Littérature scientifique sur le sujet « Citochinesi »

RIASSUNTOScopo – Il termine “stress” viene spesso usato come sinonimo di “vita moderna”. In questa revisione della letteratura abbiamo valutato la relazione tra lo stress e l'insorgenza o il decorso della depressione maggiore, dei disturbi cardiovascolari e delle malattie tumorali, le maggiori cause di morbidità e di mortalita nel mondo occidentale. Abbiamo anche discusso come i cambiamenti nei parametri del sistema immunitario indotti dallo stress possano essere considerati, almeno in parte, responsabili di questa relazione tra stress e malattia. Metodo – Abbiamo condotto una ricerca su Medline per il periodo 1996-2000, utilizzando i termine stress, disease (malattia) e immune system (sistema immunitario), allo scopo di identificare i più recenti sviluppi della ricerca in questo campo. Abbiamo anche rintracciato le più importanti pubblicazioni citate in questi articoli. Risultati – Gli studi in letteratura confermano il legame tra lo stress e l'insorgenza della depressione. Lo stress sembra anche avere un effetto negativo sulla prognosi dei disturbi cardiovascolari e delle malattie tumorali, ed evidenze preliminari suggeriscono che interventi di gestione dello stress possono migliorare la sopravvivenza in questi pazienti. Situazioni di stress cronico sono associate ad una soppressione della funzionalità del sistema immunitario, mentre stress acuti hanno un effetto sia attivante, sia inibitorio. La liberazione di citochine infiammatorie, mediatori solubili della risposta immunitaria, può indurre la comparsa di sintomi depressivi. Conclusioni – Studi epidemiologici prospettici sono necessari per chiarire il ruolo dello stress nell'insorgenza, decorso e prognosi delle malattie. L'utilizzo di terapie di gestione dello stress allo scopo di migliorare la prognosi dei pazienti con disturbi cardiovascolari, malattie tumorali ed altre malattie croniche, è un'area di ricerca particolarmente interessante. Gli effetti dello stress sul sistema immunitario sono importanti per capire il legame tra stress e malattia. In particolare, l'aumentata produzione di citochine infiammatorie durante situazioni di stress costituisce un possibile meccanismo biologico per spiegare il legame tra stress e depressione.

Esiste uno stretto legame tra anemia, malattia cardiovascolare e mortalità nei pazienti in dialisi. L'anemia rappresenta infatti un fattore prognostico negativo ed è associata a una scarsa sopravvivenza e a una ridotta qualità della vita nei soggetti in trattamento dialitico. Oggi, la disponibilità di numerosi agenti stimolanti l'eritropoiesi (ESAs) ha portato alla quasi completa scomparsa dell'anemia di grado severo che richiede emotrasfusioni. Nonostante questo una percentuale abbastanza consi-stente di pazienti, circa il 10%, non riesce ancora a raggiungere il valore di Hb target raccomandato dalle linee guida internazionali; il termine di Resistenza all'Eritro-poietina è stato quindi introdotto per definire quei pazienti che non raggiungono il target di Hb nonostante una dose di ESA superiore a quelle usuali o che continuamente necessitano di dosi più elevate per mantenere nel range i valori di Hb. Numerosi studi presenti in letteratura hanno evidenziato l'associazione tra incremento degli indici infiammatori e ridotta risposta agli ESA; l'infammazione cronica, mediante la produzione di citochine pro-inflammatorie determina soppressione midollare con inibizione della proliferazione e della differenziazione dei progenitori eritroidi e aumento dei livelli di una piccola proteina, l'epcidina, prodotta dal fegato in risposta a stimoli infiammatori che sembra fortemente legata al meccanismo della resistenza all'eritropoietina.

Rettocolite Ulcerosa e Morbo di Crohn, note come Malattie Infiammatorie Croniche Intestinali, sono largamente diffuse nei paesi occidentali. L'eziologia è multifattoriale e comprende una predisposizione genetica e squilibri immunologici del tratto digerente che attivano il processo flogistico della parete intestinale. La terapia delle Malattie Infiammatorie Intestinali comprende amino salicilati, cortisonici, immunosoppressori, ciclosporina e agenti biologici, farmaci gravati da una grave tossicità a lungo termine e da fenomeni di resistenza. Dal momento che granulociti e monociti attivati, insieme a citochine proinflammatorie e alla deregolazione dell'attività dei linfociti T regolatori (T®), hanno un ruolo cruciale nell'infiammazione cronica intestinale, l'aferesi selettiva dei monociti e dei granulociti, una tecnica che rimuove i leucociti attivati dal sangue in regime di circolazione extracorporea, potrebbe rappresentare un presidio terapeutico sicuro ed efficace. Vari studi multicentrici sull'efficacia terapeutica della granulocitoaferesi hanno dimostrato che questa rappresenta un'opzione sicura per i pazienti resistenti alla terapia farmacologica oppure un trattamento ben tollerato in associazione con protocolli terapeutici tradizionali, capace di indurre periodi di remissione clinica prolungati e una significativa riduzione dell'assunzione di cortisonici. Ulteriori studi sono necessari per definire meglio la frequenza del trattamento, i volumi ematici da processare, la migliore terapia farmacologica da associare alla granulocitoaferesi e la sua efficacia in altre patologie autoimmuni.

Nel mieloma multiplo (MM) le lesioni osteolitiche interessano prevalentemente lo scheletro assiale e la colonna vertebrale è la sede più frequente. Tipicamente la lesione erode l'osso spugnoso lasciando relativamente intatta la corticale. Alle immagini RM sono stati descritti tre pattern che in ordine decrescente sono: focale, diffuso e variegato. La patogenesi delle lesioni osteolitiche è legata ad una azione locale delle plasmacellule e delle cellule midollari non neoplastiche, le quali producono una vasta gamma di citochine che in ultima analisi stimolano gli osteoclasti. Recenti ricerche hanno dimostrato che il rapporto RANKL/OPG è critico per l'attivazione osteoclastica mentre un altro importante fattore osteoclastogenico, il MIP-1α, sembra agire attraverso una via differente. La modalità migliore per valutare le lesioni osteolitiche rimane la semplice radiografia, anche se la RM ha mostrato una maggiore sensibilità e viene usualmente impiegata nei pazienti asintomatici per predire la possibilità di fratture o di progressione di malattia. Sul piano terapeutico, la chirurgia classica non riveste un ruolo importante, mentre la nuova metodica della vertebroplastica si sta facendo strada in tutte le istituzioni. La radioterapia è confinata ad alcuni casi particolari. Il presidio medico più impiegato è costituito dai bisfosfonati, sopratutto quelli di ultima generazione che hanno dato un contributo significativo alla terapia di supporto ed hanno sicuramente migliorato la qualità di vita di questi pazienti. Esistono inoltre rari tumori costituiti da vasi sanguigni aberranti che vanno sotto il nome di emangiomi o emangioteliomi. Sono per la maggior parte benigni, ma se ne conoscono anche di diversi gradi di malignità con tendenza a recidivare. Spesso sono asintomatici e costituiscono un reperto occasionale. Presentano un aspetto radiologico abbastanza tipico. Sono sensibili alla radioterapia e possono anch'essi giovarsi della vertebroplastica.

We describe an uncommon severe clinical complication of sepsis – thyrotoxic storm (TS). Common biologic, pathogenic, clinical conditions that can determine sepsis can cause a TS. High circulating values of vascular cellular adhesive molecules-1 and various pro-inflammatory citochines are related with thyroid damage. During sepsis, moderate dysfunctions are not expression of actual disease, but severe damage in pituitary-thyroid hormonal axis. Thyroid stimulated hormon release, and consequent overproduction of thyroid hormones can cause TS. In critical patients, presence of hormonal dysfunctions determines more elevated clinical score of sepsis severity and higher risk of death than control groups (without thyroid disease) or survived patients.

Nelle persone che vivono con HIV (PLWH) i disturbi nella regolazione dell'espressione delle citochine possono influenzare in modo determinante l’esito della patologia favorendo, da un lato, l’insorgenza precoce di comorbilità e alterando, dall’altro, la risposta immune alle infezioni. Molte evidenze hanno dimostrato peraltro che l’esito della malattia da SARS-CoV-2 è strettamente correlato alla risposta immunitaria e alla preesistenza di comorbilità. <br />È evidente che entrambi i virus sono in grado di attivare meccanismi infiammatori, acuti nel caso di SARS-CoV-2, cronici nel caso di HIV, mentre le comorbilità sembrano rappresentare nel primo caso una causa, nel secondo un effetto del danno dovuto al virus. La disregolazione immune dovuta ad HIV potrebbe influenzare in modo determinante la risposta a SARS-CoV-2 sebbene, al momento, non sia ancora chiaro se PLWH abbiano una prognosi peggiore o migliore in caso di COVID-19. Entrambi i casi pongono in evidenza quanto infiammazione e comorbilità siano ormai un aspetto fondamentale nella fisiopatologia di molte malattie infettive e debbano essere studiate con attenzione per le loro importanti implicazioni nella clinica e nella terapia.

La citochinesi è quel processo regolato nel tempo e nello spazio tramite cui, dopo la segregazione dei cromosomi, le cellule eucariotiche dividono il loro citoplasma e le membrane per formare due cellule figlie indipendenti l’una dall’altra. Nel lievito gemmante Saccharomyces cerevisiae la citochinesi è promossa da vie finemente regolate che coordinano la divisione cellulare con la divisione nucleare al fine di garantire la stabilità genetica di cellule in crescita. Queste vie promuovono la contrazione dell’anello di actomiosina (AC) accoppiandola rispettivamente con la costrizione della membrana plasmatica e con la deposizione centripeta del setto primario (SP). Le vie che portano alla citochinesi sono parzialmente ridondanti e la loro contemporanea inattivazione causa un blocco della citochinesi e morte cellulare. Nelle cellule animali, il piano di divisione è specificato dal posizionamento del fuso mitotico e la citochinesi avviene grazie alla contrazione dell’anello di actomiosina, seguita dall’invaginazione della membrana plasmatica. In S. cerevisiae, il primo passo verso la citochinesi è l’assemblaggio di un anello rigido di septine attorno al collo della gemma contemporaneamente all’emissione della stessa, non appena le cellule entrano in fase S, definendo la posizione in cui avrà luogo la costrizione tra la cellula madre e la figlia in seguito all’uscita dalla mitosi. L’anello di septine funge da piattaforma di legame, al collo della gemma, per diverse proteine tra cui la catena pesante della miosina di tipo II, Myo1. Myo1 forma un anello al sito di emissione della gemma all’inizio della fase S in modo dipendente dalle septine. Alla fine dell’anafase un anello di actina si sovrappone con quello di Myo1 a generare il risultante anello di actomiosina la cui contrazione è strettamente accoppiata alla deposizione del setto primario. L’anello di septine permette la localizzazione anche di Iqg1 che, insieme a Bni1, è importante per il reclutamento dell’actina al collo della gemma, di Cyk3, richiesto per la corretta formazione del setto primario, e di Hof1, che colocalizza con l’anello di actomiosina durante la citochinesi. La successiva degradazione di Hof1 permette l’efficiente contrazione dell’anello di actomiosina e la separazione cellulare. Durante l’uscita dalla mitosi, la chitina sintasi Chs2 si localizza al sito di divisione e sintetizza il setto primario, composto di chitina, evento cha avviene in contemporanea con la contrazione dell’AC. Infine il setto secondario, che ha composizione simile a quella della parete di lievito, è deposto da entrambi i lati, della madre e della figlia, del setto primario. La successiva degradazione del setto primario dal solo lato della cellula figlia è garantita dal RAM pathway il quale viene attivato solo all’interno della gemma. A questo punto la cellula madre e la cellula figlia si separano definitivamente e questo processo lascia un disco di chitina (bud scar), residuo del setto primario, sulla superficie della cellula madre. Nel primo capitolo è stato descritto il ruolo delle ubiquitine ligasi Dma1 e Dma2 nella citochinesi. Queste proteine, a funzione almeno parzialmente ridondante, appartengono alla stessa famiglia FHA-RING ubiquitina ligasi di Chfr e Rnf8 umane e di Dma1 di Schizosaccharomyce pombe. In particolare abbiamo dimostrato che sia la mancanza di Dma1 e Dma2 che la moderata sovraproduzione di Dma2, nonostante non causino alterazioni nella progressione del ciclo cellulare, inficiano la contrazione dell’anello di actomiosina e la deposizione del setto primario. Inoltre, la moderata sovraproduzione di Dma2 impedisce l’interazione tra Tem1 e Iqg1, la quale è richiesta per la contrazione dell’AC, e causa la deposizione asimmetrica del setto primario nonché la delocalizzazione di Cyk3, un regolatore positivo di questo processo. Nell’insieme queste scoperte suggeriscono che le proteine Dma agiscono come dei regolatori negativi della citochinesi. Nel secondo capitolo è stato mostrato che l’ubiquitinazione della GTPasi Ras-like Tem1 è coinvolta nella regolazione della contrazione dell’anello di actomiosina. Tem1 non è richiesta per l’assemblaggio dell’AC ma per la sua dinamica. Nel primo capitolo abbiamo mostrato come questa proteina venga sottoposta ad ubiquitinazione ciclo-cellulare dipendente, in particolare la quantità di Tem1 ubiquitinata decresce quando le cellule iniziano a contrarre l’anello di actomiosina. In particolare, alti livelli di Dma2 inducono l’ubiquitinazione di Tem1, come anche l’inibizione della contrazione dell’AC. Analizzando le cinetiche di contrazione dell’AC in cellule che esprimono alti livelli di Dma2 e diverse varianti di Tem1 K-R ( in cui i residui di lisina sono stati sostituiti con arginine, rendendo così la proteina non ubiquitinabile), abbiamo dimostrato che l’ubiquitinazione di Tem1 sembra essere importante per l’inibizione Dma-dipendente della contrazione dell’anello di actomiosina. In particolare le lisine 112, 133 e 219 sembrano essere maggiormente implicate in questo processo. Nell’insieme questi dati suggeriscono che le proteine Dma agiscono come regolatori negativi della contrazione dell’AC influenzando in modo indiretto l’ubiquitinazione di Tem1. Nel terzo capitolo è stato mostrato come Dma1 e Dma2 sono coinvolte nel NoCut pathway, un checkpoint la cui attivazione previene la rottura dei cromosomi durante la divisione cellulare. La mancanza delle proteine Dma inficia l’attivazione del checkpoint in presenza di mutazioni che causano la permanenza di cromatina a livello del sito di divisione o danni alla zona centrale del fuso. Inoltre, la mancanza di Dma1 e Dma2 causa difetti di crescita se combinata con la delezione di geni coinvolti nel NoCut pathway o nei meccanismi che permettono la riparazione delle rotture del DNA che si vengono a generare quando il checkpoint non è perfettamente funzionante. Inoltre la mancanza delle proteine Dma, nonostante non sembra alterare la progressione del ciclo cellulare, quando combinata con la mancanza delle proteine Boi (le quali agiscono da inibitori dell’abscissione nel NoCut pathway) causa difetti di crescita dovuti ad un aumento della missegregazione cromosomica. Nell’insieme questi dati suggeriscono che le proteine Dma sono coinvolte nell’attivazione del NoCut pathway. Nell’ultimo capitolo è illustrata l’analisi della funzione di un nuovo fattore che regola la divisione cellulare: Vhs2. Nonostante questa proteina non sia essenziale per la vitalità cellulare, abbiamo dimostrato la sua implicazione nella stabilizzazione delle strutture generate dalle septine. La mancanza di Vhs2 causa difetti di crescita se combinata con diversi mutanti che affliggono la stabilità di queste strutture. Inoltre le cellule vhs2Δ mostrano per se un difetto nella stabilità delle septine infatti queste cellule mostrano un fenotipo tipico: le septine spariscono dal sito di divisione prima che il fuso venga disassemblato, mentre nelle cellule selvatiche le septine permangono fino alla fine della citochinesi. Abbiamo inoltre mostrato che Vhs2 è una proteina fosforilata e la sua fosforilazione decresce all’inizio della citochinesi ed è regolata dalla fosfatasi Cdc14.
Cytokinesis is the spatially and temporally regulated process by which, after chromosome segregation, eukaryotic cells divide their cytoplasm and membranes to produce two daughter cells independent of each other. In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae cytokinesis is driven by tightly regulated pathways that coordinate cell division with nuclear division to ensure the genetic stability during cell growth. These ways promote actomyosin ring (AMR) contraction coupled to plasma membrane constriction and to centripetal deposition of the primary septum, respectively. These pathways can partially substitute for each other, but their concomitant inactivation leads to cytokinesis block and cell death. In animal cells, the division plane is defined by the central spindle positioning and cytokinesis occurs through the contraction of the AMR, followed by the membrane furrowing. In S. cerevisiae, the first step towards cytokinesis is the assembly of a rigid septin ring, which forms at the bud neck concomitantly with bud emergence as soon as cells enter S phase and marks the position where constriction between mother and daughter cell will take place at the end of mitosis. The septin ring acts as a scaffold for the recruitment other proteins, among which Myo1, the heavy chain of the type II miosin. Myo1 forms a ring at the site of bud emergence at the onset of S phase in a septin-dependent manner. At the end of anaphase, an actin ring overlaps with that of Myo1 and the resulting contractile actomyosin ring drives primary septum deposition. The septin ring also recruits Iqg1 which is important, together with Bni1, for actin recruitment at the bud neck, Cyk3, required for proper synthesis of the septum, and Hof1, which is phosphorylated in telophase and colocalizes with the actomyosin ring during cytokinesis. The subsequent degradation of Hof1 allows efficient AMR contraction and cell separation. During mitotic exit, Chs2 localizes at the cell division site, where it drives synthesis of the primary septum, composed of chitin, simultaneously with actomyosin ring contraction. Afterwards the secondary septum, which has a similar composition to yeast cell wall, is produced on both the mother and the daughter side of the bud neck. The subsequent degradation of the primary septum from the daughter-side is ensured by the RAM pathway that is activated only in the bud. At this point mother and daughter cell separate permanently from each other leaving a chitin disk, that is the primary septum residue, called “bud scar", on the mother cell surface. In the first chapter we describe the role in cytokinesis of the functionally redundant FHA-RING ubiquitin ligases Dma1 and Dma2, that belong to the same ubiquitin ligase family as human Chfr and Rnf8 and Schizosaccharomyces pombe Dma1. In particular we show that both the lack of Dma1 and Dma2 and moderate Dma2 overproduction affect actomyosin ring contraction as well as primary septum deposition, although they do not apparently alter cell cycle progression of otherwise wild type cells. In addition, overproduction of Dma2 impairs the interaction between Tem1 and Iqg1, which is thought to be required for AMR contraction, and causes asymmetric primary septum deposition as well as mislocalization of Cyk3, a positive regulator of this process. In agreement with these multiple inhibitory effects, a Dma2 excess that does not cause any apparent defect in wild-type cells leads to lethal cytokinesis block in cells lacking the Hof1 protein, which is essential for primary septum formation in the absence of Cyk3. Altogether, these findings suggest that the Dma proteins act as negative regulators of cytokinesis. In the second chapter we show that the Ras-like GTPase Tem1 ubiquitylation is involved in AMR contraction regulation. Tem1 is not required for the actomyosin ring assembly but is required for its dynamics. In the first chapter we show how this protein undergoes cell cycle-regulated ubiquitylation, in particular the amount of ubiquitylated Tem1 decreases concomitantly with cells undergoing AMR contraction. Interestingly, high levels of Dma2 induce Tem1 ubiquitylation as well as inhibit AMR contraction. Analyzing the kinetics of AMR contraction in cells that express high levels of Dma2 and different Tem1 K-R variants (in which lysine residues were replaced by arginine residues, thus becoming not ubiquitylable), we show that Tem1 ubiquitylation seems to be important for Dma2’s AMR contraction inhibition. In particular lysines 112, 133 and 219 are mostly implicated in this regulation. Altogether, these findings suggest that the Dma proteins act as negative regulators of AMR contraction by indirectly influencing Tem1 ubiquitylation. In the third chapter we show that Dma1 and Dma2 are involved in the NoCut pathway, a checkpoint whose activation prevents chromosome breakage during cell division. The lack of Dma proteins affects checkpoint activation in the presence of mutations that cause chromatin persistance at the division site or spindle midzone damage. Moreover, the lack of Dma1 and Dma2 causes cell growth defect in combination with the deletion of genes involved in the NoCut pathway or in the mechanisms that permit DNA breaks repair generated when the checkpoint is not totally functional. Furthermore the lack of Dma proteins, although they do not apparently alter cell cycle progression, when combined with the lack of Boi proteins (that work as abscission inhibitors in the NoCut pathway) causes a growth defect due to an increase in chromosome missegregation. Altogether, these findings suggest that the Dma proteins act in the NoCut pathway. In the last chapther we describe the functional characterization of a new player in cell division control: Vhs2. Despite it is not essential for cells viability, we show how this protein is implicated in septins stabilizaton. The lack of Vhs2 causes cell growth defect in combination with several mutants that affect septin structure. Moreover vhs2Δ cells per se have a defect in septin stability, in fact these cells show a typical phenotype: the septins disappear from the division site before mitotic spindle disassembly, while in wild type cells septins remain until the end of cytokinesis. We also show that Vhs2 is subject to phosphorylations that decrease at the beginning of cytokinesis and that is regulated by Cdc14 phosphatase.

The aim of this experimental thesis focuses on the study of eye diseases related to the involvement of growth factors, of inflammatory cytokines in chronic-inflammatory, and of tissue remodeling. Particular emphasis has been addressed to the physiopathology of the eye surface and the complex relationships existing between cells and mediators in the immune response. Furthermore, the research has been directed to molecular events that control these biological responses. The lost in regulation of the inflammatory processes corresponds to the loss of control of the production/action of cytokines followed by the onset of inflammatory or autoimmune pathologies. Immunohistochemical technique has been performed in order to evaluate the physiopathological behaviour of inflammatory cytokines and of some growth factors (TGF-b1, IL-1b, IL-6, TNF-a and VEGF) located in the ocular tissues. Samples were obtained from human patients affected by glaucoma, diabetic retinopathy and macular degeneration. Our main purpose was to assess the levels of expression and localization of pro-inflammatory cytokines by immunohistochemistry in order to identify their involvement in the pathology, assuming for them a role in the modulation of these factors as a potential therapeutic target. Our study has shown an imbalance between pro- and anti-inflammatory cytokine plays a key role in the pathogenesis of retinal diseases. This disproportion within a complex regulatory network is related to some immunological processes that promote autoimmunity, chronic inflammation and / or tissue destruction. We were able to confirm that the inflammatory process involves a complex cascade of molecular and cellular biological signals, altering the physiological responses of the ocular tissues. The transmission electron microscopy investigation (TEM) showed that at the site of the lesion cells the probable release of molecular signals produces changes in the affected area: dilation of blood vessels resulting in increased blood flow and vascular permeability, exudation of fluid containing proteins such as immunoglobulins and invasion by leukocytes. It is well known that chronic and prolonged inflammation is a fundamental feature in some diseases such as atherosclerosis, obesity, diabetes, rheumatoid arthritis, asthma and various types of cancer. These diseases are strictly connected with their ocular manifestations: diabetic retinopathy, scleritis, uveitis, dry eye syndrome and ocular tumours. It should be noticed that pharmacological and clinical advances occur in areas apparently distant from application in ophthalmology, but they should be potentially used also in the ocular field by a translational application. Since many ocular tissues have a immune-privileged system to protect the delicate visual apparatus, the control of the acute inflammation is regulated by the same pathways and mediators that manage inflammatory responses in other organs. These scientific informations not only provide further support to the chronic inflammation, that plays a significant role in the pathogenesis of diabetic retinopathy, but also suggest that the inflammatory process is active even before retinopathy (diabetic and/or proliferative) is clinically diagnosed. Therefore, the alteration of the profile of some cytokines might be useful both as a predictive marker as well as an important target for the development of new therapeutic treatments. A novel pharmacological approach to treat eye inflammation may be represented by progress in the cellular therapy. In recent years, research has been devoted to the development of cell therapy applied to eye diseases producing a remarkably increased risk of visual impairment. Recently, cellular therapy has evolved into two research pathways: one finalized to a remodeling of the structure and the relative functions of specific tissues using stem cells; the other one has been focused on the restore of the immunological homeostasis controlling the harmful effects caused by inflammatory diseases.
Questo lavoro di tesi sperimentale è rivolto allo studio di alcune patologie oculari e al coinvolgimento di alcuni fattori di crescita e citochine infiammatorie in alcune condizioni cronico-infiammatorie e nel rimodellamento tissutale, con particolare interesse per la fisiopatologia della superficie oculare e al legame complesso tra cellule e mediatori nella risposta immune innata ed acquisita. Nello svolgimento dell’attività di ricerca particolare interesse è stato rivolto agli eventi molecolari deputati al controllo e allo spegnimento di queste risposte biologiche. La mancata regolazione dei processi infiammatori corrisponde infatti alla perdita del controllo della produzione/azione delle citochine e determina come conseguenza l’insorgere di patologie infiammatorie croniche o autoimmuni. In questo lavoro di tesi è stato valutato, mediante l'utilizzo della tecnica immunoistochimica, il ruolo fisiopatologico di alcune citochine infiammatorie e di alcuni fattori di crescita (TGF-b1, IL-1b, IL-6, TNF-a e VEGF) in tessuti oculari umani ottenuti da pazienti affetti da glaucoma, retinopatia diabetica ed degenerazione maculare in confronto ad analoghi tessuti umani normali. Pertanto il nostro principale scopo è stato quello di valutare i livelli di espressione e la localizzazione delle citochine pro-infiammatorie mediante tecnica immunoistochimica in modo da poter identificare il loro coinvolgimento nella patologia ipotizzando per esse un ruolo nella modulazione di tali fattori come potenziale bersaglio terapeutico. Come dimostrato nel nostro studio uno sbilanciamento tra citochine pro- e anti-infiammatorie giuoca un ruolo fondamentale nella patogenesi delle patologie retiniche. Tale sbilanciamento nell’ambito di un complesso network regolatorio è correlato ad alcuni processi immunologici che favoriscono autoimmunità, infiammazione cronica e/o distruzione tissutale. Nello svolgimento del lavoro di tesi è stato ulteriormente confermato come il processo infiammatorio comporti una complessa cascata di segnali biologici molecolari e cellulari, che alterano le risposte fisiologiche del tessuto oculare interessato. L'analisi in microscopia elettronica (TEM) ha evidenziato come presso il sito della lesione le cellule rilascino verosimilmente segnali molecolari che causano una serie di modificazioni nella zona interessata: dilatazione dei vasi sanguigni, con conseguente aumento del flusso sanguigno e della permeabilità vascolare, essudazione di liquidi contenenti proteine come le immunoglobuline ed invasione da parte dei leucociti. Risulta ampiamente noto come l’infiammazione cronica e prolungata sia una caratteristica determinante per malattie come aterosclerosi, obesità, diabete, artrite reumatoide, asma e diversi tipi di tumore. Molte di queste malattie si caratterizzano per una ormai consolidata manifestazione oculare: retinopatia diabetica, sclerite, uveite, sindrome dell’occhio secco e neoplasie oculari. Questo ci porta ad osservare attentamente anche i progressi farmacologici e clinici che si registrano in aree apparentemente distanti dall’applicazione in campo oftalmologico, ma che potenzialmente, per traslazione, potrebbero essere utilizzabili in prospettiva anche in campo oculare. Infatti, nonostante molti tessuti oculari abbiano un sistema immuno-privilegiato o altamente evoluto per proteggere il delicato apparato visivo, l’indispensabile controllo dell’infiammazione acuta è regolato dalle stesse vie generali e da mediatori e cellule effettrici che gestiscono le risposte infiammatorie in altri organi. Queste informazioni scientifiche non soltanto conferiscono ulteriore supporto al fatto che l’infiammazione cronica svolga un ruolo significativo nella patogenesi della retinopatia, ma suggeriscono, inoltre, che il processo infiammatorio si attivi prima ancora che la retinopatia (diabetica e/o proliferativa) sia clinicamente diagnosticata. L’alterazione nel profilo di alcune citochine potrebbe, quindi, diventare sia un marker predittivo, che un importante target per lo sviluppo di future opzioni terapeutiche. Un percorso radicalmente diverso dall’approccio farmacologico nella cura delle patologie infiammatorie oculari potrebbe in futuro essere rappresentato dai progressi dalla terapia cellulare. Negli ultimi anni si è evidenziato un crescente interesse per la possibile applicazione della terapia cellulare ad alcune patologie oculari che incidono maggiormente sul rischio di disabilità visiva. La terapia cellulare si può dividere in due ampie classi: una, attraverso l’impiego di cellule staminali, finalizzata al rimodellamento della struttura e della relativa funzionalità di specifici tessuti e cellule; l’altra, che utilizza cellule immunitarie nel ruolo di potenziali immunomodulatori dell’infiammazione, diretta al ripristino dell’omeostasi immunologica attraverso il controllo degli effetti nocivi provocati dalle patologie infiammatorie.

Tuberous sclerosis complex (TSC), an autosomal dominant disease, is characterized by the formation of hamartomas in various organs such as brain, kidney, skin, retina and heart, and is caused by mutations in TSC1 e TSC2 tumor suppressor genes, encoding hamartin and tuberin, respectively. Lymphangioleiomyomatosis (LAM) is a rare lung disease characterized by cystic lung destruction leading to progressive respiratory failure and formation of abdominal tumors. LAM can be sporadic or associated to TSC and LAM lung alterations resulting from proliferation of neoplastic cells bearing mutations in either TSC1 or TSC2 genes. A metastatic process has been proposed in dissemination of LAM and TSC cells to explain the identical TSC2 mutations and loss of heterozigosity (LOH) patterns in LAM cells of lung nodules, angiomyolipomas and lymph nodes of the same sporadic LAM patients, that is consistent with metastatic spread among organs. The aim of this project is to study the role of cytokines and matrix metalloproteinases in LAM and TSC. LAM/TSC cells, isolated from chylous of a patient affected by LAM associated to TSC, bear a TSC2 germline mutation and do not express tuberin for an epigenetic silencing of the TSC2 second allele that confirms our previously published evidence that an epigenetic alterations of TSC2 can cause the loss of tuberin in TSC cells. Treatment of LAM/TSC cells with 5-azacytidine that inhibits CpG DNA methylation led to the expression of tuberin as consequence of the chromatin remodeling. Proliferation of LAM/TSC cells is epidermal growth factor (EGF)-dependent and blockade of EGF receptor causes cell death, as we previously showed in cells lacking tuberin, while rapamycin, an mTOR inhibitor, significantly reduced proliferation. LAM/TSC cells have the ability to grow independently from adhesion and survive in adherent and nonadherent condition. For these features these cells are a good model to study the mechanisms of motility in LAM and TSC and the relation to tuberin expression. We studied the effect of anti-EGFR Ab and rapamycin on motility, cytokines and MMPs (Matrix metalloproteinases) expression. LAM/TSC cells spontaneously detach and undergo spontaneous cycles of adhesion and nonadhesion conditions likely for the inactivation of the focal adhesion kinase (FAK)/Akt/mTOR pathway. In LAM/TSC cells FAK inhibition caused the reduction of AKT phosphorylation which was followed by inhibition of mTOR phosphorylation and mTOR autophosphorylation and, consequently, by a strong reduction of S6 phosphorilation as it occurs in nonadherent cells. Anti-EGFR antibody and rapamycin reduced the viability of adherent and nonadherent cells while 5-azacytidine slightly increased the percentage of detaching cells. Nonadherent LAM/TSC cells underwent an extremely low proliferation rate consistent with tumour stem cell characteristics. One of the step driving EMT is the repression of E-cadherin, resulting in the loss of cell-cell adhesion. LAM/TSC cells did not express E-cadherin, but they express vimentin, marker of mesenchymal cells. EMT process controls the migration of cancer cells from primary tumors depending on an inflammatory microenvironment. LAM/TSC cells secreted high amount of IL-6, IL-8 and IL-1α, cytokines crucial for a variety of cancer cells. The levels of IL-6, IL-8 and IL-1α were not affected by rapamycin or anti-EGFR antibody but were regulated by tuberin expression since their levels were reduced by 5-azacytidine incubation. MMPs degrade and modify the extracellular matrix (ECM), facilitating detachment of cells from the tissue. Levels of MMP-2 and MMP-9 in urine are predictive of disease status in a variety of cancers and also in LAM. MMP-2 and MMP-9 levels are high in urine of LAM patients and MMP-2 is substantially up-regulated in their lung tissue. Matrilisin (MMP-7) contributes to tumor progression, invasion and is overexpressed in several types of invasive cancers. In adherent status LAM/TSC cells expressed higher levels of MMP-2 mRna and lower of MMP-7 than in nonadherent condition. Consistent with ECM degration and invasive features respectively,. MMP-2 and MMP-7 mRna expression appeared to be related to tuberin since they were significantly reduced by 5-azacytidine incubation. Anti-EGFR Ab and rapamycin significantly decreased MMP-2 mRna expression while their effect was the opposite on MMP-7. Extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN), is thought to affect tumor progression through its ability to stimulate MMPs expression. EMMPRIN expression, quantified by cytometric analysis, was reduced by 5-azacytidine and was much higher in LAM/TSC cells than in MCF7, breast cancer cells. Anti-EGFR antibody and rapamycin did not change EMMPRIN levels. For the mesenchymal feature of LAM/TSC cells and their ability to survive in adherent and nonadherent conditions, we evaluated LAM/TSC motility in wound healing assay providing an indication of cell migration rate. LAM/TSC cells closed wounds in about 11h, much faster than tumoral cells such as MCF7. Cell motility of LAM/TSC cells is related to tuberin expression since 5-azacytidine treatment, and the consequent induced-tuberin expression, increased the time of wound closure to 19h. However, 5-azacytidine treatment did not have any effect on MMP-2 and MMP-7 mRna expression in wound healing assay. Rapamycin and anti-EGFR Ab decreased the migration rate of LAM/TSC cells leading to the closure of wound in about 25h and causing an induced an increase of MMP-2 and MMP-7 levels. However during wound closure (50%) MMP-2 secretion was increased by anti-EGFR and rapamycin treatments and normalized at complete wound closure. In conclusion, LAM/TSC cells express invasive and migratory features which appear to be related to tuberin expression . Phosphorylation of FAK and MMP-2 expression was reduced in nonadherent LAM/TSC cells compared to adherent cells suggesting that FAK signaling was required for the activation of MMP-2 expression. MMP-2 and MMP-7 are related to the adherent and nonadherent conditions and are involved in the metastatic process proposed in dissemination of LAM cells. LAM/TSC cells have the ability to migrate and their motility is related to tuberin expression and reduced by anti-EGFR antibody and rapamycin. Rapamycin and anti-EGFR Ab control MMP-2 and MMP-7 expression and secretion during cell migration. These data suggest a specific role for MMP-2 and MMP-7 in LAM/TSC cell motility and thereby in the pathogenesis of LAM and TSC indicating their involvement in the metastatic process proposed in dissemination of LAM cells. The understanding of LAM/TSC cell features in motility is important for the assessment of cell invasiveness in LAM and TSC and provide highlights to sustain MMPs pathways as potential target for LAM. TSC and TSC related disorders.

Le mutazioni nei geni Progranulina (GRN) e C9orf72 sono responsabili della maggior parte dei casi familiari di Degenerazione Lobare Frontotemporale (FTLD), che è il tipo di demenza più frequente in età presenile ed è caratterizzata prevalentemente da disturbi comportamentali. Gli obiettivi di questa ricerca sono stati: 1) effettuare uno screening genetico su una popolazione di pazienti affetti da FTLD, al fine di identificare mutazioni causali 2) valutare i livelli di espressione di citochine e chemochine in pazienti portatori di mutazioni in GRN, c9orf72 e confrontarli con quelli dei casi sporadici e controlli 3) analizzare i livelli proteici di molecole infiammatorie nel liquor e sieri negli stessi gruppi di pazienti e controlli. Venti pazienti sono risultati portatori di mutazioni nel gene GRN, in due è stata rilevata una nuova mutazione, Cys149fs (g. 1159_1160TG), localizzata nell’esone 5 del gene GRN. La presenza dell’espansione della ripetizione G 4 C 2 , localizzata nel primo introne del gene c9orf72, è stata analizzata in un’ampia popolazione (772 pazienti FTLD, 22 con CBD e 33 PSP). Sono stati individuati quarantasei pazienti portatori dell’espansione. L’analisi condotta su pazienti affetti da CBD e PSP non ha prodotto alcun risultato positivo, così come lo screening su 222 controlli sani. Per quanto riguarda l’analisi dei livelli di espressione genica di citochine e chemochine, sono state utilizzate le piastre della Sabioscience selezionando 3 pazienti portatori dell’espansione in c9orf72, 6 pazienti portatori di mutazioni in GRN (3 sintomatici e 3 asintomatici), 3 casi sporadici di FTLD e 3 controlli di pari età. I risultati ottenuti mostrano una diminuzione generalizzata dei livelli di espressione di citochine e chemochine in pazienti portatori di mutazioni in GRN sintomatici rispetto ai controlli; in particolare, è stata rilevata una significativa down-regolazione dei livelli di interleuchina (IL)-4. Al contrario, prendendo in considerazione il profilo delle citochine nei casi sporadici di FTLD rispetto ai controlli, è emersa una tendenza opposta; in particolare, i livelli di espressione di IL-5 e Leukemia Inhibitory Factor (LIF) sono risultati aumentati in maniera statisticamente significativa. Nei pazienti portatori dell’espansione in c9orf72 invece abbiamo costatato un quadro più eterogeneo; in particolare, è emersa una significativa over-espressione dei livelli di chemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL-2 o MCP-1) e chemokine (C-X-C motif) ligand 10 (CXCL-10 o IP-10). I risultati di espressione ottenuti mettono in evidenza una tendenza opposta dei livelli di molecole infiammatorie tra i pazienti FTLD portatori di mutazioni in GRN o C9orf72 e casi sporadici di FTLD rispetto ai controlli, suggerendo la presenza di pathways patogenetici differenti tra pazienti portatori di mutazioni e non portatori. Sono stati infine valutati i livelli di citochine e chemochine nei liquor e sieri degli stessi gruppi di pazienti e controlli attraverso l’utilizzo della tecnologia Bioplex. L’analisi dei dati ottenuti mostra un aumento significativo dei livelli di CCL-2 e CXCL10 nel liquor di pazienti FTLD sporadici rispetto ai controlli; la medesima osservazione è stata fatta per i livelli liquorali di IP-10 in pazienti con FTLD portatori di mutazioni in GRN sintomatici rispetto ai controlli. D’altra parte, i livelli liquorali di RANTES sono risultati significativamente aumentati nel liquor di soggetti sani rispetto ai pazienti portatori di mutazione in GRN sintomatici e non portatori. I livelli liquorali di CXCL- 10 e RANTES non sono influenzati dall’età, mentre MCP-1 correla positivamente con l’età. Infine per quanto riguarda i portatori dell’espansione in C9orf72, nessuna molecola infiammatoria è stata trovata alterata in maniera statisticamente significativa.
Mutations in Progranulin (GRN) and Chromosome 9 Open Reading Frame 72 (C9orf72) genes are common causes of familial Frontotemporal Lobar Degeneration (FTLD), which represents the most common cause of dementia in presenile population. This study aimed to 1) perform a genetic screening in a population of patients with FTLD in order to identify pathogenic causal mutations 2) evaluate the expression of cytokines and chemokines in peripheral cells from GRN and C9orf72 carriers as compared with sporadic FTLD and controls 3) analyze protein levels of inflammatory molecules in CSF and sera of the same group of patients and controls. Twenty patients were carriers of GRN gene mutations, two of which had a novel mutation, Cys149fs (g. 1159_1160TG), located in exom 5 of GRN gene. The presence of G4C2 repeat expansion, positioned on the first intron of C9orf72 gene, was analyzed in a larger population (772 FTLD, 22 CBD and 33 PSP patients). Fourty-six patients with FTLD were carriers of pathogenetic repeat expansion, whereas none of CBD and PSP patients as well as 222 controls carried the mutation. Concerning gene expression analysis of cytokines or chemokines, Sabioscience PCR arrays were used in 3 C9orf72 expansion carriers, 6 GRN carriers (3 symptomatic and 3 asymptomatic), 3 sporadic FTLD cases and 3 age- matched controls. We observed a generalized down-regulation of cytokine and chemokine expression levels in GRN symptomatic carriers compared with controls; in particular Interleukin (IL)-4 expression levels showed a significant down- regulation. On the contrary, considering cytokines profiling of sporadic cases compared to controls, the opposite trend was observed; in particular, IL-5 and Leukemia Inhibitory Factor (LIF) expression levels showed a significant overexpression compared to controls. In C9orf72 expansion carriers compared with controls, we showed a more heterogeneous situation; in particular, chemokine (C- C motif) ligand 2 (CCL-2 or MCP-1) and chemokine (C-X-C motif) ligand 10 (CXCL- 10 or IP-10) were significantly over-expressed. These results showed an opposite trend of inflammatory molecules expression levels between FTLD GRN or C9orf72 carriers and sporadic patients compared with controls, suggesting different pathogenic pathways between mutation carriers and sporadic FTLD. To complete the study, we evaluated protein expression levels of cytokines and chemokines in Cerebrospinal Fluid (CSF) and serum from the same group of patients and controls through Bioplex technology. Data analysis showed that CCL- 2 and CXCL-10 levels were significantly increased in CSF from sporadic FTLD patients as compared to controls; the same observation was done for intrathecal CXCL-10 levels in patients with FTLD carrying GRN mutations compared with control subjects. Conversely, RANTES levels were increased in control subjects compared to sporadic FTLD cases and GRN symptomatic carriers. IP-10 and RANTES CSF levels were not likely to be influenced by age, whereas CCL-2 positively correlated with age. Finally regarding c9orf72 expansion carriers, none of inflammatory molecules was found statistically significant altered.

Psoriasis has recently been defined as “a T-cell mediated inflammatory skin disease with T helper cell type 1 (Th1), type 17 (Th17) and IL-22-producing CD4+ T cells as principal mediators”. The interplay between pro-inflammatory cytokines such as Tumour Necrosis Factor (TNF)-alpha, interleukin (IL)-17 and IL-22 and the two main epidermal cytotypes, i.e. keratinocytes and Langerhans cells, is a central issue in the pathogenesis of psoriasis. The aim of our study was to evaluate the early, direct, and specific effect of TNF-alpha, IL-17 and IL-22 alone or in combination by immunofluorescence on keratinocyte proliferation, keratin (K) 10, 14 and 17 expression, the molecular composition of intercellular junctions (desmocollin 1, E-cadherin, occludin and filaggrin), number of epidermal Langerhans cells. Transmission electron microscopy (TEM) was used to analyse the fine structure of the skin. An innovative model of human skin culture standardized in our laboratory, in which a psoriatic microenvironment was reproduced, was used. Skin explants were obtained from plastic surgery of healthy 20-40 year-old women (n = 7) after informed consent. Bioptic fragments were divided before adding TNF-alpha or IL-17 or IL-22 or a combination of the three cytokines (Triple), and harvested 24, 48, and 72 hours after cytokine incubation. Interestingly, keratinocyte proliferation was inhibited after exposure to TNF-alpha, IL-17 and the combination of cytokines while this parameter was not affected by IL-22 incubation. In all experimental groups, starting from 24 hours, occludin immunostaining was not homogeneously distributed. K10 immunostaining gradually decreased in scattered clusters in the spinous layer only after exposure to IL-22 or to a combination of the three cytokines. K14 staining became widely discontinuous with both IL-22 and the triple, starting from 48 hours. K17 expression was induced and progressively increased with time in the suprabasal layers of epidermis in all experimental groups, except TNF-alpha group. No differences were found in the expression of desmocollin 1 and the distribution of E-cadherin, at any time point. By immunofluorescence analysis with anti-human Langerin antibody we calculated the percentage of Langerhans cells/mm2 of living epidermis after 24 and 48 hours of incubation (considering control as 100%). At 24 hours Langerhans cells number was significantly higher in samples treated with a combination of IL-17 and TNF-alpha (216.71 + 15.10%; p < 0.001) and in TNF-alpha (125.74 + 26.24%; p < 0.05). No differences were observed in IL-17- treated samples (100.14 + 38.42%). After 48 hours, the number of epidermal Langerin-positive cells in IL-17- and TNF-alpha treated samples slightly decreased (94.99 + 36.79 % and 101.37 + 23% vs. their controls, respectively). With the combination of IL-17 and TNF-alpha epidermal Langerhans cells strongly decreased (120 +13.36%). At ultrastructural level, after IL-22 incubation we observed keratin aggregates in the perinuclear cytoplasm of cells, while the combination of the three cytokines induced an enlargement of intercellular spaces. By TEM, upon TNF-alpha stimulus, Langerhans cells appeared with few organelles, mostly mitochondria, lysosomes, and scattered peripherical Birbeck granules. Upon IL-17 stimulus, Langerhans cells showed a cytoplasm with many mitochondria and numerous Birbeck granules close to the perinuclear space and Golgi apparatus, but also at the periphery, at the beginning of the dendrites. The addition of a combination of IL-17 and TNF-alpha did not affect Langerhans cells ultrastructure. Altogether, our results support the hypothesis that a synergistic effect exists among the pro-inflammatory cytokines of psoriasis and that they interplay with each other in the microenvironment of the psoriatic plaque, with consequent amplification of the effect of each cytokine.

Liver transplantation has become the standard treatment for patients with terminal liver failure. The different forms of liver injury (acute, subacute, acute on chronic, chronic) are characterized by high mortality rates. The natural course of chronic liver injury is often complicated by acute episodes of potentially reversible decompensation, triggered by a sudden event such as infection or gastrointestinal bleeding. These episodes are defined as acute on chronic liver injury. The willingness to carry out transplants is limited by the shortage of organs resulting in longer waiting times for patients on the transplant list. In 2002, in Western Europe, more than 4,000 liver transplants were made, and the waiting list were more than 5000 patients. The extracorporeal liver support therapies have the aim of preparing the patient for transplantation and provide two different approaches: a biological one and non-organic one type. While biological approaches use hepatocytes or a whole organ (both animal and human), non-biological ones use filtration dialytic techniques and sorption. The aim of our study is to evaluate clinical efficacy of the Prometheus system liver for detoxification, improvement of the indices of nitrogen retention and improvement of the MELD score. We have dealt, with the Prometheus system, 7 patients with acute liver failure, we studied consecutively, for a total of 18 treatments. Primary outcome of treatment with the Prometheus system is to achieve optimal serum bilirubin levels. Was estimated plasma concentration of cytokines in patients treated with the Bio-Plex Suspension Array System. Our experience has confirmed that the Prometheus, while causing achieving the primary outcome to get a significant reduction in serum bilirubin, it does not affect the mortality of patients with terminal liver disease but must be viewed as an important tool in preparation for liver transplantation. The trend of plasma concentrations of cytokines measured by us showed that the prolongation of therapy involves the modulation of a greater number of cytokines, in particular the down-regulation of pro-inflammatory ones, such as IP10, IL-6, IL-8, PDGF bb and RANTES accompanied by a decrease in apoptosis. The system optimization and further results, still being processed, could be developed on two fronts: · Implementation of knowledge on the pathophysiological mechanisms that relate to the inflammatory process metabolic decompensation in the course of acute liver failure from chronic liver disease · Final implementation of the Prometheus system as a bridge to liver transplantation in face of increasingly significant mismatch between the pool of available donors and the number of waiting list patients for liver transplantation
Il trapianto di fegato è diventato il trattamento standard per pazienti con insufficienza epatica terminale. Le differenti forme di danno epatico (acuto, subacuto, acuto su cronico, cronico) sono caratterizzate da alti tassi di mortalità. Il corso naturale del danno epatico cronico è complicato spesso da episodi acuti di scompenso, potenzialmente reversibili, innescati da un evento improvviso quale un’infezione o un sanguinamento gastrointestinale, episodi che vengono definiti come danno epatico acuto su cronico. La disponibilità ad effettuare i trapianti è limitata dalla scarsa disponibilità di organi con conseguente allungamento dei tempi d’attesa per i pazienti in lista di trapianto. Nel 2002 sono stati effettuati, in Europa occidentale, oltre 4000 trapianti di fegato e in lista d’attesa erano presenti più di 5000 pazienti. Le terapie di supporto epatico extracorporeo hanno la scopo di preparare il paziente al trapianto e prevedono due diversi approcci: uno di tipo biologico e uno di tipo non biologico. Mentre quelli di tipo biologico utilizzano epatociti o l’organo intero (sia di origine animale che umana), quelli non biologici utilizzano tecniche dialitiche di filtrazione e adsorbimento. Lo scopo del nostro studio è la valutazione dell’efficacia clinica del sistema Prometheus per la detossificazione epatica, il miglioramento degli indici di ritenzione azotata e miglioramento del MELD score. Abbiamo trattato con il sistema Prometheus 7 pazienti con insufficienza epatica acuta, consecutivamente giunti alla nostra osservazione, per un totale di 18 trattamenti. Outcome primario dei trattamenti con il sistema Prometheus consiste nel raggiungimento di valori sierici di bilirubina ottimali. E’ stata valutata la concentrazione plasmatica delle citochine nei pazienti trattati con il sistema Bio-Plex Suspension Array System. La nostra esperienza ha confermato che il sistema Prometheus, pur determinando il raggiungimento dell’outcome primario di ottenere una importante riduzione dei livelli sierici di bilirubina, non incide sulla mortalità dei pazienti epatopatici terminali ma va considerato come un importante strumento di preparazione al trapianto di fegato. L’andamento delle concentrazioni plasmatiche delle citochine da noi dosate ha evidenziato che il prolungamento della terapia comporta la modulazione di un numero maggiore di citochine, in particolare la down-regolazione di quelle pro-infiammatorie, come IP10, IL-6, IL-8, PDGF bb e RANTES accompagnata da una diminuzione della apoptosi. La ottimizzazione del sistema e gli ulteriori risultati ancora in fase di elaborazione potranno svilupparsi su due fronti: - implementazione delle conoscenze sui meccanismi fisiopatologici che correlano il processo flogistico allo scompenso metabolico in corso di insufficienza epatica acuta da epatopatia cronica - applicazione definitiva del Sistema Prometheus come bridge al trapianto epatico, a fronte del sempre più rilevante mismatch tra il pool dei donatori disponibili e il numero dei pazienti in lista in attesa di trapianto epatico.

Citokines are proteins produced by several cell types and secreted in response to various stimuli. These molecules are able to modify the behaviour of other cells inducing activities like growth, differentiation and apoptosis. In the last years, veterinary scientists have investigated the role played by these factors; in fact, cytokines can act as intercellular communicative signals in immune response, cell damage repair and hematopoiesis. Up to date, various cytokines have been identified and in depth comprehension of their effects in physiology, pathology and therapy is an interesting field of research. This thesis aims to understand the role played by these mediators during natural or experimentally induced pathologies. In particular, it has been evaluated the genic and protein expressions of a large number of cytokines during several diseases and starting from different matrix. Considering the heterogeneity of materials used in experimentations, multiple methods and protocols of nucleic acids and proteins extractions have been standardized. Results on cytokines expression obtained from various in vitro and in vivo experimental studies have shown how important these mediators are in regulation and modulation of the host immune response also in veterinary medicine. In particular, the analysis of inflammatory and septic markers, like cytokines, has allowed a better understanding in the pathogenesis during horse Recurrent Airway Obstruction, foal sepsis, Bovine Viral Diarrhea Virus infection and dog Parvovirus infection and the effects of these agents on the host immune system. As experimentations with mice have shown, some pathologies of the respiratory and nervous system can be reduced or even erased by blocking cytokines inflammatory production. The in vitro cytokines expression evaluation in cells which are in vivo involved in the response to exogenous (like pathogens) or endogenous (as it happens during autoimmune diseases) inflammatory stimuli could represent a model for studying citokines effects during the host immune response. This has been analyzed using lymphocytes cultured with several St. aureus strains isolated from bovine mastitic milk and different colostrum products. In the first experiment different cytokines were expressed depending on enterotoxins produced, justifying a different behaviour of the microrganism in the mammal gland. In the second one, bone marrow cells derived incubated with murine lymphocytes with colostrum products have shown various cluster of differentiation expression , different proliferation and a modified cytokines profile. A better understanding of cytokine expression mechanisms will increase the know-how on immune response activated by several pathogen agents. In particular, blocking the cytokine production, the inhibition or catalyzation of the receptor binding mechanism and the modulation of signal transduction mechanism will represent a novel therapeutic strategy in veterinary medicine.

Citokines are proteins produced by several cell types and secreted in response to various stimuli. These molecules are able to modify the behaviour of other cells inducing activities like growth, differentiation and apoptosis. In the last years, veterinary scientists have investigated the role played by these factors; in fact, cytokines can act as intercellular communicative signals in immune response, cell damage repair and hematopoiesis. Up to date, various cytokines have been identified and in depth comprehension of their effects in physiology, pathology and therapy is an interesting field of research. This thesis aims to understand the role played by these mediators during natural or experimentally induced pathologies. In particular, it has been evaluated the genic and protein expressions of a large number of cytokines during several diseases and starting from different matrix. Considering the heterogeneity of materials used in experimentations, multiple methods and protocols of nucleic acids and proteins extractions have been standardized. Results on cytokines expression obtained from various in vitro and in vivo experimental studies have shown how important these mediators are in regulation and modulation of the host immune response also in veterinary medicine. In particular, the analysis of inflammatory and septic markers, like cytokines, has allowed a better understanding in the pathogenesis during horse Recurrent Airway Obstruction, foal sepsis, Bovine Viral Diarrhea Virus infection and dog Parvovirus infection and the effects of these agents on the host immune system. As experimentations with mice have shown, some pathologies of the respiratory and nervous system can be reduced or even erased by blocking cytokines inflammatory production. The in vitro cytokines expression evaluation in cells which are in vivo involved in the response to exogenous (like pathogens) or endogenous (as it happens during autoimmune diseases) inflammatory stimuli could represent a model for studying citokines effects during the host immune response. This has been analyzed using lymphocytes cultured with several St. aureus strains isolated from bovine mastitic milk and different colostrum products. In the first experiment different cytokines were expressed depending on enterotoxins produced, justifying a different behaviour of the microrganism in the mammal gland. In the second one, bone marrow cells derived incubated with murine lymphocytes with colostrum products have shown various cluster of differentiation expression , different proliferation and a modified cytokines profile. A better understanding of cytokine expression mechanisms will increase the know-how on immune response activated by several pathogen agents. In particular, blocking the cytokine production, the inhibition or catalyzation of the receptor binding mechanism and the modulation of signal transduction mechanism will represent a novel therapeutic strategy in veterinary medicine.