Thèses : « Cellule staminali mesenchimali umane »

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Focaroli, Stefano <1982&gt. « Scaffold funzionali per il differenziamento condrogenico di cellule staminali mesenchimali umane ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2016. http://amsdottorato.unibo.it/7527/4/tesi_stefano_focaroli.pdf.

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Résumé :

L'ingegneria tissutale è un campo multidisciplinare in rapida crescita che si avvale delle scienze fisiche, ingegneristiche e della vita per sviluppare ed ottenere cellule funzionali, tessuti ed organi per riparare, sostituire o migliorare le funzioni biologiche perse a causa di anomalie congenite, traumi, malattie o invecchiamento. Nell’ambito della ricostruzione della cartilagine articolare sono stati fatti notevoli passi in avanti ma la soluzione per il ripristino completo del tessuto sembra ancora essere lontana. Nella prima parte di questo lavoro è stata valutata la capacità di uno scaffold a base di gelatina di indirizzare le ADSCs verso un differenziamento in senso condrogenico. Successivamente, con lo scopo di migliorare il grado differenziamento e diminuire i costi associati all’utilizzo di fattori differenziativi, l’attenzione è stata posta sullo sviluppo di un biomateriale a base di alginato e ioni cobalto in modo da mimare e sfruttare le caratteristiche fisiche della cartilagine piuttosto che il suo intorno chimico. In ultimo, è stato sviluppato un sistema low cost per la produzione di chip microfluidici sfruttabili per la realizzazione di sistemi micrometrici per incapsulazione cellulare.
Tissue engineering is an interdisciplinary and multidisciplinary field that aims at the developmentof biological substitutes that restore, mantain, or improve tissue function. Concerning the articular cartilage many improvments were made, but the complete tissue restoration approach still lacking. In the first part of this work, it was evaluated the ability of a gelatin scaffold to promote the condrogenic differentiation of ADSCs. Successively, in order to obtain a low cost sistem, a based alginate/Cobalt scaffold was designed with the aim to take advantage of the physical features of the cartilage tissue. Finally, it was developted a cost effective method to produce microfluidic chips with the aim to obtain micro-systems for cell encapsulation.

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Focaroli, Stefano <1982&gt. « Scaffold funzionali per il differenziamento condrogenico di cellule staminali mesenchimali umane ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2016. http://amsdottorato.unibo.it/7527/.

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Résumé :

L'ingegneria tissutale è un campo multidisciplinare in rapida crescita che si avvale delle scienze fisiche, ingegneristiche e della vita per sviluppare ed ottenere cellule funzionali, tessuti ed organi per riparare, sostituire o migliorare le funzioni biologiche perse a causa di anomalie congenite, traumi, malattie o invecchiamento. Nell’ambito della ricostruzione della cartilagine articolare sono stati fatti notevoli passi in avanti ma la soluzione per il ripristino completo del tessuto sembra ancora essere lontana. Nella prima parte di questo lavoro è stata valutata la capacità di uno scaffold a base di gelatina di indirizzare le ADSCs verso un differenziamento in senso condrogenico. Successivamente, con lo scopo di migliorare il grado differenziamento e diminuire i costi associati all’utilizzo di fattori differenziativi, l’attenzione è stata posta sullo sviluppo di un biomateriale a base di alginato e ioni cobalto in modo da mimare e sfruttare le caratteristiche fisiche della cartilagine piuttosto che il suo intorno chimico. In ultimo, è stato sviluppato un sistema low cost per la produzione di chip microfluidici sfruttabili per la realizzazione di sistemi micrometrici per incapsulazione cellulare.
Tissue engineering is an interdisciplinary and multidisciplinary field that aims at the developmentof biological substitutes that restore, mantain, or improve tissue function. Concerning the articular cartilage many improvments were made, but the complete tissue restoration approach still lacking. In the first part of this work, it was evaluated the ability of a gelatin scaffold to promote the condrogenic differentiation of ADSCs. Successively, in order to obtain a low cost sistem, a based alginate/Cobalt scaffold was designed with the aim to take advantage of the physical features of the cartilage tissue. Finally, it was developted a cost effective method to produce microfluidic chips with the aim to obtain micro-systems for cell encapsulation.

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CALDARA, CRISTINA. « Effetto di diverse sostanze sul differenziamento mesengenico di cellule staminali mesenchimali umane ». Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano-Bicocca, 2013. http://hdl.handle.net/10281/49729.

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Résumé :

RIASSUNTO E SCOPO DEL LAVORO Esiste una stretta correlazione tra obesità e osteoporosi: nell'obesità si riscontra una maggiore fragilità ossea ed un ridotto assorbimento di calcio a livello intestinale, mentre l'osteoporosi è spesso accompagnata da un aumento dell'adipogenesi midollare. In questi ultimi anni un'area della ricerca scientifica si è concentrata sullo studio di nuovi farmaci/sostanze in grado di agire sull'adipogenesi o sull'osteoblastogenesi in quanto è fondamentale trovare nuove terapie che prevengano tali patologie. Conoscendo la stretta relazione tra il differenziamento adipogenico e osteogenico, un farmaco contro l'obesità non dovrebbe avere effetti sul metabolismo osseo, mentre contro l'osteoporosi non dovrebbe avere effetti sull'adipogenesi. A tale proposito gli studi in vitro rappresentano un punto importante sia per valutare l’effetto di tali sostanze che per comprendere i meccanismi alla base delle loro azioni. La maggior parte degli studi condotti sul differenziamento adipocitico, e sulla sua inibizione, sono stati condotti su linee di preadipociti murini (3T3-L1) o umani, mentre sono state utilizzate linee murine MC3T3-E1 e C3H10T1/2 per il differenziamento osteogenico. Nonostante la rilevanza dei dati ottenuti grazie a questi modelli cellulari, i risultati sono spesso controversi, anche in considerazione del fatto che i processi differenziativi nell’uomo e nei roditori possono essere regolati a livello molecolare in modo significativamente diverso. Inoltre questi modelli sono basati su cellule già indirizzate verso il differenziamento adipocitico o osteogenico, e quindi non prendono in considerazione il processo di determinazione che porta la cellula progenitrice ed indifferenziata verso un lineage mesengenico. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) in questo contesto rappresentano un modello cellulare particolarmente utile in quanto possono essere efficacemente indotte da uno stato indifferenziato allo stato di adipociti o osteoblasti, di cui peraltro rappresentano fisiologicamente i precursori biologici. Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare l'effetto di Acido Valproico (AVP), Valpromide (VPM), Berberina (BRB), Hibiscus Sabdariffa (HIB) e Resveratrolo (RESV) sul differenziamento adipogenico e osteogenico di cellule staminali mesenchimali umane (hMSC). Le hMSC utilizzate in questo studio sono state caratterizzate e corrispondono ai criteri minimi stabiliti dalla letteratura (Dominici et al., 2006) per poterle definire MSC. Tre le condizioni necessarie: capacità di aderire alla plastica assumendo una morfologia simil-fibroblastica; negatività per i marker ematopoietici CD34 e CD45 e positività per i marker CD29, CD90, CD105 e CD73; capacità, sotto opportune condizioni di coltura, di differenziare nei lineage mesengenici ovvero in osteoblasti, condroblasti ed adipociti. Questo lavoro si è articolato in 5 fasi: 1) Valutazione della tossicità delle diverse sostanze. Per valutare la tossicità delle sostanze precedentemente elencate, le hMSC indifferenziate e le MSC differenziate in senso adipogenico e osteogenico sono state trattate con ciascuna delle diverse sostanze a differenti concentrazioni e sono stati effettuati saggi di vitalità. Sono stati condotti due tipi di test: MTT assay, che valuta l'attività mitocondriale come indicatore della vitalità cellulare e SRB assay, che valuta il contenuto proteico per stimare il numero delle cellule vitali. Sulla base dei risultati ottenuti sono state individuate le concentrazioni non tossiche dei diversi composti da utilizzare negli esperimenti successivi. 2) Effetto delle diverse sostanze sul differenziamento adipogenico e osteogenico. A partire da hMSC indifferenziate è possibile studiare l’intero processo adipogenico trattando le cellule con un terreno (DMEM high glucose) di induzione contenente fattori adipogenici (desametasone 1μM, indometacina/isobutilmetilxantina 100μM/500μM, insulina 10μg/ml) per i primi 10 giorni e successivamente, fino al 28° giorno, con un terreno di mantenimento (contenente insulina 10μg/ml) per la maturazione in senso adipogenico. Le diverse sostanze sono state somministrate alle hMSC sin dal momento dell'induzione e portate fino al 28° giorno di differenziamento adipogenico. L'effetto anti-adipogenico è stato valutato mediante colorazioni istologiche specifiche per i trigliceridi presenti nei depositi lipidici degli adipociti: la colorazione con Oil Red O per osservare la morfologia cellulare mentre la colorazione Nile Red, esaminata mediante citofluorimetro a flusso, per determinare il numero di cellule differenziate. I risultati dimostrano che AVP, BRB, HIB e RESV presentano un effetto anti-adipogenico, mentre VPM non ha dimostrato avere effetto sul differenziamento adipogenico. Successivamente è stato valutato l'effetto di AVP, VPM e HIB aggiunte dopo 3, 7, 10, 14 e 21 giorni dall'induzione adipogenica e analizzate tutte al 28°giorno. Con questi dati abbiamo dimostrato che solo AVP ha un effetto anti-adipogenico, anche quando viene aggiunto dopo 3 o 7 giorni dall'induzione. L'aggiunta di VPM e HIB a tempi diversi dall'induzione non ha portato a delle variazioni significative rispetto alle hMSC indotte con solo il terreno adipogenico. Per il differenziamento osteogenico le hMSC sono state trattate con uno specifico terreno (DMEM low glucose) contenente fattori osteogenici (desametasone 100nM, acido ascorbico 2-fosfato 50μM e βglicerolo 2-fosfato10mM) fino al 28° giorno. La valutazione del differenziamento osteogenico è stata effettuata mediante la colorazione istologica Alizarin red S, che evidenzia la deposizione di calcio mineralizzato. Le diverse sostanze, alle dosi precedentemente scelte, sono state aggiunte inizialmente al terreno osteogenico delle hMSC e portate fino al 28°giorno di trattamento. Da questi esperimenti abbiamo ottenuto risultati differenti per le diverse sostanze valutate. AVP e VPM determinano un precoce differenziamento osteogenico delle hMSC rispetto alle cellule trattate con solo il terreno di differenziamento. Infatti in presenza di AVP e VPM il differenziamento si osserva già dopo 10gg rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico. BRB e HIB presentano invece un effetto anti-osteogenico, poichè con l’aggiunta di queste sostanze nel terreno non si osserva deposito di matrice mineralizzata e la colorazione istologica risulta negativa. Le cellule trattate con RESV non mostrano differenze significative rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico. Successivamente per AVP, VPM e HIB è stato valutato l'effetto della sostanza aggiunta dopo 3, 7, 10, 14 e 21 giorni dall'induzione osteogenica e analizzate tutte al 28°giorno. Da questi dati abbiamo dimostrato che HIB ha un effetto anti-osteogenico anche quando aggiunta dopo 3, 7, 10 e 14 giorni dall'induzione. L'aggiunta di AVP e VPM a tempi diversi dall'induzione non ha portato variazioni significative rispetto alle hMSC indotte con solo il terreno osteogenico. 3) Valutazione dell'effetto delle sostanze sulla fosforilazione di ERK1/2 durante il differenziamento adipogenico e osteogenico. Mediante esperimenti di immunoblotting abbiamo studiato la fosforilazione (forma attiva) di ERK1/2 per poter capire i meccanismi molecolari alla base delle azioni di tali sostanze nei due diversi differenziamenti. Nelle hMSC, trattate per il differenziamento adipogenico con l'aggiunta di AVP, VPM, BRB, HIB e RESV non si sono osservate variazioni significative nella fosforilazione di ERK1/2 rispetto alle hMSC indotte con solo il terreno adipogenico. Nel differenziamento osteogenico abbiamo osservato a 10giorni una riduzione significativa della forma fosforilata di ERK1 nelle cellule trattate con VPM o BRB rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico; la forma fosforilata di ERK2 non varia. A 14giorni solo le cellule trattate con terreno osteogenico e BRB presentano una riduzione significativa di entrambe le forme pERK1/2 rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico. 4) Valutazione dell'effetto di Acido Valproico, Valpromide e Hibiscus Sabdariffa sui livelli di fosforilazione di GSK3β e di espressione di βcatenina. Per comprendere meglio il meccanismo d'azione di AVP, VPM e HIB abbiamo studiato, mediante esperimenti di immunoblotting, i livelli di fosforilazione (forma inattiva) di GSK3β e i livelli di espressione di βcatenina nelle hMSC trattate per il differenziamento adipogenico e osteogenico con l'aggiunta delle tre sostanze. Per quanto riguarda il differenziamento adipogenico solo a 3giorni di induzione abbiamo osservato nelle hMSC indotte al differenziamento con l'aggiunta di AVP un aumento significativo di pGSK3β, rispetto alle hMSC trattate con solo il terreno adipogenico. Analizzando i livelli di βcatenina a 12ore, 1, 3giorni non abbiamo rilevato variazioni significative tra le hMSC indotte al differenziamento adipogenico sia in presenza che in assenza delle sostanze. Analizzando i dati relativi al confronto tra le hMSC indotte al differenziamento osteogenico, in presenza o assenza delle sostanze, non abbiamo riscontrato differenze significative nei livelli di pGSK3β per tutti i tempi analizzati. Abbiamo osservato una riduzione significativa nei livelli di βcatenina a 3, 10 e 14giorni in hMSC trattate per il differenziamento osteogenico con l'aggiunta di AVP, mentre solo a 10giorni si osserva una riduzione significativa di βcatenina anche per le hMSC trattate con VPM rispetto alle hMSC indotte con solo terreno osteogenico. 5) Valutazione dell'effetto di Acido Valproico, Valpromide e Hibiscus Sabdariffa sull'espressione genica di C/EBPβ, PPARγ, RUNX2 e OSTERIX. Infine è stato valutato, mediante qPCR, l’effetto di AVP, VPM e HIB sull'espressione genica di C/EBPβ, PPARγ, RUNX2 e OSTERIX (importanti fattori trascrizionali adipogenici e osteogenici) durante il differenziamento adipogenico e osteogenico di hMSC. Dai risultati ottenuti si osserva che le hMSC indotte al differenziamento adipogenico con l'aggiunta di AVP hanno dei livelli di espressione significativamente maggiori per C/EBPβ e significativamente minori per PPARγ rispetto alle hMSC indotte con solo terreno adipogenico. Durante il differenziamento osteogenico si osserva un aumento significativo di Runx2 nelle hMSC trattate con AVP rispetto alle hMSC indotte con solo terreno osteogenico. L'analisi dei nostri risultati ha evidenziato che la sostanza più promettente per un eventuale uso terapeutico sembra essere l’Acido Valproico perché, oltre ad inibire il differenziamento adipogenico, sembra avere un effetto pro-osteogenico sulle hMSC indotte al differenziamento osteogenico anche se saranno necessari ulteriori studi per comprendere a pieno il meccanismo d'azione di tale sostanza.

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Lanzoni, Giacomo <1982&gt. « Cellule staminali mesenchimali umane da molteplici tessuti adulti : caratteristiche condivise e tessuto-specificità ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2010. http://amsdottorato.unibo.it/2768/2/Lanzoni_Giacomo_Tesi.pdf.

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Résumé :

L’attività di ricerca ha riguardato lo studio di popolazioni di cellule staminali mesenchimali umane (MSC) ottenute da molteplici tessuti adulti. Sono state investigate sorgenti di MSC alternative al midollo osseo, libere da conflitti etici, dotate di vantaggi per l’applicabilità clinica che vanno dalla elevata resa nel recupero cellulare alla tessuto-specificità. Le cellule ottenute dalle diverse sorgenti sono state caratterizzate immunofenotipicamente, commissionate mediante protocolli di induzione specifici per i diversi tipi cellulari ed analizzate con opportuni saggi istologici, immunoistochimici, di espressione genica e proteica. Esperimenti di cocoltura hanno permesso la descrizione di capacità immunomodulatorie e trofiche. - La placenta a termine risulta essere una ricca sorgente di cellule staminali mesenchimali (MSC). Dalla membrana amniotica, dal corion e dalla gelatina di Wharton del cordone ombelicale sono state ottenute MSC con potenzialità differenziative verso commissionamenti mesenchimali, con capacità immunomodulatorie e trofiche. Tali tessuti sono ampiamente disponibili, garantiscono una elevata resa nel recupero cellulare e sono liberi da conflitti etici. - Due popolazioni di cellule con caratteristiche di MSC sono state individuate nella mucosa e nella sottomucosa intestinale. Queste cellule possiedono caratteristiche di tessuto-specificità, sono dotate di attività trofiche ed immunomodulatorie che potrebbero essere vantaggiose per approcci di terapia cellulare in patologie quali le Malattie Infiammatorie Croniche Intestinali (IBD). - Popolazioni di cellule staminali con caratteristiche simili alle MSC sono state ottenute da isole pancreatiche. Tali popolazioni possiedono vantaggi di tessuto-specificità per approcci di terapia cellulare per il Diabete. - Sono stati investigati ed individuati marcatori molecolari (molecole HLA-G) correlati con il livello di attività immunomodulatoria delle MSC. La valutazione di tali marcatori potrebbere permettere di determinare l’attività immunosoppressiva a priori del trapianto, con l’obiettivo di scegliere le popolazioni di MSC più adatte per l’applicazione e di definirne il dosaggio. - E’ stato messa a punto una metodica e una strumentazione per il frazionamento di cellule staminali in Campo Flusso in assenza di marcatura (NEEGA-DF). Questa metodica permette di discriminare sottopopolazioni cellulari in base a caratteristiche biofisiche.

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Lanzoni, Giacomo <1982&gt. « Cellule staminali mesenchimali umane da molteplici tessuti adulti : caratteristiche condivise e tessuto-specificità ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2010. http://amsdottorato.unibo.it/2768/.

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Résumé :

L’attività di ricerca ha riguardato lo studio di popolazioni di cellule staminali mesenchimali umane (MSC) ottenute da molteplici tessuti adulti. Sono state investigate sorgenti di MSC alternative al midollo osseo, libere da conflitti etici, dotate di vantaggi per l’applicabilità clinica che vanno dalla elevata resa nel recupero cellulare alla tessuto-specificità. Le cellule ottenute dalle diverse sorgenti sono state caratterizzate immunofenotipicamente, commissionate mediante protocolli di induzione specifici per i diversi tipi cellulari ed analizzate con opportuni saggi istologici, immunoistochimici, di espressione genica e proteica. Esperimenti di cocoltura hanno permesso la descrizione di capacità immunomodulatorie e trofiche. - La placenta a termine risulta essere una ricca sorgente di cellule staminali mesenchimali (MSC). Dalla membrana amniotica, dal corion e dalla gelatina di Wharton del cordone ombelicale sono state ottenute MSC con potenzialità differenziative verso commissionamenti mesenchimali, con capacità immunomodulatorie e trofiche. Tali tessuti sono ampiamente disponibili, garantiscono una elevata resa nel recupero cellulare e sono liberi da conflitti etici. - Due popolazioni di cellule con caratteristiche di MSC sono state individuate nella mucosa e nella sottomucosa intestinale. Queste cellule possiedono caratteristiche di tessuto-specificità, sono dotate di attività trofiche ed immunomodulatorie che potrebbero essere vantaggiose per approcci di terapia cellulare in patologie quali le Malattie Infiammatorie Croniche Intestinali (IBD). - Popolazioni di cellule staminali con caratteristiche simili alle MSC sono state ottenute da isole pancreatiche. Tali popolazioni possiedono vantaggi di tessuto-specificità per approcci di terapia cellulare per il Diabete. - Sono stati investigati ed individuati marcatori molecolari (molecole HLA-G) correlati con il livello di attività immunomodulatoria delle MSC. La valutazione di tali marcatori potrebbere permettere di determinare l’attività immunosoppressiva a priori del trapianto, con l’obiettivo di scegliere le popolazioni di MSC più adatte per l’applicazione e di definirne il dosaggio. - E’ stato messa a punto una metodica e una strumentazione per il frazionamento di cellule staminali in Campo Flusso in assenza di marcatura (NEEGA-DF). Questa metodica permette di discriminare sottopopolazioni cellulari in base a caratteristiche biofisiche.

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Barbagallo, Ignazio Alberto. « Effetto dell'Iperglicemia nel differenziamento di Cellule Staminali Mesenchimali Umane in Osteoblasti:Ruolo dell'Eme Ossigenasi 1 ». Thesis, Università degli Studi di Catania, 2011. http://hdl.handle.net/10761/169.

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Résumé :

Le cellule staminali mesenchimali sono cellule pleiotropiche che si differenziano in adipociti o osteoblasti attraverso un signaling pathway che prevede il coinvolgimento dell'espressione di HO-1 ed HO-2. Abbiamo esaminato gli effetti di un induttore dell'espressione di HO-1 e di un inibitore dell'attivita' enzimatica di HO-1 sul differenziamento osteoblastico delle MSC in presenza ed in assenza di un'alta concentrazione di glucosio. Le MSC sono state coltivate in un medium osteogenico aumentando l'espressione dell'osteonectina, RUNX-2, osteocalcina e la fosfatasi alcalina. L'espressione di HO-1 durante il differenziamento e' stata inizialmente downregolata per poi tornare a valori simili alle cellule indifferenziate dopo 15 giorni di differenziamento. Inoltre, l'effetto di HO-1 sugli osteoblasti appare differente da quello visto nel differenziamento in adipociti. L'induzione di HO-1 attraverso una cobalto protoporfirina (CoPP) decrementa l'adipogenesi. In piu' come evidenziato dalla diminuzione dei livelli di BMP-2, osteocalcina , osteoprotegerina l'aggiunta di glucosio al medium osteogenico inibisce il differenziamento in osteoblasti. Tuttavia il differenziamento di MSC in adipociti e' incrementato dal glucosio. L'induzione di HO-1 attraverso il CoPP e' stato in grado di aumentare l'espressione dei markers osteoblastici gia citati. Lo studio suggerisce che l'induzione dell'eme ossigenasi e' in grado di attenuare l'effetto dell'iperglicemia durante il differenziamento in osteoblasti.
Human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) are pleiotrophic cells that differentiate to either adipocytes or osteoblasts as a result of crosstalk by specific signaling pathways including heme oxygenase (HO)-1/-2 expression. We examined the effect of inducers of HO-1 expression and inhibitors of HO activity on MSC differentiation to the osteoblast and following high glucose exposure. MSC cultured in osteogenic medium increased expression of osteonectin, Runt-related transcription factor 2 (RUNX-2), osteocalcin, and alkaline phosphatase. HO-1 expression during differentiation was initially decreased and then followed by a rebound increase after 15 days of culture. Additionally, the effect of HO-1 on osteoblasts appears different to that seen in adipocyte stem cells. On addition of a cobalt compound, the resultant induction of HO-1 decreases adipogenesis. Moreover, glucose (30 mM) inhibited osteoblast differentiation, as evidenced by decreased bone morphogenetic protein (BMP)-2, osteonectin, osteocalcin, and osteoprotegerin (OPG). In contrast, MSC-derived adipocytes were increased by glucose. Increased HO-1 expression increased the levels of osteonectin, OPG, and BMP-2. Inhibition of HO activity prevented the increase in osteonectin and potentiated the decrease of osteocalcin and OPG in cells exposed to high glucose levels. Furthermore, targeting HO-1 expression increased pAMPK and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and restored osteoblastic markers. Our findings suggest that targeting HO-1 gene expression attenuates the hyperglycemia-mediated decrease in MSC-derived osteoblast differentiation. Finally, the mechanism underlying the HO-1-specific cell effect on osteoblasts and adipocytes is yet to be explored. Thus, the targeting of HO-1 gene expression presents a portal to increase osteoblast function and differentiation and attenuate osteoporosis by promoting bone formation

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Bulj, Zrinka <1983&gt. « Studio del ruolo della Protein chinasi B/Akt nella migrazione di Cellule Staminali Mesenchimali umane ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2013. http://amsdottorato.unibo.it/5154/1/Bulj_Zrinka_tesi.pdf.

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Le cellule staminali/stromali mesenchimali umane (hMSC) sono attualmente applicate in diversi studi clinici e la loro efficacia è spesso legata alla loro capacità di raggiungere il sito d’interesse. Poco si sa sul loro comportamento migratorio e i meccanismi che ne sono alla base. Perciò, questo studio è stato progettato per comprendere il comportamento migratorio delle hMSC e il coinvolgimento di Akt, nota anche come proteina chinasi B. L’espressione e la fosforilazione della proteinchinasi Akt è stata studiata mediante Western blotting. Oltre al time-lapse in vivo imaging, il movimento cellulare è stato monitorato sia mediante saggi tridimensionali, con l’uso di transwell, che mediante saggi bidimensionali, attraverso la tecnica del wound healing. Le prove effettuate hanno rivelato che le hMSC hanno una buona capacità migratoria. E’ stato osservato che la proteinchinasi B/Akt ha elevati livelli basali di fosforilazione in queste cellule. Inoltre, la caratterizzazione delle principali proteine di regolazione ed effettrici, a monte e a valle di Akt, ha permesso di concludere che la cascata di reazioni della via di segnale anche nelle hMSC segue un andamento canonico. Specifici inibitori farmacologici sono stati utilizzati per determinare il potenziale meccanismo coinvolto nella migrazione cellulare e nell'invasione. L’inibizione della via PI3K/Akt determina una significativa riduzione della migrazione. L’utilizzo di inibitori farmacologici specifici per le singole isoforme di Akt ha permesso di discriminare il ruolo diverso di Akt1 e Akt2 nella migrazione delle hMSC. E’ stato infatti dimostrato che l'inattivazione di Akt2, ma non quella di Akt1, diminuisce significativamente la migrazione cellulare. Nel complesso i risultati ottenuti indicano che l'attivazione di Akt2 svolge un ruolo critico nella migrazione della hMSC; ulteriori studi sono necessari per approfondire la comprensione del fenomeno. La dimostrazione che l’isoforma Akt2 è necessaria per la chemiotassi diretta delle hMSC, rende questa chinasi un potenziale bersaglio farmacologico per modulare la loro migrazione.
Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSC) are currently tested in several clinical trials. In spite of hMSC efficacy is frequently linked to their ability to reach the affected site, little is known on their migratory behavior and the underlying mechanism. This study was designed to investigate the migratory behavior of hMSC and to test the involvement of Akt, also known as protein kinase B. Akt protein expression and phosphorylation was investigated in hMSC western blotting analysis. Cell migration was assessed by transwell, wound healing and time lapse in vivo motility assays. MSC results fairly migratory and Akt was strongly activated at basal level. Furthermore, the characterization of the major regulatory proteins and effectors, upstream and downstream of Akt, has led to the conclusion that the cascade of reactions of this signaling pathway in hMSC follows a canonical pathway. Pharmacological inhibitors were used to determine the potential mechanism responsible for cell migration and invasion. Blocking PI3K/Akt pathway resulted in decreased hMSC migration. The use of pharmacological inhibitors specific for individual Akt isoforms allowed us to discriminate the different role of Akt1 and Akt2 in the migration of the hMSC. Through our analysis, we demonstrated that pharmacological inactivation of Akt2, but not that of Akt1, significantly decreased cell migration and invasion. Although these results are not fully comprehensive for the understanding of the phenomenon, in the complex indicate that the activation of Akt2 plays a critical role in allowing the migration of the hMSC. The demonstration that the Akt2 isoform is required for the chemotaxis of direct hMSC, makes this kinase a potential pharmacological target to modulate the migration of such cells.

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Bulj, Zrinka <1983&gt. « Studio del ruolo della Protein chinasi B/Akt nella migrazione di Cellule Staminali Mesenchimali umane ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2013. http://amsdottorato.unibo.it/5154/.

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Résumé :

Le cellule staminali/stromali mesenchimali umane (hMSC) sono attualmente applicate in diversi studi clinici e la loro efficacia è spesso legata alla loro capacità di raggiungere il sito d’interesse. Poco si sa sul loro comportamento migratorio e i meccanismi che ne sono alla base. Perciò, questo studio è stato progettato per comprendere il comportamento migratorio delle hMSC e il coinvolgimento di Akt, nota anche come proteina chinasi B. L’espressione e la fosforilazione della proteinchinasi Akt è stata studiata mediante Western blotting. Oltre al time-lapse in vivo imaging, il movimento cellulare è stato monitorato sia mediante saggi tridimensionali, con l’uso di transwell, che mediante saggi bidimensionali, attraverso la tecnica del wound healing. Le prove effettuate hanno rivelato che le hMSC hanno una buona capacità migratoria. E’ stato osservato che la proteinchinasi B/Akt ha elevati livelli basali di fosforilazione in queste cellule. Inoltre, la caratterizzazione delle principali proteine di regolazione ed effettrici, a monte e a valle di Akt, ha permesso di concludere che la cascata di reazioni della via di segnale anche nelle hMSC segue un andamento canonico. Specifici inibitori farmacologici sono stati utilizzati per determinare il potenziale meccanismo coinvolto nella migrazione cellulare e nell'invasione. L’inibizione della via PI3K/Akt determina una significativa riduzione della migrazione. L’utilizzo di inibitori farmacologici specifici per le singole isoforme di Akt ha permesso di discriminare il ruolo diverso di Akt1 e Akt2 nella migrazione delle hMSC. E’ stato infatti dimostrato che l'inattivazione di Akt2, ma non quella di Akt1, diminuisce significativamente la migrazione cellulare. Nel complesso i risultati ottenuti indicano che l'attivazione di Akt2 svolge un ruolo critico nella migrazione della hMSC; ulteriori studi sono necessari per approfondire la comprensione del fenomeno. La dimostrazione che l’isoforma Akt2 è necessaria per la chemiotassi diretta delle hMSC, rende questa chinasi un potenziale bersaglio farmacologico per modulare la loro migrazione.
Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSC) are currently tested in several clinical trials. In spite of hMSC efficacy is frequently linked to their ability to reach the affected site, little is known on their migratory behavior and the underlying mechanism. This study was designed to investigate the migratory behavior of hMSC and to test the involvement of Akt, also known as protein kinase B. Akt protein expression and phosphorylation was investigated in hMSC western blotting analysis. Cell migration was assessed by transwell, wound healing and time lapse in vivo motility assays. MSC results fairly migratory and Akt was strongly activated at basal level. Furthermore, the characterization of the major regulatory proteins and effectors, upstream and downstream of Akt, has led to the conclusion that the cascade of reactions of this signaling pathway in hMSC follows a canonical pathway. Pharmacological inhibitors were used to determine the potential mechanism responsible for cell migration and invasion. Blocking PI3K/Akt pathway resulted in decreased hMSC migration. The use of pharmacological inhibitors specific for individual Akt isoforms allowed us to discriminate the different role of Akt1 and Akt2 in the migration of the hMSC. Through our analysis, we demonstrated that pharmacological inactivation of Akt2, but not that of Akt1, significantly decreased cell migration and invasion. Although these results are not fully comprehensive for the understanding of the phenomenon, in the complex indicate that the activation of Akt2 plays a critical role in allowing the migration of the hMSC. The demonstration that the Akt2 isoform is required for the chemotaxis of direct hMSC, makes this kinase a potential pharmacological target to modulate the migration of such cells.

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Mancini, Stefania. « Ruolo degli adipociti nell’emopoiesi umana ». Doctoral thesis, Università Politecnica delle Marche, 2014. http://hdl.handle.net/11566/242863.

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Gli adipociti rappresentano una popolazione cellulare mesenchimale naturalmente presente nel midollo osseo umano. In questo specifico microambiente gli adipociti possono interagire con una varietà di cellule differenti, il loro ruolo però è in larga parte sconosciuto. Questo lavoro ha lo scopo di caratterizzare molecolarmente e funzionalmente gli adipociti maturi isolati dal midollo osseo umano (BM-A) per studiare il loro ruolo nel microambiente emopoietico. Gli BM-A normali sono stati isolati dopo digestione con collagenasi e filtrazione, studiata la loro morfologia, la loro espressione genica, il profilo immunofenotipico e la loro capacità funzionale nel microambiente emopoietico, sono stati poi confrontati con gli adipociti derivati da tessuto adiposo (AT-A). Gli BM-A hanno una forma sferica di dimensioni assai variabili, caratterizzata dalla presenza nel citoplasma di un unico vacuolo lipidico che occupa, da solo, più del 90% del volume cellulare ed un piccolo nucleo appiattito, caratteristiche simili agli AT-A che non vengono perse in coltura, inoltre, come gli AT-A, esprimono alcuni antigeni di superficie tipici delle cellule staminali. In linea con queste osservazioni, i dati molecolari hanno mostrato che gli BM-A esprimono alcuni geni delle cellule staminali embrionali necessari per il self-renewal e la pluripotenza, come Oct4, Klf4, c-myc, GATA4, Tbx1 e Sox17, ma non esprimono i marcatori Sox2 e Nanog. Inoltre gli adipociti da BM esprimono Dio2 e CIDEA, regolatori di termogenesi, mentre risultano negativi per Prdm16 e UCP1, marker molecolari degli adipociti bruni. Questi risultati, suggeriscono che gli BMA esprimono il fenotipo molecolare del grasso bianco con un importante ruolo nell’attività metabolica.
Adipocytes are a cell population largely located in the human bone marrow cavity. In this specific microenvironment where adipocytes can interact with a variety of different cells, the role of fat is mainly unknown. To our knowledge, this report is the first to characterize mature adipocytes isolated from human bone marrow (BM-A) molecularly and functionally to better understand their roles into the hematopoietic microenvironment. Healthy BM-A were isolated after collagenase digestion and filtration. We studied the morphology of BMA, their gene expression and immunophenotypic profile and their functional ability in the hematopoietic microenvironment, comparing them with adipocytes derived from adipose tissue (AT-A). BM-A showed a unilocular lipid morphology similar to AT-A and did not lose their morphology in culture; they showed a comparable pattern of stem cell-surface antigens to AT-A. In line with these observations, molecular data showed that BM-A expressed some embryonic stem cells genes, such as Oct4, KLf4, c-myc, Gata4, Tbx1, and Sox17, whereas they did not express the stem cell markers Sox2 and Nanog. Moreover, BM-A had long telomeres that were similar to bone marrow mesenchymal stem cells. Notably, BM-A supported the survival and differentiation of hematopoietic stem cells in long-term cultures. These results showed that BM-A are stromal cells with a gene expression pattern that distinguished them from AT-A. BM-A showed stem cell properties through their hematopoietic supporting function, which was certainly linked to their role in the maintenance of the bone marrow microenvironment. Depending on specific demands, BM-A may acquire different functions based on their local environment.

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Chioato, Tatiana. « Studio delle capacità differenziative e della potenzialità terapeutica di cellule staminali mesenchimali umane isolate da cordone ombelicale e sangue cordonale nelle malattie epatiche acute ». Doctoral thesis, Università degli studi di Padova, 2011. http://hdl.handle.net/11577/3427456.

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Résumé :

Liver transplantation remains the only therapeutic option for most of acute and chronic end-stage liver diseases, but its use is limited by a severe shortage of donor organs for transplantation. In this contest the use of stem cells in cell therapy can be considered a promising therapeutical approach instead of liver transplantation. In particular, mesenchymal stem cells (MSCs) can be obtained from several adult tissues and from fetal-derived tissues, such as umbilical cord (UC), umbilical cord blood (UCB) and placenta, and they can be induced to differentiate into several cell types. Nevertheless, proliferative and differentiative potential of these cells has not yet been explained; particularly differentiative potential of fetal-derived tissue cells remains to be investigated. In this study, umbilical cord blood (UCB) and umbilical cord (UC) have been evaluated as potential sources of MSCs. For this purpose, the proliferative potential and plasticity of MSC isolated from UC and UCB to differentiate into adipogenic and osteogenic lineages in vitro were been investigated. After establishing of MSCs plasticity, the cells were differentiated in vitro towards hepatocyte-like cells, evaluating different biological supports for cell growth and differentiation. Finally, in view of clinical applications, the engraftment of these cells in a model of acute CCl4-induced liver injury has been verified. MSCs were capable of differentiating into hepatocyte-like cells as demonstrated by progressive up-regulation of mature hepatocyte markers. In particular the MSCs isolated from UC seem to acquire the features of mature hepatocyte as demonstrated by glycogen storage and albumin secretion. All finding suggested that these cells can grow and differentiate into functional hepatocyte-like cells without any biological support, whereas mature hepatocytes need a three-dimensional scaffold in order to maintain their viability and functional features. Finally the MSCs from human UC seem to contribute to liver regeneration by enhancing the reparative activity of hepatocytes that spontaneously occurs after injury, even if the mechanism of their action is not known. The establishment in vitro of the plasticity of UCB and UC not only towards mesodermal lineage cells but also towards endodermal lineage cells and the in vivo contribution of these cells to regenerate liver tissue, support their future application for cell therapy in acute and chronic liver disease. Moreover, due to availability, safety in the collection and lack of ethical issues, UCB and UC may become elective sources of multipotent MSC
Il trapianto di fegato rappresenta l’unica opzione terapeutica per malattie croniche del fegato in fase terminale e in casi selezionati di insufficienza epatica acuta. Esiste ancora tuttavia un notevole divario fra le donazioni d’organo ed il numero di pazienti in lista d’attesa, divario che ha portato alla ricerca di terapie alternative. In questo contesto le cellule staminali potenzialmente potrebbero svolgere un ruolo di primaria importanza nella terapia cellulare. Tra i vari tipi di cellule staminali, le cellule mesenchimali risultano particolarmente interessanti, in quanto possono essere isolate non solo da vari tipi di tessuti adulti, ma anche da tessuti di derivazione fetale, quali cordone, sangue cordonale e placenta, e possono essere indotte a differenziarsi in numerosi tipi cellulari diversi. Tuttavia, soprattutto per quanto riguarda le cellule isolate da tessuti di derivazione fetale, non è ancora completamente chiarito il reale potenziale proliferativo e differenziativo. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di isolare una popolazione di cellule con caratteristiche mesenchimali da cordone ombelicale (UC) e sangue cordonale umano (UCB). Una volta verificata in vitro la loro capacità di differenziare in cellule di origine mesodermica (adipociti e osteoblasti), è stata testata la loro capacità di differenziare verso la linea epatocitaria utilizzando un terreno contenente fattori di crescita epatogenici e come supporto per le colture due diverse matrici extracellulari o la plastica non trattata. Infine è stata valutata la capacità di engraftment in vivo delle MSC isolate da UC in un modello di danno acuto indotto da CCl4. Le cellule staminali mesenchimali isolate hanno mostrato la capacità di rispondere agli stimoli differenziativi epatogenici sovraregolando l’espressione di marcatori epatici. In particolare le cellule isolate da UC hanno evidenziato la capacità di differenziare in cellule simil-epatocitarie funzionali come dimostra la positività alla colorazione PAS per l’accumulo di glicogeno e il saggio ELISA per la produzione di albumina. I risultati ottenuti dimostrano che il differenziamento non necessita dell’utilizzo di nessuna matrice extra-cellulare come supporto per la crescita delle cellule e il mantenimento della loro funzionalità nel tempo come invece avviene per gli epatociti maturi messi in coltura. Inoltre le MSC da UC somministrate ad animali sottoposti a danno epatico acuto da CCl4, hanno dimostrato di contribuire alla rigenerazione completa dell’organo, anche se il meccanismo d’azione resta ancora da indagare. La dimostrazione in vitro della plasticità delle MSC da UC e UCB non solo verso la linea mesodermica ma anche verso la linea endodermica e la loro capacità in vivo di contribuire alla rigenerazione epatica, rappresenta un risultato utile sulla futura applicazione di tali cellule nella terapia delle malattie epatiche acute e croniche. Inoltre, essendo completamente accessibili, privi di qualsiasi implicazione etica e di rischio nella raccolta, il sangue cordonale e il cordone ombelicale potrebbero diventare due fonti di elezione per l’ottenimento di cellule staminali multipotenti

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Marchionni, Cosetta <1972&gt. « Trombocitopenia con assenza del radio (sindrome TAR) : verifica funzionale di due mutazioni nella regione del promotore del TGFβ2 e studio delle cellule staminali mesenchimali ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2007. http://amsdottorato.unibo.it/512/1/TesiCosettaMarchionni.pdf.

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Marchionni, Cosetta <1972&gt. « Trombocitopenia con assenza del radio (sindrome TAR) : verifica funzionale di due mutazioni nella regione del promotore del TGFβ2 e studio delle cellule staminali mesenchimali ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2007. http://amsdottorato.unibo.it/512/.

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Turetta, Michela. « Studio in vitro e in vivo della capacità differenziativa di cellule CD105 positive da cordone ombelicale e da sangue cordonale umano ». Doctoral thesis, Università degli studi di Padova, 2008. http://hdl.handle.net/11577/3425165.

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Résumé :

Stem cells have become worldwide interesting because they can be potentially employed for the treatment of many different types of deseases; moreover, they can be manipulated representing a promising tool for genetic therapy. Mesenchymal stem cells (MSC) can be obtained from several adult tissues and from fetal-derived tissues, such as umbilical cord, umbilical cord blood and placenta, and they can be induced to differentiate into several cell types. Nevertheless, proliferation and differentiation potential of these cells has not yet been explained; particularly differentiative potential of fetal-derived tissue cells remains to be investigated. In this study, umbilical cord blood (UCB) and umbilical cord (UC) have been evaluated as potential sources of MSC. For this purpose, a subpopulation of cells expressing CD105, a membrane antigen well known as marker of MSC, has been isolated from UCB and UC. The proliferative potential and plasticity of CD105-positive cells have been investigated in vitro by means of synthetic or natural supports and/or using differentiative media containing inductive factors. Finally, in view of clinical applications, the engraftment of these cells in a model of chemical-induced liver injury has been verified. Collectively, our data have demonstrated in vitro the plasticity of UCB and UC CD105-positive cells not only towards mesodermal lineage cells (osteogenic and adipogenic lineage) but also towards endodermal lineage cells (hepatogenic lineage). These results suggest that CD105-positive cells could be usefully employed in regenerative medicine. In fact, due to availability, safety in the collection and lack of ethical issues, UCB and UC may become elective sources of multipotent MSC.

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RAVASI, MADDALENA. « Cellule staminali mesenchimali (msc) nelle patologie demielinizzanti : studio in vitro della promozione della sopravvivenza di neuroni e della formazione della mielina da parte di msc ». Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano-Bicocca, 2009. http://hdl.handle.net/10281/7472.

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Résumé :

The aim of this work was the study of trophic properties of MSCs on sensitive neurons in culture. In particular we tested the MSCs’s capacity of myelination in order to use these cells for demyelinating disease therapies. MSCs are adult, multipotent and undifferentiated stem cells derived from bone marrow and isolated by plastic adherence. DRG from 15-day old Sprague-Dawley rat embryos were removed and cultured on a substrate of rat-tail collagen in AN2 medium supplemented with 5 ng/ml NGF. In a previous study our lab demonstrated that MSCs are able to rescue DRG dissociated neurons and to support their long-lasting survival in presence of NGF when co-cultured at direct contact. In this work we characterized cultured DRG neurons cellular death by means of cytofluorimetric, immunofluorescences and electron microscopy tecniques, demonstrating that neuronal cultures died for apoptosis and that MSCs protected neurons from this kind of death. We then investigate if the trophic role of MSCs was mediated by the release of soluble factors. We demonstrated that cocultures MSCs conditioned medium didn’t improve neuronal survival. We also investigated if MSC express constitutively on their surface some molecules able to improve neuronal survival by plating neurons on paraformaldehyde fixed MSCs (0,5%, 4%) and even in this case neurons died as the untreated control neurons. Therefore we concluded that the effect of MSCs on neuronal survival was mainly mediated by direct contact. We also observe in electron microscopy some point of contact between MSCs and neurons, and using a vital fluorescent cytoplasmatic stain we demonstrated the possibility of a passage of material between the two populations. By immunofluorescences we observed the presence only in cocultures of connexin 32, 36 and 42, which are proteins involved in neuronal gap junction formation. Connexin 32 was found in correspondence of neuronal and MSC membrane, suggesting that there were connection between neurons and MSC. We also demonstrated by electron microscopy the presence of axonal myelination only in neurons in cocultures. The myelin production was not due to the presence of satellite cells in our cultures, because we eliminated them with fluorodesoxyuridin that kills proliferating cells, as confirmed by immunofluorescences experiment with two markers of glial cells, GFAP and S100. Moreover the myelin production is neither due to transdifferentiation of MSCs, as demonstrated by immunofluorescences. The myelin presented in cocultures is few but it is compact and functional, presenting Node of Ranvier and morphological characteristic similar to myelin of neuronal and Schwann cells cocultures. In conclusion in this work we demonstrated that MSC can myelinate neuronal processes in culture, without transdifferentiating in Schwann cells. These results can be the base of more elaborate studies on human MSCs and on other types of neurons, like SNC neurons, to confirm the validity of MSC even on SNC, in order to identify a possible therapy for demyelinating disease with stem cells.

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MAURI, MARIO. « Cellule staminali mesenchimali : potenziali modulatori del sistema nervoso centrale ». Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano-Bicocca, 2012. http://hdl.handle.net/10281/39835.

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Résumé :

Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) account for a small population of cells of the non-hematopoietic component of bone marrow. MSCs are multipotent stem cells endowed with neurotrophic potential combined to immunological properties, making them a promising therapeutic tool for neurodegenerative disorders. Although the mechanisms by which they act are still largely unknown, trans-differentiation, paracrine and autocrine actions have been hypothesized. Here we focus on the study of the effects exerted by rat MSCs on CNS neurons and oligodendrocytes by using a simplified in vitro co-culture system that precludes any direct contact between different cell types. The analysis of hippocampal synaptogenesis, synaptic vesicle recycling and electrical activity show that MSCs by themselves, efficiently support morphological and functional neuronal differentiation. Our observations demonstrate that MSCs selectively and directly increased hippocampal GABAergic presynapses and inhibitory transmission. In fact, this increment correlated to a higher expression of the potassium/chloride KCC2 cotransporter and to an enhancement of both the frequency and the amplitude of mIPSC and sIPSC. The decreased of GABA synapses following the treatment with a widely used Trk-neurotrophin receptor blocker, K252a, and the more specific TrkB receptor bodies prompt for the involvement of the brain derived neurotrophic factor (BDNF) in mediating such effects. The involvement of this neurotrophin is also strengthened by test ELISA on the culture medium collected from MSC-neuron co-cultures in which an higher BDNF concentration was detected, when compared to astrocyte-neuron co-cultures. The results obtained indicate that MSC-secreted factors induce glial-dependent neuronal survival and directly trigger an augmented GABAergic transmission in hippocampal cultures, highlighting a new effect by which MSCs could cooperate in CNS repair. Additionally, MSCs have been described to improve the clinical course of some demyelinating pathologies and to promote tissue repair through immunological mechanisms and neuroprotective effects. Following these evidences we performed in vitro and in vivo experiments to assess whether MSCs exert their actions through the support of oligodendrocytes (OLs), the myelinating CNS cells, and participate in the regulation of their proliferation and maturation. Through the analysis of specific proteins typically used as markers of the different stages of proliferation, maturation and differentiation (specifically, the membrane glycoprotein O4, the proteoglycan NG2 and myelin basic protein MBP, respectively), it has been noticed that MSCs are capable to prolong the proliferation phase of OPCs and also to anticipate OL differentiation, with respect to standard astrocyte/OL co-cultures. Moreover we investigated a possible molecular mechanism underlying these phenomena focusing on neurotrophin pathways. Trk receptors activation was analyzed in order to find out a possible role of neurotrophins in MSC-mediated effects on OLs, as it happens in neuronal cultures. We focused on the changes in the phosphorylation level of ERK (Extracellular signaling-regulated kinases), one of the activated effectors by TrK receptors. Our observations show that, in OLs co-cultured with MSCs, ERK is highly phosphorylated with respect to astrocyte/OL co-cultures, suggesting a MSC-induced activation of the pathways regulated by this protein. These data, although preliminary, suggest that MSCs positively act on the regulation of proliferation and maturation of OLs and, due to the observed effects on the regulation of synaptogenesis (see above), make these cells an interesting model for the identification of molecules involved in MSC neuroprotective processes. This may open new therapeutic approaches in the treatment of neurodegenerative diseases involving not only a synaptic imbalance, as it happens in various forms of epilepsy, but also in demyelinating diseases. Thus, in this research project, we aimed at characterising the molecular mechanisms underlying MSC actions that could participate in the recovery of neurological disorders or demyelinating pathologies.

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Maurizi, Giulia. « Caratterizzazione fenotipica, molecolare e proprietà immunoregolatorie delle cellule staminali mesenchimali ». Doctoral thesis, Università Politecnica delle Marche, 2012. http://hdl.handle.net/11566/242057.

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Le cellule staminali mesenchimali (Mesenchymal Stem Cells, MSCs) sono una popolazione con elevata capacità proliferativa e con potenziale di differenziazione multilineare; rappresentano, quindi, delle buone candidate per la terapia cellulare e la medicina rigenerativa. In questo studio sono state valutate MSCs fetali isolate da villi coriali (Chorionic Villi, CV) e da liquido amniotico (Amniotic Fluid, AF), confrontandole con le MSCs ottenute da midollo osseo (Bone Marrow, BM), per la capacità di crescita in presenza di siero umano allogenico (human serum, HS) o di lisato piastrinico (platelet lysate, PL), per le caratteristiche immunofenotipiche, il profilo di espressione citochinico e l’attività immunoregolatoria su linfociti allogenici stimolati e sottopopolazioni immunoselezionate. Data l’elevata potenzialità di espansione delle MSCs fetali, le cellule studiate sono state valutate per la loro stabilità replicativa tramite lo studio della lunghezza dei telomeri, l’attività dell’enzima telomerasi, l’espressione dei geni hTERT, c-myc e p53 e l’analisi del cariotipo. Una popolazione omogenea di cellule fibroblastoidi positiva ai tipici marcatori di superficie mesenchimali è stata isolata da tutti i campioni di CV ed AF analizzati. Le cellule di CV espandono rapidamente in HS (20 raddoppiamenti di popolazione, PDs, in 59 giorni e 6 passaggi di coltura), mentre in siero animale (fetal bovine serum, FBS) raggiungono 27 PDs in 65 giorni e 7 passaggi. Il PL determina un’espansione nel 60% dei campioni CV, comunque minore rispetto a quella in HS. I campioni di AF espandono, invece, 40 PDs in 90 giorni, ma solo nel 20% dei campioni analizzati, non proliferano in PL, mentre in FBS espandono 28.5 PDs in 66 giorni. Le cellule fetali studiate inibiscono la proliferazione di linfociti allogenici stimolati e regolano la crescita anche di popolazioni linfocitarie selezionate CD4+ e CD8+. Nonostante il loro elevato potenziale di espansione, le MSCs fetali studiate hanno mostrato una lunghezza stabile dei telomeri durante la cultura a lungo termine, assenza dell’attività telomerasica, nessuna espressione di hTERT, livelli costanti di espressione di c-myc e p53 e nessuna anomalia cromosomica. In conclusione, i risultati mostrano che i CV rappresentano un’ottima fonte di MSCs con proprietà immunoregolatorie, capace di espandere in un sistema di proliferazione umanizzato a lungo termine senza alterazioni genetiche. In più del 90% dei campioni di CV analizzati si ottiene un’espansione su larga scala in presenza di siero umano, incoraggiante per potenziali applicazioni cliniche.
Mesenchymal stem cells (MSCs) are promising candidates for cell therapy and tissue engineering. In previous studies, the most important source of MSCs was adult bone marrow (BM). Recently, MSCs with similar cell surface markers and differentiation capacity have also been found in developmentally younger tissues. This study showed data from fetal MSCs obtained from first-trimester chorionic villi (CV) and second trimester amniotic fluid (AF), comparing them with BM. The work reports on growth in human allogeneic serum (HS) and platelet lysate (PL), immunophenotype, cytokine expression profile and immunoregulatory activity of fetal MSCs on stimulated peripheral blood mononuclear lymphocyte subpopulations. The cells studied was analyzed also for telomere length, telomerase activity, hTERT, p53 and cmyc transcriptions, to evaluate their replicative stability. Spontaneous chromosomal alterations were excluded by cytogenetic analysis. CV cells grow rapidly in HS, with 20 populations doublings (PDs) after 59 days (6 passages), and also in animal serum, with 27 PDs after 65 days (7 passages). PL allowed an expansion in 60% of the samples tested, though it was lower than HS. HS supported an average of 40 PDs of expansion in 20% of AF cells after 90 days, whereas animal serum supported 28.5 PDs in 66 days. CV and AF cells inhibited the proliferation of stimulated T lymphocytes, suppressing the growth of both CD4+ and CD8+ T subpopulations and, sometimes, CD19+ cells. Despite their high proliferation capacity, fetal MSCs showed no telomerase activity, no hTERT transcriptions and maintained long, stable telomeres. A constant expression level of p53 and c-myc and a normal karyotype were preserved throughout long-term expansion, suggesting the safety of fetal MSCs. In conclusion, these results indicate that CV would be an optimal and safety source of MSCs with high expansion potential in a HS propagation system, immunoregulatory capacity of T and B lymphocytes. More than 90% of CV samples achieved a large-scale expansion in HS, that is encouraging for potential clinical applications of these cells.

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VELLECA, LUCIA. « PRODUZIONE DI CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI PER APPLICAZIONI DI TERAPIA AVANZATA ». Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano, 2014. http://hdl.handle.net/2434/231151.

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SOMMARIO I prodotti di ingegneria tissutale sono medicinali che contengono o consistono in cellule o tessuti sottoposti ad una rilevante manipolazione così da ottenere caratteristiche biologiche, funzioni fisiologiche e proprietà strutturali pertinenti alla finalità di rigenerazione, riparazione o sostituzione. Nel caso di cellule e tessuti manipolati in vitro, l'obiettivo da raggiungere nel controllo dei processi di produzione e della qualità del prodotto finale è garantire la sicurezza e l'efficacia dei prodotti da immettere nell'uso clinico. Ne consegue la necessità di operare nel rispetto di norme proprie dei processi produttivi dei farmaci sia dal punto di vista della qualità che della sicurezza del prodotto. Lo scopo del lavoro svolto durante il dottorato è stato lo studio e messa a punto di sistemi di produzione per la generazione di un prodotto innovativo per terapie avanzate. Si tratta di un prodotto costituito da cellule staminali mesenchimali, ottime candidate per applicazioni cliniche in medicina rigenerativa. Per la produzione di un prodotto di terapia avanzata, l’intero processo, a partire dal campione iniziale fino al prodotto finito, deve essere svolto in un’officina farmaceutica autorizzata che operi nel rispetto delle Good Manufacturing Practices (GMP). Si tratta di linee guida il cui scopo è assicurare che un farmaco sia prodotto, analizzato e rilasciato in un regime di Qualità controllata e certificata in modo da minimizzare il pericolo che vi siano rischi non previsti per il paziente. Nella fase preliminare del processo è stata valutata la fattibilità del metodo e sono stati definiti i protocolli da impiegare. La fase di fattibilità ha permesso di mettere a punto la procedura di isolamento, espansione, differenziamento delle cellule staminali. E’ stato possibile valutare la stabilità genomica e le caratteristiche immunofenotipiche delle cellule a vari passaggi cellulari. Tutti i dati ottenuti durante lo studio di fattibilità sono stati fondamentali per definire i test di controllo di qualità, le specifiche di prodotto e i criteri di accettabilità richiesti per la successiva convalida del processo. I risultati presentati durante lo studio di fattibilità evidenziano come sia possibile trasferire protocolli di ricerca in processi potenzialmente applicabili in sperimentazione clinica. Alla fine del processo di convalida che prevede la produzione di tre lotti di cellule, le specifiche previste per i controlli in ingresso, durante il processo di produzione e sul prodotto finito devono risultare conformi a tutte le richieste. I passi futuri sono la validazione del processo asettico, mediante l’esecuzione di tre mediafill e la valutazione del rischio relativa alla produzione di lotti destinati alla clinica, in modo da completare la serie di studi necessari per la presentazione di una domanda di autorizzazione allo studio clinico.
ABSTRACT Tissue Engineered products may carry cells or tissues either of human or animal origin. The cells and tissues shall be subjected to substantial manipulation in order to obtain biological characteristics, physiological functions or structural properties relevant for the intended regeneration, repair or replacement. For cells and tissues manipulated in vitro, the objective to be achieved in terms of control of production processes and quality of the final product is to ensure the safety and effectiveness of the products that would be placed in clinical use. Hence the need to act in accordance with the rules which define production processes used for drugs, in order to guarantee the quality and safery of the product.. The purpose of the work done during the PhD was the study and the development of production protocol for the generation of an innovative product for advanced therapies. It is a cellular product made of mesenchymal stem cells, good candidates for clinical applications in regenerative medicine. For this production, all stages, starting from the initial sample and up to the final product, must be carried out in an authorized pharmaceutical facility which operates in compliance with Good Manufacturing Practices (GMP). The purpose of these guidelines is to ensure that drugs are produced, analysed and released in a regime of controlled and certified quality minimizing the danger of unexpected risks for the patient. In the preliminary phase of the process the feasibility of the method was evaluated and the protocols to be used were defined. The feasibility phase allowed the development of procedures for the isolation, expansion and differentiation of stem cells. It was possible to evaluate the genomic stability and immunophenotypic features of the cells at different steps. All data obtained during the feasibility study have been fundamental to define the tests of quality control, product specifications and criteria of acceptability required for the subsequent validation of the process. The results presented in the feasibility study show that it is possible to transfer research protocols to a GMP framework which is potentially applicable in clinical trials. At the end of the validation process, which involves the production of three batches of cells, the specifications required for the incoming controls, during the production’s process and on the final product must comply with all the requirements. The future steps will be the validation of the aseptic process, through the execution of three mediafill and the risk assessment related to the production of batches intended for clinical use, in order to complete the series of documents required for the submission of an application for a clinical study.

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BOSSIO, CATERINA. « TRANSDIFFERENZIAMENTO DI CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI DI RODITORE IN CELLULE DEL SISTEMA NERVOSO CENTRALE ». Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano, 2012. http://hdl.handle.net/2434/171967.

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One of the most important challenges in modern medicine is the identification of cell therapy protocols, enabling identification of personalized treatment strategies. WIthin this context, adult stem cells (ASC) have a large applicative potential. Contrary to ESCs (embryonic stem cells) and IPSCs (induced pluripotent stem cells), ASCs can be easily extracted from different tissues (bone marrow, skin, adipose tissue, muscle) without raising ethical issues . Moreover, they can be used for autologous transplantation, eliminating the complications associated with autoimmune reactions. Mesenchymal stem cells (MSC,), are an ASC population present in the bone marrow, adipose tissue and other tissues. MSCs are readily available and are able to self-replicate and differentiate, supported by the presence of appropriate stimuli, into cell lines derived from mesodermal lineage (osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, and muscle cells). In the last decade it has also been observed that MSCs are able to trans-differentiate into cell types of ectodermal and endodermal origin (transdifferentiation).. The purpose of my work was to develop and define the conditions which can induce trans-differentiation of MSCs extracted from rat adipose tissue toward the neuronal phenotype. The study is part of a major project of regenerative medicine focused on identifying new strategies aimed at restoring functionality in degenerated brain tissue. Initially, MSCs have been characterized by the induction of osteoblastic differentiation, one of their physiological differentiations, and their interaction with biocompatible materials ( titanium dioxide) was analyzed, in order to assess their possible application in medicine for the creation, for example, of prothesic solutions. Subsequently, we sought to devise a GMP compliant cell culturing medium for MSC proliferation, crucial in order to obtain a clinically relevant cell number to differentiate following isolation from adipose tissue. For that reason we tried to induce the differentiation of MSCs into a neural phenotype; a first approach has been to apply protocols already known in literature for the differentiation of different types of stem cells toward the neuronal phenotype.. We considered both the direct differentiation protocols, as well as those that encompassed intermediate stages (sphere-forming). The protocols of differentiation by sphere formation resulted in differentiated MSC expressing glial markers (GFAP), but the protocol was too long(30 days) and a number of differentiated cells very low.. A second approach has been to develop a proprietary differentiation medium (NZ4) using the knowledge and expertise gained from the literature and from the negative results previously obtained The cells maintained in NZ4 differentiation medium , showed a clear morphological change and a high vitality; moreover they expressed both markers of specific neurons in the early stages of development (nestin, doublecortin) as well as markers expressed by mature neurons (βIIItubulin, VAMP2, Sinaptotagmin). Furthermore, the efficiency of the differentiation protocol has been functionally characterized by means of qualitative analysis of the dynamics of intracellular calcium and with quantitative analysis of the resting membrane potential The functional characterization clearly showed that MSC exposed to NZ4 differentiation medium have comparable behavior as primary neurons undergoing in vitro maturation. Given the future direction of the project will be to inject in an animal model the cell undergoing differentiation in order to attempt a partial recovery of the damaged neuronal tissue (i.e. ischemia) we characterized the behavior of MSC encapsulated in a biocompatible bioresorbable hydrogel matrix. The cells were encapsulated for different time periods, recovered, and heir survival as well as maintenance of stemness potential following retrieval was assessed . There are still other issues to be clarified n in particular, it will be necessary to verify in an in vivo setting the the efficacv of the differentiation protocol as well as to characterize the process of MSCs homing and to perform more detailed studies on behavioral changes of the same animal model. However, preliminary data obtained during this thesis allows to deepen the knowledge concerning the differentiation process of MSC from adipose tissue toward a neuronal phenotype.

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CARRI, A. DELLI. « GENERAZIONE DI NEURONI STRIATALI FUNZIONALI DA CELLULE STAMINALI EMBRIONALI UMANE ». Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano, 2013. http://hdl.handle.net/2434/215120.

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Medium-sized spiny neurons (MSNs) are the only neostriatum-projection neurons, and their degeneration underlies some of clinical features of Huntington's disease. We used human developmental biology and exposure to key neurodevelopmental molecules to drive human pluripotent stem (hPS) cells into MSNs. In a feeder-free adherent culture, ventral-telencephalic specification is induced by BMP/TGF-β inhibition and subsequent SHH/DKK-1 treatment. The emerging FOXG1+/GSX2+ telencephalic progenitors are then terminally differentiated, resulting in the systematic line-independent generation of FOXP1+/FOXP2+/CTIP2+/calbindin+/DARPP-32+ MSNs. Similarly to mature MSNs, these neurons carry dopamine- and A2a-receptors, elicit typical firing pattern, and show inhibitory postsynaptic currents, as well as dopamine neuromodulation and synaptic integration ability in vivo. When transplanted into the striatum of quinolinic acid-lesioned rats, hPS-derived neurons survive and differentiate into DARPP-32+-neurons, leading to a restoration of apomorphine-induced rotation behaviour. In summary, hPS cells can be efficiently driven to acquire a functional striatal fate using an ontogeny-recapitulating stepwise method. Moreover, we have established stable HD-iPS cell lines that recapitulating, in vitro, features of the disease can be used for investigating disease mechanisms that underlie HD, representing a platform for in vitro human developmental neurobiology studies and drug screening approaches.

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Babini, Lucia. « Ruolo del sistema FASL/FAS nella biologia delle cellule mesenchimali staminali ». Doctoral thesis, Università Politecnica delle Marche, 2013. http://hdl.handle.net/11566/243016.

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Résumé :

Le cellule staminali mesemchimali (MSC) sono una popolazione eterogenea di cellule stromali multipotenti, possono essere isolate da diversi tessuti adulti e possono dare origine a diversi tipi cellulari(21). Nel midollo osseo (BM) differenziano principalmente in osteoblasti e adipociti, e l’ interazione con questo microambiente influenza da vicino il loro programma differenziativo. FasL è una citochina molto conosciuta per il suo ruolo pro-apoptotico, in associazione con il suo recettore specifico Fas, tuttavia diversi studi propongono che sia coinvolta anche in altri processi biologici. Questo lavoro dimostra per la prima volta che FasL può essere coinvolto nella proliferazione e nella differenziazione delle BM-MSC. Le BM-MSC trattate con una bassa dose di FasL (0.5 ng/ml) proliferano più rapidamente delle cellule non trattate, senza andare incontro ad apoptosi o a processi differenziativi, mentre dosi più alte (25 ng/ml) inducono il processo apoptotico nel 20% delle cellule, selezionando una popolazione con un fenotipo ancora staminale. A livello molecolare il trattamento con FasL 0.5 ng/ml induce la fosforilazione di ERK 1/2 e l’aumento dell’espressione della survivina mentre FasL 25 ng/ml determina l’attivazione delle caspasi 8 e 3. Inoltre FasL 25 ng/ml attraverso la modulazione di PPARγ e FABP4/aP2 inibisce reversibilmente la differenziazione delle BM-MSC in adipociti. I dati di inibizione dell’adipogenesi in vitro sono stati confermati su topi Fas lpr, mutati per Fas, che hanno mostrato una maggiore espressione dell’mRNA e delle proteine PPARγ e FABP4/aP2 rispetto ai controlli. I nostri dati suggeriscono che il sistema FasL/Fas è coivolto nella biologia delle BM-MSC, e può regolarne sia la proliferazione che il differenziamento adipogenico. Questi risultati possono avere una rilevanza clinica, chiarendo i meccanismi che determinano l’aumento dell’adipogenesi nel midollo durante l’invecchiamento o in alcune condizioni patologiche come l’osteoporosi.
Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent progenitor cells that can differentiate into several cell types. Bone marrow (BM)-MSCs mainly differentiate into osteoblasts or adipocytes. MSC interactions with their microenvironment directly affect their self-renewal/differentiation program. Here we show for the first time that FasL, a well-explored pro-apoptotic cytokine, can promote proliferation of BM-derived MSCs in vitro and inhibits their differentiation into adipocytes. BMMSCs treated with a low FasL dose (0.5 ng/ml) proliferated more rapidly than untreated cells without undergoing spontaneous differentiation or apoptosis, whereas higher doses (25 ng/ml) induced significant though not massive BM-MSC death, with surviving cells maintaining a stem cell phenotype. At the molecular level, 0.5 ng/ml FasL induced ERK1/2 phosphorylation and surviving up-regulation, whereas 25 ng/ml FasL induced caspase activation. Importantly, 25 ng/ml FasL reversibly prevented BM-MSC differentiation into adipocytes by modulating PPARγ and FABP4/aP2 expression induced by adipogenic medium. All such effects were inhibited by anti-Fas neutralizing antibody. The in vitro data regarding adipogenesis were confirmed using Faslpr mutant mice, where higher PPARγ and FABP4/aP2 mRNA and protein levels were documented in whole tibia. These data show that the FasL/Fas system plays a role in BM-MSC biology via regulation of both proliferation and adipogenesis. These findings may have clinical relevance because circulating Fas/FasL levels decline with age and several age-related conditions, including osteoporosis, are characterized by adipocyte accumulation in BM.

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Magnasco, Alberto <1964&gt. « Ruolo delle cellule staminali mesenchimali in modelli cellulari e animali di nefropatia ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2008. http://amsdottorato.unibo.it/1085/1/Tesi_Magnasco_Alberto.pdf.

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Résumé :

Background. Mesenchymal stem cells (MSC) may be of value in regeneration of renal tissue after damage, however lack of biological knowledge and variability of results in animal models limit their utilization. Methods. We studied the effects of MSC on podocytes ‘in vitro’ and ‘in vivo’ utilizing adriamycin (ADR) as a model of renal toxicity. The ‘in vivo’ experimental approach was carried out in male Sprague Dawley rats (overall 60 animals) treated with different ADR schemes to induce acute and chronic nephrosis. MSC were given a) concomitantly to ADR in tail vein or b) in aorta and c) in tail vein 60 days after ADR. Homing was assessed with PKH26-MSC. Results. MSC rescued podocytes from apoptosis induced by ADR ‘in vitro’. The maximal effect (80% rescue) was obtained with MSC/Podocytes co-culture ratio of 1:1 for 72 hours. All rats treated with ADR developed nephrosis. In no case MSC modified the clinical parameters (i.e. proteinuria, serum creatinine, lipids) but protected the kidney from severe glomerulosclerosis when given concomitantly to ADR. Rats given MSC 60 days after ADR developed the same severe renal damage. Only few MSC were found in renal tubule-interstitial areas after 1-24 hours from injection and no MSC was detected in glomeruli. Conclusions. MSC reduced apoptosis of podocytes treated with ADR ‘in vitro’. Early and repeated MSC infusion blunted glomerular damage in chronic ADR nephropathy. MSC did not modify proteinuria and progression to renal failure, that implies lack of regenerative potential in this model.

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Magnasco, Alberto <1964&gt. « Ruolo delle cellule staminali mesenchimali in modelli cellulari e animali di nefropatia ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2008. http://amsdottorato.unibo.it/1085/.

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Résumé :

Background. Mesenchymal stem cells (MSC) may be of value in regeneration of renal tissue after damage, however lack of biological knowledge and variability of results in animal models limit their utilization. Methods. We studied the effects of MSC on podocytes ‘in vitro’ and ‘in vivo’ utilizing adriamycin (ADR) as a model of renal toxicity. The ‘in vivo’ experimental approach was carried out in male Sprague Dawley rats (overall 60 animals) treated with different ADR schemes to induce acute and chronic nephrosis. MSC were given a) concomitantly to ADR in tail vein or b) in aorta and c) in tail vein 60 days after ADR. Homing was assessed with PKH26-MSC. Results. MSC rescued podocytes from apoptosis induced by ADR ‘in vitro’. The maximal effect (80% rescue) was obtained with MSC/Podocytes co-culture ratio of 1:1 for 72 hours. All rats treated with ADR developed nephrosis. In no case MSC modified the clinical parameters (i.e. proteinuria, serum creatinine, lipids) but protected the kidney from severe glomerulosclerosis when given concomitantly to ADR. Rats given MSC 60 days after ADR developed the same severe renal damage. Only few MSC were found in renal tubule-interstitial areas after 1-24 hours from injection and no MSC was detected in glomeruli. Conclusions. MSC reduced apoptosis of podocytes treated with ADR ‘in vitro’. Early and repeated MSC infusion blunted glomerular damage in chronic ADR nephropathy. MSC did not modify proteinuria and progression to renal failure, that implies lack of regenerative potential in this model.

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BECCIA, Elisa. « Possibile uso delle cellule staminali mesenchimali amniotiche come terapia nella fibrosi cistica ». Doctoral thesis, Università degli studi del Molise, 2021. http://hdl.handle.net/11695/100844.

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Résumé :

La fibrosi cistica (FC) è una malattia genetica letale, autosomica recessiva, causata dalla mutazione del gene Cystic Fibrosis Trasmembrane Conductance Regulator (CFTR) che codifica per una proteina canale che regola la conduzione transmembrana di cloro, cAMP- dipendente, espressa sul lato apicale delle cellule epiteliali. Il difetto di base dell’epitelio respiratorio nei pazienti è duplice ossia riguarda la secrezione di cloro e l’assorbimento di sodio. Ne deriva un alterato flusso di fluidi attraverso l’epitelio, con alterata clearance mucociliare respiratoria, cicli di infezioni batteriche e infiammazione ed infine grave danno polmonare. Principale causa di morbilità e mortalità è l’infiammazione cronica che colpisce il polmone. Sono stati scoperti farmaci agenti direttamente sulla CFTR ma non riescono a risolvere il difetto associato a tutte le mutazioni responsabili della FC. La terapia cellulare, invece, essendo agnostica per la mutazione, ha la possibilità di poter curare ogni paziente. Oltre al midollo osseo, nuova promettente fonte di cellule staminali è la membrana amniotica, da cui derivano cellule stromali mesenchimali amniotiche umane (hAMSC) che esprimono marcatori di staminalità e possono differenziare in cellule epiteliali respiratorie quando co-coltivate con cellule epiteliali bronchiali umane immortalizzate (CFBE14o-), omozigoti per l’allele F508del, mutazione più frequente nella FC. Le co-colture mostrano un’aumentata espressione e funzionalità della CFTR e una parziale correzione di altri difetti di base associati alla FC. Poiché tali risultati vengono ottenuti solo nelle co-colture, è stato supposto che un contatto diretto tra hAMSC e CFBE14o- sia necessario per il recupero di tali difetti. Uno degli obiettivi di questa tesi è stato comprendere il ruolo della comunicazione intercellulare, mediata dalle gap junctions (GJ), nelle co-colture studiate per l’espressione e la funzionalità della proteina Cx43, una delle principali componenti delle GJ, silenziando o meno le stesse con un siRNA diretto contro l’mRNA di interesse. I risultati evidenziano il ruolo fondamentale delle GJ nella correzione dei difetti di base associati alla FC da parte delle hAMSC. Si è, quindi, indagato quale messaggero molecolare potesse essere trasmesso attraverso le GJ e, eventualmente, mediare l’effetto terapeutico delle hAMSC. Anche i microRNA (miRNA) vengono trasferiti attraverso le GJ ed è stato dimostrato il loro coinvolgimento nei livelli di espressione della CFTR. In particolare, miRNA-138 aumenta l’espressione della CFTR interagendo con la proteina SIN3A. Sono stati quindi studiati i livelli di miRNA-138 mediante droplet digital PCR. I dati preliminari mostrano come le cellule wild-type abbiano dei livelli più alti di miRNA-138 rispetto alle CFBE14o- con un trend all’aumento nelle co-colture. Ulteriore obiettivo è stato studiare se le hAMSC possano velocizzare la rigenerazione dell’epitelio respiratorio bronchiale e la chiusura delle lesioni che continuamente si formano sotto lo stimolo infiammatorio cronico nei polmoni dei pazienti con FC. I risultati dimostrano che le hAMSC aggiunte ad una ferita indotta su un monostrato di CFBE14o-, sono in grado di riparare il danno con la stessa tempistica richiesta ad una ferita simulata su monostrato di cellule epiteliali bronchiali wild type. Questi studi indicano la possibile utilità terapeutica delle cellule hAMSC nella malattia polmonare associata alla FC, sebbene ulteriori studi sul loro meccanismo d’azione e in modelli più vicini alla patologia umana siano necessari.
Cystic fibrosis (CF) is a lethal, autosomal recessive inherited genetic disease caused by mutation on the Cystic Fibrosis Trasmembrane Conductance Regulator (CFTR) gene encoding a cAMP-dependent channel protein that regulates transmembrane conduction of chloride, which is expressed on the apical membrane of epithelial cells. The basic defect of the airway epithelium in CF patients is due to a double defect in chloride secretion and sodium absorption that lead to an altered flow of fluids through the epithelium of the airways, resulting in an alteration of the airway’s mucociliary clearance, opportunistic bacterial infections, inflammation and severe lung damage. The main cause of morbidity and mortality is chronic inflammation affecting the lung. New drugs have been developed recently to act directly on the CFTR protein, in order to rescue the mutated CFTR processing and function. However, there are still mutations that still failed to be rescued by CFTR modulators. Cell therapy, on the other hand, being agnostic for mutation, has the possibility of being able to cure every patient. Recently have been investigated stem cells as potential therapeutic sources for CF. In addition to the bone marrow, stem cells derived from the amniotic membrane, human amniotic mesenchymal stem cells (hAMSC) are very promising as they express stem cells markers and can differentiate into respiratory epithelial cells when they are co-cultured with immortalized human bronchial epithelial cells (CFBE14o-), homozygous for the F508del allele, the most frequent mutation in CF. The co-cultures also show an increased processing and conductance of the CFTR protein and a partial correction of other basic defects associated with the disease. Since these results are obtained only in co-cultures, it has been assumed that direct contact between hAMSC and CFBE14o- is necessary for the recovery of these defects. One of the objectives of this thesis was to understand the role of intercellular communication, mediated by gap junctions (GJ), in co-cultures that were studied for the expression and functionality of the Cx43 protein, one of the main components of GJ, before and after their silencing, obtained using a siRNA directed against the mRNA of interest. The results highlighted the fundamental role of GJ in the correction of the basic defects associated with CF by hAMSC. It was further investigated which molecular messenger could be transmitted through the GJ and, possibly, mediate the therapeutic effect of hAMSC. MicroRNAs (miRNAs) are also transferred across GJ and their involvement in the expression levels of the CFTR protein has been demonstrated. In particular, miRNA-138 increases the expression of the CFTR protein by interacting with the SIN3A protein. The levels of miRNA-138 were then investigated by droplet digital PCR. Preliminary data show that wild-type CFTR cells have higher levels of miRNA-138 than cells with F508del mutation and that there is an upward trend in co-cultures. A further objective of the study was to investigate whether hAMSC can speed up the regeneration of the airway bronchial epithelium and the closure of the injury that continuously form under the chronic inflammatory stimulus in the lungs of CF patients. The results demonstrate that hAMSC added to a wound induced on a monolayer of CFBE14o-, are able to repair the damage with the same timing required for a simulated wound on a monolayer of wild type CFTR bronchial epithelial cells. Taking to account the data generated in the current study, it indicates the possible therapeutic utility of hAMSC in lung disease associated with CF. However, further studies on their mechanism of action conducted in models with closer resemblance to human CF pathology are required.

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Ave, Elisa. « Le cellule mesenchimali staminali nella patogenesi della leucemia linfatica cronica di tipo B ». Doctoral thesis, Università degli studi di Padova, 2010. http://hdl.handle.net/11577/3427362.

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B-cell Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL) is the most common leukemia in adults and is characterized by the accumulation of mature clonal CD5+ B lymphocytes in peripheral blood, bone marrow and lymphoid tissues. The defect in programmed cell death favours the disease progression through a prolonged survival of malignant cells and the induction of the drug-resistance. The defective apoptosis of B-CLL cells is not only due to intrisic defects of the leukemic clone, but also to extrinsic factors that influence its behavior in the tissue microenvironment. Since the accumulation of monoclonal B cells is also supported by their interaction with surrounding cells, we focused our attention on mesenchymal stem cells (MSCs) in order to evaluate their role in survival and localization of neoplastic clone. MSCs can be isolated, expanded with high efficiency and induced to differentiate into multiple mesenchymal lineages under appropriated colture conditions. In addition, they show crucial immunoregulatory properties suppressing several T-, B- and NK-cell functions and affecting dendritic cell activities. In the present study MSCs isolated from the bone marrow of 47 B-CLL patients were expanded ex vivo and characterized through fluocytometric analysis and differentiation coltures (adipocytes and osteocytes). While MSCs from B-CLL patients exhibited normal phenotype and differentiation capacities, when co-coltured with neoplastic B cells they exherted an anti-apoptotic effect reducing lymphocyte apoptosis. After 7 days of colture in presence of CLL-MSC, we observed a relevant extended survival of leukemic cells, but not of normal B lymphocytes. The same effect was observed on B-CLL cells isolated from 3 patients treated with pro-apoptotic compounds, suggesting an involvement of MSCs in drug-resistance. Finally, chemotaxis tests showed the ability of MSCs to produce molecules promoting migration and localization of neoplastic B cells in bone marrow. Taken together, these findings suggest that MSCs derived from patients with B-CLL, despite an apparent normal phenotype and normal differentiation ability, provide survival signals to neoplastic cells extending their lifespan and producing chemotattic factors favouring their accumulation in the bone marrow.
La leucemia linfatica cronica di tipo B (LLC-B) è la forma più comune di leucemia nell’adulto ed è caratterizzata dall'accumulo clonale di piccoli linfociti B CD5+ nel sangue periferico, nel midollo osseo e negli organi linfatici, dovuto sia ad un aumento della proliferazione che ad un difetto dei meccanismi di morte cellulare programmata. La resistenza all’apoptosi in questi linfociti favorisce la progressione della malattia attraverso un’aumentata sopravvivenza del clone neoplastico e l’induzione della resistenza ai farmaci citostatici. Tali alterazioni sono imputabili sia a fattori intrinseci che a fattori estrinseci derivanti dal microambiente. Poiché l’aumentata sopravvivenza ed il progressivo accumulo del clone linfocitario risultano selettivamente favoriti dall'interazione con cellule accessorie non tumorali presenti nel microambiente in cui esso risiede, in questa tesi abbiamo focalizzato l’attenzione sulle cellule mesenchimali staminali (MSC), allo scopo di valutare il loro ruolo nella sopravvivenza e nella compartimentalizzazione del clone B leucemico. Le MSC costituiscono una frazione esigua (inferiore allo 0,01%) della popolazione di cellule midollari, sono cellule staminali multipotenti in grado di differenziare in diversi tessuti di origine mesenchimale; sono inoltre dotate di proprietà immunomodulatorie verso linfociti B, T, Natural Killer e cellule dendritiche. In questa tesi le MSC sono state isolate dal sangue midollare di 47 pazienti affetti da LLC-B e sono state caratterizzate fenotipicamente e funzionalmente mediante analisi citofluorimetrica (positività per CD73, CD90 e CD105, negatività per CD31, CD34 e CD45) e colture differenziative (adipociti ed osteociti) confrontandole con MSC di donatori sani. Successivamente si sono allestite co-colture di linfociti B di pazienti affetti da LLC e MSC allo scopo di valutare l’effetto delle MSC sul clone neoplastico di LLC. Le MSC ottenute dai pazienti non hanno presentato alterazioni dal punto di vista fenotipico né funzionale rispetto alle MSC di donatori sani, tuttavia esse hanno sviluppato interazioni capaci di favorire la sopravvivenza del clone leucemico. Gli esperimenti di co-coltura hanno dimostrato infatti che le MSC esercitano un effetto anti-apoptotico sui linfociti B neoplastici, documentato da un aumento significativo della sopravvivenza delle cellule B di LLC dopo 7 giorni di coltura, effetto verificatosi anche con MSC di donatori sani e invece molto meno marcato nei linfociti B normali. Tale attività anti-apoptotica si è osservata, seppur di minore intensità, anche nei linfociti B di pazienti sottoposti a trattamento chemioterapico in vivo con Fludabarina e Ciclofosfamide, suggerendo che le MSC possano essere implicate anche nei meccanismi di chemio resistenza del clone di LLC. Infine l’analisi della migrazione cellulare dei linfociti B patologici in presenza di terreno condizionato derivante dalle colture di MSC ha dimostrato la capacità delle MSC di produrre stimoli chemiotattici in grado di richiamare in sede midollare il clone maligno, ma non i linfociti B normali. I dati riportati suggeriscono che le MSC nei pazienti affetti da LLC-B, sebbene non mostrino alterazioni dal punto di vista fenotipico e funzionale, svolgono un ruolo attivo nel favorire la sopravvivenza e la compartimentalizzazione delle cellule B neoplastiche a livello midollare.

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Tigano, Vincenzo Mario Marco. « I profili di rilevanza penale della ricerca scientifica sulle cellule staminali embrionali umane ». Thesis, Universita' degli Studi di Catania, 2011. http://hdl.handle.net/10761/369.

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Résumé :

La tesi esamina i diversi profili di intersezione tra istanze di innovazione della ricerca scientifica e rispetto dei principi fondamentali del diritto penale. Nel primo capitolo, dopo un'attenta e dettagliata analisi della fattispecie di sperimentazione sugli embrioni umani, viene rilevata l'esigenza di effettuare un contemperamento tra la tutela dell'embrione e la liberta' della ricerca scientifica, soprattutto per quanto concerne le possibili destinazioni degli embrioni soprannumerari in condizioni di abbandono. Nell'ambito del secondo capitolo, rilevano le valutazioni compiute sul concetto di "dignita'", sulla base di un approccio multidisciplinare tra la filosofia del diritto, la bioetica e il diritto penale. La configurazione del bene giuridico della "dignita' umana" come interesse della collettivita' risulta funzionale a reprimere la strumentalizzazione del genere umano, in un'ottica di apertura "bilanciata" alla liberta' della scienza medica nel campo dell'impiego di cellule staminali embrionali. E' condotto, altresi', un giudizio sull'irragionevolezza del trattamento sanzionatorio apprestato dalla legge n. 40/2004 per le fattispecie "aggravanti" del delitto di sperimentazione. Nel terzo capitolo, viene affrontato l'esame comparatistico dei diversi modelli di regolamentazione rinvenibili tra gli Stati membri dell'UE, al fine di evidenziare le cause che impediscono un'armonizzazione europea in materia.
Doctoral thesis considers aspects of connection between advances in stem cell research and principles of criminal law. In the first chapter, after an analysis of the crime of experiment with human embryos, the author deals with necessary balance between protection of scientific research and safeguard of supernumeraries embryosÃ Ã Ã Â¢ life. In the second chapter, the author examines the concept of Ã Ã Ã Â¢ human dignityÃ Ã Ã Â¢ , showing thoughts of philosophers and criminal lawÃ Ã Ã Â¢ s experts. Configuration of Ã Ã Ã Â¢ human dignityÃ Ã Ã Â¢ as a collective right can allow a strong repression of human speciesÃ Ã Ã Â¢ exploitation, made by embryosÃ Ã Ã Â¢ cloning. The author examines disproportion of penalities provided, too. In the third chapter, the author examines possibilities of a criminal harmonisation in the EU about embryo research

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Casadei, Emanuele. « Induzione del differenziamento osteogenico di cellule staminali mesenchimali tramite microstiramento musicale a frequenza variabile ». Bachelor's thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2022.

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Nel mondo ogni anno circa 2,2 milioni di pazienti si sottopongono a innesti ossei. Esiste inoltre un ramo dell’ingegneria dei tessuti che sviluppa e sperimenta biomateriali e bioreattori con la capacità di indurre un commissionamento osteogenico di cellule staminali in coltura, per realizzare in vitro tessuto osseo biomimetico. Tuttavia, al momento non esiste una tecnica accreditata come standard di coltura per stimolare le cellule nello stesso modo nel quale sono sollecitate nel tessuto in vivo. I meccanismi di generazione e riparazione del tessuto osseo sono, in gran parte, regolati da segnali meccanici che agiscono attraverso una deformazione che nell’osso si manifesta come non-uniforme, a frequenza variabile e a bassa intensità. Attualmente i dispositivi in grado di stimolare meccanicamente i sistemi cellulari producono una deformazione con una frequenza costante e con un’ampiezza che non rispecchia quella fisiologica. Tuttavia è stato recentemente progettato un con spettro analogo a quello di un segnale musicale (NUMS non uniform micro stretching) . I risultati del lavoro descritto in questo elaborato confermano che le cellule stimolate con NUMS presentano un miglior differenziamento osteogenico rispetto a cellule stimolate con un segnale uniforme (US uniform stretching). Questo dispositivo innovativo getta le basi per uno sviluppo di una tecnologia che promuova la sintesi in vitro di tessuto osseo bioibrido.

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Cavallari, Giuseppe <1972&gt. « Capacità immunomodulatoria delle cellule staminali mesenchimali in un modello di trapianto d'organo in vivo ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2008. http://amsdottorato.unibo.it/1130/1/Tesi_Cavallari_Giuseppe.pdf.

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Cavallari, Giuseppe <1972&gt. « Capacità immunomodulatoria delle cellule staminali mesenchimali in un modello di trapianto d'organo in vivo ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2008. http://amsdottorato.unibo.it/1130/.

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LEONIDA, ALESSANDRO. « Studio in vitro del processo di osteointegrazione mediante l'utilizzo di cellule staminali mesenchimali adulte ». Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano-Bicocca, 2012. http://hdl.handle.net/10281/29719.

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The aim of our study was to evaluate the properties of the laser-modified titanium surface, that are its skills of promoting a faster differentiation of human Mesenchymal Stem Cells (hMSCs) into osteoblasts and a more stable connection between differentiated cells and titanium comparing to the machined and the sand-blasted surfaces. Furthermore, we wanted to evaluate if titanium alone was a sufficient factor able to induce the differentiation towards the osteogenic lineage. Materials and methods: we harvested stem cells from an individual (after his consensus) and cultivated them into dishes with titanium disks presenting three different surfaces: machined (M), sand-blasted (S) and laser-modified (L). In the test group cells were cultivated in an osteogenic medium, while in the control group cells were seeded in a standard DMEM. Evaluations of the degree of differentiation were made with Alizarin coloration after 28, 38, 42, 49, 56 and 63 days of induction. Results: no signs of differentiation were evident in the control group, while in the test group there was a statistically significant differentiation evident since the fourth week. Laser-modified and sand-blasted surfaces showed similar values, greater than the machined surface. Discussion: the differentiation reached its peak on the sixth week for the laser-modified surface, and on the seventh week for the other two surfaces. After the peak, the differentiation had a slow decrease for the laser-modified surface and a rapid decrease for the other two. Conclusions: titanium alone can’t be considered a sufficient factor able to induce differentiation of human Mesenchymal Stem Cells into osteoblasts. Moreover, laser-modified induces a faster differentiation of stem cells and a more stable connection between osteoblasts and titanium.

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ROFANI, CRISTINA. « Cellule staminali : studio di base, espansione ed applicazioni in ingegneria tissutale ». Doctoral thesis, Università degli Studi di Roma "Tor Vergata", 2009. http://hdl.handle.net/2108/878.

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Résumé :

Le cellule staminali sono molto rare e per questo il loro impiego in campo clinico è problematico. L’utilizzo del cordone ombelicale, che risolverebbe il problema del donatore, ha purtroppo un’applicazione limitata a causa proprio del numero insufficiente di cellule staminali. Per questo motivo è di fondamentale importanza lo sviluppo di un sistema per l’espansione delle cellule staminali. Nello stesso tempo, per l’applicazione delle cellule staminali in ingegneria tissutale (ad esempio per la riparazione del tessuto osseo) risulta indispensabile l’individuazione di uno scaffold idoneo a tale scopo. Per questo motivo, da un lato è stato studiato un sistema per l’espansione delle cellule staminali emopoietiche di cordone ombelicale, dall’altro è stato fatto uno screening di scaffold diversi per l’applicazione in ingegneria del tessuto osseo. In un nostro precedente studio è stato dimostrato che l’interleuchina (IL)-16 è capace di indurre le cellule CD34+ a proliferare e differenziare in cellule dendritiche mature. In questo lavoro, è stato investigato il ruolo dell’IL-16 nell’espansione delle cellule CD34+ isolate da sangue di cordone ombelicale. E’ stato osservato che l’IL-16 aggiunta al cocktail di base costituito da stem cell factor (SCF), Flt-3 ligand (FL), thrombopoietin (TPO), IL-6 e IL-3, aumenta significativamente il numero delle cellule CD34+, della popolazione più primitiva CD34+CD38-, dei progenitori emopoietici e delle LTC-IC (long-term-culture-initiating-cells), non alterando la capacità delle cellule CD34+ di differenziare in linfociti-B e cellule natural killer (NK). L’aggiunta dell’IL-16 aumenta l’attività migratoria delle cellule CD34+ espanse e diminuisce la percentuale delle cellule CD34+CD4+. Questi risultati sembrano suggerire che l’IL-16 possa avere un ruolo importante nell’espansione delle cellule staminali emopoietiche e possa essere utilizzata in clinica per l’espansione delle cellule CD34+ (Articolo I). Scaffold diversi di policaprolattone (PCL) sono stati analizzati al fine di individuare un nuovo biomateriale in grado di promuovere il differenziamento delle cellule staminali mesenchimali di coniglio in osteoblasti. I risultati ottenuti dimostrano che lo scaffold PCL/TZ-HA, ottenuto mescolando PCL e proteina termoplastica zeina, sembra favorire l’adesione ed il differenziamento osteogenico, dimostrando un ottimo potenziale applicativo nell’ingegneria del tessuto osseo (Articolo II). Recentemente è stato sviluppato un nuovo modello dello sviluppo tumorale basato sulle cellule staminali tumorali. Con l’introduzione di tale ipotesi si è fatta avanti la necessità di individuare nuovi marcatori molecolari e sviluppare nuove terapie. Studi precedenti hanno dimostrato che l'aumento d’espressione dei recettori Eph e dei loro ligandi ephrin è in vari casi collegato con fenomeni di progressione tumorale ed angiogenesi. In questo lavoro, è stata valutata l'espressione dei ligandi ephrin-B1-B2 e dei recettori EphB1-B4 in linee cellulari di rabdomiosarcomi e tumori primari. I risultati ottenuti evidenziano deregolazione sia dei ligandi sia dei recettori nelle linee cellulari, mentre un generale aumento dell'espressione delle proteine analizzate è stato registrato nei tumori primari. E’ stata inoltre dimostrata anche una correlazione tra l'espressione di EphB2 ed EphB4 in entrambi i tipi tumorali. La generale deregolazione dell'espressione genica e le correlazioni registrate tra ligandi e recettori e tra EphB2 e EphB4 suggeriscono un ruolo di ephrin-B e EphB nello sviluppo dei RMS (Articolo III).
Stem cells are very rare and this represents a big problem for clinical application. The use of umbilical cord blood, that could be a good alternative source of stem cells, is limited because of the poor number of stem cell that is not sufficient for transplantation. Accordingly, it will be very important to develop an assay to expand ex-vivo stem cell population. At the same time, for stem cell application in tissue engineering (for example bone tissue engineering) it could be very important to prepare a scaffold. This is why we studied an assay for ex-vivo expansion of hematopoietic stem cells isolated from cord blood and we did a screening of biomaterials for bone tissue engineering. A previous work reported that interleukin (IL)-16 can induce CD34+ hematopoietic cells to proliferate and differentiate in-vitro into phenotypically and functionally mature DCs. In this study, the effects of IL-16 on the expansion of CD34+ cells from human cord blood were investigated. IL-16 added to a basal cocktail (BC) composed of stem cell factor (SCF), Flt-3 ligand (FL), thrombopoietin (TPO), IL-6 e IL-3,of cytokines significantly enhanced the expansion of CD34+ cells, CD34+CD38-, early stem cells progenitor cells and long-term-culture-initiating-cells (LTC-IC). Moreover, CD34+ cells expanded with IL-16 maintained the capacity to differentiate into the lymphoid-B and -NK lineage. The addition of IL-16 to BC increased the migratory capacity of expanded CD34+ cells compared to BC alone and decreased the percentage of CD34+CD4+ cells. Overall, this study suggests that IL-16 may have a new role in promoting the expansion of hematopoietic stem cells and may represent a new tool for the expansion of CD34+ cells for clinical applications (Paper I). Scaffolds of different composition have been analysed to develop a novel multiphase biomaterial able to promote osteogenic differentiation of rabbit mesenchymal stem cells (rMSC). Results demonstrated that the multi-phase PCL/TZ-HA system showed improved rMSCs adhesion and osteoblast differentiation, thus demonstrating great potential for bone regeneration. (Paper II). Recent advances in tumour progression introduce the concept of cancer stem cells. According to this hypothesis, it will be important to identify new tumour markers and to develop new therapeutic strategies. Previous works demonstrated that increased expression of Eph receptors and their ephrin ligands have been implicated in promoting angiogenesis and tumour progression in several malignancies. Here the expression of mRNA for ephrin-B and EphB receptors in rhabdomyosarcoma (RMS) cell lines and primary tumours were measured. A dysregulation of both ligands and receptors was found in all cell lines. A global up-regulation of ephrin-Bs and EphB receptors in RMS tumours was found. In embryonal tumours, a correlation between ligand and receptor was found. A correlation between EphB2 and EphB4 receptors was demonstrated in both tumour types. The dysregulation of ephrin-B and Eph-B in RMS and the correlations between ligand and receptors and between EphB2 and EphB4 suggest a possible role for ephrin-B and EphB in RMS development (Paper III).

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Diceglie, C. « STUDIO NON INVASIVO DEL RUOLO DI CELLULE MESENCHIMALI STAMINALI NELLA PROGRESSIONE DI MODELLI DI CARCINOMA MAMMARIO ». Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano, 2015. http://hdl.handle.net/2434/347375.

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ABSTRACT Introduction: Mesenchymal stem cells (MSCs) are defined as a heterogeneous population of stromal stem cells and can be isolated from many adult tissues like bone marrow or adipose tissue. Many studies have shown that MSCs play a key role in tumour progression. MSCs recruited in tumour sites can stimulate tumour cell progression and mobilization, especially in breast cancer. However it is still unclear the molecular mechanism used by MSCs to promote angiogenesis, metastasis and tumour progression. Recently, studies demonstrated that P2X7 purinergic receptor plays a key role in stimulating tumour cell mobilization and metastatization. In fact, they have proposed that TGF-β stimulation promotes ATP release from cancer cells that stimulates P2X7 receptor activation. This activation stimulates neoplastic cells migration and then promoting tumour metastatization. Moreover, tumour cells that over-express P2X7 receptor grow faster than other cells and in vivo generate larger tumours. In these animals, the use of oATP (a P2X7 inhibitor) reduces tumour dimensions. The aim of this study is to confirm MSCs role in tumour progression and to clarify the involvement of P2X7 receptor as a key mediator of MSC-mediated induction of tumor growth. Mat & met: We used in vitro and in vivo optical imaging to study the influence of MSCs in tumour progression. Murine (EMT-6 and MET-1 cell lines) and human (SUM159) mammary carcinoma cells were infected with a lentiviral construct expressing mCherry or Luciferase as a constitutive reporter gene. These cells were used for in vitro and in vivo studies. Tumour cells were cultured in the presence or absence of MSCs for 48h with or without an inhibitor: oATP (100 µM). In in vitro studies cell viability was monitored by Trypan blue exclusion test, and by reporter gene activity. To perform in vivo studies, tumor cells (EMT-6, MET-1 and SUM159) were injected into mammary fat pad of nude mice. mCherry or Luciferase activity was used to assess tumour growth over time by whole body optical imaging. MSC injection and the treatment with the inhibitors started after tumour establishment, and the longitudinal imaging was further performed twice a week. At the endpoint, tumors were explanted and tumour weight and volume were evaluated for each experimental group. Results: In vitro studies showed that MSC migration ability significantly increases after treatment with tumour conditioned culture medium. Moreover, tumor cells proliferation was increased by MSCs co-culture as demonstrated by cell count and by reporter photon emission observed by optical imaging and biochemical analysis in cell lysates. This effect was prevented by treatment with the inhibitor oATP. In vivo data confirmed in vitro observations, in fact, a significant increase of tumour dimension at the endpoint was detected in animals injected with MSCs. The evaluation of tumour growth by optical imaging of reporter activity over time, demonstrated that the presence of MSCs significantly stimulated the proliferation of mammary carcinoma cells whereas the treatment with oATP prevented this phenomenon. These results were validated by ex vivo analysis. In comparison to control group, tumour weight and volume were higher in the MSC treated group, while they were similar to controls for the inhibitor treated ones. The inhibitory effect of oATP underlines a key role of P2X7 receptor in tumor growth and a correlation between MSCs tumour stimulation and P2X7 activity. Conclusions: These data demonstrated the capability of stem cells to stimulate the rate of breast cancer growth. These preliminary studies pave the way for the understanding of the molecular mechanism of MSC-mediated induction of tumor cell proliferation, proposing the involvement of the purinergic receptor pathway. In the TME, mesenchymal cells release a large amount of TGF-β that could support tumour progression and metastatizzation by indirectly activating P2X7 receptors. In this scenario, the recruitment of endogenous MSCs to tumour sites acquires important implications. In fact, it could be useful to understand the rate of endogenous MSC migration to tumour sites to evaluate if an inhibition of MSC-tumor cross talk or MSC-mediated immunomodulation could help in increasing anti-neoplastic treatment efficacy.

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Alba, Anna. « Eventi precoci nel processo di interazione tra Cellule Staminali Mesenchimali e Biomateriali polimerici (PSS e PEI Multilayers) ». Doctoral thesis, Università di Catania, 2016. http://hdl.handle.net/10761/3732.

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Résumé :

Il mantenimento del fenotipo cellulare è di fondamentale importanza in qualsiasi applicazione di ingegneria tissutale. La possibilità di valutare in vitro le risposte cellulari a condizioni che mimano l'ambiente in vivo, può fornire una più completa conoscenza del comportamento dei biomateriali impiantati. La realizzazione di multistrati di polielettroliti (PEMs) su materiali impiantabili è un'ottima strategia per realizzare condizioni che possano promuovere o prevenire l'adesione cellulare, o ancora più importante dirigerne e mantenerne il fenotipo. La versatilità dei PEMs fornisce la straordinaria possibilità di mimare il complesso ambiente extracellulare in vitro; variando le caratteristiche chimiche, meccaniche e topografiche è possibile promuovere l'adesione, la proliferazione, il differenziamento, la migrazione e l'espressione genica di praticamente tutti i tipi di cellule. La grande varietà dei tessuti biologici e i fenotipi cellulari ad essi associati, impone che la scelta delle caratteristiche dei PEMs sia la più idonea possibile al tipo cellulare utilizzato per la rigenerazione di uno specifico tessuto. Lo strato terminale di un multilayer di polielettroliti è un fattore determinante nella biocompatibilità di un materiale e deve essere attentamente considerato sulla base delle interazioni cellulari desiderate per una particolare applicazione. Lo studio si basa sulle interazioni tra cellule staminali mesenchimali umane e PEMs terminanti rispettivamente con Polistirensolfonato (PSS) e Polietilenimmina (PEI). I PEMs PSS-ended sembrano avere le caratteristiche migliori per dirigere l'adesione ed il mantenimento del fenotipo delle hMSCs, mostrando una buona biocompatibilià. Il PEMs PEI-ended induce significative modificazioni morfologiche ed un abbassamento dell'attività metabolica cellulare; tuttavia la forza di adesione cellulare a questa superficie è superiore rispetto a quella che si riscontra negli altri campioni. Nello sviluppo di nuovi biomateriali per applicazioni in ingegneria tissutale, il PSS si comporta come un buon substrato di crescita per le cellule mesenchimali, a differenza del PEI che ne compromette alcune funzioni biologiche; tuttavia potrebbe essere interessante modulare alcuni parametri nella struttura del PEMs PEI-ended o funzionalizzarlo con opportuni fattori che ne riducano l'effetto negativo sulle hMSCs, al fine di poter sfruttare il forte ancoraggio cellulare indotto da questa superficie.

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Govoni, Marco <1977&gt. « Riparazione del danno ischemico ostruttivo del miocardio mediante cellule staminali mesenchimali sottoposte a stimolazione elettromeccanica in bioreattore ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2009. http://amsdottorato.unibo.it/1698/1/Govoni_Marco_tesi.pdf.

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Résumé :

Nell’ambito dell’ingegneria dei tessuti, la possibilità di rigenerazione del miocardio post-infartuale è un argomento “caldo”, che suscita grandi speranze ma solleva altrettanto grandi interrogativi - sostenuti dal sussistere di dubbi di base sulle scelte operative praticabili. Esiste tuttavia concordanza nel considerare fondamentale l’utilizzo di un “supporto” che possa mantenere nella sede peri-infartuale le cellule competenti. Infatti, la semplice iniezione di cellule staminali per via endovenosa o direttamente nell’area infartuata non si è dimostrata particolarmente efficace, soprattutto a causa della cospicua perdita cellulare che si verifica rapidamente dopo il trapianto. Ci si orienta quindi verso la strategia di seminare cellule in grado di transdifferenziare in senso muscolare cardiaco su un materiale biocompatibile in vitro e di impiantare successivamente il costrutto ottenuto in vivo dove ci si attende il riassorbimento del biomateriale e l’integrazione delle cellule. Tuttavia, mentre in altri settori della medicina - quali ortopedia e dermatologia - l’impiego di pseudotessuti ingegnerizzati ha già permesso di conseguire ottimi risultati nella rigenerazione di tessuti danneggiati, allo stato attuale, i progressi ottenuti nell’ambito della rigenerazione del miocardio infartuato appaiono ancora aneddotici e distanti dall’ottenere protocolli condivisi per l’impiego in clinica. Il lavoro presentato in questa ricerca, condotto grazie alla sinergia di competenze interdisciplinari negli ambiti chimico, biologico e dell’ingegneria biomedica meccanica ed elettronica, è uno studio di fattibilità di una metodica standardizzata in grado di indirizzare cellule staminali mesenchimali (MSCs) indifferenziate verso l’acquisizione in vitro di caratteri fenotipici confrontabili con quelli delle cellule muscolari cardiache attraverso il paradigma della coltura dinamica in bioreattore. Il prototipo di bioreattore impiegato, in quanto sviluppato originalmente nel corso di questa attività di ricerca, presenta rispetto ad altri strumenti descritti l’innovazione e il vantaggio di non richiedere l’utilizzo di un incubatore, in quanto esso stesso permette di coltivare cellule al suo interno in condizioni controllate di temperatura, pH e concentrazione di CO2. La sua flessibilità operativa consente di impostare e controllare da personal computer leggi di moto di qualsiasi forma anche con cicliche molto veloci. Infine, la presenza di estensimetri in grado di misurare finemente la variazione di tensione esercitata sulla matrice polimerica utilizzata, posta in trazione tra due afferraggi, permette di applicare nel tempo una forza di stiramento costante, ottenendo deformazioni controllate e risultati riproducibili in termini di modificazioni cellulari. Il superamento delle problematiche sorte durante la fase di messa a punto del sistema, che deve essere ritenuto parte integrante del lavoro di sviluppo condotto, ha permesso di studiare l’adattamento di MSCs allo stiramento ciclico, mostrando che questo effettivamente determina alcune differenze fenotipiche rispetto al controllo statico. Inoltre le cellule hanno acquistato una disposizione orientata lungo l’asse longitudinale delle fibre, dato questo particolarmente importante se si considera la disposizione ordinata delle cellule del miocardio, le quali costituiscono un vero e proprio sincizio, indispensabile per una diffusione sincrona dell’impulso elettrico di contrazione. La creazione di uno pseudotessuto cardiaco ottimale richiederà ovviamente ulteriore lavoro, ma la metodica qui presentata si propone al tempo stesso come uno strumento di studio e come una strategia operativa per un approccio innovativo e standardizzabile alla medicina rigenerativa del miocardio.

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Govoni, Marco <1977&gt. « Riparazione del danno ischemico ostruttivo del miocardio mediante cellule staminali mesenchimali sottoposte a stimolazione elettromeccanica in bioreattore ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2009. http://amsdottorato.unibo.it/1698/.

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Nell’ambito dell’ingegneria dei tessuti, la possibilità di rigenerazione del miocardio post-infartuale è un argomento “caldo”, che suscita grandi speranze ma solleva altrettanto grandi interrogativi - sostenuti dal sussistere di dubbi di base sulle scelte operative praticabili. Esiste tuttavia concordanza nel considerare fondamentale l’utilizzo di un “supporto” che possa mantenere nella sede peri-infartuale le cellule competenti. Infatti, la semplice iniezione di cellule staminali per via endovenosa o direttamente nell’area infartuata non si è dimostrata particolarmente efficace, soprattutto a causa della cospicua perdita cellulare che si verifica rapidamente dopo il trapianto. Ci si orienta quindi verso la strategia di seminare cellule in grado di transdifferenziare in senso muscolare cardiaco su un materiale biocompatibile in vitro e di impiantare successivamente il costrutto ottenuto in vivo dove ci si attende il riassorbimento del biomateriale e l’integrazione delle cellule. Tuttavia, mentre in altri settori della medicina - quali ortopedia e dermatologia - l’impiego di pseudotessuti ingegnerizzati ha già permesso di conseguire ottimi risultati nella rigenerazione di tessuti danneggiati, allo stato attuale, i progressi ottenuti nell’ambito della rigenerazione del miocardio infartuato appaiono ancora aneddotici e distanti dall’ottenere protocolli condivisi per l’impiego in clinica. Il lavoro presentato in questa ricerca, condotto grazie alla sinergia di competenze interdisciplinari negli ambiti chimico, biologico e dell’ingegneria biomedica meccanica ed elettronica, è uno studio di fattibilità di una metodica standardizzata in grado di indirizzare cellule staminali mesenchimali (MSCs) indifferenziate verso l’acquisizione in vitro di caratteri fenotipici confrontabili con quelli delle cellule muscolari cardiache attraverso il paradigma della coltura dinamica in bioreattore. Il prototipo di bioreattore impiegato, in quanto sviluppato originalmente nel corso di questa attività di ricerca, presenta rispetto ad altri strumenti descritti l’innovazione e il vantaggio di non richiedere l’utilizzo di un incubatore, in quanto esso stesso permette di coltivare cellule al suo interno in condizioni controllate di temperatura, pH e concentrazione di CO2. La sua flessibilità operativa consente di impostare e controllare da personal computer leggi di moto di qualsiasi forma anche con cicliche molto veloci. Infine, la presenza di estensimetri in grado di misurare finemente la variazione di tensione esercitata sulla matrice polimerica utilizzata, posta in trazione tra due afferraggi, permette di applicare nel tempo una forza di stiramento costante, ottenendo deformazioni controllate e risultati riproducibili in termini di modificazioni cellulari. Il superamento delle problematiche sorte durante la fase di messa a punto del sistema, che deve essere ritenuto parte integrante del lavoro di sviluppo condotto, ha permesso di studiare l’adattamento di MSCs allo stiramento ciclico, mostrando che questo effettivamente determina alcune differenze fenotipiche rispetto al controllo statico. Inoltre le cellule hanno acquistato una disposizione orientata lungo l’asse longitudinale delle fibre, dato questo particolarmente importante se si considera la disposizione ordinata delle cellule del miocardio, le quali costituiscono un vero e proprio sincizio, indispensabile per una diffusione sincrona dell’impulso elettrico di contrazione. La creazione di uno pseudotessuto cardiaco ottimale richiederà ovviamente ulteriore lavoro, ma la metodica qui presentata si propone al tempo stesso come uno strumento di studio e come una strategia operativa per un approccio innovativo e standardizzabile alla medicina rigenerativa del miocardio.

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Massa, Annamaria <1988&gt. « Il ruolo del microambiente extracellulare nella modulazione della staminalità e del differenziamento di cellule staminali mesenchimali (MSC) ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2016. http://amsdottorato.unibo.it/7400/1/Tesi_Annamaria_Massa.pdf.

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Résumé :

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) impiegate nelle strategie di medicina rigenerativa sono state isolate da vari tessuti, quali midollo osseo, tessuto adiposo e polpa dentale. Le MSC sono elementi peculiari che contribuiscono al processo di guarigione ossea, sia direttamente poichè precurcosi degli osteoblasti o indirettamente, producendo citochine, fattori di crescita e modulando la vascolarizzazione e l’infiammazione. Pertanto, l’infusione di MSC rappresenta un potenziale approccio terapeutico per favorire la guarigione ossea. Tuttavia, il successo delle strategie rigenerative può essere influenzato da un microambiente sfavorevole. Lo scopo di questo studio è stato studiare come le caratteristiche fisico-chimiche del microambiente extracellulare, in particolare la tensione di ossigeno e l’acidosi extracellulare, possono modulare la staminalità e il potenziale osteogenico delle MSC. Abbiamo esaminato se l’ipossia prolungata influenzava il differenziamento osteogencio delle cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (ASC). L’effetto della tensione di ossigeno è stato valutato sulla proliferazione cellulare, sugli antigeni di superficie, sull’espressione dei geni di staminalità e dell’osteogenesi, sulla deposizione di matrice minerale e sul rilascio dei fattori di crescita. Abbiamo dimostrato che l’ipossia aveva un duplice ruolo, promuoveva la proliferazione delle ASC in assenza di stimoli osteogenici, ma favoriva il differenziamento in presenza di fattori pro-osteogenici. Successivamente abbiamo valutato l’effetto di differenti livelli di pH extracellulare (6.5, 6.6, 7.1 e 7.4) sulla staminalità e il differenziamento osteogenico delle cellule staminali derivate dalla polpa dentale (DPSC). Abbiamo evidenziato che il microambiente acido promuoveva il fenotipo staminale delle DPSC. Inoltre, l’acidosi extracellulare riduceva significativamente la crescita cellulare favorendo lo stato quiescente G0 del ciclo cellulare. Infine, abbiamo dimostrato l’effetto inibitorio del pH acido sul potenziale osteogenico delle DPSC. Pertanto la modulazione delle variazioni della tensione di ossigeno e del pH extracellulare devono essere considerate quando le MSC rappresentano uno strumento terapeutico in campo ortopedico.
Mesenchymal stem cells (MSC) have been isolated from various tissues, including bone marrow, adipose tissue, and dental pulp for regenerative strategies in orthopaedics and dentistry. MSC are critical elements that may contribute to bone healing, either directly as osteoblast precursors or indirectly by producing cytokines and growth factors, and by modulating vascularization and inflammation. The infusion of MSC therefore represents a valuable therapeutic approach to enhance bone healing. However, the success of regenerative strategy may be hampered by an unfavourable microenvironment. The aim of this study was to investigate how physicochemical characteristics of extracellular microenvironment, including oxygen tension and extracellular acidity, can modulate the stemness and the osteogenic potential of MSC. We first examined whether a prolonged exposure to hypoxia affects the osteogenic differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells (ASC). The effect of oxygen tension was evaluated on cell proliferation, surface antigens, stemness gene and bone-related genes expression, alkaline phosphatase activity, mineral matrix deposition, and growth factor release. We demonstrated that hypoxia acts dually, promoting ASC proliferation and stemness in the absence of osteogenic stimuli, but also inducing their differentiation in a bone-like milieu. We subsequently investigated the effect of different levels of extracellular pH (6.5, 6.8, 7.1 and 7.4) on stemness and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells from dental pulp (DPSC). We were able to provide consistent evidence that an acidic microenvironment promotes the stemness state of DPSC. Moreover, extracellular acidosis significantly reduces cells growth, and push cells to reside in the quiescent G0 phase of the cell cycle. Finally, we demonstrated the inhibitory effect of acidic pH on the osteogenic potential of DPSC. Modulation of oxygen tension and extracellular pH variations must be considered when MSC are included as a therapeutic tool in bone-related applications.

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Massa, Annamaria <1988&gt. « Il ruolo del microambiente extracellulare nella modulazione della staminalità e del differenziamento di cellule staminali mesenchimali (MSC) ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2016. http://amsdottorato.unibo.it/7400/.

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Résumé :

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) impiegate nelle strategie di medicina rigenerativa sono state isolate da vari tessuti, quali midollo osseo, tessuto adiposo e polpa dentale. Le MSC sono elementi peculiari che contribuiscono al processo di guarigione ossea, sia direttamente poichè precurcosi degli osteoblasti o indirettamente, producendo citochine, fattori di crescita e modulando la vascolarizzazione e l’infiammazione. Pertanto, l’infusione di MSC rappresenta un potenziale approccio terapeutico per favorire la guarigione ossea. Tuttavia, il successo delle strategie rigenerative può essere influenzato da un microambiente sfavorevole. Lo scopo di questo studio è stato studiare come le caratteristiche fisico-chimiche del microambiente extracellulare, in particolare la tensione di ossigeno e l’acidosi extracellulare, possono modulare la staminalità e il potenziale osteogenico delle MSC. Abbiamo esaminato se l’ipossia prolungata influenzava il differenziamento osteogencio delle cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (ASC). L’effetto della tensione di ossigeno è stato valutato sulla proliferazione cellulare, sugli antigeni di superficie, sull’espressione dei geni di staminalità e dell’osteogenesi, sulla deposizione di matrice minerale e sul rilascio dei fattori di crescita. Abbiamo dimostrato che l’ipossia aveva un duplice ruolo, promuoveva la proliferazione delle ASC in assenza di stimoli osteogenici, ma favoriva il differenziamento in presenza di fattori pro-osteogenici. Successivamente abbiamo valutato l’effetto di differenti livelli di pH extracellulare (6.5, 6.6, 7.1 e 7.4) sulla staminalità e il differenziamento osteogenico delle cellule staminali derivate dalla polpa dentale (DPSC). Abbiamo evidenziato che il microambiente acido promuoveva il fenotipo staminale delle DPSC. Inoltre, l’acidosi extracellulare riduceva significativamente la crescita cellulare favorendo lo stato quiescente G0 del ciclo cellulare. Infine, abbiamo dimostrato l’effetto inibitorio del pH acido sul potenziale osteogenico delle DPSC. Pertanto la modulazione delle variazioni della tensione di ossigeno e del pH extracellulare devono essere considerate quando le MSC rappresentano uno strumento terapeutico in campo ortopedico.
Mesenchymal stem cells (MSC) have been isolated from various tissues, including bone marrow, adipose tissue, and dental pulp for regenerative strategies in orthopaedics and dentistry. MSC are critical elements that may contribute to bone healing, either directly as osteoblast precursors or indirectly by producing cytokines and growth factors, and by modulating vascularization and inflammation. The infusion of MSC therefore represents a valuable therapeutic approach to enhance bone healing. However, the success of regenerative strategy may be hampered by an unfavourable microenvironment. The aim of this study was to investigate how physicochemical characteristics of extracellular microenvironment, including oxygen tension and extracellular acidity, can modulate the stemness and the osteogenic potential of MSC. We first examined whether a prolonged exposure to hypoxia affects the osteogenic differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells (ASC). The effect of oxygen tension was evaluated on cell proliferation, surface antigens, stemness gene and bone-related genes expression, alkaline phosphatase activity, mineral matrix deposition, and growth factor release. We demonstrated that hypoxia acts dually, promoting ASC proliferation and stemness in the absence of osteogenic stimuli, but also inducing their differentiation in a bone-like milieu. We subsequently investigated the effect of different levels of extracellular pH (6.5, 6.8, 7.1 and 7.4) on stemness and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells from dental pulp (DPSC). We were able to provide consistent evidence that an acidic microenvironment promotes the stemness state of DPSC. Moreover, extracellular acidosis significantly reduces cells growth, and push cells to reside in the quiescent G0 phase of the cell cycle. Finally, we demonstrated the inhibitory effect of acidic pH on the osteogenic potential of DPSC. Modulation of oxygen tension and extracellular pH variations must be considered when MSC are included as a therapeutic tool in bone-related applications.

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Tibullo, Daniele. « Studio in vitro della differenziazione delle cellule mesenchimali staminali di midollo osseo in epatociti e valutazione funzionale ». Thesis, Università degli Studi di Catania, 2011. http://hdl.handle.net/10761/235.

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Résumé :

Il trapianto di fegato e' il trattamento di scelta per pazienti con patologia epatica cronica, cirrotica e/o neoplastica. Il limitato numero di donatori, nonche' il rigetto e l'uso prolungato di immunosoppressori, ne limitano l'applicazione clinica. Inoltre, la possibilita' di ottenere epatociti trapiantabili e' ostacolato dal basso potenziale replicativo delle cellule epatiche, dalla loro concomitante perdita di funzionalita' in coltura e dal ridotto numero di cellule vitali e funzionali che si ottengono dopo criopreservazione. Le cellule dello stroma midollare hanno la capacita' di differenziare in epatociti. In particolare, le cellule staminali mesenchimali (BM-MSCs) possiedono self-renewal e, coltivate in vitro e sotto opportuno condizionamento, possono differenziare in osteoblasti, adipociti, condrociti, miociti, rappresentando un potenziale trapiantologico. Scopo del nostro studio e' valutare le differenze in vitro delle hBM-MSCs in epatociti ed il loro stato funzionale.
Liver transplantation is the treatment of choice for patients with chronic liver disease, cirrhosis and / or cancer. The limited number of donors and rejection prolonged use of immunosuppressants, thus limiting their clinical application. In addition, the possibility of obtaining transplantable hepatocytes is hampered by the low replicative potential of liver cells, their concomitant loss of function in culture and the reduced number of viable cells and functional are obtained after cryopreservation. The bone marrow stromal cells have the ability to differentiate into hepatocytes. In particular, mesenchymal stem cells (BM-MSCs) possess self-renewal, and cultured in vitro and under appropriate conditions, can differentiate into osteoblasts, adipocytes, chondrocytes, myocytes, representing a potential transplant. The aim of our study was to evaluate the differences of the HBM-MSCs in vitro in hepatocytes and their functional status.

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Seria, Elisa Libera. « Rigenerazione epatica mediante l'impiego di cellule staminali mesenchimali in un modello murino di danno epatico tetracloruro-indotto ». Doctoral thesis, Università di Catania, 2012. http://hdl.handle.net/10761/1133.

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Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) have been investigated as marker of liver regeneration in an experimental model of acute liver failure (ALF). This model was created in Wistar rats through an intraperitoneal injection of carbon tetrachloride (CCl4). MSCs (3 million) were collected by long bones of 10 Wistar rats and then intravenously infused 24 hours after induction of ALF in 16 rats, Group A. In control Group B, 16 rats received a peritoneal injection of CCl4, and an intravenous infusion of normal saline. All rats were sacrificed at 2, 3, 4 and 7 days post-CCl4-injection. To assess the efficacy of the induction of the ALF, 4 rats Group (C) were sacrified 1 day after poisoning. Biochemical markers (BM) of liver function as platelets counts and pathology examination of the procured livers were staged on post-infusion-days 2, 3, 4 and 7. In Group A platelets count was higher than in the untreated control Group on post-CCl4-infusion day 2nd (p = 0.02) and 3rd (p=0.001). Also The trend of BM as transaminases was higher in the non-treated Group B, GOT (p=0.002), GPT (p<0.0001). Pathology examination showed greater grade of hepatocellular necrosis, and neutrophilic infiltration in Group B (p=0.02). MSCs infusion determined a less aggressive picture of hepatic damage.

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Castellini, Claudia <1973&gt. « Protocollo per l'impiego di cellule staminali mesenchimali (MSC) nella profilassi e terapia della GvHD acuta insorta in bambini affetti da tumore solido sottoposti a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2011. http://amsdottorato.unibo.it/3330/1/Castellini_Claudia_Tesi.pdf.

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Castellini, Claudia <1973&gt. « Protocollo per l'impiego di cellule staminali mesenchimali (MSC) nella profilassi e terapia della GvHD acuta insorta in bambini affetti da tumore solido sottoposti a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2011. http://amsdottorato.unibo.it/3330/.

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NICOLAI, MICHELE. « Effetti dell'acquisizione del fenotipo senescente sulle cellule staminali dell'epitelio pigmentato retinico ». Doctoral thesis, Università Politecnica delle Marche, 2019. http://hdl.handle.net/11566/263051.

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Résumé :

Gli approcci di medicina rigenerativa basati su cellule staminali mesenchimali (MSC) sono stati studiati per trattare diverse malattie associate all'invecchiamento, inclusa la degenerazione maculare legata all'età (DMLE). La perdita delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (EPR) si verifica all'inizio della DMLE e il loro trapianto ha il potenziale per rallentare la progressione della malattia. L'EPR umano contiene una sottopopolazione di cellule - cellule staminali EPR adulte (RPESC) - che sono in grado di auto-rinnovarsi e di differenziarsi in cellule RPE in vitro. Tuttavia, i cambiamenti di MSC correlati all'età comportano perdita di funzione e acquisizione di un fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP), che può contribuire al mantenimento di uno stato cronico di infiammazione di basso grado nei tessuti e negli organi. In uno studio precedente abbiamo isolato, caratterizzato e RPESC differenziati. In questa sperimentazione abbiamo indotto senescenza replicativa in RPESCs e testato la loro acquisizione del fenotipo della senescenza e della SASP così come la capacità di differenziazione di RPESC giovani e senescenti. Gli RPESC senescenti hanno mostrato una capacità di proliferazione significativamente ridotta, un'alta attività β-galattosidasi associata alla senescenza e l'acquisizione di SASP. I geni specifici per RPE erano sottoregolati e l'espressione della proteine p21 e p53 era sovraregolata. Questi risultati documentano gli effetti della senescenza e dell'acquisizione di SASP sulla capacità di differenziazione di RPESC e sottolineano la necessità di una maggiore comprensione del loro ruolo nella patogenesi della DMLE.
Regenerative medicine approaches based on mesenchymal stem cells (MSCs) are being investigated to treat several aging-associated diseases, including age-related macular degeneration (AMD). Loss of retinal pigment epithelium (RPE) cells occurs early in AMD, and their transplant has the potential to slow disease progression. The human RPE contains a subpopulation of cells - adult RPE stem cells (RPESCs) – that are capable of self-renewal and of differentiating into RPE cells in vitro. However, age-related MSC changes involve loss of function and acquisition of a senescence-associated secretory phenotype (SASP), which can contribute to the maintenance of a chronic state of low-grade inflammation in tissues and organs. In a previous study we isolated, characterized, and differentiated RPESCs. Here, we induced replicative senescence in RPESCs and tested their acquisition of the senescence phenotype and the SASP as well as the differentiation ability of young and senescent RPESCs. Senescent RPESCs showed a significantly reduced proliferation ability, high senescence-associated β-galactosidase activity, and SASP acquisition. RPE-specific genes were downregulated and p21 and p53 protein expression was upregulated. These findings document the effects of senescence and SASP acquisition on RPESC differentiation ability and highlight the need for a greater understanding of their role in AMD pathogenesis.

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ALTOMARE, Roberta. « ISOLAMENTO E CARATTERIZZAZIONE DI CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI DA TESSUTO ADIPOSO DI RATTO PER IL LORO DIFFERENZIAMENTO IN SENSO ENDOTELIALE ». Doctoral thesis, università degli studi di Palermo, 2015. http://hdl.handle.net/10447/107804.

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Erratico, S. A. « SVILUPPO DI UN MODELLO SPERIMENTALE PER LO STUDIO DEI FATTORI DEGENERATIVI CHE INDUCONO IL DIFFERENZIAMENTO ADIPOCITARIO DI CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI ». Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano, 2012. http://hdl.handle.net/2434/169910.

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Résumé :

In adult tissues, somatic stem cells represent a cell reservoir involved in physiological or pathological cell replacement within healthy or damaged tissue. Thanks to specific molecular or physical signals of the microenvironment, homeostasis process is guaranteed inside stem cell niches. Factors deriving from pathological events induce a shift in stem cell behaviour to cell differentiation, in order to reconstitute cell populations lost in the damaged tissue. In several myopathies, chronic inflammation is a part of pathological process that causes fibrotic infiltrations and adipose deposition within degenerating tissue, leading even to muscle substitution. Mechanisms underlying these events are not clear yet and represents a focus in etiopathogenetic studies on muscular research. The aim of this work was to develop an experimental model for mimicking in vitro the effects of a damaged muscle on a specific stem cell population; the methodological improvement is represented by the simultaneous culture of both the component in a microenvironment divided by a porous membrane. Parameters setting and standardization make the method reproducible and applicable to different culture conditions. First experimental session, performed on a population of human circulating myogenic progenitors expressing CD133 antigen, has shown how the presence of a murine muscle tissue section in culture can induce an higher cell proliferation and expression of an early marker of muscle differentiation, as Myf5. Nevertheless, because of their hematopoietic origin, these cells cannot complete their myogenic differentiation, that is usually achieved in a direct coculture with myotubes or myofibers. The same experimental design, applied for the culture of mesenchymal stem cells with myogenic potential, has shown how the biological factors, released by the murine muscle section, can induce an adipose differentiation in that stem cell population. Lipid drops in cell cytoplasm and expression of specific markers of adipose differentiation, such as perilipin A and FABP4, confirmed that the experimental model proposed can reproduce in vitro a culture condition similar to the one observed in degenerating muscle in several myopathies. This methodological approach represents a new model for in vitro study of adipose deposition in muscle, whose molecular mechanisms are not well characterized yet; using a whole tissue section in culture allows to reproduce in vitro a microenvironment similar to the once observed in vivo. For this reason the experimental model developed for this work can be seen as new perspective in the study of molecular process underlying adipose tissue formation in degenerating muscle.

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Bianconi, Eva <1983&gt. « Ricerca di nuove strategie differenziative : Analisi degli effetti di stimoli fisici e molecolari su cellule mesenchimali umane isolate da tessuto adiposo ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2014. http://amsdottorato.unibo.it/6513/1/Bianconi_Eva_tesi.pdf.

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Résumé :

Introduzione. Le cellule mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (hASC) rappresentano un importante strumento per la terapia cellulare, in quanto derivano da un tessuto adulto abbondante e facilmente reperibile. Con il dispositivo medico Lipogems l’isolamento di tali cellule è eseguito esclusivamente mediante sollecitazioni meccaniche. Il prodotto ottenuto è quindi minimamente manipolato e subito utilizzabile. Ad oggi, il condizionamento pro-differenziativo delle staminali è per lo più attuato mediante molecole di sintesi. Tuttavia, altri fattori possono modulare la fisiologia cellulare, come gli stimoli fisici e molecole naturali. Onde elettromagnetiche hanno indotto in modelli cellulari staminali l’espressione di alcuni marcatori di differenziamento e, in cellule adulte, una riprogrammazione, mentre estratti embrionali di Zebrafish sono risultati antiproliferativi sia in vitro che in vivo. Metodi. La ricerca di nuove strategie differenziative sia di natura fisica che molecolare, nel particolare onde acustiche ed estratti embrionali di Zebrafish, è stata condotta utilizzando come modello cellulare le hASC isolate con Lipogems. Onde acustiche sono state somministrate mediante l’utilizzo di due apparati di trasduzione, un generatore di onde meccaniche e il Cell Exciter . I trattamenti con gli estratti embrionali sono stati effettuati utilizzando diverse concentrazioni e diversi tempi sperimentali. Gli effetti sull’espressione dei marcatori di staminalità e differenziamento relativi ai trattamenti sono stati saggiati in RT-PCR quantitativa relativa e/o in qPCR. Per i trattamenti di tipo molecolare è stata valutata anche la proliferazione. Risultati e conclusioni. La meta-analisi dei dati delle colture di controllo mostra la stabilità d’espressione genica del modello. I trattamenti con i suoni inducono variazioni dell’espressione genica, suggerendo un ruolo regolatorio di tali stimoli, in particolare del processo di commitment cardiovascolare. Due degli estratti embrionali di Zebrafish testati inibiscono la proliferazione alle 72 ore dalla somministrazione. L’analisi d’espressione associata ai trattamenti antiproliferativi suggerisce che tale effetto abbia basi molecolari simili ai processi di differenziamento.
Background. Adipose derived mesenchymal stem cells (hASC) represent an interesting tool for cell therapy, due to their tissue derivation that is abundant and easily available. Using Lipogems, a medical device, stem cells isolation is performed only with mild mechanical forces, giving a minimally manipulated and ready to use fat product. To date, the differentiation processes in vitro are mostly obtained using chemical compounds. Anyway, other factors are shown to be modulators in cell physiology, as physical stimuli and some natural molecules. For instance, electromagnetic waves induced the expression of differentiation markers in stem cell models and adult cells were reprogrammed after treatment, while Zebrafish embryo derived extracts were shown to be antiproliferative both in vitro and in vivo. Methods. The search for new differentiation strategies was focused both on physical waves and Zebrafish extracts, using hASC isolated with Lipogems as cell model. Acoustic waves were gave using two types of transducer, the mechanical wave generator and the Cell Exciter. Zebrafish extracts treatments were performed using different doses and experimental times. Gene expression analysis of stemness and differentiation genes was conducted in both the experimental approaches using quantitative relative RT-PCR and/or qPCR. Proliferation assay was also performed for treatments with natural compounds. Results and conclusions. Control cell culture data meta-analysis revealed that hASC has a stable gene expression in basal conditions. Acoustic waves induced gene expression changes in hASC, in particular in cardiovascular commitment genes, suggesting a regulatory role in differentiation processes. Two of the Zebrafish extracts are shown to inhibit hASC proliferation, with statistical significance after 72 hours from the treatment. Gene espression analysis suggested that this effect could share the same molecular mechanism with differentiation events.

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Bianconi, Eva <1983&gt. « Ricerca di nuove strategie differenziative : Analisi degli effetti di stimoli fisici e molecolari su cellule mesenchimali umane isolate da tessuto adiposo ». Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2014. http://amsdottorato.unibo.it/6513/.

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Résumé :

Introduzione. Le cellule mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (hASC) rappresentano un importante strumento per la terapia cellulare, in quanto derivano da un tessuto adulto abbondante e facilmente reperibile. Con il dispositivo medico Lipogems l’isolamento di tali cellule è eseguito esclusivamente mediante sollecitazioni meccaniche. Il prodotto ottenuto è quindi minimamente manipolato e subito utilizzabile. Ad oggi, il condizionamento pro-differenziativo delle staminali è per lo più attuato mediante molecole di sintesi. Tuttavia, altri fattori possono modulare la fisiologia cellulare, come gli stimoli fisici e molecole naturali. Onde elettromagnetiche hanno indotto in modelli cellulari staminali l’espressione di alcuni marcatori di differenziamento e, in cellule adulte, una riprogrammazione, mentre estratti embrionali di Zebrafish sono risultati antiproliferativi sia in vitro che in vivo. Metodi. La ricerca di nuove strategie differenziative sia di natura fisica che molecolare, nel particolare onde acustiche ed estratti embrionali di Zebrafish, è stata condotta utilizzando come modello cellulare le hASC isolate con Lipogems. Onde acustiche sono state somministrate mediante l’utilizzo di due apparati di trasduzione, un generatore di onde meccaniche e il Cell Exciter . I trattamenti con gli estratti embrionali sono stati effettuati utilizzando diverse concentrazioni e diversi tempi sperimentali. Gli effetti sull’espressione dei marcatori di staminalità e differenziamento relativi ai trattamenti sono stati saggiati in RT-PCR quantitativa relativa e/o in qPCR. Per i trattamenti di tipo molecolare è stata valutata anche la proliferazione. Risultati e conclusioni. La meta-analisi dei dati delle colture di controllo mostra la stabilità d’espressione genica del modello. I trattamenti con i suoni inducono variazioni dell’espressione genica, suggerendo un ruolo regolatorio di tali stimoli, in particolare del processo di commitment cardiovascolare. Due degli estratti embrionali di Zebrafish testati inibiscono la proliferazione alle 72 ore dalla somministrazione. L’analisi d’espressione associata ai trattamenti antiproliferativi suggerisce che tale effetto abbia basi molecolari simili ai processi di differenziamento.
Background. Adipose derived mesenchymal stem cells (hASC) represent an interesting tool for cell therapy, due to their tissue derivation that is abundant and easily available. Using Lipogems, a medical device, stem cells isolation is performed only with mild mechanical forces, giving a minimally manipulated and ready to use fat product. To date, the differentiation processes in vitro are mostly obtained using chemical compounds. Anyway, other factors are shown to be modulators in cell physiology, as physical stimuli and some natural molecules. For instance, electromagnetic waves induced the expression of differentiation markers in stem cell models and adult cells were reprogrammed after treatment, while Zebrafish embryo derived extracts were shown to be antiproliferative both in vitro and in vivo. Methods. The search for new differentiation strategies was focused both on physical waves and Zebrafish extracts, using hASC isolated with Lipogems as cell model. Acoustic waves were gave using two types of transducer, the mechanical wave generator and the Cell Exciter. Zebrafish extracts treatments were performed using different doses and experimental times. Gene expression analysis of stemness and differentiation genes was conducted in both the experimental approaches using quantitative relative RT-PCR and/or qPCR. Proliferation assay was also performed for treatments with natural compounds. Results and conclusions. Control cell culture data meta-analysis revealed that hASC has a stable gene expression in basal conditions. Acoustic waves induced gene expression changes in hASC, in particular in cardiovascular commitment genes, suggesting a regulatory role in differentiation processes. Two of the Zebrafish extracts are shown to inhibit hASC proliferation, with statistical significance after 72 hours from the treatment. Gene espression analysis suggested that this effect could share the same molecular mechanism with differentiation events.

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Martinelli, Giulia. « Stampa 3D di un idrogelo a base di PEG-peptide contenente cellule mesenchimali staminali per la realizzazione di costrutti tissulari osteo-cartilaginei ». Bachelor's thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2016. http://amslaurea.unibo.it/12309/.

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Résumé :

La versatilità della struttura chimica del glicole polietilenico (PEG) e la sua eccellente biocompatibilità, hanno reso questo biomateriale un’ottima scelta per svariate applicazioni biomediche. Questa tesi compilativa si propone di descrivere questo interessante biomateriale nel campo dell’ingegneria dei tessuti, affrontando nel dettaglio un particolare caso di studio che vede il PEG impiegato come scaffold per la realizzazione di tessuti biologici (osseo e cartilagineo). Dopo avere introdotto e illustrato i principi dell’ingegneria dei tessuti e dei biomateriali più utilizzati in questo ambito, si descriveranno le principali tecniche di manipolazione per la fabbricazione dello scaffold costituito da PEG e alcuni impieghi del PEG come supporto per la drug delivery e la detossinazione. Infine verrà trattato il caso di studio: biostampa 3D di uno scaffold composito PEG-peptide contenente cellule mesenchimali staminali.

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TUTINO, Roberta. « Utilizzo di cellule staminali autologhe mesenchimali di origine adiposa e concentrato piastrinico per uso non trasfusionale nel trattamento delle fistole perianali complesse ». Doctoral thesis, Università degli Studi di Palermo, 2021. http://hdl.handle.net/10447/484938.

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Résumé :

Questo progetto di ricerca ha voluto valutare l’efficacia del trattamento combinato con cellule staminali autologhe di origine mesenchimale e concentrato piastrinico per uso non trasfusionale, come innovativo trattamento sphincter-saving, nella cura delle fistole perianali complesse. Il reclutamento iniziale eseguito presso l’ambulatorio di colo-proctologia dell’UOC di Chirurgia generale e d’Urgenza del Policlinico “P. Giaccone” ha compreso 22 pazienti con fistole perianali complesse. I nostri criteri di esclusione sono stati: fistole non complicate curabili con semplice fistulotomia, fistole retto-vaginali, gravidanza, morbo di Crohn e rettocolite ulcerosa, HCV, HBV, HIV, neoplasie, malattie autoimmuni, TBC, malattie psichiatriche, in trattamento con agenti immunosoppressori o citotossici. Questi pazienti sono stati sottoposti, dopo studio morfo-funzionale con RMN con mdc e manometria, a trattamenti di bonifica preliminare che sono consistiti nel posizionamento di un loose seton in 13 pazienti e di una bonifica perianale per la presenza di raccolte ascessuali in 5 pazienti. Durante i controlli intermedi 12 pazienti sono stati esclusi dallo studio, nello specifico in 7 pazienti si è avuta una superficializzazione del tramite, motivo per cui gli stessi sono stati sottoposti a semplice fistulotomia, 2 pazienti sono stati esclusi a causa delle comorbidità, 3 pazienti hanno rifiutato il trattamento proposto. Sono quindi stati trattati con stromal vascular fraction, contenente cellule staminali autologhe di origine mesenchimale, ottenuto mediante lipoaspirazione e centrifugazione, unitamente al concentrato piastrinico per uso non trasfusionale autologo pre-depositato, 9 pazienti, di cui 4 maschi e 5 femmine. L’età media dei pazienti è stata di 41 anni. Le fistole trattate erano tutte transfinteriche, di cui recidive in 5 pazienti che presentavano un numero medio di interventi chirurgici precedenti il nostro trattamento di 5 interventi ed anteriori in 4 pazienti. Durante il follow-up in una paziente data la persistenza di secrezioni è stato posizionato un setone di drenaggio ed eseguito un nuovo trattamento con inoculo di un’ulteriore quota di CPUNT dopo periodo di bonifica, cui è succeduta una nuova recidiva; la paziente ha poi avuto una diagnosi di verosimile M. di Crohn; si segnala che lo studio e l’esclusione di presenza di IBD era stato eseguito nel preoperatorio di tutti i pazienti trattati. Un altro paziente ha mostrato una riduzione delle secrezioni pur con una loro persistenza per cui è stato sottoposto ad un nuovo trattamento con CPUNT senza beneficio. E’ stata eseguita una valutazione della qualità di vita con l’utilizzo dello score SF-36 (versione italiana) ed una dei risultati funzionali con il Wexner score e Vaizey score. Nei pazienti guariti si è avuto un miglioramento nella valutazione generale della salute fisica (PCS) in 5 pazienti, in un paziente il valore è rimasto invariato ed un paziente ha mostrato un peggioramento. Il miglioramento del PCS tra il pre ed il post-operatorio è stato debolmente significativo (P=0.0502). Per quanto riguarda la valutazione generale dello stato di salute mentale (MCS), nei pazienti guariti si è avuto un miglioramento in 5 pazienti ed un peggioramento in due pazienti. La variazione nel MCS tra il pre ed il post-operatorio non è stata statisticamente significativa (P=0.1665). Non vi sono state differenze statisticamente significative nel Wexner score (p=0.3125) e nel Vazey score(p=0.4375). Al follow-up ad un anno il 77.7% dei pazienti è guarito. Il trattamento proposto ha mostrato alti tassi di guarigione, pressocchè nulle complicanze e non ha influito negativamente sulla continenza dei pazienti trattati.

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Achilli, A. « Processi di differenziazione di cellule staminali mesenchimali da midollo osseo e da tessuto adiposo e valutazione del loro comportamento su scaffold polimerici ». Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano, 2007. http://hdl.handle.net/2434/63846.

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Résumé :

"Human Bone Marrow and Adipose Tissue Mesenchimal Stem cells: isolation, differentiation and growth on polimeric scaffold" Tissue engineering has demonstrated his positive role in the repair of damaged tissues. This study investigated the properties of adult mesenchimal stem cells (MSCs) obteined from adipose tissue and bone marrow. The plastic-adherent (PA) and immunomagnetic by anti-nerve growth factor receptor antibodies (anti-NFGR) isolation tecniques were compared. In vitro MSCs diffusion and differentiation was studied for multiple lineage (chondrogenic, adipogenic, fibroblastic and osteoblastic). Adesive and proliferation cells properties were studied on commercial homologous idrossilapatite and on biomaterials polyurethane polimeric scaffold constructed and developed just for this research. Results suggested that adipose tissue may be a source of pluripotent stem cells and that NGFR+ cells are a population highly primitive and homogeneous. The polyurethane scaffolds aren' t citotossic and permit the diffusion and proliferation of MSCs

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ADAMO, DAVIDE. « Cellule staminali dell’epitelio respiratorio : proprietà rigenerative, potenziale differenziativo e loro applicazione in ingegneria dei tessuti per la ricostruzione delle vie aeree umane ». Doctoral thesis, Università degli studi di Modena e Reggio Emilia, 2021. http://hdl.handle.net/11380/1256002.

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Résumé :

Le malattie respiratorie colpiscono milioni di persone in tutto il mondo, indipendentemente dalla fascia d'età o dallo status socioeconomico, emergendo come una delle principali cause di disabilità e morte. Molte di esse possono alterare la struttura e la funzione di diversi tratti respiratori, influenzando in modo sostanziale la vita dei pazienti. Purtroppo, il numero di persone affette da questi disturbi è drammaticamente in aumento a causa della pandemia da COVID-19 in corso. In caso di ampie alterazioni strutturali, i trattamenti medici disponibili e le strategie chirurgiche standard sono inefficaci o totalmente inapplicabili. Nonostante gli approcci chirurgici e le strategie di “tissue-engineering” (TE) proposti per affrontare questa urgente necessità medica, ad oggi nessuna strategia è diventata una procedura clinica ben consolidata e applicata di routine. Una delle maggiori difficoltà riscontrate in questi approcci clinici è la rigenerazione di un epitelio stabile sul costrutto trapiantato. Questa caratteristica è indispensabile per preservare la funzionalità respiratoria, evitare infezioni, formazione di tessuto di granulazione e re-stenosi. La fonte cellulare più appropriata per la rigenerazione dell’epitelio respiratorio in approcci di TE sarebbero le cellule epiteliali adulte del tessuto stesso. Tuttavia, la loro espansione in-vitro è resa difficile dal fatto è stato osservato siano capaci di dividersi efficientemente solo per pochissimi passaggi, oltre i quali perdono il loro potenziale di differenziazione e la capacità di formare una barriera funzionale. Pertanto si pensa che tali cellule siano inadatte e inaffidabili per approcci di TE. In questo studio abbiamo dimostrato la sicurezza e l’efficacia di un sistema di coltura, clinicamente validato per l’espansione di diversi tessuti epiteliali, nel mantenere il potenziale di proliferazione e differenziazione a lungo termine delle cellule epiteliali delle vie aeree. Inoltre, abbiamo stabilito dei controlli di qualità riproducibili da adottare nei diversi stadi di un approccio di TE. Tali controlli di qualità comprendono/verificano 1) le proprietà rigenerative delle cellule estratte dalla biopsia, 2) l'espressione di alcuni marcatori critici che identificano l'identità cellulare, l'integrità tessutale e il differenziamento epiteliale precoce delle colture. Questi marcatori devono essere verificati sia durante l'espansione cellulare in-vitro, sia durante il processo di TE. 3) Di cruciale importanza, abbiamo identificato le cellule staminali dell'epitelio delle vie aeree. Queste cellule sono in grado di auto-rinnovarsi, sopportando anche condizioni di differenziazione estreme per rigenerare il tessuto, mantenendo la sua eterogeneità fisiologica. Abbiamo ipotizzato l'uso di alcuni fattori di trascrizione, come possibili marcatori molecolari da adottare, in alternativa all'analisi clonale, per la valutazione della percentuale di cellule staminali all'interno di una coltura delle vie aeree. Inoltre, le molte analisi condotte a livello di singola cellula ci ha permesso di comprendere i meccanismi alla base del processo di specializzazione cellulare. Questo ci ha portato a proporre un modello che descrive come il rinnovamento epiteliale delle vie aeree e il processo di differenziazione potrebbero avvenire. Infine, grazie alle conoscenze acquisite durante la caratterizzazione delle colture in-vitro e alla coerenza dei risultati ottenuti da molti donatori umani, abbiamo deciso di avviare uno studio pilota che prevede la ricostruzione di uno pseudo-turbinato per il trattamento dei pazienti affetti da sindrome del naso vuoto. In questa tesi, presentiamo anche la nostra strategia di TE e i dati ottenuti dalle fasi iniziali su cui si basa questo approccio.
Respiratory diseases affect millions of people globally, regardless of age, group or socioeconomic status, emerging as one of the major causes of disability and death overall. Many diseases can alter the structure and function of the different tracts of the respiratory system, substantially affecting the patients' life. Even worst, the number of people affected by these disorders is dramatically increasing due to the ongoing COVID-19 pandemic. In the case of wide structural alterations, the available medical treatments and the standard surgical strategies are ineffective or totally inapplicable. Despite the surgical based approaches and the tissue-engineering (TE) strategies tested to face this urgent medical need, the positive results obtained have been very few and, to date, no strategy has become a well-established and routinely-applied clinical procedure. One of the major difficulties encountered in these clinical approaches is the regeneration of a stable/self-renewing epithelium onto the transplanted graft. This feature is imperative to preserve the respiratory function, avoid infections, granulation tissue formation and re-stenosis. In TE strategies, the adult airway epithelial cells would be the most appropriate cellular source for restoring the airway epithelium. However, many difficulties have been encountered in the in-vitro expansion of these cells. Indeed, they were described as effectively dividing for a very limited number of passages, beyond which they lose their differentiative potential and the ability to form a functional barrier. Therefore, it is reported that autologous airway epithelial cells do not meet the clinical regeneration needs and are unsuitable and unreliable cell sources for TE approaches. In the present study, we proved the ability of a culture system, largely used for the clinical expansion of different epithelial tissues, to safely and effectively maintain the long-term proliferative and differentiation potential of airway epithelial cells. Moreover, we established reproducible quality controls to be adopted from the biopsy collection up to the first steps of the generation of a TE construct. These quality controls include/verify 1) the tissue-regenerative properties of the cells extracted from the biopsy, 2) the expression of some critical markers identifying the cellular identity, the tissue integrity and the early epithelial differentiation of the cultures. These markers have to be verified during both the in-vitro cell expansion and during the TE process. 3) Crucial, we assessed the heterogeneity of the basal cells, identifying the stem cells of the airway epithelium. These cells can self-renew, withstanding even extreme differentiation conditions to regenerate the tissue, maintaining its physiological heterogeneity. Here, we hypothesized the use of some transcription factors as possible molecular markers to be adopted, alternatively to the clonal analysis, to evaluate the percentage of stem cells within an airway culture. Moreover, the multiple analyses conducted at the single-cell level allowed us to understand the mechanisms that underlie the cellular differentiation/specialization process. Therefore, here we propose a model showing how the airway epithelial renewal and differentiation process could occur. Finally, thanks to the knowledge acquired during the in-vitro cultures characterization and to the consistency of the results obtained from many human donors, we decided to start a pilot study envisaging the reconstruction of a pseudo-turbinate for the treatment of Empty Nose Syndrome’s patients. In this manuscript, we present our TE strategy and the data obtained by the initials steps on which this approach is based.

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Battan, Manuele. « Preparazione e caratterizzazione di micelle costituite da un pro-farmaco di Paclitaxel e caricate con un agente fotosensibile per il trattamento chemio- e foto-terapico dei tumori ». Master's thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2019. http://amslaurea.unibo.it/19227/.

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Résumé :

Il Paclitaxel (PTX) è un potente agente chemioterapico approvato per il trattamento di numerosi tumori solidi. Tuttavia, la scarsa solubilità in acqua e l’elevata tossicità causano gravi effetti collaterali che pregiudicano severamente la qualità di vita dei pazienti, già compromessa dalla patologia. Il presente lavoro di tesi ha riguardato la preparazione mediante nano-precipitazione di micelle di un pro-farmaco del PTX (PTX2S), caricate con feoforbide a (PheoA), una molecola fotosensibile che illuminata ad una specifica lunghezza d’onda genera specie reattive all’ossigeno (ROS) e ossigeno di singoletto (1O2) capaci di uccidere le cellule tumorali. Le nanomicelle sono state caratterizzate in termini di stabilità in condizioni fisiologiche, capacità di loading e di rilascio del farmaco e sviluppo di ROS a seguito di irraggiamento con luce bianca. Inoltre, test preliminari in vitro eseguiti su cellule staminali mesenchimali umane (MSC) hanno dimostrato che le nanomicelle sono efficacemente internalizzate dalle cellule senza comprometterne la vitalità e la morfologia. Tali dati preliminari dimostrano che le MSC possono essere quindi utilizzate come vettori selettivi delle nanomicelle qui descritte.

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Thèses sur le sujet « Cellule staminali mesenchimali umane »

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