Thèses sur le sujet « Déficits immunitaires – Génétique »

Les déficits immunitaires primitifs sont un groupe de troubles causés par des mutations monogéniques dans des gènes jouant un rôle clé dans le développement et la fonction du système immunitaire. Dans cette thèse, une approche multiomique a été adoptée pour étudier deux gènes associés à ces conditions, afin d'élucider davantage les mécanismes par lesquels les variants pathogènes nuisent au système immunitaire. Le premier sujet était HYOU1, défini comme un gène dont les défauts causent un déficit immunitaire primitif. Nous avons observé une hypogranularité dans les neutrophiles du patient et révélé un arrêt de maturation dans la lignée des cellules B avant le stade des cellules B pro. Le deuxième sujet était ITGAL, un gène candidat potentiel non précédemment décrit en relation avec les déficits immunitaires primitifs. Nous avons démontré que le variant étudié est hérité selon un mode autosomique récessif, et les analyses de voies ont révélé un dysfonctionnement de plusieurs voies liées à l'adhésion et à la motilité. De plus, nous avons montré une élévation de l'expression d'autres intégrines, suggérant une réponse compensatoire visant à contrebalancer les intégrines défectueuses
Primary immunodeficiencies, or inborn errors of immunity, are a group of disorders caused by monogenic mutations in genes playing a key role in the development and function of the immune system. In this thesis, a multiomics approach was taken to study two genes associated with these conditions, further elucidating the mechanisms by which pathogenic variants impair the immune system. The first subject was HYOU1, defined as a gene whose defects cause primary immunodeficiency. We observed hypogranularity in the patient's neutrophils and revealed a maturation arrest in the B cell lineage before the pro-B cell stage. The second subject was ITGAL, a potential candidate gene not previously described in relation to primary immunodeficiencies. We demonstrated that the studied variant is inherited in an autosomal recessive pattern, and pathway analyses revealed impairment of multiple adhesion and motility-related pathways. Moreover, we showed an elevation in the expression of other integrins, suggesting a compensatory response to counterbalance the defective integrins

L’association entre déficits immunitaires primitifs (DIPs) et manifestations auto-immunes peut sembler paradoxale lorsque l’on aborde les DIPs comme des défauts d’immunité opposés à l’autoimmunité vue comme excès d’immunité adaptative à l’encontre du soi. Néanmoins, loin de se résumer à un simple défaut d’une ou plusieurs composantes du système immunitaire qui prédispose aux infections par divers agents pathogènes, les DIPs sont fréquemment associés à une autoimmunité; parfois révélatrice. Ainsi, les données épidémiologiques issues de registres ou de larges séries de patients atteints de DIPs s’accordent sur une prévalence globale de 25 à 30% de complications auto-immunes (au premier rang desquelles figurent les cytopénies auto-immunes). Différentes hypothèses sont avancées pour rendre compte de l’auto-immunité dans les DIPs. On peut citer : 1°) une perturbation profonde de l’homéostasie lymphocytaire, en particulier dans les déficits immunitaires combinés sévères (CID) avec lymphopénies T et B ; 2°) des défauts intrinsèques des lymphocytes B permettant une rupture de tolérance précoce des LB auto réactifs ; 3°) un comportement aberrant des LT (défaut de maturation, excès d’activation) ; 4°) une absence de lymphocytes T ou de B régulateurs ; 5°) une production inappropriée de certaines cytokines proinflammatoires comme dans les interféronopathies. Ces hypothèses concernent surtout les DIPs pédiatriques sévères. Mon travail de thèse explore la rupture de tolérance immunitaire adaptative au cours des DIPs de l’adulte par différentes approches. Nous nous sommes en particulier attachés au plus fréquent, le DICV (Déficit Immunitaire Commun Variable), déficit immunitaire humoral pas toujours bien défini sur le plan génétique et physiopathologique qui constitue un défi thérapeutique lorsqu’il est compliqué d’une auto-immunité nécessitant un traitement immunosuppresseur
The association between primary immune deficiency (PID) and autoimmunity may seem paradoxical when PID is considered only as an immune response defect against pathogens and autoimmunity only as an excess of immunity. Nevertheless, far from being simple immune defects increasing the risk of infections, DIPs are frequently associated with autoimmunity. Even more, autoimmunes manifestations can sometimes reveal a PID. Thus, epidemiological data from registers or large series of patients with PIDs agree on an overall prevalence of 25 to 30% of autoimmune complications (with auto-immune cytopenias as first causes). Several hypotheses have been proposed with different underlying mechanisms to explain the tolerance breakdown in PIDs. We can cite : 1°) a severe disturbance of lymphocyte homeostasis, for example in severe combined immunodeficiencies ; 2°) an impaired B-cell developpement with earlystage defects of tolerance ; 3°) a dysregulation of T cells (developpement or activation impairments) ; 4°) a dysfunction of T-reg (or B-reg) ; 5°) an excess of production of proinflammatory cytokines. These hypotheses are especially true for early-onset PIDs (in infancy). In this work (PhD), we explore the mechanisms of tolerance breakdown involved in adults PIDs. We use several approaches to describe the pathways leading to autoimmunity, focusing on the most common PID in adult : CVID (common variable immunodeficiency). This syndrome is not well defined on the genetic and physiopathological level. It is still a therapeutic challenge when complicated by autoimmunity (requiring immunosuppressive therapy)

La protéine tyrosine kinase ZAP-70 jour un rôle clé dans l'ontogénie et l'activation des cellules T. Les patients déficients en ZAP-70 présentent un déficit immunitaire combiné et sévère (DICS) caractérisé par un défaut de développement des cellules T CD8+ dans le thymus, associé à un défaut de fonction des cellules T CD4+ en périphérie. Ces patients peuvent être traités avec succès par une transplantation de cellules souches hématopoïétiques (TCSH) histocompatibles. Cependant, les greffes réalisées à partir de donneurs non-histocompatibles sont associés à de graves complications et à une reconstitution immune retardée et incomplète. La mise au point d'un traitement optimal pour ces patients nécessite une bonne connaissance du rôle fondamental de la protéine mutée. J'ai en premier lieu étudié le rôle de ZAP-70 dans les étapes précoces de la signalisation via le TCR. Nous avons montré que ZAP-70 est non seulement capable de transduire le signal, mais aussi de l'amplifier en augmentant la phosphorylation de la chaîne [zêta] du TCR et ainsi, de promouvoir sa propre phosphorylation ou celle de sa kinase homologue Syk. Ces résultats remettent en cause le modèle linéaire de signalisation via le TCR admis jusque-là et confirment le rôle essentiel que joue ZAP-70 dans l'activation des cellules T après engagement du TCR. Dans la deuxième partie de ce travail, j'ai exploré l'efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant le thymus en utilisant le modèle murin de la déficience en ZAP-70. Pour ce la, nous avons injecté des cellules souches hématopoïétiques (CSH) sauvages ou un vecteur lentiviral exprimant le transgène ZAP-70 directement dans le thymus des souris ZAP-70-/-. Ceci a permis une restauration de la différenciation thymique à long terme avec production de cellules T fonctionnelles chez les souris injectées. Le maintien de la thymopoïèse pendant plusieurs mois après transfert de gène suggère fortement la transduction de progéniteurs thymiques. Par ailleurs, l'injection intrathymique de CSH a permis une meilleure reconstitution de la lignée T par rapport à la TCSH conventionnelle effectuée par voie intraveineuse, avec production d'un plus grand nombre de cellules T, au répertoire plus diversifié. L'ensemble des données ainsi obtenues devrait contribuer au développement de stratégies thérapeutiques génique et cellulaire optimales et sûres pour le traitement, non seulement de l'immunodéficience liée à ZAP-70, mais aussi pour celui d'autres formes d'immunodéficiences. Par ailleurs, le ciblage du thymus peut constituer un outil intéressant pour l'immunomodulation, ainsi que pour les études fondamentales du développement et fonction des cellules T.

Le système immunitaire est particulièrement dépendant des mécanismes de réparation de l’ADN, en effet le développement du système immunitaire adaptatif nécessite certains mécanismes de réparation de l’ADN, lors de la recombinaison V(D)J et lors de la commutation de classe des immunoglobulines. De plus, le système hématopoïétique est par sa nature très sensible aux lésions spontanées de l’ADN. Il existe chez l’homme de nombreux déficits immunitaires directement liés à un défaut de réparation de l’ADN. L’identification du gène responsable est importante pour un conseil génétique familial approprié et pour la prise en charge médicale. Nous avons accès aujourd’hui à de puissants outils de dépistage génétique grâce au séquençage à haut débit et la liste des gènes responsables d’un déficit immunitaire s’allonge de plus en plus en rapidement. La première partie de ce travail porte sur la mise au point d’un nouvel outil de dépistage rapide des déficits de la réparation de l’ADN, en particulier dans le cas de déficit immunitaires. Ce test est fondé sur l’observation d’un biais du répertoire du TCRdes lymphocytes T circulants lorsque les thymocytes ont une durée de vie diminuée, or un défaut de réparation de l’ADN entraîne une diminution de la survie thymocytaire. Nous avons mis au point deux techniques, par biologie moléculaire et par cytométrie en flux, pour détecter un éventuel biais du répertoire du TCRα et évaluer la pertinence de ce test dans les déficits immunitaires liés à un défaut de réparation de l’ADN. Un biais a notamment été détecté dans les cas de déficit en facteur du NHEJ et en ATM. Nous avons également établi en collaboration avec le service d’Immunologie Clinique de l’hôpital Saint-Louis une cohorte de patients atteints de déficit immunitaire commun variable (DICV) dont la présentation clinique est évocatrice d’un défaut de réparation de l’ADN. Une série de test fonctionnels de dépistages de déficit de la réparation de l’ADN ainsi que des analyses génétiques (CGH array, séquençage complet de l’exome) ont été fait chez ces patients afin d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans les DICV. Parmi les 18 patients analysés, dans 5 cas on retrouve une sensibilité cellulaire accrue aux agents génotoxiques et chez 15 patients, un gène candidat a été identifié. Ces résultats sont encore préliminaires et la caractérisation génétique et fonctionnelle des mutations identifiées sera poursuivie par notre équipe. Pour finir, nous avons entrepris l’exploration génétique et fonctionnelle de deux mutations identifiées chez une jeune patiente atteinte de déficit immunitaire combiné (CID) associé à un syndrome lymphoprolifératif et une auto-immunité, et chez qui une hypersensibilité cellulaire à la Mitomycine C, agent pontant de l’ADN, a été détectée. La première mutation a été identifiée dans le gène ELKS qui code pour un facteur impliqué dans la réparation de l’ADN. La complémentation fonctionnelle de ce gène prouve l’implication de cette mutation dans l’hypersensibilité des cellules de la patiente à la MMC. Nous avons développé un modèle murin KO conditionnel de ce gène dans les cellules hématopoïétiques qui n’a pas montré de défaut de développement du système immunitaire. La deuxième mutation identifiée se situe dans le gène BACH2 codant pour un répresseur transcriptionnel très impliqué dans le développement du système immunitaire. Les souris KO pour ce gène ont un phénotype proche du déficit immunitaire décrit chez cette patiente. Les investigations de cette mutation sont en cours chez elle et chez les membres de sa famille également porteurs de la mutation
The immune system is particularly dependent on DNA damage response (DDR) pathways. The development of the adaptive immune system requires certain DDR mechanisms, in particular during the V(D)J recombination and during class switch recombination (CSR), furthermore, the hematopoietic system is very sensitive to spontaneous DNA lesions. Therefore, there are many immune deficiencies in human directly related to a DDR deficiency. The identification of the responsible gene is important for appropriate genetic counseling. Today, we have access to powerful genetic screening tools, in particular next generation sequencing (NGS) and the list of genes responsible for immune deficiency is growing rapidly. The first part of this work focuses on the development of a new screening tool for DDR defects, in particular in the case of immune deficiency, and evaluation of clinical interest. This test is based on the observation of a bias of the TCRα repertoire in circulating T lymphocytes when thymocytes lifespan is diminished and we know that DDR defect causes decreased thymocyte survival. We have developed two techniques, by molecular biology and by flow cytometry, to detect a potential bias of the TCRα repetoire and assess the suitability of this test in some immunodeficiencies linked to a DDR defect. A significant bias was detected in the case of ATM and NHEJ factor deficiency. Furthermore, we have established a cohort of patients suffering from common variable immunodeficiency (CVID) with a clinical presentation highly suggestive of DDR defect, in collaboration with the Clinical Immunology Service of Hôpital Saint-Louis (Paris). Functional test for DDR defect and genetic analysis (CGHarray, whole exome sequencing) were performed in these patients to identify new genes involved in CVID. Among the 18 patients analyzed until now, five cases of cellular sensitivity to genotoxic agents have been detected and a candidate gene was identified in 15 of them. These results are still preliminary and our team will pursue genetic and functional characterization of the identified mutations. Finally, we undertook genetic and functional exploration of two mutations identified in a young patient with combined immunodeficiency (CID) associated with a lymphoproliferative disease and autoimmunity, and in whom a cellular hypersensitivity to mitomycin C, a DNA crosslinking agent, was detected. The first mutation was identified in the ELKS gene, which codes for a factor involved in DNA repair. Functional complementation of this gene demonstrates the involvement of this mutation in the hypersensitivity of patient’s cells to MMC. We have developed a conditional knockout mouse model of this gene in hematopoietic cells that did not show any defect in development of the immune system. The second mutation was identified in BACH2 gene encoding a transcriptional repressor involved in the development of the immune system. Knockout mice for this gene have a similar phenotype to the immune deficiency described in this patient. Investigations on this mutation are ongoing in the patient and among family members that also carry the mutation

Au-delà du bénéfice clinique du diagnostic, l'étude des patients atteints de déficits immunitaires héréditaires a aussi largement contribué à la compréhension des mécanismes moléculaires complexes impliqués dans la réponse adaptative humaine contre les pathogènes. Cependant, un grand nombre d’immunodéficiences primaires n’a pas encore été génétiquement défini, en particulier le déficit immunitaire commun variable (ou CVID en anglais). Au cours de ma thèse, j'ai cherché à identifier et caractériser de nouvelles causes moléculaires aux immunodéficiences primaires en me basant sur des mutants naturels humains comme modèle de recherche. Par séquençage entier de l'ADN de patients présentant une forme pédiatrique ou familiale de lupus érythémateux disséminé (ou SLE en anglais) et CVID, nous avons identifié trois variations hétérozygotes distinctes prédites comme délétères chez un patient atteint de CVID (RELAWT/Y306X), un patient pédiatrique SLE (RELAWT/R329X) et les patients atteints de SLE (RELAWT/H86N). Afin de comprendre comment les mutations identifiées peuvent affecter le rôle de RELA dans la voie NF-kB, nous avons confirmé que les deux mutations non-sens de RELA entraînent l'expression de formes tronquées de la protéine, tandis que la mutation faux-sens menait à l'expression de formes mutées de la protéine. Par immunoblot des protéines nucléaires et par immunofluorescence cellulaire, nous avons démontré que les deux formes tronquées de RELA peuvent entrer dans le noyau. Ensuite, en utilisant un oligonucléotide consensus NF-κB marqué, nous avons démontré que les deux formes tronquées de RELA étaient capables de se lier à l'ADN. Les trois protéines RELA mutées, lorsqu'elles étaient exprimées de manière ectopique, présentaient une altération de l'activité transcriptionnelle. Enfin, nous avons montré par co-immunoprécipitation que les trois protéines RELA mutées exprimées de manière ectopique sont capables d'interagir avec ses partenaires protéiques et de former des homodimères. En conclusion, nos résultats indiquent que des mutations affectant le facteur de transcription RELA peuvent être associées à des CVID ou des SLE. Étant donnés les cas précédents décrivant des haploinsuffisances de RELA liées à un syndrome lymphoprolifératif avec auto-immunité associé à une cytopénie auto-immune ainsi qu’aux ulcérations cutanéo-muqueuses TNF-dépendantes associées à des inflammations intestinales, notre travail élargit le spectre des maladies et des phénotypes cliniques liés à un dysfonctionnement de la protéine RELA et suggère que différentes mutations du gène RELA entraînent diverses conséquences fonctionnelles
Beyond the clinical benefit for diagnosis, the study of patients with primary immunodeficiency (PID) has also largely contributed to the deciphering of the complex molecular mechanisms involved in the human adaptive response against pathogens. Still, a large number of PIDs, especially common variable immunodeficiency (CVID), are genetically not defined. During my thesis, I aimed to identify and characterize novel molecular causes of PIDs based on human natural mutants as a research model (1). By whole-exome sequencing of DNA from patients presenting either with pediatric or familial form of CVID and Systemic Lupus Erythematosus (SLE), we identified three distinct heterozygous single nucleotide variations predicted deleterious in a CVID patient (RELAY306X), a pediatric SLE patient (RELAR329X) and familial SLE patients (RELAH86N). To better understand how the identified mutations may impact the role of RELA in the NF-kB pathway, we confirmed that the two nonsense RELA mutations led to the expression of truncated forms of the protein, while the missense mutation led to the expression of mutated forms of the protein. By immunoblotting of nuclear protein extracts and cellular immunofluorescence, we demonstrated that the two truncated forms of RELA can translocate into the nucleus. Then, using a labeled NF-κB consensus oligonucleotide, we demonstrated that the two truncated forms of RELA were able to bind to DNA. All three mutated RELA proteins, when expressed ectopically, had an impaired transcriptional activity. Finally, we showed by immunoprecipitation that all three ectopically expressed mutated RELA proteins are able to interact with protein partners and form homodimers. As a whole, our results indicate that mutations affecting the transcription factor RELA can be associated with CVID or SLE. Given the previous cases associating RELA haploinsufficiency to autoimmune lymphoproliferative syndrome with autoimmune cytopenia and to TNF-dependent mucocutaneous ulceration and inflammatory intestinal disease, our work widens the spectrum of disease and clinical phenotypes associated with RELA dysfunction and suggests that different RELA mutations lead to different functional consequences

Le déficit immunitaire commun variable (DICV) est le déficit immunitaire symptomatique le plus fréquent de l'adulte. De cause inconnue, il est caractérisé par un défaut de production d'immunoglobulines associé à un ensemble hétérogène de manifestations cliniques comprenant des infections ainsi que des complications autoimmunes et lymphoprolifératives. Les granulomatoses constituent une des complications lymphoprolifératives et sont caractérisées par l'infiltration d'un ou plusieurs organes par des structures histologiques composées de macrophages activés entourés d'une couronne lymphocytaire. La granulomatose du DICV est d'étiologie inconnue. Nous avons caractérisé le phénotype de 59 patients atteints de granulomatose et montré qu'il s'agissait d'un groupe homogène présentant un déficit immunitaire sévère. Nous avons montré que la présence du polymorphisme +488A du gène du TNFA était associé à la survenue d'une granulomatose au cours du DICV. Nous avons étudié la prévalence des polymorphismes rs2076530 du gène BTNL2 et rs1049550 du gène ANXAll associés à la survenue d'une sarcoïdose et montré que ceux-ci n'étaient pas associés à la granulomatose du DICV. Nous avons enfin fait l'hypothèse que certaines mutations hypormorphes touchant des gènes responsables de déficits immunitaires pédiatriques pouvaient être responsables de formes monogéniques de DICV avec granulomatose et ainsi mis en évidence une mutation faux sens p. S94T du gène IL2RG chez un patient atteint d'une granulomatose liée à une maladie de Whipple ainsi que deux mutations hétérozygotes faux sens (p. S676R et p. Q242R) de RAGI chez deux patients atteints de DICV avec granulomatose et lymphome
Common variable immunodeficiency (CVID) is the most frequent primary immune deficiency in adults. It encompasses a broad spectrum of clinical manifestations including infectious, autoimmune and lymphoproliferative complications. Granulomatous disease, defined by nodal or extranodal non-caseating granulomas, belongs to lymphoproliferative complications and remains of unknown etiology. We analyzed the clinical and biological phenotype of 59 patients with CVID-associated granulomatous disease and showed that they belonged to a highly homogeneous subgroup with severe immune deficiency. We also showed a strong association between granulomatous disease and a SNP located at position 488 of the TNFA gene. We failed to demonstrate any statistical association with two SNPs in the BTN L2 and ANXA 11 genes recently linked to sarcoidosis occurrence. We hypothesized that hypomorphic mutations of SCID genes could be responsible for some cases of granulomatous-associated CVID and identified an IL2 RG mutation in a patient with Tropheryma Whipplei infection and two heterozygous RAG 1 mutations in two patients with lymphoma. All mutations were previously undescribed missense mutations and resulted in hypomorphic alleles

Le DICV est une maladie dont la physiopathologie reste encore largement incomprise. La caractéristique de ce syndrome est l'hypogarnmaglobulinémie, les patients peuvent également combiner plusieurs complications cliniques : infections à répétition, lymphoprolifération, maladie auto-immune. Cette maladie touche presque exclusivement des individus d'origine caucasienne (1/30 000 en France). Dans la cohorte DEFI, 21% de cas familiaux sont recensés, ce qui a justifié d'orienter ce travail de thèse vers la génétique. L'identification de deux nouveaux patients porteurs de mutations dans le gène CD 19 a permis d'améliorer la compréhension de ce déficit immunitaire et de montrer une hétérogénéité phénotypique chez les patients. Le CD 19 apparaît donc comme un acteur majeur dans la réponse efficace aux infections nécessitant la participation des LB. TACI présente le paradoxe d'être le gène le plus fréquemment muté dans le DICV (10% des patients), mais aussi le plus controversé quant à son implication dans la genèse de l'hypogammaglobulinémie car des mutations sont aussi retrouvées dans la population générale. Les mutations de TACI prédisposent à l'apparition du DICV, mais elles ne sont ni nécessaires ni suffisantes et d'autres facteurs (génétiques, environnementaux) sont certainement impliqués. Ce travail a donc permis de mieux comprendre la physiopathologie du DICV par l'identification de mutations dans des gènes connus avec des phénotypes cliniques ou biologiques inhabituels et par la confirmation de la fréquence des mutations de TACI dans le DICV, sans que l'on puisse dégager de consensus clair quant au rôle effectif de TACI dans la genèse de rhypogammaglobulinêmie chez l'homme
Common variable immunodeficiency is a primary immunodeficiency characterized by defective antibody production leading to recurrent infections, lymphoproliferation or autoimmune diseases. This affection is closely restricted to Caucasian population (1/30,000 in France). The 21% of family cases observed in the DEFI cohort led us to study the genetic aspects of CVID. We identified two patients with new mutations in CD19. Their phenotypes indicate that CD 19 signalling remains crucial for a robust humoral response and point to its possible role in IgGl switching and control of autoimmunity. TACI is very frequently mutated in CVID (10% of patients). However, its involvement in CVID genesis is controversial since mutations are also present in controls. TA CI mutations predispose to the onset of CVID, but they are neither necessary nor sufficient, suggesting other features (genetic or environmental) are certainly involved. This work has improved the understanding of CVID pathophysiology by the discovery of mutations in previously known genes (BTK, SH2D1A, CD 19) with unusual clinical and biological features and by the confirmation of TACI mutations frequency in CVID

La sous-unité catalytique p110 de la phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PI3K) est exprimée spécifiquement dans les leucocytes, et possède un rôle central dans la biologie des lymphocytes. Des mutations germinales dominantes gain-de-fonction de PI3KCD (codant p110 ) ont été identifiées récemment chez des patients présentant une immunodéficience combinée caractérisée par une présentation clinique hétérogène incluant des infections récurrentes des voies respiratoires et des lymphoproliférations associées à une virémie EBV et/ou CMV élevée, connue sous le nom de syndromes APDS. L’hétérogénéité des présentations cliniques suggère l’existence de facteurs secondaires, génétiques ou environnementaux. Au cours de ma thèse de doctorat, j’ai rapporté le cas de deux nouveaux patients présentant des anomalies génétiques affectant la voie PI3K. Le premier patient, né dans une famille consanguine, présentait une mutation gain- de-fonction de PIK3CD déjà décrite. Par séquençage de l’exome du patient, nous avons identifié une seconde mutation homozygote non-sens de SEC14L2, un régulateur connu de la voie PI3K. Nous avons analysé le phénotype et la fonctionnalité des lymphocytes du patient, et avons mis en évidence in vitro certains mécanismes de régulation de l’activation lymphocytaire par SEC14L2. Enfin, nous avons réalisé une étude de transcriptome afin d’identifier les voies de régulation dérégulées chez notre patient. Dans l’ensemble, ces résultats ont permis d’identifier le premier co-facteur génétique associé au syndrome APDS. Le second patient est également né dans une famille consanguine et présentait des infections sévères des voies respiratoires et un syndrome d’infection chronique à l’EBV (CAEBV) fatal. Par séquençage de l’exome du patient, nous avons identifié une mutation homozygote rare dans PIK3CD. Une modélisation de la structure de la protéine a montré que l’acide aminé muté se situe dans le domaine catalytique de p110 , dans une boucle phylogénétiquement conservée interagissant avec la sous-unité régulatrice p85↵ de la PI3K, et que la mutation conduisait à la perte de cette interaction. In vitro, la mutation de p110 cause la perte de l’activité PI3K, et les lymphocytes T du patient présentaient une diminution de phosphorylation d’AKT et de p70 S6K, deux cibles de la PI3K. Les lymphocytes T du patient présentaient également une production diminuée d’IFN- et de TNF↵, et un excès de prolifération et de flux calcium suite à la stimulation du TCR. Des lignées cellulaires Jurkat déficientes pour PIK3CD générées par CRISPR/Cas9 ont également présenté un défaut de phosphorylation d’ATK et un excès de prolifération et de flux calcium. L’expression de la version sauvage de p110 dans ces cellules, mais pas de la version mutée, a permis une restauration des réponses normales, prouvant l’implication de la mutation dans les phénotypes cellulaires identifiés. De manière intéressante, nous avons mis en évidence l’existence d’un équilibre entre l’activité PI3K et PLC- 1 lors de l’activation T, qui pourrait être expliqué par une compétition pour l’accès à leur substrat commun, le PIP2. Enfin, nous avons identifié chez notre patient une seconde mutation homozygote délétère dans le gène TNFRSF9. Cette mutation est également retrouvée chez la sœur saine du patient, qui présentait une réplication persistante de l’EBV dans le sang, suggérant que cette mutation pourrait agir comme facteur génétique secondaire. Dans l’ensemble, cette étude à permis l’identification de la première immunodéficience associée à des mutations perte-de-fonction de PIK3CD
The pathway p110 catalytic subunit of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PI3K) is selectively expressed in leukocytes and has a central role in lymphocytes biology. Gain-of-function dominant germline mutations of PIK3CD (encoding p110 ) have been recently described in patients presenting a heterogeneous combined immunodeficiency associated with respiratory tract infections, lymphadenopathy and high EBV and/or CMV viremia. The heterogeneous clinical presentation suggests the existence of genetic or environmental modifying factors. In my thesis I report two new patients with different genetic defects causing CID. The first patient, born from a consanguineous family, presented a known gain-of- function mutation of PIK3CD. His clinical presentation was partially compatible with the already described patients. By whole exome sequencing, we identified a homozygous nonsense mutation in SEC14L2, a known regulator of PI3K pathway. We further analyzed the phenotype and functions of patient’s lymphocytes, and performed a transcriptome analysis to better characterize the implication of SEC14L2 mutation in the pathology. The second patient was born from consanguineous family and presented recurrent severe respiratory tract infections and a fatal Chronic Active EBV disease (CAEBV). By Whole Exome Sequencing, we identified a homozygous rare missense mutation in PIK3CD. 3D structure modelization showed that the mutated amino acid is located in p110 catalytic domain, in an evolutionarily conserved loop that interacts with alpha-helix of PI3K regulatory subunit p85a, which interaction is lost in mutated p110 . Phenotyping of patient’s circulating lymphocytes showed increased CD8+ T cells and reduced NK and CD4+ T cells. The mutation in PI3KCD resulted in impaired PI3K activity in vitro and in vivo. Moreover, patient’s T cells exhibited reduced activation-induced phosphorylation of AKT and p70-S6K, two indirect targets of p110 , that we restored by expressing wild type p110 . Patient’s T cells also showed a decreased induction of IFN- and TNF-↵ and an increased proliferation and calcium flux after TCR stimulation. By CRISPR CAS9 technology, we generated Jurkat T- cell lines expressing wild type or mutated PI3K. Jurkat cells expressing mutant PI3K showed decreased AKT phosphorylation and increased calcium flux and proliferation after TCR stimulation, confirming the implication of PIK3CD mutation in patient’s cells phenotype. Interestingly, we highlighted the existence of a balance between PI3K and PLC- 1 activity during T cell activation, that may be due to a competition for access to their shared substrate, the PIP2. Finally, we identified in our patient a second deleterious mutation in TNFRSF9 that is shared by his healthy sister, who also presented persistent EBV replication in blood, suggesting that this additional mutation may act as a modifying genetic factor. Taken together, the results presented in this thesis identified the first loss-of-function mutation in PIK3CD causing CID

La radiothérapie est un traitement majeur des cancers car les radiations ionisantes (RI) vont induire différents dommages à l'ADN dont les cassures doubles brins (CDB). Lors de l'irradiation d'une tumeur, les cellules du microenvironnements vont être aussi irradiées et cela pourraient modifier la réponse des cellules cibles. Parmi les cellules du stroma mammaire, les adipocytes pourraient jouer un rôle important car ce sont les cellules les plus abondantes du stroma mammaires et elles sécrètent de nombreux facteurs susceptibles de modifier le comportement de la tumeur. Je me suis intéressé dans un premier temps à la réponse des adipocytes à l'exposition aux RI, et dans un deuxième temps à l'influence des adipocytes sur la radiosensibilité de cellules tumorales mammaires. Nous avons pu montrer qu'au cours de l'adipogenèse, l'activité de réparation des CDBs est augmentée et cela est du à l'augmentation de l'expression et de l'activité d'une protéine clé de ce mécanisme de réparation, la DNA-PKcs. Ces résultats sont retrouvés pour une adipogenèse murine et humaine. Par ailleurs, nous avons pu montrer que les adipocytes étaient des cellules radiorésistantes, ce qui favorise l'hypothèse de leur participation à la réponse tissulaire aux RI. Effectivement, les premiers résultats obtenus montrent que dans un système de coculture en 2D, les adipocytes protègent les cellules tumorales mammaires de la mort clonogène, cet effet étant dépendant de facteurs solubles sécrétés par les adipocytes. Il serait intéressant d'étudiant l'influence des adipocytes dans un contexte d'obésité, car l'obésité est associée à un mauvais pronostic des cancers
Radiotherapy is a major therapeutic strategy in the treatment of many human tumors becase the exposure to ionizing radiation (IR) induces DNA damage and among them DNA double strand breaks (DSBs). However, cancer is a tissue-based disease in which malignant cells interact dynamically with multiple normal cell or stroma, and to the response to IR, emerging studies suggest that the irradiated stroma can influence the sensibility of cancer cell. Stroma was composed by differents types of cell, and adipocytes cells are excellent candidat because they are highly represented in breast tumor stroma and are able to secrete many factors. So the goal of our project was to investigate if adipocyte can influence the tissue response to IR. As a first step, we have demonstrated that the ability to repair DSBs is increased during adipocyte differentiation, that can explain by the increase of expression and activity of a key protei of DSB repair, DNA-PKcs. This result are observed during human and mrin adipogenesis. Moreover, we are observed that adipocyte are radioresistan cell and this ability to resist to genotoxic stress supports the idea that adipocytes might participate to radioresistance at a tissue level. In fact we demonstrated, in a 2D co-culture model that adipocytes protect breast cancer cell from clonogenic cell death in a manner that is dependent of secreted soluble factors. Accordingly, it would be of interest to evaluate the paracrine role of adipocytes within the context of obesity that has been recently established a negative prognostic factor even for localized breast tumors

Des mutations gains de fonction du gène STING chez l’Homme (telles que V155M) déclenchent une pathologie autoinflammatoire sévère de type interféronopathie, le SAVI (Sting associated vasculopathy with onset in infancy), une vasculopathie associée à une fibrose pulmonaire et des symptômes lupus-like. Afin de comprendre la physiopathologie du SAVI, nous avons généré un modèle murin porteur de la mutation correspondante grâce à la technologie CRISPR/Cas9. Ces souris STING V154M/WT développent un phénotype SCID (déficit immunitaire combiné sévère) avec diminution des LT, des LB et des NK en périphérie, et une expansion du compartiment myéloïde. Ce défaut de développement est observé précocement dès le stade pré-proB dans la moelle osseuse, et au stade DN2 dans le thymus, et semble intrinsèque aux cellules hématopoïétiques. De plus, ces souris présentent une hypogammaglobulinémie sévère. Les LT et LB matures présentent également des défauts intrinsèques. Enfin, les souris présentent une signature IFN, mais leur phénotype SCID est IFN de type I-indépendant. Ces résultats mettent en évidence un rôle important de STING dans le développement lymphoïde
In humans, point mutations in STING gene, such as V155M, lead to a severe autoinflammatory disease called SAVI (Sting associated vasculopathy with onset in infancy), classified as interferonopathy and characterized by vasculopathy, pulmonary fibrosis and a lupus-like pathology. In order to better understand the pathophysiology of SAVI, we generated a mouse model with the corresponding mutation, using CRISPR/Cas9 technology. These STING V154M/WT mice develop a SCID (severe combined immunodeficiency disease) with decrease of peripheral T, B and NK cells, and expansion of myeloid compartment. This defect seems to be present since the early stages, i.e. pre-proB cells stage in bone marrow and DN2 stage in thymus, and seems intrinsic to hematopoiectic cells. In addition, these mice present a strong hypogammaglobulinemia. Mature T and B cells also present intrinsic defaults. Finally, these mice present an IFN signature but their phenotype is independent of the IFN pathway. These results highlight an important role of STING in lymphoid development

Le thymus est un organe clé de l’immunité, permettant tout au long de la vie la production de cellules T naïves. L'involution thymique associée à l'âge est liée à une réduction de la masse tissulaire et de la cellularité thymique, ainsi que la perte de la structure tissulaire et de l’architecture normale conduisant à une baisse de la production de cellules T naïfs. Cependant, à l'exception de l'âge, les facteurs environnementaux ou génétiques susceptibles de régir la fonction thymique chez l'Homme restent mal connus. Nous avons caractérisé la variabilité de la fonction thymique chez 1000 adultes sains stratifiés par l’âge et par sexe sur la cohorte Milieu Intérieur, en utilisant la quantification des cercles d’excision (TRECs) dans le sang périphérique comme marqueur de la thymopoïèse. L'âge et le sexe sont les seuls facteurs non héritables identifiés qui affectent la fonction thymique. Les quantités de TREC diminuent avec l'âge étant plus élevée chez les femmes de tout âge. Surtout, une étude d'association pangénomique a révélé l’existence d’un variant génétique (rs2204985) dans le locus TCRA-TCRD, situé entre les segments géniques DD2 et DD3, l’allèle G étant associé à un niveau de TRECs supérieur à l’allèle A. Cette association a été validée dans une cohorte de réplication (cohorte MARTHA). La transplantation de cellules souches hématopoïétiques humaines de foie fetal avec le génotype GG dans des souris immunodéficientes est associée à une thymopoïèse accrue avec des TRECs plus élevés, une augmentation du nombre de thymocytes et aussi une plus grande diversité du répertoire TCRA-TCRD. Notre approche d’immunologie des populations a mis en évidence un variant génétique influençant la thymopoïèse l’adulte sain. Ceci pourrait avoir un impact direct en médecine dite de précision dans les domaines du vieillissement et de la vaccination, en transplantation de cellules souches hématopoïétiques, ainsi qu’en autoimmunité. Ces travaux conduisent également à étudier plus en détail les mécanismes de la thymopoïèse précoce et des réarrangements du locus TCRATCRD
The thymus is a vital organ for homeostatic maintenance of the peripheral immune system. Age-associated thymic involution is associated with a reduction in tissue mass and thymic cellularity, loss of tissue structure and abnormal architecture leading to a decline in naïve T cell output. However, with the exception of age, the underlying parameters that govern thymic function in healthy humans remain to be defined. We characterized the variability of thymic function among 1000 age- and sex-stratified healthy adults of the Milieu Intérieur cohort, using quantification of TRECs in peripheral blood T cells as a surrogate marker of thymopoiesis. Age and sex were the only nonheritable factors identified that affect thymic function. TREC amounts decreased with age and were higher in women compared to men of all ages. In addition, a genome-wide association study revealed a common variant (rs2204985) within the T cell receptor TCRA-TCRD locus, between the DD2 and DD3 gene segments, which associated with TREC amounts. This association was validated in a replication cohort (MARTHA cohort). Strikingly, transplantation of human hematopoietic stem cells with the rs2204985 GG genotype into immunodeficient mice led to thymopoiesis with higher TRECs, increased thymocyte counts, and a higher TCR repertoire diversity. Our population immunology approach revealed a genetic locus that influences thymopoiesis in healthy children and adults, with potentially broad implications in precision medicine, especially in aging and vaccines, hematopoietic stem cell transplantation and autoimmunity. This study leads also to further study the precise mechanisms of TCRA-TCRD rearrangements at early steps of thymopoiesis

Pas de résumé
Chronic mucocutaneous candidiasis (CMC) is seen in human patients with a variety of conditions and refers to recurrent or persistent infection of the skin, nails and/or mucosae by commensal Candida species. Its pathogenesis had long remained elusive, until human genetic studies of rare patients with inherited forms of idiopathic CMC (whether isolated or syndromic), incriminated impaired interleukin (IL)-17A/F immunity. The first genetic etiologies of idiopathic isolated CMC, autosomal dominant (AD) IL-17F and autosomal recessive (AR) IL-17 receptor A (IL-17RA) deficiencies, were reported in 2011 in a multiplex and in a sporadic case, respectively. Using Whole Exome Sequencing (WES), we identified 26 novel patients bearing 15 different homozygous mutations in the IL17RA gene. The mutations identified are either nonsense; missense; frameshift deletions; frameshift insertions; or non-coding essential splice site mutations. Interestingly, 2 alleles encode for surface expressed receptors, whereas all the other tested alleles are not detected at the surface of the patient’s cells (fibroblasts or leucocytes). IL-17RA deficiency is a fully penetrant AR disease, with early onset symptoms, usually within the first year of life. CMC is always present. In addition, 17 patients present with staphylococcal skin infections, and some patients with pyogenic infections of the respiratory tract, including pneumonia. Interestingly, tuberculosis occurred in two unrelated BCG-vaccinated patients. The response to IL-17A and IL-17F homo- and heterodimers is abrogated in fibroblasts, as well as the response to IL-17E/IL-25 in T cells. Human IL-17RA is thus essential for mucocutaneous immunity against Candida and Staphylococcus, but otherwise largely redundant. AR IL-17RA deficiency should be considered in children or adults with CMC, cutaneous staphylococcal disease, or both. In a separate project, I investigated a female child patient born to consanguineous parents who suffered from CMC, recurrent viral infections, disseminated BCG disease and biliary cryptosporidiosis, suggestive of combined immunodeficiency, and who is homozygous for a mutation in REL, encoding the NF-kB protein c-REL. Sanger sequencing confirmed that the patient is homozygous and that both parents are heterozygous for the mutation, consistent with an AR inheritance. The candidate mutation is a nucleotide substitution localized in an acceptor splice site; is not reported in available public databases; and is predicted to be damaging in silico. The mutation disrupts mRNA splicing and is loss-of expression. The patient shows normal counts of lymphoid subsets, with the exception of diminished frequencies of memory CD4+ T, Th2, Th1*, and memory B cells. The patient’s T cells fail to proliferate in response to recall antigens. Naïve CD4+ T cells produce little IL-2 and respond poorly to polyclonal stimulation, a phenotype reverted by exogenous IL-2. Memory CD4+ T cells also produce little amounts of IL-2, and strongly diminished amounts of key effector cytokines (IFN-γ, IL-4, IL-17A and IL-21). The patient exhibited with no detectable specific antibody response following vaccination. Survival and therefore proliferation of naïve B cells are compromised leading to poor generation of plasma cell, and immunoglobulins secretion. The patient shows normal counts of myeloid cells, and frequencies of dendritic cell subsets. IL-12 production is abolished in whole blood in response to BCG+IFN-γ and B-EBV cells in response to mitogens. Although further investigation is needed to fully characterize the patient’s phenotype, these results strongly suggest that the patient suffers from AR complete c-REL deficiency

Le syndrome d'Evans est défini par l'existence concomitante ou séquentielle de cytopénies auto-immunes, le plus souvent, anémie hémolytique et thrombopénie immunologique. Chez l'enfant, il peut être secondaire à une infection, une maladie auto-immune systémique ou un déficit immunitaire primitif. Alternativement, chez une grande partie des patients, l'étiologie n'est pas clairement identifiée. Les patients atteints de syndrome d'Evans présentent parfois d'autres atteintes, telles une auto-immunité d'organe, une lymphoprolifération bénigne ou un déficit immunitaire. L'objectif de ce travail était d'identifier des causes génétiques chez des enfants présentant un syndrome d'Evans sans étiologie sous-jacente identifiée. Nous avons centré notre étude sur des formes sévères à début pédiatrique en faisant l'hypothèse qu'une maladie monogénique serait plus fréquente dans ce groupe de patients. Nous avons mis à profit les technologies de séquençage haut débit « nouvelle génération » (NGS) pour réaliser et analyser le séquençage de l'exome de patients et de certains de leurs apparentés afin de mettre en évidence des gènes candidats potentiels. Ce travail a permis l'identification de 4 gènes candidats : LRBA, CTLA-4, STAT3 (mutations gain de fonction) et NFKBIA. L'implication des 3 premiers gènes dans de nouvelles maladies monogéniques où l'auto-immunité est au premier plan a été confirmée par d'autres équipes au cours de ce travail. Pour chacun de ces gènes, nous avons poursuivi 2 objectifs complémentaires : d'une part, tenter de valider l'implication des gènes identifiés dans la maladie des patients. Nous avons pour cela utilisé des approches et techniques variées : biochimie et protéomique afin d'identifier des partenaires protéiques, microscopie confocale pour localiser les protéines et leurs interactions, tests cellulaires in vitro pour mettre en évidence un défaut fonctionnel, marquages en cytométrie en flux pour identifier des modifications dans les sous-populations lymphocytaires. D'autre part, nous avons recherché d'autres mutations de ces gènes chez des patients de phénotype clinique similaire. Nous avons ainsi constitué et exploré 3 cohortes de patients présentant des mutations de LRBA, CTLA-4 ou STAT3. Nous avons rassemblé une cohorte de 18 patients porteurs d'une mutation de LRBA, répartis dans 11 familles. Cela nous a permis de préciser et d'étendre le spectre clinique de cette maladie de découverte récente, avec en particulier des atteintes articulaires sévères s'associant à un diabète précoce, ou des entéropathies. Nous avons identifié 15 nouvelles mutations de transmission autosomique récessive dans le gène LRBA, codant une protéine de fonction inconnue dont l'absence entraine une maladie principalement caractérisée par une poly-auto-immunité. Nous avons identifié 29 partenaires protéiques potentiels de LRBA et précisé la localisation de LRBA dans les différents compartiments cellulaires. Nous avons également établi une cohorte de 12 patients dans 10 familles présentant un déficit en CTLA-4 par haplo-insuffisance. Au delà de la mise en évidence de 9 nouvelles mutations, nous avons décrit une famille où la variation est transmise de façon autosomique récessive. Dans les déficits en LRBA et CTLA-4, nous avons mis en évidence une diminution du pourcentage de lymphocytes T régulateurs parmi les PBMC et une diminution de l'expression de CTLA-4 dans les lymphocytes T activés. Ceci corrobore l'interaction entre ces 2 protéines décrite en parallèle par une autre équipe. Nous avons montré que les spectres cliniques des déficits en LRBA et CTLA-4, fortement chevauchant dans les premières descriptions publiées, pourraient se différencier, malgré l'implication des lymphocytes T régulateurs dans ces 2 maladies. (...)
Evans syndrome is defined by the occurence of autoimmune cytopenias, either at the same time or sequential, mainly autoimmune hemolytic anemia and immune thrombocytopenia. In children, it may be secondary to infections, systemic autoimmune disease, or primary immune deficiency, though in most patients, its etiology isn't obvious. Patients affected with Evans syndrome can also present other features, such as autoimmunity toward a particular organ, benign lymphoproliferation or immunodeficiency. The main goal of this work was to identify genetic causes in children presenting an Evans syndrome without a known underlying etiology. We focused our study on severe, early onset forms of the disease, with the hypothesis that a monogenic disease would be more frequent in this group of patients. Taking advantage of high throughput "Next Generation" sequencing (NGS) techniques, we sequenced and analyzed exome from patients and their relatives in search for adequate candidate genes. We identified 4 candidate genes: LRBA, CTLA-4, STAT3 (gain-of-function mutations), and NFKBA. Implication of the first 3 genes in new monogenic diseases with autoimmunity as a key feature was also confirmed by others during the course of this work. For each gene, we pursued 2 complementary goals: First, we sought to validate the implication of the gene in the patients' disease. To do so, we used various techniques and approaches: biochemistry and proteomics to identify protein partners, confocal microscopy to localize proteins and interactions, in vitro cellular assays to bring to light functional defect, flow cytometry to identify changes in lymphocytes subpopulations. We also looked for other mutations of each gene in patients with a similar clinical presentation. Hence we created and explored 3 cohorts of patients presenting with mutations of LRBA, CTLA-4 or STAT3. We constituted a cohort of 18 patients with LRBA mutations within 11 families. We then were able to precise and extend the clinical spectrum of this recently described disease. In particular, we observed patients with severe chronic arthritis associated with diabetes mellitus or enteropathies. We identified 15 new mutations of autosomal recessive transmission in the LRBA gene, coding a protein of unknown function, which absence is responsible for a disease mainly characterized by autoimmune features. We identified 29 candidate protein partners of LRBA and precized LRBA localisation in cell compartiments. We also established a cohort of 12 patients within 10 families presenting CTLA-4 haploinsufficiency. Beyond describing 9 new mutations, we report a family with autosomal recessive transmission.In LRBA and CTLA-4 deficiencies, we showed a decrease of regulatory T lymphocyte subset proportion among PBMC and a decrease of CTLA-4 expression in activated T cells. These results support the interaction between these 2 proteins, described concurrently by another team. We showed that the clinical spectra of these 2 diseases, although widely overlapping in first published reports, could be different despite a role of regulatory T cells in both. Hence, organ-specific autoimmunity and lymphoproliferation are more frequent in LRBA deficiency whereas granuloma and hypogammaglobulinemia are more present in CTLA-4 deficiency. Theses results suggests a role of genetic modifyers, which remain to identify. Among our cohort of patients with Evans syndrome, we also identified 5 patients within 5 families presenting gain-of-function mutations of STAT3. 3 of those mutations were reported by others during our work and appeared de novo in our patients. Functional validation of the 4th one is in progress. The last mutation follows a recessive transmission and could exemplify a new transmission modality of this disease. (...)

L'une des étapes clefs de la multiplication des rétrovirus est l'expression des gènes viraux à partir de l'ADN proviral intégré dans le génome de la cellule hôte. Le transcrit primaire unique synthétisé à partir de l'ADN proviral par l'ARN polymérase de la cellule hôte doit, à la fois, rester intact pour servir d'ARN génomique pour les nouveaux virions et être épissé pour servir d'ARN messager pour la production des protéines nécessaires au développement viral. La survie et la multiplication virales passent donc par un équilibre précis entre ARN épissé et ARN non épissé, équilibre qui dépend de l'expression de la protéine virale Rev. L'épissage du transcrit primaire du virus BIV-1 est un processus très complexe du fait de l'existence de 4 sites donneurs et de 8 sites accepteurs d'épissage, dont l'utilisation en combinaison permet la synthèse d'une quarantaine d'ARN différents. Des travaux antérieurs du laboratoire et de l'équipe de K. Beemon (USA) montraient que les choix d'épissage reposent essentiellement sur la nature sous-optimale des sites accepteurs. Le but de notre travail a été d'étudier les bases moléculaires régissant les choix alternatifs d'utilisation de ces sites accepteurs. La structure secondaire de l'ARN est un paramètre susceptible de moduler l'efficacité des sites d'épissage. Afin de tester l'effet de ce paramètre dans le cas du virus BIV-1, nous avons mené une étude expérimentale sur la structure secondaire de l'ARN de ce virus autour des sites accepteurs A2, A3 à A5 et A7. Cette étude a révélé un fort degré de structuration de l'ARN et nous avons pu montrer qu'aussi bien in vitro qu' in vivo l'appariement de bases impliquant la séquence polypyrimidine du site A3 module l'efficacité d'utilisation de ce site, ceci du fait du caractère sous-optimal de cette séquence polypyrimidine. L'efficacité d'utilisation des sites accepteurs d'épissage est également liée à l'existence, à leur voisinage, de séquences régulatrices agissant en cis, dont le rôle est, en général, de fixer des facteurs protéiques agissant en trans. Ainsi, nous avons étudié une séquence intronique inhibant l'utilisation du site A2 in vitro, qui avait été découverte précédemment au laboratoire. L'action de cette séquence pourrait expliquer l'élimination couplée de l'intronD2-A2 avec un intron aval renfermant le site D3, qui est observée in vivo. Nous avons délimité cette séquence est montré qu'elle avait une architecture modulaire. Nous avons également découvert une nouvelle séquence exonique qui limite l'utilisation du site A3 in vitro et in vivo et nous avons montré qu'elle fixe la protéine hnRNP H. Des substitutions de bases dans cette séquence peuvent soit affaiblir son effet inhibiteur, soit l'augmenter et, dans ce cas, nous avons montré qu'il y avait fixation de la protéine hnRNP A1. Cette séquence correspond à une des régions de l'ARN du virus BIV-1 subissant un processus d'édition dans des cellules chroniquement infectées. Nos résultats indiquent que la modification générée par l'édition diminue fortement l'épissage au site A3 ; ce qui doit limiter la production de protéine Tat, toxique pour la cellule hâte. Enfin, nous avons pu montrer que l'utilisation des sites d'épissage de l'ARN du virus BIV-1 est activée de façon différentielle par les protéines SR SC35 et ASF/SF2, dont le taux relatif d'expression varie au cours de l'infection virale. Ainsi, la régulation complexe de l'épissage de l'ARN du virus BIV-1 dépend de la structuration de l'ARN, de séquences régulatrices, de facteurs agissant en trans et ces régulations semblent être la cible de mécanismes de résistance de la cellule.

Le maintien de l'intégrité du génome est essentiel pour la survie cellulaire et la propagation de l'information génétique. Une mauvaise prise en charge des dommages de l’ADN et / ou une aberration de la maintenance de l’intégrité des télomères - les extrémités des chromosomes linéaires - provoquent chez l'homme des pathologies associées à une instabilité génétique. Ainsi, des dysfonctions télomériques sont à l’origine de la Dyskératose Congénitale (DC), et de sa forme rare et sévère, le Syndrome de Hoyeraal-Hreidarsson (HHS). Les DC et HHS se caractérisent principalement par une insuffisance médullaire progressive, des défauts développementaux et une prédisposition à développer des cancers. Par ailleurs, de nombreux syndromes associant déficits immunitaires et anomalies développementales sont causés par des défauts de réparation de l'ADN (cas de déficits immunitaires sévères, de l’Anémie de Fanconi (FA), de l’ataxie télangiectasie (AT), etc …). Au cours de ce travail, nous avons réalisé une étude phénotypique et génétique de patients atteints de deux pathologies aux caractéristiques cliniques distinctes. Ce travail de thèse a permis : 1) d'une part d'identifier des mutations de RTEL1 chez 3 patients atteints de HHS, décrivant ainsi une nouvelle cause moléculaire de cette pathologie. L'analyse des cellules de ces patients a révélé le rôle crucial que joue RTEL1 sur la stabilité du génome et le maintien des télomères dans des cellules humaines. 2) d'autre part, d'identifier un défaut en MYSM1, une histone déubiquitinase, dans un nouveau syndrome immuno-hématologique associé à des défauts de réparation de l’ADN présentant certaines similitudes avec l'anémie de Fanconi. Cette étude démontre pour la première fois, qu'outre son rôle dans la régulation transcriptionnelle, MYSM1 participe également aux mécanismes de réparation des lésions de l'ADN
Maintaining genome integrity is essential for cell survival and propagation of the genetic information. Improper management of DNA damages and / or aberrations in maintenance of telomere - the ends of linear chromosomes - causes humans disorders associated with genetic instability. Thus, in humans, telomere dysfunction causes Dyskeratosis Congenita (DC), and its rare and severe form, Hoyeraal-Hreidarsson Syndrome (HHS). DC and HHS are mainly characterized by progressive bone marrow failure, developmental defects and predisposition to cancer. In addition, many syndromes involving immunodeficiency and developmental abnormalities are caused by defects in DNA repair (e.g. severe immune deficiencies, Fanconi Anemia (FA), Ataxia Telangiectasia (AT),…). In this work, we performed a phenotypic and genetic study of patients with two syndromes presenting distinct clinical features. This work permitted : 1) on one hand, to identify RTEL1 mutations in patients with HHS and describe a new molecular cause of this disease. The analysis of patients’ cells revealed the crucial role for RTEL1 in genome stability and telomere maintenance in human cells. 2) on the other hand, to identify mutations in MYSM1, a histone deubiquitinase, in a new immuno-hematological syndrome associated with defects in DNA repair and sharing some similarities with Fanconi anemia. This study demonstrates for the first time that, in addition to its role in transcriptional regulation, MYSM1 is required to cope with DNA damages

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) assurent la génération de toutes les lignées sanguines. Leur différenciation en cellules T matures se déroule dans un microenvironnement spécialisé, le thymus, orchestrée par des interactions complexes entre cytokines, chimiokines et cellules stromales. Les mutations bloquant la différenciation des cellules T ont un impact sur l'architecture du thymus, soulignant l’importance des interactions entre cellules T en développement et cellules stromales thymiques.Les déficits immunitaires combinés sévères sont généralement traités, avec succès, par transplantation de CSH allogénique par voie intraveineuse. Cependant, des complications peuvent survenir notamment en cas de greffe non compatible. Pour pallier à cela, la thérapie génique a été développée mais son efficacité et son innocuité restent à améliorer. Dans ce but, notre groupe a développé une approche par correction génique des progéniteurs T directement in vivo, via un vecteur lentiviral. Bien qu’efficace, là encore, l’efficacité de traitement reste insuffisante voire extrêmement limitée chez les macaques.Lors de ma thèse, j'ai donc évalué le potentiel de différents sérotypes de vecteur viraux adéno-associés (AAV) pour la transduction des thymocytes. L'administration IT de plusieurs sérotypes de AAV2 engendre une transduction des thymocytes >10 fois plus élevée que celle des vecteurs lentiviraux. Le sérotype AAV2/8 induit la transduction des thymocytes la plus efficace et les cellules transduites représentent jusqu'à 1% des cellules T périphériques d’une souris immunocompétente. En utilisant des souris immunodéficientes ZAP-70-/- comme paradigme, j'ai découvert que l'injection IT de l’AAV2/8-ZAP-70 entraîne une transduction et différentiation lymphocytaire T rapide, associée à la génération d’une medulla thymique. En effet, des cellules épithéliales thymiques de la médulla (mTEC) exprimant le régulateur auto-immun AIRE sont détectées en <2 semaines. Bien que cette reconstitution soit transitoire, les mTECs AIRE+ diminuant 10 semaines post-injection, les cellules T périphériques corrigées persistent >40 semaines et présentent environ 1 copie du vecteur AAV/cellule. Ces cellules T effectrices peuvent sécréter des niveaux élevés de cytokines et un nombre important de cellules T régulatrices est également généré. Ainsi, une seule vague de thymopoïèse à partir de progéniteurs transduits par l’AAV-ZAP-70, permet une restauration, rapide et transitoire de l'architecture thymique mais, à long terme de cellules T périphériques fonctionnelles.Pour évaluer les diverses populations de TEC régissant le développement et la sélection des cellules T, j'ai collaboré avec les groupes de P Jay/J Abramson/I Amit pour établir une cartographie de novo du compartiment stromal thymique. Nos analyses ont mis en évidence quatre populations majeures de mTEC (I-IV) avec des fonctions distinctes. Notamment, les mTEC-IV constituent une population unique présentant des similarités moléculaires et morphologiques avec les cellules tuft intestinales. Comme nous avions précédemment identifié la sécrétion d'IL-25 par les cellules tufts comme un régulateur des interactions entre compartiment épithélial et hématopoïétique dans l'intestin, nous avons évalué ce potentiel dans le thymus. Ainsi, des souris déficientes en cellules tuft intestinales présentent également une déficience spécifique en mTEC-IV et une homéostasie perturbée de diverses populations exprimant l'IL-25R dans le thymus. Notre recherche a donc permis d'identifier une nouvelle population de TEC tuft avec un rôle critique dans la formation de la niche immunitaire du thymus.L’ensemble de mes résultats montrent le potentiel thérapeutique de stratégie intrathymique de thérapie génique pour des patients ayant besoin d’une reconstitution rapide en cellules T et fournissent de nouvelles perspectives sur les populations stromales thymique et leur rôle dans l’équilibre de la niche immunitaire
Hematopoietic stem cells (HSC) ensure the generation of all blood lineages. Their differentiation to mature T lymphocytes occurs in the specialized microenvironment of the thymus, orchestrated by complex interactions between cytokines, chemokines, and stromal cells. Mutations resulting in a block in T cell differentiation impact on the architecture of the thymus, pointing to the critical crosstalk between developing T cells and thymic stromal components.Genetic severe combined immunodeficiencies (SCID) are generally treated by the intravenous transplantation of healthy allogeneic HSCs. Although this therapy is often successful, complications can occur, especially for patients receiving non-histocompatible HSC transplants. To circumvent these problems , significant efforts have gone into developing gene therapy strategies but adverse events indicate the necessity of exploring other avenues. Our group hypothesized that in situ gene correction of T lymphoid progenitors in the thymus itself may overcome some of the drawbacks of ex vivo gene therapy. While intrathymic (IT) lentiviral vector administration corrected immunodeficient thymocyte precursors in mice, thymus transduction was inefficient and efficacy in macaques was limited.During my PhD, I assessed the in vivo potential of adeno-associated vectors (AAV) to transduce thymocyte precursors. Intrathymic administration of several different scAAV2 serotypes resulted in a >10-fold higher transduction of thymocytes (3-5%) as compared to lentiviral vectors. scAAV2/8 promoted the highest level of gene transfer and strikingly, transduced cells represented up to 1% of peripheral T lymphocytes in immunocompetent mice. Using ZAP-70-/- immunodeficient mice as a paradigm, I found that IT injection of an AAV2/8-ZAP-70 vector resulted in a rapid transduction and T cell differentiation, correlating with a dramatic generation of the thymus medulla. Indeed, medullary thymic epithelial cells (mTEC) expressing the AIRE autoimmune regulator were detected within <2 weeks. While this reconstitution was transient––AIRE+ mTECs decreased by 10 weeks post gene transfer––gene-corrected peripheral T cells, harboring approximately 1 AAV genome/ cell, persisted for >40 weeks. Effector T cells had the potential to secrete high levels of cytokines and significant numbers of gene-corrected regulatory T cells were also generated. Thus, a single wave of thymopoiesis, from intrathymic AAV-ZAP-70-transduced progenitors, allows for a rapid but transient restoration of the thymic architecture and long-term peripheral T cell function.To better assess the diverse TEC populations that orchestrate T cell development and selection, I collaborated with the groups of P. Jay/J. Abramson/I. Amit to combine single cell analysis and in-vivo fate-mapping to de novo characterize the entire stromal compartment of the thymus. Our analyses highlighted four major medullary TEC (mTEC I-IV) populations with distinct lineage regulator function and specifically, we found that mTEC-IV constitutes a highly divergent TEC subset that bears strong molecular and morphological characteristics to intestinal tuft cells. As we previously identified tuft cell secretion of IL-25 as a regulator of the crosstalk between the epithelial and hematopoietic compartments in the gut, we assessed the potential immune-modulatory function of mTEC-IV. Notably, mice deficient in intestinal tuft cells exhibited a specific depletion of mTEC-IV and a perturbed homeostasis of various IL25-R-expressing populations in the thymus. Taken together, our data identify a new tuft TEC population critical for shaping the thymus immune niche.In conclusion, the data generated during my PhD advance the therapeutic potential of intrathymic-based vector strategies for the treatment of patients requiring a rapid T cell reconstitution and provide new insights into thymic stromal subsets that are critical for shaping the thymus immune niche