Littérature scientifique sur le sujet « Division méiotique »

@La méiose est le pivot de la reproduction sexuée et de la régulation de la transmission des gènes. Les mécanismes des accidents précoces survenant lors de la première division méiotique et l'incidence de tels accidents sur la reproduction humaine sont encore très mal connus. La première partie de cette thèse porte sur la caractérisation d'anomalies méiotiques chez des hommes infertiles. Dans une première série d'études portant sur 17 patients ayant une hypospermatogénèse histologiquement définie, nous avons montré que de façon quasi constante (mais avec des taux variables) la présence d'asynapsis des chromosomes homologues conduisait soit à la mort cellulaire (augmentation de la fragmentation de l'ADN) soit à la production de spermatozoides anormaux (augmentation du nombre de spermatozoides aneuploides). Cette approche a ensuite été appliquée à une série multicentrique de 247 hommes azoospermes. L'evaluation thermique intratesticulaire à l'aide de microcapteurs a permis de démontrer une corrélation entre l'élévation de la température testiculaire, les anomalies histologiques et les anomalies méiotiques et que la cure microchirurgicale de la varicocèle corrigeait les anomalies de la thermorégulation du testicule, aboutissant ipso facto à la normalisation de la méiose. Nous avons ainsi démontré que les anomalies méiotiques de classe IIC sont réversibles. La deuxième partie de notre travail vise à préciser l'incidence et le type des anomalies de la prophase de la méiose féminine, étudiée à la période fœtale. L'étude des chiasmas des chromosomes 21 et x chez 15 fœtus non porteurs d'anomalies chromosomique somatique ni d'anomalies de la différentiation gonadique a objectivé 30% d'anomalies pouvant conduire à la non disjonction de ces chromosomes et donc à la formation de gamètes aneuploides. En complément, l'analyse de fœtus trisomiques 21 a établi la fréquence de constitution de trivalents complexes lors de la première méiotique, expliquant la grande fréquence de production de gamètes aneuploides chez les femmes trisomiques 21.

Le noyau du spermatozoïde est inactif et sa chromatine est très condensée. Apres fécondation, il se décondense, se réactive et participe au développement de l'embryon. Nous avons étudié, par hybridation in situ fluorescente couplée à la microscopie confocale, la distribution tridimensionnelle (3D) des centromères, des télomères ainsi que de deux chromosomes X et 13 dans le noyau du spermatozoïde humain. Au sein du volume nucléaire, les centromères apparaissent groupes en quelques foyers distribués aléatoirement alors que les télomères seraient plutôt associes en doublets. Les chromosomes occupent des territoires individuels dans le noyau spermatique humain. Le territoire du chromosome X, souvent globulaire, est localise dans la moitie apicale du noyau alors que celui du chromosome 13, à forme globulaire ou allongée, ne présente pas de position préférentielle. Cette organisation spécifique du noyau du spermatozoïde humain pourrait avoir des conséquences sur les fonctions du spermatozoïde avant, durant et après la fécondation. Le spermatozoïde est le produit final de la spermatogenèse, processus incluant des divisions mitotiques puis méiotiques, suivies d'une phase de maturation sans division, ou spermatogenèse. La spermatogenèse est la phase de maturation post-méiotique de la spermatide ronde dont le noyau s'allonge puis se condense pour donner le spermatozoïde. Au cours de l'élongation de la spermatide, les histones somatiques sont remplacées par des protéines fortement basiques, les protéines de transition puis les protamines qui sont les nucléoprotéines majeures du spermatozoïde. Nous avons essaye d'éclaircir le rôle de l'acétylation des histones dans ce processus de remodelage chromatinien post-méiotique chez la souris, par une approche in situ utilisant l'immunohistochimie et l'immunofluorescence. Les histones CUR H2a, H2b, H3, et H4 se trouvent sous leurs formes acétylées dans les spermatides en élongation avant leur remplacement par les protéines de transition. L'analyse 3D de H4 acétylée révèle une distribution spatiale de cette histone évoluant au cours de l'élongation de la spermatide : d'abord homogène dans tout le volume nucléaire, elle devient plus hétérogène au fur et à mesure du processus d'élongation. Enfin, H4 acétylée se localise dans la partie caudale du noyau en fin d'élongation, avant de disparaitre dans la spermatide en condensation. C'est la première fois qu'une séquence spatiale d'événements est mise en évidence au cours du remodelage chromatinien post-méiotique

Ma thèse a visé à comprendre comment la cellule germinale femelle, ou ovocyte, reprend la division méiotique. Dans tout le règne animal, l’ovocyte est bloqué en prophase de première division méiotique et reprend la division au moment de l’ovulation, sous l’effet d’un signal externe, la progestérone chez le xénope. Cette hormone déclenche une voie de signalisation qui aboutit après 3 à 5 heures à l’activation de la kinase Cdk1. Les premières molécules activées de Cdk1 déclenchent une boucle d’auto-amplification permettant son activation totale et l’entrée en division. Cette boucle repose sur des phosphorylations catalysées par Cdk1 et ne fonctionne que si la phosphatase qui contrecarre son activité, PP2A-B55δ, est inhibée. Cette inhibition dépend de la protéine Arpp19, un inhibiteur spécifique de PP2A-B55δ quand elle est phosphorylée sur la S67 par la kinase Greatwall. Arpp19 a un second rôle lors de la reprise de la méiose. Chez tous les vertébrés, l’arrêt en prophase est maintenu par une forte activité de PKA. Chez le xénope, Arpp19 est phosphorylée par PKA sur un résidu distinct de celui ciblé par Greatwall, la S109. En réponse à la progestérone, l’inhibition de PKA provoque la déphosphorylation d’Arpp19, ce qui permet d'enclencher la voie de signalisation conduisant à l'activation de Cdk1. Une phosphatase est donc requise pour déphosphoryler Arpp19 sur S109 et lever le verrou exercé sur l'activation de Cdk1 en prophase. Mon travail a visé à élucider l’identité moléculaire de cette phosphatase inconnue. Par des approches de biochimie et protéomique, j’ai identifié cette phosphatase comme étant PP2A-B55δ. Par des approches fonctionnelles dans des extraits acellulaires et des ovocytes, j’ai établi que PP2A-B55δ est active en prophase. La phosphorylation d’Arpp19 sur la S109 dépend d'une balance entre les activités de PKA et PP2A-B55δ, en faveur de la kinase. En réponse à la progestérone, l’activité de PP2A-B55δ n’est pas affectée et l’inhibition de PKA suffit à la déphosphorylation d’Arpp19. PP2A-B55δ orchestre donc la levée de l’arrêt en prophase et l'entrée en phase M en agissant à deux périodes et sur deux sites distincts d’Arpp19, respectivement ciblés par PKA et Greatwall
My thesis aimed at understanding how the female germ cell, or oocyte, resume meiotic divisions. In the animal kingdom, the oocyte is blocked in prophase of the first meiotic division and resumes the division at time of ovulation, in response to an external signal, progesterone in Xenopus. This hormone triggers a signalling pathway that leads to the activation of the Cdk1 kinase after 3 to 5 hours. The first activated molecules of Cdk1 trigger a self-amplification loop allowing its total activation and division. This loop is based on phosphorylations catalyzed by Cdk1 and depends on the inhibition of the phosphatase that antagonizes Cdk1 activity, PP2A-B55δ. This inhibition depends on the protein Arpp19, a specific inhibitor of PP2A-B55δ when phosphorylated at S67 by Greatwall kinase. Arpp19 has a second role during meiosis resumption. In all vertebrates, the prophase arrest is maintained by high PKA activity. In Xenopus, Arpp19 is phosphorylated by PKA on a residue distinct from Greatwall target, S109. In response to progesterone, the inhibition of PKA induces Arpp19 dephosphorylation, which activates the signalling pathway leading to Cdk1 activation. A phosphatase is therefore required to dephosphorylate Arpp19 at S109 and to unlock the Cdk1 activation pathway. My work aimed at elucidating the molecular identity of this unknown phosphatase. Through biochemical and proteomic approaches, I have identified this phosphatase as PP2A-B55δ. By functional approaches in acellular extracts and oocytes, I have established that PP2A-B55δ is active in prophase. Arpp19 phosphorylation at S109 depends on a balance between PKA and PP2A-B55δ activities, in favor of the kinase. In response to progesterone, PP2A-B55δ activity is not affected and PKA inhibition is sufficient for Arpp19 dephosphorylation. PP2A-B55δ therefore orchestrates the release of the prophase arrest and the entry into M-phase by acting at two different periods and at two distinct residues in Arpp19, respectively facing PKA and Greatwall

Les divisions méiotiques chez les femelles sont asymétriques et conduisent à l’obtention de petits globules polaires et d’un grand ovocyte contenant la majorité des réserves nécessaires au futur développement embryonnaire. Dans l’ovocyte de souris, l’asymétrie de la première division méiotique est assurée par la migration du fuseau de division du centre de l’ovocyte vers le cortex. En général, le positionnement du fuseau dépend des interactions entres les microtubules astraux et le cortex. L’ovocyte de souris est acentriolaire et dépourvu de vrais microtubules astraux. Dans ce modèle, les microfilaments d’actine nucléés par la Formine-2 assurent la migration du fuseau en méiose I. J’ai démontré que la Formin-2 nuclée un réseau cytoplasmique de filaments d’actine. Ce réseau est très dynamique et sa densité est remodelée durant la maturation méiotique. Ces changements de densité sont en corrélation avec la régulation de la Formine-2. Altérer la régulation de la Formine-2 empêche la migration du fuseau induisant la perte de l’asymétrie de la division.

Ma thèse a porté sur le rôle d’ARPP19, une protéine qui est au cœur du mécanisme de reprise de la méiose des ovocytes. Chez tous les animaux, la méiose des ovocytes s’interrompt en prophase I. Ce long arrêt est mis à profit par l’ovocyte qui accumule des molécules nutritives et informatives utilisées lors de l’embryogenèse. L’arrêt en prophase est dû au maintien sous une forme inactive du MPF (M-phase Promoting Factor). Ce complexe, formé de la kinase Cdk1 et de la Cycline B, est le moteur de la division des cellules eucaryotes. Chez les vertébrés, une activité élevée de la kinase PKA (Protéine Kinase dépendant de l’AMPc) empêche l’activation du MPF, ce qui maintient le blocage en prophase de l’ovocyte. Un stimulus hormonal provoque la levée de ce blocage et la reprise de la méiose. Chez les vertébrés, l’un des premiers évènements induits par cette stimulation est l’inactivation de PKA, ce qui enclenche une voie de signalisation aboutissant à l’activation du MPF. Ma thèse a porté sur les mécanismes permettant à PKA de contrôler le MPF. Chez le Xénope, l’un des substrats-clés de PKA est ARPP19, phosphorylée par PKA sur la sérine 109 (S109). Suite à l’inactivation de PKA par la stimulation hormonale, ARPP19 est déphosphorylé par la phosphatase PP2A-B55 et permet indirectement l’activation du MPF. Au moment où le MPF s’active, ARPP19 remplit une autre fonction. Le MPF active la kinase Greatwall (Gwl) qui phosphoryle ARPP19 sur la sérine 67 (S67), le convertissant en un inhibiteur de PP2A-B55. Cette inhibition est essentielle pour la division car cette phosphatase s’oppose au MPF en déphosphorylant ses substrats. Le contrôle négatif exercé par PKA sur le MPF n’est pas conservé chez tous les métazoaires. De nombreuses espèces non-vertébrées présentent un mécanisme inversé : la levée du blocage en prophase ne dépend pas d’une inactivation, mais d’une activation de PKA, comme chez la méduse Clytia hemisphaerica. Or, ARPP19 est exprimé dans les ovocytes de cette espèce. La protéine devrait donc être phosphorylée par PKA dans l’ovocyte de Clytia. Comment ne bloque-t-elle pas l’activation du MPF? J’ai montré qu’ARPP19 de Clytia (ClyARPP19) possédait un site de phosphorylation par PKA. Néanmoins, ClyARPP19 est un mauvais substrat de PKA et n’est pas phosphorylé par cette kinase dans l’ovocyte. En outre, les mécanismes par lesquels il inhibe le MPF ne sont pas fonctionnels chez Clytia. Une double sécurité protège donc l’ovocyte de Clytia d’une inhibition du MPF par ARPP19. Mes résultats permettent d’établir un scénario évolutif quant au contrôle négatif exercé par PKA sur la reprise de la méiose chez les vertébrés. Contrairement au contrôle d’ARPP19 par Gwl, retrouvé chez tous les eucaryotes, le site de phosphorylation d’ARPP19 par PKA apparaît chez les métazoaires, chez qui il est conservé. Mais il n’est utilisé comme régulateur de la reprise de la méiose que chez les vertébrés, grâce à un accroissement de son potentiel de phosphorylation par PKA. J’ai ensuite étudié les mécanismes permettant à la forme phosphorylée sur S109 d’ARPP19 d’inhiber le MPF. J’ai découvert qu’en prophase, ARPP19 est faiblement phosphorylé sur la S67 par une activité basale de Gwl. Or, il est critique de limiter cette phosphorylation pour éviter une reprise spontanée de la méiose. J’ai montré que deux types de régulation limitaient cette phosphorylation. Le premier est la phosphorylation de la S109 par PKA, le second est une régulation intramoléculaire reposant sur deux domaines de la partie C-terminale d’ARPP19. Mes travaux conduisent à une nouvelle vision de l’arrêt en prophase, un état métastable où ARPP19 est à la fois phosphorylé sur S109 (majeure) et S67 (mineure). Ils permettent de dégager un rôle négatif de la phosphorylation d’ARPP19 par PKA sur l’activation du MPF : empêcher la phosphorylation par Gwl. La déphosphorylation de la S109 en réponse à l’hormone génère une protéine ARPP19 accessible à Gwl, l’un des éléments nécessaires à l’activation du MPF
My thesis focused on the role of ARPP19, a protein at the center of meiosis resumption in oocytes. In all animals, oocyte meiosis is interrupted during prophase I. This long pause is used by the oocyte to accumulate nutritive and informative molecules that will serve during embryogenesis. The prophase arrest is due to an inactive form of MPF (M-phase Promoting Factor). This complex, made up of the Cdk1 kinase and Cyclin B, is the driving force behind eukaryotic cell division. In vertebrates, high levels of cAMP-dependent protein kinase (PKA) activity prevent MPF activation, keeping the oocyte blocked in prophase. A hormonal stimulus releases the prophase arrest and promotes meiosis resumption. In vertebrates, one of the first events induced by this stimulation is the inactivation of PKA, triggering a signaling pathway leading to MPF activation. My thesis focused on the mechanisms by which PKA controls MPF. In Xenopus, one of PKA key substrates is ARPP19, phosphorylated by PKA on serine 109 (S109). Following inactivation of PKA by the hormonal stimulation, ARPP19 is dephosphorylated by the PP2A-B55 phosphatase, indirectly enabling MPF activation. When MPF activates, ARPP19 undertakes another function. MPF activates the Greatwall kinase (Gwl), which phosphorylates ARPP19 on serine 67 (S67), converting it into an inhibitor of PP2A-B55. This inhibition is essential for division, as this phosphatase opposes MPF by dephosphorylating its substrates. The negative control exerted by PKA on MPF is not conserved in all metazoans. Many non-vertebrate species show an inverted mechanism: the release of the prophase block does not depend on PKA inactivation, but on its activation, as in the jellyfish Clytia hemisphaerica. ARPP19 is expressed in the oocytes of this species. The protein should therefore be phosphorylated by PKA in the Clytia oocyte. Why does it not block MPF activation? I have shown that Clytia ARPP19 (ClyARPP19) has a PKA phosphorylation site. However, ClyARPP19 is a poor substrate of PKA and is not phosphorylated by this kinase in the oocyte. Moreover, the mechanisms by which it inhibits MPF are not functional in Clytia. This double security level therefore protects Clytia oocyte from MPF inhibition by ARPP19. My results provide an evolutionary scenario for the negative control exerted by PKA on the resumption of meiosis in vertebrates. Unlike the control of ARPP19 by Gwl, conserved in all eukaryotes, the phosphorylation site of ARPP19 by PKA appears in metazoans, where it is conserved. But it is used as a regulator of meiosis resumption only in vertebrates, thanks to an increase of its phosphorylation potential by PKA. I then investigated the mechanisms by which the phosphorylated form of ARPP19 on S109 inhibits MPF. I discovered that in prophase, ARPP19 is weakly phosphorylated on S67 by a basal Gwl activity. Limiting this phosphorylation is critical to prevent spontaneous resumption of meiosis. I have shown that two types of regulation limit this phosphorylation by Gwl. The first is S109 phosphorylation by PKA, the second is an intramolecular regulation based on two domains in the C-terminal part of ARPP19. My work leads to a new vision of the prophase arrest, a metastable state in which ARPP19 is phosphorylated on both S109 (major) and S67 (minor). They provide insight into one negative role of PKA-phosphorylated ARPP19 on MPF activation: preventing phosphorylation by Gwl. Dephosphorylation of S109 in response to the hormone generates an ARPP19 protein accessible to Gwl, one of the key elements required for MPF activation

Avant d'etre en mesure de se diviser, chaque cellule eucaryote passe par un certain nombre de phases dont la succession constitue le cycle cellulaire. La progression coordonnee de ces phases est gouvernee par la formation et l'activation de complexes constitues d'une sous-unite regulatrice, une cycline (a, b, c, d, e, h), et d'une sous-unite catalytique, cdk (pour cyclin dependent kinase), possedant une activite kinase (cdk1-7). Nous nous sommes plus particulierement interesses a la regulation du complexe cycline b/cdc2 au cours de la meiose i de l'ovocyte d'etoile de mer. L'activite kinase du complexe cycline b/cdc2 est regulee grace au controle de deux parametres: la regulation des modifications post-traductionnelles et la regulation de la synthese et de la degradation des cyclines. L'etude de cette derniere nous a permis de montrer que la kinase cycline b/cdc2 doit etre active pendant la prometaphase et la metaphase: la cellule fait en sorte de maintenir un niveau d'activite suffisant pour assurer une metaphase normale, en particulier par la synthese de cycline. Par le jeu de la synthese et de la degradation de la cycline, egalement des eventuelles modifications post-traductionnelles des deux constituants de mpf, la cellule adapte l'activite kinase aux exigences de chaque etape du cycle cellulaire. D'autre part, pour etre efficace la kinase mitotique doit etre non seulement active mais aussi correctement localisee. D'autre part, nous avons etudie le mecanisme d'amplification de mpf. En effet, la phase d'initiation de mpf correspond a un changement du statut du cytoplasme qui devient apte a amplifier le mpf, et ce changement n'est pas l'apparition d'une petite quantite de mpf. Il est provoque par le transfert de cytoplasme actif, grace en particulier a un facteur nucleaire en absence duquel la kinase injectee est aussitot inhibee

L’objectif de cette thèse a été de comprendre deux caractéristiques majeures des divisions méiotiques chez la femelle: le blocage en prophase de 1ère division méiotique qui permet à l’ovocyte d’accumuler des réserves énergétiques et des déterminants nécessaires au développement embryonnaire ; et l’absence de phase-S entre les deux divisions méiotiques ce qui permet de former des cellules haploïdes aptes à la fécondation. Pour cela, j’ai choisi comme modèle d’étude l’ovocyte de Xénope qui permet de suivre ces processus in vitro en réponse à la progestérone. L’ovocyte subit les deux divisions méiotiques grâce à l’activation du facteur universel de la division cellulaire, le MPF, et se bloque en métaphase de 2ème division méiotique dans l’attente d’être fécondé. Chez tous les vertébrés, le 1er arrêt en prophase dépend de l’activité de la protéine kinase dépendante de l’AMPc, PKA, dont l’inactivation est nécessaire pour la reprise de la méiose. Le substrat de PKA dans l’ovocyte était resté inconnu. Nous avons découvert que la protéine Arpp19, jusqu’alors connue pour son rôle positif dans l’activation du MPF, est phosphorylée par PKA de cette phosphorylation bloque l’activation du MPF nécessaire pour la levée du blocage en prophase. ARPP19 possède donc un double rôle, le 1er exercé comme substrat de PKA et responsable de l’arrêt en prophase, le second dans l’activation du MPF suite à un changement dans sa phosphorylation. Dans un second temps, nous avons étudié la protéine Cdc6, un acteur majeur de la réplication de l’ADN. Absente en prophase, Cdc6 s’accumule entre les deux divisions méiotiques ce qui permet à l’ovocyte d’acquérir la compétence à répliquer l’ADN. Cette compétence ne s’exprime pas ce qui permet de réduire de moitié la ploïdie. Nous avons montré que Cdc6 est un inhibiteur puissant du MPF capable de bloquer les divisions méiotiques et d’induire la réplication de l’ADN. Pour éviter ces effets délétères l’accumulation de Cdc6 est strictement régulée lors des deux divisions méiotiques, ce qui est absolument requis pour assurer l’enchainement des deux divisions cellulaires sans phase-S intercalaire
The goal of my PhD project was to understand two main features of the female meiotic division: the arrest in prophase of the 1st meiotic division that allows the accumulation of nutrients and determinants necessary for the embryonic cell cycles; and the absence of S-phase between the two meiotic divisions in order to produce haploid gametes. For this purpose, I studied Xenopus oocytes, a powerful model system that allows the biochemical analysis of these two processes in vitro. In ovary, oocytes are arrested in prophase I and resume meiosis in response to progesterone. The oocytes then proceed through the 1st and the 2nd meiotic divisions and halt at metaphase II, awaiting for fertilization. These two consecutive divisions are controlled by two waves of Cdk1 activation, the universal factor responsible for the entry into mitosis. I analysed the mechanisms responsible for arresting the oocyte in prophase I. In all vertebrates, this arrest depends on a high activity of the cAMP-dependent protein kinase, PKA, whose downregulation is required for the release of the prophase block. The substrate of PKA had never been identified up to date. I discovered that the small protein Arpp19, already known for positively regulating entry into M-phase, is phosphorylated by PKA in prophase I and is dephosphorylated upon progesterone addition, an event required for Cdk1 activation. Hence, Arpp19 has a dual function, responsible of the prophase arrest as a PKA substrate, and then converted into an activator of Cdk1 by changes of its phosphorylation pattern. The second part of my thesis has been dedicated to understanding the role and the regulation of the Cdc6 protein during meiotic divisions. This protein is essential for DNA replication in somatic cells. It is accumulated between the two oocyte meiotic divisions and restores the competence to replicate DNA in oocyte. However, this competence is repressed before fertilization, allowing formation of haploid cells. I found that the accumulation of Cdc6 is tightly controlled during meiotic maturation by the Cyclin B accumulation and the Mos/MAPK pathway. I further demonstrated that Cdc6 is a strong inhibitor of Cdk1 in Xenopus oocytes and that the timely accumulation of Cdc6 is required to coordinate the two meiotic divisions with no intercaling S-phase