaj kontaktów między atomami łańcuchów bocznych ligandów a atomami kieszeni wiążącej receptora. Informacje uzyskane w ten sposób mogą znacznie ułatwić projektowanie kolejnej generacji analogów jeszcze silniej oddziałujących z receptorem oraz wykazujących silniejsze działanie biologiczne. W rezultacie badań przeprowadzonych w pierwszym etapie tej pracy przy wykorzystaniu dokowania molekularnego, mechaniki molekularnej i semiempirycznej mechaniki kwantowej uzyskano nowy model wiązania epotilonu A do β-tubuliny. Otrzymany model jakościowo różni się od uzyskanych metodami doświadczalnymi. Charakteryzuje się on kilkoma cechami, które stanowią o jego wartości z perspektywy sposobu wiązania się cząsteczki epotilonu z β-tubuliną. Po pierwsze, tworzy gęstą sieć wiązań wodorowych, która stabilizuje kompleks i przyczynia się do znacznego zwiększenia energii oddziaływania w porównaniu z istniejącymi modelami. Wykazuje również znacznie mniejszą podatność na solwatację, ze względu na głębsze umieszczenie w kieszeni wiążącej hydrofilowego fragmentu przy C3-C7 i dodatkową ochronę, jaką stanowią grupy metylowe przy C4, C6 i C8. Grupa tiazolowa epotilonu stanowi zarówno „kotwicę”, oddziałując z Gly360, ale również ochronę przed solwatacją, ze względu na jej położenie blisko powierzchni białka i ekspozycję atomu siarki, posiadającą właściwości hydrofobowe. Zaproponowany model wyjaśnia znaczącą liczbę rezultatów badań SAR i nie stoi w sprzeczności do żadnych spośród rozważanych. W kolejnej części pracy zastosowano metody dokowania molekularnego, mechaniki molekularnej i semiempirycznej mechaniki kwantowej do obliczenia energii swobodnej wiązania receptor-ligand. Obliczenia wykonano dla 1,25 dihydroksywitaminy D3 oraz jej trzech silnie oddziałujących i wykazujących wysoką aktywność przeciwnowotworową analogów. Wykazano, że dla wszystkich ligandów, biorąc pod uwagę energię oddziaływania, kluczową rolę pełnią interakcje grupy hydroksylowej O25-H z His305 i His 397. Zwiększona liczba kontaktów van der Waalsa tworzonych przez łańcuchy boczne cząsteczek EB 1089 i KH 1060 nie miała istotnego wpływu na zwiększenie energii oddziaływania w porównaniu z wiązaniami wodorowymi tworzonymi i akceptowanymi przez grupę O25-H. Bioaktywność danego liganda jest również determinowana głównie przez siłę wiązań wodorowych pomiędzy O25-H i His305 i His397, która bardzo dobrze koreluje z uzyskanymi wynikami obliczeń. W tej części pracy pokazano również, że bardzo wysoka energia oddziaływania (a zarazem i bioaktywność) RO 25-9022 związana jest z unikalnym sposobem interakcji z receptorem VDR. W niniejszej pracy doktorskiej przedstawiono procedury i rezultaty modelowania molekularnego dwóch strukturalnie odmiennych układów: β-tubuliny i receptora VDR, oddziałujących z określonymi ligandami. W pierwszej części, opracowano nowy model wiązania cząsteczki epotilonu A do β-tubuliny, wyjaśniający znaczącą liczbę rezultatów badań SAR oraz posiadający cechy, które powinno się brać pod uwagę podczas projektowania nowych analogów epotilonów. W drugiej części, przeprowadzono obliczenia energii swobodnej wiązania 1,25 dihydroksywitaminy D3 oraz jej trzech wybranych analogów do receptora witaminy D i skorelowano jej wartości z danymi eksperymentalnymi. Uzyskane informacje mogą okazać się użyteczne w perspektywie projektowania nowych analogów 1,25-dihydroksywitaminy D3.