Thèses sur le sujet « Comunità microbica »

La qualità delle fave di cacao disponibili in commercio, che rappresentano la principale materia prima per la produzione di cioccolato, dipende da diversi fattori inclusi: il tipo di piantagione, le pratiche agricole ed il processo di post raccolta. Tra queste; fermentazione ed essicazzione sono generalmente considerate le più rilevanti, dal momento in cui, durante queste fasi, vengono formati e fissati i precursori degli aromi del cacao. Inoltre, esse rappresentano un step cruciale durante il quale possono verificarsi contaminazioni da parte dei funghi filamentosi. La fermentazione è caratterizzata da una successione ben definita di lieviti, batteri lattici e batteri acetici, a tal fine, lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di esplorare e descrivere in modo completo le comunità batteriche e fungine coinvolte nella fermentazione delle fave di cacao e valutare se l’origine geografica ed il metodo di fermentazione potessero influenzare la loro composizione. Per ottenere tali risultati il gene 16s rRNA è stato usato come marker per descrivere la comunità batterica totale mediante High Throughput Sequencing (HTS), dimostrando come tale approccio abbia la capacità di evidenziare la totalità delle comunità batteriche a livello di specie. In un secondo approccio l’Internal Transcribed Spacer 1 (ITS1) ed il dominio D1/D2 della sub unità maggiore dell’RNA ribosomiale (26s rRNA) sono stati selezionati per descrivere la popolazione fungina. I risultati hanno evidenziato come le due regioni abbiano la capacità di descrivere la composizione generale delle popolazioni, sebbene il dominio D1/D2 sia stato in grado di analizzare più nel dettaglio la composizione. Infine gli stessi campioni sottoposti all’analisi mediante HTS sono stati analizzati mediante SPME-GC-MS per evidenziare i principali composti aromatici formatisi durante il processo di post raccolta. Complessivamente i risultati indicano chiaramente che l’approccio mediante HTS ha le potenzialità per fornire una dettagliata visione d’insieme delle comunità batteriche e fungine presenti durante le fasi di post raccolta delle fave di cacao, inoltre le analisi statistiche hanno evidenziato come l’ITS1 ed i composti volatili possano essere utilizzati per la tracciabilità geografica.
The quality of commercial cocoa beans, the principal raw material for chocolate production, depends on several factors including type of plantations, the agricultural practices and the post-harvest processing. Among these, fermentation and drying are generally considered the most relevant, since during these phases cocoa flavors precursors are formed and fixed. Furthermore, they represent crucial steps during which filamentous fungi contamination might occur. Fermentation is characterized by a well-defined succession of yeasts, lactic acid bacteria and acetic acid bacteria, so that, the aim of the described studies was to explore total bacterial and fungal communities involved in cocoa bean fermentation and to evaluate if geographical origin and fermentation method might affect their composition. To achieve these results, 16s rRNA gene was used as marker to assess the total bacterial community by using High Throughput Sequencing (HTS), indicating that this approach has the ability to provide a comprehensive view of the cocoa bean microbiota at the species level. In a second approach, Internal Transcribed Spacer 1 (ITS1) and the D1/D2 domain of the Large subunit (LSU) of the nuclear ribosomal RNA (26S rRNA) were screened to assess the total fungal community. Results revealed the ability of these two genomic regions to describe reliably the general composition, even if D1/D2domain was able to go deeper into the fungal composition resulting in a higher resolution. In the last approach the same samples subjected to HTS investigation were analyzed through SPME-GC-MS in order to underline the principal key-aroma compounds formed during the post-harvest processing. Overall, results point out clearly that HTS approach has the ability to provide a comprehensive view of the total bacterial and fungal communities, and statistical analyses have shown how analyses of ITS1 sequences and volatile compounds might be useful for the geographical traceability of the processed cocoa beans samples.

La qualità delle fave di cacao disponibili in commercio, che rappresentano la principale materia prima per la produzione di cioccolato, dipende da diversi fattori inclusi: il tipo di piantagione, le pratiche agricole ed il processo di post raccolta. Tra queste; fermentazione ed essicazzione sono generalmente considerate le più rilevanti, dal momento in cui, durante queste fasi, vengono formati e fissati i precursori degli aromi del cacao. Inoltre, esse rappresentano un step cruciale durante il quale possono verificarsi contaminazioni da parte dei funghi filamentosi. La fermentazione è caratterizzata da una successione ben definita di lieviti, batteri lattici e batteri acetici, a tal fine, lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di esplorare e descrivere in modo completo le comunità batteriche e fungine coinvolte nella fermentazione delle fave di cacao e valutare se l’origine geografica ed il metodo di fermentazione potessero influenzare la loro composizione. Per ottenere tali risultati il gene 16s rRNA è stato usato come marker per descrivere la comunità batterica totale mediante High Throughput Sequencing (HTS), dimostrando come tale approccio abbia la capacità di evidenziare la totalità delle comunità batteriche a livello di specie. In un secondo approccio l’Internal Transcribed Spacer 1 (ITS1) ed il dominio D1/D2 della sub unità maggiore dell’RNA ribosomiale (26s rRNA) sono stati selezionati per descrivere la popolazione fungina. I risultati hanno evidenziato come le due regioni abbiano la capacità di descrivere la composizione generale delle popolazioni, sebbene il dominio D1/D2 sia stato in grado di analizzare più nel dettaglio la composizione. Infine gli stessi campioni sottoposti all’analisi mediante HTS sono stati analizzati mediante SPME-GC-MS per evidenziare i principali composti aromatici formatisi durante il processo di post raccolta. Complessivamente i risultati indicano chiaramente che l’approccio mediante HTS ha le potenzialità per fornire una dettagliata visione d’insieme delle comunità batteriche e fungine presenti durante le fasi di post raccolta delle fave di cacao, inoltre le analisi statistiche hanno evidenziato come l’ITS1 ed i composti volatili possano essere utilizzati per la tracciabilità geografica.
The quality of commercial cocoa beans, the principal raw material for chocolate production, depends on several factors including type of plantations, the agricultural practices and the post-harvest processing. Among these, fermentation and drying are generally considered the most relevant, since during these phases cocoa flavors precursors are formed and fixed. Furthermore, they represent crucial steps during which filamentous fungi contamination might occur. Fermentation is characterized by a well-defined succession of yeasts, lactic acid bacteria and acetic acid bacteria, so that, the aim of the described studies was to explore total bacterial and fungal communities involved in cocoa bean fermentation and to evaluate if geographical origin and fermentation method might affect their composition. To achieve these results, 16s rRNA gene was used as marker to assess the total bacterial community by using High Throughput Sequencing (HTS), indicating that this approach has the ability to provide a comprehensive view of the cocoa bean microbiota at the species level. In a second approach, Internal Transcribed Spacer 1 (ITS1) and the D1/D2 domain of the Large subunit (LSU) of the nuclear ribosomal RNA (26S rRNA) were screened to assess the total fungal community. Results revealed the ability of these two genomic regions to describe reliably the general composition, even if D1/D2domain was able to go deeper into the fungal composition resulting in a higher resolution. In the last approach the same samples subjected to HTS investigation were analyzed through SPME-GC-MS in order to underline the principal key-aroma compounds formed during the post-harvest processing. Overall, results point out clearly that HTS approach has the ability to provide a comprehensive view of the total bacterial and fungal communities, and statistical analyses have shown how analyses of ITS1 sequences and volatile compounds might be useful for the geographical traceability of the processed cocoa beans samples.

2013 - 2014
Gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) sono composti complessi derivanti principalmente dal processo di combustione incompleta di qualunque materiale organico in carenza di ossigeno. L’interesse scientifico per questa classe di composti è legato principalmente alla loro riconosciuta azione cancerogena che deriva dalle trasformazioni metaboliche degli IPA in diolo-epossidi, molecole in grado di legarsi al DNA e di indurre mutazioni genetiche e cancerogenicità. La contaminazione di IPA nel suolo sta diventando un problema di grande interesse a causa dell'accumulo nella frazione organo-argillosa, che è attribuibile principalmente al carattere idrofobico di questi contaminanti. La bioremediation è una delle tecniche che può essere utilizzata per bonificare i siti contaminati da IPA. La comunità microbica del suolo, infatti, è in grado di degradare questi contaminanti organici grazie alla capacità di sintetizzare enzimi ligninolitici con una bassa specificità di substrato. Grazie a questa caratteristica e alla somiglianza chimica degli IPA con la lignina, gli enzimi ligninolitici possono utilizzare gli IPA come substrati. Lo scopo di questo progetto è stato quello di studiare la degradazione degli IPA nel suolo in funzione dell’attività microbica. A tale proposito sono stati caratterizzati dieci suoli, uno tra i quali è stato selezionato per l’allestimento di mesocosmi in condizioni controllate. Il suolo prescelto è stato campionato e contaminato con due IPA, il benzo[a]pirene e l’antracene (150 μg/g everyone). I mesocosmi sono stati allestiti in tre diversi trattamenti: il suolo tal quale, il suolo addizionato con compost e il suolo addizionato con funghi (A. mellea, P. eryngii, P. ostreatus, S. ferrei e S. citrinum). I mesocosmi sono stati incubati per 273 giorni, nel corso dei quali sono stati monitorati i seguenti parametri: le concentrazioni degli IPA, le attività enzimatiche coinvolte nel processo di degradazione (attività laccasica, catecolo-ossidasica e perossidasica totale), la biomassa e la struttura della comunità microbica mediante lo studio del profilo dei PLFA ed alcuni parametri chimico-fisici (tenore idrico, contenuto di sostanza organica e pH). In tutti e tre i suoli nel corso dei 273 giorni l'antracene è stato degradato molto velocemente fino a raggiungere una quantità residua intorno al 4%, mentre il benzo[a]pirene si è ridotto circa del 50%, mostrando una dinamica più lenta. La degradazione nei suoli con compost e con funghi è risultata più rapida rispetto al suolo tal quale. L'attività perossidasica totale è l'unica attività enzimatica che ha mostrato valori più alti nei due suoli addizionati rispetto al suolo tal quale. Soltanto l'attività laccasica ha mostrato una relazione con le dinamiche dei due IPA. In tutti e tre i suoli la biomassa microbica e la biomassa fungina si sono ridotte dopo 273 giorni di incubazione. La struttura della comunità a fine esperimento si è modificata in tutti e tre i suoli a favore dei batteri metanotrofi. Questi risultati hanno fornito importanti informazioni sul processo di degradazione degli IPA, sebbene sia necessario approfondire ulteriormente la tematica al fine di poter applicare in campo interventi efficienti di bioremediation. [a cura dell'autore]
XIII n.s.

In agricoltura, i pesticidi sono stati usati molto frequentemente per salvaguardare le colture dagli attacchi di parassiti e dalle malattie. Questi pesticidi, oltre a uccidere gli organismi target, molte volte colpiscono anche gli organismi non-target. Tra gli organismi non-target, possiamo individuare molti microrganismi utili a determinare la fertilità e la qualità del terreno. La presenza di questi xenobiotici nel terreno può influenzare i principali cicli biogeochimici (N, C, S, P) e altre vie metaboliche (es. β-ketoadipate). In questo studio abbiamo analizzato gli effetti di isoproturon, tebuconazole e chlorpyrifos sull’abbondanza, sulla struttura e sulla diversità della comunità microbica. Inoltre, abbiamo anche studiato gli effetti di questi pesticidi sui geni coinvolti nel ciclo dell’azoto. Si è potuto notare che l’abbondanza della comunità batterica è molto influenzata dall’applicazione del fungicida tebuconazole . Per quanto riguarda gli studi sulla funzionalità e diversità della popolazione microbica, l’applicazione di questi pesticidi sembra non indurre una chiara dose-dipendente e un effetto tempo. Diversamente, in relazione all’analisi sulla diversità microbica, possiamo affermare che l’applicazione di questi tre pesticidi ha influenzato il numero di OTU rilevate; tuttavia, l’indice di diversità (H’) ci dice che l’uso di questi pesticidi porta ad un incremento della diversità all’interno dei campioni trattati. In conclusione, è possibile affermare che l’applicazione di questi pesticidi influenza l’abbondanza e la funzionalità della popolazione microbica, ma non induce una diminuzione della diversità all’interno della medesima comunità.
In agriculture, pesticides have been frequently used to protect crops from pest and disease attacks. Many times such pesticides, besides killing the target organisms, hit non-target organisms. Among the non-target organisms, we can find many useful microorganisms that determine fertility and soil quality. The presence of these xenobiotics in soil can influence the main biogeochemical cycles (N, C, S, P) and other metabolic pathways (eg. Β-ketoadipate). In this study, we investigated the effects of isoproturon, tebuconazole and chlorpyrifos on the abundance, the structure and the diversity of the microbial community. We have also studied the effects of these pesticides on the genes involved in the nitrogen cycle. It was observed that the abundance of the bacterial community is significantly affected by the application of the fungicide tebuconazole. As for the studies on the functionality and the diversity of the bacterial population, the application of these pesticides does not seem to induce a clear dose-dependent nor a time effect. On the contrary, with respect to the analysis on microbial diversity, we observed that the application of these three pesticides did influence the number of detected OTU, whereas the diversity index (H') tells us that the use of such pesticides leads to an increase of diversity within the treated samples. Finally, we can conclude that the application of these pesticides affects the abundance and function of the microbial population, but does not lead to lower diversity within the same community.

In agricoltura, i pesticidi sono stati usati molto frequentemente per salvaguardare le colture dagli attacchi di parassiti e dalle malattie. Questi pesticidi, oltre a uccidere gli organismi target, molte volte colpiscono anche gli organismi non-target. Tra gli organismi non-target, possiamo individuare molti microrganismi utili a determinare la fertilità e la qualità del terreno. La presenza di questi xenobiotici nel terreno può influenzare i principali cicli biogeochimici (N, C, S, P) e altre vie metaboliche (es. β-ketoadipate). In questo studio abbiamo analizzato gli effetti di isoproturon, tebuconazole e chlorpyrifos sull’abbondanza, sulla struttura e sulla diversità della comunità microbica. Inoltre, abbiamo anche studiato gli effetti di questi pesticidi sui geni coinvolti nel ciclo dell’azoto. Si è potuto notare che l’abbondanza della comunità batterica è molto influenzata dall’applicazione del fungicida tebuconazole . Per quanto riguarda gli studi sulla funzionalità e diversità della popolazione microbica, l’applicazione di questi pesticidi sembra non indurre una chiara dose-dipendente e un effetto tempo. Diversamente, in relazione all’analisi sulla diversità microbica, possiamo affermare che l’applicazione di questi tre pesticidi ha influenzato il numero di OTU rilevate; tuttavia, l’indice di diversità (H’) ci dice che l’uso di questi pesticidi porta ad un incremento della diversità all’interno dei campioni trattati. In conclusione, è possibile affermare che l’applicazione di questi pesticidi influenza l’abbondanza e la funzionalità della popolazione microbica, ma non induce una diminuzione della diversità all’interno della medesima comunità.
In agriculture, pesticides have been frequently used to protect crops from pest and disease attacks. Many times such pesticides, besides killing the target organisms, hit non-target organisms. Among the non-target organisms, we can find many useful microorganisms that determine fertility and soil quality. The presence of these xenobiotics in soil can influence the main biogeochemical cycles (N, C, S, P) and other metabolic pathways (eg. Β-ketoadipate). In this study, we investigated the effects of isoproturon, tebuconazole and chlorpyrifos on the abundance, the structure and the diversity of the microbial community. We have also studied the effects of these pesticides on the genes involved in the nitrogen cycle. It was observed that the abundance of the bacterial community is significantly affected by the application of the fungicide tebuconazole. As for the studies on the functionality and the diversity of the bacterial population, the application of these pesticides does not seem to induce a clear dose-dependent nor a time effect. On the contrary, with respect to the analysis on microbial diversity, we observed that the application of these three pesticides did influence the number of detected OTU, whereas the diversity index (H') tells us that the use of such pesticides leads to an increase of diversity within the treated samples. Finally, we can conclude that the application of these pesticides affects the abundance and function of the microbial population, but does not lead to lower diversity within the same community.

Le comunità microbiche sono complesse associazioni di microrganismi che coesistono ed interagiscono fra loro, interferendo sulla composizione della matrice che colonizzano. Il loro studio del microbiota può essere condotto con metodi convenzionali e/o con tecniche di high-throughput sequencing. Questo progetto si è incentrato sullo studio del microbiota di matrici diverse (larve di Hermetia illucens, prosciutto cotto confezionato in atmosfera protettiva (MAP) e infiorescenze di Cannabis sativa) con metodi metagenomici e di microbiologia classica. Inoltre, è stata eseguita una caratterizzazione fisiologica e funzionale della specie Leuconostoc carnosum, frequente colonizzatore di prodotti carnei, specie a tutt’oggi poco studiata. È stato analizzato il microbiota di larve H. illucens alimentate con scarti agroalimentari, nella prospettiva di produrre mangimi innovativi per galline ovaiole. Sono state testate 3 diverse temperature di allevamento delle larve per valutare l’influenza sul microbiota dell'insetto, utilizzando tecniche coltura-dipendenti per la valutazione del rischio microbiologico e analisi metagenomiche basate sul sequenziamento del gene 16S rRNA. Le temperature più alte hanno accelerato lo sviluppo larvale e determinato una maggiore biomassa finale e una maggiore mortalità. In base all’analisi metagenomica, il microbiota delle larve è dominato dal genere Providencia e da altri Proteobateria. Nello stadio di prepupe aumentano la complessità della composizione e l’abbondanza relativa di Actinobacteria, Bacteroidetes e Bacilli. Le tecniche coltura dipendenti hanno evidenziato un’elevata carica di mesofili totali (108 ufc/g) e di patogeni opportunisti che possono compromettere la stabilità della biomassa e la safety del prodotto. Un approccio combinato metagenomico e coltura dipendente è stato utilizzato per studiare l’evoluzione del microbiota del prosciutto cotto in MAP, durante la shelf-life secondaria. La qualità del prosciutto cotto dopo l’apertura, durante i 12 giorni di conservazione a 7°C, è stata valutata attraverso analisi microbiologiche, molecolari, sensoriali e chimiche. Lo studio ha evidenziato una grande variabilità nella composizione del microbiota legata soprattutto al produttore, confermando che durante la shelf-life il prodotto è già colonizzato da una comunità complessa. Lo studio del microbiota è stato esteso a inflorescenze di 9 varietà di C. sativa ad uso industriale, raccolte ed essiccate in tre località Italiane, destinate alla produzione di biochemicals di interesse manifatturiero e cosmeceutico. Nel complesso le varietà raccolte a Rovigo presentavano una maggiore contaminazione in aerobi totali. La presenza di Salmonella è stata evidenziata nei campioni ottenuti da Rovigo e Acireale, mentre era assente in quelli raccolti a Caserta. Il progetto di tesi ha riguardato anche lo studio comparativo delle caratteristiche biochimiche, fisiologiche e funzionali della specie L. carnosum, a cui appartengono numerosi ceppi isolati da prosciutto cotto e altre matrici carnee dove possono svolgere una duplice funzione, o preservante o deteriorante. Sono stati analizzati 12 ceppi, che sviluppano a temperature comprese fra 4 e 37° C, in presenza di NaCl fino a 60 g/L. Sei ceppi producono esopolisaccaridi, responsabili della comparsa di essudati mucosi. È emerso un potenziale ruolo protettivo dei ceppi L. carnosum WC0321 e L. carnosum WC0323 nei confronti di Listeria monocytogenes. Tre ceppi selezionati sono stati saggiati per la capacità di colonizzare un modello murino e sono state studiate le loro proprietà immunomodulatorie. I ceppi, nonostante la perdita di vitalità durante il transito gastrointestinale, hanno mostrato diversi effetti immunomodulatori sulla maturazione delle cellule dendritiche in vivo, suggerendo un impatto positivo sulla salute dell’ospite.
Microbial communities are complex associations of microorganisms that coexist and interact with each other, interfering with the composition of the matrix they colonise. The study of microbiota can be conducted with conventional microbiological methods and/or with high-throughput sequencing techniques. In this thesis, the microbiota of different matrices (cooked ham packaged in a protective atmosphere (MAP), larvae of Hermetia illucens, and inflorescences of Cannabis sativa) was characterised by metagenomic analysis and/or classical microbiology techniques. In addition, a physiological and functional characterisation of Leuconostoc carnosum, a frequent colonizer of meat products, species still poorly studied, was performed. Thanks to the disclosure of L. carnosum genome, it was possible to resolve the phylogenetic relationships within the genus Leuconostoc through a phylogenomic approach. A combined metagenomic and culture-dependent approach was used to study the evolution of the microbiota of cooked ham in MAP, in order to determine the secondary shelf-life. The quality of the cooked ham after opening, during 12 days of storage at 4 °C, was assessed through microbiological, molecular, sensory, and chemical analyses. The study highlighted a great variability in the composition of the microbiota, mostly associated to the producer, confirming that during the shelf-life the product is already abundantly colonised by a rather complex community. Biochemical, physiological, and functional features of L. carnosum, frequently isolated from cooked ham and other meat matrices, were determined. This species can perform a dual function in meat products, either preserving or deteriorating them. Twelve strains that developed at temperatures between 4 and 37 °C and in the presence of NaCl up to 60 g/L, were analysed. Six strains produced exopolysaccharides responsible for the appearance of mucous exudates. A potential protective role of L. carnosum WC0321 and L. carnosum WC0323 emerged against Listeria monocytogenes. Three selected strains were tested for the ability to colonize a murine model, and their immunomodulatory properties were investigated. Despite the loss of viability during the passage through the gastrointestinal transit, the strains showed different immunomodulatory effects on dendritic cell maturation in vivo, suggesting a positive impact on the host's health. Phylogenomic analysis of the genus Leuconostoc was carried out. 216 deposited genome sequences were subjected to phylogenomic analysis based on the Average Nucleotide Identity (ANI) and the core genome alignment, resulting in a proposal of phylogenomic reorganization of the genus. Microbiological analysis of two diverse potential ingredients for novel foods/feeds and nutraceutical were carried out on larvae and prepupae of Hermetia illucens, and inflorescences of Cannabis sativa. The microbiota of larvae H. illucens fed with waste from agri-food industries has been determined, in order to develop innovative feed for laying hens. Three rearing temperatures of larvae were assayed to evaluate the influence on the insect microbiota. The higher temperatures favoured faster larval development and resulted in higher final biomass and mortality. The culture-dependent approach showed a high load of total mesophiles (108 cfu/g) and opportunistic pathogens, that can compromise the stability of the biomass and the safety of the product. Inflorescences of 7 varieties of C. sativa for industrial purposes were analysed. They were collected and dried in two Italian locations, with the aim to produce biochemicals for manufacturing and cosmeceutical interest. Overall, the varieties collected in Rovigo showed higher contamination in total aerobes.

Microbial communities are ubiquitous and play crucial roles in many natural processes (e.g., biogeochemical cycles and industrial processes). Despite their importance, however, there are still many aspects of microbial community dynamics that we do not fully understand. In this Thesis we provide two improvements to the approach used to study competition in microbial communities that can help us in this direction. The theoretical framework on which we build is MacArthur's consumer-resource model, commonly used to describe mathematically competition between microbes. The first improvement consists in introducing an optimization principle in the dynamics of such systems, so that we can include in mathematical models the well known fact that microbes can switch between different energy sources depending on environmental conditions. We require that each species does so in order to maximize its own relative fitness, and we explore the consequences of this choice on the biodiversity of competitive communities, comparing also the model with experimental data. Then, we reconsider the consumer-resource framework in light of experimental evidence showing that the allocation of cellular internal resources affects microbial growth. This new framework describes community dynamics at an intermediate level of complexity, allowing us to explore the relationship between population dynamics and microbial metabolism, which has attracted the attention of the scientific community in recent years. We compare the predictions of our new model with experimental data in a simple case, and then we study its predictions analytically and numerically to understand how biodiversity in competitive communities can be maintained.
Le comunità microbiche sono onnipresenti in natura, e giocano ruoli fondamentali in moltissimi processi naturali (come cicli biogeochimici e processi di produzione industriale). Nonostante la loro importanza, ci sono ancora molti aspetti delle comunità microbiche che non comprendiamo appieno. In questa Tesi vengono proposti due miglioramenti all'approccio nello studio della competizione in comunità microbiche che possono aiutarci in questa direzione. Il framework teorico sul quale si fonda il lavoro di questa Tesi è il modello consumer-resource di MacArthur, comunemente utilizzato per descrivere matematicamente la competizione fra specie microbiche. Il primo miglioramento consiste nell'introduzione di un principio di ottimizzazione nella dinamica di questo tipo di sistemi, di modo tale da includere nei modelli matematici il fatto (ben noto sperimentalmente) che i batteri possono passare da una fonte di energia all'altra a seconda delle condizioni ambientali. In particolare, in questa Tesi si impone che ogni specie faccia ciò con l'obiettivo di massimizzare il proprio tasso di crescita, e si esplorano le conseguenze di questa scelta sulla biodiversità di comunità competitive, confrontando anche il modello con dati sperimentali. Dopodiché, in questa Tesi il consumer-resource framework viene riconsiderato alla luce di evidenze sperimentali che mostrano come l'allocazione delle risorse cellulari interne influenzi la crescita di specie microbiche. Questo nuovo framework descrive le comunità a un livello intermedio di complessità, consentendo di esplorare la relazione fra dinamica delle popolazioni e metabolismo microbico, una relazione che ha attirato l'attenzione della comunità scientifica di recente. Le predizioni di questo nuovo framework vengono confrontate con dati sperimentali in un caso semplice, dopodiché il modello e le sue predizioni vengono studiati analiticamente e numericamente per capire come la biodiversità possa essere mantenuta in comunità competitive.

Gli idrocarburi petroliferi sono contaminanti molto diffusi. Per la bonifica di siti contaminati da idrocarburi possono essere usate sia tecniche chimico-fisiche, sia tecniche biologiche. Le tecniche biologiche hanno due vantaggi: consentono la completa rimozione del contaminante, invece che il trasferimento in un’altra fase, e sono più economiche. La biodegradazione è più rapida in condizioni aerobiche, ma l’aggiunta di ossigeno può essere costosa e tecnicamente difficile. Recentemente è stata proposta la possibilità di usare sistemi bioelettrochimici (BESs) come un approccio alternativo per la bonifica dei siti contaminati da idrocarburi. L’obiettivo di questa tesi di dottorato è di incrementare le conoscenze necessarie all’applicazione dei BESs per la biodegradazione degli idrocarburi. Le biobarriere (BBs) sono una nuova tecnologia per il trattamento delle falde contaminate. Le comunità microbiche di due BBs per il trattamento a scala di laboratorio di acque di falda contaminate da benzina sono state caratterizzate tramite metodi molecolari. Sono stati allestiti due esperimenti, con e senza inoculo microbico selezionato ma non si sono osservate differenze in termini di rimozione. Le comunità microbiche nella prova senza inoculo selezionato erano dominate dal genere Thauera, indicando la presenza di microambienti con bassa concentrazione di ossigeno. I risultati hanno mostrato the l’inoculo microbico è stato in grado di persistere solo parzialmente sulla pomice e che la bioaugmentation non ha portato ad un aumento delle capacità degradative. Inoltre il controllo della quantità di ossigeno è emerso come un parametro chiave per il successo del trattamento. L’uso di BESs potrebbe essere una valida alternativa per la stimolazione della degradazione anaerobica in BBs. Questa possibilità è stata studiata a livello preliminare usando per stimolare la degradazione di una miscela di BTEX e MTBE. Gli esperimenti hanno permesso di osservare la produzione di corrente elettrica associata alla degradazione degli idrocarburi. Durante il lavoro di tesi è stata inoltre valutata la possibilità di stimolare la rimozione degli idrocarburi in ambiente marino tramite metodi bioelettrochimici. Il toluene è stato usato come idrocarburo modello testando diversi potenziali anodici (0 mV e +300 mV vs Ag/AgCl) e le comunità microbiche sono state caratterizzate tramite sequenziamento del gene 16S rRNA. La degradazione del toluene è stata accoppiata alla produzione di corrente elettrica. Tuttavia, i picchi di corrente sono diminuiti nel tempo. Il monitoraggio delle concentrazioni di solfati/solfuri ha suggerito che il ciclo dello zolfo potrebbe giocare un ruolo importante nella degradazione bioelettrochimica del toluene, portando alla passivazione dell’anodo. Le comunità microbiche sono risultate essere dominate da solfato riduttori, in particolare la famiglia delle Desulfobulbaceae potrebbe essere legata sia alla produzione di corrente sia alla degradazione del toluene.

Scopo di questa tesi è studiare l’influenza delle acque dense di origine Nord-adriatica (NAdDW) sull’abbondanza , il metabolismo e la biodiversità delle comunità microbiche planctoniche dell’Adriatico meridionale. A tal fine queste masse d’acqua sono state intercettate nell’area compresa tra la penisola del Gargano e la città di Bari nel corso della campagna oceanografica condotta nel Marzo-Aprile 2012 nell’ambito del Progetto di Ricerca Bandiera RITMARE (Ricerca Italiana per il MARE). Nel corso della campagna, sono stati eseguiti campionamenti di acqua superficiale e profonda lungo transetti orientati dalla costa verso il mare aperto lungo la direzione di propagazione prevista dai modelli matematici. La possibile influenza delle NAdDW è stata investigata valutando l’abbondanza totale dei procarioti (Batteri ed Archea) e del nanoplancton, le principali variabili funzionali del metabolismo procariotico (tassi di respirazione e di produzione di carbonio) e la biodiversità dei batteri (descritta utilizzando la tecnica di fingerprinting genetico ARISA e il sequenziamento con tecnica di nuova generazione del gene 16S rDNA). I risultati prodotti per il comparto microbico si inseriscono nell’ambito di uno studio multidisciplinare condotto dal CNR-ISMAR di Venezia per la caratterizzazione del fenomeno delle acque dense.

Le moderne tecnologie di Next Generation Sequencing sono un componente cruciale nello studio di microrganismi e comunità microbiche grazie all’enorme quantità di dati fornita in breve tempo. Con queste tecnologie è possibile identificare e caratterizzare i microrganismi utilizzando un ampio numero di tool bioinformatici che possono sostituire le classiche tecniche di tipizzazione in vitro, portando un risparmio di tempo e risorse. La genomica e la metagenomica possono essere applicate a vari campi e forniscono informazioni sia riguardo un singolo organismo, sia su intere comunità microbiche. I nostri studi sono stati concentrati su due nicchie ecologiche: matrici alimentari e microbiota intestinale umano, entrambi importanti per la salute umana. Un prima parte della tesi descrive la comparazione genomica di 12 ceppi di Leuconostoc carnosum isolati da prodotti a base di carne. Questo batterio è un noto colonizzatore di queste matrici, ricopre un ruolo nel loro deterioramento, ma alcuni ceppi presentano effetti utili alla preservazione. Abbiamo eseguito un sequenziamento whole genome per tutti i ceppi, e dopo l’assembly sono state identificate le caratteristiche genomiche, la presenza di plasmidi, di geni responsabili di antibiotico-resistenza, produzione di batteriocine, sintesi di ammine biogene e abbiamo ricostruito i loro pathway metabolici. La comparazione ha rivelato che i ceppi sono strettamente correlati e condividono la maggior parte delle caratteristiche metaboliche, evidenziando l’adattamento all’ambiente di isolamento grazie alle 23 peptidasi presenti nel genoma core. Questo studio fornisce un approfondimento genomico e metabolico su questo batterio ubiquitario nei prodotti a base di carne. Un secondo progetto della tesi è stato indirizzato a indagare la presenza delle beta-glucuronidasi (GUS) nel microbiota intestinale umano attraverso una strategia metagenomica inedita. Le GUS prodotte dai batteri del microbiota sono capaci di rimuovere le porzioni di acido glucuronico da molti composti e metaboliti, come farmaci e xenobiotici. Queste molecole vengono coniugate con l’acido glucuronico nel fegato per l’escrezione attraverso il tratto gastrointestinale, quindi l’azione enzimatica potrebbe riattivarle permettendone il riassorbimento comportando un’alterazione dell’efficacia del farmaco ed effetti negativi sulla salute. Le GUS sono organizzate in classi in base alle differenze nel loro sito catalitico. Sono stati utilizzati 60 metagenomi ottenuti con shotgun sequencing provenienti da soggetti sani divisi in coorti in base alla provenienza geografica. Da questo set di dati, è stata definita la composizione batterica ed è stata sviluppata ed impiegata una nuova strategia per indagare la distribuzione delle diverse GUS. La beta diversità calcolata con gli indici di Jaccard e Bray-Curtis è stata impiegata per determinare le distanze tra i campioni e determinare le differenze tra essi in termini di distribuzione del tipo di GUS e abbondanza dei batteri che le contengono. Poiché alle differenze strutturali dell’enzima corrisponde una diversa specificità di substrato, e considerando la proporzione delle comunità batteriche contenenti GUS, possiamo valutare che la composizione del microbiota può alterare l’escrezione di alcuni farmaci o xenobioti e determinare un’ampia variabilità interindividuale in termini di risposta al farmaco. Un’ultima parte del progetto di tesi descrive l’applicazione dell’approccio metagenomico in due diversi studi: il primo incentrato a indagare la composizione microbica di campioni fecali arricchiti per identificare specie intestinali capaci di degradare la mucina, e il secondo focalizzato sulla descrizione del microbiota di larve di Hermetia illucens allevate per consumo umano o animale.
The modern Next Generation Sequencing technologies represent a crucial component in the study of microorganisms and microbial communities thanks to the huge quantity of data they can provide in a short period of time. These technologies allow the identification and characterization of microorganisms exploiting a vast number of bioinformatic tools that can replace the standard in vitro typing techniques, resulting in savings of time and resources. Genomics and metagenomics can be applied in different fields and they can provide information on single microorganism or on entire microbial communities. We focused our studies on two ecological niches: food matrices and human gut microbiome, due to their relevance to human health. The first work of this thesis is a comparative genomic study of 12 Leuconostoc carnosum strains isolated from meat-based products. This bacterium is a known colonizer of meat-based food matrices, it plays a role in spoilage, but preservative effects have also been proposed for some strains. In our study we performed whole genome sequencing for all the strains, and after genome assembly we identified their genomic features, the presence of plasmids, and genes related to antibiotic resistance, bacteriocins production, biogenic amines synthesis. We also reconstructed their metabolic pathways. The comparison revealed that the strains are closely related and share most of the metabolic features, confirming the adaptation to the meat environment due to the presence of 23 peptidase genes in their core genome. With this study we provided a deeper insight into the genomic and metabolic features of this bacterium ubiquitous in meat products. The second project of the thesis aimed to investigate through an inedited metagenomic strategy the presence of beta-glucuronidases (GUS) in the human gut microbiome. Beta-glucuronidases (GUS) produced by gut microbiome bacteria can remove glucuronic acid moieties from a vast range of compounds and metabolites, like drugs and xenobiotics. These molecules are conjugated with glucuronic acid in the liver to be excreted in the gastrointestinal tract, so the action of GUS may reactivate them allowing the reabsorption, with unpredictable and different efficacy of drugs and negative effect on health. GUS are classified in classes by the differences in the catalytic site. 60 shotgun sequenced metagenomic samples from healthy subjects, ascribed to five geographically distinct cohorts, have been retrieved. From this dataset, bacterial composition has been defined and a novel pipeline to investigate distribution the different GUS has been developed and utilized. Beta-diversity calculated on Bray-Curtis dissimilarity index has been used to determine the distances among samples and determine the differences among samples in terms of GUS type distribution and abundance of bacteria containing GUS. Since the structural differences in the enzyme involve a different substrate specificity, and taking into account the ratio of bacterial community harbouring GUS genes, we can assess that the microbiota composition can alter the excretion of certain drugs or xenobiotics, and determine a wide interindividual variability in terms of response to drugs. In the third part of the thesis, I present metagenomic analysis carried out in two other different studies, the former aimed to investigate the microbial composition in enriched human faecal samples to identify gut mucin degraders, and the latter focused on the description of the microbiota of Hermetia illucens larvae reared for food or feed consumption.

I solventi clorurati sono composti organici di sintesi appartenenti alla classe degli idrocarburi alifatici clorurati, largamente impiegati in diversi settori industriali e, come conseguenza, ampiamente diffusi nell’ambiente come inquinanti e particolarmente pericolosi anche per la salute umana. Tra i metodi di bonifica di siti contaminati da solventi clorurati, quelli basati sul biorisanamento sfruttano uno dei peculiari metabolismi batterici coinvolti nella biodegradazione di tali composti: la declorurazione riduttiva anaerobia in cui il composto clorurato è utilizzato come accettore terminale di elettroni in un vero e proprio processo di respirazione anaerobia, detta dealorespirazione; il cometabolismo aerobio in cui il composto clorurato viene fortuitamente ossidato ad opera di ossigenasi batteriche normalmente utilizzate per l’uptake del substrato di crescita preferenziale; l’ossidazione aerobia diretta in cui il composto clorurato funge da donatore di elettroni e substrato di crescita primario per il microrganismo. Il presente lavoro di tesi di dottorato si è occupato della caratterizzazione microbiologica di un’acqua contaminata da solventi clorurati, prevalentemente da 1,2-dicloroetano (1,2-DCA), e della valutazione del suo potenziale di biodegradazione, con l’obiettivo di sfruttare consorzi microbici autoctoni alla matrice contaminata per la definizione di un eventuale intervento di biorisanamento in situ. Le comunità microbiche autoctone dell’acqua contaminata sono state dapprima caratterizzate in termini di struttura, diversità e composizione, mediante ARISA (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) e 16S rRNA metabarcoding, evidenziando una grande variabilità: campioni di acqua raccolti da diversi punti di prelievo e in diversi periodi sono risultati infatti piuttosto eterogenei, sia da un punto di vista chimico-fisico che da un punto di vista microbiologico. Abbastanza limitata è risultata la presenza di specie batteriche note in grado di degradare solventi clorurati. La biodegradazione di 1,2-DCA è stata successivamente valutata mediante analisi gascromatografiche in spazio di testa effettuate in microcosmo. Allo scopo di indagare tutti i metabolismi biodegradativi noti nei confronti di 1,2-DCA, sono stati allestiti e opportunamente biostimolati microcosmi in aerobiosi e anaerobiosi. I microcosmi sono stati realizzati all’interno di vials con acqua contaminata, un opportuno terreno di coltura e una quota aggiunta di 1,2-DCA. Il monitoraggio della concentrazione di 1,2-DCA nel tempo ha mostrato elevati abbattimenti nei microcosmi anaerobi biostimolati in presenza/assenza di lattato e nei microcosmi biostimolati in presenza di O2. In entrambi, la caratterizzazione della comunità microbica ha evidenziato la presenza di batteri in grado di svolgere declorurazione riduttiva di solventi clorurati e dealogenazione idrolitica di 1,2-DCA. Nel DNA metagenomico dei suddetti microcosmi è stata anche rilevata la presenza di sequenze dei geni per una dealogenasi riduttiva specifica per 1,2-DCA (dcaA) e per la aloalcano dealogenasi (dhlA). Un’efficiente biodegradazione di 1,2-DCA è stata evidenziata anche in una simulazione di sistema di Barriera Reattiva Permeabile in colonna biostimolato con poli-β-idrossibutirrato (PHB), quale substrato fermentabile e donatore di elettroni a lento rilascio per i processi di declorurazione riduttiva. Il sistema in colonna è stato alimentato con l’acqua contaminata, inoculata con un consorzio batterico precedentemente arricchito su PHB. Infine, è stata avviata una sperimentazione che vede l’utilizzo di carrier biopolimerici biodegradabili come innovativa tecnologia di immobilizzazione di batteri biodegradatori direttamente reclutati dall’acqua contaminata, allo scopo di ottenere una maggiore efficienza di biodegradazione di solventi clorurati, a basso costo e in maniera ecocompatibile. Supporti in acido polilattico hanno dato preliminari evidenze sia di assorbimento del contaminante 1,2-DCA, sia di adesione microbica quando immersi nell’acqua contaminata in un sistema a scala di microcosmo.

In recent years it has increased the interest in the role that certain foods have on some chronic diseases in particular against free radicals. Furthermore, certain foods show positive effects on one or more specific functions of the body, in addition to the normal nutritional role, so as to improve the health and well-being and/or reduce the risk of diseases. In the olives and its derivatives it has been recognized antioxidant capacity and beneficial properties against degenerative diseases induced by oxidative stress, due to the particular fatty acid composition, the important concentration of phenolic compounds and the Vitamin E content. The phenolic content of olives and their transformation products may be influenced by several factors: variety (type of cultivar), processing methods, soil conditions, climatic and technological processes. In table olives functional characteristics and antioxidants are strongly influenced by the fermentation process mediated by microbial starters. The type of inoculum may conditioning the final characteristics of the product. This work is divided in two part. In the first part it were evaluated the nutraceutical characteristics of some monocultivar extravirgin olive oils from Italy by means of their phenolic and Vitamin E composition, and antioxidant capacity. Furthermore the technological performances, during the processing of table olives, of two starters were evaluated: a Single Strain LAB (SSL) starter culture and a Selected Inoculum Enrichment (SIE), made up of an undefined number of strains, taking natural fermentation (NF) as control. Fermentation profile has been traced monitoring microbial counts, pH, titratable acidity and volatile acidity development. Phenolic profile, antioxidant capacity, along with instrumental texture analyses and sensory evaluations have been carried out to define the impact of the technologies employed on the quality features during the processing and in the final products. In the second part of this thesis it were evaluated the antimicrobial and antibiofilm effects of some common foods typical of the Mediterranean diet (Allium sativum L .; Allium cepa L .; Ocimum basilicum, L .; Petroselinum crispum) and shiitake mushroom (Lentinula edodes) extracts. Actually this is an important topic of study within the renewed philosophy of “more natural life” and environmentally friendly. The Olive oils tested showed excellent quality characteristics. SIE resulted more efficient in supplanting the spoilage microbiota (Enterobacteriaceae) compared to SSL and NF. Both starters were able to lower the pH at security levels in a shorter time compared to NF driven fermentation that resulted in higher final pH levels and lower titratable acidity. Texture analyses showed that NF samples retained more cohesiveness and elasticity than inoculated samples. However, SIE samples texture resulted more firm and elastic, compared to SSL texture. Microbial starters efficiently debittered the olives in 5 months, while NF samples resulted not yet debittered at the end of the sampling period. The results obtained in the second part of the thesis shown an activity profile of the extract of garlic for most of the tested strains. The results obtained from the experiments on the biofilm showed the oppositive trend to expected, in contrast to the antimicrobial action of the extract. The foods we studied could produce increased activity in the commensal (greater biofilm physiological) reducing pathogenicity. The most important fact, concerning the extract of Lentinula edoses, is the increase of the biofilm of the probiotic compared to the pathogen (inhibited). This could allow the use of the shiitake mushroom in the treatment of periodontal disease.

In the semi-arid Mediterranean regions, extended reaches of rivers and streams show a recurrent dry phases of varying duration and spatial extent. It is important to study the effects of water stress on riverine ecological processes since freshwater systems are crucial in linking terrestrial and marine environments, My Doctorate thesis research, supported by the European TempQsim project (EVK1-CT2002-00112), was aimed to investigate the dynamics of microbial communities associated to sediments in temporary rivers. In particular, I have been investigating the effects of water stress on the structure and function of benthic bacterial communities and their role in the carbon cycle of rivers characterized by a seasonal hydrologic regime. Bacterial abundance and phylogenetic composition were assessed by molecular techniques, while bacterial activity was estimated by measuring the incorporation rates of radioactive tracers and by immunofluorescence. From a methodological point of view, all applied techniques required a specific optimization phase in order to increase their analytical efficiency. In particular, a detachment procedure to extract and purify bacterial cells from freshwater sediments was optimized by the combined use of different chemical and physical treatments, followed by high-speed density gradient centrifugation using the medium Nycodenz. This procedure was initially applied to analyze the benthic bacterial communities in rivers with stable water flow conditions (Rivers Albegna, Ente, Fiora – Tuscany, Italy; River Cremera – Lazio, Italy). In addition, the efficiency of specific in situ hybridization techniques (Fluorescence In Situ Hybridization with fluorescently monolabeled probes – FISH; Fluorescence In Situ Hybridization with signal amplification by Catalyzed Reporter Deposition – CARD-FISH) was tested with regards to the different physicochemical characteristics of selected sediments (i.e. sediment organic matter and moisture content). In this respect, CARD-FISH protocol was improved to better estimate the occurrence of specific phylogenetic clusters in dry sediments. For the field study, sediments were regularly collected at the river outlet section of the River Mulargia (Sardinia, Italy). A seasonal in-depth study was performed for benthic bacterial composition and activity analyses. Additional tests were performed in artificial microcosms to experimentally describe benthic bacterial responses to drying and rewetting processes, by simulating desiccation and re-inundation of sediments collected from four European temporary rivers (River Mulargia and Tagliamento - Italy; River Krathis - Greece; River Pardiela - Portugal). In a further laboratory experiment, the composition and activity of the bacterial community that primary colonized the water phase was followed in microcosms set up with Mulargia sediments. This study could contribute to better understand the ecological role of those benthic microbes that reside in a state of low-activity in dry sediments and promptly colonize the new incoming water at the end of the dry period. In synthesis, my Doctorate research contributed to a better understanding of the functional role of bacterial community in river sediments. The results could help to elucidate the mechanisms involved in the sediment transformation processes during drought periods, which are attended to increase in length and frequency as a possible effect of climatic changes.

De acuerdo con la línea de investigación de fermentación en estado sólido (FES) que actualmente se desarrolla en el grupo de investigación de compostaje (GICOM) el objetivo principal de esta tesis es desarrollar un proceso sustentable y a una escala representativa para la producción de celulasas utilizando residuos orgánicos. Con el fin de lograr este objetivo se analizaron diferentes residuos orgánicos y su potencial para la producción de celulasas a escala de laboratorio. Además, se utilizó compost como inoculo mixto, con el objetivo de incorporar el matriz sólida microorganismos capaces de degradar material lignocelulósicos. Luego de la selección de los mejores substratos en reactores de 0.5 L, se llevó a cabo el escalamiento del proceso en reactores de 10 L and 50 L. Todos los experimentos fueron desarrollados en condiciones cercanas a adiabáticas utilizando reactores aislados térmicamente. Durante el desarrollo del proceso, se realizó la monitorización de la actividad biológica reflejada como la velocidad especifica de consumo de oxígeno (sVCO) y temperatura. El principal desafío a superar cuando se trabaja con FES y residuos orgánicos son, por un lado, el desarrollo de un proceso en continuo y, por otro lado, que el proceso desarrollado sea reproducible y consistente. Ambas temáticas fueron abordadas durante el desarrollo de la tesis. Un primer acercamiento a un proceso en continuo se desarrolló para la producción de amilasas utilizando fibra de soja y residuos de pan como substrato y Thermomyces sp como inoculo. Se evaluaron tres estrategias de operación en reactores secuenciales, retirando del reactor una parte del sólido fermentado en el momento de: máxima sVCO y máxima actividad de amilasas. En esta última se evaluó la reinoculación con y sin extracción enzimática. En todas las estrategias se obtuvo un incremento por sobre el 200%. Debido al éxito de la operación en continuo para la producción de amilasas, se desarrolló un proceso similar para la producción de celulasas utilizando las condiciones operacionales desarrolladas a escala laboratorio. Inicialmente se consideró la incorporación de compost como inóculo (10%) y cascarilla de café como substrato (90%). Después de conseguir el máximo de actividad de celulasas, el sistema se continuó operando en ciclos, substrayendo una cantidad determinada de material y reemplazándolo por substrato fresco. Se trabajó con tasas de intercambio de 50% y 90%. Finalmente se pudo desarrollar exitosamente un proceso en continuo para la producción de celulasas, logrando producciones sostenidas en el tiempo entre 8-9 unidades de actividad por gramos de materia seca. Adicionalmente, se caracterizó el sólido fermentado obtenido al final de la fermentación con la finalidad de identificar las poblaciones microbianas presentes. En este sólido se identificaron una amplia gama de bacterias y hongos capaces de degradar material lignocelulósico, por lo que se catalogó como un inóculo especializado que podría ser utilizado con la finalidad de desarrollar un proceso reproducible; sin necesidad de la adición continua de nuevo inóculo. Finalmente, se evaluaron a escala piloto (50 L) la reproducibilidad y consistencia del proceso utilizando el inóculo especializado y cascarilla de café como substrato en triplicados. Adicionalmente, se analizaron las emisiones gaseosas generadas durante el proceso con la finalidad de determinar los posibles requerimientos de una unidad de tratamiento de gases. Los resultados obtenidos en estos experimentos mostraron que tanto la dinámica del proceso como la producción enzimática fueron consistentes y robustas. Además, el proceso puede ser catalogado como amigable con el medioambiente, debido a la valorización de residuos orgánicos, así como también debido a los bajos factores de emisión generados por el sistema.
According to the solid-state fermentation (SSF) research line of the composting research group GICOM, the main goal of this thesis is to develop a sustainable process for the production of carbohydrases using organic wastes in a representative scale. To achieve this goal, several organic wastes were screened on its potential to produce cellulase at laboratory scale. Also, compost was added as a complex mixture of biomass in order to provide cellulose-degrading microorganisms. After the selection of the two best substrates: orange peels and coffee husk using 0.5 L reactors, the scale up was assessed in 10 and 50 L reactors. All SSF were undertaken in near-adiabatic conditions using thermally isolated reactors with a continuous monitoring of the biological activity reflected as specific oxygen uptake rate (sOUR) and temperature. The main challenges to overcome in SSF using organic wastes is on one hand the possibility to work in a continuous configuration and, on the other hand, the reproducibility of the proposed process. These two aspects were assessed in this thesis. A first approach towards a continuous process was carried out for the production of amylase using bread waste and soy fiber as substrate and adding Thermomyces sp as inoculum. Three different strategies were developed in a sequential batch operation by removing part of the substrate in three diffeerent stages of the process: during maximum sOUR, maximum amylase activity and maximum amylase activity with a posterior enzymatic extraction. An increase of above 200% in amylase activity production was obtained in all the assessed strategies. Due to the success of the amylase production in a continuous configuration, the next step was to use the operational conditions obtained at laboratory scale for cellulase production and develop a sequential batch operation in 4.5L reactors. An initial compost addition as inoculum was considered only at the beginning of the fermentation. After reaching the maximum cellulase production the system started working in cycles, removing one part of the substrate and replacing it for fresh substrate. Two substrate exchange ratios were evaluated: 90% and 50%. Using this configuration, a continuous process was carried out, with a continuous production of cellulase and valorization of organic wastes and eliminating the requirement for fresh inoculum in each cycle. The sequential batch operation resulted in the successful production of cellulase with sustained values around 8-9 filter paper units per grams of dry matter in both configurations. In addition. the microbial communities present at the end of this operation was characterized, identifying several cellulose, lignin and hemicellulose degraders. This fermented solid was described as a specialized inoculum able to colonize the solid matrix of the reactor and provides the opportunity to develop a reproducible process. Finally, the reproducibility and consistency of the process was assessed in triplicates in a 50 L reactor using the specialized inoculum and coffee husk as the substrate. In addition the gaseous emissions were measured in order to fully understand the process and to determine the requirement of a gas treatment unit. Results showed that the process in consistent and robust with minor emissions of pollutants.

A educação ambiental constitui um valioso meio de despertar nos cidadãos e cidadãs, a partir de reflexões sobre a ética da relação ser humano-ambiente, a compreensão da necessidade de se investir em um modelo de gestão ambiental integrada e participativa dos municípios, como um passo importante para a consolidação de um modelo mais sustentável e justo de sociedade. A área escolhida para o desenvolvimento deste trabalho pertence a microbacia do córrego da Água Quente (São Carlos, SP), e se destaca pela beleza da paisagem e pela sua importância ambiental, em contraste com seu adiantado estágio de degradação ambiental, decorrente da interferência antrópica mal planejada. Através da caracterização ambiental desta área verde (com ênfase na qualidade da água e na biodiversidade) e do estudo da percepção e dos saberes locais da comunidade do entorno e de estudantes do ensino médio de três escolas estaduais inseridas na microbacia em relação a esse ecossistema, objetivamos gerar subsídios para o desenvolvimento de projetos de EA escolar e comunitária que visem a recuperação e conservação da área verde. A caracterização ambiental confirmou a má qualidade dos corpos d’água e a presença de um número bastante significativo de espécies animais e vegetais (considerando-se que é uma área impactada). A análise da percepção ambiental e dos saberes locais revelou que a maioria das(os) participantes possui com a área uma relação de topofilia, baseada principalmente no sentimento de pertencimento e na valorização estética desta paisagem, o que reflete em uma consciência ecológica. Entre as pessoas da comunidade, a maioria indicou o poder público como o responsável pela gestão da área verde e pelo atual estágio de degradação, desconsiderando o papel da população local, enquanto que a maioria das(os) estudantes acredita que cabe à comunidade local decidir sobre o manejo da área. Finalmente, apesar da evidente falta de participação política no que diz respeito às decisões sobre o manejo da área verde, ficou evidente, através das sugestões de manejo, que a maioria entende a importância da recuperação e conservação da área e percebe o seu grande potencial como espaço de lazer para a população sendo unânime, nos dois grupos participantes, o desejo de participar desse processo
Environmental education with an ethic basis performs a valious way to help citizens comprehension of the importance to invest in integrated and participative municipal environmental management model as an important step to consolidate a fairy and sutainable society. The choosen area to develop this study is located in Água Quente stream watershed (São Carlos, SP) which is distinguished by its landscape and environmental attributes which oppose to the advanced degree of environmental degradation due an anthropic action not planned. Through landscape characterization (with emphasis to water quality and biodiversity) together with environmental perception plus knowledge about this ecossystem from inhabitants of the surround area and students of three public high school located into the watershed, we aim generate subsidies to environmental education programs and projects in schools and with community which seek landscape restoration. Limnological studies of Água Quente stream confirmed the low water quality of water bodies. Avian survey showed that in the region occur a significative number of species despite area impactation. Vegetation studies showed that the area has a high variety of plant species althought few cerrado and forest vegetation sites remained. Environmental perception and people knowledge showed that majority of local dwellers has a topophilic relation based mainly in a belonging feeling, in ecological conscienciounes and valorization of landscape aesthetic. Among community people was mainly indicated that public government is responsible for area management while students believe that community should decide about area destinations. Analysing environmental management sugestions pointed by community and students is clear that everyone understands the importance of restoration and conservation importance for the watershed and notice its great potencial as a laisure place