Littérature scientifique sur le sujet « Endolisine »

Objetivo: Realizar el análisis bioinformático de la endolisina LysB4 empleada en el biocontrol de Bacilllus cereus en la industria alimentaria. Materiales y Métodos: Se realizó la búsqueda de endolisinas bacterianas empleando la base de datos del GenBank. A partir de dicha información, se obtuvo la secuencia aminoacídica de la endolisina LysB4 (código de accesión AFF27501.1). Dicha secuencia fue utilizada para determinar sus principales parámetros bioquímicos, dominios conservados entre proteínas cercanamente relacionadas, predicción de estructuras secundarias y modelamiento tridimensional, empleando las herramientas bioinformáticas ProtParam, Prosite, PHD Secondary Structure Prediction, Cn3D, SWISS-MODEL, Phyre2 y Robetta, respectivamente. La visualización de modelos tridimensionales se realizó empleando PyMol.

La obtención de alimentos sanos y seguros requiere de técnicas de conservación inocuas para el consumidor y para el me­dio ambiente, entre las que se destaca la bioconservación. A su ca­tálogo de compuestos naturales o microorganismos, utilizados de forma habitual, la bioconservación ha incorporado recientemente los bacteriófagos (fagos) y las proteínas fágicas con actividad lítica (endolisinas). La utilización de fagos y endolisinas en el biocontrol ofrece importantes ventajas frente a otros sistemas de conserva­ción tradicionales. Entre dichas ventajas destacan su inocuidad, especificidad y versatilidad. Por otra parte, la acuciante necesidad de reducir el uso de antibióticos en la cadena alimentaria ha impul­sado la investigación basada en estos antimicrobianos con el fin de aplicarlos en producción primaria (terapia fágica). Sin embargo, y a pesar de la gran eficacia ya demostrada en múltiples sectores, la falta de legislación de la Unión Europea sobre el uso de bacteriófa­gos junto con la necesidad de ser aceptados por los consumidores, son factores que están afectando negativamente a su implantación como bioconservantes. En este contexto, este artículo recoge los últimos resultados relacionados con este tipo de antimicrobianos en la industria agro-alimentaria, y resume los puntos clave para entender las posibilidades reales de su aplicación ante los nuevos requisitos asociados con una producción sostenible tanto desde una perspectiva económica como ambiental

Los virus son partículas que infectan a todas las formas de vida. Los virus bacteriófagos, que infectan bacterias, fueron descubiertos antes que los antibióticos. A pesar de su tamaño pequeño, han contribuido al desarrollo científico desde hace décadas, como en el descubrimiento de numerosas enzimas con aplicaciones en la biología molecular1. En este trabajo se analizarán aspectos generales de la biología de los virus bacteriófagos, su contribución a la salud y se presentarán algunos casos exitosos de la terapia antimicrobiana usando bacteriófagos en humanos y animales. Aunque la terapia con bacteriófagos no cuenta con autorización para su uso global, ya existen formulaciones comerciales de bacteriófagos para la industria alimentaria. Se describirá el arma principal de los bacteriófagos, la endolisina, enzima que “revienta” a las bacterias. Las endolisinas se consideran una alternativa más segura que los bacteriófagos, al carecer de material genético. Los bacteriófagos y las endolisinas tienen aplicaciones revolucionarias en la medicina, como vehículos de transporte de moléculas y generación de vacunas, de fantasmas bacterianos, o en la detección diagnóstica de bacterias patógenas.

Biodiversity of organisms and their genomic content is a valuable source of enzymes, some of which can be isolated and turned into biocatalysts, useful for more sustainable and efficient industrial processes. Organisms thriving in constantly cold environments produce enzymes that may be more efficient in the cold and more thermolabile than enzymes from other organisms, and that display interesting features for the catalysis of several processes that require or are better at low temperature. In the first part of this thesis, two glycoside hydrolases of family 19 (GH19), named LYS177 and LYS188, were identified in the genome of an Antarctic Pseudomonas strain and characterized. Even though most of the characterized GH19 are chitinases, LYS177 and LYS188 showed no chitinolytic activity, but were active as lysozymes with an optimum temperature of 25-35°C, and retained 40% of their highest activity at 5°C. The temperatures of midpoint unfolding transition were estimated to be 20°C higher than their optimum of activity. Based on these features and sequence analysis, LYS177 and LYS188 can be considered cold-active phage endolysins integrated in prophagic regions of the bacterial host. Moreover, the best performing of the two, LYS177, was active and structurally stable over several days only at 4°C, indicating it as a candidate for potential application on the preservation of food and beverages during cold storage. In protein families, enzymes can rapidly acquire new specializations. Therefore, best practices should be implemented to select optimal candidates with the activity of interest and new, potentially promising, features. Characterized GH19 enzymes showed an enhanced in vivo crop defence against chitin containing pathogens and antimicrobial potentialities. In the second part of this thesis, the sequence space of the GH19 family was explored and a database was created to highlight non-described sequences potentially endowed with interesting variants. Based on global pairwise sequence identity of all proteins available in public databases, GH19s were assigned to two subfamilies, the chitinases and the endolysins. Subfamilies were further split into homologous families, which differ in the n° of characterized enzymes they harbour, in the taxonomical distribution, in the presence of accessory domains and loop insertions. Despite this heterogeneity, a core consisting of 27 amino acids around the active site, including important substrate binding residues, was inferred to be conserved between GH19 subfamilies. Thus, this shared core is suggested to be associated to the GH19 capacity to bind sugars containing N-acetyl-glucosamine. Moreover, specifically conserved positions in each subfamily alignment were identified to be a “signature” useful for predicting the substrate specialization of chitinases and endolysins, and to indicate possible outliers with different features. The GH19 evolution was also investigated through molecular phylogeny to explain the observed sequence and structural plasticity: despite endolysins were divided in an higher number of homologous families, they remained in phages and their bacterial hosts, contrary to chitinases, which spread to both prokaryotic and eukaryotic taxa, and acquired at least four loop insertions; moreover, the GH19 chitinase catalytic domain passed from plants to bacteria by horizontal gene transfer in at least two cases. In conclusion, the second part of this thesis shows how bioinformatic tools can be used to analyse the sequence space of a glycoside hydrolase family and extract information to help both experts and non-experts to optimize the discovery of new biocatalysts potentially applied in the field of human health and nutrition.
Biodiversity of organisms and their genomic content is a valuable source of enzymes, some of which can be isolated and turned into biocatalysts, useful for more sustainable and efficient industrial processes. Organisms thriving in constantly cold environments produce enzymes that may be more efficient in the cold and more thermolabile than enzymes from other organisms, and that display interesting features for the catalysis of several processes that require or are better at low temperature. In the first part of this thesis, two glycoside hydrolases of family 19 (GH19), named LYS177 and LYS188, were identified in the genome of an Antarctic Pseudomonas strain and characterized. Even though most of the characterized GH19 are chitinases, LYS177 and LYS188 showed no chitinolytic activity, but were active as lysozymes with an optimum temperature of 25-35°C, and retained 40% of their highest activity at 5°C. The temperatures of midpoint unfolding transition were estimated to be 20°C higher than their optimum of activity. Based on these features and sequence analysis, LYS177 and LYS188 can be considered cold-active phage endolysins integrated in prophagic regions of the bacterial host. Moreover, the best performing of the two, LYS177, was active and structurally stable over several days only at 4°C, indicating it as a candidate for potential application on the preservation of food and beverages during cold storage. In protein families, enzymes can rapidly acquire new specializations. Therefore, best practices should be implemented to select optimal candidates with the activity of interest and new, potentially promising, features. Characterized GH19 enzymes showed an enhanced in vivo crop defence against chitin containing pathogens and antimicrobial potentialities. In the second part of this thesis, the sequence space of the GH19 family was explored and a database was created to highlight non-described sequences potentially endowed with interesting variants. Based on global pairwise sequence identity of all proteins available in public databases, GH19s were assigned to two subfamilies, the chitinases and the endolysins. Subfamilies were further split into homologous families, which differ in the n° of characterized enzymes they harbour, in the taxonomical distribution, in the presence of accessory domains and loop insertions. Despite this heterogeneity, a core consisting of 27 amino acids around the active site, including important substrate binding residues, was inferred to be conserved between GH19 subfamilies. Thus, this shared core is suggested to be associated to the GH19 capacity to bind sugars containing N-acetyl-glucosamine. Moreover, specifically conserved positions in each subfamily alignment were identified to be a “signature” useful for predicting the substrate specialization of chitinases and endolysins, and to indicate possible outliers with different features. The GH19 evolution was also investigated through molecular phylogeny to explain the observed sequence and structural plasticity: despite endolysins were divided in an higher number of homologous families, they remained in phages and their bacterial hosts, contrary to chitinases, which spread to both prokaryotic and eukaryotic taxa, and acquired at least four loop insertions; moreover, the GH19 chitinase catalytic domain passed from plants to bacteria by horizontal gene transfer in at least two cases. In conclusion, the second part of this thesis shows how bioinformatic tools can be used to analyse the sequence space of a glycoside hydrolase family and extract information to help both experts and non-experts to optimize the discovery of new biocatalysts potentially applied in the field of human health and nutrition.

Dissertação de mestrado em Bioengenharia
A Loque Americana (LA) é uma doença causada pela Paenibacillus larvae, uma bactéria gram-positiva formadora de esporos, que são a forma infetante das primeiras fases larvares das abelhas. Esta doença leva à destruição de colónias inteiras, causando graves perdas financeiras e da população de abelhas, em todo mundo. A restrição à presença de antibióticos no mel imposta pela legislação Europeia, e o aparecimento de resistências aos antibióticos mais usados, dificulta o seu uso no tratamento da LA, tornando urgente desenvolver métodos antimicrobianos alternativos. O uso de endolisinas tem sido considerado uma boa alternativa aos antibióticos, especialmente em bactérias gram-positivas. Neste trabalho avaliou-se o efeito antimicrobiano da endolisina PlyPl23, uma N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase derivada do fago phiIBB_Pl23, no controlo de P. larvae. Após clonagem, expressão e purificação da PlyPl23, realizaram-se ensaios in vitro de modo a determinar as condições de reação ótimas e avaliar a sua capacidade antimicrobiana. Todas as estirpes identificadas como P. larvae (71.2 % pertencentes ao genótipo ERIC I e 19 % ao ERIC II) foram sensíveis à PlyPl23 com um maior espetro de ação do que o fago phiIBB_Pl23 (76.2 %). A PlyPl23 apresentou valores de pH ótimo a pH 3 e muito elevado a pH 4 (em média, 56.5 % da atividade apresentada em pH3), que correspondem a níveis de pH encontrados no mel, néctar, pólen e geleia real. Quando suplementada com 200 mM NaCl a pH 7 (pH semelhante ao das larvas, 6.8), apresentou resultados de atividade mais elevados do que sem a adição do sal, (em média, com 0 mM NaCl observou-se 74.6 % da atividade obtida com 200 mM NaCl). Ao contrário, a adição do ião Zn2+ ao tampão de reação não melhorou a atividade. Relativamente à avaliação do efeito antimicrobiano da PlyPl23, verificou-se que uma concentração de 0.2 μM foi suficiente para diminuir a população de P. larvae em cerca de 4 log. Partindo de 104 CFU.ml-1, que se assemelha às concentrações de P. larvae encontradas em larvas infetadas, a enzima reduziu a bactéria para níveis não detetáveis. No que diz respeito aos testes de estabilidade em substâncias importantes a ter em conta para a aplicação in vivo, a enzima, manteve a atividade quando sujeita ao contato com, sacarose, e melhorou o seu efeito antibacteriano após contato com geleia real (aumento médio de 64.9 % de atividade após 30 min) e com homogeneizado de larva (diminuição mais 1 log de atividade após 15 min), relativamente à ação em tampão Tris pH7, 200 mM NaCl. A PlyPl23 é, até à data, a primeira endolisina derivada de um fago de P. larvae a ser reportada, e os resultados obtidos revelaram um elevado potencial para integrar um produto comercial para o controlo da loque americana.
The American foulbrood (AFB) is a disease caused by Paenibacillus larvae, a gram-positive spore-forming bacteria. The spores are the infective form, of the first larval stages of honeybees. This disease leads to the destruction of entire colonies, causing serious financial losses and the decline in bee population worldwide. The restriction on the presence of antibiotics in honey imposed by European legislation, and the emergence of bacterial resistance to commonly used antibiotics, hamper its use in the AFB treatment and makes urgent the development of alternative antimicrobial methods. The use of endolysins, bacteriophage-derived enzymes, has been considered a good alternative to antibiotics, particularly in gram-positive bacteria. In this work, the antimicrobial effect of an endolysin, PlyPl23, to control P. larvae was evaluated. PlyPl23, was identified as an N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase and derived from phage phiIBB_Pl23. After cloning, expression and purification of the enzyme, in vitro assays were performed to determine the optimal reaction conditions and to evaluate the antimicrobial performance. All the strains identified as P. larvae (71.2 % belonging to genotype ERICI and 19 % to ERIC II) were sensitive to PlyPl23 with a broader spectrum of action than phiIBB_Pl23 phage (76.2 %). PlyPl23 presented the optimum pH at pH 3 and very high activity at pH 4 (56.5 % of the activity observed in pH 3, on average), which correspond to the pH levels found in honey, nectar, pollen and royal jelly. When PlyPl23 acted in Tris pH 7 supplemented with 200 mM NaCl (pH similar to larvae, 6.8), results showed higher activity than without the addition of salt, (on average, with 0 mM NaCl was observed 74.6% of the activity obtained with 200 mM NaCl). In contrast, the addition of Zn2+ to the reaction buffer did not improve the activity. Relatively to the antimicrobial effect of PlyPl23, it was found that a concentration of 0.2 μM was sufficient to decrease the population of P. larvae in about 4 log. Starting from a concentration of 104 CFU.ml-1, which is similar to concentrations found in infected larvae, the enzyme reduced the bacteria to non-detectable levels. Concerning to stability tests when the enzyme was in contact with substances that are important to consider for in vivo applications, it was observed that the enzyme remained active after contact with sucrose, and improved its antibacterial effects when in contact with royal jelly (average increase of 64.9% activity after 60 min) and larvae homogenized (decrease of 1 log of activity after 15 min), comparing with the action in Tris pH 7, 200 mM NaCl. PlyPl23 is, to this date, the first P. larvae phage- derived endolysin that was reported, and the results revealed a high potential of the enzyme to comprise a commercial product for the control of AFB.

As estirpes de Staphylococcus aureus (S. aureus) que adquiriram resistência a antibióticos nomeadamente, as estirpes resistentes à meticilina (MRSA), são dos agentes patogénicos com mais impacto na saúde pública a nível mundial. Existem várias estratégias para reduzir o impacto das infeções por estas bactérias incluindo, o controlo restrito do uso de antibióticos, medidas profiláticas para impedir a contaminação e/ou disseminação e a busca e desenvolvimento de novos fármacos antimicrobianos para tratar infeções quer humanas quer animais causadas por estas bactérias. As proteínas fagolíticas ou endolisinas possuem atividade bactericida e podem ser usadas como alternativa aos antibióticos convencionais no tratamento de infeções provocadas por bactérias MRSA. Esta classe de proteínas possui uma probabilidade baixa, quase nula, de desenvolver resistência, e está classificada numa nova classe de antibióticos potentes denominado por enzibióticos. A endolisina do fago Twort possui atividade bactericida contra uma larga gama de estirpes de S. aureus, incluindo estirpes resistentes e sensíveis a antibióticos. Esta proteína é composta por três domínios estruturais e funcionais, com dois domínios que possuem atividade de hidrolase do peptidoglicano (endopeptidase e amidase) e um domínio carboxi-terminal de ligação ao peptidoglicano (denominado de CBD). A atividade e a especificidade da endolisina para S. aureus é dada pela combinação da atividade destes domínios e é regulada pela interação entre os domínios independentes. Neste contexto, o objetivo principal deste trabalho é caracterizar a interação do domínio CBD da endolisina do fago Twort com o peptidoglicano de S. aureus e identificar os determinantes moleculares para o reconhecimento do peptidoglicano. Para tal, utilizou-se diferentes técnicas bioquímicas focadas no RMN. A estrutura 3D do domínio CBD foi determinada por RMN usando a seguinte metodologia: atribuição das ressonâncias usando espectros 3D de ressonância tripla; a atribuição automática do 3D NOESY usando o noeassign/CYANA; refinamento manual usando o programa CARA e cálculo da estrutura tridimensional usando o CYANA. As 20 melhores estruturas apresentaram os parâmetros: 1431 restrições de distância, “target function” de 2.52 A2 e RMSD cadeia principal de 0.57 Å. A estrutura resultante foi analisada e apresenta um enrolamento do tipo SH3b. A análise dos ensaios de titulação entre o domínio CBD e a mistura de fragmentos de peptidoglicano monitorizados por 1H-15N-HSQC demonstrou que existem dois locais de ligação ao peptidoglicano em faces opostas no domínio. Estes resultados foram comparados com estudos anteriormente realizados com o domínio SH3b da lisostafina. Cada região liga a zonas diferentes do peptidoglicano (a região 1 liga no péptido de transpeptidação constituído por 5 glicinas, e a região 2 liga ao tetrapéptido que está ligado pelo resíduo L-Lys na posição 3 com a região carboxi- terminal do péptido de transpeptidação). Foi possível identificar uma região na zona do distal loop do domínio CBD que se propõe que liga ao tetrapéptido que está ligado na região amino- terminal do péptido de transpeptidação (ligado à D-Ala na posição 4 do tetrapéptido).
ROTEIRO/0031/2013-PINFRA/22161/2016

Tese de mestrado em Microbiologia Clínica, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, 2008
A terapia fágica envolve a utilização de fagos ou dos seus produtos como bioagentes para o tratamento ou profilaxia de doenças infecciosas bacterianas. Os bacteriófagos que apresentam genomas de DNA de cadeia dupla, geralmente, produzem enzimas (endolisinas ou lisinas) que degradam o peptidoglicano da parede celular bacteriana, na fase final da infecção, para libertar a progenia viral. Estudos recentes forneceram provas consideráveis de que as lisinas de alguns fagos mostram uma actividade bacteriolítica imediata e elevada, mesmo quando aplicadas exogenamente. Estas evidências apoiam, fortemente, a utilidade clínica das lisinas fágicas no controlo das infecções bacterianas. As bactérias Staphylococcus aureus são patogenes comuns que estão envolvidos em várias doenças infecciosas. O tratamento destas infecções tornou-se, particularmente, problemático devido à sua capacidade de adquirir resistências aos antibióticos de uso comum. Contudo, têm sido realizados muito poucos estudos para possíveis aplicações terapêuticas de lisinas fágicas, activamente purificadas, contra S. aureus. Neste estudo pretendeu-se analisar a actividade lítica de uma lisina (Lys87) codificada pelo fago 87 de S. aureus. Inicialmente, foi deduzido que o gene lys87 codifica para uma possível lisina, com base na pesquisa de homologias. A análise da sequência de aminoácidos da Lys87 revelou a presença de um domínio CHAP e de resíduos conservados existentes em inferidos e conhecidos domínios de endopeptidase, semelhantes aos de outras lisinas de fagos que infectam S. aureus. O gene lys87 foi clonado e a lisina sobre-expressa, como uma proteína de fusão com uma cauda de histidinas, em Escherichia coli. Foram utilizadas várias estratégias para purificar, com sucesso, a Lys87. Os resultados obtidos neste estudo mostraram que esta lisina exibe uma actividade lítica contra diversas estirpes clinicamente relevantes de S. aureus, que incluem estirpes resistentes à meticilina. Contudo, a Lys87 também revelou uma capacidade lítica contra outras espécies de bactérias gram-positivas pertencentes aos géneros Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus e Enterococcus. Em conclusão, os resultados obtidos no presente estudo indicam que a Lys87 apresenta um largo espectro de actividade mureinolítica contra S. aureus e outras espécies de bactérias grampositivas, o que sugere que a Lys87 apresenta potencial para ser utilizada como agente antimicrobiano na prevenção e/ou tratamento de infecções provocadas por estafilococos. Consequentemente, é necessário prosseguir com as investigações para analisar a actividade lítica da Lys87.
Phage therapy involves using phages or their products as bioagents for the treatment or prophylaxis of bacterial infectious diseases. Bacteriophages with double-stranded DNA genomes, produce a bacterial cell-wall peptidoglycan degrading enzyme (endolysin or lysin), at the end stage of infection, to release progeny virions. Recent studies have provided considerable evidence that lysins from certain phages exhibit immediate and strong bacteriolytic activity, even when applied exogenously. These findings strongly support the clinical usefulness of phage lysin in controlling bacterial infections. Staphylococcus aureus is a common pathogen involved in various infectious diseases. The treatment of these infections has become particularly problematic due to their ability to acquire resistance to commonly use antibiotics. However, there have been only a few studies into the possibility of therapeutic applications of purified S. aureus phage lysin. In this study we intended to analyze the lytic activity of the lysin (Lys87) from S. aureus phage 87. Initially, the gene lys87 was deduced, on the basis of a homology search, to encode a possible lysin. Analysis of the amino acid sequence of Lys87 revealed the presence of a CHAP domain and conserved residues present in known and inferred endopeptidases domains similar to other lysins of S. aureus phages. Gene lys87 was cloned and the lysin overexpressed, as a Histagged fusion protein, in Escherichia coli. Several purification approaches were used in order to successfully purify Lys87. The results obtained in this study showed that this lysin exhibits lytic activity of several clinically relevant S. aureus, including methicillin-resistant strains. However, Lys87 also revealed a lytic ability against other gram-positive bacteria species from genera Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus and Enterococcus. In conclusion, the results obtained in the present study indicate that Lys87 has a broad spectrum of muralytic activity against S. aureus and other species of gram-positive bacteria, suggesting that Lys87 has potential as an antimicrobial in prevention and/or treatment of infections caused by staphylococci. Consequently, it is necessary to continue the investigations to analyse the lytic activity of Lys87.

Dissertation for Master Degree in Biotechnology Supervisor
Acinetobacter species have become a major cause of nosocomial infections worldwide due to its inherent and adaptive resistance towards the majority of antibiotics, survival in hostile environments and virulence traits. The increased mortality rates associated with these hard-to-treat bacteria urgently demands the development of new therapeutic options. In the present work, bacteriophage endolysins and depolymerases were explored to tackle Acinetobacter infections. Five novel enzymes were identified, heterologously expressed in Escherichia coli and characterized to gain insights into their enzymatic and structural features, as well tested in vitro (Acinetobacter cells and human cell line A549) and in vivo (Galleria mellonella) to assess their therapeutic potential. Remarkably, endolysins exhibited intrinsic ability to kill Acinetobacter cells, with optimal activity at pH 5-7 and low ionic strength (20 mM), reducing approximately 3.5 log to > 5 log (below the detection limit) within 2 h. Interestingly, no antibacterial activity of endolysins could be observed in biomatrices such as culture medium. All depolymerases exhibited activity on extracellular polysaccharides in all ranges of pH values (pH 5 to 9) and ionic strengths (0 to 500 mM) and retained at least 50% of the activity at 70 ºC. Consistently, circular dichroism analysis showed moderate and high thermostability of endolysins (rich in α-helices) and depolymerases (rich in β-sheets), with melting temperatures around 56 ºC and > 68 ºC, respectively. Combinations of endolysin and depolymerase reduced 24 h-old bacterial biofilms in approximately 1 log. Further work conducted on depolymerases demonstrated that these enzymes degrade the bacterial capsular polysaccharides (observations confirmed by Atomic Force Microscope). The removal of the capsule via depolymerase activity reduced the virulence of Acinetobacter to human epithelial cells for 2 h. Complementary studies performed in vivo showed that depolymerase was able to rescue Galleria mellonella larvae from Acinetobacter baumannii infection in a time- and dose-dependent manner. Maximal difference survival between larvae injected with depolymerase-treated bacteria and non-treated bacteria was observed after 72 h with 5 μM of depolymerase (88% vs 10%; P < 0.01). In summary, the enzymes studied in this thesis revealed to be effective candidates to control problematic Acinetobacter infections, either as bacteriolytic or anti-virulence agents.
As espécies de Acinetobacter tornaram-se uma das principais causas de infeções nosocomiais em todo o mundo, devido à sua resistência inerente e adaptativa à grande maioria dos antibióticos, sobrevivência em ambientes hostis e fatores de virulência. O aumento da taxa de mortalidade associada com estas bactérias de difícil tratamento exige, urgentemente, o desenvolvimento de novas opções terapêuticas. No presente trabalho, endolisinas e depolimerases de bacteriófago foram exploradas para combater infeções de Acinetobacter. Cinco novas enzimas foram identificadas, expressas de forma heteróloga em Escherichia coli e caracterizadas para obter informações sobre as suas características enzimáticas e estruturais, e também, testadas in vitro (células de Acinetobacter e linha celular humana A549) e in vivo (Galleria Mellonella) para avaliar o seu potencial terapêutico. Notavelmente, as endolisinas exibiram capacidade intrínseca para matar células de Acinetobacter, com atividade ótima no pH 5-7 e a baixa força iónica (20 mM), reduzindo aproximadamente 3.5 log até > 5 log (abaixo do limite de deteção) em 2 h. Curiosamente, nenhuma atividade antibacteriana das endolisinas foi observada em biomatrizes, como meio de cultura. Todas as depolimerases exibiram atividade contra os polissacarídeos extracelulares em todas as gamas de valores de pH (pH 5 a 9) e força iónica (0 a 500 mM) e conservaram pelo menos 50% da atividade a 70 ºC. De forma consistente, os estudos em dicroísmo circular mostraram moderada e alta thermoestabilidade das endolisinas (ricas em α-helices) and depolimerases (ricas em β-sheets), com temperaturas de desnaturação de aproximadamente 56 ºC and > 68 ºC, respetivamente. Combinações de endolisina e depolimerase reduziram biofilmes bacterianos de 24 h em aproximadamente 1 log. Estudos adicionais realizados com as depolimerases demonstraram que estas enzimas degradam a cápsula polissacarídica bacteriana (observações confirmadas por microscopia de força atómica). A remoção da cápsula pela atividade da depolimerase reduziu a virulência de Acinetobacter em células epiteliais humanas por 2 h. Estudos complementares realizados in vivo revelaram que a depolimerase foi capaz de resgatar larvas de Galleria Mellonella da infeção de Acinetobacter baumannii, de uma forma dependente do tempo e da dose. A maior diferença de sobrevivência entre larvas injetadas com bactéria tratada com depolimerase e bactéria não tratada foi observada após 72 h com 5 μM de depolimerase (88% vs 10%; P < 0.01). Em suma, as enzimas estudadas nesta tese revelaram ser candidatas eficientes para o controlo de infeções problemáticas de Acinetobacter, quer como agentes antibacteriano ou anti-virulência.
This study was supported by the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) under the scope of the strategic funding of UID/BIO/04469/2013 unit and COMPETE 2020 (POCI-01-0145-FEDER-006684) and BioTecNorte operation (NORTE-01-0145-FEDER-000004) funded by the European Regional Development Fund under the scope of Norte2020 - Programa Operacional Regional do Norte and the Project PTDC/BBB-BSS/6471/2014 (FEDER: POCI-01-0145-FEDER-016643).

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2015
Esta monografia teve como objectivo a revisão de alguns estudos científicos sobre as possíveis aplicações dos bacteriófagos e das endolisinas, nomeadamente o seu potencial bactericida no combate de infecções bacterianas e também o seu potencial na detecção de bactérias. O uso excessivo de antibióticos levou ao aparecimento de vários mecanismos de resistência bacteriana, existindo actualmente inúmeras estirpes de bactérias que não são susceptíveis à acção dos antibióticos disponíveis para terapêutica humana. A actividade lítica das endolisinas expressas pelos bacteriófagos e a especificidade que estes demonstram para as células bacterianas alvo fazem com que possam ser encarados como uma potencial alternativa terapêutica aos antibióticos em casos de infecções bacterianas, pois demonstram eficácia inclusive para estirpes de bactérias resistentes, e, no caso das endolisinas, não são até à data conhecidos quaisquer mecanismos de resistência desenvolvidos pelas bactérias contra estas enzimas. Adicionalmente, a especificidade para as células alvo demonstrada por estes microrganismos faz com que possam ser utilizados também na detecção de bactérias, o que pode trazer vantagens à indústria alimentar no combate de contaminações por patogénios bacterianos.

Tese de Mestrado, Biologia Humana e Ambiente, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Enzimas sintetizadas pelos fagos, como as endolisinas responsáveis por degradarem a camada de peptidoglicano (PG) das bactérias, estão a ser estudadas como uma terapia alternativa devido ao crescente número de bactéria multirresistente a antibióticos. Neste trabalho, de um conjunto de 16 genomas de P. aeruginosa pertencentes à Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa (FFUL), foram identificados 24 profagos diferentes, aos quais se somaram outros 7 de um trabalho realizado por Mageeney e equipa (2020) e mais 72 identificados em estirpes de P. aeruginosa presentes na base de dados PathoSystems Resource Integration Center (PATRIC). Nestes genomas fágicos foram identificadas um total de 25 endolisinas putativas, selecionando-se 5 (7; 13; 15; 119 e 542) mediante a sua percentagem de identidade (identidade inferior 20%) e da família identificada. Foi então induzida a sua expressão, não se conseguindo apenas induzir a expressão da proteína 542. A atividade bacteriolítica das restantes 4 proteínas foi avaliada contra a bactéria Gram-positiva Micrococcus luteus, com todas a exibirem resultados positivos. Posteriormente, foi realizado um zimograma, onde se usou como substrato células autoclavadas de P. aeruginosa com todas as endolisinas putativas a hidrolisar o PG da bactéria alvo. Avaliada a ação sinérgica das endolisinas mais promissoras, a 7 e 119, com permeabilizadores membranares contra P. aeruginosa, ambas levaram à morte bacteriana em sinergia com o ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), o que não se observou para o ácido cítrico. Quando encapsuladas em lipossomas observou-se a morte da bactéria P. aeruginosa ao fim de 5 dias para a composição lipídica DOPE: DMPC: CHEMS (rácio 4:4:2). Relativamente aos profagos, apresentaram uma elevada variabilidade entre si, com a maioria a pertencer à família Siphoviridae. Foram ainda identificados outros genes de interesse e determinados os locais de inserção, observando-se que os genes de tRNA são os locais de inserção preferências dos profagos.
The global increase in multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to phage therapy being refocused upon. Applying bioinformatics tools in 16 newly sequenced genomes of P. aeruginosa were identified 24 prophages to which add up more 7 of another project accomplished by Mageeney et al. (2020). Then 6 phylogenetic distant prophages (identity < 50%) were selected to identify homologues prophages in P. aeruginosa strains deposited in the database PathoSystems Resource Integration Center (PATRIC) with defined criteria. In total were identified 61 prophages homologues to the 6 of reference prophages and 11 different from the prophages already in study in 50 strains of P. aeruginosa. We have identified 25 putative endolysins and based on sequence and structure distinctiveness we selected 5 (7; 13; 15; 119 and 542) to study their activity. We try to induce their expression in Escherichia coli BL21(DE3) but just 4 of them were expressed. These 4 putative endolysins showed in vitro activity against the Gram positive bacteria Micrococcus luteus. Zymogram analysis using autoclaved cells of P. aeruginosa showed that these 4 putative endolysins exhibit activity against P. aeruginosa peptidoglycan (PG). Then the activity of 2 of the most promising putative endolysins was analysed together with outer membrane permeabilizers: ethylenediaminetetra-acetic acid (EDTA) and citric acid. Only EDTA allowed permeabilizing the P. aeruginosa outer membrane, leading to the observation of cell lysis after endolysin application. Then these 2 putative endolysins were encapsulated in liposomes, with the composition DOPE: DMPC: CHEMS (ratio 4:4:2) and was observed the cell death after 5 days. The studied prophages genomes reveal to have small intergenic regions and exhibit high variability. Besides endolysins, other genes with therapeutic and virulence interests were identified. The insertion sites were also analysed, and it was possible to conclude that tRNA genes are the most common.

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2021
Antibiotic resistance is one of the major threats of our time, which has been driving research on antibacterial alternatives. Among these are endolysins, enzymes that digest the peptidoglycan, the major and essential constituent of the bacterial cell wall. Endolysins are produced by bacteriophages, the viruses that infect bacteria, which use them to lyse host cells at the end of the viral replicative cycle for virion progeny release. Those that target Gram-positive bacteria have a typical modular architecture, with one or more catalytic domains responsible for peptidoglycan cleavage in the N-terminal region, and a C-terminal module carrying one or more motifs involved in cell wall binding. Although generally monomeric, two-subunit heteromeric endolysins have already been described. For the recently discovered examples, it was found that the two subunits are produced from a single gene, thanks to the presence of an internal translation start site (ITSS) that allows translation of a smaller reading frame into a C-terminal product of the endolysin. In these cases, the heteromeric endolysins are composed typically by one subunit of the full-length polypeptide, and three copies of the smaller polypeptide. Based on a handful of examples of endolysins with diverse domain architectures that carried putative ITSS, and which are produced by phages that infect clinically or industrially relevant bacteria, we have demonstrated that two different polypeptides are indeed produced from a single gene. These results suggest that this mechanism may be more frequent than anticipated. For one of the studied endolysins, we have also shown that the association of the two polypeptides, with one as a multimer, is necessary for full enzymatic activity. The biochemical analysis also showed that this heteromultimeric endolysin should be composed by one subunit of the full-length polypeptide and between four to six of the smaller polypeptides, indicating a structure never described before.

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018
Devido ao rápido desenvolvimento de bactérias resistentes a múltiplos antibióticos, tem havido um grande esforço no sentido de serem formuladas novas classes de moléculas que constituam uma alternativa viável aos antibióticos convencionais. Os péptidos antimicrobianos (AMPs) e as endolisinas têm sido propostos como sendo duas das alternativas mais promissoras. No entanto, a aplicação destes agentes em contexto terapêutico tem demonstrado algumas limitações que podem prejudicar a sua eficácia antimicrobiana. Os AMPs são pequenos péptidos sintetizados pela grande maioria dos seres vivos, fazendo parte dos mecanismos de defesa antimicrobiana. O seu modo de ação envolve a perturbação do invólucro celular bacteriano, levando frequentemente à dissipação da força proto-motriz (PMF). Por sua vez, as endolisinas são enzimas codificadas por vírus que infetam bactérias, os bacteriófagos ou fagos. São enzimas que degradam o peptidoglicano, um componente polimérico essencial na estrutura da parede celular bacteriana. As enzimas produzidas de modo recombinante conseguem degradar a parede celular, causando bacteriólise, capacidade esta que confere às proteínas o seu caracter antibacteriano (de enzibiótico). Contudo, foi demonstrado que bactérias Gram-positivas em crescimento ativo em meios complexos podem apresentar tolerância à ação bacteriolítica das endolisinas. Os mecanismos responsáveis por esta tolerância ainda não foram elucidados; no entanto, parecem depender de uma PMF intacta. Com base nestas observações, surgiu a ideia de utilizar a ação perturbadora dos AMPs sobre a PMF para potenciar a atividade bacteriolítica das endolisinas. Deste modo, selecionaram-se AMPs para fundir a uma endolisina que tem como alvo Bacillus subtilis, uma bactéria modelo Gram-positiva. Para um dos AMPs selecionados, verificou-se que a sua fusão à endolisina resultou num aumento drástico da atividade bacteriolítica em condições ótimas de crescimento bacteriano. Todavia, este efeito só foi observado quando as proteínas atuavam numa concentração mínima de 1 micromolar. Do mesmo modo, a atividade bactericida de uma das fusões apresentou um aumento de cerca de 3 ordens de magnitude quando comparada com a endolisina nativa. Globalmente, os resultados suportam a criação de uma nova classe de agentes antibacterianos contra bactérias Gram-positivas, designada AMPLys, que resulta da fusão de AMPs com ação perturbadora da membrana e de endolisinas que degradam a parede celular bacteriana.
Due to the rapid development of drug resistant bacteria, there has been an effort in the search of new classes of molecules that may substitute or complement conventional antibiotics. Antimicrobial peptides (AMPs) and endolysins have been proposed and explored as two of the most promising alternatives. However, the application of these molecules, per se, in a therapeutic context has revealed some limitations that may hinder the antibacterial efficacy of the agents. AMPs are short peptides synthetized by most living organisms as part of antimicrobial defense mechanisms. Their antibacterial mode of action involves perturbation of the bacterial cell envelope, frequently with disruption of the so-called membrane proton-motive force (PMF). On the other hand, endolysins are enzymes encoded by the viruses that infect bacteria, the bacteriophages or phages. These enzymes degrade the peptidoglycan, an essential polymeric component of the bacterial cell wall. The capacity of recombinantly-produced endolysins to degrade the cell wall and cause bacteriolysis is what confers their antibacterial character (enzybiotics). However, it has been shown that, when actively growing in complex media, Gram-positive bacteria may present some tolerance against the lytic action of endolysins. The mechanisms responsible for this tolerance remain unknown, but they seem to depend on an intact PMF. Based on these observations, we have hypothesized that the PMF disturbing character of AMPs could be used to potentiate the bacteriolytic activity of endolysins. To test this idea, selected AMPs were fused to an endolysin targeting Bacillus subtilis, a model Gram-positive bacterial species. For one of the AMPs it could be shown that its fusion to the endolysin resulted in a dramatic increase of the bacteriolytic activity under optimal bacterial growth conditions. This effect required though that the fusion proteins acted at the minimum concentration of 1 micromolar. Likewise, the bactericidal activity of one of the fusion proteins showed an increase of 3 orders of magnitude when compared to the unmodified endolysin. Overall, our results point towards the generation of a promising new class of antibacterial agents towards Gram-positive bacteria, named AMPLys, which results from combining the membrane disturbing action of AMPs and the cell wall degrading activity of endolysins in a single agent.