Littérature scientifique sur le sujet « Deidrogenasi »

L'iperossaluria primaria di tipo 1 è causata da mutazioni nel gene codificante per l'enzima L-alanina-gliossilato amino transferasi (AGT), che è espresso nel fegato. La trasmissione avviene con modalità autosomica recessiva: i genitori sono portatori sani della mutazione (e spesso non sanno di averla, soprattutto se non ci sono familiari affetti), mentre ciascun figlio della coppia ha il 25% di probabilità di essere malato. Esiste anche un secondo tipo della malattia (iperossaluria primaria di tipo 2), causato dalla carenza di un altro enzima, la D-glicerato deidrogenasi, e un terzo tipo (iperossaluria di tipo 3), identificato piú di recente e causato dal difetto del gene DHDPSL. Sulla base dell'osservazione clinica ed eventualmente della storia familiare, la diagnosi di iperossaluria primaria può essere formulata grazie a test di laboratorio (misurazione dell'ossalato di calcio nelle urine e nel sangue) e analisi genetica, con ricerca delle mutazioni nel gene coinvolto. La diagnosi e il trattamento precoci sono in grado di ridurre il rischio di evoluzione verso l'IRC e verso complicanze gravi come l'ossalosi sistemica. L'articolo riguarda un caso clinico che ha coinvolto il gruppo infermieristico che ha modificato l'approccio e la presa in carico di un adolescente in un “mondo” di adulti. (sian) (nursing)

Si segnala la particolare evoluzione neuroradiologica di una piccola paziente, che ha attualmente a.2 e m. 10, e che a seguito di un coma metabolico con stato di male epilettico, iperlattacidemia, epatopatia moderata, anomalie lente sull'EEGramma, ha cominciato all'età di 3 mesi ad eseguire accertamenti neuroradiologici. la TC a quell'età mostrò solo una lievissima atrofia cerebrale con ipodensità irregolare della sostanza bianca. All'età di 6 mesi, allorquando fu posta la diagnosi di sindrome di Alpers, la RM metteva in evidenza un quadro di gravissima atrofia degli emisferi cerebrali, sia corticale che sottocorticale, e, in minor misura, di quelli cerebellari, con relativo risparmio dei nuclei della base e del tronco cerebrale. L'evoluzione atrofica era stata talmente rapida da indurre in tre mesi anche la formazione di due voluminosi ematomi sottodurali. La RM fu decisiva per confermare il sospetto diagnostico. Da allora, la condizione clinica neurologica e metabolica della paziente, in trattamento con dosi elevate di carnitina e vit. Bl, oltre che con anticomiziali, si è stabilizzata. Anche il quadro neuroradiologico si mantiene sostanzialmente invariato, fatta eccezione per il riassorbimento dei due ematomi sottodurali. Le indagini metaboliche approfondite hanno permesso di dimostrare un difetto di attivazione del complesso piruvato-deidrogenasi. La RM si dimostra esame indispensabile per la diagnosi di questa rara malattia, e superiore alla TC. A nostra conoscenza è questo il primo studio neuroradiologico prospettico della sindrome di Alpers.

Estudou-se, mediante polimorfismo enzimático em gel de poliacrilamida, a variabilidade genética das espécies de laranja-doce (Citrus sinensis); laranja-azeda (C. aurantium); tangerinas clementina (C. clementina), sunki (C. sunki), cleópatra (C. reshni) e poncã (C. rsticulata); lima-da-pérsia (C. limettioides); limão-galego (C. aurantifolia); limão-cravo (C. limonia) e trifoliata (Poncirus trifoliata). Extratos de folhas foram analisados para as isoenzimas de malato deidrogenase (MDH), enzima málica (ME), leucino amino peptidase (LAP), glutamato oxaloacetato transaminase (GOT), fosfoglucoisomerase (PGI), fosfoglucomutase (PGM) e isocitrato deidrogenase (IDH). Verificou-se grande variabilidade genética interespecífica, porém nenhuma entre os cultivares de laranja-doce. Foram encontradas algumas aloenzimas, além das referidas pela literatura em gel de amido, como aquelas de uma região próxima ao loco conhecido por Pgm-1, responsável por proteínas monoméricas. Este sistema, denominado PGM, revelou a maior diferenciação entre as espécies, tendo apresentado duas regiões distintas com 9 alelos. No sistema MDH, foram considerados dois locas codificando para proteínas diméricas com 7 alelos; no ME, um loco com 3 alelos; no LAP, possivelmente dois locos responsáveis por proteínas monoméricas com 4 alelos; no GOT, dois focos com 7 alelos; no PGI, um loco com 3 alelos e no IDH, um loco com 4 alelos.

Analisou-se separadamente amêndoas e embriões de cocos de babaçu, (Orbignya martiana) para estudar algumas de suas enzimas e vitaminas tendo em vista seu maior consumo na alimentação. Detetou-se sistematicamente duas frações protéicas fortemente coradas e uma que aparece em algumas amostras e não aparece em outras. Das enzimas constatou-se três leucino-aminoptidase málicas (MDH1, MDH2, MDH3) e duas deidrogenase do glicerol -3-fosfato (GPD). Quanto às vitaminas constatou-se existir em 100 gramas de material: no embrião 0.100mg de riboflovina, 3,4 de vit. C e 30 de alfa-tocoferol; a amêndoa tem pouco menos da metade das vitaminas B1 e C.

O corpo lúteo (CL) é uma estrutura endócrina transitória formada por células luteais esteroidogênicas pequenas (SLC) e grandes (LLC), que associadas aos fibroblastos e a uma ampla rede de capilares constituem uma estrutura especializada na síntese de progesterona (P4). De maneira geral, para a síntese de P4 nas células luteais esteroidogênicas, o colesterol se liga a receptores específicos na membrana celular e é transportado ao citosol. Posteriormente, o colesterol dirige-se a membrana mitocondrial interna e por ação da enzima P450scc transforma-se em pregnenolona. No retículo endoplasmático liso a pregnenolona é convertida a P4 pela enzima 3²-hidroxiesteróide deidrogenase (3²-HSD). A proteína de regulação aguda da esteroidogênese (StAR), o receptor benzodiazepínico tipo periférico (PBR) e a endozepina participam no transporte do colesterol para os diferentes compartimentos mitocondriais. Assim, supõe-se que a capacidade de síntese de P4 no CL esteja relacionada à concentração celular de receptores que captam o colesterol, às enzimas P450scc e 3²-HSD, e às proteínas celulares transportadoras de colesterol. Na espécie bovina, as LLC são responsáveis por mais de 80% da produção deste hormônio no CL. A menor concentração de proteínas transportadoras de colesterol na mitocôndria parecem limitar a síntese de P4 nas SLC. A P4 favorece um meio ambiente uterino apropriado para o desenvolvimento do(s) concepto(s), dependendo da espécie. Na maioria das espécies, a ausência da fertilização ou a incapacidade do concepto em sinalizar sua existência no útero estabelecem a luteólise. Tal evento fisiológico caracteriza-se pela regressão funcional e estrutural do(s) corpo(s) lúteo(s). Para o estabelecimento e a manutenção da prenhez torna-se necessário o bloqueio da luteólise por mecanismos que diferem entre as espécies. Em primatas e equídeos esse reconhecimento ocorre pela secreção de gonadotrofinas específicas e em ruminantes pela presença de fatores anti-luteolíticos. Esta revisão tem como objetivo caracterizar os mecanisnos endócrinos e moleculares envolvidos na formação do corpo lúteo e na luteólise.

La ferroptosi è una forma di morte cellulare regolata, dovuta alla perossidazione lipidica dipendente dal ferro. La ferroptosi viene innescata dalla mancata attività dell’enzima glutathione perossidasi 4 (GPx4), che catalizza la riduzione glutatione (GSH)-dipendente degli idroperossidi di membrana ad alcoli corrispondenti. Oltre all’inattivazione di GPx4, la ferroptosi avviene quando sono soddisfatte altre condizioni: -la presenza del metabolismo aerobico che porta alla continua formazione di tracce di idroperossidi a partire dai fosfolipidi contenenti acidi grassi polinsaturi; - la disponibilità di ferro ridotto dal pool labile di ferro. In accordo con il ruolo critico delle tracce di LOOH, di recente abbiamo proposto che la ferroptosi possa essere dovuta alla perdita del controllo omeostatico tra l’ambiente ossidativo dovuto al metabolismo aerobico e l’attività di GPx4. L’ipotesi di lavoro è che O2•- derivante dal metabolismo aerobico sia responsabile delle tracce di LOOH che iniziano la perossidazione lipidica e di conseguenza la ferroptosi. Questo lavoro è stato volto alla ricerca della relazione tra metabolismo aerobico mitocondriale e ferroptosi dovuta a deplezione di GSH, con un focus sul sito di produzione ed il meccanismo reazione che porta alla formazione di tracce di PL-OOH dalle quali il ferro innesca la perossidazione lipidica se l’attività di GPx4 è insufficiente. Nel nostro modello, non abbiamo rilevato il coinvolgimento della catena respiratoria ma abbiamo osservato chela piruvato deidrogenasi sostiene la ferroptosi. Silenziando alternativamente la subunità E1 o E3 abbiamo stabilito che la fonte dell’anione superossido è data dall’autossidazione della diidrolipoamide. A questo riguardo, abbiamo osservato che la deplezione di GSH attiva la produzoine di anione superossido attraverso l’inibizione della chinasi (PDK) che inibisce la piruvato deidrogenasi. Infine abbiamo dimostrato che l’autofagia svolge un ruolo nel mediare la ferroptosi dovuta a deplezione di GPx4.
Ferroptosis is a form of regulated cell death operated by iron-dependent lipid peroxidation. Ferroptosis is primed by the missing or insufficient activity of the Glutathione Seleno-Peroxidase 4 (GPx4), which catalyzes the glutathione (GSH)-dependent reduction of lipid hydroperoxides to the corresponding alcohols. Besides GPx4 inactivation, ferroptosis occurs when other conditions are satisfied: -oxygen metabolism leading to the continuous formation of traces of LOOH from phospholipid-containing polyunsaturated fatty acids; - availability of ferrous iron from the labile iron pool. Consistently with the critical role of the traces of LOOH, we recently proposed that ferroptosis follows the loss of homeostatic control between the oxidative challenge posed by aerobic metabolism and GPx4 activity. The working hypothesis, supported by acknowledged chemical mechanisms, was that O2•- arising from aerobic metabolism accounts for the formation of the tiny amounts of LOOH sparking iron-dependent LPO and thus ferroptosis. This work aimed to shed light on the relationship between aerobic mitochondrial metabolism and ferroptosis induced by GSH depletion, focusing on the site of production and the mechanism of reactions leading to the indispensable formation of traces amounts PL-OOH from which iron initiates LPO when GPx4 activity is insufficient. In our cell model, we failed to detect a role of respiratory chain. We observed instead that the pyruvate dehydrogenase complex supports ferroptosis. By silencing either the E1 or the E3 subunit of the pyruvate dehydrogenase complex, the autoxidation of dihydrolipoamide emerges as the source of superoxide. In this respect, we observed that GSH depletion activates superoxide production, through the inhibition of the specific kinase that inhibits pyruvate dehydrogenase. Finally, we observed the contribution of autophagy in mediating ferroptosis due to GSH depletion.

L’SSADH è un enzima mitocondriale NAD+-dipendente e svolge il suo ruolo principale nel catabolismo del GABA, il principale neurotrasmettitore inibitore del Sistema Nervoso Centrale (SNC), attraverso l’ossidazione del substrato succinico semialdeide (SSA) a succinato, il quale a sua volta entra nel ciclo di Krebs; l’SSA può essere anche convertito nell’acido 4-idrossibutirrico (GHB) da SSA reduttasi tessuto-specifiche. La deficienza completa di SSADH risulta nella 4-idrossibutirrico aciduria (4-HBA), una rara malattia autosomica recessiva del metabolismo umano. I malati di 4-HBA manifestano un’ampia variabilità di fenotipi clinici, che vanno dal ritardo psicomotorio a gravi difetti neurologici, dovuti agli effetti neurotossici dell’anormale accumulo di GABA e GHB nei tessuti e nei liquidi fisiologici. Studi recenti hanno rivelato un secondo ruolo dell’SSADH: essa è una delle due aldeidi deidrogenasi mitocondriali responsabili della detossificazione del 4-idrossi-2-nonenale (HNE). L’HNE è un’aldeide reattiva prodotta fisiologicamente in quantità relativamente elevate in seguito a perossiadazione lipidica. Livelli elevati di HNE nel Sistema Nervoso Centrale sono implicati nella patogenesi di numerose malattie neurodegenerative quali la malattia di Parkinson e di Alzheimer. Dallo studio di più di 50 famiglie deficienti di SSADH, abbiamo identificato numerose varianti patologiche. Abbiamo anche identificato varianti non patologiche nella regione codificante. Alcune di queste sono rare e altre mostrano frequenze polimorfiche come ad esempio la trasversione da G a C in posizione 106 e la transizione da C a T nelle posizioni 538 e 545. Tramite il sequenziamento del DNA di primati non umani, abbiamo identificato gli alleli ancestrali e derivati per ciascun tipo polimorfico e abbiamo identificato quelli che si trovano in modo specifico nella linea umana. Abbiamo osservato che per le posizioni c.106 e c.545 è presente sia l’allele ancestrale che quello derivato in quasi tutte le popolazioni umane e che l’allele ancestrale è quello più frequente; invece per la posizione c.538 l’allele derivato ha aumentato la propria frequenza e ora è quello più comune nella popolazione umana. Dal sequenziamento di famiglie e singoli individui abbiamo ottenuto 3 differenti aplotipi per i tre polimorfismi più comuni (c.106 G>C, c.538 C>T and c.545 C>T): l’aplotipo 1 (GCC), l’aplotipo 4 (GTC) e l’aplotipo 5 (CTT). Abbiamo effettuato trasfezioni transienti con i cDNA corrispondenti a questi tre aplotipi nella linea cellulare HEK293. L’attività enzimatica associata ai tre aplotipi ha mostrato la stessa efficienza sia con il substrato SSA che HNE. Esprimendo l’attività SSADH degli aplotipi 4 e 5 come percentuale dell’aplotipo 1 (100%), questi hanno prodotto un’attività pari rispettivamente al 62-72% e 23-25%, usando l’SSA e l’HNE come substrati. Per caratterizzare la regione del promotore del gene SSADH abbiamo analizzato circa 100 individui di differente origine geografica identificando così nove posizioni varianti e ricostruendo gli aplotipi e le loro frequenze. Gli aplotipi sono stati subclonati in un vettore d’espressione che avesse la luciferasi come gene reporter e sono stati chiamati BK31, BK45 e BK70; abbiamo ottenuto i seguenti risultati: il clone BK31 ha mostrato l’attività più alta (100%) mentre gli altri,BK45 and 70, hanno mostrato circa il 50% dell’attività rispetto a BK31. Altro scopo di questo studio è stato quello di confermare il secondo ruolo dell’SSADH verificando se conferisce protezione contro l’HNE e altri agenti ossidanti. Abbiamo ottenuto linee cellulari trasfettate stabilmente che overesprimessero l’aplotipo 1 della regione codificante del gene SSADH con differente dosaggio genico. Per ciascuna linea stabile abbiamo misurato l’espressione dell’RNA e l’attività enzimatica utilizzando sia il substrato SSA che l’HNE. Per ciascuna linea cellulare abbiamo osservato che la differenza nei livelli di espressione dell’RNA è in accordo con la differenza nell’attività enzimatica. Usando il saggio MTT come misura della capacità di sopravvivenza cellulare, abbiamo osservato che le linee cellulari con la più alta attività enzimatica mostravano anche una maggiore resistenza al trattamento con differenti dosaggi di HNE and H2O2, confermando che le cellule che overesprimono SSADH sono anche le più effficienti nella detossificazione. Abbiamo quindi concluso che sia la regione codificante che quella del promotore del gene SSADH presentano una variabilità molto elevata nella popolazione umana e che alcune varianti aplotipiche riducono l’attività enzimatica fino al 50% rispetto a quella dell’aplotipo più comune. Abbiamo inoltre confermato il secondo ruolo dell’SSADH nel proteggere le cellule dall’HNE e altri agenti ossidanti.
SSADH is a mitochondrial NAD+-dependent enzyme and serves its major role in the catabolism of the GABA, the most important inhibitory neurotransmitter of the Central Nervous System (CNS), by oxidation of the substrate succinic semialdehyde (SSA) to succinate which enters the Krebs cycle; SSA can be also converted into 4-hydroxybutyric acid (GHB) by tissue specific SSA reductases. Complete SSADH deficiency results in 4-hydroxybutyric aciduria, a rare recessive autosomal disorder of human metabolism. 4-HBA patients manifest a considerable variability of the clinical phenotype, ranging from mild psychomotor retardation to severe neurological defects, due to the neurotoxic effects of the abnormal accumulation of GABA and GHB in tissues and physiologic fluids. Recent studies reveal a second role of SSADH: it is one of the two mitochondrial aldehyde dehydrogenases responsible of detoxification of 4-hydroxy-2-nonenal (HNE). HNE is a reactive aldehyde physiologically produced in relatively large amounts from lipid peroxidation. Elevated levels of HNE in CNS are implicated in the pathogenesis of numerous neurodegenerative disorders such as Parkinson’s and Alzheimer’s diseases. By studying more than 50 SSADH deficient families, we identified several pathological variants. We also identified not pathological variants in the coding region. Some of the polymorphic variants are rare and some reach polymorphic frequencies: the G to C transversion in position c.106 and C to T transitions in positions c.538 and c.545. Resequencing non human primates DNA, we identified the ancestral and derived alleles for each polymorphic site and we identified those that occurred in the human specific lineage. We observed that both ancestral and derived alleles for the positions c.106 and c.545 are present in almost all human populations and that the ancestral allele is more frequent; whereas the derived allele at the position c.538 has increased its frequency and now represent the majority in human populations. Resequencing families and single subjects, we obtained 3 different haplotypes for the most common polymorphisms (c.106 G>C, c.538 C>T and c.545 C>T): haplotype 1 (GCC), haplotype 4 (GTC) and haplotype 5 (CTT). We performed transient transfections with cDNAs corresponding to these three haplotypes into HEK293 cell line. The enzyme activity associated with the three haplotypes showed the same efficiency when the substrate was SSA or HNE. When expressing SSADH activity of haplotypes 4 and 5 as percentage of haplotype 1 (100%), they produced 62-72% and 23% of the activity, respectively, using SSA and HNE as substrates. In order to characterized the SSADH promoter region we analysed about 100 subjects of different geographic origins; we identified nine variant positions and obtained the reconstruction of haplotypes and their frequencies. The haplotypes were subcloned in an expression vector with luciferase as reporter gene and named BK31, BK45 and BK70; we obtained the following results: clone BK31 showed the highest activity (100%) while the others, BK45 and 70, showed about 50% of the activity with respect to BK31. Another aim of this study was to confirm the second role of SSADH verifying whether it confers protection against HNE and other oxidants. We obtained stable transfected cell lines overexpressing haplotype 1 of SSADH coding region with different gene-dosage. For each stable cell line we measured RNA expression and enzyme activity, on both SSA and HNE as substrates. We observed that the difference in RNA expression levels parallels the difference in enzyme activities. Using MTT assay as a measure of cell viability, we observed that the stable transfected cell lines, showing the highest enzyme activity, showed also a significant increase of cell viability after treatment with different concentrations of HNE and H2O2, confirming a very high efficacy of SSADH overexpressing cells in detoxification. We concluded that both coding and promoter regions show a very high variability in the human population and some haplotype variant reduce the enzyme activity up to 50% of the most common ones. We confirmed the second role of ALDH5A in the protection against HNE and other oxidants.

Il lavoro svolto nel corso del mio dottorato ha avuto per oggetto lo studio dell’ inibizione della glicolisi aerobia (il principale processo metabolico utilizzato dalle cellule neoplastiche per produrre energia) ottenuta mediante il blocco dell’enzima lattato deidrogenasi (LDH). La mia attività si è concentrata sulla possibilità di utilizzare questo approccio allo scopo di migliorare l’efficacia della terapia antitumorale, valutandone gli effetti su colture di carcinoma epatocellulare umano Inizialmente, per valutare gli effetti della inibizione della LDH, è stato usato l’acido ossamico ( OXA). Questo composto è l’unico inibitore noto specifico per LDH ; è una molecola non tossica in vivo, ma attiva a concentrazioni troppo elevate per consentirne un uso terapeutico. Un importante risultato ottenuto è stata la dimostrazione che l’ inibizione della LDH ottenuta con OXA non è solo in grado di innescare una risposta di morte nelle cellule trattate, ma, associata alla somministrazione di sorafenib, aumenta fortemente l’efficacia di questo farmaco, determinando un effetto di sinergismo. Questo forte effetto di potenziamento dell’azione del farmaco è stato spiegato con la dimostrazione che il sorafenib ha la capacità di inibire il consumo di ossigeno delle cellule trattate, rendendole più dipendenti dalla glicolisi. Grazie alla collaborazione con il Dipartimento di Scienze Farmaceutiche il nostro gruppo di ricerca è arrivato alla identificazione di un composto (galloflavina) che inibisce la LDH con una efficienza molto maggiore di OXA. I risultati preliminari ottenuti sulle cellule di epatocarcinoma suggeriscono che la galloflavina potrebbe essere un composto promettente nel campo degli inibitori metabolici tumorali e inducono a una sua valutazione più approfondita come potenziale farmaco antineoplastico.
The aim of this work was to study the inhibition of aerobic glycolysis (the main metabolic pathway used by cancer cells to produce energy) achieved by blocking the enzyme lactate dehydrogenase (LDH). My activity has focused on the possibility of using this approach in order to improve the efficacy of anticancer therapy, evaluating its effects on cultured human hepatocellular carcinoma. In order to evaluate the effects of LDH inhibition, in a first set of experiments, we used oxamic acid (OXA). This compound is the only known specific inhibitor of LDH; it is a non-toxic molecule in vivo, but it is active at too high concentrations to allow its therapeutic use. An important result was the demonstration that LDH inhibition achieved by OXA not only triggers cell death signals but, when combined with the administration of sorafenib, also greatly increases the efficacy of this drug, leading to a synergistic effect. This strong potentiating effect of the drug action has been explained with the demonstration that sorafenib has the ability to inhibit the oxygen consumption of the treated cells, making them more dependent on glycolysis for ATP generation. In collaboration with the Department of Pharmaceutical Sciences our research group has identified a compound (galloflavin) that inhibits LDH with much higher efficacy than OXA. To our knowledge, inhibition of LDH is the only biochemical effect described for galloflavin. According to the results obtained on hepatocarcinoma cultured cells, galloflavin might be a promising lead candidate in the field of tumor metabolic inhibitors, deserving a more exhaustive evaluation as a potential anticancer agent.

Il lavoro svolto nel corso del mio dottorato ha avuto per oggetto lo studio dell’ inibizione della glicolisi aerobia (il principale processo metabolico utilizzato dalle cellule neoplastiche per produrre energia) ottenuta mediante il blocco dell’enzima lattato deidrogenasi (LDH). La mia attività si è concentrata sulla possibilità di utilizzare questo approccio allo scopo di migliorare l’efficacia della terapia antitumorale, valutandone gli effetti su colture di carcinoma epatocellulare umano Inizialmente, per valutare gli effetti della inibizione della LDH, è stato usato l’acido ossamico ( OXA). Questo composto è l’unico inibitore noto specifico per LDH ; è una molecola non tossica in vivo, ma attiva a concentrazioni troppo elevate per consentirne un uso terapeutico. Un importante risultato ottenuto è stata la dimostrazione che l’ inibizione della LDH ottenuta con OXA non è solo in grado di innescare una risposta di morte nelle cellule trattate, ma, associata alla somministrazione di sorafenib, aumenta fortemente l’efficacia di questo farmaco, determinando un effetto di sinergismo. Questo forte effetto di potenziamento dell’azione del farmaco è stato spiegato con la dimostrazione che il sorafenib ha la capacità di inibire il consumo di ossigeno delle cellule trattate, rendendole più dipendenti dalla glicolisi. Grazie alla collaborazione con il Dipartimento di Scienze Farmaceutiche il nostro gruppo di ricerca è arrivato alla identificazione di un composto (galloflavina) che inibisce la LDH con una efficienza molto maggiore di OXA. I risultati preliminari ottenuti sulle cellule di epatocarcinoma suggeriscono che la galloflavina potrebbe essere un composto promettente nel campo degli inibitori metabolici tumorali e inducono a una sua valutazione più approfondita come potenziale farmaco antineoplastico.
The aim of this work was to study the inhibition of aerobic glycolysis (the main metabolic pathway used by cancer cells to produce energy) achieved by blocking the enzyme lactate dehydrogenase (LDH). My activity has focused on the possibility of using this approach in order to improve the efficacy of anticancer therapy, evaluating its effects on cultured human hepatocellular carcinoma. In order to evaluate the effects of LDH inhibition, in a first set of experiments, we used oxamic acid (OXA). This compound is the only known specific inhibitor of LDH; it is a non-toxic molecule in vivo, but it is active at too high concentrations to allow its therapeutic use. An important result was the demonstration that LDH inhibition achieved by OXA not only triggers cell death signals but, when combined with the administration of sorafenib, also greatly increases the efficacy of this drug, leading to a synergistic effect. This strong potentiating effect of the drug action has been explained with the demonstration that sorafenib has the ability to inhibit the oxygen consumption of the treated cells, making them more dependent on glycolysis for ATP generation. In collaboration with the Department of Pharmaceutical Sciences our research group has identified a compound (galloflavin) that inhibits LDH with much higher efficacy than OXA. To our knowledge, inhibition of LDH is the only biochemical effect described for galloflavin. According to the results obtained on hepatocarcinoma cultured cells, galloflavin might be a promising lead candidate in the field of tumor metabolic inhibitors, deserving a more exhaustive evaluation as a potential anticancer agent.

The steroid hormone aldosterone, that normally controls the urinary Na+/K+ balance, and the osmolarity in the kidney, colon, salivary and swab glands epithelial tissues, exerts also many different effects, by binding to the mineralocorticoid receptor (MR). This receptor binds both aldosterone and glucocorticoids (mostly cortisol) with approximately the same affinity. However, cortisol has a 1000-fold higher concentration in plasma than that of aldosterone. In its classical target tissues, the mineralocorticoid selectivity mainly depends on the enzymatic activity of the type 2 11ß-hydroxysteroid dehydrogenase (11ß -HSD2), which converts cortisol into inactive cortisone, a corticosteroid that doesn't bind to the MR. The human MR gene (hMR) maps on chromosome 4 and contains 8 coding exons, with the start of the open reading frame (ORF) in the exon 2, which gives a 984 aminoacid product. The untranslated exon 1, which exists in the two isoforms 1? and 1ß, may give rise, by alternative splicing, to the hMR? and hMRß mRNA variants. The hMRß seems to be expressed only in some tissues and cell types. In 2001, two other hMR mRNA variants were described and they were called hMR?5 and hMR?5,6, because they lack the exon 5 or both exons 5 and 6, respectively. The hMR? transcript isoforms, first detected in the kidney, encode for a receptor which lack a fragment or the whole LBD domain, and they are both widely expressed among tissues, where they act as transcription factors that do not depend upon the ligand aldosterone. In this work, I first demonstrated, by RT-PCR assays, the expression of hMR gene in spermatozoa, even though, in these cells, it was less detectable than in human mononuclear leukocytes (LMN). These important data were confirmed by immunofluorescence, in which the hMR protein was detectable in the middle piece and in the tail of the spermatozoa. These results may provide useful insight into mechanisms that can modify sperm motility in the presence of aldosterone in the milieu. It is well known, from the scientific literature, that the activation of a number of genes, consequently to the specific MR-aldosterone interaction, may lead to the synthesis of some pro-inflammatory substances, in the heart, kidney, and in the vascular endothelium. In primary hyperaldosteronism, the presence of high aldosterone plasma levels may finally cause fibrosis in the same districts. The first steps of the inflammatory processes are characterized by a massive invasion of LMN, so, in the present research, I analyzed, by RT-PCR reactions, the expression of hMR gene variants in LMN from patients with Conn syndrome, and in both the normal adrenal cortex tissue, and in the adjacent adenoma producing aldosterone (APA) samples. I demonstrated a variable expression of the hMRß isoform, in comparison with the hMR? variant, which is homogeneously detectable in all the analyzed samples, and it was found that the hMRß mRNA was less expressed in the APA tissues, than in the normal adrenal tissue and in the LMN of the same patients. In the same samples, I also verified the co-expression of mRNA for both the type 1 and 2 11ß-hydroxysteroid dehydrogenase (11ß-HSD 1 and 2). A very interesting outcome from this step of my study was the demonstration of the 11ß -HSD type 2 expression in LMN of most of the patients with primary aldosteronism, while the same mRNA was not detectable in LMN from healthy volunteers. These important results, if they are confirmed in a significantly greater number of patients, would provide more information in order to predict the presence of a primary aldosteronism itself. In this work, I also analyzed, by RT-PCR, the expression of the above mentioned genes in five normal tissue samples from human larynx. Even in this case, the hMR?, hMRß and the 11ß-HSD type 2 mRNAs were all detectable in the larynx tissue, and so this can be considered as a novel tissue specifically responsive, in a genomic manner, to aldosterone by its interaction with MR. The meaning of this result will be investigate in the future. Many human diseases depend upon a number of important mutations in almost all the hMR exons, causing type I pseudo-hypoaldosteronism (PHA I), which mimics the absence of aldosterone, even if it is synthesized in a great amount. In the last period of my work, I investigated the hMR gene for mutations in each exon, in a family with PHA I, composed by a newborn, that was identified as the case-control, and their parents. Since no important nucleotide substitutions was revealed in the analyzed coding regions, this family is probably affected by the renal variant of the above mentioned diseases, where the mutations involve the gene encoding for the epithelial sodium channels subunits in the kidney.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde.
Ethylmalonic acid (EMA) accumulates in tissues and biological fluids of patients affected by short-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (SCADD) and ethylmalonic encephalopathy, illnesses characterized by neurological and muscular symptoms. Considering that the mechanisms responsible for the brain and skeletal muscle damage in these diseases are poorly known, in the present work we investigated the effects of acute EMA administration on oxidative stress parameters in cerebral cortex and skeletal muscle from 30-day-old rats. Animals received three subcutaneous injections of EMA (6 mol/g; 90 min interval between injections) and were killed 1 h after the last injection. Control animals received saline in the same volumes. EMA administration significantly increased thiobarbituric acid-reactive substances levels in cerebral cortex and skeletal muscle, indicating an increased lipid peroxidation. In addition, carbonyl content was increased in EMA-treated animal skeletal muscle when compared to the saline group. EMA administration also significantly increased DCFH oxidation and superoxide production (reactive species markers), and decreased glutathione peroxidase activity in cerebral cortex, while glutathione levels were decreased in skeletal muscle. The present results show that acute EMA administration elicits oxidative stress in rat brain and skeletal muscle, suggesting that oxidative damage may be involved in the pathophysiology of the brain and muscle symptoms found in patients affected by SCADD and ethylmalonic encephalopathy.
O ácido etilmalônico (EMA) se acumula em tecidos e fluidos biológicos de pacientes afetados pela deficiência da desidrogenase de acil-coenzima A de cadeia curta (SCADD) e pela encefalopatia etilmalônica (EE). Ambas as doenças caracterizam-se por sintomas neurológicos e musculares. O presente trabalho investigou os efeitos da administração aguda de EMA sobre parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral e músculo esquelético de ratos de 30 dias de vida. Os animais receberam três injeções subcutâneas de EMA (6 μmol/g; 90 minutos de intervalo entre as injeções) e foram eutanasiados 1 hora após a última injeção. Os animais do grupo controle receberam solução salina nos mesmos volumes. A administração de EMA aumentou significativamente os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico e o conteúdo de grupamentos carbonila em córtex cerebral e músculo esquelético, quando comparados ao grupo controle. A administração aguda de EMA também aumentou significativamente a oxidação de 2’,7’-diclorofluoresceína reduzida e a geração de ânion superóxido. Por outro lado, a atividade da enzima glutationa peroxidase em córtex cerebral foi inibida pela administração de EMA, em comparação ao grupo controle. Adicionalmente, os níveis de glutationa reduzidas encontraram-se diminuídos no músculo esquelético dos animais que receberam a administração aguda de EMA. Os resultados do presente estudo mostram que a administração aguda de EMA induz estresse oxidativo em córtex cerebral e músculo esquelético de ratos jovens, sugerindo que o dano oxidativo possa estar envolvido na fisiopatologia dos danos neurológicos e musculares encontradas em pacientes afetados por SCADD e EE.

I processi di produzione e consumo negli ecosistemi del suolo contribuiscono ai cicli biochimici globali di molti gas in tracce (CH4, CO, H2, N2O e NO) che sono rilevanti per la chimica atmosferica e il clima. Tali piccole molecole di gas svolgono ruoli diversi nel metabolismo dei microrganismi posti nel suolo che si basano su metalloenzimi specifici per la loro trasformazione. Tra questi, è stato dimostrato che i metalloenzimi a base di molibdeno sono cruciali in tale contesto. In particolare, è stato riportato che un molibdoenzima specifico è coinvolto nell'ossidazione della CO atmosferica. MoCu CO deidrogenasi (MoCu CODH) è un enzima presente nei carbossidobatteri aerobici, come Oligotropha carbossidovorans, che rappresentano uno dei componenti essenziali nel consumo biogeochimico di monossido di carbonio (CO). Essi infatti contribuiscono al mantenimento della concentrazione subtossica di CO nella bassa atmosfera elaborandone circa 2 × 108 tonnellate all'anno. Questa metalloproteina batterica catalizza l'ossidazione della CO a CO2, mentre può anche scindere H2 in due protoni e due elettroni. Tali reazioni vengono eseguite grazie a un sito attivo unico composto da due metalli, uno ione rame e uno molibdeno, legati tra loro tramite un atomo di zolfo. Nonostante siano stati condotti ampi studi teorici e sperimentali su questo enzima, diversi aspetti relativi alla sua reattività non sono stati ancora chiariti. Nella presente tesi ci siamo concentrati sulla descrizione in silico di MoCu CODH al fine di approfondire la comprensione dei meccanismi di reazione catalizzati dall'enzima. Per fare ciò, nel quadro della teoria del funzionale della densità (DFT), abbiamo applicato modelli di diverse dimensioni per ottenere una descrizione accurata del sistema. Nel contesto della catalisi dell'ossidazione della CO, abbiamo evidenziato che se un intermedio simile al tiocarbonato si forma lungo il percorso catalitico, non rappresenta una specie limitante la velocità nel panorama energetico enzimatico, a differenza di quanto proposto in base ai risultati di precedenti studi teorici. Inoltre, siamo stati in grado di suggerire un meccanismo catalitico alternativo per l'ossidazione della CO che coinvolge il ruolo diretto di una molecola d'acqua, attivata dal sito attivo circostante. Per quanto riguarda l'attività idrogenasica di MoCu CODH, sono stati presentati due meccanismi plausibili per la scissione di H2. Per la prima volta abbiamo suggerito che il sito attivo MoCu CODH possa essere visto come Frustrated Lewis Pairs (FLP) e abbiamo proposto un meccanismo tipo FLP per l'ossidazione del diidrogeno. In alternativa, un evento di protonazione, quale la protonazione del residuo di cisteina coordinata allo ione rame prima del legame di H2 al sito attivo, si è rivelato necessario per presentare un canale reattivo plausibile.
Production and consumption processes in soil ecosystems contribute to the global bio­chemical cycles of many trace gases (CH4, CO, H2, N2O and NO) that are relevant for atmospheric chemistry and climate. Such small gas molecules play different role into the metabolism of microorganisms placed in soil that rely on specific metalloen­zymes for their transformation. Among these, molybdenum-­based metalloenzymes were evidenced to be crucial in such context. In particular, a specific molybdoen­zyme was reported to be involved in atmospheric CO oxidation. MoCu CO dehy­drogenases (MoCu CODH) is an enzyme found in aerobic carboxido­bacteria, such as Oligotropha carboxidovorans which represent one of the essential components in the biogeochemical carbon monoxide (CO) consumption. In fact, they contribute to maintenance of sub­toxic concentration of CO in the lower atmosphere by processing approximately 2×108 tons of it annually. This bacterial metalloprotein catalyses the oxidation of CO to CO2, while it can also split H2 in two protons and two electrons. Such reactions are performed thanks to a unique active site composed of two metals, a copper ion and a molybdenum one, linked together through a sulphur atom. Despite extended theoretical and experimental studies had been carried out concerning this enzyme, several aspects related to its reactivity have not been unravelled.In the present thesis, we focused on the in silico description of MoCu CODH in order to deepen the understanding of the reaction mechanisms catalysed by the enzyme. To do so, in the framework of density functional theory (DFT), we applied models of different sizes to obtain an accurate description of the system. In the context of CO oxidation catalysis, we evidenced that if a previously proposed thiocarbonate ­like intermediate is formed along the catalytic path, it does not repre­sent a rate ­limiting species on the enzymatic energy landscape, differently from results of previous theoretical studies. Moreover, we were able to suggest an alternative cat­alytic mechanism for the oxidation of CO that involves the direct role of a water molecule, activated by the sourrounding active site. As for the MoCu CODH hydrogenase activity, two plausible mechanisms for the splitting of H2 were presented. For the first time we suggested that the MoCu CODH active site may be viewed as a Frustrated Lewis Pair (FLP), and we proposed a FLP­-like mechanism for oxidation of the dihydrogen. Alternatively, a protonation event–e.g. Cu­-bound cysteine residue protonation – prior to binding of H2 to the active site proved to be necessary to present a plausible reactive channel.

L'interesse per la modulazione del metaboloma della nicotinamide adenina dinucleotide (NAD) sta guadagnando interesse a causa del suo potenziale terapeutico in diverse patologie umane. La soppressione della via di recupero della nicotinamide da parte degli inibitori della nicotinamide fosforibosil transferasi (NAMPT), tuttavia, ha dato risultati inconcludenti nei pazienti neoplastici perché diverse vie metaboliche aggirano il blocco enzimatico convergendo direttamente sulla nicotinamide mononucleotide adenil transferasi (NMNAT) per la sintesi di NAD. Sfortunatamente, inibitori NMNAT-specifici non sono stati identificati. Qui, il nostro gruppo, riporta l'identificazione di Vacor come substrato metabolizzato dall'azione consecutiva di NAMPT e NMNAT2 nell'analogo del NAD, Vacor adenina dinucleotide (VAD). Ciò porta all'inibizione di entrambi gli enzimi, nonché delle deidrogenasi NAD-dipendenti: ciò causa una rapida deplezione del NAD, blocco della glicolisi, a cui conseguono mancanza di energia e morte per necrosi delle cellule cancerose che esprimono NMNAT2. Al contrario, la mancanza di espressione NMNAT2 conferisce completa resistenza a Vacor. Sorprendentemente, Vacor stimola la formazione di VAD e la soppressione della crescita in xenotrapianti di neuroblastoma e melanoma NMNAT2-positivi. I nostri dati mostrano un primo tentativo di sfruttare l'intero percorso di recupero della nicotinamide come strategia antimetabolica nel trattamento delle neoplasie. // Interest in the modulation of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) metabolome is gaining great momentum because of its therapeutic potential in different human disorders. Suppression of nicotinamide salvage by nicotinamide phosphoribosyl transferase (NAMPT) inhibitors, however, gave inconclusive results in neoplastic patients because several metabolic routes circumvent the enzymatic block converging directly on nicotinamide mononucleotide adenylyl transferases (NMNATs) for NAD synthesis. Unfortunately, NMNAT inhibitors have not been identified. Here, we report the identification of Vacor as a substrate metabolized by the consecutive action of NAMPT and NMNAT2 into the NAD analog Vacor adenine dinucleotide (VAD). This leads to inhibition of both enzymes, as well as NAD-dependent dehydrogenases, thereby causing unprecedented rapid NAD depletion, glycolytic block, energy failure, and necrotic death of NMNAT2-proficient cancer cells. Conversely, lack of NMNAT2 expression confers complete resistance to Vacor. Remarkably, Vacor prompts VAD formation and growth suppression in NMNAT2-positive neuroblastoma and melanoma xenografts. Our data show the first evidence of harnessing the entire nicotinamide salvage pathway for antimetabolic strategies.