Thèses sur le sujet « CELLULE STAMINALE »

Negli ultimi anni, l’editing genetico nelle cellule staminali/progenitrici ematopoietiche umane (HSPC) per il trattamento di malattie genetiche del sangue è migliorato drasticamente trasformando inserzioni genetiche casuali in precise e mirate modificazioni del genoma. La modifica mirata dei geni mutati ereditati consente la correzione in situ e la ricostituzione funzionale con il mantenimento del controllo endogeno dell'espressione. Recentemente abbiamo dimostrato che sia le rotture del DNA a doppio filamento indotte dall’editing che il genoma stesso dell’Adeno-Associated Virus 6 (AAV) innescano una risposta dipendente da p53 nell'HSPC che risulta in un ritardo della proliferazione con conseguente diminuzione della ricostituzione ematopoietica dopo il trapianto delle cellule editate in animali immuno-compromessi. Per cui, abbiamo quindi dimostrato come la soppressione di questa risposta mediante l’espressione transitoria della forma negativa dominante di p53 preservi la ricostituzione del lineage ematopoietico. Tuttavia, la biologia sottostante è rimasta sconosciuta, così come l'impatto dell'editing genetico sulle dinamiche clonali dell'HSPC modificate con riparo diretto per omologia (Homology Directed Repair, HDR) al momento del trapianto. Inoltre, lo stato quiescente delle HSC primitive costituisce un limite per l’editing genetico mediato da HDR, riducendo le sue possibili applicazioni cliniche. In questo lavoro, abbiamo prima superato tale limite esprimendo transitoriamente la proteina dell'adenovirus 5 E4orf6/7, che regola il principale controllore del ciclo cellulare, E2F, insieme alla nucleasi. Mediante un'analisi dell'espressione genica globale e mirata, abbiamo dimostrato come E4orf6/7 spinga le cellule in fase S/G2 con concomitante sovra-regolazione di tutti i principali componenti del macchinario HDR, aumentando così l'efficienza dell'inserimento del transgene in cellule precedentemente quiescenti. Nel contesto dello xenotrapianto, l'espressione combinata di E4orf6/7 e l'inibizione di p53 hanno migliorato l'efficienza del HDR (>50%) all'interno dell'innesto umano totale, superando i livelli riportati fino ad ora in letteratura. Tale risultato è stato riprodotto in diversi donatori da diverse fonti di HSPC e sono stati modificati più loci genomici, dimostrando la maggior versatilità di questa piattaforma se paragonata ad altre strategie di editing. In parallelo, abbiamo ideato una nuova tecnologia (BAR-seq) che consente il monitoraggio clonale di singole HSC modificate con HDR. Questo approccio prevede l’introduzione di un codice a barre ereditabile univoco (BAR) nel templato AAV6 necessario al HDR. Il sequenziamento ad alta copertura di tali sequenze negli xenotrapianti ha mostrato come l’editing genetico risulti in un attecchimento di pochi cloni dominanti. Mentre l'inibizione transitoria di p53 durante l’editing ha consentito un aumento sostanziale della composizione clonale dell'innesto senza alterare la capacità ripopolante delle HSC. Inoltre, questi dati suggeriscono come la risposta mediata da p53 sia responsabile di un'ematopoiesi oligoclonale. È importante sottolineare che il BAR-seq ha fornito la prima prova diretta che le HSC umane modificate con HDR mantengono un potenziale multilineage e subiscono più cicli di divisioni simmetriche e asimmetriche nei trapianti primari e secondari. In conclusione, auspichiamo che i miglioramenti messi a punto nel nostro protocollo di editing possano ampliare le possibili applicazioni cliniche dell’editing genetico.
The scope of genome engineering in hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) has broadened from random to precise genome insertions for treating genetic diseases of the blood lineages. Targeted editing of inherited mutant genes allows in situ correction and functional reconstitution with preserved expression control. We recently showed that both the induced double-strand DNA breaks and the AAV6 genome trigger a p53-dependent DNA damage response in HSPC delaying proliferation and decreasing hematopoietic reconstitution after xenotransplantation. Suppression of this response by transient expression of a dominant negative p53 released cell-cycle block and rescued hematopoietic reconstitution. Yet, the underlying biology remained unknown as well as the impact of gene editing on clonal dynamics of HDR-edited HSPC upon transplantation. Moreover, it has long been contended that the quiescence of primitive HSC constrains HDR-mediated gene editing, thus limiting its perspective clinical applications in several diseases. Here, we first overcame such constraints by transiently expressing the adenovirus 5 protein E4orf6/7, which operates the major cell cycle controller E2F, together with the nuclease. By global and targeted gene expression analysis we showed engagement of targeted cells in S/G2 phases with concomitant upregulation of all major components of the HDR machinery, thus increasing the efficiency of targeted transgene insertion. Combined E4orf6/7 expression and p53 inhibition enhanced >50% HDR efficiency within human graft surpassing the levels reported until now in the literature. Such outcome was reproducible across several HSPC donors and sources, genomic loci and conceivably portable to most types of editing platforms. In parallel, we devised a novel technology (BAR-seq) which enables clonal tracking of individual HDR-edited HSC by introducing a unique heritable barcode in the AAV6 template. Deep sequencing of integrated BARs in human hematochimeric mice showed that only few (5-10) dominant clones of edited HSC robustly contributed to the hematopoietic graft long-term after transplant. Transient p53 inhibition during editing enabled substantial increase in polyclonal graft composition without altering individual HSC output, thus explaining the improved engraftment and highlighting the p53-mediated response as culprit of an otherwise oligoclonal hematopoiesis. Importantly, BAR-seq provided the first direct evidence that human HDR-edited HSC maintain multilineage potential and undergo multiple rounds of symmetric and asymmetric divisions in primary and secondary xenogeneic hosts. Altogether, we expect that the substantial gains obtained in HDR efficiency and polyclonal repopulation by our improved editing protocol should broaden applicability of HSC gene editing and pave its way to clinical translation.

Recent progress in stem cell research makes it possible to use them in cardiac therapy. Our aim was to characterize the pacemaker current (If) and HCN channels distribution in murine embryonic stem cells and cardiac adult mesoangioblasts following differentiation towards a pacemaker-like phenotype. Mouse embryonic stem cells (mESCs) are pluripotent stem cells and they were differentiated through formation of embryoid bodies (EBs). A fraction of these cells exhibited action potentials characterized by a slow diastolic depolarization typical of pacemaker myocytes and expressed the If current. Immunofluorescence analysis revealed that both the HCN1 and HCN4 isoforms of the pacemaker channel are expressed. Rhythmic cells responded to β-adrenergic and muscarinic agonists: isoproterenol accelerated and acetylcholine slowed spontaneous rate. Accordingly, β1- and β2-adrenergic, and M2-muscarinic receptors were detected by immunofluorescence. Cardiac mesoangioblasts are vessel-associated clonogenic, self-renewing progenitor cells identified in the post-natal murine heart, which can be induced to differentiate into cardiac myocytes. A subpopulation of cardiac mesoangioblasts induced to differentiate in vitro into cardiomyocytes acquires a phenotype with specific pacemaker cells properties, such as the presence of If current and the expression of the HCN4 isoform of pacemaker channels. As in native cardiac pacemaker cells, f-channel modulation by autonomic transmitters, in these cells, contributes to control of spontaneous rate. These results show that both of these cell types express proteins which underlie generation and modulation of heart rhythm, and can represent a potential substrate for a biological pacemaker.

Over the past few years, in veterinary medicine there has been an increased interest in understanding the biology of mesenchymal stem cells (MSCs). This interest comes from their potential clinical use especially in wound repair, tissue engineering and application in therapeutics fields, including regenerative surgery. MSCs can be isolated directly from bone marrow aspirates, adipose tissue, umbilical cord and various foetal tissues. In this study, mesenchymal stem cells were isolated from equine bone marrow, adipose tissue, cord blood, Wharton’s Jelly and, for the first time, amniotic fluid. All these cell lines underwent in vitro differentiation in chondrocytes, osteocytes and adipocytes. After molecular characterization, cells resulted positive for mesenchymal markers such as CD90, CD105, CD44 and negative for CD45, CD14, CD34 and CD73. Adipose tissue and bone marrow mesenchymal stem cells were successfully applied in the treatment of tendinitis in race horses. Furthermore, for the first time in the horse, skin wounds of septicemic foal, were treated applying amniotic stem cells. Finally, results never reported have been obtained in the present study, isolating mesenchymal stem cells from domestic cat foetal fluid and membranes. All cell lines underwent in vitro differentiation and expressed mesenchymal molecular markers.

Over the past few years, in veterinary medicine there has been an increased interest in understanding the biology of mesenchymal stem cells (MSCs). This interest comes from their potential clinical use especially in wound repair, tissue engineering and application in therapeutics fields, including regenerative surgery. MSCs can be isolated directly from bone marrow aspirates, adipose tissue, umbilical cord and various foetal tissues. In this study, mesenchymal stem cells were isolated from equine bone marrow, adipose tissue, cord blood, Wharton’s Jelly and, for the first time, amniotic fluid. All these cell lines underwent in vitro differentiation in chondrocytes, osteocytes and adipocytes. After molecular characterization, cells resulted positive for mesenchymal markers such as CD90, CD105, CD44 and negative for CD45, CD14, CD34 and CD73. Adipose tissue and bone marrow mesenchymal stem cells were successfully applied in the treatment of tendinitis in race horses. Furthermore, for the first time in the horse, skin wounds of septicemic foal, were treated applying amniotic stem cells. Finally, results never reported have been obtained in the present study, isolating mesenchymal stem cells from domestic cat foetal fluid and membranes. All cell lines underwent in vitro differentiation and expressed mesenchymal molecular markers.

One of the most important challenges in modern medicine is the identification of cell therapy protocols, enabling identification of personalized treatment strategies. WIthin this context, adult stem cells (ASC) have a large applicative potential. Contrary to ESCs (embryonic stem cells) and IPSCs (induced pluripotent stem cells), ASCs can be easily extracted from different tissues (bone marrow, skin, adipose tissue, muscle) without raising ethical issues . Moreover, they can be used for autologous transplantation, eliminating the complications associated with autoimmune reactions. Mesenchymal stem cells (MSC,), are an ASC population present in the bone marrow, adipose tissue and other tissues. MSCs are readily available and are able to self-replicate and differentiate, supported by the presence of appropriate stimuli, into cell lines derived from mesodermal lineage (osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, and muscle cells). In the last decade it has also been observed that MSCs are able to trans-differentiate into cell types of ectodermal and endodermal origin (transdifferentiation).. The purpose of my work was to develop and define the conditions which can induce trans-differentiation of MSCs extracted from rat adipose tissue toward the neuronal phenotype. The study is part of a major project of regenerative medicine focused on identifying new strategies aimed at restoring functionality in degenerated brain tissue. Initially, MSCs have been characterized by the induction of osteoblastic differentiation, one of their physiological differentiations, and their interaction with biocompatible materials ( titanium dioxide) was analyzed, in order to assess their possible application in medicine for the creation, for example, of prothesic solutions. Subsequently, we sought to devise a GMP compliant cell culturing medium for MSC proliferation, crucial in order to obtain a clinically relevant cell number to differentiate following isolation from adipose tissue. For that reason we tried to induce the differentiation of MSCs into a neural phenotype; a first approach has been to apply protocols already known in literature for the differentiation of different types of stem cells toward the neuronal phenotype.. We considered both the direct differentiation protocols, as well as those that encompassed intermediate stages (sphere-forming). The protocols of differentiation by sphere formation resulted in differentiated MSC expressing glial markers (GFAP), but the protocol was too long(30 days) and a number of differentiated cells very low.. A second approach has been to develop a proprietary differentiation medium (NZ4) using the knowledge and expertise gained from the literature and from the negative results previously obtained The cells maintained in NZ4 differentiation medium , showed a clear morphological change and a high vitality; moreover they expressed both markers of specific neurons in the early stages of development (nestin, doublecortin) as well as markers expressed by mature neurons (βIIItubulin, VAMP2, Sinaptotagmin). Furthermore, the efficiency of the differentiation protocol has been functionally characterized by means of qualitative analysis of the dynamics of intracellular calcium and with quantitative analysis of the resting membrane potential The functional characterization clearly showed that MSC exposed to NZ4 differentiation medium have comparable behavior as primary neurons undergoing in vitro maturation. Given the future direction of the project will be to inject in an animal model the cell undergoing differentiation in order to attempt a partial recovery of the damaged neuronal tissue (i.e. ischemia) we characterized the behavior of MSC encapsulated in a biocompatible bioresorbable hydrogel matrix. The cells were encapsulated for different time periods, recovered, and heir survival as well as maintenance of stemness potential following retrieval was assessed . There are still other issues to be clarified n in particular, it will be necessary to verify in an in vivo setting the the efficacv of the differentiation protocol as well as to characterize the process of MSCs homing and to perform more detailed studies on behavioral changes of the same animal model. However, preliminary data obtained during this thesis allows to deepen the knowledge concerning the differentiation process of MSC from adipose tissue toward a neuronal phenotype.

Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) account for a small population of cells of the non-hematopoietic component of bone marrow. MSCs are multipotent stem cells endowed with neurotrophic potential combined to immunological properties, making them a promising therapeutic tool for neurodegenerative disorders. Although the mechanisms by which they act are still largely unknown, trans-differentiation, paracrine and autocrine actions have been hypothesized. Here we focus on the study of the effects exerted by rat MSCs on CNS neurons and oligodendrocytes by using a simplified in vitro co-culture system that precludes any direct contact between different cell types. The analysis of hippocampal synaptogenesis, synaptic vesicle recycling and electrical activity show that MSCs by themselves, efficiently support morphological and functional neuronal differentiation. Our observations demonstrate that MSCs selectively and directly increased hippocampal GABAergic presynapses and inhibitory transmission. In fact, this increment correlated to a higher expression of the potassium/chloride KCC2 cotransporter and to an enhancement of both the frequency and the amplitude of mIPSC and sIPSC. The decreased of GABA synapses following the treatment with a widely used Trk-neurotrophin receptor blocker, K252a, and the more specific TrkB receptor bodies prompt for the involvement of the brain derived neurotrophic factor (BDNF) in mediating such effects. The involvement of this neurotrophin is also strengthened by test ELISA on the culture medium collected from MSC-neuron co-cultures in which an higher BDNF concentration was detected, when compared to astrocyte-neuron co-cultures. The results obtained indicate that MSC-secreted factors induce glial-dependent neuronal survival and directly trigger an augmented GABAergic transmission in hippocampal cultures, highlighting a new effect by which MSCs could cooperate in CNS repair. Additionally, MSCs have been described to improve the clinical course of some demyelinating pathologies and to promote tissue repair through immunological mechanisms and neuroprotective effects. Following these evidences we performed in vitro and in vivo experiments to assess whether MSCs exert their actions through the support of oligodendrocytes (OLs), the myelinating CNS cells, and participate in the regulation of their proliferation and maturation. Through the analysis of specific proteins typically used as markers of the different stages of proliferation, maturation and differentiation (specifically, the membrane glycoprotein O4, the proteoglycan NG2 and myelin basic protein MBP, respectively), it has been noticed that MSCs are capable to prolong the proliferation phase of OPCs and also to anticipate OL differentiation, with respect to standard astrocyte/OL co-cultures. Moreover we investigated a possible molecular mechanism underlying these phenomena focusing on neurotrophin pathways. Trk receptors activation was analyzed in order to find out a possible role of neurotrophins in MSC-mediated effects on OLs, as it happens in neuronal cultures. We focused on the changes in the phosphorylation level of ERK (Extracellular signaling-regulated kinases), one of the activated effectors by TrK receptors. Our observations show that, in OLs co-cultured with MSCs, ERK is highly phosphorylated with respect to astrocyte/OL co-cultures, suggesting a MSC-induced activation of the pathways regulated by this protein. These data, although preliminary, suggest that MSCs positively act on the regulation of proliferation and maturation of OLs and, due to the observed effects on the regulation of synaptogenesis (see above), make these cells an interesting model for the identification of molecules involved in MSC neuroprotective processes. This may open new therapeutic approaches in the treatment of neurodegenerative diseases involving not only a synaptic imbalance, as it happens in various forms of epilepsy, but also in demyelinating diseases. Thus, in this research project, we aimed at characterising the molecular mechanisms underlying MSC actions that could participate in the recovery of neurological disorders or demyelinating pathologies.

Cell therapy is an attractive perspective for the treatment of life threatening disorders. In this context, foetal tissues are gaining interest as sources of cells for auto- and allo-transplantation, because of their pluripotency, proliferative capability and their low, if any, immunogenicity. Recently a pluripotent stem cell population has been isolated from Amniotic Fluid (AF). It is able to proliferate for more than 18 months, maintaining their differentiative ability as well as a normal karyotype. In term of differentiation potential, we succeeded in obtaining in vitro mesenchymal-, ectodermal- and endodermal-derived tissues from human Amniotic Fluid Stem (AFS) cells. Furthermore, murine AFS cells injected in blastocytes took part to the formation not only of several different foetal organs, but also of the placenta and the umbilical cord. In the present study we investigated the possibility of differentiating AFS cells towards the hematopoietic pathway. AFS cells isolated from human amniotic fluid, collected during routine diagnostic procedures and obtained under informed consent, were firstly expanded in vitro and selected on the basis of their ckit expression. We achieved a reproducible erythroid differentiation by culturing hAFSCs as embryoid bodies (EBs) under serum free conditions with haematopoietic cytokines. Erythroid cells expressing CD235a constituted 70% of the total hAFSCs forming EBs showing also a co-expression of CD36 and CD71. Furthermore, human erythrocytes (human CD235a) were isolated from bone marrow and spleen of sublethally irradiated NOD/SCID mice at 3 months after the injection of hAFSCs. To determine if the expansion procedure had led to a restriction of the hematopoietic potential towards the erythroid pathway, we compared expanded AFSCs and freshly isolated cKit+ Lin- (AFKL) cells. We also harvested cKit+ Lin- KL cells from the membrane surrounding the AF, the Amnion, in search for a possible origin. We compared the hematopoietic potential of mAFKL and mAmKL to Fetal Liver KL, the main source of fetal HSC. When cultivated immediatly after their sorting, freshly isolated murine AFKL and AmKL cells gave rise to all the different hematopoietic lineages both in vitro and in vivo. Actually, when cocultivated with OP9(d)1 cells, AFKL and AmKL undergo complete T cell differentiation within 2 weeks. They also generate myeloid and erythroid colonies when cultivated in methylcellulose for clonogenic assay. The erythroid restricted potential of human AFS cells was thus probably linked to the in vitro expansion procedure. Moreover, cells belonging to all the three hematopoietic lineages (lymphoid, myeloid and erythroid) and arising from freshly isolated mAFKL and mAmKL are found in the peripheral blood of sublethally irradiated RAG1 deficient mice only 4 weeks after transplantation. Four month later, transplanted mice showed mAFKL-derived lymphoid, myeloid and erythroid cells, in all the hematopoietic organs. Successful econdary transplantation strongly suggest that mAFKL and mAmKL comprise HSC, with self-renewal ability. Those results were very similar to those obtained with mFLKL, confirming the strong hematopoietic potential of mAFKL and mAmKL. Experiments with freshly isolated hAFKL gave good results in the in vitro assays being able to give rise to erythroid, myeloid and lymphoid lineages, but failed to reconstitute the hematopoietic system in irradiated NOD/SCID mice, probably due to the poor amount of cells injected. This is the first report demonstrating that AFKL and AmKL do have an haematopoietic potential, supporting the idea that AF and Am may be an excellent source for therapeutic application.

Although mostly resident in the bone marrow (BM), few circulating HSPC (cHSPC) regularly traffic in the peripheral blood (PB) of un-mobilized subjects. Mainly descriptive studies have been published so far about this rare population in humans, and a complete evaluation of their composition, functional features and hierarchical relationship with respect to BM HSPC is still missing. In the present study, we phenotypically characterized cHSPC composition during aging, by applying multi-parametric flow cytometry on 114 PB and, as control, 48 BM samples of healthy donors (HD) of diverse age. These analyses were integrated with single-cell transcriptome profiling (scRNAseq), and ad hoc designed in vitro and in vivo assays to investigate the transcriptional and functional properties of steady-state cHSPC with respect to BM counterpart. Moreover, to study circulating vs. resident HSPC relationships and differentiation potential in vivo in humans, we exploited integration site (IS) clonal tracking of cHSPC, BM HSPC and mature PB lineages isolated from patients treated with HSPC-gene therapy (GT). We observed that cHSPC show a progressive reduction in number during aging and a different composition than BM counterpart, with Multi Lymphoid Progenitors (MLP) displaying the highest PB circulation capability. cHSPC are endowed with multilineage differentiation potential both in vitro and in vivo, with comparable BM homing capability but reduced long-term survival after transplantation in immune-deficient mice than BM HSPC. This latter finding can be explained by the low primitive HSC content and the transcriptional pre-activated state observed in steady-state PB HSC. Indeed, applying scRNA-seq, we identified a unique transcriptional profile of both primitive and lineage-committed cHSPC subpopulations, characterized by lower replicative, metabolic and transcriptional activity, but increased differentiation-, adhesion- and immune response-priming than BM counterpart. The enrichment of lymphoid phenotypic and transcriptional signatures found in PB HSPC, together with their higher IS sharing with PB lymphoid than myeloid mature lineages suggest that cHSPC could have a role in seeding lymphoid organs. Moreover, the higher expression of erythroid marker genes detected in trafficking than resident HSPC was consistent with cHSPC erythroid differentiation bias observed after transplantation and in single-cell in vitro differentiation assay. These findings suggest cHSPC as a source of erythroid-committed progenitors, able to sustain stress-responsive extramedullary erythropoiesis. Finally, our preliminary data on a cohort of HSPC-GT patients suggest that cHSPC may sustain clonal redistribution to distant BM sites, both during active hematopoietic reconstitution and, at a lower extent, during steady-state conditions. Altogether, our findings indicate PB trafficking HSPC as a peculiar steady-state reservoir of low-cycling, pre-activated hematopoietic progenitors, which continuously recirculate among multiple BM sites and are poised for promptly sustaining activation and in situ local hematopoietic differentiation in case of demand.
Nonostante risiedano principalmente nel midollo osseo (BM), poche HSPC circolanti (cHSPC) ricircolano regolarmente nel sangue periferico (PB) di donatori sani in assenza di mobilizzazione. Soprattutto studi di tipo descrittivo sono stati pubblicati sino ad ora su questa rara popolazione nell’uomo e al momento manca una valutazione completa della loro composizione, caratteristiche funzionali e relazione gerarchica rispetto alle HSPC di BM. In questo studio abbiamo caratterizzato fenotipicamente la composizione delle cHSPC durante l'invecchiamento fisiologico, applicando la citometria a flusso multiparametrica su 114 campioni di PB e, come controllo, 48 campioni di BM di donatori sani (HD) di età diversa. Queste analisi sono state integrate con l’analisi del profilo trascrizionale a livello di singola cellula (scRNAseq) e studi in vitro e in vivo, al fine di studiare rispettivamente le proprietà trascrizionali e funzionali delle cHSPC in condizioni fisiologiche rispetto alla controparte di BM. Inoltre, per studiare la relazione tra HSPC circolanti e residenti nel midollo osseo e il loro potenziale di differenziamento in vivo nell'uomo, abbiamo effettuato il monitoraggio clonale dei siti d’integrazione (IS) di cHSPC, BM HSPC e cellule mature di PB isolate da pazienti trattati con terapia genica (GT) basata su HSPC. Abbiamo osservato che le cHSPC si riducono progressivamente durante l'invecchiamento e sono caratterizzate da una composizione diversa rispetto alla controparte di BM, mostrando una più alta capacità di ricircolo dei progenitori linfoidi. Le cHSPC sono in grado di differenziare nelle varie popolazioni ematopoietiche sia in vitro che in vivo, mostrando una simile capacità di migrazione nel BM ma una ridotta sopravvivenza a lungo termine dopo trapianto in topi immunodeficienti rispetto a HSPC di BM. Quest'ultima scoperta può essere spiegata dal basso contenuto di HSC primitive e da uno stato trascrizionale pre-attivato presente nelle HSC di sangue periferico in condizioni fisiologiche. Applicando scRNA-seq, abbiamo identificato un profilo trascrizionale unico nelle sottopopolazioni di cHSPC, sia primitive che più differenziate, caratterizzato da una minore attività replicativa, metabolica e trascrizionale, ma una maggiore capacità di differenziamento, adesione e risposta immunitaria rispetto alla controparte di BM. L'arricchimento dei profili fenotipici e trascrizionali di tipo linfoide osservato nelle HSPC di PB, in associazione con la loro più elevata condivisione di IS con cellule di PB di lignaggio linfoide rispetto a quello mieloide, suggeriscono che le cHSPC potrebbero seminare organi linfoidi. Inoltre, la maggiore espressione di geni di differenziamento eritroide rilevati nelle HSPC circolanti rispetto a quelle residenti è coerente con il bias di differenziamento eritroide osservato nelle cHSPC post-trapianto e nel test di differenziamento in vitro. Questi risultati suggeriscono che le cHSPC costituiscono una fonte di progenitori eritroidi, in grado di sostenere l'eritropoiesi extramidollare in risposta a stress. Infine, i nostri dati preliminari su una coorte di pazienti trattati con HSPC-GT suggeriscono che il ricircolo di HSPC può sostenere la ridistribuzione clonale di cellule staminali in siti midollari distanti, sia durante la ricostituzione ematopoietica attiva che, in misura minore, in condizioni fisiologiche. Complessivamente, i nostri risultati indicano le HSPC circolanti come una peculiare popolazione di progenitori ematopoietici in stato pre-attivato, che ricircolano continuamente tra diversi siti di midollo osseo e sono pronti per sostenere rapidamente un'attivazione e un differenziamento ematopoietico locale in situ in caso di necessità.

Le cellule staminali mesenchimali (Mesenchymal Stem Cells, MSCs) sono una popolazione con elevata capacità proliferativa e con potenziale di differenziazione multilineare; rappresentano, quindi, delle buone candidate per la terapia cellulare e la medicina rigenerativa. In questo studio sono state valutate MSCs fetali isolate da villi coriali (Chorionic Villi, CV) e da liquido amniotico (Amniotic Fluid, AF), confrontandole con le MSCs ottenute da midollo osseo (Bone Marrow, BM), per la capacità di crescita in presenza di siero umano allogenico (human serum, HS) o di lisato piastrinico (platelet lysate, PL), per le caratteristiche immunofenotipiche, il profilo di espressione citochinico e l’attività immunoregolatoria su linfociti allogenici stimolati e sottopopolazioni immunoselezionate. Data l’elevata potenzialità di espansione delle MSCs fetali, le cellule studiate sono state valutate per la loro stabilità replicativa tramite lo studio della lunghezza dei telomeri, l’attività dell’enzima telomerasi, l’espressione dei geni hTERT, c-myc e p53 e l’analisi del cariotipo. Una popolazione omogenea di cellule fibroblastoidi positiva ai tipici marcatori di superficie mesenchimali è stata isolata da tutti i campioni di CV ed AF analizzati. Le cellule di CV espandono rapidamente in HS (20 raddoppiamenti di popolazione, PDs, in 59 giorni e 6 passaggi di coltura), mentre in siero animale (fetal bovine serum, FBS) raggiungono 27 PDs in 65 giorni e 7 passaggi. Il PL determina un’espansione nel 60% dei campioni CV, comunque minore rispetto a quella in HS. I campioni di AF espandono, invece, 40 PDs in 90 giorni, ma solo nel 20% dei campioni analizzati, non proliferano in PL, mentre in FBS espandono 28.5 PDs in 66 giorni. Le cellule fetali studiate inibiscono la proliferazione di linfociti allogenici stimolati e regolano la crescita anche di popolazioni linfocitarie selezionate CD4+ e CD8+. Nonostante il loro elevato potenziale di espansione, le MSCs fetali studiate hanno mostrato una lunghezza stabile dei telomeri durante la cultura a lungo termine, assenza dell’attività telomerasica, nessuna espressione di hTERT, livelli costanti di espressione di c-myc e p53 e nessuna anomalia cromosomica. In conclusione, i risultati mostrano che i CV rappresentano un’ottima fonte di MSCs con proprietà immunoregolatorie, capace di espandere in un sistema di proliferazione umanizzato a lungo termine senza alterazioni genetiche. In più del 90% dei campioni di CV analizzati si ottiene un’espansione su larga scala in presenza di siero umano, incoraggiante per potenziali applicazioni cliniche.
Mesenchymal stem cells (MSCs) are promising candidates for cell therapy and tissue engineering. In previous studies, the most important source of MSCs was adult bone marrow (BM). Recently, MSCs with similar cell surface markers and differentiation capacity have also been found in developmentally younger tissues. This study showed data from fetal MSCs obtained from first-trimester chorionic villi (CV) and second trimester amniotic fluid (AF), comparing them with BM. The work reports on growth in human allogeneic serum (HS) and platelet lysate (PL), immunophenotype, cytokine expression profile and immunoregulatory activity of fetal MSCs on stimulated peripheral blood mononuclear lymphocyte subpopulations. The cells studied was analyzed also for telomere length, telomerase activity, hTERT, p53 and cmyc transcriptions, to evaluate their replicative stability. Spontaneous chromosomal alterations were excluded by cytogenetic analysis. CV cells grow rapidly in HS, with 20 populations doublings (PDs) after 59 days (6 passages), and also in animal serum, with 27 PDs after 65 days (7 passages). PL allowed an expansion in 60% of the samples tested, though it was lower than HS. HS supported an average of 40 PDs of expansion in 20% of AF cells after 90 days, whereas animal serum supported 28.5 PDs in 66 days. CV and AF cells inhibited the proliferation of stimulated T lymphocytes, suppressing the growth of both CD4+ and CD8+ T subpopulations and, sometimes, CD19+ cells. Despite their high proliferation capacity, fetal MSCs showed no telomerase activity, no hTERT transcriptions and maintained long, stable telomeres. A constant expression level of p53 and c-myc and a normal karyotype were preserved throughout long-term expansion, suggesting the safety of fetal MSCs. In conclusion, these results indicate that CV would be an optimal and safety source of MSCs with high expansion potential in a HS propagation system, immunoregulatory capacity of T and B lymphocytes. More than 90% of CV samples achieved a large-scale expansion in HS, that is encouraging for potential clinical applications of these cells.

Il trapianto di cellule staminali emopoietiche rappresenta la terapia di scelta per numerose patologie ematologiche. Tuttavia, la mortalità da trapianto (non relapse mortality-NRM), ha limitato per lungo tempo il suo utilizzo in pazienti di età >65 anni. L’età non può più essere considerata una controindicazione assoluta al trapianto e il suo utilizzo in fasce di età un tempo ritenute non idonee è in sensibile aumento. La NRM è legata a tre ordini di complicanze: immunologiche (malattia del trapianto contro l’ospite, Graft versus-Host Disease -GVHD-), infettive e tossiche. La tossicità d’organo è direttamente correlata alla intensità del condizionamento che quindi viene ridotta in caso di comorbidità e nel paziente anziano. Tuttavia, ridurre l’intensità del condizionamento significa anche aumentare il rischio di ripresa della malattia ematologica di base e quindi tale aggiustamento deve essere fatto in funzione di indici di invecchiamento e di comorbidità, al fine di non ridurre la potenzialità curativa del trapianto. Per valutare le comorbidità abbiamo uno score altamente predittivo (Hematopoietic Cell Transplant-Comorbidity Index, di Sorror), mentre per valutare l’invecchiamento c’è una grande necessità clinica di marcatori innovativi di età biologica. Il presente lavoro ha l’obiettivo di valutare, nei pazienti sottoposti a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche per tutte le indicazioni ematologiche, lo stato di metilazione del DNA, indice di età biologica. Lo scopo è di correlare l’epigenoma al rischio trapiantologico del singolo individuo.
Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is a well-established therapy for several life-threatening hematological disorders, mostly malignancies. However, non-relapse mortality (NRM) has limited its use in patients aged over 65 years. Nowadays age cannot be considered an absolute contraindication for this treatment and the use of transplantation, in patient groups once considered unsuitable, is increasing significantly. NRM is due to three types of complications: immunological (graft versus host disease), infectious and toxic. Organ toxicity is directly related to the intensity of conditioning which is therefore reduced in case of comorbidities and in elderly patients. However, reducing the intensity of chemotherapy also means increasing the risk of relapse of the underlying haematological disease and therefore this adjustment must consider aging and comorbidity indexes in order not to reduce the curative potential of the transplant. To evaluate comorbidities we have a highly predictive score (the Comorbidity Index Score by Sorror, HCT-CI), while to evaluate aging there is a great clinical need to apply innovative biological age markers. The present work aims to evaluate the state of DNA methylation, a biological age index, in the setting of patients undergoing allogeneic haematopoietic stem cell transplantation for all haematological indication. The aim is also to correlate the epigenome with the transplant risk of the single individual.

Many studies performed over the past years have shown that some forms of human cancers are characterized by stem-like-cells (cancer stem cells, CSCs) with specific stem-cell properties. These cells are currently considered as “tumour-initiating“ cells, responsible of tumor relapse. CSCs have the capacity for self-renewal, the potential to develop into any cell and the proliferative ability to drive continued expansion of malignant cells. Many studies have described the rather heterogeneous tumorigenic potential of CSCs and led to the development of the cancer stem cells hypothesis that postulates that only a fraction of cells within a tumour is endowed with stem cells-like features, giving rise to all the other components of the tumour (Jordan CT et al. 2006). Two different approaches to identify CSCs within tumors have been proposed: the first one tracks specific surface markers that are selectively expressed on CSCs but not on the bulk of tumour cells; the second approach exploits some functional characteristics, such as a unique pattern of staining with certain dyes, to identify stem-like cells. In particular this latter method is used for the detection by dual-wavelenght flow cytometry of the so-called side population (SP) on the basis of the ability of these cells to efflux the fluorescent dye Hoechst 33342 (Goodell MA et al 1996). The SP cells represents only a small fraction of the whole cell population and given their ability to efflux drugs, they represent the multi-drug resistant cell fraction within tumors (Hirschmann-Jax C et al. 2004). Moreover, SP cells seem to be an enriched source of stem cells (Challen GA et al. 2006). Solid tumours account for the major cancer burden, and epithelial cancers constitute approximately 80% of all cancers (Visvader J.E. and Lindeman G.J. 2008). The cellular origins of most solid tumours are largely unknown, but it has been speculated that different tumor subtypes reflect distinct cells of origin at the time of tumour initiation. Moreover there is increasing evidence that diverse solid tumours are hierarchically organized and sustained by a distinct subpopulation of CSCs (Visvader J.E. and Lindeman G.J. 2008). A first ongoing study has evaluated the role and the characteristics of cancer stem cells, in particular of the SP cell subset, in Medulloblastoma (MDB) cell lines. MDBs are the most common paediatric solid tumours occurring in the central nervous system (CNS) and recent data have shown that also MDB arises from stem-like cells. We have tried to isolate the subset with stem-like cell properties and to understand which signaling pathway is mainly involved in the CSCs/SP maintenance. First data strongly suggest that MDB cell lines encompass stem-like cells and that the PI3K/AKT/mTOR pathway is crucial for the survival of the SP cells, which have a high capacity to form colonies in vitro. The increased experience in FACS sorter technologies and setting has allowed to well identify SP cells in both primary ovarian cancer cells cultured in vitro and xenografted in nude mice and also to investigate the effects of IFN- on this tumour cell subset. This was the aim of a second study leaded in the Departments of Oncology and Surgical Sciences of Padua in collaboration with our laboratory. Our findings show that IFN- exerts marked antiproliferative and proapoptotic effects on the SP subset, which translates into a therapeutic effect against tumours bearing large amounts of SP cells. These results suggest that screening tumour samples for their SP content could form the basis for rationale-based administration of IFN- to patients with ovarian cancer and possibly other solid tumours. In the last year our research has also focused on the characterization of the CSCs population in brain tumor cell lines and in primary cultures of both Medulloblastoma and Glioblastoma. The tumour microenvironment influences distribution of CSCs within the tumour mass and their resistance to radiation. There are some clues that hypoxia can favour stem cells expansion and maintenance in tumours (Moserle L. et al 2009, Blazek et al 2007, Platet N. et al. 2007). Moreover, preclinical and clinical studies show that local tumour control after radiotherapy inversely correlates with tumour hypoxia (Nordsmark M. et al.2005). Based on these considerations, in the Medulloblastoma (MDB) study we have investigated the link between the hypoxic microenvironment and some molecular pathway (i.e. Notch1 signaling; HIF-1α) that seem to be involved in the maintenance of primary MDB derived cells. First results clearly indicate that MDB derived cells can be successfully expanded in vitro only by preserving them into a hypoxic context. In the Glioblastoma (GMB) study we have exploited image guided surgery to sample multiple intra-tumoral areas to define potential cellular heterogeneity in correlation to the oxygen tension gradient within the GBM mass. Our results indicate that more immature cells, identified with the stem cell marker CD133, are localized in the inner core and in the intermediate layer of the tumour mass, while more committed cells are distributed along the peripheral and neo-vascularised area. These results indicate a correlation between the intra-tumoral hypoxic gradient, the tumour cell phenotype and the tumour resistance to chemotherapy, leading to a novel concentric model of tumour stem cell niche, which may be useful to define the real localization of the chemo-resistant GBM tumour cells in order to design more effective treatment strategies. The last part of this work, different from those discussed above, is focused on the study of the role that IL-23 exert on the B-acute lymphoblastic leukaemia (B-ALL) cells. This study was mainly conducted in the A.I.R.C. Tumor Immunology Unit of the Department of Experimental and Laboratory Medicine, G.Gaslini Institute of Genova. B-cell acute lymphoblastic leukaemia (B-ALL) is a clonal malignant disease originated from a single cell and characterized by the accumulation of blast cells that are phenotypically reminiscent of normal stages of B-cell differentiation (Cobaleda C. and Sánchez-García I. 2009; Onciu M. 2009). Steady progress in development of effective treatments has led to a cure rate of more than 80% in children, creating opportunities for innovative approaches (Pui CH et al. 2006). Studies are underway to ascertain the precise events that take place in the genesis of acute lymphoblastic leukaemia, to enhance the clinical application of known risk factors and anti-leukemic agents, and to identify treatment regimens that reduce relapse. The aim of this study was to investigate the potential direct anti-tumour activity of IL-23 in paediatric B-acute lymphoblastic leukaemia (B-ALL) cells and the molecular mechanisms involved. First results demonstrate that IL-23 possesses anti-leukemic activity on B-ALL cells. We show for the first time that IL-23R is up-regulated in primary B-ALL cells as compared to normal early B lymphocytes, and that IL-23 dampens directly tumour growth in vitro and in vivo through inhibition of tumour cell proliferation and induction of apoptosis. Therefore, in principle, IL-23 may be a good candidate drug to be tested in a phase I trial in childhood B-ALL patients otherwise unresponsive to current therapeutic standards.
CELLULE STAMINALI TUMORALI: RUOLO DELLA SIDE POPULATION NEI TUMORI SOLIDI Molti studi negli ultimi anni hanno dimostrato che alcune forme di tumore sono caratterizzate dalla presenza di cellule con specifiche proprietà stem-like, dette anche cellule staminali tumorali (Cancer Stem Cells/CSCs). Queste cellule sono considerate le cellule “inizianti” il tumore e sono probabilmente le responsabili delle recidive del tumore. Le CSCs hanno la capacità di auto-rinnovarsi, la potenzialità di dare origine a una o più specie cellulari all’interno del tumore e l’abilità di guidare, in modo continuo, la proliferazione delle cellule maligne. Molti studi hanno descritto il potenziale tumorigenico delle CSCs fino ad arrivare alla formulazione della cancer stem cell (CSC) hypothesis, secondo la quale a sostenere la crescita del tumore e a causare recidive, sarebbe una ristretta popolazione cellulare (Jordan CT et al.2006). Sono stati proposti due diversi approcci per caratterizzare le CSCs all’interno del tumore: il primo utilizza marcatori di superficie selettivamente espressi dalle CSCs, ma non dalla maggior parte delle cellule tumorali; il secondo approccio sfrutta alcune caratteristiche funzionali della cellula, come la peculiare capacità di colorarsi con coloranti specifici. In particolare, questo secondo metodo è utilizzato per l'identificazione, tramite citometria a flusso, della cosiddetta Side Population (SP), distinta sulla base della capacità di queste cellule di estrudere il colorante vitale Hoechst 33342 (Goodell MA et al 1996). Le cellule SP rappresentano solo una piccola frazione di tutta la popolazione di cellule e, data la loro capacità di estrudere farmaci, esse rappresentano la frazione chemio-resistente all’interno del tumore (Hirschmann-Jax C et al. 2004). Inoltre le SP sembrano essere una fonte arricchita di cellule staminali (Challen GA et al. 2006). I tumori solidi rappresentano la maggior parte delle patologie maligne ed i tumori epiteliali ne costituiscono circa l'80% (Visvader JE e Lindeman GJ 2008). L’ origine della maggior parte dei tumori solidi è sconosciuta, ma è stato ipotizzato che sottotipi diversi sottendono a cellule inizianti il tumore differenti. Inoltre ci sono evidenze crescenti che diversi tumori solidi siano organizzati in modo gerarchico e sostenuti da una sottopopolazione distinta di CSCs (Visvader JE e Lindeman GJ 2008). Un primo studio ancora in corso ha valutato il ruolo e le caratteristiche delle cellule staminali tumorali, in particolare della sottopopolazione SP, in linee cellulari di Medulloblastoma (MDB). Il MDB è uno dei più comuni tumori solidi pediatrici a livello del sistema nervoso centrale e dati recenti hanno dimostrato che anche il MDB sembra originare da una componente staminale. Abbiamo cercato di isolare la sottopopolazione con caratteristiche stem-like per capire quale pathway fosse principalmente coinvolto nel mantenimento della componente staminale (CSCs/SP). I primi dati ottenuti suggeriscono che nelle linee di MDB è presente una componente staminale e che la via di PI3K/AKT/mTOR è cruciale per la sopravvivenza delle cellule SP, che hanno una elevata capacità di formare colonie in vitro. Una sempre maggiore esperienza nella tecnologia e nel setting del FACS (Flow Activated Cell Sorter) sorter ha permesso di estendere l’approccio sperimentale ad altri tipi di tumore e quindi di identificare le SP sia in cellule primarie di carcinoma ovarico che in cellule, sempre di carcinoma ovarico, xenotrapiantate in topi NOD/SCID e di indagare gli effetti che l’ IFN-? ha sulle cellule tumorali. Questo è stato l'obiettivo di un secondo studio condotto nel Dipartimento di Oncologia e Scienze Chirurgiche di Padova in collaborazione con il nostro laboratorio. I nostri risultati mostrano che IFN-? ha effetti antiproliferativi e proapoptotici sulla componente SP, che si traducono in un potenziale effetto terapeutico contro quei tumori caratterizzati da una elevata percentuale di cellule SP. Questi risultati suggeriscono che lo screening dei campioni di tessuto tumorale per il loro contenuto di SP potrebbe costituire la base per la somministrazione di IFN-? ai pazienti con tumore ovarico ed eventualmente con altri tumori solidi. Nel corso dell’ultimo anno la nostra ricerca si è concentrata anche sulla caratterizzazione delle CSCs in linee cellulari e in colture primarie sia di medulloblastoma (MDB) che di glioblastoma (GBM). E’ noto che il microambiente o nicchia del tumore influenza la distribuzione della CSCs all'interno della massa tumorale e la loro resistenza alle radiazioni. Ci sono alcune evidenze che l'ipossia può favorire l'espansione delle cellule staminali e il mantenimento del tumore (Moserle L. et al 2009, Blazek et al 2007, Platet N. et al. 2007). Inoltre, studi preclinici e clinici indicano che c’è una relazione inversa tra andamento del tumore e ipossia (Nordsmark M. et al.2005). Sulla base di queste considerazioni, nello studio sul medulloblastoma (MDB) abbiamo indagato il legame tra il microambiente ipossico e alcune vie del segnale (Notch1; HIF-1a) che sembrano essere coinvolte nel sostenere la crescita delle cellule di MDB. I primi risultati indicano chiaramente che le cellule di MDB possono essere espanse con successo in vitro solo in un contesto di ipossia. Nello studio sul Glioblastoma (GMB), abbiamo sfruttato la chirurgia immagine-guidata per cercare di definire differenti aree intra-tumorali per capire se ci fosse una distribuzione eterogenea delle cellule correlata al gradiente di ossigeno all'interno del GBM. I nostri risultati mostrano che le cellule più immature, identificate con il marcatore di staminalità CD133, sono localizzate nella parte interna e in quella intermedia della massa tumorale, mentre le cellule più differenziate sono distribuite lungo la zona periferica e maggiormente vascolarizzata. Questi risultati indicano una stretta correlazione tra il gradiente di ipossia intra-tumorale, il fenotipo delle cellule tumorali e la resistenza del tumore alla chemioterapia, portando alla formulazione di un nuovo modello di distribuzione delle cellule staminali nella nicchia del tumore, che potrebbe essere utili per definire con più precisione la reale localizzazione della cellule tumorali chemio-resistenti nel GBM, al fine di elaborare strategie di trattamento più efficaci. L'ultima parte di questa tesi, che esula dagli argomenti trattati sopra, si è focalizzata sullo studio del ruolo che la IL-23 esercita sulle cellule di leucemia linfoblastica acuta-B (B-ALL). Questo studio è stato condotto principalmente nella Unità di Immunologia del Dipartimento di Medicina Sperimentale e Laboratorio dell’ Istituto G.Gaslini di Genova. La Leucemia linboblastica acuta (LLA) è una patologia in cui il blocco della differenziazione, l’iperprpolifrazione e una apoptosi difettosa risultano in un accumulo aberrante di un clone cellulare. Le B-ALL rappresentano l’85% dei casi delle leucemie infantili e vengono distinte in diversi sottotipi a seconda dello stadio maturativo della cellula linfoide (Cobaleda C. e García Sánchez-I . 2009, Onciu M. 2009). Nonostante i progressi degli ultimi anni nello sviluppo di trattamenti sempre più efficaci sono comunque in corso ulteriori studi per capire quali siano gli eventi specifici che portano alla leucemia, per migliorare l'approccio clinico e identificare terapie che possano ridurre le recidive della malattia. L'obiettivo di questo lavoro è stato quello di studiare l’espressione e la funzione del recettore della IL-23 (IL23R) nelle cellule di leucemie acuta B pediatrica (B-ALL) rispetto alla controparte normale e verificare se la IL-23 potesse esercitare una azione anti tumorale diretta sulle cellule di leucemia B e se sì quale fosse il meccanismo coinvolto. I primi risultati ottenuti dimostrano che IL-23R è up-regolato nelle cellule primarie di B ALL rispetto alla controparte normale e che la IL-23 media direttamente la crescita tumorale in vitro e in vivo attraverso l'inibizione della proliferazione delle cellule tumorali e l’ induzione della apoptosi. Pertanto, in linea di principio, la IL-23 potrebbe essere un buon farmaco da testare in trial di fase I in pazienti pediatrici affetti da B-ALL che non rispondono alle attuali terapie.

The aim of the first part of this research project was to improve the knowledge about the existence and location of adult stem cells in the adrenal gland. Although some experiments might suggest that undifferentiated cells derived from the external periphery of cortical zone, the origin of the regenerating cells remains ambiguous, and there are not currently known surface markers for defining these cells. Two distinct cellular populations, from the capsular zone and from the inner part of the adrenal gland, were isolated and investigated in vitro in order to study their phenotype, their proliferative potential and plasticity. The second research project aims to design scaffolds for bone tissue engineering. The development of novel scaffolds for bone tissue engineering is very complex, because ideal support for cellular colonization would possess the same structural and functional characteristics of ECM. In this work, the creation of hybrid scaffolds, mixing a very well known biocompatible synthetic polymer, poly(ε-caprolactones), with different self-assembling peptides, is presented. The microfibrous structure of the scaffold is assured by the electrospinning process, whereas the nanofibrous structure is produces by the self-assembling process of peptides. We prepared six different scaffolds adding six different peptides to poly(ε-caprolactones). These peptides were synthesized by solid phase strategy, and one sequence was prepared condensing a RGD motif to a self-assembling sequence. The characterization of the different scaffolds was carried out through SEM morphological analysis, FT-IR spectroscopy and contact angle measurements. All prepared scaffold exhibit interwoven nanofibers comparable to the ECM ones. FTIR investigations showed that self-assembling peptides incorporated in the PCL nanofibers retain the -sheet conformation, and that an incubation with saline buffered solution can increase the percentage of this structure in the RGD containing peptide. The enrichment with peptides improves the wettability of the polymer scaffold adding an important requirement for better cellular adhesion. The biological assay showed that the presence of self-assembling peptides into the scaffold increases cellular adhesion, the calcium amount and the gene expression of some proteins important for osteoblast.
Premessa Il lavoro di ricerca svolto nel triennio di dottorato si è focalizzato su due progetti. Il primo ha riguardato l’individuazione di cellule staminali nel surrene di ratto, al fine di poterle isolare e caratterizzare. Nel secondo progetto ci si è occupati della progettazione e realizzazione di matrici biomimetiche nanofibrose per la rigenerazione del tessuto osseo. RIASSUNTO Il primo progetto di ricerca ha cercato di chiarire le conoscenze attuali riguardo l’esistenza di cellule staminali adulte residenti nel tessuto surrenale. Sebbene alcune evidenze sperimentali suggeriscano l’esistenza di tali cellule nella parte esterna della corticale surrenale, al riguardo non c’è ancora una teoria riconosciuta in modo unanime: non è stata identificata la loro zona d’origine, né tantomeno sono stati individuati dei marker caratteristici che permettano di isolarle. L’individuazione di tali cellule potrebbe trovare applicazione nella cura di malattie surrenali, ad esempio nell’ipocorticosurrenalismo permetterebbe di evitare la terapia ormonale a vita e quindi, rappresenterebbe la terapia d’elezione. Il progetto si è quindi prefisso come obiettivi di identificare e isolare una popolazione di cellule staminali all’interno della ghiandola surrenale di ratto. Tramite analisi immunoistochimica e di immunofluorescenza sono state ricercate: a) zone cellulari BrdU+ (ratti trattati alla nascita con BrdU), a ciclo cellulare lento; b) marker di staminalità CD105, CD90 e c-kit. Dai surreni di ratto sono state estratte due sottopopolazioni di cellule, capsulari e della parte interna: queste sono state coltivate in vitro, osservate e immunoseparate per CD105 e CD90. Infine, è stata testata la capacità differenziativa delle colture sia in senso osteogenico che adipogenico. Nel secondo progetto sono stati ideati e prodotti scaffold da impiegare nell’ambito dell’ingegneria del tessuto osseo. La progettazione di uno scaffold per l’ingegneria tessutale risulta essere alquanto complessa visto che un supporto ideale per la colonizzazione cellulare dovrebbe possedere le caratteristiche, strutturali e funzionali, della matrice extracellulare. Lo scaffold ideato ha natura ibrida essendo composto di un polimero di sintesi biodegradabile quale il poli(ε-caprolattone) e di peptidi auto-assemblanti. La struttura fibrosa dello scaffold su scala micrometrica è stata assicurata mediante un processo di elettrofilatura. D’altro canto, è noto che i peptidi auto-assemblanti formano spontaneamente matrici tridimensionali con fibre nanometriche estremamente gradite a differenti tipi di cellule, incluse quelle del tessuto osseo. Sono stati ottenuti sei differenti tipi di scaffold utilizzando sei diversi peptidi, ottenuti per sintesi su fase solida, tra i quali una sequenza auto-assemblante coniugata ad un motivo adesivo RGD. Le matrici sono state estesamente caratterizzate mediante analisi di spettroscopia elettronica a scansione, spettroscopia all’infrarosso in trasformata di Fourier e valutazione dell’angolo di contatto. Le matrici risultano essere composte da un intreccio di fibre di dimensioni comparabili a quelle della matrice extracellulare; inoltre, è stato possibile confermare che la struttura β-sheet, che è alla base dell’auto-aggregazione, è presente nelle matrici e viene incrementata, nel caso del peptide auto-assemblante con motivo RGD, dal pre-trattamento con soluzione salina. E’ stato inoltre dimostrato come l’arricchimento con piccole percentuali (5%) di peptidi dello scaffold in poli(ε-caprolattone) produca un grado di bagnabilità notevolmente superiore e quindi crei i presupposti per una maggior colonizzazione della matrice da parte delle cellule. I saggi biologici, eseguiti su tutti gli scaffold, hanno permesso di dimostrare che la presenza di sequenze auto-assemblanti incrementa in modo significativo l’adesione cellulare, la produzione di calcio e l’espressione di geni che codificano per proteine importanti per gli osteoblasti.

Medium-sized spiny neurons (MSNs) are the only neostriatum-projection neurons, and their degeneration underlies some of clinical features of Huntington's disease. We used human developmental biology and exposure to key neurodevelopmental molecules to drive human pluripotent stem (hPS) cells into MSNs. In a feeder-free adherent culture, ventral-telencephalic specification is induced by BMP/TGF-β inhibition and subsequent SHH/DKK-1 treatment. The emerging FOXG1+/GSX2+ telencephalic progenitors are then terminally differentiated, resulting in the systematic line-independent generation of FOXP1+/FOXP2+/CTIP2+/calbindin+/DARPP-32+ MSNs. Similarly to mature MSNs, these neurons carry dopamine- and A2a-receptors, elicit typical firing pattern, and show inhibitory postsynaptic currents, as well as dopamine neuromodulation and synaptic integration ability in vivo. When transplanted into the striatum of quinolinic acid-lesioned rats, hPS-derived neurons survive and differentiate into DARPP-32+-neurons, leading to a restoration of apomorphine-induced rotation behaviour. In summary, hPS cells can be efficiently driven to acquire a functional striatal fate using an ontogeny-recapitulating stepwise method. Moreover, we have established stable HD-iPS cell lines that recapitulating, in vitro, features of the disease can be used for investigating disease mechanisms that underlie HD, representing a platform for in vitro human developmental neurobiology studies and drug screening approaches.

SOMMARIO I prodotti di ingegneria tissutale sono medicinali che contengono o consistono in cellule o tessuti sottoposti ad una rilevante manipolazione così da ottenere caratteristiche biologiche, funzioni fisiologiche e proprietà strutturali pertinenti alla finalità di rigenerazione, riparazione o sostituzione. Nel caso di cellule e tessuti manipolati in vitro, l'obiettivo da raggiungere nel controllo dei processi di produzione e della qualità del prodotto finale è garantire la sicurezza e l'efficacia dei prodotti da immettere nell'uso clinico. Ne consegue la necessità di operare nel rispetto di norme proprie dei processi produttivi dei farmaci sia dal punto di vista della qualità che della sicurezza del prodotto. Lo scopo del lavoro svolto durante il dottorato è stato lo studio e messa a punto di sistemi di produzione per la generazione di un prodotto innovativo per terapie avanzate. Si tratta di un prodotto costituito da cellule staminali mesenchimali, ottime candidate per applicazioni cliniche in medicina rigenerativa. Per la produzione di un prodotto di terapia avanzata, l’intero processo, a partire dal campione iniziale fino al prodotto finito, deve essere svolto in un’officina farmaceutica autorizzata che operi nel rispetto delle Good Manufacturing Practices (GMP). Si tratta di linee guida il cui scopo è assicurare che un farmaco sia prodotto, analizzato e rilasciato in un regime di Qualità controllata e certificata in modo da minimizzare il pericolo che vi siano rischi non previsti per il paziente. Nella fase preliminare del processo è stata valutata la fattibilità del metodo e sono stati definiti i protocolli da impiegare. La fase di fattibilità ha permesso di mettere a punto la procedura di isolamento, espansione, differenziamento delle cellule staminali. E’ stato possibile valutare la stabilità genomica e le caratteristiche immunofenotipiche delle cellule a vari passaggi cellulari. Tutti i dati ottenuti durante lo studio di fattibilità sono stati fondamentali per definire i test di controllo di qualità, le specifiche di prodotto e i criteri di accettabilità richiesti per la successiva convalida del processo. I risultati presentati durante lo studio di fattibilità evidenziano come sia possibile trasferire protocolli di ricerca in processi potenzialmente applicabili in sperimentazione clinica. Alla fine del processo di convalida che prevede la produzione di tre lotti di cellule, le specifiche previste per i controlli in ingresso, durante il processo di produzione e sul prodotto finito devono risultare conformi a tutte le richieste. I passi futuri sono la validazione del processo asettico, mediante l’esecuzione di tre mediafill e la valutazione del rischio relativa alla produzione di lotti destinati alla clinica, in modo da completare la serie di studi necessari per la presentazione di una domanda di autorizzazione allo studio clinico.
ABSTRACT Tissue Engineered products may carry cells or tissues either of human or animal origin. The cells and tissues shall be subjected to substantial manipulation in order to obtain biological characteristics, physiological functions or structural properties relevant for the intended regeneration, repair or replacement. For cells and tissues manipulated in vitro, the objective to be achieved in terms of control of production processes and quality of the final product is to ensure the safety and effectiveness of the products that would be placed in clinical use. Hence the need to act in accordance with the rules which define production processes used for drugs, in order to guarantee the quality and safery of the product.. The purpose of the work done during the PhD was the study and the development of production protocol for the generation of an innovative product for advanced therapies. It is a cellular product made of mesenchymal stem cells, good candidates for clinical applications in regenerative medicine. For this production, all stages, starting from the initial sample and up to the final product, must be carried out in an authorized pharmaceutical facility which operates in compliance with Good Manufacturing Practices (GMP). The purpose of these guidelines is to ensure that drugs are produced, analysed and released in a regime of controlled and certified quality minimizing the danger of unexpected risks for the patient. In the preliminary phase of the process the feasibility of the method was evaluated and the protocols to be used were defined. The feasibility phase allowed the development of procedures for the isolation, expansion and differentiation of stem cells. It was possible to evaluate the genomic stability and immunophenotypic features of the cells at different steps. All data obtained during the feasibility study have been fundamental to define the tests of quality control, product specifications and criteria of acceptability required for the subsequent validation of the process. The results presented in the feasibility study show that it is possible to transfer research protocols to a GMP framework which is potentially applicable in clinical trials. At the end of the validation process, which involves the production of three batches of cells, the specifications required for the incoming controls, during the production’s process and on the final product must comply with all the requirements. The future steps will be the validation of the aseptic process, through the execution of three mediafill and the risk assessment related to the production of batches intended for clinical use, in order to complete the series of documents required for the submission of an application for a clinical study.

Date le sollecitazioni meccaniche alle quali è sottoposta, la cartilagine, soprattutto quella articolare, è facilmente danneggiabile e la mancanza di vascolarizzazione la rende un tessuto incapace di auto-rigenerarsi. Il fallimento della chirurgia tradizionale ha incentivato negli ultimi venti anni lo sviluppo di nuove tecniche di ingegneria tissutale che prevedono la rigenerazione del tessuto cartilagineo in vitro, e il suo successivo impianto nella zona lesionata. Generalmente si preferisce utilizzare cellule staminali mesenchimali adulte (MSCs), e il tessuto adiposo si è rivelata la fonte di estrazione più conveniente.Inoltre le ATSCs (Adipose Tissue Stem Cells) possono essere facilmente isolate dalla componente vasculo-stromale (SVF) del tessuto adiposo prelevata in seguito a un intervento di liposuzione: quindi, a differenza delle MSCs estratte da midollo osseo (BMSCs- Bone Marrow Stem Cells), la loro estrazione dal paziente richiede un intervento meno invasivo e meno rischioso. Il tessuto cartilagineo non è raggiunto dai vasi sanguigni, e la sua formazione nella fase embrionale avviene ad una concentrazione di O2 notevolmente inferiore a quella ambientale. Questo ha indotto gli studiosi a pensare che un ambiente ipossico possa non soltanto favorire il differenziamento condrogenico di cellule staminali in coltura, ma anche facilitare il mantenimento del fenotipo condrocitico, mimando l'ambiente fisiologico avascolare della cartilagine.Lo scopo di questa tesi è stato la messa a punto di un protocollo di coltura cellulare in condizioni di ipossia per indurre differenziamento condrogenico di ATSCs. La metodica standardizzata verrà impiegata in laboratorio per sviluppare la ricerca di base nello studio della rigenerazione della cartilagine.

Le cellule staminali mesemchimali (MSC) sono una popolazione eterogenea di cellule stromali multipotenti, possono essere isolate da diversi tessuti adulti e possono dare origine a diversi tipi cellulari(21). Nel midollo osseo (BM) differenziano principalmente in osteoblasti e adipociti, e l’ interazione con questo microambiente influenza da vicino il loro programma differenziativo. FasL è una citochina molto conosciuta per il suo ruolo pro-apoptotico, in associazione con il suo recettore specifico Fas, tuttavia diversi studi propongono che sia coinvolta anche in altri processi biologici. Questo lavoro dimostra per la prima volta che FasL può essere coinvolto nella proliferazione e nella differenziazione delle BM-MSC. Le BM-MSC trattate con una bassa dose di FasL (0.5 ng/ml) proliferano più rapidamente delle cellule non trattate, senza andare incontro ad apoptosi o a processi differenziativi, mentre dosi più alte (25 ng/ml) inducono il processo apoptotico nel 20% delle cellule, selezionando una popolazione con un fenotipo ancora staminale. A livello molecolare il trattamento con FasL 0.5 ng/ml induce la fosforilazione di ERK 1/2 e l’aumento dell’espressione della survivina mentre FasL 25 ng/ml determina l’attivazione delle caspasi 8 e 3. Inoltre FasL 25 ng/ml attraverso la modulazione di PPARγ e FABP4/aP2 inibisce reversibilmente la differenziazione delle BM-MSC in adipociti. I dati di inibizione dell’adipogenesi in vitro sono stati confermati su topi Fas lpr, mutati per Fas, che hanno mostrato una maggiore espressione dell’mRNA e delle proteine PPARγ e FABP4/aP2 rispetto ai controlli. I nostri dati suggeriscono che il sistema FasL/Fas è coivolto nella biologia delle BM-MSC, e può regolarne sia la proliferazione che il differenziamento adipogenico. Questi risultati possono avere una rilevanza clinica, chiarendo i meccanismi che determinano l’aumento dell’adipogenesi nel midollo durante l’invecchiamento o in alcune condizioni patologiche come l’osteoporosi.
Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent progenitor cells that can differentiate into several cell types. Bone marrow (BM)-MSCs mainly differentiate into osteoblasts or adipocytes. MSC interactions with their microenvironment directly affect their self-renewal/differentiation program. Here we show for the first time that FasL, a well-explored pro-apoptotic cytokine, can promote proliferation of BM-derived MSCs in vitro and inhibits their differentiation into adipocytes. BMMSCs treated with a low FasL dose (0.5 ng/ml) proliferated more rapidly than untreated cells without undergoing spontaneous differentiation or apoptosis, whereas higher doses (25 ng/ml) induced significant though not massive BM-MSC death, with surviving cells maintaining a stem cell phenotype. At the molecular level, 0.5 ng/ml FasL induced ERK1/2 phosphorylation and surviving up-regulation, whereas 25 ng/ml FasL induced caspase activation. Importantly, 25 ng/ml FasL reversibly prevented BM-MSC differentiation into adipocytes by modulating PPARγ and FABP4/aP2 expression induced by adipogenic medium. All such effects were inhibited by anti-Fas neutralizing antibody. The in vitro data regarding adipogenesis were confirmed using Faslpr mutant mice, where higher PPARγ and FABP4/aP2 mRNA and protein levels were documented in whole tibia. These data show that the FasL/Fas system plays a role in BM-MSC biology via regulation of both proliferation and adipogenesis. These findings may have clinical relevance because circulating Fas/FasL levels decline with age and several age-related conditions, including osteoporosis, are characterized by adipocyte accumulation in BM.

Gli approcci di medicina rigenerativa basati su cellule staminali mesenchimali (MSC) sono stati studiati per trattare diverse malattie associate all'invecchiamento, inclusa la degenerazione maculare legata all'età (DMLE). La perdita delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (EPR) si verifica all'inizio della DMLE e il loro trapianto ha il potenziale per rallentare la progressione della malattia. L'EPR umano contiene una sottopopolazione di cellule - cellule staminali EPR adulte (RPESC) - che sono in grado di auto-rinnovarsi e di differenziarsi in cellule RPE in vitro. Tuttavia, i cambiamenti di MSC correlati all'età comportano perdita di funzione e acquisizione di un fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP), che può contribuire al mantenimento di uno stato cronico di infiammazione di basso grado nei tessuti e negli organi. In uno studio precedente abbiamo isolato, caratterizzato e RPESC differenziati. In questa sperimentazione abbiamo indotto senescenza replicativa in RPESCs e testato la loro acquisizione del fenotipo della senescenza e della SASP così come la capacità di differenziazione di RPESC giovani e senescenti. Gli RPESC senescenti hanno mostrato una capacità di proliferazione significativamente ridotta, un'alta attività β-galattosidasi associata alla senescenza e l'acquisizione di SASP. I geni specifici per RPE erano sottoregolati e l'espressione della proteine p21 e p53 era sovraregolata. Questi risultati documentano gli effetti della senescenza e dell'acquisizione di SASP sulla capacità di differenziazione di RPESC e sottolineano la necessità di una maggiore comprensione del loro ruolo nella patogenesi della DMLE.
Regenerative medicine approaches based on mesenchymal stem cells (MSCs) are being investigated to treat several aging-associated diseases, including age-related macular degeneration (AMD). Loss of retinal pigment epithelium (RPE) cells occurs early in AMD, and their transplant has the potential to slow disease progression. The human RPE contains a subpopulation of cells - adult RPE stem cells (RPESCs) – that are capable of self-renewal and of differentiating into RPE cells in vitro. However, age-related MSC changes involve loss of function and acquisition of a senescence-associated secretory phenotype (SASP), which can contribute to the maintenance of a chronic state of low-grade inflammation in tissues and organs. In a previous study we isolated, characterized, and differentiated RPESCs. Here, we induced replicative senescence in RPESCs and tested their acquisition of the senescence phenotype and the SASP as well as the differentiation ability of young and senescent RPESCs. Senescent RPESCs showed a significantly reduced proliferation ability, high senescence-associated β-galactosidase activity, and SASP acquisition. RPE-specific genes were downregulated and p21 and p53 protein expression was upregulated. These findings document the effects of senescence and SASP acquisition on RPESC differentiation ability and highlight the need for a greater understanding of their role in AMD pathogenesis.

L'ingegneria tissutale è un campo multidisciplinare in rapida crescita che si avvale delle scienze fisiche, ingegneristiche e della vita per sviluppare ed ottenere cellule funzionali, tessuti ed organi per riparare, sostituire o migliorare le funzioni biologiche perse a causa di anomalie congenite, traumi, malattie o invecchiamento. Nell’ambito della ricostruzione della cartilagine articolare sono stati fatti notevoli passi in avanti ma la soluzione per il ripristino completo del tessuto sembra ancora essere lontana. Nella prima parte di questo lavoro è stata valutata la capacità di uno scaffold a base di gelatina di indirizzare le ADSCs verso un differenziamento in senso condrogenico. Successivamente, con lo scopo di migliorare il grado differenziamento e diminuire i costi associati all’utilizzo di fattori differenziativi, l’attenzione è stata posta sullo sviluppo di un biomateriale a base di alginato e ioni cobalto in modo da mimare e sfruttare le caratteristiche fisiche della cartilagine piuttosto che il suo intorno chimico. In ultimo, è stato sviluppato un sistema low cost per la produzione di chip microfluidici sfruttabili per la realizzazione di sistemi micrometrici per incapsulazione cellulare.
Tissue engineering is an interdisciplinary and multidisciplinary field that aims at the developmentof biological substitutes that restore, mantain, or improve tissue function. Concerning the articular cartilage many improvments were made, but the complete tissue restoration approach still lacking. In the first part of this work, it was evaluated the ability of a gelatin scaffold to promote the condrogenic differentiation of ADSCs. Successively, in order to obtain a low cost sistem, a based alginate/Cobalt scaffold was designed with the aim to take advantage of the physical features of the cartilage tissue. Finally, it was developted a cost effective method to produce microfluidic chips with the aim to obtain micro-systems for cell encapsulation.

L'ingegneria tissutale è un campo multidisciplinare in rapida crescita che si avvale delle scienze fisiche, ingegneristiche e della vita per sviluppare ed ottenere cellule funzionali, tessuti ed organi per riparare, sostituire o migliorare le funzioni biologiche perse a causa di anomalie congenite, traumi, malattie o invecchiamento. Nell’ambito della ricostruzione della cartilagine articolare sono stati fatti notevoli passi in avanti ma la soluzione per il ripristino completo del tessuto sembra ancora essere lontana. Nella prima parte di questo lavoro è stata valutata la capacità di uno scaffold a base di gelatina di indirizzare le ADSCs verso un differenziamento in senso condrogenico. Successivamente, con lo scopo di migliorare il grado differenziamento e diminuire i costi associati all’utilizzo di fattori differenziativi, l’attenzione è stata posta sullo sviluppo di un biomateriale a base di alginato e ioni cobalto in modo da mimare e sfruttare le caratteristiche fisiche della cartilagine piuttosto che il suo intorno chimico. In ultimo, è stato sviluppato un sistema low cost per la produzione di chip microfluidici sfruttabili per la realizzazione di sistemi micrometrici per incapsulazione cellulare.
Tissue engineering is an interdisciplinary and multidisciplinary field that aims at the developmentof biological substitutes that restore, mantain, or improve tissue function. Concerning the articular cartilage many improvments were made, but the complete tissue restoration approach still lacking. In the first part of this work, it was evaluated the ability of a gelatin scaffold to promote the condrogenic differentiation of ADSCs. Successively, in order to obtain a low cost sistem, a based alginate/Cobalt scaffold was designed with the aim to take advantage of the physical features of the cartilage tissue. Finally, it was developted a cost effective method to produce microfluidic chips with the aim to obtain micro-systems for cell encapsulation.

Le cellule staminali sono molto rare e per questo il loro impiego in campo clinico è problematico. L’utilizzo del cordone ombelicale, che risolverebbe il problema del donatore, ha purtroppo un’applicazione limitata a causa proprio del numero insufficiente di cellule staminali. Per questo motivo è di fondamentale importanza lo sviluppo di un sistema per l’espansione delle cellule staminali. Nello stesso tempo, per l’applicazione delle cellule staminali in ingegneria tissutale (ad esempio per la riparazione del tessuto osseo) risulta indispensabile l’individuazione di uno scaffold idoneo a tale scopo. Per questo motivo, da un lato è stato studiato un sistema per l’espansione delle cellule staminali emopoietiche di cordone ombelicale, dall’altro è stato fatto uno screening di scaffold diversi per l’applicazione in ingegneria del tessuto osseo. In un nostro precedente studio è stato dimostrato che l’interleuchina (IL)-16 è capace di indurre le cellule CD34+ a proliferare e differenziare in cellule dendritiche mature. In questo lavoro, è stato investigato il ruolo dell’IL-16 nell’espansione delle cellule CD34+ isolate da sangue di cordone ombelicale. E’ stato osservato che l’IL-16 aggiunta al cocktail di base costituito da stem cell factor (SCF), Flt-3 ligand (FL), thrombopoietin (TPO), IL-6 e IL-3, aumenta significativamente il numero delle cellule CD34+, della popolazione più primitiva CD34+CD38-, dei progenitori emopoietici e delle LTC-IC (long-term-culture-initiating-cells), non alterando la capacità delle cellule CD34+ di differenziare in linfociti-B e cellule natural killer (NK). L’aggiunta dell’IL-16 aumenta l’attività migratoria delle cellule CD34+ espanse e diminuisce la percentuale delle cellule CD34+CD4+. Questi risultati sembrano suggerire che l’IL-16 possa avere un ruolo importante nell’espansione delle cellule staminali emopoietiche e possa essere utilizzata in clinica per l’espansione delle cellule CD34+ (Articolo I). Scaffold diversi di policaprolattone (PCL) sono stati analizzati al fine di individuare un nuovo biomateriale in grado di promuovere il differenziamento delle cellule staminali mesenchimali di coniglio in osteoblasti. I risultati ottenuti dimostrano che lo scaffold PCL/TZ-HA, ottenuto mescolando PCL e proteina termoplastica zeina, sembra favorire l’adesione ed il differenziamento osteogenico, dimostrando un ottimo potenziale applicativo nell’ingegneria del tessuto osseo (Articolo II). Recentemente è stato sviluppato un nuovo modello dello sviluppo tumorale basato sulle cellule staminali tumorali. Con l’introduzione di tale ipotesi si è fatta avanti la necessità di individuare nuovi marcatori molecolari e sviluppare nuove terapie. Studi precedenti hanno dimostrato che l'aumento d’espressione dei recettori Eph e dei loro ligandi ephrin è in vari casi collegato con fenomeni di progressione tumorale ed angiogenesi. In questo lavoro, è stata valutata l'espressione dei ligandi ephrin-B1-B2 e dei recettori EphB1-B4 in linee cellulari di rabdomiosarcomi e tumori primari. I risultati ottenuti evidenziano deregolazione sia dei ligandi sia dei recettori nelle linee cellulari, mentre un generale aumento dell'espressione delle proteine analizzate è stato registrato nei tumori primari. E’ stata inoltre dimostrata anche una correlazione tra l'espressione di EphB2 ed EphB4 in entrambi i tipi tumorali. La generale deregolazione dell'espressione genica e le correlazioni registrate tra ligandi e recettori e tra EphB2 e EphB4 suggeriscono un ruolo di ephrin-B e EphB nello sviluppo dei RMS (Articolo III).
Stem cells are very rare and this represents a big problem for clinical application. The use of umbilical cord blood, that could be a good alternative source of stem cells, is limited because of the poor number of stem cell that is not sufficient for transplantation. Accordingly, it will be very important to develop an assay to expand ex-vivo stem cell population. At the same time, for stem cell application in tissue engineering (for example bone tissue engineering) it could be very important to prepare a scaffold. This is why we studied an assay for ex-vivo expansion of hematopoietic stem cells isolated from cord blood and we did a screening of biomaterials for bone tissue engineering. A previous work reported that interleukin (IL)-16 can induce CD34+ hematopoietic cells to proliferate and differentiate in-vitro into phenotypically and functionally mature DCs. In this study, the effects of IL-16 on the expansion of CD34+ cells from human cord blood were investigated. IL-16 added to a basal cocktail (BC) composed of stem cell factor (SCF), Flt-3 ligand (FL), thrombopoietin (TPO), IL-6 e IL-3,of cytokines significantly enhanced the expansion of CD34+ cells, CD34+CD38-, early stem cells progenitor cells and long-term-culture-initiating-cells (LTC-IC). Moreover, CD34+ cells expanded with IL-16 maintained the capacity to differentiate into the lymphoid-B and -NK lineage. The addition of IL-16 to BC increased the migratory capacity of expanded CD34+ cells compared to BC alone and decreased the percentage of CD34+CD4+ cells. Overall, this study suggests that IL-16 may have a new role in promoting the expansion of hematopoietic stem cells and may represent a new tool for the expansion of CD34+ cells for clinical applications (Paper I). Scaffolds of different composition have been analysed to develop a novel multiphase biomaterial able to promote osteogenic differentiation of rabbit mesenchymal stem cells (rMSC). Results demonstrated that the multi-phase PCL/TZ-HA system showed improved rMSCs adhesion and osteoblast differentiation, thus demonstrating great potential for bone regeneration. (Paper II). Recent advances in tumour progression introduce the concept of cancer stem cells. According to this hypothesis, it will be important to identify new tumour markers and to develop new therapeutic strategies. Previous works demonstrated that increased expression of Eph receptors and their ephrin ligands have been implicated in promoting angiogenesis and tumour progression in several malignancies. Here the expression of mRNA for ephrin-B and EphB receptors in rhabdomyosarcoma (RMS) cell lines and primary tumours were measured. A dysregulation of both ligands and receptors was found in all cell lines. A global up-regulation of ephrin-Bs and EphB receptors in RMS tumours was found. In embryonal tumours, a correlation between ligand and receptor was found. A correlation between EphB2 and EphB4 receptors was demonstrated in both tumour types. The dysregulation of ephrin-B and Eph-B in RMS and the correlations between ligand and receptors and between EphB2 and EphB4 suggest a possible role for ephrin-B and EphB in RMS development (Paper III).

Nitric oxide (NO) is a free radical synthesized in various cells from L-arginine by a family of enzymes called the nitric oxide syntheses (NOS). Two NOS are constitutively expressed, the type I NOS, also classified as neuronal NOS and the type III or endothelial NOS. The type II, the inducible NOS, is expressed in inflammatory cells and is up-regulated in many pathological conditions. Their activity can be pharmacologically inhibited in vitro and in vivo by L-NAME while the NO effect can be mimicked by synthetic NO donor compounds. In the skeletal muscle NO is produced by a muscle specific isoform of neuronal NOS, the NOSmu, that is localized to the sarcolemma by association with alfa-synuclein into the dystrophin glycoprotein complex. Loss of dystrophin leads to NOS mislocalization and activity down-regulation; the absence of NO thus resulting is considered one of the causes of muscle damage in Duchenne Muscular Dystrophy. NO exerts different functions in muscle: it regulates muscle contraction, couples energy supply with demand, and controls force generation and resistance to fatigue; in addition, it regulates satellite cells activation and fusion. Satellite cells are a small quiescent population of myoblast precursors responsible for growth, maintenance and repair of postnatal skeletal muscle. They become activated in response to damage, start to proliferate and differentiate to form new fibres; some of this cells exit from the cell cycle and revert to quiescence by a self renewal mechanism which is essential for muscle homeostasis. Our laboratory has recently demonstrated that NO in association with non steroidal anti-inflammatory drugs has therapeutic effects in skeletal muscle dystrophy, controlling damage and regeneration. In this work we have evaluated the effect of NO in the regulation of satellite cells self-renewal, and we have studied the importance of this effect in maintenance of skeletal muscle regeneration capacity after different types of injuries. We have carried out in vitro experiments using single fibre cultures treated with the NO donor drug SIN-1 or the NOS inhibitor, L-NAME, and single myofibres isolated from age matched nNOS null mice; and in vivo analyses of two different model of muscle damage. For the chronic waste model we have used alfa-sarcoglycan null mice that shows many characters of Duchenne muscular dystrophy including the absents of a functional NOS, To investigate acute damage we have induced cardiotoxin (CTX) damage. In both models NO or the NOS inhibitor L-NAME were supplied the diet and we have also analysed nNOS null mice as genetic-related control. The results of our experiments demonstrate that NO ameliorates the muscle function and morphology enhancing regeneration and that this effect can be maintained long term. NO appears to increase the number of quiescent satellite cells involved in self-renewal mechanism, thus avoiding satellite cells pool exhaustion. NO exerts this effect at least in part by modulation of WNT pathway. Results obtained encourage the development of NO-based therapeutic strategies in skeletal muscle diseases treatment.

Recent reports have shown that tumor growth is supported by a specific subpopulation of stem cells, known as cancer stem cells (CSCs) or tumor-initiating cells. This cells have stem-like features, such as self renewal,multipotency, high migration capacity, drug resistance and aberrant differentiation. CSCs have been detected in several kind of tumors and in cancer cell lines grown as non-adherent spheres in serum–free medium under intense stimulation whit growth factors. Presence of cancer stem-like cells in thyroid differentiated carcinoma has not yet fully investigated and the literature on such issue is still limited. The objective of this study was to identify and characterize CSCs from a cancer cell line from papillary thyroid carcinoma (B-CPAP) and a cell line, derived from human thyroid follicular cells (N-THY-ORI 3-1), as control. Thyrospheres from B-CPAP cells could be propagated up to ten generations, whereas those from N-THY-ORI 3-1 lasted only for four generations. The “stemness” profile was evaluated by functional assays and RT-PCR. B-CPAP sphere forming efficiency (SFE) and self renewal increased exponentially at every generation with maximum value at the 8th. By contrast, N-THY-ORI 3-1 SFE and self renewal progressively decreased along generations. RT-PCR showed mRNA expression of stem cell markers (Oct 4, Nanog, ABCG2) and early and thyroid late differentiation markers (PAX8, TTF1, Tg) in B-CPAP thyrosphere. In particular, ABCG2 expression significantly increased in thyrospheres at 9th generation. On the contrary, PAX8, TTF1 and Tg showed a decrease in thyrosphere along the generation of spheres, while p63 maintained the same expression in all samples. Thyrospheres from non tumorigenic cell line were positive for mRNA expression of stem cell markers (Oct4, Nanog, ABCG2,) and PAX8. In this cell line, Nanog and ABCG2 mRNA expression increased along the generations. To isolate stem-like cells in tumor and normal thyrospheres, we used the fluorescent dye PKH26. The single cells suspensions from thyrospheres were then FACS sorted. According to fluorescent intensity we selected two populations: the brightest fluorescent cells (PKH26 high), which constitute the putative stem cell population and the dimmest fluorescent cells (PKH26 low), which represent proliferating and differentiated cells. Both populations were able to form sphere, but only PKH26 high formed secondary spheres. The molecular analysis showed a higher stem cell marker mRNA expression in PKH26 high compare to PKH26 low cells. On the contrary TTF-1, PAX8 and Tg mRNA were more expressed in PKH26 low cells. Take together, our data show, for the first time, that B-CPAP and N-THY-ORI 3-cell lines contain cells with features and properties of stem cell.

Le cellule staminali mesenchimali possono essere considerarate una valida alternativa terapeutica al trapianto d'organo nel trattamento delle patologie epatiche. Il nostro studio, su modello animale, si propone di valutare parametri di funzionalita epatica (GOT,GPT,FAL) a diversi timepoints dopo la rigenerazione endogena con MSCs previa necrosi CCL4 indotta, rispetto al gruppo controllo di rigenerazione endogena spontanea. Tutti i ratti recuperano la funzionalita' epatica ma differente e il tempo di recupero che e risultato significativamente piu breve nel gruppo trattato con MSCs. Questi dati dimostrano che il trattamento con le cellule staminali mesenchimali potrebbe essere una efficace e valida terapia per le epatopatie.
Mesenchymal stem cells can represent a therapeutic alternative to organ transplantation in the treatment of liver diseases.This animal model study investigated liver function parameters (GOT, GPT, ALP) at different timepoints after organ regeneration with MSCs after CCL4-induced necrosis compared with normal organ regeneration controls.Hepatic functional recovery was significantively smaller in rats treated with stem cells compared with controls.These data demonstrated that the use of MSCs may ameliorate the treatment of hepatic desease

La letteratura scientifica degli ultimi anni si è arricchita di un numero sempre crescente di studi volti a chiarire i meccanismi che presiedono ai processi di homing di cellule staminali emopoietiche e del loro attecchimento a lungo termine nel midollo osseo. Tali fenomeni sembrano coinvolgere da un lato, l’interazione delle cellule staminali emopoietiche con la complessa architettura e componente cellulare midollare, e dall’altro la riposta ad un’ampia gamma di molecole regolatrici, tra le quali chemochine, citochine, molecole di adesione, enzimi proteolitici e mediatori non peptidici. Fanno parte di quest’ultimo gruppo anche i nucleotidi extracellulari, un gruppo di molecole-segnale recentemente caratterizzate come mediatori di numerose risposte biologiche, tra le quali l’allestimento di fenomeni flogistici e chemiotattici. Nel presente studio è stata investigata la capacità dei nucleotidi extracellulari ATP ed UTP di promuovere, in associazione alla chemochina CXCL12, la migrazione di cellule staminali umane CD34+. E’ così emerso che la stimolazione con UTP è in grado di incrementare significativamente la migrazione dei progenitori emopoietici in risposta al gradiente chemioattrattivo di CXCL12, nonché la loro capacità adesiva. Le analisi citofluorimetriche condotte su cellule migranti sembrano inoltre suggerire che l’UTP agisca interferendo con le dinamiche di internalizzazione del recettore CXCR4, rendendo così le cellule CD34+ maggiormente responsive, e per tempi più lunghi, al gradiente attrattivo del CXCL12. Saggi di homing competitivo in vivo hanno parallelamente mostrato, in topi NOD/SCID, che la stimolazione con UTP aumenta significativamente la capacità dei progenitori emopoeitci umani di localizzarsi a livello midollare. Sono state inoltre indagate alcune possibili vie di trasduzione del segnale attivate dalla stimolazione di recettori P2Y con UTP. Esperimenti di inibizione in presenza della tossina della Pertosse hanno evidenziato il coinvolgimento di proteine Gαi nella migrazione dipendente da CXCL12 ed UTP. Ulteriori indicazioni sono provenute dall’analisi del profilo trascrizionale di cellule staminali CD34+ stimolate con UTP, con CXCL12 o con entrambi i fattori contemporaneamente. Da questa analisi è emerso il ruolo di proteine della famiglia delle Rho GTPasi e di loro effettori a valle (ROCK 1 e ROCK 2) nel promuovere la migrazione UTP-dipendente. Questi dati sono stati confermati successivamente in vitro mediante esperimenti con Tossina B di C. Difficile (un inibitore delle Rho GTPasi) e con Y27632 (in grado di inibire specificatamente le cinasi ROCK). Nel complesso, i dati emersi in questo studio dimostrano la capacità del nucleotide extracellulare UTP di modulare la migrazione in vitro di progenitori emopoietici umani, nonché il loro homing midollare in vivo. L’effetto dell’UTP su questi fenomeni si esplica in concerto con la chemochina CXCL12, attraverso l’attivazione concertata di vie di trasduzione del segnale almeno parzialmente condivise da CXCR4 e recettori P2Y e attraverso il reclutamento comune di proteine ad attività GTPasica, tra le quali le proteine Gαi e i membri della famiglia delle Rho GTPasi.

La letteratura scientifica degli ultimi anni si è arricchita di un numero sempre crescente di studi volti a chiarire i meccanismi che presiedono ai processi di homing di cellule staminali emopoietiche e del loro attecchimento a lungo termine nel midollo osseo. Tali fenomeni sembrano coinvolgere da un lato, l’interazione delle cellule staminali emopoietiche con la complessa architettura e componente cellulare midollare, e dall’altro la riposta ad un’ampia gamma di molecole regolatrici, tra le quali chemochine, citochine, molecole di adesione, enzimi proteolitici e mediatori non peptidici. Fanno parte di quest’ultimo gruppo anche i nucleotidi extracellulari, un gruppo di molecole-segnale recentemente caratterizzate come mediatori di numerose risposte biologiche, tra le quali l’allestimento di fenomeni flogistici e chemiotattici. Nel presente studio è stata investigata la capacità dei nucleotidi extracellulari ATP ed UTP di promuovere, in associazione alla chemochina CXCL12, la migrazione di cellule staminali umane CD34+. E’ così emerso che la stimolazione con UTP è in grado di incrementare significativamente la migrazione dei progenitori emopoietici in risposta al gradiente chemioattrattivo di CXCL12, nonché la loro capacità adesiva. Le analisi citofluorimetriche condotte su cellule migranti sembrano inoltre suggerire che l’UTP agisca interferendo con le dinamiche di internalizzazione del recettore CXCR4, rendendo così le cellule CD34+ maggiormente responsive, e per tempi più lunghi, al gradiente attrattivo del CXCL12. Saggi di homing competitivo in vivo hanno parallelamente mostrato, in topi NOD/SCID, che la stimolazione con UTP aumenta significativamente la capacità dei progenitori emopoeitci umani di localizzarsi a livello midollare. Sono state inoltre indagate alcune possibili vie di trasduzione del segnale attivate dalla stimolazione di recettori P2Y con UTP. Esperimenti di inibizione in presenza della tossina della Pertosse hanno evidenziato il coinvolgimento di proteine Gαi nella migrazione dipendente da CXCL12 ed UTP. Ulteriori indicazioni sono provenute dall’analisi del profilo trascrizionale di cellule staminali CD34+ stimolate con UTP, con CXCL12 o con entrambi i fattori contemporaneamente. Da questa analisi è emerso il ruolo di proteine della famiglia delle Rho GTPasi e di loro effettori a valle (ROCK 1 e ROCK 2) nel promuovere la migrazione UTP-dipendente. Questi dati sono stati confermati successivamente in vitro mediante esperimenti con Tossina B di C. Difficile (un inibitore delle Rho GTPasi) e con Y27632 (in grado di inibire specificatamente le cinasi ROCK). Nel complesso, i dati emersi in questo studio dimostrano la capacità del nucleotide extracellulare UTP di modulare la migrazione in vitro di progenitori emopoietici umani, nonché il loro homing midollare in vivo. L’effetto dell’UTP su questi fenomeni si esplica in concerto con la chemochina CXCL12, attraverso l’attivazione concertata di vie di trasduzione del segnale almeno parzialmente condivise da CXCR4 e recettori P2Y e attraverso il reclutamento comune di proteine ad attività GTPasica, tra le quali le proteine Gαi e i membri della famiglia delle Rho GTPasi.

Background. Mesenchymal stem cells (MSC) may be of value in regeneration of renal tissue after damage, however lack of biological knowledge and variability of results in animal models limit their utilization. Methods. We studied the effects of MSC on podocytes ‘in vitro’ and ‘in vivo’ utilizing adriamycin (ADR) as a model of renal toxicity. The ‘in vivo’ experimental approach was carried out in male Sprague Dawley rats (overall 60 animals) treated with different ADR schemes to induce acute and chronic nephrosis. MSC were given a) concomitantly to ADR in tail vein or b) in aorta and c) in tail vein 60 days after ADR. Homing was assessed with PKH26-MSC. Results. MSC rescued podocytes from apoptosis induced by ADR ‘in vitro’. The maximal effect (80% rescue) was obtained with MSC/Podocytes co-culture ratio of 1:1 for 72 hours. All rats treated with ADR developed nephrosis. In no case MSC modified the clinical parameters (i.e. proteinuria, serum creatinine, lipids) but protected the kidney from severe glomerulosclerosis when given concomitantly to ADR. Rats given MSC 60 days after ADR developed the same severe renal damage. Only few MSC were found in renal tubule-interstitial areas after 1-24 hours from injection and no MSC was detected in glomeruli. Conclusions. MSC reduced apoptosis of podocytes treated with ADR ‘in vitro’. Early and repeated MSC infusion blunted glomerular damage in chronic ADR nephropathy. MSC did not modify proteinuria and progression to renal failure, that implies lack of regenerative potential in this model.

Background. Mesenchymal stem cells (MSC) may be of value in regeneration of renal tissue after damage, however lack of biological knowledge and variability of results in animal models limit their utilization. Methods. We studied the effects of MSC on podocytes ‘in vitro’ and ‘in vivo’ utilizing adriamycin (ADR) as a model of renal toxicity. The ‘in vivo’ experimental approach was carried out in male Sprague Dawley rats (overall 60 animals) treated with different ADR schemes to induce acute and chronic nephrosis. MSC were given a) concomitantly to ADR in tail vein or b) in aorta and c) in tail vein 60 days after ADR. Homing was assessed with PKH26-MSC. Results. MSC rescued podocytes from apoptosis induced by ADR ‘in vitro’. The maximal effect (80% rescue) was obtained with MSC/Podocytes co-culture ratio of 1:1 for 72 hours. All rats treated with ADR developed nephrosis. In no case MSC modified the clinical parameters (i.e. proteinuria, serum creatinine, lipids) but protected the kidney from severe glomerulosclerosis when given concomitantly to ADR. Rats given MSC 60 days after ADR developed the same severe renal damage. Only few MSC were found in renal tubule-interstitial areas after 1-24 hours from injection and no MSC was detected in glomeruli. Conclusions. MSC reduced apoptosis of podocytes treated with ADR ‘in vitro’. Early and repeated MSC infusion blunted glomerular damage in chronic ADR nephropathy. MSC did not modify proteinuria and progression to renal failure, that implies lack of regenerative potential in this model.

La ricerca sulle cellule staminali apre nuove prospettive per approcci di terapia cellulare. Molta attenzione è concentrata sulle cellule staminali isolate da membrane fetali, per la facilità di recupero del materiale di partenza, le limitate implicazioni etiche e le caratteristiche delle popolazioni di cellule staminali residenti. In particolare a livello dell’epitelio amniotico si concentra una popolazione di cellule (hAECs) con interessanti caratteristiche di staminalità, pluripotenza e immunomodulazione. Restano però una serie di limiti prima di arrivare ad un’applicazione clinica: l’uso di siero di origine animale nei terreni di coltura e le limitate conoscenze legate alla reazione immunitaria in vivo. La prima parte di questo lavoro è focalizzata sulle caratteristiche delle hAECs coltivate in un terreno privo di siero, in confronto a un terreno di coltura classico. Lo studio è concentrato sull’analisi delle caratteristiche biologiche, immunomodulatorie e differenziative delle hAECs. L’interesse verso le caratteristiche immunomodulatorie è legato alla possibilità che l’uso di un terreno serum free riduca il rischio di rigetto dopo trapianto in vivo. La maggior parte degli studi in vivo con cellule isolate da membrane fetali sono stati realizzati con cellule di derivazione umana in trapianti xenogenici, ma poco si sa circa la sopravvivenza di queste cellule in trapianti allogenici, come nel caso di trapianti di cellule di derivazione murina in modelli di topo. La seconda parte dello studio è focalizzata sulla caratterizzazione delle cellule derivate da membrane fetali di topo (mFMSC). Le caratteristiche biologiche, differenziative e immunomodulatorie in vitro e in vivo delle mFMSC sono state confrontate con i fibroblasti embrionali di topo. In particolare è stata analizzata la risposta immunitaria a trapianti di mFMSC nel sistema nervoso centrale (CNS) in modelli murini immunocompetenti.
The stem cell research opens new perspectives for cell therapy approaches. Much attention has been focused on stem cells isolated from fetal membranes, for the easy recovery of these tissues, the limited ethical implications and the characteristics of resident stem cells. In particular from the amniotic epithelium it is possible to isolate a population of cells (hAECs) with interesting characteristics of stemness, pluripotency and immunomodulation. However, before going to clinic there are some limitations to overcome: the use of culture media supplemented with animal serum and the limited knowledge related to immune reactions in vivo. The first part of this work is focused on the characterization of hAECs cultured in a serum-free medium, in comparison to a classical culture medium. The study is concerned with the biological, immunomodulatory and differentiation properties of hAECs. The interest towards immunomodulatory characteristics is related to the possibility that using a serum free medium could reduce the risk of grafts rejection after transplantation in vivo. The majority of in vivo studies with cells isolated from fetal membranes were carried out with human-derived cells in xenogeneic transplantation, but little is known about the survival of these cells in allogeneic settings, as for transplantation of murine cells in mouse models. The second part of this study is focused on the characterization of cells derived from murine fetal membranes (mFMSC). Biological characteristics, differentiation potential, in vitro and in vivo immunomodulatory properties of mFMSC has been compared with mouse embryonic fibroblasts. In particular we analyzed the immune response towards mFMSC grafted in the central nervous system (CNS) of immunocompetent mice.

La ricerca sulle cellule staminali apre nuove prospettive per approcci di terapia cellulare. Molta attenzione è concentrata sulle cellule staminali isolate da membrane fetali, per la facilità di recupero del materiale di partenza, le limitate implicazioni etiche e le caratteristiche delle popolazioni di cellule staminali residenti. In particolare a livello dell’epitelio amniotico si concentra una popolazione di cellule (hAECs) con interessanti caratteristiche di staminalità, pluripotenza e immunomodulazione. Restano però una serie di limiti prima di arrivare ad un’applicazione clinica: l’uso di siero di origine animale nei terreni di coltura e le limitate conoscenze legate alla reazione immunitaria in vivo. La prima parte di questo lavoro è focalizzata sulle caratteristiche delle hAECs coltivate in un terreno privo di siero, in confronto a un terreno di coltura classico. Lo studio è concentrato sull’analisi delle caratteristiche biologiche, immunomodulatorie e differenziative delle hAECs. L’interesse verso le caratteristiche immunomodulatorie è legato alla possibilità che l’uso di un terreno serum free riduca il rischio di rigetto dopo trapianto in vivo. La maggior parte degli studi in vivo con cellule isolate da membrane fetali sono stati realizzati con cellule di derivazione umana in trapianti xenogenici, ma poco si sa circa la sopravvivenza di queste cellule in trapianti allogenici, come nel caso di trapianti di cellule di derivazione murina in modelli di topo. La seconda parte dello studio è focalizzata sulla caratterizzazione delle cellule derivate da membrane fetali di topo (mFMSC). Le caratteristiche biologiche, differenziative e immunomodulatorie in vitro e in vivo delle mFMSC sono state confrontate con i fibroblasti embrionali di topo. In particolare è stata analizzata la risposta immunitaria a trapianti di mFMSC nel sistema nervoso centrale (CNS) in modelli murini immunocompetenti.
The stem cell research opens new perspectives for cell therapy approaches. Much attention has been focused on stem cells isolated from fetal membranes, for the easy recovery of these tissues, the limited ethical implications and the characteristics of resident stem cells. In particular from the amniotic epithelium it is possible to isolate a population of cells (hAECs) with interesting characteristics of stemness, pluripotency and immunomodulation. However, before going to clinic there are some limitations to overcome: the use of culture media supplemented with animal serum and the limited knowledge related to immune reactions in vivo. The first part of this work is focused on the characterization of hAECs cultured in a serum-free medium, in comparison to a classical culture medium. The study is concerned with the biological, immunomodulatory and differentiation properties of hAECs. The interest towards immunomodulatory characteristics is related to the possibility that using a serum free medium could reduce the risk of grafts rejection after transplantation in vivo. The majority of in vivo studies with cells isolated from fetal membranes were carried out with human-derived cells in xenogeneic transplantation, but little is known about the survival of these cells in allogeneic settings, as for transplantation of murine cells in mouse models. The second part of this study is focused on the characterization of cells derived from murine fetal membranes (mFMSC). Biological characteristics, differentiation potential, in vitro and in vivo immunomodulatory properties of mFMSC has been compared with mouse embryonic fibroblasts. In particular we analyzed the immune response towards mFMSC grafted in the central nervous system (CNS) of immunocompetent mice.

La fibrosi cistica (FC) è una malattia genetica letale, autosomica recessiva, causata dalla mutazione del gene Cystic Fibrosis Trasmembrane Conductance Regulator (CFTR) che codifica per una proteina canale che regola la conduzione transmembrana di cloro, cAMP- dipendente, espressa sul lato apicale delle cellule epiteliali. Il difetto di base dell’epitelio respiratorio nei pazienti è duplice ossia riguarda la secrezione di cloro e l’assorbimento di sodio. Ne deriva un alterato flusso di fluidi attraverso l’epitelio, con alterata clearance mucociliare respiratoria, cicli di infezioni batteriche e infiammazione ed infine grave danno polmonare. Principale causa di morbilità e mortalità è l’infiammazione cronica che colpisce il polmone. Sono stati scoperti farmaci agenti direttamente sulla CFTR ma non riescono a risolvere il difetto associato a tutte le mutazioni responsabili della FC. La terapia cellulare, invece, essendo agnostica per la mutazione, ha la possibilità di poter curare ogni paziente. Oltre al midollo osseo, nuova promettente fonte di cellule staminali è la membrana amniotica, da cui derivano cellule stromali mesenchimali amniotiche umane (hAMSC) che esprimono marcatori di staminalità e possono differenziare in cellule epiteliali respiratorie quando co-coltivate con cellule epiteliali bronchiali umane immortalizzate (CFBE14o-), omozigoti per l’allele F508del, mutazione più frequente nella FC. Le co-colture mostrano un’aumentata espressione e funzionalità della CFTR e una parziale correzione di altri difetti di base associati alla FC. Poiché tali risultati vengono ottenuti solo nelle co-colture, è stato supposto che un contatto diretto tra hAMSC e CFBE14o- sia necessario per il recupero di tali difetti. Uno degli obiettivi di questa tesi è stato comprendere il ruolo della comunicazione intercellulare, mediata dalle gap junctions (GJ), nelle co-colture studiate per l’espressione e la funzionalità della proteina Cx43, una delle principali componenti delle GJ, silenziando o meno le stesse con un siRNA diretto contro l’mRNA di interesse. I risultati evidenziano il ruolo fondamentale delle GJ nella correzione dei difetti di base associati alla FC da parte delle hAMSC. Si è, quindi, indagato quale messaggero molecolare potesse essere trasmesso attraverso le GJ e, eventualmente, mediare l’effetto terapeutico delle hAMSC. Anche i microRNA (miRNA) vengono trasferiti attraverso le GJ ed è stato dimostrato il loro coinvolgimento nei livelli di espressione della CFTR. In particolare, miRNA-138 aumenta l’espressione della CFTR interagendo con la proteina SIN3A. Sono stati quindi studiati i livelli di miRNA-138 mediante droplet digital PCR. I dati preliminari mostrano come le cellule wild-type abbiano dei livelli più alti di miRNA-138 rispetto alle CFBE14o- con un trend all’aumento nelle co-colture. Ulteriore obiettivo è stato studiare se le hAMSC possano velocizzare la rigenerazione dell’epitelio respiratorio bronchiale e la chiusura delle lesioni che continuamente si formano sotto lo stimolo infiammatorio cronico nei polmoni dei pazienti con FC. I risultati dimostrano che le hAMSC aggiunte ad una ferita indotta su un monostrato di CFBE14o-, sono in grado di riparare il danno con la stessa tempistica richiesta ad una ferita simulata su monostrato di cellule epiteliali bronchiali wild type. Questi studi indicano la possibile utilità terapeutica delle cellule hAMSC nella malattia polmonare associata alla FC, sebbene ulteriori studi sul loro meccanismo d’azione e in modelli più vicini alla patologia umana siano necessari.
Cystic fibrosis (CF) is a lethal, autosomal recessive inherited genetic disease caused by mutation on the Cystic Fibrosis Trasmembrane Conductance Regulator (CFTR) gene encoding a cAMP-dependent channel protein that regulates transmembrane conduction of chloride, which is expressed on the apical membrane of epithelial cells. The basic defect of the airway epithelium in CF patients is due to a double defect in chloride secretion and sodium absorption that lead to an altered flow of fluids through the epithelium of the airways, resulting in an alteration of the airway’s mucociliary clearance, opportunistic bacterial infections, inflammation and severe lung damage. The main cause of morbidity and mortality is chronic inflammation affecting the lung. New drugs have been developed recently to act directly on the CFTR protein, in order to rescue the mutated CFTR processing and function. However, there are still mutations that still failed to be rescued by CFTR modulators. Cell therapy, on the other hand, being agnostic for mutation, has the possibility of being able to cure every patient. Recently have been investigated stem cells as potential therapeutic sources for CF. In addition to the bone marrow, stem cells derived from the amniotic membrane, human amniotic mesenchymal stem cells (hAMSC) are very promising as they express stem cells markers and can differentiate into respiratory epithelial cells when they are co-cultured with immortalized human bronchial epithelial cells (CFBE14o-), homozygous for the F508del allele, the most frequent mutation in CF. The co-cultures also show an increased processing and conductance of the CFTR protein and a partial correction of other basic defects associated with the disease. Since these results are obtained only in co-cultures, it has been assumed that direct contact between hAMSC and CFBE14o- is necessary for the recovery of these defects. One of the objectives of this thesis was to understand the role of intercellular communication, mediated by gap junctions (GJ), in co-cultures that were studied for the expression and functionality of the Cx43 protein, one of the main components of GJ, before and after their silencing, obtained using a siRNA directed against the mRNA of interest. The results highlighted the fundamental role of GJ in the correction of the basic defects associated with CF by hAMSC. It was further investigated which molecular messenger could be transmitted through the GJ and, possibly, mediate the therapeutic effect of hAMSC. MicroRNAs (miRNAs) are also transferred across GJ and their involvement in the expression levels of the CFTR protein has been demonstrated. In particular, miRNA-138 increases the expression of the CFTR protein by interacting with the SIN3A protein. The levels of miRNA-138 were then investigated by droplet digital PCR. Preliminary data show that wild-type CFTR cells have higher levels of miRNA-138 than cells with F508del mutation and that there is an upward trend in co-cultures. A further objective of the study was to investigate whether hAMSC can speed up the regeneration of the airway bronchial epithelium and the closure of the injury that continuously form under the chronic inflammatory stimulus in the lungs of CF patients. The results demonstrate that hAMSC added to a wound induced on a monolayer of CFBE14o-, are able to repair the damage with the same timing required for a simulated wound on a monolayer of wild type CFTR bronchial epithelial cells. Taking to account the data generated in the current study, it indicates the possible therapeutic utility of hAMSC in lung disease associated with CF. However, further studies on their mechanism of action conducted in models with closer resemblance to human CF pathology are required.

All acquired or congenital cholestatic diseases (primary biliary cirrhosis, sclerosing cholangitis, pediatric biliary atresia) represent one of major indications for liver transplantation. In the last 20 years new and innovative cell-based therapeutic strategies using post-natal multipotent stem cells have been characterised and proposed for hepatic surgery. This work develops a research program aimed to identify and isolate adult stem cells from an easy and ethic approved source like Wharton jelly (CCO) for liver applications in particular for cholangiopathies. In perspective, CCO cells have been in vitro stimulated with specific inducers in order to test their ability to differentiate into cholangiocyte-like cells. By cytometrical analysis, the isolated fibroblastic populations have showed to be positive for stem cell markers like CD105, CD90, CD133 and negative for CD45, cKit, CD44 and HLA-DR. Although cell immunophenotype revealed to keep stable all over subculturing, after 15 passages a significative percentage increase of CD133, CD44 and cKit positive cells has been observed. Similarly to stem cells defined as “migrating”, CCO populations expressed mRNAs for matrix metalloproteinases such as MMP2, MMP3. Moreover, they showed to respond to differentiative adipogenic, osteogenic and chondrogenic stimula until XV culture passage, as demonstrated by cytoplasmic lipid droplets and expression of specific markers as perlecan, Runx-2, osteocalcin and osteopontin. In order to evaluate the cholangiocyte differentiative potential of CCOs, it has been set on: a) 2D culture system based on unconditionated plates; b) 3D culture system for studying the in vitro tubulogenesis using a scaffold constituted of collagen type 1 and MatrigelTM (MATCO); c) MATCO coating-based culture system. After 7 days of stimulation, by immunofluorescence and cytometrical analysis, cells cultured in 2D system demonstrated the expression of typical cholangiocite markers as CK19 and GGT-1. The MATCO matrix prepared as a coating layer showed to sustain the differentiaton of CCOs into cholangiocyte-like cells. Indeed, by RT-PCR study, the encapsulated cells into MATCO demonstrated to express only GGT-1 marker and, by morphogenesis study, resulted not to be organized into tubular like structures. When induced and cultured on MATCO coating, CCOs showed similarities to cholangiocytes as demonstrated by the expression of mRNAs for GGT-1, CK19, MMP1, MMP2 and aquaporin 1. No expression of ALB, INTβ4, HNF1B. So, the present work demonstrated that, using a standadized procedure, it is possible to isolate from Wharton jelly a multipotent stem cell population, characterized by stable immunophenotype, long-term growth and responsivity to cholangiocyte differentiative stimulus on unconditioned plates or on matrix prepared with collagen type 1 and MatrigelTM. The in vivo study using a biliary damage model will permit to evaluate the real differentiative potential of CCO populations.
Le malattie colestatiche croniche congenite o acquisite (cirrosi biliare primitiva, colangite sclerosante, atresia pediatrica delle vie biliari) rappresentano nel loro insieme una delle principali indicazioni al trapianto di fegato. Nell’ultimo ventennio, nuove ed innovative strategie terapeutiche basate sull’impiego di cellule staminali adulte, ovvero cellule staminali multipotenti identificate in tessuti diversi dell’organismo in età postnatale, sono state caratterizzate e proposte in chirurgia epatica. Tale ricerca si inserisce in un programma di studio che in campo epatologico mira all’identificazione di popolazioni cellulari staminali adulte (CCO), che, isolate da una fonte di facile accesso ed eticamente approvata quale la gelatina di Wharton., possono rappresentare candidati ideali per la terapia cellulare delle colangiopatie. In tale prospettiva, le popolazioni cellulari CCO sono state stimolate in vitro con fattori induttivi per testare la loro capacità di differenziare in cellule simil colangiociti. All’analisi di citofluorimetria, le popolazioni fibroblastoidi ottenute hanno mostrato positività all’espressione di marcatori di staminalità quali CD105, CD90, CD133 e negatività alla presenza di CD45, cKit, CD44 e HLA-DR. Sebbene l’immunofenotipo si sia mantenuto stabile nel corso delle subcolture, è stato osservato, dopo 15 passaggi, un significativo aumento percentuale di cellule positive per i marcatori CD133, CD44 e cKit. Similmente alle popolazioni cellulari staminali definite “migranti”, le popolazioni CCO presentano mRNA specifici per le metalloproteinasi di matrice quali MMP2 e MMP3 e rispondono agli stimoli differenziativi in senso adipogenico, osteogenico e condrogenico fino alla subcoltura XV, come dimostrato dai tipici accumuli lipidici citoplasmatici e dall’espressione di specifici marcatori quali il perlecano, Runx-2, osteocalcina ed osteopontina. Per valutare il grado di potenzialità differenziativa colangiocitaria sono stati allestiti a) un sistema di coltura bidimensionale per semina su piastre di polistirene non condizionate, b) un sistema di coltura tridimensionale per lo studio della tubulogenesi in vitro mediante incapsulazione delle cellule in una matrice di collagene 1 e Matrigel (MATCO), c) un sistema di coltura su coating di matrice MATCO. Dopo 7 giorni di stimolazione, le cellule coltivate nel sistema bidimensionale hanno dimostrato, all’analisi di immunofluorescenza e di citofluorimetria, l’espressione di marcatori tipici di linea colangiocitaria quali CK19 e GGT-1. La matrice MATCO si è dimostrata adatta a sostenere il differenziamento delle cellule CCO in senso simil-colangiocitario solo nella forma di substrato. Infatti, all’analisi d’espressione mediante RT-PCR le cellule incapsulate in MATCO hanno dimostrato dopo trattamento induttivo la sola espressione di RNA messaggero per il marcatore GGT-1 e, all’analisi di morfogenesi, non hanno evidenziato alcuna organizzazione simil tubulare. Le cellule CCO differenziate su coating MATCO hanno acquisito caratteristiche simili a quelle dei colangiociti come dimostrato dall’espressione di mRNA per i marcatori GGT-1, CK19, MMP1, MMP2 e acquaporina 1. Non è stata osservata l’espressione di marcatori quali ALB, INTb4 e fattore HNF1B. Dal presente studio è quindi emerso che, mediante una procedura standardizzata, è possibile isolare da gelatina di Wharton una popolazione cellulare staminale multipotente, dotata di caratteristiche immunofenotipiche stabili, potenziale di crescita a lungo termine in vitro e capace di rispondere allo stimolo differenziativo colangiocitario su piastre di polistirene condizionate o meno con una matrice di collagene 1 e matrigel. L’impianto in vivo in un modello animale di danno biliare consentirà la valutazione del reale potenziale differenziativo delle popolazioni CCO.

In recent years the stem cells are subject of intensive studies because they are able to differentiate in different types of cells and they can be use for regenerative therapies. In particular we are interested to the care of several acquired or genetic cardiac diseases that they are characterized by rhythm disturbances. These diseases include for example severe bradycardia, Sick Sinus Syndrome, atrio-ventricular block and heart block and often the pharmacological treatment is not always applicable. The our major object is to create a biological pacemaker, generally intended as cell substrates with the same features of native sinoatrial node (SAN) myocytes. So far, murine and human embryonic stem cells have been shown to differentiate into pacemaker myocytes, with electrical and molecular characteristics similar to those of SAN cells. Embryonic stem cells are at the moment one of the most promising cell sources for regenerative but they have different ethical and immunological problems. For this purpose we intend to study different type of adult stem cells and, in particular, a population of hematopoietic stem cells CD34+ isolated from umbilical cord blood and a class of vessel-associated clonogenic, self-renewing progenitor cells, called Mesoangioblasts, Mabs. In this work we investigated whether CD34+ endothelial progenitor cells acquire spontaneous beating and pacemaker properties by using a co-culture system onto neonatal cardiac. We found that the CD34+ cells acquire a spontaneously contractile phenotype but it were the result of fusion events between cardiac myocytes and CD34+-derived cells, as assessed by double color labeling experiment and high throughput FACS analysis. Furthermore the electrophysiological properties investigated did not show any difference between EGFP+ cells and neonatal cardiac myocytes, supporting the hypothesis that these autorhythmic cells derive indeed from a fusion events between electrically passive CD34+ cells with cardiac myocytes. Furthermore we have shown that ventricle-derived Mabs when cultured in low-serum medium spontaneously differentiate into cardiomyocytes that express typical cardiac ion channels. A distinct feature of cardiac MABs not described previously in other adult cardiac stem cells is the high spontaneous rate of cardiac differentiation, which allows the prospective use of these cells for systemic delivery and in vivo transplantation. Cardiac MABs express several factors involved in early cardiac differentiation, among these such as Isl-1, Tbx2, Tbx3, GATA-6 are especially relevant to the development of the cardiac conduction system. Upon differentiation, cardiac MABs often displayed spontaneous activity which involved large, syncronous foci, suggesting that at least a fraction of these cells were capable of self-generating action potentials. We have identified a novel type of adult stem cells, the MdPCs, as the subpopulation of cardiac vessel-derived Mabs which differentiate into a pacemaker cell-like phenotype. The cardiac differentiation potency, the expression of HCN channels underlying spontaneous activity and the sensitivity to autonomic modulation of rate are features especially suitable to a potential use of these cells as a substrate for developing implantable biological pacemakers. The major limitation of the use of mesoangioblasti is the low rate of proliferation and cardiac differentiation. One way to overcome the limitations imposed by the use of pluripotent stem cells derived from adult tissues. Two such types of cells are presently available: induced pluripotent stem (iPS) cells and pluripotent stem cells derived from testis. iPS are somatic cells reprogrammed by exogenous expression of a series of genes involved in the maintenance of ES cell pluripotency (Oct3/4, Sox2, c-Myc and Klf4 for murine cells and Oct4, Sox2, nanog and lin28 for human cells). While these cells have the advantage of not being immunogenic, they still require genetic manipulation which could potentially impair their therapeutic application. Recent data have shown that spermatogonial stem cells (SSCs), which are normally located on the basal membrane of the seminiferous tubules and are responsible for spermatogenesis, can in vitro become pluripotent cells which differentiate into derivatives of all three embryonic germ layers and form teratomas when injected in animals. We have developed a protocol of enzymatic and mechanical dissociation from wild type and transgenic mouse. The most promising protocol is the use of transgenic mouse that express the protein reporter GFP under control of trascritional factor Oct4. At the moment we obtained single cells Oct4+/EGFP+ that remain in colture until seven days but we must apply further analysis to find the optimal conditions to enable the survival and the proliferation of this cells.

RIASSUNTO E SCOPO DEL LAVORO Esiste una stretta correlazione tra obesità e osteoporosi: nell'obesità si riscontra una maggiore fragilità ossea ed un ridotto assorbimento di calcio a livello intestinale, mentre l'osteoporosi è spesso accompagnata da un aumento dell'adipogenesi midollare. In questi ultimi anni un'area della ricerca scientifica si è concentrata sullo studio di nuovi farmaci/sostanze in grado di agire sull'adipogenesi o sull'osteoblastogenesi in quanto è fondamentale trovare nuove terapie che prevengano tali patologie. Conoscendo la stretta relazione tra il differenziamento adipogenico e osteogenico, un farmaco contro l'obesità non dovrebbe avere effetti sul metabolismo osseo, mentre contro l'osteoporosi non dovrebbe avere effetti sull'adipogenesi. A tale proposito gli studi in vitro rappresentano un punto importante sia per valutare l’effetto di tali sostanze che per comprendere i meccanismi alla base delle loro azioni. La maggior parte degli studi condotti sul differenziamento adipocitico, e sulla sua inibizione, sono stati condotti su linee di preadipociti murini (3T3-L1) o umani, mentre sono state utilizzate linee murine MC3T3-E1 e C3H10T1/2 per il differenziamento osteogenico. Nonostante la rilevanza dei dati ottenuti grazie a questi modelli cellulari, i risultati sono spesso controversi, anche in considerazione del fatto che i processi differenziativi nell’uomo e nei roditori possono essere regolati a livello molecolare in modo significativamente diverso. Inoltre questi modelli sono basati su cellule già indirizzate verso il differenziamento adipocitico o osteogenico, e quindi non prendono in considerazione il processo di determinazione che porta la cellula progenitrice ed indifferenziata verso un lineage mesengenico. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) in questo contesto rappresentano un modello cellulare particolarmente utile in quanto possono essere efficacemente indotte da uno stato indifferenziato allo stato di adipociti o osteoblasti, di cui peraltro rappresentano fisiologicamente i precursori biologici. Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare l'effetto di Acido Valproico (AVP), Valpromide (VPM), Berberina (BRB), Hibiscus Sabdariffa (HIB) e Resveratrolo (RESV) sul differenziamento adipogenico e osteogenico di cellule staminali mesenchimali umane (hMSC). Le hMSC utilizzate in questo studio sono state caratterizzate e corrispondono ai criteri minimi stabiliti dalla letteratura (Dominici et al., 2006) per poterle definire MSC. Tre le condizioni necessarie: capacità di aderire alla plastica assumendo una morfologia simil-fibroblastica; negatività per i marker ematopoietici CD34 e CD45 e positività per i marker CD29, CD90, CD105 e CD73; capacità, sotto opportune condizioni di coltura, di differenziare nei lineage mesengenici ovvero in osteoblasti, condroblasti ed adipociti. Questo lavoro si è articolato in 5 fasi: 1) Valutazione della tossicità delle diverse sostanze. Per valutare la tossicità delle sostanze precedentemente elencate, le hMSC indifferenziate e le MSC differenziate in senso adipogenico e osteogenico sono state trattate con ciascuna delle diverse sostanze a differenti concentrazioni e sono stati effettuati saggi di vitalità. Sono stati condotti due tipi di test: MTT assay, che valuta l'attività mitocondriale come indicatore della vitalità cellulare e SRB assay, che valuta il contenuto proteico per stimare il numero delle cellule vitali. Sulla base dei risultati ottenuti sono state individuate le concentrazioni non tossiche dei diversi composti da utilizzare negli esperimenti successivi. 2) Effetto delle diverse sostanze sul differenziamento adipogenico e osteogenico. A partire da hMSC indifferenziate è possibile studiare l’intero processo adipogenico trattando le cellule con un terreno (DMEM high glucose) di induzione contenente fattori adipogenici (desametasone 1μM, indometacina/isobutilmetilxantina 100μM/500μM, insulina 10μg/ml) per i primi 10 giorni e successivamente, fino al 28° giorno, con un terreno di mantenimento (contenente insulina 10μg/ml) per la maturazione in senso adipogenico. Le diverse sostanze sono state somministrate alle hMSC sin dal momento dell'induzione e portate fino al 28° giorno di differenziamento adipogenico. L'effetto anti-adipogenico è stato valutato mediante colorazioni istologiche specifiche per i trigliceridi presenti nei depositi lipidici degli adipociti: la colorazione con Oil Red O per osservare la morfologia cellulare mentre la colorazione Nile Red, esaminata mediante citofluorimetro a flusso, per determinare il numero di cellule differenziate. I risultati dimostrano che AVP, BRB, HIB e RESV presentano un effetto anti-adipogenico, mentre VPM non ha dimostrato avere effetto sul differenziamento adipogenico. Successivamente è stato valutato l'effetto di AVP, VPM e HIB aggiunte dopo 3, 7, 10, 14 e 21 giorni dall'induzione adipogenica e analizzate tutte al 28°giorno. Con questi dati abbiamo dimostrato che solo AVP ha un effetto anti-adipogenico, anche quando viene aggiunto dopo 3 o 7 giorni dall'induzione. L'aggiunta di VPM e HIB a tempi diversi dall'induzione non ha portato a delle variazioni significative rispetto alle hMSC indotte con solo il terreno adipogenico. Per il differenziamento osteogenico le hMSC sono state trattate con uno specifico terreno (DMEM low glucose) contenente fattori osteogenici (desametasone 100nM, acido ascorbico 2-fosfato 50μM e βglicerolo 2-fosfato10mM) fino al 28° giorno. La valutazione del differenziamento osteogenico è stata effettuata mediante la colorazione istologica Alizarin red S, che evidenzia la deposizione di calcio mineralizzato. Le diverse sostanze, alle dosi precedentemente scelte, sono state aggiunte inizialmente al terreno osteogenico delle hMSC e portate fino al 28°giorno di trattamento. Da questi esperimenti abbiamo ottenuto risultati differenti per le diverse sostanze valutate. AVP e VPM determinano un precoce differenziamento osteogenico delle hMSC rispetto alle cellule trattate con solo il terreno di differenziamento. Infatti in presenza di AVP e VPM il differenziamento si osserva già dopo 10gg rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico. BRB e HIB presentano invece un effetto anti-osteogenico, poichè con l’aggiunta di queste sostanze nel terreno non si osserva deposito di matrice mineralizzata e la colorazione istologica risulta negativa. Le cellule trattate con RESV non mostrano differenze significative rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico. Successivamente per AVP, VPM e HIB è stato valutato l'effetto della sostanza aggiunta dopo 3, 7, 10, 14 e 21 giorni dall'induzione osteogenica e analizzate tutte al 28°giorno. Da questi dati abbiamo dimostrato che HIB ha un effetto anti-osteogenico anche quando aggiunta dopo 3, 7, 10 e 14 giorni dall'induzione. L'aggiunta di AVP e VPM a tempi diversi dall'induzione non ha portato variazioni significative rispetto alle hMSC indotte con solo il terreno osteogenico. 3) Valutazione dell'effetto delle sostanze sulla fosforilazione di ERK1/2 durante il differenziamento adipogenico e osteogenico. Mediante esperimenti di immunoblotting abbiamo studiato la fosforilazione (forma attiva) di ERK1/2 per poter capire i meccanismi molecolari alla base delle azioni di tali sostanze nei due diversi differenziamenti. Nelle hMSC, trattate per il differenziamento adipogenico con l'aggiunta di AVP, VPM, BRB, HIB e RESV non si sono osservate variazioni significative nella fosforilazione di ERK1/2 rispetto alle hMSC indotte con solo il terreno adipogenico. Nel differenziamento osteogenico abbiamo osservato a 10giorni una riduzione significativa della forma fosforilata di ERK1 nelle cellule trattate con VPM o BRB rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico; la forma fosforilata di ERK2 non varia. A 14giorni solo le cellule trattate con terreno osteogenico e BRB presentano una riduzione significativa di entrambe le forme pERK1/2 rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico. 4) Valutazione dell'effetto di Acido Valproico, Valpromide e Hibiscus Sabdariffa sui livelli di fosforilazione di GSK3β e di espressione di βcatenina. Per comprendere meglio il meccanismo d'azione di AVP, VPM e HIB abbiamo studiato, mediante esperimenti di immunoblotting, i livelli di fosforilazione (forma inattiva) di GSK3β e i livelli di espressione di βcatenina nelle hMSC trattate per il differenziamento adipogenico e osteogenico con l'aggiunta delle tre sostanze. Per quanto riguarda il differenziamento adipogenico solo a 3giorni di induzione abbiamo osservato nelle hMSC indotte al differenziamento con l'aggiunta di AVP un aumento significativo di pGSK3β, rispetto alle hMSC trattate con solo il terreno adipogenico. Analizzando i livelli di βcatenina a 12ore, 1, 3giorni non abbiamo rilevato variazioni significative tra le hMSC indotte al differenziamento adipogenico sia in presenza che in assenza delle sostanze. Analizzando i dati relativi al confronto tra le hMSC indotte al differenziamento osteogenico, in presenza o assenza delle sostanze, non abbiamo riscontrato differenze significative nei livelli di pGSK3β per tutti i tempi analizzati. Abbiamo osservato una riduzione significativa nei livelli di βcatenina a 3, 10 e 14giorni in hMSC trattate per il differenziamento osteogenico con l'aggiunta di AVP, mentre solo a 10giorni si osserva una riduzione significativa di βcatenina anche per le hMSC trattate con VPM rispetto alle hMSC indotte con solo terreno osteogenico. 5) Valutazione dell'effetto di Acido Valproico, Valpromide e Hibiscus Sabdariffa sull'espressione genica di C/EBPβ, PPARγ, RUNX2 e OSTERIX. Infine è stato valutato, mediante qPCR, l’effetto di AVP, VPM e HIB sull'espressione genica di C/EBPβ, PPARγ, RUNX2 e OSTERIX (importanti fattori trascrizionali adipogenici e osteogenici) durante il differenziamento adipogenico e osteogenico di hMSC. Dai risultati ottenuti si osserva che le hMSC indotte al differenziamento adipogenico con l'aggiunta di AVP hanno dei livelli di espressione significativamente maggiori per C/EBPβ e significativamente minori per PPARγ rispetto alle hMSC indotte con solo terreno adipogenico. Durante il differenziamento osteogenico si osserva un aumento significativo di Runx2 nelle hMSC trattate con AVP rispetto alle hMSC indotte con solo terreno osteogenico. L'analisi dei nostri risultati ha evidenziato che la sostanza più promettente per un eventuale uso terapeutico sembra essere l’Acido Valproico perché, oltre ad inibire il differenziamento adipogenico, sembra avere un effetto pro-osteogenico sulle hMSC indotte al differenziamento osteogenico anche se saranno necessari ulteriori studi per comprendere a pieno il meccanismo d'azione di tale sostanza.

Gli adipociti rappresentano una popolazione cellulare mesenchimale naturalmente presente nel midollo osseo umano. In questo specifico microambiente gli adipociti possono interagire con una varietà di cellule differenti, il loro ruolo però è in larga parte sconosciuto. Questo lavoro ha lo scopo di caratterizzare molecolarmente e funzionalmente gli adipociti maturi isolati dal midollo osseo umano (BM-A) per studiare il loro ruolo nel microambiente emopoietico. Gli BM-A normali sono stati isolati dopo digestione con collagenasi e filtrazione, studiata la loro morfologia, la loro espressione genica, il profilo immunofenotipico e la loro capacità funzionale nel microambiente emopoietico, sono stati poi confrontati con gli adipociti derivati da tessuto adiposo (AT-A). Gli BM-A hanno una forma sferica di dimensioni assai variabili, caratterizzata dalla presenza nel citoplasma di un unico vacuolo lipidico che occupa, da solo, più del 90% del volume cellulare ed un piccolo nucleo appiattito, caratteristiche simili agli AT-A che non vengono perse in coltura, inoltre, come gli AT-A, esprimono alcuni antigeni di superficie tipici delle cellule staminali. In linea con queste osservazioni, i dati molecolari hanno mostrato che gli BM-A esprimono alcuni geni delle cellule staminali embrionali necessari per il self-renewal e la pluripotenza, come Oct4, Klf4, c-myc, GATA4, Tbx1 e Sox17, ma non esprimono i marcatori Sox2 e Nanog. Inoltre gli adipociti da BM esprimono Dio2 e CIDEA, regolatori di termogenesi, mentre risultano negativi per Prdm16 e UCP1, marker molecolari degli adipociti bruni. Questi risultati, suggeriscono che gli BMA esprimono il fenotipo molecolare del grasso bianco con un importante ruolo nell’attività metabolica.
Adipocytes are a cell population largely located in the human bone marrow cavity. In this specific microenvironment where adipocytes can interact with a variety of different cells, the role of fat is mainly unknown. To our knowledge, this report is the first to characterize mature adipocytes isolated from human bone marrow (BM-A) molecularly and functionally to better understand their roles into the hematopoietic microenvironment. Healthy BM-A were isolated after collagenase digestion and filtration. We studied the morphology of BMA, their gene expression and immunophenotypic profile and their functional ability in the hematopoietic microenvironment, comparing them with adipocytes derived from adipose tissue (AT-A). BM-A showed a unilocular lipid morphology similar to AT-A and did not lose their morphology in culture; they showed a comparable pattern of stem cell-surface antigens to AT-A. In line with these observations, molecular data showed that BM-A expressed some embryonic stem cells genes, such as Oct4, KLf4, c-myc, Gata4, Tbx1, and Sox17, whereas they did not express the stem cell markers Sox2 and Nanog. Moreover, BM-A had long telomeres that were similar to bone marrow mesenchymal stem cells. Notably, BM-A supported the survival and differentiation of hematopoietic stem cells in long-term cultures. These results showed that BM-A are stromal cells with a gene expression pattern that distinguished them from AT-A. BM-A showed stem cell properties through their hematopoietic supporting function, which was certainly linked to their role in the maintenance of the bone marrow microenvironment. Depending on specific demands, BM-A may acquire different functions based on their local environment.

L’attività di ricerca ha riguardato lo studio di popolazioni di cellule staminali mesenchimali umane (MSC) ottenute da molteplici tessuti adulti. Sono state investigate sorgenti di MSC alternative al midollo osseo, libere da conflitti etici, dotate di vantaggi per l’applicabilità clinica che vanno dalla elevata resa nel recupero cellulare alla tessuto-specificità. Le cellule ottenute dalle diverse sorgenti sono state caratterizzate immunofenotipicamente, commissionate mediante protocolli di induzione specifici per i diversi tipi cellulari ed analizzate con opportuni saggi istologici, immunoistochimici, di espressione genica e proteica. Esperimenti di cocoltura hanno permesso la descrizione di capacità immunomodulatorie e trofiche. - La placenta a termine risulta essere una ricca sorgente di cellule staminali mesenchimali (MSC). Dalla membrana amniotica, dal corion e dalla gelatina di Wharton del cordone ombelicale sono state ottenute MSC con potenzialità differenziative verso commissionamenti mesenchimali, con capacità immunomodulatorie e trofiche. Tali tessuti sono ampiamente disponibili, garantiscono una elevata resa nel recupero cellulare e sono liberi da conflitti etici. - Due popolazioni di cellule con caratteristiche di MSC sono state individuate nella mucosa e nella sottomucosa intestinale. Queste cellule possiedono caratteristiche di tessuto-specificità, sono dotate di attività trofiche ed immunomodulatorie che potrebbero essere vantaggiose per approcci di terapia cellulare in patologie quali le Malattie Infiammatorie Croniche Intestinali (IBD). - Popolazioni di cellule staminali con caratteristiche simili alle MSC sono state ottenute da isole pancreatiche. Tali popolazioni possiedono vantaggi di tessuto-specificità per approcci di terapia cellulare per il Diabete. - Sono stati investigati ed individuati marcatori molecolari (molecole HLA-G) correlati con il livello di attività immunomodulatoria delle MSC. La valutazione di tali marcatori potrebbere permettere di determinare l’attività immunosoppressiva a priori del trapianto, con l’obiettivo di scegliere le popolazioni di MSC più adatte per l’applicazione e di definirne il dosaggio. - E’ stato messa a punto una metodica e una strumentazione per il frazionamento di cellule staminali in Campo Flusso in assenza di marcatura (NEEGA-DF). Questa metodica permette di discriminare sottopopolazioni cellulari in base a caratteristiche biofisiche.

L’attività di ricerca ha riguardato lo studio di popolazioni di cellule staminali mesenchimali umane (MSC) ottenute da molteplici tessuti adulti. Sono state investigate sorgenti di MSC alternative al midollo osseo, libere da conflitti etici, dotate di vantaggi per l’applicabilità clinica che vanno dalla elevata resa nel recupero cellulare alla tessuto-specificità. Le cellule ottenute dalle diverse sorgenti sono state caratterizzate immunofenotipicamente, commissionate mediante protocolli di induzione specifici per i diversi tipi cellulari ed analizzate con opportuni saggi istologici, immunoistochimici, di espressione genica e proteica. Esperimenti di cocoltura hanno permesso la descrizione di capacità immunomodulatorie e trofiche. - La placenta a termine risulta essere una ricca sorgente di cellule staminali mesenchimali (MSC). Dalla membrana amniotica, dal corion e dalla gelatina di Wharton del cordone ombelicale sono state ottenute MSC con potenzialità differenziative verso commissionamenti mesenchimali, con capacità immunomodulatorie e trofiche. Tali tessuti sono ampiamente disponibili, garantiscono una elevata resa nel recupero cellulare e sono liberi da conflitti etici. - Due popolazioni di cellule con caratteristiche di MSC sono state individuate nella mucosa e nella sottomucosa intestinale. Queste cellule possiedono caratteristiche di tessuto-specificità, sono dotate di attività trofiche ed immunomodulatorie che potrebbero essere vantaggiose per approcci di terapia cellulare in patologie quali le Malattie Infiammatorie Croniche Intestinali (IBD). - Popolazioni di cellule staminali con caratteristiche simili alle MSC sono state ottenute da isole pancreatiche. Tali popolazioni possiedono vantaggi di tessuto-specificità per approcci di terapia cellulare per il Diabete. - Sono stati investigati ed individuati marcatori molecolari (molecole HLA-G) correlati con il livello di attività immunomodulatoria delle MSC. La valutazione di tali marcatori potrebbere permettere di determinare l’attività immunosoppressiva a priori del trapianto, con l’obiettivo di scegliere le popolazioni di MSC più adatte per l’applicazione e di definirne il dosaggio. - E’ stato messa a punto una metodica e una strumentazione per il frazionamento di cellule staminali in Campo Flusso in assenza di marcatura (NEEGA-DF). Questa metodica permette di discriminare sottopopolazioni cellulari in base a caratteristiche biofisiche.

La tesi esamina i diversi profili di intersezione tra istanze di innovazione della ricerca scientifica e rispetto dei principi fondamentali del diritto penale. Nel primo capitolo, dopo un'attenta e dettagliata analisi della fattispecie di sperimentazione sugli embrioni umani, viene rilevata l'esigenza di effettuare un contemperamento tra la tutela dell'embrione e la liberta' della ricerca scientifica, soprattutto per quanto concerne le possibili destinazioni degli embrioni soprannumerari in condizioni di abbandono. Nell'ambito del secondo capitolo, rilevano le valutazioni compiute sul concetto di "dignita'", sulla base di un approccio multidisciplinare tra la filosofia del diritto, la bioetica e il diritto penale. La configurazione del bene giuridico della "dignita' umana" come interesse della collettivita' risulta funzionale a reprimere la strumentalizzazione del genere umano, in un'ottica di apertura "bilanciata" alla liberta' della scienza medica nel campo dell'impiego di cellule staminali embrionali. E' condotto, altresi', un giudizio sull'irragionevolezza del trattamento sanzionatorio apprestato dalla legge n. 40/2004 per le fattispecie "aggravanti" del delitto di sperimentazione. Nel terzo capitolo, viene affrontato l'esame comparatistico dei diversi modelli di regolamentazione rinvenibili tra gli Stati membri dell'UE, al fine di evidenziare le cause che impediscono un'armonizzazione europea in materia.
Doctoral thesis considers aspects of connection between advances in stem cell research and principles of criminal law. In the first chapter, after an analysis of the crime of experiment with human embryos, the author deals with necessary balance between protection of scientific research and safeguard of supernumeraries embryosà à à ¢ life. In the second chapter, the author examines the concept of à à à ¢ human dignityà à à ¢ , showing thoughts of philosophers and criminal lawà à à ¢ s experts. Configuration of à à à ¢ human dignityà à à ¢ as a collective right can allow a strong repression of human speciesà à à ¢ exploitation, made by embryosà à à ¢ cloning. The author examines disproportion of penalities provided, too. In the third chapter, the author examines possibilities of a criminal harmonisation in the EU about embryo research

The aim of this study was to better define, by immunohistochemistry, the molecular markers of renal stem/progenitor cells localized in the different niches of ten human preterm kidneys with gestational age ranging from 11 up to 25 weeks. Our data evidence the existence of multiple stem/progenitor pools in different zones of the human developing kidney that are characterized by different phenotypes: capsular stem cells were EMA (MUC1)+, MDM2+, Vimentin+ and Wnt1+; progenitors of the sub-capsular nephrogenic zone were MDM2+ and Wnt1+; cap mesenchymal cells were EMA (MUC1)+, CD15+, vimentin+, Wt1+, CD10+, Bcl2+, Wnt1+ and PAX2+; interstitial progenitor cells were Vimentin+, Wt1+ and α1Anti-tripsin +. Our data evidence the existence of multiple stem/progenitor cell pools in the fetal and neonatal human kidney. Progenitors of these different pools are characterized by a peculiar phenotype, indicating a different differentiation stage of these renal progenitors. A better knowledge of the molecular markers expressed by renal stem/progenitors might represent a relevant datum for researchers involved in renal regenerative medicine.

B-cell Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL) is the most common leukemia in adults and is characterized by the accumulation of mature clonal CD5+ B lymphocytes in peripheral blood, bone marrow and lymphoid tissues. The defect in programmed cell death favours the disease progression through a prolonged survival of malignant cells and the induction of the drug-resistance. The defective apoptosis of B-CLL cells is not only due to intrisic defects of the leukemic clone, but also to extrinsic factors that influence its behavior in the tissue microenvironment. Since the accumulation of monoclonal B cells is also supported by their interaction with surrounding cells, we focused our attention on mesenchymal stem cells (MSCs) in order to evaluate their role in survival and localization of neoplastic clone. MSCs can be isolated, expanded with high efficiency and induced to differentiate into multiple mesenchymal lineages under appropriated colture conditions. In addition, they show crucial immunoregulatory properties suppressing several T-, B- and NK-cell functions and affecting dendritic cell activities. In the present study MSCs isolated from the bone marrow of 47 B-CLL patients were expanded ex vivo and characterized through fluocytometric analysis and differentiation coltures (adipocytes and osteocytes). While MSCs from B-CLL patients exhibited normal phenotype and differentiation capacities, when co-coltured with neoplastic B cells they exherted an anti-apoptotic effect reducing lymphocyte apoptosis. After 7 days of colture in presence of CLL-MSC, we observed a relevant extended survival of leukemic cells, but not of normal B lymphocytes. The same effect was observed on B-CLL cells isolated from 3 patients treated with pro-apoptotic compounds, suggesting an involvement of MSCs in drug-resistance. Finally, chemotaxis tests showed the ability of MSCs to produce molecules promoting migration and localization of neoplastic B cells in bone marrow. Taken together, these findings suggest that MSCs derived from patients with B-CLL, despite an apparent normal phenotype and normal differentiation ability, provide survival signals to neoplastic cells extending their lifespan and producing chemotattic factors favouring their accumulation in the bone marrow.
La leucemia linfatica cronica di tipo B (LLC-B) è la forma più comune di leucemia nell’adulto ed è caratterizzata dall'accumulo clonale di piccoli linfociti B CD5+ nel sangue periferico, nel midollo osseo e negli organi linfatici, dovuto sia ad un aumento della proliferazione che ad un difetto dei meccanismi di morte cellulare programmata. La resistenza all’apoptosi in questi linfociti favorisce la progressione della malattia attraverso un’aumentata sopravvivenza del clone neoplastico e l’induzione della resistenza ai farmaci citostatici. Tali alterazioni sono imputabili sia a fattori intrinseci che a fattori estrinseci derivanti dal microambiente. Poiché l’aumentata sopravvivenza ed il progressivo accumulo del clone linfocitario risultano selettivamente favoriti dall'interazione con cellule accessorie non tumorali presenti nel microambiente in cui esso risiede, in questa tesi abbiamo focalizzato l’attenzione sulle cellule mesenchimali staminali (MSC), allo scopo di valutare il loro ruolo nella sopravvivenza e nella compartimentalizzazione del clone B leucemico. Le MSC costituiscono una frazione esigua (inferiore allo 0,01%) della popolazione di cellule midollari, sono cellule staminali multipotenti in grado di differenziare in diversi tessuti di origine mesenchimale; sono inoltre dotate di proprietà immunomodulatorie verso linfociti B, T, Natural Killer e cellule dendritiche. In questa tesi le MSC sono state isolate dal sangue midollare di 47 pazienti affetti da LLC-B e sono state caratterizzate fenotipicamente e funzionalmente mediante analisi citofluorimetrica (positività per CD73, CD90 e CD105, negatività per CD31, CD34 e CD45) e colture differenziative (adipociti ed osteociti) confrontandole con MSC di donatori sani. Successivamente si sono allestite co-colture di linfociti B di pazienti affetti da LLC e MSC allo scopo di valutare l’effetto delle MSC sul clone neoplastico di LLC. Le MSC ottenute dai pazienti non hanno presentato alterazioni dal punto di vista fenotipico né funzionale rispetto alle MSC di donatori sani, tuttavia esse hanno sviluppato interazioni capaci di favorire la sopravvivenza del clone leucemico. Gli esperimenti di co-coltura hanno dimostrato infatti che le MSC esercitano un effetto anti-apoptotico sui linfociti B neoplastici, documentato da un aumento significativo della sopravvivenza delle cellule B di LLC dopo 7 giorni di coltura, effetto verificatosi anche con MSC di donatori sani e invece molto meno marcato nei linfociti B normali. Tale attività anti-apoptotica si è osservata, seppur di minore intensità, anche nei linfociti B di pazienti sottoposti a trattamento chemioterapico in vivo con Fludabarina e Ciclofosfamide, suggerendo che le MSC possano essere implicate anche nei meccanismi di chemio resistenza del clone di LLC. Infine l’analisi della migrazione cellulare dei linfociti B patologici in presenza di terreno condizionato derivante dalle colture di MSC ha dimostrato la capacità delle MSC di produrre stimoli chemiotattici in grado di richiamare in sede midollare il clone maligno, ma non i linfociti B normali. I dati riportati suggeriscono che le MSC nei pazienti affetti da LLC-B, sebbene non mostrino alterazioni dal punto di vista fenotipico e funzionale, svolgono un ruolo attivo nel favorire la sopravvivenza e la compartimentalizzazione delle cellule B neoplastiche a livello midollare.

Bone, a specialized connective tissue, consists of cells and mineralized extracellular matrix. The main cell types of bone tissue are: the osteoblasts, the osteocytes and the osteoclasts. Osteoblasts produce extracellular matrix, osteoclasts are responsible of its resorption, hence bone physiology is a delicate balance between synthesis of new bone and resorption of the old one. Osteoporosis is a disease in which catabolic activity of osteoclasts overtakes anabolic activity of osteoblasts leading to increased bone resorption and progressive bone fragility. Primary osteoporosis is a common disease among post-menopausal female population. Pathologies as diabetes mellitus, hyperparathyroidism and long-term treatment with glucocorticoids cause secondary osteoporosis. Glucocorticoid-induced osteoporosis is the most common type of secondary osteoporosis. Glucocorticoid treatment is a well known method to induce osteoporosis in animal models, hence it could be an example of “translational model” in which injured bone could be repopulated by stem cells or progenitors in clinical trials. The aim of this thesis is to investigate whether preosteoblasts could repopulate injured bone in an animal model treated with glucocorticoids. Preosteoblasts have been isolated from newborn calvariae of GFP mice. In these cells, expression of the osteogenic marker Runx2 has been assessed by Real time PCR, while osteogenic potential has been analysed by cytochemistry assays to detect alkaline phosphatase and mineralized bone nodules (Alizarin Red and Von Kossa staining). To realize the in vivo model, C57BL/6 three months aged mice have been divided into three groups [group I (n=4): mice not treated with drug and not infused with cells, group II (n=4): mice treated with drug and not infused with cells, group III (n=4): mice treated with drug and infused with cells]. Drug (methylprednisolone) has been administered for one month with a dose of 75 mg/Kg/week. In mice of group III, 5 x 105 GFP preosteoblasts, previously expanded in vitro, have been infused with injection into the tail vein. Mice have been sacrificed, tibial and femoral bones have been harvested, processed and analysed by istomorphometry and immunoistochemistry. Expression of Runx2, osteonectin (SPARC) and alkaline phosphatase (ALP) in these tissues has been detected with Real time PCR. In vitro preosteoblasts produce alkaline phosphatase during early time in culture with normal medium, while the level decreases in differentiating conditions with medium containing ascorbic acid and β-glycerophosphate. Preosteoblasts maintained in differentiation medium for 30 days are positive to Alizarin and Von Kossa staining, hence they are able to produce mineralized extracellular matrix that is a feature of functional mature osteoblasts. Runx2 expression increases during differentiating conditions; in cells maintained in differentiation medium for 30 days there is an increase of 50% compared to cells maintained in normal medium (p<0.05). In mice of group III an increased level of parameters concerning osteoid has been detected (O.Th, OS/BS, OV/BV) and an increased number of active osteoblasts (during synthetic activity) has been observed compared to group II. Between these two groups, significant variations of bone volume (BV/TV), trabecular thickness (Tb.Th), trabecular number (Tb.N) and trabecular separation (Tb.Sp) have not been detected. Microarchitecture parameters (Nd.N/TV, Nd/Tm) have not been affected. Similar results have been obtained from inderect microarchitecture parameters as Marrow Star Volume and Fractal Dimension. Real time PCR analysis revealed a reduction in osteogenic gene expression in group II compared to group I (ALP: -50%, p<0.01; Runx2: -56.75%, p<0.01; SPARC: -44.5%, p<0.05). In group III there is a recovery of expression of osteogenic markers (ALP: +40%, p<0.05; Runx2: +66.28%, p<0.001; SPARC: +55%; p<0.01) compared to group II. Immunoistochemistry is under investigation. In our glucocorticoid-induced osteoporosis model we sacrificed mice only one week after infusion of cells, this preparatory investigation shows that our model induces the engraftment of preosteoblasts in injured bone. However, a longer time, at least of 1-2 months, is needed to investigate if preosteoblasts are able not only to graft onto host tissue, but also to proliferate in vivo and to differentiate in full mature and functional osteoblasts.
L’osso è un tessuto connettivo specializzato costituito da cellule e matrice extracellulare mineralizzata. Le cellule principali sono gli osteoblasti, gli osteociti e gli osteoclasti. Gli osteoblasti depongono la matrice ossea, mentre gli osteoclasti sono i responsabili del suo riassorbimento. La fisiologia dell’osso è quindi il risultato di un delicato equilibrio tra deposizione di matrice ossea e suo riassorbimento. Quando l’azione catabolica degli osteoclasti è maggiore rispetto a quella anabolica degli osteoblasti si produce una progressiva fragilità ossea che porta ad un quadro clinico osteoporotico. L’osteoporosi primaria colpisce soprattutto la popolazione femminile dopo la menopausa. Molte patologie come il diabete mellito, l’iperparatiroidismo ed il trattamento a lungo termine con glucocorticoidi causano l’osteoporosi secondaria. L’osteoporosi indotta da glucocorticoidi è la più comune causa di osteoporosi secondaria. Il trattamento con glucocorticoidi è un noto procedimento di induzione dell’osteoporosi in modelli animali e può dunque rappresentare un primo esempio di modello “traslazionale” potenzialmente applicabile in clinica per indurre un ripopolamento dell’osso con cellule staminali mesenchimali o precursori osteogenici. Lo scopo di questo lavoro è stato pertanto valutare nel modello animale se sia possibile ripopolare l’osso danneggiato con preosteoblasti. I crani di topi neonati transgenici (GFP) sono stati prelevati e messi in coltura per ottenere preosteoblasti. Nelle colture in vitro è stata valutata l’espressione del gene Runx2 con la tecnica di Real time PCR, mentre la capacità osteogenica è stata analizzata con colorazioni citochimiche per la fosfatasi alcalina e per la deposizione di matrice ossea mineralizzata (Alizarin Red e Von Kossa). Per la realizzazione del modello in vivo topi C57BL/6 maschi di 3 mesi sono stati divisi in 3 gruppi [gruppo I (n=4): topi non trattati con farmaco e non infusi con cellule; gruppo II (n=4): topi trattati con farmaco non infusi con cellule; gruppo III (n=4): topi trattati con farmaco ed infusi con cellule]. Il farmaco (metilprednisolone) è stato somministrato per un mese alla dose di 75 mg/Kg/settimana. Negli animali appartenenti al gruppo III sono state infuse, attraverso iniezione nella vena della coda, 5 x 105 preosteoblasti GFP precedentemente espansi in vitro. I topi sono stati sacrificati, le tibie ed i femori sono stati prelevati e processati per l’analisi istomorfometrica e della microarchitettura ossea e per l’ immunoistochimica. In questi tessuti, l’espressione genica di Runx2, osteonectina (SPARC) e fosfatasi alcalina (ALP) è stata valutata tramite Real time PCR. In vitro i preosteoblasti producono fosfatasi alcalina durate i primi giorni di coltura in medium non differenziante, mentre il livello decresce in condizioni differenzianti, cioè in medium contenente acido ascorbico e β-glicerofosfato. I preosteoblasti mantenuti in medium di differenziamento per 30 giorni sono positivi alle colorazioni Alizarin Red e Von Kossa, quindi sono in grado di produrre matrice ossea mineralizzata, caratteristica degli osteoblasti funzionali e maturi. L’espressione del gene Runx2 aumenta durante il differenziamento, si ha un aumento del 50% nelle cellule differenziate per 30 giorni rispetto alle cellule non differenziate (p<0.05). L’inoculazione dei preosteoblasti nei topi del gruppo III ha evidenziato un aumento dei parametri statici di neoformazione ossea relativi all’osteoide (O.Th, OS/BS, OV/BV) ed un aumento del numero di osteoblasti attivi, cioè in corso di deposizione di osteoide, rispetto al gruppo II. Tra questi due gruppi non si sono osservate, invece, variazioni significative in termini di volume osseo (BV/TV), spessore trabecolare (Tb.Th) numero delle trabecole (Tb.N) e separazione fra esse (Tb.Sp). Non sono state rilevate, inoltre, differenze dei parametri di microarchitettura (Nd.N/TV, Nd/Tm). Risultati simili sono emersi dalla valutazione dei parametri indiretti di microarchitettura (Marrow Star Volume e Fractal Dimension). L’espressione genica ha dimostrato che nel gruppo II si ha una riduzione dell’espressione dei geni osteogenici rispetto al gruppo I (ALP: -50%, p<0.01; Runx2: -56.75%, p<0.01; SPARC: -44.5%, p<0.05). Nel gruppo III si è avuto un recupero dell’espressione dei geni osteogenici (ALP: +40%, p<0.05; Runx2: +66.28%, p<0.001; SPARC: +55%, p<0.01) rispetto al gruppo II. I campioni di tessuto per l’ immunoistochimica devono essere processati. Nel nostro modello sperimentale di osteoporosi indotta da glucocorticoidi nel topo, abbiamo sacrificato gli animali solo una settimana dopo l’infusione delle cellule; questi dati preliminari dimostrano che il nostro modello induce l’engraftment dei preosteoblasti nell’osso danneggiato. Tuttavia è richiesto un tempo di osservazione più lungo, di almeno 1-2 mesi per valutare se le cellule trapiantate siano in grado, non solo di integrarsi nel tessuto dell’ospite, ma anche di proliferare in vivo e di differenziare in osteoblasti maturi e funzionali.

Mouse embryonic stem cells (ESCs) can be differentiated into spontaneously beating cell aggregates called Embryoid Bodies (EBs) which contain cells with functional and electrical properties of sinoatrial myocytes. These cells represent a small fraction of the subset of cardiomyocytes and an even a smaller fraction of the total cells composing the EBs. This work is aimed to isolate a homogeneous population of cardiac progenitors which specifically differentiate into pacemaker cardiomyocytes. We used transient expression, during cardiomyocyte differentiation, of CD166(or ALCAM, activated leukocyte cell adhesion molecule) to isolate cardiomyocyte progenitors from differentiating EBs. ESC have been cultured and differentiated as previously described1. CD166+ cells were sorted by flow cytometry and analyzed by quantitative RT-PCR, immunofluorescence and electrophysiology analyses. The data show that CD166+ cells isolated from 8 days-old EBs express significantly higher levels of cardiac genes (sarcomeric α-actinin, Mef2c, cTnI, Gata4) than both CD166- and undifferentiated ES cells. Our data also show that CD166+ cells express transcription factors involved in the generation of the conduction system (Shox2, Tbx18, Tbx3 and Isl-1) and genes typical of pacemaker myocytes (HCN4, HCN1, ssTnI) while expressing very low levels of typical ventricular genes (Nkx2-5, Cx43, HCN2). When CD166+ cells are allowed to re-aggregate for 24h in suspension and are then plated, they form a layer of synchronously beating cells that generate spontaneous action potentials modulated by autonomic neurotransmitters. Importantly, these cells can be maintained in culture for more than four weeks without losing their pacemaker activity. In conclusion our data show that ES-derived CD166+ cells isolated from differentiating EBs represent a population of cardiomyocytes, with the molecular and functional features of pacemaker cells, that can be cultured, in vitro, for long periods and can thus represent a suitable cellular pacemaker in cell therapy interventions.

In recent years, numerous cancers have been described as having a "cancer stem cell" (CSC) population also known as "cancer initiating cells". CSCs refer to a subset of tumour cells that has the ability to self-renew and generate the diverse cells that comprise the tumor. Their name derives from their "stem-like" properties and ability to continually sustain tumorigenesis. CSCs have the same properties that define a normal tissue adult stem cell, even if they are aberrant: self-renewal and differentiation. Renal cell carcinoma (RCC) accounts for about 3% of adult cancers and is among the 10 most common malignancies in Europe. RCC has several morphological subtypes and clear cell RCC accounts for ~80% of cases. RCC has a late diagnosis and is therapy resistant. In renal pathologies there are situation in which the presence and function of adult renal stem cells may have clinical relevance. In the last years the existence of different sources of renal stem cells has been proposed even if the phenotype of a resident stem cell of the kidney has not been exhaustively described. Even in RCC the definition of a kidney cancer stem cell may have a role for better understanding renal cell carcinoma biology. A number of approaches based on the exploitation of renal stem cell markers have allowed the prospective isolation of human renal stem cells, even if the relative promiscuity of these markers limits their usefulness when highly purified stem cells are needed. So we decided to use a functional approach for the isolation of normal and cancer stem cells of the kidney by culturing the cells in suspension, non-adherent conditions, at low density with specific growth factors. In these conditions only a little percentage of cells survives growing as spherical aggregates in suspension. We called them "nephrospheres". Using fluorescent lipophilic dyes PKH, we demonstrated the clonal origin of the spheres and the presence of a heterogeneous population inside the spheres. In fact the dye dilutes in active replicating cells while is retained in quiescent cells; we can observe in normal and cancer nephrospheres some most fluorescent cells, the quiescent stem cells, and some less fluorescent or not fluorescent cells, that are the active replicating progenitors. We performed a characterization of the nephrospheres by immunofluorescence after cytospin or FACS evaluating the expression of some epithelial and stem cell markers. By Real Time PCR we found that some genes related with stemness or involved in the maintenance of pluripotency are overexpressed in normal and cancer nephrospheres if compared with the corresponding differentiated primary cell cultures. We then evaluated the differentiative abilities of the cells derived from normal nephrospheres by culturing the cells in specific media and semisolid substrates; the cells are able to differentiate into epithelial and neuronal-like phenotype and to form tubular/glomerular-like tridimensional structures. We the isolated the stem cell population form normal nephrospheres on the basis of the PKH fluorescence. We identified 3 PKH populations: PKHhigh population, with a high level of fluorescence, PKHlow population, with a low level of fluorescence, and PKHneg population, negative for PKH. The populations were separated with cell sorting and cultivated to form spheres. Only PKHhigh cells were able to generate new spheres, demostrating that the PKHhigh cells represent the stem cell population inside the nephrospheres. Normal and cancer PKHhigh cells will be deeply characterized in the future.