Thèses sur le sujet « Edition génétique »

Les nucléases programmables et site-spécifiques comme CRISPR-Cas9 sont des signes avant-coureurs d’une nouvelle révolution en génie génétique et portent en germe un espoir de modification radicale de la santé humaine. Le « multiplexing » ou la capacité d’introduire plusieurs modifications simultanées dans le génome sera particulièrement utile en recherche tant fondamentale qu’appliquée. Ce nouvel outil sera susceptible de sonder les fonctions physiopathologiques de circuits génétiques complexes et de développer de meilleures thérapies cellulaires ou traitements antiviraux. En repoussant les limites du génie génétique, il sera possible d’envisager la réécriture et la conception de génomes mammifères. Le développement de notre capacité à modifier profondément le génome pourrait permettre la création de cellules résistantes aux cancers, aux virus ou même au vieillissement ; le développement de cellules ou tissus transplantables compatibles entre donneurs et receveurs ; et pourrait même rendre possible la résurrection d’espèces animales éteintes. Dans ce projet de recherche doctoral, nous présentons l’état de l’art du génie génétique « multiplex », les limites actuelles et les perspectives d’améliorations. Nous tirons profit de ces connaissances ainsi que de l’abondance des éléments transposables de notre ADN afin de construire une plateforme d’optimisation et de développement de nouveaux outils de génie génétique qui autorisent l’édition génomique à grande échelle. Nous démontrons que ces technologies permettent la production de modifications à l’échelle du génome allant jusqu’à 3 ordres de grandeur supplémentaires que précédemment, ouvrant la voie au développement de la réécriture des génomes de mammifères. En outre, l’observation de la toxicité engendrée par la multitude de coupures double-brins dans le génome nous a amenés à développer un bio-interrupteur susceptible d’éviter les effets secondaires des thérapies cellulaires actuelles ou futures. Enfin, en conclusion, nous exposons les potentielles inquiétudes et menaces qu’apporte le domaine génie génétiques et apportons des pistes de réflexions pour diminuer les risques identifiés
Programmable and site-specific nucleases such as CRISPR-Cas9 have started a genome editing revolution, holding hopes to transform human health. Multiplexing or the ability to simultaneously introduce many distinct modifications in the genome will be required for basic and applied research. It will help to probe the physio-pathological functions of complex genetic circuits and to develop improved cell therapies or anti-viral treatments. By pushing the boundaries of genome engineering, we may reach a point where writing whole mammalian genomes will be possible. Such a feat may lead to the generation of virus-, cancer- or aging- free cell lines, universal donor cell therapies or may even open the way to de-extinction. In this doctoral research project, I outline the current state-of-the-art of multiplexed genome editing, the current limits and where such technologies could be headed in the future. We leveraged this knowledge as well as the abundant transposable elements present in our DNA to build an optimization pipeline and develop a new set of tools that enable large-scale genome editing. We achieved a high level of genome modifications up to three orders of magnitude greater than previously recorded, therefore paving the way to mammalian genome writing. In addition, through the observation of the cytotoxicity generated by multiple double-strand breaks within the genome, we developed a bio-safety switch that could potentially prevent the adverse effects of current and future cell therapies. Finally, I lay out the potential concerns and threats that such an advance in genome editing technology may be bringing and point out possible solutions to mitigate the risks

Le melon (Cucumis melo) est une plante de la famille des Cucurbitacées. Depuis le 17e siècle, le melon a fait l'objet d'une active sélection variétale utilisant des techniques d'hybridation. Afin d’accélérer le développement de variétés adaptés aux changements climatiques et intégrant de nouveaux caractères d’intérêt, il est important d’adapter au melon, les nouvelles méthodes de sélection et d’édition de génome. Le melon étant une espèce récalcitrante à la transformation génétique, l'élaboration d’un protocole de transformation et de régénération de plantules est une première étape vers l’utilisation des technologies d’édition des génomes. Dans la première section de cette thèse, différents facteurs affectant l'efficacité de la transformation ont été évalués. Tout d’abord, nous avons montré que la durée de co-culture optimale, entre l’explant et le milieu d’inoculation, était de 20 min. L'efficacité de transformation dans une culture d’agrobactérie à une DO600 de 0,8 était 11% supérieure à celle d’une culture de DO600 égale 0,4. Dans un second temps, d’autres facteurs tels que le papier filtre, la concentration du milieu de culture (10 mM de MES) et la température (24 °C) ont eu un effet positif sur l'efficacité de la transformation. L'utilisation de papier filtre au lieu d'agar pour solidifier le milieu de co-culture a amélioré l'efficacité de la transformation. Enfin, l’effet de l'éthylène, connu pour inhiber la transformation génétique, a été évalué par l’ajout d’AVG, AgNO₃ et KMnO₄ dans un milieu de culture de tissus végétaux. Le KMnO₄ s’est révélé être le produit le plus efficace augmentant l’efficacité de transformation de plus de 50 %. Une fois le protocole de transformation et régénération mis en place, les premières expériences de transgenèse ont montré une efficacité de transformation de 4.72 %. 90% des plantes transformées étaient diploïdes. Afin de développer des melons résistants aux potyvirus, nous avons initiés l’édition d’acides aminés cibles dans le facteur d’initiation de la traduction eIF4E. L’édition génomique ciblé a été réalisée en utilisant le système CRIPR-Cas-9 et des ARN guide désignés pour cibler certains acides aminés de eIF4E. L’analyse de 2500 explants, nous a permis d’identifié 59 lignées transformées soit une efficacité globale de 2.4 %. Après amplification et séquençage du gène eIF4E chez ces lignées, nous avons identifiés 17 lignées présentation des modifications de séquence au sein du gène eIF4E. Dans les lignées T1, neuf allèles d’eIF4E ont été identifiés. Huit allèles été prédits délétères sur la fonction de la protéine eIF4E. Ces lignées éditées seront évaluées pour leur résistance aux virus ZYMV, WMV, CMV, PRSV
Melon (Cucumis melo L.) is a diploid plant of the Cucurbitaceae family. Since the 17th century, melon has been the object of an active varietal selection using hybridization techniques. In order to accelerate the development of varieties adapted to climatic changes and integrating new characteristics of interest, it is important to adapt to melon, the new methods of selection and genome edition. Melon is a recalcitrant species to genetic transformation. Thus, the development of a protocol for genetic transformation and seedling regeneration is a first step towards the use of the latest genome editing technologies. In the first section of this thesis, different factors affecting the efficiency of the transformation were evaluated. First, we showed that the optimal co-culture time between the explant and the inoculation medium was 20 minutes. The transformation efficiency in an agrobacteria culture at an optical density (OD600) of 0.8 was 11% higher than that of a culture with OD600 of 0.4. In a second step, other factors such as filter paper, concentration of culture medium (10 mM MES) and temperature (24 °C) had a positive effect on the transformation efficiency. The use of filter paper instead of agar to solidify the co-culture medium strongly improved the transformation efficiency. Finally, the effect of ethylene, known to inhibit genetic transformation, was evaluated by adding AVG, AgNO₃ and KMnO₄ to plant tissue culture medium. KMnO₄ was found to be the most effective product increasing the transformation efficiency by more than 50%.Once the transformation and regeneration protocol was set up, the first transgenesis experiments showed a transformation efficiency of 4.72%. 90% of the transformed plants were diploid. In order to develop potyvirus resistant melons, we initiated the editing of target amino acids in the translation initiation factor eIF4E. Targeted genomic editing was performed using the CRIPR-Cas-9 system and guide RNAs designed to target specific amino acids of eIF4E. The analysis of 2500 explants, allowed us to identify 59 transformed lines for an overall efficiency of 2.4 %. After amplification and sequencing of the eIF4E gene in these lines, we identified 17 lines presenting sequence modifications within the eIF4E gene. In T1 lines, nine alleles of eIF4E were identified. Eight alleles were predicted to be deleterious to eIF4E function. These edited lines will be evaluated for their resistance to ZYMV, WMV, CMV, PRSV

Un défi majeur pour l'agriculture sera sa capacité à nourrir le monde du 21ème siècle face au changement climatique et à l'accroissement de la population, tout en répondant à la nécessité de la transition agroécologique. Le blé tendre (Triticum aestivum) en sera un enjeu clé, et les biotechnologies un outil clé à mobiliser. Trois axes de recherche mettant en jeu l'outil CRISPR-Cas ont été abordés dans cette thèse. Tout d'abord nous avons évalué l'utilisation d'enzymes alternatives à Cas9, en particulier pour leur capacité à réaliser des mutations multiples. Nous avons testé l'enzyme Cas12a, reconnaissant un PAM différent de Cas9 et générant un site de coupure cohésif, ainsi que l'enzyme CAS9-NG, reconnaissant un PAM plus réduit que Cas9. Nous avons obtenu des résultats très intéressants puisque nous avons réussi à induire jusqu'à 16 mutations simultanément dans la même plante, ce qui est particulièrement encourageant quant à l'utilisation future de cet outil dans des programmes de sélection variétale. Dans un second axe, nous avons cherché à réaliser l'insertion ciblée de cassettes porteuses de codons stop afin de provoquer des extinctions de gènes plus précises que celles réalisées actuellement. Les résultats préliminaires obtenus par expression transitoire et analysés par PCR emboitée ont montré que de nombreux évènements d'insertion ciblée peuvent être mis en évidence, que les évènements indésirables de dégradation se déroulent préférentiellement aux extrémités de la cassette par rapport aux extrémités de l'ADN génomique générées par la coupure CRISPR-Cas, ainsi qu'une asymétrie dans l'occurrence des évènements stochastiques d'insertion d'ADN aux extrémités de la cassette. Nous n'avons par contre pas réussi à régénérer de plante présentant une insertion stable, ce qui implique qu'une amélioration conjointe des efficacités de transformation et d'intégration devra être réalisée pour atteindre cet objectif. Les résultats obtenus on fait l'objet d'une demande de dépôt de brevet par le partenaire industriel, et une publication a été rédigée pour une soumission postérieure à l'éventuelle acceptation du brevet. Le troisième axe de notre thèse avait une vocation applicative des outils développés dans les deux premiers axes sur la thématique de résistance aux maladies. En effet, la transition agroécologique induisant une réduction drastique des pesticides de synthèse, un effort tout particulier doit être réalisé pour mettre en place un contrôle génétique des maladies, ce qui sous-entend des efforts importants de recherche pour comprendre les interactions plantes-pathogènes. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés, en collaboration avec le laboratoire MDC du GDEC, à 20 gènes candidats de sensibilité du blé à la fusariose de l'épi. Les résultats obtenus montrent qu'il est possible d'éteindre trois gènes simultanément, ce qui était jusqu'à présent impossible par les techniques de mutagénèse classique. La plante résultante sera phénotypée pour son profil de résistance au pathogène. Pris dans leur ensemble, les résultats de la thèse montrent que le système CRISPR est capable d'atteindre un grand nombre de locus simultanément chez le blé tendre, et qu'une insertion ciblée d'un petit fragment d'ADN est possible mais avec une fréquence très faible à l'état stable dans l'état actuel des technologies. Ces résultats ont pu trouver ne première application pour résoudre le problème du phénotypage des QTL à effets faibles. Ils montrent la nécessité de maitriser et de développer ces nouvelles technologies pour répondre à des questions de recherche. Ces résultats sont également une avancée vers l'utilisation des techniques d'édition pour appuyer la sélection variétale, par exemple en supprimant des gènes de sensibilité préalablement identifiés dans des variétés élite. Les implications dans les programmes de sélection ainsi que les éventualités de développement en fonction des orientations règlementaires de l'Union Européenne sont discutées
A major challenge for agriculture will be its capacity to feed the world in the 21st century in the face of climate change and population growth, while meeting the need for agro-ecological transition. Bread wheat (Triticum aestivum) will be a key issue, and biotechnologies a key tool to be mobilised. Three lines of research involving the CRISPR-Cas tool were addressed in this PhD. First, we evaluated the use of alternative enzymes to Cas9, in particular for their ability to perform multiple mutations simultaneously. We tested the Cas12a enzyme, recognising a different PAM from Cas9 and generating a cohesive cleavage site, as well as the CAS9-NG enzyme, recognising a shorter PAM than Cas9. We obtained very interesting results since we were able to induce up to 16 mutations simultaneously in the same plant, which is particularly encouraging for the future use of this tool in varietal selection programmes. Secondly, we sought to carry out targeted insertion of stop codon cassettes in order to induce more precise gene silencing than is currently possible. Preliminary results obtained by transient expression and analysed by nested PCR have shown that numerous targeted insertion events can be demonstrated, that undesirable degradation events occur preferentially at the ends of the cassette compared to the ends of the genomic DNA generated by the CRISPR-Cas cut, as well as an asymmetry in the occurrence of stochastic DNA insertion events at the ends of the cassette. However, we did not succeed in regenerating a plant with a stable insertion, which implies that a joint improvement of transformation and integration efficiencies will have to be achieved to reach this goal. The results obtained have been the subject of a patent application by the industrial partner, and a publication has been written for submission after the eventual acceptance of the patent. The third axis of our thesis had an applicative vocation of the tools developed in the first two axes on the theme of disease resistance. Indeed, as the agro-ecological transition induces a drastic reduction of synthetic pesticides, a special effort must be made to improve genetic control of diseases, which implies major research efforts to understand plant-pathogen interactions. In this context, in collaboration with the MDC laboratory of the GDEC, we focused on 20 candidate genes for Fusarium head blight (FHB) susceptibility in wheat. The results obtained show that it is possible to extinguish three genes simultaneously, which was previously impossible using conventional mutagenesis techniques. The resulting plant will be phenotyped for its pathogen resistance profile. Taken together, the results of the thesis show that the CRISPR systems are capable of reaching a large number of loci simultaneously in common wheat, and that a targeted insertion of a small DNA fragment is possible but with a very low frequency in stable transformation in the current state of the technology. These results could be applied for the first time to solve the problem of phenotyping QTLs associated with weak effects. They show the need to master and develop these new technologies to answer research questions. These results are also a step towards using editing techniques to support varietal selection, for example by deleting previously identified susceptibility genes in elite varieties. Implications for breeding programmes and possible developments in the light of EU regulatory guidelines are discussed

Cette thèse porte sur Les Fêtes de l’Hymen et de l’Amour, ballet héroïque de Jean-Philippe Rameau sur un livret de Louis de Cahusac, créé le 15 mars 1747 à Versailles à l’occasion du second mariage du Dauphin. L’étude se consacre à l’histoire de l’œuvre, explorant ainsi ses diverses représentations, ses remaniements successifs en passant par le rayonnement de l’opéra sur le spectacle lyrique de l’époque. Elle s’intéresse également à la figure de Louis de Cahusac, à ses théories sur l’opéra et le ballet, aux sources d’inspirations de son livret puisant dans l’égyptologie et la franc-maçonnerie. Elle aborde par ailleurs le traitement musical du compositeur. Pour finir, cette étude propose une édition du livret et de la partition accompagnée d’un apparat critique et du catalogue des sources de l’opéra
This thesis focuses on Les Fêtes de l’Hymen et de l’Amour, an heroic ballet written by Jean-Philippe Rameau with a libretto by Louis de Cahusac, created on March 15th, 1747 in Versailles for the Dauphin’s second wedding. The study is about the history of the piece, exploring its various representations, its successive changes and the influence of this opera on the lyric show of the xviiith century. It is also interested in the figure of Louis de Cahusac, his theories on opera and ballet, the inspirations of his libretto drawing Egyptology and Freemasonry. It also addresses the composer’s musical treatment. Lastly, this study offers an edition of the libretto and the score accompanied by a critical apparatus and a catalog’s sources of the opera

Support, à l'origine, d'une genèse à la fois textuelle et intellectuelle, lieu mémoriel par excellence, le carnet développe aussi, grâce aux conditions d'écriture spécifiques qu'il favorise, une poétique de l'attention et du regard dont découlent directement écriture de l' « incident » (Barthes) et saisies de l'instant. La discontinuité formelle qu'elles engendrent, en évinçant l'écriture du Moi au profit de l'écriture du Monde, semblent, d'autre part, encourager une poétique de l'anti-journal – perceptible autant d'un point de vue métatextuel que formel. Dans le carnet, de surcroît, se déploient des etha spécifiques et complexes, fondés sur une dialectique subtile entre le « dedans » et le « dehors ». Enfin, la question de la mise en livre du carnet doit être interrogée, sous l'angle de sa publication autant que sa réception : quel protocole éditorial privilégier ? Quel lecteur pour le carnet d'écrivain ?
Originally a medium of genesis, both textual and intellectual, an archetypal memory space, the notebook also develops, thanks to the specific writing conditions it favorises, the poetics of attention and regard from which « incident » (Barthes) style and seizure of the moment style emanate directly. The formal discontinuity that these styles create, World writing rather than writings of Self, seems, on the other hand, to encourage the poetics of the anti-journal – perceptible from both the metatextual and formal points of view. Moreover, in the notebook, specific and complex etha unfold, based upon subtle dialectics situated between the « in » and the « out ». Finally, the question of transforming a notebook into a book has to be asked, from the angle of publication as well as in it's reception : which editorial protocol should be priviledged ? What type of reader for a writer's notebook ?

"L'utilisation des croisements pour la sélection d'animaux d'élevage a permis depuis le début de la domestication d'utiliser au mieux la variabilité génétique pour obtenir des phénotypes toujours plus adaptés à nos attentes : on veut produire plus, c'est-à-dire sélectionner des animaux qui naissent facilement (taux de fertilité, facilité de reproduction), grandissent vite, et produisent en quantité (masse musculaire, production laitière, nombre d'œufs. . . ). Mais on veut aussi produire mieux et ainsi sélectionner des animaux non agressifs et non stressés, qui supportent les changements de conditions environnementales, et dont l'élevage est le moins dommageable possible pour l'environnement. Le plus fréquemment, de nombreux gènes sont impliqués dans la variabilité d'un phénotype. Un des enjeux est d'identifier les facteurs causaux de la variabilité génétique, si possible en allant jusqu'à la compréhension des mécanismes sous-jacents, car l'application des connaissances fondamentales est un levier pour optimiser la production. L'avancée des connaissances permet de définir certains dogmes, qui constituent le socle de nos "croyances scientifiques". On sait par exemple que chez un organisme diploïde, dans des conditions classiques d'expression, les transcrits paternels et maternels reproduisent fidèlement les parties codantes des ADN parentaux dont ils sont issus, en particulier les variants génétiques. Or deux exceptions vont à l'encontre de cette règle de transmission de la variabilité génétique : l'empreinte génomique parentale et l'édition de l'ARN. L'empreinte parentale est un mécanisme épigénétique ayant pour conséquence l'expression de certains gènes selon l'origine parentale de l'allèle, dont l'existence chez les Oiseaux fait l'objet d'un débat dans la littérature. L'édition de l'ARN correspond à des modifications post-transcriptionnelles sur le brin d'ARN sans modification de la séquence d'ADN dont il est transcrit. Cette thèse participe à la caractérisation de ces phénomènes qui interviennent de manière singulière dans le fonctionnement du génome chez la Poule, à l'aide de données issues de séquençage haut débit. Deux lignées de poulet les plus consanguines et les plus distantes génétiquement possible ont été choisies pour pouvoir détecter un grand nombre de polymorphismes chez les animaux issus de leur croisement et remonter à l'origine parentale des allèles observés. Deux croisements réciproques ont été effectués entre ces lignées et le transcriptome ainsi que le génome des embryons générés ont été séquencés. L'analyse de ces séquences, qui constitue l'essentiel de ce travail de thèse, a permis de répondre par la négative à la question de l'existence d'empreinte parentale chez les Oiseaux, au moins chez l'embryon entier de Poule de 4,5 jours. Ces résultats constituent la première approche tout génome pour la recherche d'empreinte chez la Poule. Cette thèse a également permis de caractériser le phénomène d'édition de l'ARN à l'échelle du génome dans cette espèce. Les résultats montrent que cet évènement est peu fréquent en comparaison avec les Primates, même si il est intéressant de noter que certains sites sont conservés. De plus, ces données démontrent que la grande majorité des modifications dues à l'édition sont des substitutions canoniques, à savoir principalement A-vers-G. Les analyses nous permettent également de confirmer le caractère tissu et stade spécifique de ce phénomène. "
Since the beginning of domestication crosses have been used in farm animal selection in order to use genetic variability at its best to obtain phenotypes better adapted to our expectations. The main goal is to produce more, ie select animals with good reproduction capacities, growing fast and with good production performances (muscle mass, milk production, egg production. . . ). But another objective is to raise non aggressive and unstressed animals, handling environmental conditions changes without damaging the environment. Most frequently, numerous genes are implicated in phenotypic variability. One big issue is to identify factors causing genetic variability and when possible, to understand the underlying mechanisms, their application being a possible lever to optimize production. Accumulating knowledge on a subject allows defining dogmas, which constitute the bases of our "scientific beliefs". For example, it is known that in a diploid organism, in classical expression conditions, both paternal and maternal transcripts faithfully reproduce coding parts of parental DNA from which they come, in particular concerning genetic variants. However, two exceptions do exist for this rule: parental genomic imprinting and RNA editing. Genomic imprinting is an epigenetic phenomenon leading to a parent-of-origin dependent expression of some genes and the existence of such event in Birds is undergoing a strong debate in literature. RNA editing corresponds to post-transcriptional modifications on RNA without modification of DNA sequence from which it is transcribed. This thesis participates in characterizing these singular phenomena taking part in genome functioning in Chicken, through high-throughput sequencing data analyses. Two chicken lines as inbred and genetically distant as possible were chosen in order to detect numerous polymorphisms and to identify the parental origin of the allele in offspring resulting from their cross. Two reciprocal crosses were made between these lines; genome and transcripts from generated embryos were then sequenced. The analysis of these sequences, which constitutes the major part of this work, allowed us to conclude to the absence of genomic imprinting in Birds, at least in whole embryo at 4. 5 days. These results constitute the first transcriptome-wide approach to seek for genomic imprinting in Chicken. This thesis was also the occasion to characterize RNA editing at genome scale in this species. Results tend to prove that this event is not frequent in comparison to Primates, even if, notably, some edited sites are conserved. Moreover, most modifications correspond to canonical A-to-G substitutions. Finally, we confirm the tissue and stage specificity of this phenomenon

La thérapie génique est une stratégie thérapeutique prometteuse pour le traitement des maladies monogéniques. Si les premières approches, dites additives, ont reposées sur l’utilisation de vecteurs viraux, une part grandissante se tourne désormais vers l’édition génique. Celle-ci est permise par la mise au point de nouvelles générations d’endonucléases, et en particulier le système CRISPR-Cas9. Moins d’une décennie après sa caractérisation, le système CRISPR-Cas9 a permis de faire passer l’édition génique à un stade clinique. Toutefois, dans le même laps de temps, plusieurs interrogations ont été soulevées vis-à-vis de la génotoxicité pouvant être induite par la Cas9. Une littérature émergente pointe le risque de génotoxicité au site ciblé. Le travail de thèse présentée ici s’inscrit dans cette thématique. La première partie de l’étude a eu pour objectif de décrire la génotoxicité induite par une unique cassure double-brin faite par la Cas9. La caractérisation des effets a été faite à la fois à l’échelle nucléotidique, par le suivi de la balance HDR / InDels, mais également à l’échelle du chromosome. Le suivi de l’intégrité chromosomique a permis de mettre en lumière un nouveau risque de génotoxicité encore non-caractérisé. Un système de détection sensible et spécifique de ce risque a été mis au point pour continuer de le caractériser. Le second objectif a été de répondre aux limites soulevées par la génotoxicité non-voulus, en mettant au point une méthode d’édition génique plus sûre et aussi efficace, via l’utilisation d’une unique cassure simple-brin par la Cas9D10A -nickase
Gene therapy is a promising therapeutic strategy for the monogenic diseases treatment. If the first approaches, called additive, have relied on the use of viral vectors, a growing share is now turning to gene editing. Less than a decade after its characterization, the CRISPR-Cas9 system has moved gene editing to a clinical stage. However, in the same period of time, several questions have been raised regarding the genotoxicity that can be induced by Cas9. An emerging literature points to the risk of genotoxicity at the targeted site. The thesis work presented here is part of this theme. The first part of the study aimed to describe the genotoxicity induced by a single double-stranded break made by Cas9. Characterization of the effects was done both at the nucleotide level, by monitoring the HDR / InDels balance, but also at the chromosome scale. The monitoring of chromosomal integrity has brought to light a new risk of genotoxicity that was not characterized. A sensitive and specific detection system for this risk has been developed to further characterize it. The second objective was to address the limitations of unwanted genotoxicity by developing a safer and more efficient gene editing method through the use of a single single-stranded breakage by Cas9D10A-nickase

Le Temple de la Gloire fut commandé par la cour à Voltaire et à Rameau pour célébrer le retour du roi, victorieux à Fontenoy. Créé en 1745 à Versailles, il fut repris aussitôt à Paris en décembre. Retiré après son échec public et critique, il fut considérablement remanié, recréé à Paris en avril 1746, puis oublié, même si beaucoup de ses morceaux ont été réutilisés. Il demeure l’unique opéra de Voltaire a avoir été représenté à l’Académie royale de musique. Ce travail propose une double édition critique du livret et de la musique des deux versions de 1745 et de 1746. Il fait l’histoire de l’oeuvre de 1745 à nos jours (I), en retrace la genèse (II), et en évalue la portée esthétique (III), qui est originale. Voltaire, loin de flagorner, y érige en modèle non le roi conquérant, mais celui qui fait le bonheur du peuple. Il se propose pour cela, en 1745, d’étendre sa réforme dramatique (moins d’amour, plus de spectacle, sérieux métastasien) à l’opéra. Mais finit, en 1746, par céder à Rameau, aux codes de l’Académie royale de musique et à son public
The court commissioned Voltaire and Rameau to write Le Temple de la Gloire in celebration of the king’s victorious return from Fontenoy. Premiered in Versailles in 1745, restaged in Paris in December, the opera closed down after its critical and box-office failure. It was considerably reworked, restaged in Paris in April 1746, and then forgotten, although many of its pieces were reused in other works. It is the only Voltaire opera staged at the Royal Academy of Music. This study consists of a double critical edition of the libretto and music of the two versions, from 1745 and 1746. It traces the history of the work from 1745 to the present day (Chapter 1), discusses it genetically (Chapter 2), and analyzes its esthetic reach (Chapter 3), which is considerable. Voltaire is not a courtly flatterer here ; he does not present a model of the conquering king, but rather one of a king who makes the people happy. Thus, in 1745, Voltaire extends his dramatic reforms to opera (less love, more entertainment, Metastasian gravitas). But in the end, in 1746, he gives into Rameau, to the Royal Academy of music’s protocol, and to his audience

Candida glabrata est une levure pathogène opportuniste, apparaissant aujourd’hui comme la deuxième cause de candidémie en Europe et en Amérique du Nord. Cette levure présente de nombreuses particularités génomiques telles que la présence de nouveaux domaines structuraux au sein d’ARN non-codants ubiquitaires. Le premier aspect de cette thèse a consisté en l’étude de la sous-unité ARN atypique de la Ribonucléase P nucléaire de C. glabrata. Cet ARN contient trois grand domaines additionnels octroyant au transcrit une taille trois fois plus élevée que la moyenne des sous-unités ARN des RNase P eucaryotiques. Les expériences réalisées ont permis une meilleure compréhension du rôle de ces domaines additionnels et ont démontré la présence inédite de la protéine Rcl1 au sein du complexe de la RNase P. Dans un second temps ce travail de thèse a aussi contribué à l’amélioration des outils d’édition du génome de C. glabrata existants. De nouvelles cassettes intégratives de faible taille et positivement sélectionnables ont été mises au point. Ces éléments présentent toutes les caractéristiques permettant leur utilisation dans la modification du génome de souches sauvages et d’isolats cliniques de C. glabrata
Candida glabrata is an opportunistic pathogenic yeast, and is today the second causative agent of candidemia in Europe and North America. This yeast has many genomic peculiarities such as the presence of new structural domains within ubiquitous non-coding RNAs. The first aspect of this thesis was the study of the atypical RNA subunit of the nuclear Ribonuclease P of C. glabrata. This RNA contains three large additional domains giving the transcript an overall size more than three times larger than the average eukaryotic RNase P RNA subunits. The experiments performed led to a better understanding of the role of these additional domains and demonstrated for the first time the presence of the Rcl1 protein within the RNase P complex. Secondly, this thesis work also contributed to the improvement of existing genome editing tools in C. glabrata. New small and positively selectable integrative cassettes have been developed. These elements exhibited all the required characteristics for their use in wild-type strains and clinical isolates of C. glabrata

L’édition des ARN est une exception à la règle de la biologie moléculaire qui stipule que l’information codée par le gène se trouve fidèlement transmise à la protéine. Dans les mitochondries de plante, elle procède par conversion de centaines de cytosines en uraciles par désamination, principalement dans les ARNm. Afin de comprendre le mode de reconnaissance des cytosines par la machinerie d’édition nous avons systématiquement vérifié l’importance des nucléotides -1 et +1 entourant la cytosine cible dans l’édition des transcrits cox2 de blé. Sur cette base, les sites d'édition peuvent être classés en quatre familles: (a) dépendance du résidu +1, (b) dépendance du résidu -1, (c) dépendance des deux résidus et (d) indépendance. Nous avons d’autre part mis en évidence des effets à distance sur le taux de la réaction d’édition, montrant ainsi que certains sites ne sont pas autonomes pour la réaction. L'ensemble des observations nous révèle que le devenir des transcrits a une influence sur l'efficacité de l’édition. Pour le vérifier nous avons construit des gènes cox2 et rps10 dépourvus d'introns. L’efficacité d’édition des transcrits qui ne sont pas soumis à l'épissage est grandement réduite par rapport aux transcrits sauvages, ce qui renforce l’idée que les mécanismes de maturation doivent être interconnectés dans les mitochondries de plante. D’autre part, nous avons montré que l’édition de certains sites introniques pouvait être indispensable à la maturation des transcrits en rétablissant des structures nécessaires à l’épissage. L’exploration de la mécanistique de l’épissage des introns mitochondriaux nous a conduit à mettre au point un test de trans-épissage in organello. Ce test doit permettre de valider expérimentalement les hypothèses ayant trait à la reconnaissance des transcrits et de vérifier le rôle de l’édition dans ce mécanisme. Enfin, la mise en relation de l’édition avec d’autres phénomènes physiologiques touchant les organelles, comme la stérilité mâle cytoplasmique, nous a permis de développer une hypothèse permettant d’expliquer l’émergence et le maintien au cours de l’évolution de ce phénomène chez les plantes. Nous proposons que le conflit nucléo-cytoplasmique a constitué l’élément moteur pour l’apparition de l’édition en permettant l’installation de mutations T en C au niveau de la mitochondrie. La réponse nucléaire a été la correction de ces mutations sur l’ARN mitochondrial, aboutissant à ce que nous appelons aujourd'hui l’édition des ARN
RNA editing is an exception to the central dogma of molecular biology which states that the information encoded by the gene is faithfully transmitted to the protein. The plant mitochondrial transcriptome undergoes hundreds of specific C-to-U changes by RNA editing, mainly in mRNAs. To understand the mechanism used by the plant to select the C targets on the transcript, we studied the role of the neighbors -1 and +1 nucleotides in wheat cox2 editing sites. Under this scheme, four different recognition patterns can be distinguished: (a) +1 dependency (b) -1 dependency (c) +1/-1 dependency and (d) no dependency on nearest neighbor residues. An important observation was that distal elements can influence the editing efficiency, indicating that some sites are not autonomous for the reaction. We propose that these results could be a consequence of the fate of transcripts during the different maturation steps. To test this hypothesis, we constructed intronless cox2 and rps10 genes. RNA editing was strongly reduced in these constructs, suggesting that efficient RNA processing may require a close interaction of factors engaged in different maturation processes. Our results on editing events in non coding region, particularly in introns, indicate that editing is essential for splicing by remodeling the secondary structure required to excise the intron. To gain insight into the splicing mechanism for scattered mitochondrial genes, we have settled an in organello trans-splicing assay. By this way, it should be possible to decipher the molecular determinants of the reaction and the eventual role of RNA editing in this process. Finally, we proposed a new hypothesis explaining the origin and evolution of RNA editing in plant mitochondria. We assume that the nucleo-cytoplasmic conflict was the driving force allowing the settlement of T-to-C mutations in the mitochondrial genome. The nuclear response was the correction of these mutations on the RNA, i.e. RNA editing

El maquiavelismo degollado est un défi lancé à tous les hommes de pouvoir tentés de suivre la voie pragmatique de Machiavel plutôt que celle tracée par l’Église catholique romaine ; son auteur, Claude Clément, fut alors considéré comme le plus radical des penseurs de l’anti-machiavélisme. Son œuvre n’a pourtant jamais été rééditée et reste mal connue probablement parce qu’elle est composée de trois textes publiés dans deux langues différentes et que sa version espagnole semble bien être une réécriture plutôt qu’une simple traduction. Parsemée de reproductions de documents, enrichie de nombreuses allusions, de citations parfois cachées, l’œuvre de Claude Clément se veut un recueil de la pensée politique de son temps. À l’aide de bases de données numériques, ce travail se donne pour objectif d’établir le texte du Maquiavelismo degollado dans sa diversité, d’expliquer les grands mécanismes de son évolution et de comprendre sa position dans le réseau des sources qui l’influencent
El maquiavelismo degollado sounds as a challenge to all statesmen who could be tempted to follow the pragmatic way shown by Machiavelli rather than by the Roman Catholic Church. Then, Claude Clément was considered as a champion of the radical line in the anti-Machiavellian school of thought; however, the book has never been republished and, therefor, is not very well known. El maquiavelismo degollado is not a unique work knowing that three different books have been published, using two different languages and that the Spanish version really seems to be a re-written text rather than a simple translation. Scattered with reproductions of foreign documents, enriched with many allusions, quotations, some of them hidden away, this work seems to be a miscellany of political theories of its time. Using digital databases, this study attempts first to establish the text of El maquiavelismo degollado respecting its complexity, then to explain the main mechanism of its evolution from one version to the other and finally to determine how other works could have influenced it

La découverte de nouveaux procédés biotechnologiques remet en question la capacité de la loi de fournir une protection suffisante de l'être humain dès le commencement de sa vie. Ces nouvelles méthodes, comme la méthode CRISPR/Cas9, également connue sous le nom de « genome editing », le don de mitochondries et, finalement, la création de cellules souches pluripotentes induites humaines (cellules hiPS) permettent de manipuler et d'influencer de manière fondamentale la constitution génétique de la progéniture et des générations futures. En vue de ces développements, cette thèse vise à élaborer un projet de loi adressé au législateur allemand en prenant compte de deux aspects : d'un côté, sur la base d'une analyse comparative du droit allemand et français, il s'agit d'optimiser la législation allemande actuelle en identifiant des avantages éventuels de l'approche réglementaire en France. De l'autre côté, en admettant que les techniques en question pourront être appliquées un jour avec des risques gérables, il est examiné sur la base d'une étude de droit constitutionnel allemand si une telle application future pourrait en principe être justifiée, le résultat de cette étude étant également concrétisé sous forme d'une proposition de loi
The discovery of new biotechnological processes calls into question the ability of the law to provide sufficient protection for human beings from the beginning of their lite. These new methods, such as the CRISPR/Cas9 method -also known as "genome editing" -mitochondrial donation, and the creation of human induced pluripotent stem cells (hiPS cells), make it possible to manipulate and influence in a fundamental way the genetic make-up of one's offspring and future generations. This thesis aims to prepare a draft law addressed to the German legislature. ln so doing, it takes into account two aspects : on the one hand, it aims to optimise, on the basis of a comparative analysis of German and French law, current German legislation by identifying possible advantages of the regulatory approach in France. On the other hand – assuming that the techniques in question can one day be applied with controllable risks – it examines, on the basis of an analysis of German constitutional law, whether such a future application could, in principle, be justified and implements these considerations by drafting a legislative proposal

Bien que l’écrivain Horácio Bento de Gouveia n’ait jamais théorisé ce concept, ce qui impressionne le plus dans son oeuvre est, en effet, la tentative de décrire et de définir l’ « insularité de Madère », par le biais d’une pratique discursive et d’un choix de thèmes qui indiquent cette notion. Outre que le premier roman de l’auteur soit, probablement, le plus illustratif de ce que nous venons d’énoncer, notre choix se doit au fait qu’il constitue un sujet fécond – grâce au matériel existant autour de lui et le potentiel littéraire et linguistique qu’il insère -, avec une incidence spéciale, en ce qui concerne sa variation, son histoire éditoriale. Faire l’histoire du récit, une étude de ses transformations, aussi bien intratextuelles qu’intertextuelles ou encore intersémiotiques, représente ce que nous avons pensé mener à terme, nous basant sur un projet d’édition critique du roman pour, ensuite, le traduire partiellement en français. Dans le fond, ce qui nous a importé a été de réfléchir, basé sur l’étude du corpus établi et sur la pratique de la traduction, sur la question de la réécriture, de la reformulation littéraire et de la transcodification vers d’autres langages artistiques. De ce travail a surgi un essai, dans lequel nous avons détaché les fondements pour une théorie de la réécriture, de la reformulation du mode narratif en accord avec la nouvelle motivation sous-jacente au projet défini et avec le support de médiation adopté
The work of Horácio Bento de Gouveia is a cornerstone in the process of the statement of a Maderian identity and a segment of Portuguese Literature yet to be fully explored. His first novel was chosen because of its fruitful subject. It was initially entitled Ilhéus (1949, 1960) and later, after significant remodelling, called Canga (1975). In truth, besides its literary and linguistic potential which is revealing of Bento de Gouveia’s poetics, there is some rather interesting material surrounding this novel in what relates to its textual variation, its editorial history and its transversality into other artistic domains. Based on the established corpus, on the fixation and interpretation of the text of the novel and on the translation, the guideline of this research was set on the reflections about the problematics of rewriting, of literary reformulation and of transcodification into other artistic language. This work resulted in an essay where the basis for a rewriting theory was emphasized. The reformulation of the narrative mode stems, on the other hand, from the demands of the adopted medium. In volume 2, the first part entitled “Projectos” includes the proposal of a critical-genetic edition of Ilhéus I Canga, with an introduction, annotations to the novel and a glossary, a French translation of the first part of the novel and some material pertaining to the adaptations. The second part, which is entitled “Dossier”, includes a chronological synopsis of the life and works of Bento de Gouveia and various documents such as the chronicles blended into the novel, the correspondence from the editor to the author, newspaper clippings about the colonia issue and photographs

Les furocoumarines sont des composés phénoliques impliqués dans la défense contre les herbivores. Ces molécules sont majoritairement décrites dans quatre familles botaniques, notamment les Rutaceae, dont font partie les agrumes. Ces molécules sont phototoxiques ce qui peut poser des problèmes pour leur utilisation comme par exemple en cosmétique ou en phytothérapie. D’autre part, en cas d’ingestion par exemple via la consommation de jus de certains agrumes, elles ont responsables de l’inhibition d’enzymes de détoxication comme le CYP3A4 humain. Cela peut conduire à des surdosages médicamenteux connus sous le nom d’Effet Pomelo. Ce travail de thèse a consisté à réfléchir et à développer, des outils qui permettront de générer de manière ciblée des variétés de pomelo qui ne produisent plus de furocoumarines. Nous avons abordé l’ensemble des étapes essentielles pour la mise en place d’une stratégie global : i) des méthodes reproductibles ont été développées pour la production de protoplastes et de cultures cellulaires de pomelo Star Ruby ; ii) des conditions de transformation de protoplastes par électroporation ont également été mises au point ; iii) finalement, pour inhiber de manière spécifique la voie de biosynthèse des furocoumarines, nous avons choisi de mettre en œuvre une approche d’édition de génome en utilisant une méthodologie CRISPR/Cas9. La mise au point de la méthode a été réalisée avec un gène codant pour une umbelliferone 6-dimethylallyl transférase. Les résultats obtenus indiquent que la stratégie est envisageable. Pour renforcer la stratégie CRISPR/Cas9, nous avons mis en œuvre une démarche d’identification de gènes cibles additionnels. En utilisant une approche de data mining de bases de données génomiques et transcriptomiques nous avons identifié 18 séquences candidates, potentiellement impliquées dans la voie de biosynthèse des furocoumarines. L’expression hétérologue des protéines correspondantes et leur caractérisation fonctionnelle a permis de montrer que CYP706J12 est en mesure de métaboliser l’hérniarine, une coumarine. Ce résultat apporte des éléments pour émettre des hypothèses sur l’évolution convergente de la synthèse des coumarines et des furocoumarines chez les végétaux supérieurs
Furanocoumarins are phenolic compounds involved in defense against herbivores. These molecules are mainly described in four botanical families. Rutaceae, one of those families, includes Citrus species. Furanocoumarins are phototoxic compounds, which can be problematic for their use in cosmetics or in phytotherapy. Furanocoumarin ingestion via citrus juice consumption, may inhibit human enzymes of detoxification, such as human CYP3A4. This can lead to drug overdoses known as the “Grapefruit Juice Effect”. This work consisted in the development of tools that will allow to generate new varieties of pomelo that no longer produce furanocoumarins by targeted genome edition. We have covered the essential steps for the implementation of a global strategy: i) reproducible methods have been developed for the production of protoplasts and cell cultures of Star Ruby grapefruit; ii) conditions for protoplast transformation by electroporation have also been developed; iii) finally, to specifically inhibit the furanocoumarin biosynthetic pathway, we chose to implement a genome editing approach using a CRISPR / Cas9 methodology. The development of the method was carried out with a gene encoding umbelliferon 6-dimethylallyltransferase. The results obtained indicate that the strategy is feasible. To strengthen the CRISPR / Cas9 strategy, we implemented a method to identify additional target genes. Using a data mining approach of available genomic and transcriptomic databases we identified 18 candidate sequences potentially involved in the furanocoumarin biosynthetic pathway. Heterologous expression of the corresponding proteins and their functional characterization made it possible to show that CYP706J12 is able to metabolize herniarin (a coumarin). This result provides elements to hypothesize about the convergent evolution of coumarin and furanocoumarin synthesis in higher plants

L’amélioration génétique du blé tendre (Triticum aestivum L.), une des trois céréales les plus cultivées, représente un intérêt stratégique pour la sécurité alimentaire de la population mondiale. Cette amélioration génétique va nécessiter une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et physiologiques mis en jeu, et va aussi réclamer une efficacité accrue dans notre capacité à intervenir finement sur le génome. Les avancées majeures réalisées dans le domaine des biotechnologies ces dernières années permettent d’envisager de nouveaux champs d’action pour appréhender le fonctionnement des caractères d’intérêt agronomique du blé tendre, ainsi que pour son amélioration génétique, et fournissent également de nouveaux outils pour innover dans le domaine de l’édition des génomes. Nous avons cherché dans le cadre de cette thèse à développer des innovations chez blé tendre à partir de trois nouveaux outils issus des biotechnologies. Nous avons tout d’abord montré que l’extinction du gène pds par une stratégie de micro ARN artificiel à partir d’un micro ARN de riz permettait d’obtenir le phénotype attendu, et que l’expression du micro ARN artificiel était reliée à ce phénotype. Nous avons commencé à explorer la possibilité d’utiliser des microARN de blé pour réaliser la même extinction, sans résultat pour l’instant. Nous avons ensuite montré que des coupures spécifiques d’une séquence donnée peuvent être obtenues in vivo chez le blé tendre à l’aide d’une méganucléase, et que lorsque les sites de coupure encadrent une séquence donnée, une délétion du fragment encadré peut être obtenue. Nous avons enfin réalisé les premiers essais du système CRISPR-Cas9 au laboratoire et généré une lignée exprimant le transgène Cas9 de façon constitutive. Des résultats inattendus obtenus dans le cadre de ces expérimentations nous ont de plus permis d’améliorer le procédé de transformation génétique du blé tendre utilisé au laboratoire. Les applications de nos résultats pourront être utilisées pour des expérimentations de validation de gènes et de compréhension des mécanismes moléculaires associés, mais aussi à l’avenir pour intervenir directement et de plus en plus finement sur le génome du blé. Les choix stratégiques en termes de développement technologique et d’innovation dans le domaine des biotechnologies et dans le cadre des objectifs d’un laboratoire public sont discutés
The genetic improvement of common wheat (Triticum aestivum L.), one of the three most cultivated cereals, is of strategic interest to the food security of the world's population. This genetic improvement will require a better understanding of the molecular and physiological mechanisms involved, and will also require increased efficiency in our ability to modify finely the genome. In recent years, the major advances in biotechnology have made it possible to envisage new fields of action for a deeply understanding of agronomic traits of wheat as well as for genetic improvement, and also provide new tools for innovate in the field of genome editing. In this PhD manuscript, we sought to develop innovations for wheat improvement using three new biotechnology tools. We first demonstrated that the extinction of the pds gene by a strategy of artificial micro RNA succeeded in the obtaining of the expected phenotype and that the expression of the artificial RNA was related to this phenotype. We have begun to explore the possibility of using wheat microRNAs to achieve the same extinction, with no results at this time. We have then shown that specific cuts of a given sequence can be obtained in vivo in wheat using a meganuclease, and that when the cleavage sites frame a given sequence a deletion of the framed fragment may be obtained. We finally carried out the first tests of the CRISPR-Cas9 system in the laboratory and generated a line expressing the Cas9 transgene constitutively. Unexpected results obtained during these experiments have also made it possible to improve the process of genetic transformation of soft wheat used in the laboratory. The applications of our results can be used for gene validation experiments and a better understanding of the molecular mechanisms involved, but also in the future for wheat genome editing. Strategic choices in terms of technological development and innovation in the field of biotechnology and within the framework of the objectives of a public laboratory are discussed

Les furocoumarines sont des composés phénoliques impliqués dans la défense contre les herbivores. Ces molécules sont majoritairement décrites dans quatre familles botaniques, notamment les Rutaceae, dont font partie les agrumes. Ces molécules sont phototoxiques ce qui peut poser des problèmes pour leur utilisation comme par exemple en cosmétique ou en phytothérapie. D’autre part, en cas d’ingestion par exemple via la consommation de jus de certains agrumes, elles ont responsables de l’inhibition d’enzymes de détoxication comme le CYP3A4 humain. Cela peut conduire à des surdosages médicamenteux connus sous le nom d’Effet Pomelo. Ce travail de thèse a consisté à réfléchir et à développer, des outils qui permettront de générer de manière ciblée des variétés de pomelo qui ne produisent plus de furocoumarines. Nous avons abordé l’ensemble des étapes essentielles pour la mise en place d’une stratégie global : i) des méthodes reproductibles ont été développées pour la production de protoplastes et de cultures cellulaires de pomelo Star Ruby ; ii) des conditions de transformation de protoplastes par électroporation ont également été mises au point ; iii) finalement, pour inhiber de manière spécifique la voie de biosynthèse des furocoumarines, nous avons choisi de mettre en œuvre une approche d’édition de génome en utilisant une méthodologie CRISPR/Cas9. La mise au point de la méthode a été réalisée avec un gène codant pour une umbelliferone 6-dimethylallyl transférase. Les résultats obtenus indiquent que la stratégie est envisageable. Pour renforcer la stratégie CRISPR/Cas9, nous avons mis en œuvre une démarche d’identification de gènes cibles additionnels. En utilisant une approche de data mining de bases de données génomiques et transcriptomiques nous avons identifié 18 séquences candidates, potentiellement impliquées dans la voie de biosynthèse des furocoumarines. L’expression hétérologue des protéines correspondantes et leur caractérisation fonctionnelle a permis de montrer que CYP706J12 est en mesure de métaboliser l’hérniarine, une coumarine. Ce résultat apporte des éléments pour émettre des hypothèses sur l’évolution convergente de la synthèse des coumarines et des furocoumarines chez les végétaux supérieurs
Furanocoumarins are phenolic compounds involved in defense against herbivores. These molecules are mainly described in four botanical families. Rutaceae, one of those families, includes Citrus species. Furanocoumarins are phototoxic compounds, which can be problematic for their use in cosmetics or in phytotherapy. Furanocoumarin ingestion via citrus juice consumption, may inhibit human enzymes of detoxification, such as human CYP3A4. This can lead to drug overdoses known as the “Grapefruit Juice Effect”. This work consisted in the development of tools that will allow to generate new varieties of pomelo that no longer produce furanocoumarins by targeted genome edition. We have covered the essential steps for the implementation of a global strategy: i) reproducible methods have been developed for the production of protoplasts and cell cultures of Star Ruby grapefruit; ii) conditions for protoplast transformation by electroporation have also been developed; iii) finally, to specifically inhibit the furanocoumarin biosynthetic pathway, we chose to implement a genome editing approach using a CRISPR / Cas9 methodology. The development of the method was carried out with a gene encoding umbelliferon 6-dimethylallyltransferase. The results obtained indicate that the strategy is feasible. To strengthen the CRISPR / Cas9 strategy, we implemented a method to identify additional target genes. Using a data mining approach of available genomic and transcriptomic databases we identified 18 candidate sequences potentially involved in the furanocoumarin biosynthetic pathway. Heterologous expression of the corresponding proteins and their functional characterization made it possible to show that CYP706J12 is able to metabolize herniarin (a coumarin). This result provides elements to hypothesize about the convergent evolution of coumarin and furanocoumarin synthesis in higher plants

Les β-hémoglobinopathies (β-thalassémies et drépanocytose) sont des anémies génétiques qui touchent des milliers de nouveaux nés chaque année dans le monde. Ces maladies sont causées par des mutations affectant l'expression de l'hémoglobine chez l'adulte. Le seul traitement disponible est la transfusion sanguine à vie, associée à une chélation du fer. Pour les patients les plus touchés, la greffe de cellule souche hématopoïétique (CSH) demeure le seul traitement curatif. Néanmoins, la transplantation autologue de cellules souches génétiquement corrigées représente une alternative thérapeutique pour les patients dépourvus de donneur compatible. Certaines délétions naturelles comprenant les gènes de la β- et δ- globine dans le locus de l'hémoglobine sont corrélées à une persistance de l'expression de l'hémoglobine fœtale (HPFH) à l'âge adulte. Ainsi il a été démontré que un taux élevé d'hémoglobine fœtale (HbF) améliore l'évolution clinique de ces deux pathologies. Afin d'identifier les régions régulatrices potentielles de la γ-globine, nous avons combiné les données issues d'analyses de mutations rencontrées chez des patients HPFH avec les sites d'hybridation de facteur de transcription. Sur la base de cette analyse, en ayant recours à la technologie CRISPR/CAS9, nous avons développé un protocole permettant de générer: (i) la délétion d'un potentiel suppresseur de l'HbF situé entre les gènes des globines δ et γ, ciblé par le répresseur de l’HbF BCL11A chez les érythroblastes adultes; (ii) la plus courte délétion associée à des taux élevés d’HbF (délétion Corfu) chez les patients β-thalassemiques; (iii) une délétion de 13.6-kb rencontrée fréquemment chez les patients HPFH et incluant les gènes des globines β et δ ainsi que le potentiel suppresseur de l'HbF. Notre travail a montré que la délétion de la région génomique de 13.6-kb entraîne une forte production de HbF et une réduction concomitante de l'expression de la β-globine soit dans des lignées cellulaires érythroïdes humaines soit dans des érythroblastes primaires dérivées des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques (CSPH). Par ailleurs, nous avons montré que la génération de cette délétion sur des CSPHs issus de patients drépanocytaires entraîne une augmentation de la transcription de la γ-globine dans une proportion significative d'érythroblastes, conduisant à une amélioration du phénotype drépanocytaire. Enfin, nous avons exploré le mécanisme menant à la réactivation de l'expression de la γ-globine. Nous avons évalué des changements dans la conformation de la chromatine et des modifications épigénétiques dans le locus de la β-globine lors de la délétion ou de l'inversion de la région de 13.6 kb. Dans l'ensemble, cette étude contribue à la connaissance des mécanismes favorisant l'échange de l'hémoglobine fœtale à l'adulte et fournit des indices pour une approche d'édition du génome dans le traitement de la β-thalassémies et de la drépanocytose
Β-hemoglobinopathies (β-thalassemias and sickle cell disease) are genetic anemias affecting thousands of newborns annually worldwide. β-thalassemias and sickle cell disease (SCD) are caused by mutations affecting the adult hemoglobin expression and are currently treated by red blood cell transfusion and iron chelation regiments. For patients affected by severe β-hemoglobinopathies, allogenic hematopoietic stem cell (HSCs) transplantation is the only definitive therapy. However, transplantation of autologous, genetically corrected HSCs represents an alternative therapy for patients lacking a suitable HSC donor. Naturally occurring large deletions encompassing β- and δ-globin genes in the β-globin gene cluster, defined as Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin (HPFH) traits, lead to increased fetal hemoglobin (HbF) expression ameliorating both thalassemic and SCD clinical phenotypes. In this study, we integrated transcription factor binding site analysis and HPFH genetic data to identify potential HbF silencers in the β-globin locus. Based on this analysis, we designed a CRISPR/Cas9 strategy disrupting: (i) a putative δγ-intergenic HbF silencer targeted by the HbF repressor BCL11A in adult erythroblasts; (ii) the shortest deletion associated with elevated HbF levels (“Corfu” deletion) in β-thalassemic patients, encompassing the putative δγ-intergenic HbF silencer; (iii) a 13.6-kb genomic region including the δ- and β-globin genes and the putative intergenic HbF silencer. Targeting the 13.6-kb region, but not the Corfu and the putative δγ-intergenic regions, caused a robust HbF re-activation and a concomitant reduction in β-globin expression in an adult erythroid cell line and in healthy donor hematopoietic stem/progenitor cells (HSPC)-derived erythroblasts. We provided a proof of principle of this potential therapeutic strategy: disruption of the 13.6-kb region in HSPCs from SCD donors favored the β-to-γ globin switching in a significant proportion of HSPC-derived erythroblasts, leading to the amelioration of the SCD cell phenotype. Finally, we dissected the mechanisms leading to HbF de-repression demonstrating changes in the chromatin conformation and epigenetic modifications within the β-globin locus upon deletion or inversion of the 13.6-kb region. Overall, this study contributes to the knowledge of the mechanisms underlying fetal to adult hemoglobin switching, and provides clues for a genome editing approach to the treatment of SCD and β-thalassemia

Le virus de la maladie de Marek (GaHV-2), est un "-herpèsvirus induisant des lymphomes T chez le poulet. L’étude des pri-miARN des régions RL à partir des miR-M4, -M11, M31 et -M1 a montré des initiations de transcription dispersées et internes aux longs pri-miARN initialement décrits. Les tests de fonctionnalité des régions en amont ont permis de conclure quant à l’absence d’activité promotrice suggérant une régulation par le prmiR-M9M4, caractérisé dans cette étude, ou par le prMeq. Le gène de 7,5 kpb d’un ARNlnc (ERL, Edited Repeat Long) épissé et antisens à ces transcrits a été caractérisé. Une hyper-édition A-en-G des transcrits ERL par ADAR1 a été mis en évidence. Principalement lié au cycle lytique, l’édition indique une répression fonctionnelle durant cette phase. Les régulations de l’expression d’ADAR1 chez l’humain, positives par la voie de réponse aux interférons et négatives par SOCS1, ont été validées chez le poulet. L’inhibition de SOCS1 par le gga-miR-155 et son orthologue viral mdv1-miR-M4-5p a été montré fonctionnelle chez le poulet comme chez l’humain et mène à une surexpression d’ADAR1 lors de l’activation des voies de réponse aux interférons
Marek’s disease virus (GaHV-2) is an "-herpesvirus that induces T-cell lymphoma in chickens. In this study, we have shown that some pri-miRNAs, which are specific of miR-M4, -M11, M31 et -M1, initiated at dispersed transcription start sites. They are located in internal positions from previously described pri-miRNAs but upstream sequences lack promoter activity, indicated a potential regulation by the upstream prmiR-M9M4, characterised during this study, or the prMeq. The 7.5 kbp gene of the ERL (Edited Repeat Long) lncRNA, which is alternatively spliced et antisense of these pri-miRNAs was defined. An extensive A-to-G hyperediting of it sequence was observed strongly linked to the lytic phase, indicated a functional repression during this phase. We showed that, like the human one, the chicken ADAR1 expression was positively controlled by the IFN response pathway et negatively by the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). Like the human et murine miR-155-5p, the chicken gga-miR-155-5p et the GaHV-2 analog mdv1-miR-M4-5p deregulate this pathway by targeting et repressing expression of SOCS1, leading to the upregulation of ADAR1

Clostridium beijerinckii DSM 6423 est une souche bactérienne atypique capable de fermenter une variété de substrats et de produire naturellement un mélange de solvants composé d’isopropanol, de butanol et d’éthanol (IBE). Malgré ce potentiel, des limitations subsistent pour son utilisation dans un procédé de synthèse d’isopropanol biosourcé. En particulier, sa faible sélectivité envers cet alcool et sa faible tolérance au mélange de solvants réduisent la quantité de produits récupérables. Ces défauts pourraient être corrigés par des modifications ciblées du génome de cette souche, mais ceci passe par le développement d’outils génétiques, jusqu’à présent inexistants pour cette bactérie, et une meilleure compréhension de son métabolisme. Dans ce contexte, une première thèse réalisée à IFPEN a permis d’établir sa carte génétique et d’isoler de premiers mutants présentant une tolérance accrue à l’isopropanol.Dans la continuité de ces premiers résultats, les travaux de thèse présentés dans ce manuscrit se sont d’abord attachés à développer des outils de génétique ciblée performants. L’utilisation de plasmides Dam- Dcm- a permis pour la première fois de transformer ce microorganisme avec succès, ouvrant la voie au développement d’un outil basé sur la technologie CRISPR-Cas9, qui révolutionne l’ingénierie génétique en modifiant les génomes de manière itérative et sans laisser de trace. Comme preuve de concept, les 2 gènes CIBE_0562 (upp) et CIBE_3859 (catB) ont été inactivés. Cette deuxième modification a rendu ce micro-organisme sensible au thiamphénicol et compatible avec un système CRISPR à deux plasmides développé précédemment à IFPEN pour modifier le génome d’une souche solvantogène de référence, Clostridium acetobutylicum. Après suppression du plasmide endogène pNF2, les efficacités de transformation de la souche ont été drastiquement accrues, nous permettant ainsi d’obtenir une souche plateforme ∆catB ∆pNF2 qui pourra constituer le point de départ de la construction d’une souche performante pour la production d’isopropanol.Parallèlement au développement de ces outils génétiques, ma thèse s’est également consacrée à la caractérisation du microorganisme par plusieurs approches. La première a consisté à déterminer l’impact de différents substrats, modèles ou industriels, sur les performances et le métabolisme de la souche. Après sélection de trois substrats (glucose, saccharose, mélasse de betterave), un procédé de fermentation continue a été mis au point pour isoler les deux états physiologiques caractéristiques d’une fermentation IBE, puis couplé à une analyse multi-omiques. Les résultats préliminaires, s’appuyant sur les données obtenues par protéomique, soulignent l’impact très important de l’utilisation de substrats industriels sur la croissance.Deuxièmement, une approche transcriptomique, le Capp-Switch sequencing, a été employée pour cartographier, à l’échelle du génome, l’ensemble des sites d’initiation de la transcription (TSS) pour la souche DSM 6423 et deux autres souches solvantogènes de référence. Une analyse comparative des TSS a notamment révélé une régulation différentielle de l’opéron de synthèse du butyryl-CoA entre les espèces C. beijerinckii et C. acetobutylicum.Bien que non prévu au début de ce travail, le séquençage d’un mutant obtenu lors de travaux précédents et incapable de produire de l’isopropanol (souche AA), puis la reconstruction de son phénotype dans une souche modèle de C. beijerinckii, a par ailleurs révélé le rôle fondamental du facteur σ54 pour le contrôle des voies de synthèse des solvants et d’assimilation de sucres alternatifs.En conclusion, en approfondissant nos connaissances sur C. beijerinckii DSM 6423 et en permettant des modifications ciblées de son génome, ma thèse s’inscrit dans un ensemble de travaux menés à IFPEN visant à faire de cette souche un organisme modèle pour la fermentation IBE, permettant à terme la bioproduction d’isopropanol à échelle industrielle
Clostridium beijerinckii DSM 6423 is an atypical bacterial strain which can ferment a wide array of substrates and naturally produce a solvent mixture composed of isopropanol, butanol and ethanol (IBE). Despite its potential, the prospect of using this microorganism for a biobased isopropanol synthesis process remains limited. In particular, its poor selectivity to this alcohol and its weak tolerance to the solvent mixture reduce isopropanol recoverability, although these drawbacks might be alleviated by targeted genome editing approaches. For this matter, developing genetic tools, that were until this work inexistent for this bacterium, and increasing our knowledge of its metabolism are important steps. In this context, a first IFPEN thesis did the ground work by drawing its genetic map and isolating isopropanol-tolerant mutants.Based on this context, my thesis first aimed at developing efficient targeted genetic tools for this relevant strain. Use of Dam- Dcm- plasmids permitted for the first time the successful transformation of this microorganism, enabling the development of a reusable, scarless, genome editing tool based on the CRISPR-Cas9 technology. As a proof of concept, the 2 genes CIBE_0562 (upp) and CIBE_3859 (catB) were inactivated. This second modification made the strain sensitive to thiamphenicol and allowed the use of a dual-plasmid CRISPR system that had previously been engineered in IFPEN to modify the genome of a reference solventogenic species: Clostridium acetobutylicum. After the deletion of the pNF2 endogenous plasmid, transformation efficiencies were drastically increased, resulting in a ∆catB ∆pNF2 platform strain that may be used in the future to construct an efficient strain for isopropanol production.In addition to the development of these genetic tools, my thesis also aimed at characterizing the microorganism by different approaches. Firstly, we studied the impact of several model or industrial carbon sources on the strain performances and on its metabolism. Focusing on three substrates (glucose, sucrose, beetroot molasse), a continuous fermentation process was next designed to isolate the two IBE-characteristic physiological states and coupled to a multi-omic analysis. Proteomics preliminary results highlight the severe impacts of industrial substrates on growth.Secondly, the Capp-Switch sequencing transcriptomic approach was used to map transcription start sites (TSS) at the genome scale for the DSM 6423 strain and two other reference solventogenic strains. A comparative TSS analysis notably revealed a differential regulation of the butyryl-CoA synthesis operon between the C. beijerinckii and C. acetobutylicum species.Although initially not planned at the beginning of this work, the sequencing of the AA strain, one of the mutants that were obtained in the first thesis and that is unable to produce isopropanol, as well as a targeted genome approach reproducing its phenotype in a C. beijerinckii model strain, also revealed the crucial role of σ54 in controlling solvent synthesis and alternative sugar uptake pathways.To conclude, by deepening our knowledge on C. beijerinckii DSM 6423 and by allowing targeted genome editing approaches, my thesis is involved in a series of work conducted at IFPEN that aim at making this strain an IBE fermentation model organism, in order to use it for the bioproduction of isopropanol at the industrial scale

Giovanni Pascoli (1855-1912) est un classique de la littérature italienne. Poète bilingue écrivant en italien et en latin, il s’est illustré dans le domaine de la littérature néo-latine en composant des poèmes qui ont remporté le certamen poeticum hoeufftianum. Son œuvre latine, les Carmina, est méconnue en France. Le premier objectif de cette recherche doctorale est de proposer une édition bilingue traduite et commentée d’une sélection des poèmes latins de Pascoli, accessible à un public français non spécialiste de littérature latine ou italienne. Nous avons tenté de sélectionner des poèmes de formes variées (poèmes narratifs, épigrammes, odes dédicatoires) afin de donner au lecteur un aperçu de ce que pourrait être une édition intégrale des Carmina. Nous avons présenté en introduction les éléments biographiques et les diverses aspects esthétiques et linguistiques de la poésie pascolienne susceptibles de faciliter la compréhension des textes. Nous y proposons également une analyse de l’expérience poétique que représente pour Pascoli le fait d’écrire en latin et de situer cette pratique par rapport à ses contemporains. Nous avons en outre essayé autant que possible d’étudier la poésie latine de Pascoli au contact de sa poésie italienne. Le second aspect de cette thèse porte sur le caractère posthume de cette œuvre, éditée par la sœur du poète, Maria Pascoli avec l’aide du philologue Ermenegildo Pistelli. Le poète n’ayant pas eu le temps de proposer une structuration de son œuvre en recueil, les poèmes latins sont organisés selon des sections thématiques qui ne sont pas toujours satisfaisantes (par exemple, les épigrammes sont éditées sans logique d’organisation dans une section rassemblant tous les poèmes de forme brève ou les poèmes qui n’ont pu être classés dans les sections thématiques). Grâce à la numérisation de l’ensemble des brouillons de G. Pascoli, nous avons pu explorer les ébauches de plans réalisés par l’auteur, et nous proposons dans l’introduction de cette thèse deux recueils possibles : le premier organisé selon la chronologie de l’écriture, le second organisé selon la chronologie des faits représentés. Notre édition commentée des Carmina est présentée selon la première organisation, afin d’offrir un aperçu de l’écriture de Pascoli comme un processus qui a évolué au fil du temps. Cette étude du processus de l’écriture pascolienne, nous l’avons également menée à l’échelle du poème, dans le détail de la composition. Nous avons réalisé une édition génétique XML-TEI d’un dossier de brouillons, celui du poème Crepereia Tryphaena. Dans cette édition, nous avons décrit avec une très grande précision les gestes d’écriture visibles sur la page (ajouter, supprimer, substituer, déplacer, réécrire une nouvelle version) et nous avons tenté, quand cela était possible d’analyser les opérations mentales qui ont provoqué ces gestes. Nous avons en outre tenté de reconstituer la chronologie de l’écriture de chaque brouillon, afin de créer un prototype d’édition qui permette de lire les brouillons de poésie en affichant le texte une campagne d’écriture après l’autre et de visualiser les modifications apportées par l’auteur jusqu’à l’échelle de la lettre. Grâce à cette édition, nous avons pu analyser dans le détail les étapes de composition, les méthodes employées par l’auteur et les gestes effectués pour mener à bien son projet, et nous livrons les résultats de cette analyse à la fin de l’introduction de cette thèse
Giovanni Pascoli (1855-1912) is a classic of Italian literature. A bilingual poet writing in Italian and Latin. He has distinguished himself in the field of Neo-Latin literature by composing poems awarded in the certamen poeticum hoeufftianum. His Latin work, the Carminas, is almost unknown in France. The first objective of this doctoral research is to propose a bilingual edition, translated and commented, of a selection of Pascoli's Latin poems, accessible to a French audience not specialised in Latin or Italian literature. We have tried to select poems of various forms (narrative poems, epigrams, dedications odes) in order to give the reader an idea of what a complete edition of the Carmina could be like. In the introduction, we presented the biographical elements and the various aesthetic and linguistic aspects of Pascolian poetry that could facilitate the understanding of the texts. We also offer an analysis of the practice consisting in writing in Latin as a poetic experiment, and tried to situated this practice in relation to his contemporaries. We also tried as much as possible to study Pascoli's Latin poetry in relation to his Italian poetry. The second aspect of this thesis concerns the posthumous nature of this work, edited by the poet's sister, Maria Pascoli, with the help of philologist Ermenegildo Pistelli. Since the poet did not have time to propose a structure of his work in a collection, the Latin poems are organized according to thematic sections that are not always satisfactory (for example, the epigrams are published without organizational logic in a section containing all the short poems or the poems that could not be classified in the thematic sections). The digitization of all of G. Pascoli's drafts enabled us to explore the drafts of the author's plans, and we propose two possible collections in the introduction to this thesis: the first organized according to the chronology of the writing, the second organized according to the chronology of the facts represented. Our commented edition of the Carmina is presented according to the first organization, in order to offer an overview of Pascoli's writing as a process that has evolved over time. This study of the Pascholian writing process was also carried out at the poem level, in the detail of the composition. We made an XML-TEI genetic edition of a draft folder, that of the poem Crepereia Tryphaena. In this edition, we have described with great precision the writing gestures visible on the page (add, delete, substitute, move, rewrite a new version) and we have tried, when possible, to analyze the mental operations that caused these gestures. We have also tried to reconstruct the chronology of the writing of each draft, in order to create an editing prototype that allows us to read the drafts of poetry by displaying the text one writing campaign after the other and to visualize the modifications made by the author up to the scale of the letter. Thanks to this edition, we were able to analyse in detail the composition steps, the methods used by the author and the gestures made to carry out his project, and we deliver the results of this analysis at the end of the introduction of this thesis
Giovanni Pascoli (1855-1912) fa parte dei classici della letteratura italiana. Poeta bilingue scrivendo in italiano e in latino, è diventato famoso nell’ambito della letteratura neolatina per avere composto poemi premiati o lodati quasi ogni anno dal 1892 al certamenpoeticum hoeufftianum. La sua opera latina, i Carmina, è sconosciuta in Francia.Il primo obbiettivo di questa ricerca dottorale è di proporre un’edizione bilingue tradotta e commentata di una selezione dei poemi latini del Pascoli e di rendere quest’edizione accessibile a un lettorato francese che non sia specialista né di letteratura latina né di letteratura italiana. Abbiamo provato a selezionare poemi di forme varie (poemi narrativi, epigrammi, odi dedicatorie) per poter dare al lettore una visione d’insieme di quello che potrebbe essere un’edizione integrale dei Carmina. Abbiamo presentato in introduzioneelementi biografici e vari aspetti estectici e linguistici della poesia pascoliana suscettibili di agevolare la comprensione dei testi. Ci presentiamo anche un’analysi delle modalità della scrittura in latino come esperienza poetica, ambientando questa pratica nel contesto culturale in cui scriveva il Pascoli. Abbiamo inoltre provato a studiare la poesia latina del Pascoi al contatto di quella italiana.Il secondo aspetto di questa tesi riguarda il carattere postumo dei Carmina, la cui edizione princeps è stata realizzata da Maria Pascoli e Ermenegildo Pistelli. Il poeta non ha avuto il tempo di raggruppare i suoi poemi in una raccolta strutturata, quindi i Carmina sono stati organizzati in sezioni tematiche che non sono sempre soddisfacenti (per esempio, gli epigrammi sono pubblicati senza logica di organizzazione in una sezione ragruppando poemi di forma breve e poemi che non entravano nei temi delle sezioni). Grazie alla digitalizzazione dell’insieme delle carte di G. Pascoli, abbiamo potuto esplorare i tentativi di strutturazionedell’opera realizzati dal poeta, e proponiamo nell’introduzione di questa testi due strutture possibili : la prima secondo la cronologia della scrittura, e l’altra secondo la cronologia dei fatti rappresentati. Abbiamo scelto per presentare l’edizione commentata dei Carmina la prima struttura, per permettere di visualizzare la scrittura dei Carmina come un processo che ha evoluto nel tempo.Questo studio del processo della scrittura pascoliana, l’abbiamo anche portato al livello del poema, nel dettaglio della composizione. Abbiamo costituito un’edizione genetica XMLTEI di una cartella di carte, quella del poema Crepereia Tryphaena. In questa edizione, abbiamo descritto con una massima precisione possibile i gesti di scrittura visibili sulla pagina (aggiungere, cancellare, sostituire, spostare, riscrivere una nuova versione), e abbiamo tentato, quando era possibile, di analizzare le operazioni mentali che hanno provocato questi gesti. Inoltre, abbiamo provato a ricostituire la cronologia della scrittura di ogni carta, percreare un prototipo di edizione che permetta di leggere le carte di una poesia facendo apparire una stesura dopo l’altra, e permettendo di visualizzare le modifiche fino al livello della lettera. Grazie a quest’edizione abbiamo potuto analizzare precisamente le varie tappe della composizione di poesia, i metodi usati dall’autore et i gesti effettuati per condurre il suo progetto creativo. Presentiamo i risultati di quest’analisi alla fine dell’introduzione della tesi

Le changement de type sexuel est une des stratégies développées par les champignons afin de favoriser la reproduction sexuée. Ce mécanisme permet à une cellule haploïde de donner naissance à une cellule de type sexuel opposé de façon qu’elles puissent se féconder. Cela a particulièrement été bien étudié chez la levure sexuée Saccharomyces cerevisiae mais la raison pour laquelle les éléments du changement de type sexuel ont été conservés dans des espèces comme Candida glabrata chez qui ni reproduction sexuée, ni changement de type sexuel n’a lieu, n’est toujours pas connue. Nous avons montré précédemment que le changement de type sexuel peut être induit chez C. glabrata en exprimant l’endonucléase responsable de ce mécanisme chez S. cerevisiae et que cela était lié à une très forte létalité cellulaire. Dans ce travail, nous avons étudié le lien qui existe entre changement de type sexuel et forte létalité chez C. glabrata
Mating-type switching is one of the strategies developed by fungi to promote sexual reproduction and propagation. This mechanism enables one haploid cell to give rise to a cell of the opposite mating-type so that they can mate. It has been extensively studied in the sexual yeast Saccharomyces cerevisiae but little is known about why the mating-type switching components have been conserved in species like Candida glabrata, in which neither sexual reproduction nor mating-type switching is observed. We have previously shown that mating-type switching can be triggered, in C. glabrata, by expression of the endonuclease responsible of this mechanism in S. cerevisiae, but this leads to massive cell death. In this work, we studied the link existing between mating-type switching and cell death in C. glabrata

La parution en 1750 de l'Introduction à l'analyse des lignes courbes algébriques, unique ouvrage publié de Gabriel Cramer, professeur de mathématiques à l'Académie de Genève, est un jalon important dans l'histoire de la géométrie des courbes et de l'algèbre. Il s'est passé près de dix années entre le moment où le Genevois a écrit les premières lignes de son traité des courbes, à l'automne 1740, et sa publication effective : il s'agit de l'œuvre d'une vie.Ce livre a une histoire, à la fois intellectuelle et matérielle, qui s'inscrit dans les contextes scientifiques, professionnels, académiques et sociaux dans lesquels évoluent son auteur puis ses lecteurs. De la genèse d'un texte manuscrit en devenir dont nous suivrons les évolutionsau cours du processus d'écriture et au gré des événements de la vie de son auteur, aux différentes lectures mathématiciennes et historiennes du texte publié qui en sont faites dans les quelque deux siècles qui ont suivi sa publication, je souhaite ici écrire, pour autant que cette expression ait un sens - ce que je m'attacherai à démontrer - une « biographie » de l'Introduction de Gabriel Cramer
The publication in 1750 of the Introduction à l'analyse des lignes courbes algébriques, the only published work by Gabriel Cramer, professor of mathematics at the Geneva Academy, is an important milestone in the history of geometry of curves and algebra. Almost ten years passed between the time when the Genevan wrote the first lines of his treatise on curves in the autumn of 1740 and its actual publication, making it a lifetime achievement.This book has a history, both intellectual and material, which takes place in the scientific, professional, academic and social contexts in which evolve its author and its readers. From the genesis of a handwritten text as a work in progress of which we will follow the evolutions during the process of writing and according to the events of its author's life, to the various mathematicians and historians' readings of the published text which are made in the two centuries following its publication, I would like to write here, insofar as this expression makes sense - which I shall endeavour to demonstrate - a « biography » of Gabriel Cramer's Introduction

Le gène BCAR4 (Breast Cancer anti-estrogen Resistance 4) a précédemment été découvert chez le bovin comme un gène exprimé préférentiellement dans l'ovocyte et l'embryon précoce et dont l’inhibition altère le développement embryonnaire in vitro. Cependant, son rôle dans l’ovogenèse, la folliculogenèse et globalement la fertilité in vivo restait inconnu. Le gène est conservé chez divers mammifères mais pas chez les rongeurs, le lapin a donc été choisi pour analyser son expression et sa fonction in vivo. Le transcrit BCAR4 est détecté dans l’ovaire dès la formation des follicules primordiaux, et dans les follicules préantraux et antraux, jusque dans l’ovocyte ovulé. Son abondance diminue après la fécondation et tout au long du développement préimplantatoire pour disparaître dans le blastocyste, un profil typique d’un transcrit maternel.Afin d’appréhender le rôle du gène BCAR4 in vivo dans la reproduction chez la femelle, des lapins porteurs d’une altération du gène BCAR4 ont été créés par édition du génome à l’aide de nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN), et une lignée a été générée. Les animaux porteurs de la modification à l’état homozygote ou hétérozygote sont viables et en bonne santé. L’efficacité de l’altération génétique a été démontrée par transcription inverse couplée à la PCR : trente fois moindre que chez les animaux de génotype sauvage, l’expression de BCAR4 peut être considérée comme abolie dans les follicules ovariens des individus homozygotes. Les femelles ont été phénotypées sur plusieurs paramètres liés à la reproduction. Le génotype n’a pas d’impact significatif sur la folliculogenèse ou l’activité ovarienne, estimés par le dénombrement folliculaire sur coupes histologiques, la concentration plasmatique en hormone anti-mullérienne ou la réponse à la stimulation ovarienne. Pour évaluer la fertilité et la prolificité, les femelles ont été inséminées trois fois à six semaines d’intervalle. Les femelles homozygotes présentaient un taux de mise-bas significativement plus faible que les femelles hétérozygotes, 22±7% vs 71±11% (moyenne±sem), et une prolificité de 1,5±0,7 vs 5,8±1,5 lapereaux par insémination. En conclusion, le gène BCAR4 n’est pas indispensable pour le développement folliculaire, mais il contribue à une fertilité optimale chez la lapine
The BCAR4 gene (Breast Cancer anti-estrogen Resistance 4) has been previously characterized in cattle as a gene expressed preferentially in the oocyte and early embryo, whose inhibition alters embryonic development in vitro. However, its role in oogenesis, folliculogenesis and overall in fertility in vivo remains unknown. Since this gene is conserved in various mammals but not in rodents, the rabbit has been chosen to investigate its expression and function in vivo. By reverse transcription coupled to PCR, BCAR4 transcript is detected in the ovary when primordial follicles are formed, and in ovarian follicles at the preantral and antral stages, as well as in ovulated oocytes. Its abundance decreases after fertilization and throughout preimplantation development to disappear in the blastocyst, a typical profile for a maternal transcript.In order to elucidate the role of BCAR4 in vivo in female reproduction, rabbits carrying an altered BCAR4 gene were created and a line was generated. Both homozygous and heterozygous carriers of the genetic alteration are viable and appear healthy. The genetic alteration abolishes BCAR4 expression in ovarian follicles of homozygous animals, as the transcript abundance is down thirty-fold as compared to the wild-type phenotype. Females were phenotyped on several parameters related to reproduction. The genotype did not have a significant impact on follicular development or ovarian activity, as estimated by follicular count onto ovarian sections, anti-mullerian hormone concentration in plasma, and the response to ovarian stimulation. To evaluate their fertility and prolificacy, females were inseminated three times every six-weeks. Homozygous females had a significantly lower farrowing rate than heterozygous females, 22±7% vs 71±11% (mean±sem), while prolificacy was 1.5±0.7 vs 5.8±1.5 pups per insemination. In conclusion, BCAR4 is not essential for follicular development but the gene contributes to optimal fertility of female rabbits

Les phénolamides constituent une famille des métabolites spécialisés qui s’accumulent chez une grande diversité d’espèces végétales. Ils ont des fonctions dans l’initiation florale, interviennent dans les réponses des plantes à des stress, et ils entrent dans la composition des parois de grains de pollen. De plus, leur bioactivité thérapeutique a été décrite en tant que molécule anti-oxydante, anti-inflammatoire, anti-microbienne ou anti-cancéreuse. Des travaux récents du laboratoire ont montré que la tomate produit des phénolamides, notamment lorsqu’elle subit l’herbivorie du ravageur Tuta absoluta. Leur rôle dans la défense des plantes reste à instruire. Dans ce cadre, un premier objectif de ma thèse a été de moduler la composition en phénolamides chez la tomate afin d’évaluer les conséquences de cette modulation sur le fonctionnement de la plante et sa capacité à se défendre. Un second objectif a été de déterminer le potentiel thérapeutique de ces phénolamides identifiés chez la tomate, par des tests de criblage d’activité. Un préalable à la génération de plantes modifié génétiquement pour leur capacité de synthèse de phénolamides, a été d’identifier de nouveaux gènes contrôlant l’accumulation de phénolamides dans la plante. Nous avons exploité notre banque ARN Seq de tomate et des travaux chez d’autres solanacées. Nous avons identifié dix gènes candidats, dont deux codant pour des facteurs de transcription et huit pour des acyltransférases. La caractérisation fonctionnelle de ces candidats n’a, pour le moment, pas mené à l’identification de nouvelle fonction enzymatique associée à la voie des phénolamides. Ce travail devra être poursuivi en élargissant le spectre de substrat testés sur les candidats identifiés et en ciblant d’autres gènes candidats. Pour générer les plantes modifiées génétiquement, j’ai réalisé un travail de développement méthodologique volumineux, ayant nécessité de maitriser au laboratoire des protocoles de transformation et de régénération sur l’espèce tomate, et d’acquérir et maîtriser la technique d’édition de gène (CRISPR/cas9). La technique mise au point conduit à une forte efficacité de transformation, que ce soit en surexpression ou en édition de gène. Nous avons généré ainsi 94 lignées de tomates dont l’expression des gènes de putrescine hydroxycinnamoyl transférase (PHT) responsable de l’accumulation de caféoylputrescine, a été modifiée à la hausse ou à la baisse, tout comme l’expression du facteur de transcription solyc06g083900.2 susceptible d’être impliqué dans l’accumulation d’un ensemble plus large de phénolamides. Les plantes obtenues sont maintenant disponibles pour un travail de caractérisation de leur contenu métabolique et des conséquences physiologiques des modifications générées. Nous avons évalué le potentiel thérapeutique de quelques phénolamides de tomate induits par l’herbivorie de T. absoluta. L’obtention de molécules pures a demandé le concours de chimistes. Parmi les molécules évaluées, la caféoylputrescine et la kukoamine présentent des activités antibactériennes modérées vis-à-vis de Staphylococcus aureus. Les tests ont révélé la propriété anti-inflammatoire de la caféoylputrescine sur des cellules de macrophage. Ces travaux confirment le potentiel thérapeutique des phénolamides. Ils seront poursuivis en vue de l’évaluation de leurs propriétés anti-cancéreuses
Phenolamides are a family of specialized metabolites that accumulate in a wide variety of plant species. They have functions in flower initiation, are involved in plant responses to stress, and they are part of the composition of the walls of pollen grains. In addition, their therapeutic bioactivity has been described as an antioxidant, anti-inflammatory, anti-microbial or anti-cancer molecule. Recent laboratory work has shown that the tomato produces phenolamides, especially when it is attacked by the pest Tuta absoluta. Their role in the defense of plants remains unclear. In this context, a first objective of my thesis was to modulate the composition of phenolamides in tomatoes in order to assess the consequences of this modulation on the functioning of the plant and its ability to defend itself. A second objective was to determine the therapeutic potential of these phenolamides identified in tomatoes, by screening tests for activity. A prerequisite for the generation of plants genetically modified for their capacity to synthesize phenolamides, has been to identify new genes controlling the accumulation of phenolamides in the plant. We have exploited our RNA Seq tomato bank and work in other Solanaceae. We have identified ten candidate genes, two of which code for transcription factors and eight for acyltransferases. The functional characterization of these candidates has so far not led to the identification of any new enzymatic function associated with the phenolamide pathway. This work should be continued by broadening the spectrum of substrate tested on the identified candidates and by targeting other candidate genes. To generate the genetically modified plants, I carried out a methodological work, in the laboratory, to develop transformation and regeneration protocols on the tomato species, and the gene editing technique, (CRISPR / cas9). The techniques developed lead to a high efficiency of transformation, whether in overexpression or in gene editing. We thus generated 94 lines of tomatoes in which the expression of the putrescine hydroxycinnamoyl transferase (PHT) genes responsible for the accumulation of caffeoylputrescine was modified upward or downward, as was the expression of the transcription factor solyc06g083900 .2 likely to be involved in the accumulation of a wider set of phenolamides. The plants obtained are now available for characterization work on their metabolic content and the physiological consequences of the modifications generated. We evaluated the therapeutic potential of some tomato phenolamides induced by the herbivory of T. absoluta. Obtaining pure molecules required the help of chemists. Among the molecules evaluated, caffeoylputrescine and kukoamine A exhibit moderate antibacterial activities against Staphylococcus aureus. The tests revealed the anti-inflammatory property of caffeoylputrescine on macrophage cells. This work confirms the therapeutic potential of phenolamides. They will be prosecuted for the evaluation of their anti-cancer properties

Le développement de stratégies thérapeutiques curatives pour les patients affectés de β-hémoglobinopathies, c’est à dire drépanocytose et β-thalassémies, fait face à une grande demande. En effet, un accès restreint à des donneurs compatibles limite l’unique thérapie définitive autorisée, la transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques (CSH). Au cours de la première partie de cette thèse,nous avons optimisé une alternative thérapeutique,la transplantation autoloque de CSH corrigées par le biais de lentivirus (LV). Le développement de lentivirus exprimant la β-globine et l’amélioration des conditions de transduction des CSH a débouché sur de probants bénéfices cliniques pour les patients drépanocytaires et thalassémiques traités par cette approche dans le cadre d’essais cliniques récents. Malgré ces progrès majeurs,cette thérapie pourrait bénéficier d’améliorations. En effet,la correction de thalassémies majeures, dépendantes de transfusion, ainsi que de la drépanocytose requiert de forts niveaux d’expression du transgène. Le but de ce projet est de choisir un LV à titre élevé, capable de transduire une large portion de CSH et d’entraîner une forte expression du transgène dans des globules rouges (GR) dérivés de CSH. A cet effet, nous avons comparé différentes combinaisons d’éléments régulateurs afin de définir la cassette régulatrice minimale nécessaire pour l’obtention de forts niveaux d’expression de la β-globine. Nous avons construit 2 mini-LCRs contenant soit HS2 et HS3 (taille totale 2.6 kb) ou HS2, HS3 et HS4 (taille totale 3.7 kb) provenant du Locus Control Region (LCR). Ces cassettes ont été insérées dans les LV β-AS3 et β-AS3 HS4, respectivement, qui contrôlent l’expression d’une globine anti-falciformante, βAS3-globine.Premièrement, nous avons comparativement évalué l’efficacité de transduction des vecteurs β-AS3 et β-AS3 HS4 dans des cellules souches progéniteurs hématopoïétiques (CSPH) drépanocytaires et dans des CSH drépanocytaires. Le deuxième volet de cette étude a permis de déterminer l’expression de la βAS3-globine issue de ces deux constructions dans des GR dérivés de CSPH drépanocytaires, et d’évaluer l’efficacité du LV le plus efficace pour secourir le phénotype drépanocytaire.La seconde partie de cette thèse vise à développer une nouvelle stratégie thérapeutique par édition du génome pour réactiver l’hémoglobine fœtale (HbF). Cette approche s’appuie sur l’observation d’une meilleure évolution clinique des β-thalassémies et de la drépanocytose en présence de niveaux élevés d’HbF.Par l’utilisation de la technologie CRISPR/Cas9, nous avons invalidé les sites de liaisons de répresseurs transcriptionnels au niveau des promoteurs de la γ-globine pour réactiver l’expression de l’HbF dans des GR dérivés de CSPH drépanocytaires. La réactivation des gènes de γ-globine fœtale dans leur locus génomique endogène permet de s’affranchir des difficultés liées à l’expression relativement faible de transgène par copie de LV, principalement lié à la faible capacité des LV qui ne permet d’insérer que de courts fragments d’ADN du LCR, arrangés de manière non-physiologique. De plus,cette stratégie offre une approche potentiellement plus sûre comparée à une stratégie addition de gène basée sur l’usage de LV. Dans la drépanocytose, cette approche thérapeutique favorise l’expression de la γ-globine anti-falciformante aux dépens de la globine βS-globine mutée. Dans le cadre d’une approche comparative,nous avons évalué des cibles thérapeutiques connues et nouvelles au niveau des promoteurs de la γ-globine. A cet effet, plusieurs ARN guides (ARNg) ont été designés pour cibler 3 régions des promoteurs de la γ-globine, où des variants associés à des niveaux élevés d’HbF et/ou à des sites de liaison de répresseurs de l’HbF ont été décrits
Highly efficient curative therapeutic strategies are in great demand for patients affected by β-hemoglobinopathies, namely sickle cell disease (SCD) and β-thalassemia. Indeed, the poor access to compatible donors restrains the application of the only approved definitive therapy, the allogeneic hematopoietic stem cell (HSC) transplantation. In the first part of this thesis, we aimed at optimizing an established therapeutic alternative consisting in the autologous transplantation of lentivirus (LV)-corrected hematopoietic HSCs. The development of β-globin expressing LVs and the improvement of HSC transduction conditions have led to a clear clinical benefit for SCD and β-thalassemia patients treated with this approach in the frame of recent clinical trials. Despite these significant progresses, there is room for further improvement. Indeed, the correction of severe transfusion-dependent B-thalassemia and SCD patients requires high levels of transgene expression. The goal of this project was to select a high-titer LV able to transduce efficiently HSCs and to drive high levels of transgene expression in HSC-derived RBCs. To this purpose, we compared different combinations of regulatory elements, in order to define the minimal regulatory cassette needed for achieving high levels of globin expression in the frame of LVs. We constructed 2 mini-LCRs containing either HS2 and HS3 (total size 2.6 kb) or HS2, HS3 and HS4 (total size 3.7 kb) derived from the 16-kb Locus Control Region. These cassettes were inserted in the β-AS3 and β-AS3 HS4 LVs, respectively, driving the expression of an anti-sickling βAS3-globin transgene. First, we aimed at comparatively evaluate the transduction efficiency of β-AS3 and β-AS3 HS4 in SCD hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) and long term-repopulating HSCs. The second aim of the study was to assess β-AS3 and β-AS3 HS4 derived transgene expression in RBCs produced from SCD HSPCs, and to evaluate the efficacy of the best-performing LV in rescuing the SCD phenotype. The second part of this thesis aimed to develop a novel genome editing-based strategy to restore fetal γ-globin genes expression. This therapeutic approach stems from the observation that the clinical course of β-thalassemia and SCD is improved in the presence of elevated HbF levels. By using the innovative CRISPR/Cas9 technology, we aimed at disrupting repressors binding sites in the γ-globin promoters to reactivate HbF expression in SCD HSPCs-derived RBCs. Reactivating fetal γ-globin genes at their endogenous genomic locus can circumvent the difficulties associated with the relatively low LV-derived transgene expression per vector copy, likely because the low LV vector capacity allows the usage only of short DNA stretches from the LCR, arranged in a non-physiological manner. In addition, this strategy offers a potentially safer targeted approach compared to the LV-based gene addition. In SCD, this therapeutic approach can favor the anti-sickling γ-globin expression, at the expense of the mutated βS-globin, given the competition between the fetal and the adult genes for the interaction with the LCR. In a comparative approach, we intended to evaluate novel and known therapeutic targets in the γ-globin promoters. To this purpose, several gRNAs have been designed to target 3 regions of the γ-globin promoters, where variants associated with elevated HbF levels and/or binding sites for HbF repressors have been described. We aimed to screen these gRNAs in an adult erythroid cell line (HUDEP-2) and SCD HSPCs-derived RBCs in terms of HbF reactivation and correction of the patient phenotype, to select the best therapeutic target for an efficient and safe therapeutic approach for β-hemoglobinopathies

Les éléments Alu sont les retrotransposons les plus prolifiques chez l'humain avec plus d'1 million de copies occupant plus de 10% du génome. Afin de contrecarrer l'expansion des rétro-éléments, les organismes ont développés différents mécanismes pour préserver l'intégrité de leurs génomes. Le plus proéminent, également utilisé pour lutter contre la réinsertion d'ADN viral dans le génome hôte, est l'édition de l'ARN. Chez les mammifères, la plus courante est la déamination de l'adénine en inosine catalysée par la famille de protéine ADAR dont Les principales cibles sont les éléments Alu chez l'humain. L'édition des éléments Alu conduit à leur séquestration dans le noyau des cellules, mute leurs promoteurs internes, cible de l'ARN polymérase III (POLIII), et leurs queues poly-A, prévenant ainsi leur future rétrotransposition. Dans la première partie de cette étude, l'analyse de données de séquençage haut-débit révèle que ~40% des éléments Alu sont reconnus par POLIII, qu'ils sont présents en tant que petits ARN dans le cytoplasme et le noyau des cellules, que certain d'entre eux sont associés à la chromatine, et que la transcription des éléments Alu est un phénomène courant dans les tissus somatiques qui concorde avec l'expression d'éléments LINE1 fonctionnels. Ceci suggère que la rétrotransposition peut être un mécanisme normal dans la plupart des tissus humains. Enfin, l'analyse de l'expression des éléments Alu et LINE1 chez la souris montre que la transcription de rétrotransposons n'est pas spécifique de l'humain. Dans la seconde partie de cette étude, une nouvelle méthode a été développée pour explorer l'impact de l'édition de l'ARN sur le transcriptome en identifiant les ARN édités par séquençage haut-débit. Dans un premier temps, un anticorps ciblant ADAR a été utilisé pour extraire les ARN associés aux protéines de l'édition. Cette méthode n'étant pas suffisamment efficace, une autre stratégie, qui extrait directement les ARN contenant de l'inosine, a été développée : dans un premier temps, l'ARN est fixé à des billes magnétiques par leurs extrémités 3', ensuite, les billes sont traitées au glyoxal/acide borique et à la RNAse T1 pour libérer la région 5' des ARN contenant une ou plusieurs inosines, et enfin, les ARN libérés sont séquencés par séquençage haut débit. En utilisant cette méthode, 1822 sites d'éditions ont été identifiés dans l'ARN de cerveau de souris, incluant 28 nouveaux sites présents dans des séquences codantes qui conduisent à des mutations non-synonymes des futures protéines. Des sites d'éditions ont aussi été observés pour la première fois dans les ARN ribosomaux, les snoRNA et les snRNA.

Clostridium difficile (nouveau nom Clostridioides difficile) est une bactérie à Gram-positif, sporulante, anaérobie stricte, présente dans le sol et les environnements aquatiques, ainsi que dans le tractus intestinal des mammifères. C. difficile est l’un des principaux clostridies pathogènes. Cette bactérie est devenue un vrai problème de santé publique associé à l'antibiothérapie dans les pays industrialisés. La diarrhée associée à C. difficile est actuellement la diarrhée nosocomiale la plus fréquente en Europe et dans le monde. Depuis la dernière décennie, la proportion de formes d’infections graves a augmentée en raison de l’émergence des souches hypervirulantes et épidémiques comme la souche R20291 de ribotype 027. L’infection à C. difficile provoque la diarrhée, la colite et même la mort. De nombreux aspects de la pathogenèse de C. difficile restent mal compris. En particulier, les mécanismes moléculaires de son adaptation aux conditions changeantes de l'hôte doivent être examinés.Durant le cycle d'infection, C. difficile survit dans des communautés intestinales riches en bactériophages, en utilisant des systèmes qui contrôlent les échanges génétiques favorisés dans ces environnements complexes. Au cours de la dernière décennie, les systèmes CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (associés aux CRISPR) d'immunité adaptative chez les procaryotes contre des éléments génétiques exogènes sont devenus le centre d'intérêt scientifique parmi les divers systèmes de défense bactérienne.Des études antérieures ont révélé la présence d'ARN CRISPR abondants chez C. difficile. Cette bactérie possède un système CRISPR original, caractérisé par la présence d'un grand nombre de cassettes CRISPR (12 dans la souche 630 et 9 dans la souche hypervirulante R20291), de deux ou trois opérons cas conservés dans la majorité des génomes séquencés de C. difficile et la localisation au sein des prophages de plusieurs cassettes CRISPR. Cependant, le rôle de CRISPR-Cas dans la physiologie et le cycle infectieux de cet important pathogène reste obscur.Les objectifs de ce travail sont les suivants:1) étudier le rôle et la fonctionnalité du système CRISPR-Cas de C. difficile dans les interactions avec des éléments d'ADN étrangers (tels que les plasmides), 2) révéler la manière dont le système CRISPR-Cas de C. difficile est régulé et fonctionne dans des conditions de culture bactérienne différentes, incluant la réponse aux stress.Dans la présente thèse, la fonctionnalité du système CRISPR-Cas de C. difficile a été étudiée (chapitre 2). Grâce à des tests d'efficacité de conjugaison, la fonction défensive (en interférence) du système CRISPR-Cas a été démontrée. La corrélation entre les niveaux d'expression des ARN CRISPR et les niveaux d'interférence observés a également été montrée. De plus, grâce à la série d’expériences d’interférence, la fonctionnalité des motifs PAM (protospacer adjacent motifs) a été confirmée en accord avec des prédictions in silico. Le consensus fonctionnel de PAM a été déterminé expérimentalement avec les bibliothèques des plasmides. La fonction adaptative du système CRISPR-Cas de C. difficile a été également démontrée pour la souche de laboratoire. Le rôle de plusieurs opérons cas dans la fonctionnalité du système CRISPR de C. difficile est démontré aussi dans ce chapitre.Le chapitre 3 montre le lien entre le système CRISPR-Cas et un nouveau système toxine-antitoxine de type I, ainsi que leur possible co-régulation dans des conditions de biofilm et de stress. Ce chapitre définit également le rôle possible du c-di-GMP dans la régulation du système CRISPR-Cas de C. difficile. De plus, le chapitre 4 décrit l'utilisation du système CRISPR-Cas endogène comme nouvel outil pour la rédaction du génome de C. difficile.En conclusion, les données obtenues mettent en évidence les caractéristiques originales du système CRISPR-Cas actif de C. difficile et démontrent son potentiel biotechnologique
Clostridium difficile (the novel name – Clostridioides difficile) is a Gram-positive, strictly anaerobic spore forming bacterium, found in soil and aquatic environments as well as in mammalian intestinal tracts. C. difficile is one of the major pathogenic clostridia. This bacterium has become a key public health issue associated with antibiotic therapy in industrialized countries. C. difficile-associated diarrhoea is currently the most frequently occurring nosocomial diarrhoea in Europe and worldwide. Since the last decade the number of severe infection forms has been rising due to emergence of the hypervirulent and epidemic strains as ribotype 027 R20291 strain. C. difficile infection causes diarrhoea, colitis and even death. Many aspects of C. difficile pathogenesis remain poorly understood. Particularly, the molecular mechanisms of its adaptation to changing conditions inside the host are to be scrutinized. During the infection cycle C. difficile survives in bacteriophage-rich gut communities possibly by relying on some special systems that control the genetic exchanges favored within these complex environments. During the last decade, CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems of adaptive prokaryotic immunity against exogenic genetic elements has become the center of interest among various anti-invader bacterial defense systems.Previous studies revealed the presence of abundant and diverse CRISPR RNAs in C. difficile. C. difficile has an original CRISPR system, which is characterized by the presence of an unusually large set of CRISPR arrays (12 arrays in the laboratory 630 strain and 9 ones in the hypervirulent R20291 strain), of two or three sets of cas genes conserved in the majority of sequenced C. difficile genomes and the prophage location of several CRISPR arrays. However, the role CRISPR-Cas plays in the physiology and infectious cycle of this important pathogen remains obscure.The general aims of this work run as follows: 1) to investigate the role and the functionality of C. difficile CRISPR-Cas system in the interactions with foreign DNA elements (such as plasmids), 2) to reveal the way C. difficile CRISPR-Cas system expression is regulated and functions in different states of bacterial culture, including its response to stresses. In the present PhD thesis the functionality of C. difficile CRISPR-Cas system was investigated (Chapter 2). Through conjugation efficiency assays defensive function (in interference) of C. difficile CRISPR-Cas system was demonstrated. The correlation between the previously known levels of expression of CRISPR RNAs and the observed levels of interference has also been shown. Moreover, through the series of interference experiments the functionality of PAMs (protospacer adjacent motifs) was confirmed, which have already been predicted in silico. Additionally, the general functional PAM consensus was determined using PAM libraries experiments. Furthermore, an adaptive function of C. difficile CRISPR-Cas system was shown for laboratory strain. The role of multiple cas operons in C. difficile CRISPR functionality is also demonstrated in this Chapter.In Chapter 3 the link between C. difficile CRISPR-Cas system and a new type I toxin-antitoxin system is demonstrated, as well as a possible co-regulation under biofilm and stress conditions of CRISPR-Cas system and these toxin-antitoxin modules. This Chapter also defines a possible role of c-di-GMP in regulation of C. difficile CRISPR-Cas system. Additionally, Chapter 4 describes the utilization of endogenous C. difficile CRISPR-Cas system as a novel tool for genome editing in C. difficile. Altogether, the obtained data highlight the original features of active C. difficile CRISPR-Cas system and demonstrate its biotechnological potential

The research focuses on the comparative study of eroticism in two novels: The Margin by André Pieyre de Mandiargues and Pornografia by Witold Gombrowicz. Following the new comparative approach (Apter, Casanova, Moretti) from a cultural and literary perspective, the project explores the ways in which eroticism can be understood (or misunderstood) in the history of ideas, in literary criticism and finally in literary works. Starting from an epistemological inquiry, the contrasting literary histories of Poland and France and theoretical approaches developed by Bataille, Foucault, Barthes and Deleuze, the project shows the cultural differences in representing eroticism in literature. Furthermore it compares how Mandiargues and Gombrowicz defend the necessity and the danger of eroticism in literature through their critical writing. Finally, thanks to a deep textual analysis of the two novels, the study seeks to explain the dynamics of literary eroticism understood as a theme that is either descriptive or narrative. The two novels show how the erotic dream can be explored through narrative temporality or space and consequently lead to photographical or cinematographical interpretations. This research intends to highlight the role of these writers in the discussion of contemporary ars erotica in global literature and to encourage the study of eroticism in comparative literature
La recherche se focalise sur l’étude comparative de l’érotisme dans deux romans : La Marge d’André Pieyre de Mandiargues et La Pornographie de Witold Gombrowicz. Conformément à la nouvelle approche comparative (Apter, Casanova, Moretti) et dans une perspective culturelle et littéraire, le projet explore la façon dont l’érotisme peut être entendu (ou malentendu) dans l’histoire des idées, dans la critique littéraire et dans les œuvres littéraires. À partir d’une enquête épistémologique, de l’histoire contrastive du contexte littéraire franco-polonais et des enjeux critiques développés par Bataille, Foucault, Barthes et Deleuze, le projet montre les différences culturelles dans la représentation de l’érotisme littéraire. En outre, il compare la façon dont Mandiargues et Gombrowicz défendent la nécessité et le danger de l’érotisme dans la littérature, à travers leur écriture critique. Enfin, grâce à l’analyse des deux romans, l’étude tend à expliquer la dynamique de l’érotisme littéraire compris comme un thème tantôt descriptif tantôt narratif. Les deux romans montrent comment le rêve érotique peut être exploré à travers la temporalité narrative ou à travers l’espace et, par conséquent, comment ils peuvent conduire à des interprétations photographiques ou cinématographiques. Cette recherche vise à mettre en évidence le rôle de ces écrivains dans une discussion sur l’ars erotica contemporain dans la littérature mondiale et cherche à encourager l’étude de l’érotisme dans la littérature comparée.

Les études d’association pan-génomiques ont révélé plusieurs variants génétiques associés à des traits complexes. Les mesures érythrocytaires ont souvent fait l’objet de ce genre d’études, étant mesurées de façon routinière et précise. Comprendre comment les variations génétiques influencent ces phénotypes est primordial étant donné leur importance comme marqueurs cliniques et leur influence sur la sévérité de plusieurs maladies. En particulier, des niveaux élevés d’hémoglobine fœtal chez les patients atteints d’anémie falciforme est associé à une réduction des complications et une augmentation de l’espérance de vie. Néanmoins, la majorité des variants génétiques identifiés par ces études tombent à l’intérieur de régions génétiques non-codantes, augmentant la difficulté d’identifier des gènes causaux. L’objectif premier de ce projet est l’identification et la caractérisation de gènes influençant les traits complexes, et tout particulièrement les traits sanguins. Pour y arriver, j’ai tout d’abord développé une méthode permettant d’identifier et de tester l’effet de gènes knockouts sur les traits anthropométriques. Malgré un échantillon de grande taille, cette approche n’a révélé aucune association. Ensuite, j’ai caractérisé le méthylome et le transcriptome d’érythroblastes différentiés à partir de cellules souches hématopoïétiques et identifié plusieurs gènes potentiellement impliqués dans les programmes érythroïdes fœtaux et adultes. Par ailleurs, j’ai identifié plusieurs micro-ARNs montrant des motifs d’expression spécifiques entre les stages fœtaux et adultes et qui sont enrichis pour des cibles exprimées de façon opposée. Finalement, j’ai identifié plusieurs variants génétiques associés à l’expression de gènes dans les érythroblastes (eQTL). Cette étude a permis d’identifier des variants associés à l’expression du gène ATP2B4, qui encode le principal transporteur de calcium des érythrocytes. Ces variants, qui sont également associés à des traits sanguins et à la susceptibilité à la malaria, tombent dans un élément d’ADN spécifique aux cellules érythroïdes. La délétion de cet élément par le système CRISPR/Cas9 induit une forte diminution de l’expression du gène et une augmentation des niveaux de calcium intracellulaires. En conclusion, des échantillons de génotypages exhaustifs seront nécessaires pour étudier l’effet de gènes knockouts sur les traits complexes. Les érythroblastes montrent de grandes différences au niveau de leur méthylome et transcriptome entre les différents stages développementaux. Ces différences influencent potentiellement la régulation de l’hémoglobine fœtale et impliquent de nombreux micro-ARNs et régions régulatrices non-codantes. Finalement, l’exemple d’ATP2B4 montre qu’intégrer des études épigénomiques, transcriptomiques et des expériences d’édition de génome est une approche puissante pour caractériser des variants génétiques non-codants. Par ailleurs, ces résultats impliquent ATP2B4 dans l’hydratation des érythroblastes, qui est associé à la susceptibilité à la malaria et la sévérité de l’anémie falciforme. Cibler ATP2B4 de façon thérapeutique pourrait avoir un impact majeur sur ces maladies qui affectent des millions d’individus à travers le monde.
Genome-wide association studies (GWAS) have revealed several genetic variants associated with complex phenotypes. This is the case for red blood cell (RBC) traits, which are particularly amenable to GWAS as they are routinely and accurately measured. Understanding RBC trait variation is important given their significance as clinical markers and modifiers of disease severity. Notably, increased fetal hemoglobin (HbF) production in sickle cell disease (SCD) patients is associated with a higher life expectancy and decreased morbidity. Nonetheless, most variants identified through GWAS fall in non-coding regions of the human genome, increasing the difficulty of identifying causal links. The main goal of this project was to identify and characterize genes influencing complex traits, and in particular RBC phenotypes. First, I developed an approach to identify and test potential gene knockouts affecting anthropometric traits in a large sample from the general population, which did not yield significant associations. Then, I characterized the DNA methylome and transcriptome of erythroblasts differentiated ex vivo from hematopoietic progenitor stem cells (HPSC), and identified several genes potentially implicated in fetal and adult-stage erythroid programs. I also identified microRNAs (miRNA) that show specific developmental expression patterns and that are enriched in inversely expressed targets. Finally, I mapped expression quantitative trait loci (eQTL) in erythroblasts, and identify erythroid-specific eQTLs for ATP2B4, the main calcium ATPase of RBCs. These genetic variants are associated with RBC traits and malaria susceptibly, and overlap an erythroid-specific enhancer of ATP2B4. Deletion of this regulatory element using CRISPR/Cas9 experiments in human erythroid cells minimized ATP2B4 expression and increased intracellular calcium levels. In conclusion, large and comprehensive genotyping datasets will be necessary to test the role of rare gene knockouts on complex phenotypes. The transcriptomes and DNA methylomes of erythroblasts show substantial differences correlating with their developmental stages and that may be implicated in HbF production. These results also suggest a strong implication of erythroid enhancers and miRNAs in developmental stage specificity. Finally, characterizing the erythroid-specific enhancer of ATP2B4 suggest that integrating epigenomic, transcriptomic and gene editing experiments can be a powerful approach to characterize non-coding genetic variants. These results implicate ATP2B4 in erythroid cell hydration, which is associated with malaria susceptibility and SCD severity, suggesting that therapies targeting this gene could impact diseases affecting millions of individuals worldwide.