Littérature scientifique sur le sujet « Cellule progenitrici endoteliali »

In questa seconda parte, l’attenzione viene focalizzata sulle “cellule staminali non embrionali”, cioè le cellule staminali somatiche (di origine fetale o adulta) e le cellule staminali del sangue del cordone ombelicale. Queste cellule, spesso definite “cellule staminali adulte”, sono state identificate prima delle cellule staminali embrionali. Infatti, l’espressione stessa di cellula “staminale” deriva dall’identificazione delle cellule staminali emopoietiche nel midollo osseo (1961). Più tardi le ricerche hanno evidenziato la presenza di tali cellule immature, multipotenti, che si auto-rinnovano e si auto-differenziano pressoché in tutti i tessuti ed organi del feto e dell’adulto. Appena scoperte, queste cellule staminali “adulte” hanno trovato subito un impiego terapeutico con i primi trapianti di midollo osseo per il trattamento di patologie, maligne e non, del sangue e del sistema linfoide. Oggi le cellule staminali emopoietiche sono usate anche nel trattamento di malattie auto-immuni, come la sclerosi multipla o il lupus erythematosus e nella medicina rigenerativa. Una seconda fonte importante di cellule staminali “adulte” è rappresentata dalle cellule staminali mesenchimali, situate principalmente nel midollo osseo, progenitrici di vari ceppi cellulari: osso, cartilagine, muscolo, tessuto adiposo e astrociti. Queste cellule sembrano avere un ruolo-chiave nella rigenerazione dei tessuti. Sono stati isolati diversi tipi di cellule mesenchimali multipotenti, con proprietà paragonabili a quelle delle cellule staminali embrionali. Il più noto è quello delle MAPCs di Catherine Verfaillie. Queste cellule sono usate clinicamente per vari scopi, tra cui la rigenerazione del miocardio infartuato, l’angiogenesi terapeutica in pazienti con ischemia periferica acuta (specialmente la malattia di Buerger) e il bioengineering (rivestimento cellulare di legamenti o di valvole cardiache sostitutive). In questo ambito si sono registrati risultati incoraggianti nell’animale per il trattamento delle malattie neurodegenerative, dell’ictus, del trauma cerebrale e dei danni del midollo spinale. Sono stati isolati molti altri tipi di cellule staminali “adulte” le cui proprietà riparatrici sono state verificate con successo nell’animale: cellule staminali neuronali (per il morbo di Parkinson, la sclerosi multipla, il morbo di Huntington, l’ictus, il trauma cerebrale, le lesioni del midollo spinale), cellule staminali muscolari (per l’incontinenza urinaria, il danno miocardico), cellule staminali endoteliali (per l’ischemia acuta periferica), cellule staminali cardiache, cellule staminali della retina (per la degenerazione maculare), cellule staminali del limbus della cornea (per il danno corneale). Allo stato attuale, i risultati clinici più promettenti si sono ottenuti con le cellule staminali del sangue del cordone ombelicale (UCB), che hanno portato allo sviluppo di un’area di mercato caratterizzata dalla creazione di banche private di UCB. Generalmente le cellule UCB provocano, al massimo, una reazione immune piuttosto blanda quando vengono trapiantate in soggetti con donatori non compatibili. Si usano con successo laddove sia necessaria una riparazione o rigenerazione nell’organismo del ricevente. I migliori risultati con cellule staminali UCB, fino ad ora, sono stati ottenuti nel trattamento di bambini con morbo di Krabbe. Benefici si sono ottenuti anche dal trapianto locale di cellule UCB in pazienti con danni al midollo spinale. ---------- In this second part of the article, the attention is focused on “non embryonic stem cells”, that is somatic stem cells (from fetus or adult organisms), and umbilical cord blood stem cells. These stem cells, sometimes referred to as “adult stem cells”, were known and recognized as such before the embryonic ones. In fact the mere expression “stem” cells to designate this particular type of immature cell, from which derive all the others, more differentiated cells, came from the identification of the hematopoietic stem cells, in bone marrow (1961). Later investigations have shown that there are such cells, immature, multipotent, self-renewing, and self-differentiating ones in almost all tissues and organs of fetus or adult organism. As soon as they were discovered, these “adult”, autologous stem cells were immediately put in the service of patients, with the first transplantations of bone marrow performed either for the treatment of malignancies, or for the treatment of hematologic disorders. Today, autologous hematopoietic stem cells are also used for the treatment of auto-immune diseases, such as multiple sclerosis or lupus erythematosus and for regenerative medicine. A second, important source of “adult” stem cells are the mesenchymal stem cells, found mainly in bone marrow, but also in blood, progenitors of multiple cell lineages, including bone, cartilage, muscle, adipose tissue and astrocytes, and which seem to hold the key to tissue regeneration. Different types of multipotent mesenchymal stem cells, with properties comparable to those of embryonic stem cells, have been isolated, the best known being the multipotent adult progenitor cells (MAPCs). These cells are used clinically mainly for the healing of the heart after myocardial infarction, with positive statistically significant results, for therapeutic angiogenesis in patients suffering of peripheric ischemic disease (especially Buerger’s disease), and for bioengineering (cellular coating of artificial ligaments or of prosthetic heart valves). They have given promising results in animals for the treatment of neurodegenerative diseases, ictus, brain trauma and spinal cord injuries. Many other types of “adult” stem cells have been isolated and their healing properties assessed with success in animals, such as neural stem cells (for Parkinson’s disease, multiple sclerosis, Huntington’s disease, ictus, brain trauma, spinal cord injury), muscle stem cells (for urinary incontinence, myocardial infarction), endothelial stem cells (for critical limb ischemia), cardiac stem cells, retinal stem cells (for macular degeneration), limbal stem cells (for damaged cornea). At the moment, the more promising results in patients have been obtained with umbilical cord blood stem cells (UCB), prompting the birth of a commercial trade based on private banks. Umbilical cord blood stem cells offer indeed the advantage of their immaturity: as such, they rarely trigger more than a mild immune reaction when transplanted in unrelated recipient organisms. They are used with profit wherever a healing or regenerative process is necessary in a given patient. Up to now, best results with the UCB cells have been obtained in the treatment of children with Krabbe’s disease. Some patients with injured spinal cords have also experienced benefits from UCB cells grafts.

Title: Role and potential of endothelial progenitor cells in cerebral vasospasm Abstract: Background and aim: Despite many treatment approaches, cerebral vasospasm and delayed ischemic neuronal damage (DIND) still represent a serious threat to patients with subarachnoid haemorrhage (SAH). Endothelial progenitor cells (EPC) have been involved as prognostic indicators in several vascular diseases and mesenchymal stem cells already have shown some benefits in ischemic injury. Aim of this study was to investigate the therapeutic potential of endothelial progenitor cells (EPC) and mesenchymal stem cells (MSC) in attenuating or preventing vasospasm and DIND in patients with SAH. Methods: Given the emergent role of DIND as a result of multifactorial hypoperfusion stress in the outcome of SAH patients, the efficacy of EPC and MSC in reducing neuronal damage has been evaluated in an in vitro model of ischemia, namely the oxygen glucose deprivation (OGD), on primary rat cortical neuronal cultures. Further, we tested in a clinical observational study SAH patients with and without vasospasm for different recruitment patterns of circulating EPC. To this purpose arterial blood samples were collected at various timepoints from admission to discharge of the patients. On these samples real-time quantitative PCR (RT-qPCR) was performed to detect gene expression relative to EPCs, since cytofluorimetric analysis appeared not sensitive enough to detect this rare cell population. Results: Though present results need further confirmation, in vitro it was observed that both MSC and EPC treatment through conditioned medium or co-culture in transwell- although with some differences - mediate a survival advantage for OGD stressed neurons. Furthermore stem cell mediated treatment showed efficacy even when applied 24 hours after OGD stress induction. RT-qPCR results from a small sample of SAH patients might indicate an early mobilization of EPC related gene expression in subjects that do not develop vasospasm with a peak around day 4, whereas the expression of these genes remain invariably low in patients that develop vasospasm as in controls not affected by SAH. Conclusions: MSCs and EPCs seem to have an important potential role in preventing DIND in vitro as well as EPC recruitment might associate with lack of vasospasm in SAH patients. Further studies are needed to confirm these results and to prove a causal relationship between EPCs and vasospasm protection.

Accumulating evidences showed that bone marrow endothelial cells play a key role in neoplastic angiogenesis. In neoplastic progression they are more circulating endothelial cells than in remission or in health volunteers. Some circulating endothelial cells are characterized by a mature well differentiated phenotype while other entothelial cell show antigens of progenitor cells indicating that these circulating endothelial progenitor cells (EPC) might be inside in angiogenic tissues and take active part in angiogenesis of new vessels, in particular in neoplasia. It is demonstrated that circulating endothelial cells (CEC) are characterized by a limited proliferating capacity, while EPC, coming from bone marrow, have got a elevated proliferating capacity. Bone marrow endothelial cells can contribute to neoplastic angiogenesis. Increasing evidences suggest that angiogenesis is involved in pathology of hematological malignant diseases included Multiple Myeloma (MM), Acute Myeloid Leukemia (AML), Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). Taken together these findings suggest that angiogenesis plays a role in progression of oncohematological disease by synthesis of pro angiogenetic factors and neoplastic cells, mimicking a endothelial activity, taking part in synthesis of new vascular net-works by a autocrine loop, promoting leukemic progression. To clarify whether CEC in MM, in AML and in CLL originate from cancer, we evaluated 8 patients with deletion of 13q (5 with MM and 3 with Monoclonal Uncertain Gammopathy), 7 patients with AML and 74 patients with CLL with known cytogenetic abnormalities; we extracted CEC by immunomagnetic sorting from circulating cells and we characterized CEC by immunophenotype analysis and by Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). In CLL we performed also a gene expression profile of 12 samples of CEC from patients with CLL using microarrays of 33.000 genes and comparing the results with gene expression profile of 2 health volunteers. The findings of these studies have shown that CEC levels both in MM and in AML and in CLL are increased compared to CEC levels in health volunteers or to CEC levels of patients in remission. Entothelial cell are in part endothelial progenitor cell (EPC) characterized by CD133 surface expression, a early endothelial marker lost during maturation of endothelial cell. FISH analysis highlighted that endothelial cells are positive for know cytogenetic abnormalities of MM, AML and CLL. Gene expression profiling in CEC of CLL has showed a well defined genetic pattern whose genes are involved in neoplastic progression and in neo-vasulogenesis identifying a cellular population co-expressing endothelial and lymphatic genes (CD19, von Willebrand Factor, VEGFR2). In conclusion our findings suggest that in MM, AML and in CLL, CEC are increased, are tumor related, show a EPC immuno phenotype and have a gene expression profile not only of endothelial cells but also of hematological malignance; in particular we find a increased expression of genes involved in proliferation, progression and angiogenesis. CEC can contribute to neoplastic angiogenesis and to progression acting as a sort bridgehead on which more numerous and possibly more specialized and functional active non clonal bone marrow derived EPCs could actively differentiate in mature vessels and contribute to tumor neovascularization and spreading. The results presented in this study, by showing a subset of CEC harbors cytogenetic abnormalities, suggest several theories. First, ECs and hematologic malignancies may derive from the same multipotent hemangioblast precursor cell; alternatively we may advocate theory about dedifferentiation, trans differentiation or theory of cellular fusion even if the last seems unlikely. Findings about CEC might play a key role non only in understanding of hematological malignancies biological specific features of but also in translation of new anti-angiogenic therapies to the clinic.

Caratterizzazione di EPC in pazienti con malattia renale cronica. Background: Gli effetti del recettore della vitamina D (VDR)e dell'espressione dell' osteocalcina (OCN), così come VDR agonista terapia (VDRA) su circolanti cellule progenitrici endoteliali (EPCs) non è stato ancora chiarito. Metodi: sono state analizzat EPCs in 23 controlli sani e 53 pazienti sottoposti a dialisi. La percentuale di EPCs (CD34+KDR+CD133+/-CD45-) VDR+/- o OCN+/- è stata analizzata in citometria a flusso e correlata con molecole coinvolte nelle malattie. Risultati: EPCs aumentano nei pazienti con CKD trattati con VDRAs. EPCsOCN +/- in pazienti non trattati con VDRAs correlano positivamente con il calcio sierico e reticolociti, e negativamente con DKK1. La percentuale di EPCsVDR +/- correla negativamente con OPN.  EPCsOCN + nei pazienti trattati con VDRAs correla positivamente con la vitamina D. La percentuale di EPCsVDR +/- positivamente correla con IL-6. Conclusioni: la terapia VDRA influenza l'espressione VDR e di OCN su EPCs circolanti. Dal momento che l'espressione OCN può contribuire alla calcificazione vascolare, ipotizziamo un putativo effetto pro-calcificazione di VDRA. Effetti immunomodulatori di EPO. Background: Il cloruro di sodio spinge l'induzione di cellule TH17 patogeni e TH1. La correzione dell'anemia con eritropoietina (EPO) è associato ad un miglioramento della tolleranza del trapianto di rene. Prove emergenti indicano che queste osservazioni possano essere eritropoiesi-indipendente e che l'EPO presenta proprietà immunosoppressive. Metodi: esaminato gli effetti del trattamento con EPO e sale su cellule T umana, apoptosi e la produzione di INF-γ, l'effetto sulla iTh17 e iFoxP3. Le cellule sono state analizzate con l'analisi di citometria a flusso. Risultati: NaCl aumenta la proliferazione di CD4+ e CD8+, iTh17 e la produzione di INFγ. Questo effetto è prevenuto da EPO. EPO aumenta l'induzione di Foxp3. Non cambia l'apoptosi e la stabilità di FoxP3. EPO è in grado di contiene l'effetto pro infiammatorio del sale
First project: Characterization of EPCs in patients with CKD. Background: The effects of vitamin D receptor (VDR) and osteocalcin (OCN) expression as well as VDR agonist (VDRA) therapy on circulating endothelial progenitor cells (EPCs) has not been elucidated yet. Methods: we therefore analyzed EPCs in 23 healthy controls and 53 patients undergoing dialysis. The percentage of EPCs (CD34+CD133+/-KDR+CD45-) expressing VDR or OCN were analyzed using flow cytometry and correlated with molecules involved in diseases. Results: EPCs increase in CKD patients treated with VDRAs. EPCsOCN+/- in patients untreated with VDRAs correlated positively with serum calcium and reticulocytes, and negatively with DKK1. The percentage of EPCsVDR+/- correlated negatively with OPN. EPCsOCN+ in patients treated with VDRAs correlated positively with vitamin D. The percentage of EPCsVDR+/- correlated positively with IL-6. Conclusions: our data suggest that VDRA therapy influence VDR and OCN expression on circulating EPCs. Since OC expression may contribute to vascular calcification, we hypothesize a putative pro-calcifying effect of VDRA. Second project: Immunomodulatory effects of EPO. Background: Sodium chloride drives the induction of pathogenic TH17 cells and TH1. Correction of anemia with erythropoietin (EPO) is associated with improved kidney transplant outcomes. Emerging evidence indicates that these observations may be erythropoiesis-independent and that EPO exhibits immunosuppressive properties. Methods: examined the effects of treatment with EPO and salt on human T-cell alloimmunity, the apoptosis and the production to INF-γ, the effect on iTh17 and iFoxP3. The cells were analyzed with flow cytometry analysis. Results: NaCl increases the proliferation of CD4+ and CD8+ cells, iTh17 and the production of INFγ. This effect is prevented by EPO. EPO increases the induction of Foxp3. It does not change the apoptosis and stability of FoxP3. Epo contains the inflammatory effect of NaCl. EPO in the kidney, where NaCl is high, may have a tolerance effect.

Caratterizzazione di EPC in pazienti con malattia renale cronica. Background: Gli effetti del recettore della vitamina D (VDR)e dell'espressione dell' osteocalcina (OCN), così come VDR agonista terapia (VDRA) su circolanti cellule progenitrici endoteliali (EPCs) non è stato ancora chiarito. Metodi: sono state analizzat EPCs in 23 controlli sani e 53 pazienti sottoposti a dialisi. La percentuale di EPCs (CD34+KDR+CD133+/-CD45-) VDR+/- o OCN+/- è stata analizzata in citometria a flusso e correlata con molecole coinvolte nelle malattie. Risultati: EPCs aumentano nei pazienti con CKD trattati con VDRAs. EPCsOCN +/- in pazienti non trattati con VDRAs correlano positivamente con il calcio sierico e reticolociti, e negativamente con DKK1. La percentuale di EPCsVDR +/- correla negativamente con OPN.  EPCsOCN + nei pazienti trattati con VDRAs correla positivamente con la vitamina D. La percentuale di EPCsVDR +/- positivamente correla con IL-6. Conclusioni: la terapia VDRA influenza l'espressione VDR e di OCN su EPCs circolanti. Dal momento che l'espressione OCN può contribuire alla calcificazione vascolare, ipotizziamo un putativo effetto pro-calcificazione di VDRA. Effetti immunomodulatori di EPO. Background: Il cloruro di sodio spinge l'induzione di cellule TH17 patogeni e TH1. La correzione dell'anemia con eritropoietina (EPO) è associato ad un miglioramento della tolleranza del trapianto di rene. Prove emergenti indicano che queste osservazioni possano essere eritropoiesi-indipendente e che l'EPO presenta proprietà immunosoppressive. Metodi: esaminato gli effetti del trattamento con EPO e sale su cellule T umana, apoptosi e la produzione di INF-γ, l'effetto sulla iTh17 e iFoxP3. Le cellule sono state analizzate con l'analisi di citometria a flusso. Risultati: NaCl aumenta la proliferazione di CD4+ e CD8+, iTh17 e la produzione di INFγ. Questo effetto è prevenuto da EPO. EPO aumenta l'induzione di Foxp3. Non cambia l'apoptosi e la stabilità di FoxP3. EPO è in grado di contiene l'effetto pro infiammatorio del sale
First project: Characterization of EPCs in patients with CKD. Background: The effects of vitamin D receptor (VDR) and osteocalcin (OCN) expression as well as VDR agonist (VDRA) therapy on circulating endothelial progenitor cells (EPCs) has not been elucidated yet. Methods: we therefore analyzed EPCs in 23 healthy controls and 53 patients undergoing dialysis. The percentage of EPCs (CD34+CD133+/-KDR+CD45-) expressing VDR or OCN were analyzed using flow cytometry and correlated with molecules involved in diseases. Results: EPCs increase in CKD patients treated with VDRAs. EPCsOCN+/- in patients untreated with VDRAs correlated positively with serum calcium and reticulocytes, and negatively with DKK1. The percentage of EPCsVDR+/- correlated negatively with OPN. EPCsOCN+ in patients treated with VDRAs correlated positively with vitamin D. The percentage of EPCsVDR+/- correlated positively with IL-6. Conclusions: our data suggest that VDRA therapy influence VDR and OCN expression on circulating EPCs. Since OC expression may contribute to vascular calcification, we hypothesize a putative pro-calcifying effect of VDRA. Second project: Immunomodulatory effects of EPO. Background: Sodium chloride drives the induction of pathogenic TH17 cells and TH1. Correction of anemia with erythropoietin (EPO) is associated with improved kidney transplant outcomes. Emerging evidence indicates that these observations may be erythropoiesis-independent and that EPO exhibits immunosuppressive properties. Methods: examined the effects of treatment with EPO and salt on human T-cell alloimmunity, the apoptosis and the production to INF-γ, the effect on iTh17 and iFoxP3. The cells were analyzed with flow cytometry analysis. Results: NaCl increases the proliferation of CD4+ and CD8+ cells, iTh17 and the production of INFγ. This effect is prevented by EPO. EPO increases the induction of Foxp3. It does not change the apoptosis and stability of FoxP3. Epo contains the inflammatory effect of NaCl. EPO in the kidney, where NaCl is high, may have a tolerance effect.

High blood pressure is a major risk factor for cardiovascular disease, myocardial infarction, heart failure, kidney failure and peripheral vascular disease. Oxidative stress, due to increased production of reactive oxygen species (ROS), plays an important pathophysiological role in the development of hypertension and its long-term complications, such as cardiovascular remodeling and atherosclerosis (Touyz RM et al, 2004). Various risk factors (smoking, diabetes, increased LDL, as well as hypertension) lead to an increase of the redox state, resulting in endothelial dysfunction, increased expression of pro-inflammatory redox sensitive genes and activation of smooth muscle cells (Luft FC, 2001). In hypertensive patients, the Renin-Angiotensin-Aldosterone system (RAAS) is activated and this causes an increase of Angiotensin (Ang II) production (Ruster C et al, 2006). Ang II causes vasoconstriction, increases total peripheral resistance and, consequently, blood pressure but at the same time strongly induces oxidative stress. Ang II mediates its actions through two distinct receptors: AT1R (for which Ang II has more affinity) and AT2R (Dihn DT et al, 2001; Mehta PK et al, 2007; Calò LA et al, 2010). Many of the Ang II-related events are mediated via activation of the AT1R receptor followed by both a short term signaling, which causes vasoconstriction, and a long term signaling, which leads to vascular remodeling and atherosclerosis through the activation of NAPDH oxidase and consequently production of superoxide anion (O2-) (Griendling KK et al, 2000). Ang II signaling via AT2R stimulation has been suggested to counteract many actions mediated by AT1R inducing vasodilatation, anti-proliferation, cell differentiation, anti-apoptotic signals; it therefore has a role in the homeostatic counterbalance of an excessive stimulation of AT1R (Volpe et al, 2003; Zhuo et al, 2008; Yamamoto et al, 2008). Oxidative stress is well recognized to play a crucial role in the pathogenic mechanisms of endothelial dysfunction. Endothelial dysfunction defines a complex molecular and biochemical picture of inflammatory, proliferative, structural and functional abnormalities of the vasculature. Endothelial progenitor cells (EPCs), derived from bone marrow, play an important role for the protection from these abnormalities (Hill JM et al, 2003), as they are able to repair the damaged endothelium, through a continuous process of re-endothelialization and/or neovascularization (Heiss C et al, 2005). In hypertension the number of circulating EPCs is reduced and their function is altered; this situation represents an additional risk factor in the development of cardiovascular events. It has been shown that Ang II and AngII-induced oxidative stress play a pivotal role in EPC status by accelerating the onset of their senescence, which, in turn, leads to impairment of their proliferative activity (Imanishi T et al, 2005). The calcitonin gene-related peptide (CGRP), instead, is a potent vasorelaxant, which prevents circulating EPC senescence and reverses AngII-induced senescence of EPC (Zhou Z et al, 2010). The important role that oxidative stress plays in the cardiovascular remodelling and atherogenetic processes, that are observed in hypertension, has led researchers to investigate the potential pleiotropic effects of antihypertensive drugs on oxidative stress. In particular, two drugs families are more intensive studied: ACE inhibitors (ACEIs) and the Ang II type 1 receptor blocker (ARBs) which both reduce RAAS activity. Olmesartan Medoxomil, widely used in the treatment of hypertension, blocks specifically AT1R receptor and consequently its actions via short and long term signaling independently of the Ang II source. AngII is, then, available for binding to AT2R inducing vasodilatation, anti-inflammatory and antifibrotic effects and causing a dose-dependent reduction of blood pressure. Furthemore, the treatment with Olmesartan has been shown to possess antioxidant-related effects such as reduction of the plasma levels 8-isoprostane, a marker of oxidative stress (Fliser D et al, 2005), and activation of Nitric Oxide (NO) system, through increase of eNOS phosphorylation (Oyama N et al, 2010; Kanematsu Y et al, 2006). The aim of our study was, therefore, to evaluate a possible anti-oxidant and vasoprotective effect of the Olmesartan Medoxomil, in essential hypertensive patients, using a molecular biology approach. The study was carried out at different times, using two cohorts of essential hypertensive patients with similar clinical features treated for six months with Olmesartan Medoxomil. On the first cohort of patients we analyzed markers of oxidative stress and cardiovascular remodelling-related pathways, as well as the level of oxidized LDL; on the second cohort of patients, we evaluated both the protein expression of HO-1, the plasma levels of CGRP and circulating EPCs number and senescence. In particular, in the first phase of the study, we evaluated p22phox, subunit of NADPH oxidase, essential for the production of superoxide anion (O2-), and heme oxygenase-1 (HO-1), inducible isoform of HO, known to protect from oxidative stress. We also evaluated the state of phosphorylation of extracellular signal-regulated kinases (ERK1/2), an oxidative stress protein effector for cardiovascular remodeling, and the plasma level of the low-density lipoproteins (OxLDL), a plasma marker of oxidative stress, which is crucial in the development of arteries chronic inflammation at intima level. In the second phase of the study, we evaluated the vasoprotective effects of Olmesartan, considering parameters such as: HO-1, potent anti-oxidant and anti-inflammatory protein, characterized by a strong effect on re-endothelialization, which is linked to its ability to increase the number and to reduce the senescence of circulating EPC; CGRP, peptide-stimulated by HO-1, that protect the endothelium and prevents circulating EPCs senescence. Moreover, were evaluated the number and survival of circulating EPCs. The results of the first phase of the study, have demonstrated that Olmesartan Midoxomil, besides inducing blood pressure normalization in essential hypertensive patients since the third month of treatment, significantly reduced p22phox protein level after 3 months compared to baseline (0.71±0.26 vs 0,93±0.24 densitometric unit (d.u.,), p<0.001), and moreover significantly reduced p22phox at 6 months both compared to baseline (0.45±0.12 vs 0.93±0.24 d.u., p<0.001) and to 3 months (0.45±0.12 vs 0.71±0.26 d.u., p<0.02). Olmesartan treatment also significantly decreased phosphorylated ERK 1/2 levels, both after 3 months compared to baseline (0.39±0.14 vs 0.56±0.11 d.u., p=0.001), and at 6 months compared to baseline (0.19±0.08 vs 0.56±0.11, d.u., p=0.001) and to 3 months (0.19±0.08 vs 0.39±0.14, d.u., p=0.001). oxLDL plasma levels were significantly reduced after 6 months of treatment, both compared to baseline (171.92±61,83 vs 300.84±109.13 ng/ml, p=0.001), and to 3 months (171.92±61,83 vs 270.06±100.34 ng/ml, p=0.002), whereas at 3 months the reduction was not significant. Furthermore, Olmesartan treatment caused a significant increase of HO-1 protein expression levels at 3 months of the therapy compared to baseline (1.10±0.19 vs 0.77±0.071 d.u., p=0.001) and at 6 months of the therapy compared to baseline (1.11±0.19 vs 0.77±0.071 d.u., p=0.001). There was no significant increase of HO-1 protein expression between 6 and 3 months of Olmesartan treatment (1.11±0.19 vs 1.10±0.19 d.u., p=ns). In the second phase of the study, confirming the previously shown increase of HO-1, we found that Olmesartan significantly increased HO-1 protein level, both at 3 months compared to baseline (0.95±0,21 vs 0.81±0.21 d.u., p=0.031), and at 6 months compared to baseline (1.1±0.26 vs 0.81±0.21 d.u., p=0.001) and to 3 months (1.1±0.26 vs 0.95±0.21 d.u., p=0.01). Moreover, we observed a significantly increase of CGRP plasma levels after 6 months of therapy, both compared to baseline (263.91±43.08 vs 198.81±51.98 pg/ml, p=0.001), and to 3 months (263.91±43.08 vs 218.97±41.13 pg/ml, p=0.03). Circulating EPC number, defined by cell surface antigens CD34+KDR+, CD133+KDR+ e CD34+CD133+KDR+, increased after 6 months of Olmesartan treatment both compared to baseline (respectively, 112.89±53.44 vs 35.11±25.98, p=0.005; 107.60±37.09 vs 20.90±14.58, p=0.0001; 38.11±19.64 vs 3.67±3.61, p=0.0007) and compared to 3 months (respectively, 112.89±53.44 vs 59.11±35.30, p=0.002; 107.60±37.09 vs 49.50±45.20, p=0.003; 38.11±19.64 vs 15.78±18.59, p=0.0028). Olmesartan significantly reduced EPC apoptosis, evaluated by gating on CD133+KDR+ cells events based on Annexin V expression, at 3 months compared to baseline (27.24± 9.64% vs 44.28 ± 12.38%, p<0.01) and further significantly reduced it at 6 months both compared to baseline (16.83±15.68% vs 44.28 ±12.38%, p<0.001) and to 3 months (16.83±15.68% vs 27.24±9.64%, p< 0.004) (Calò LA et al, 2014). In conclusion, this study demonstrates Olmesartan’s inhibitory effect on oxidative stress and oxidative stress-related proteins involved in oxidative stress signaling in essential hypertensive patients. Moreover, it demonstrates a vasoprotective effect of Olmesartan via reduction of Ang II-mediated oxidative stress and increased CGRP-mediated improvement of endothelial dysfunction, likely due also to the increased number of circulating EPC and their improved survival/function. In addition, our data provide a mechanistic rationale for the Olmesartan’s antioxidant and anti-inflammatory potential translation, in the long term, toward antiatherosclerotic and antiremodeling effects reported in clinical trials such as MORE (Stumpe KO et al 2007), OLIVUS (Hirohata A et al, 2010), EUTOPIA (Fliser D et al, 2004) e VIOS (Smith RD et al, 2006)
L’ipertensione arteriosa è il più importante fattore di rischio per le malattie cardiovascolari, l’infarto del miocardio, lo scompenso cardiaco, l’insufficienza renale e le vasculopatie periferiche. Lo stress ossidativo, dovuto all’aumentata produzione delle specie reattive all’ossigeno (ROS), svolge un importante ruolo fisiopatologico nello sviluppo dell’ipertensione arteriosa e delle sue complicanze a lungo termine, quali il rimodellamento cardiovascolare e l’aterosclerosi (Touyz RM et al, 2004). Vari fattori di rischio (fumo, diabete, aumento di LDL, oltre che ipertensione) portano ad un aumento dello stato redox, determinando disfunzione endoteliale, aumento dell’espressione di geni pro-infiammatori redox sensibili ed attivazione delle cellule muscolari lisce (Luft FC, 2001). In pazienti ipertesi, il sistema Renina-Angiotensina (RAAS) è attivato, causando un aumento di produzione dell’Angiotensina (Ang II) (Ruster C et al, 2006). L’Ang II, potente vasocostrittore (in grado di aumentare le resistenze periferiche totali e quindi la pressione arteriosa) è un potente induttore di stress ossidativo. L’Ang II media le sue azioni attraverso due recettori distinti: AT1R e AT2R (Dihn DT et al, 2001; Mehta PK et al, 2007; Calò LA et al, 2010). La stimolazione del recettore AT1R, per il quale l’Ang II presenta maggiore affinità, determina sia vasocostrizione attraverso un signalling cellulare a breve termine ma anche rimodellamento vascolare e aterosclerosi attraverso un signalling a lungo termine che coinvolge l’attivazione dell’NADPH ossidasi, produttore di anione superossido (O2-) (Griendling KK et al, 2000). Il legame al recettore AT2R da parte dell’Ang II controbilancia gli effetti mediati dall’attivazione di AT1R, inducendo vasodilatazione, antiproliferazione, differenziazione cellulare, segnali antiapoptotici; esso ha quindi un ruolo omeostatico nel controbilanciare un eccesso di stimolazione di AT1R (Volpe et al, 2003; Zhuo et al, 2008; Yamamoto et al, 2008). Lo stress ossidativo, è considerato uno dei meccanismi patogenetici fondamentali della disfunzione endoteliale. Per disfunzione endoteliale si intende un quadro molecolare e biochimico complesso che comprende infiammazione, proliferazione, anormalità strutturali e funzionali dei vasi. Le cellule progenitrici endoteliali (EPC) circolanti di derivazione midollare, svolgono un importante ruolo di protezione da queste alterazioni (Hill JM et al, 2003) in quanto sono in grado di riparare l’endotelio danneggiato attraverso un continuo processo di re-endotelializzazione e/o neovascolarizzazione (Heiss C et al, 2005). Nell’ipertensione il numero di EPC circolanti è ridotto e la loro funzione è alterata; tale situazione rappresenta un ulteriore fattore di rischio nello sviluppo di eventi cardiovascolari. E’ stato dimostrato, infatti, che l’Ang II, che causa un aumento dello stress ossidativo, svolge un ruolo centrale nell’insorgenza dell’invecchiamento e nella inibizione della capacità proliferativa delle EPC circolanti (Imanishi T et al, 2005). Il calcitonin gene-related peptide (CGRP), invece, è un potente vasodilatatore, che previene l’invecchiamento delle EPC circolanti, indotto anche da Ang II (Zhou Z et al, 2010). L’importante ruolo che gioca lo stress ossidativo nei processi di remodelling cardiovascolare ed aterogenesi che si osservano nell’ipertensione arteriosa, ha indotto i ricercatori a porre sempre maggior attenzione e ad investigare i potenziali effetti pleiotropici dei farmaci antiipertensivi sullo stress ossidativo. I farmaci maggiormente studiati sono gli ACE inibitori (ACEIs) e i bloccanti il recettore AT1R dell'Angiotensina (ARBs), le due più importanti classi di farmaci che agiscono limitando l'attività del sistema renina-angiotensina-aldosterone (RAAS). L’Olmesartan Medoxomil, bloccante il recettore AT1R dell’Ang II, ampiamente usato nel trattamento dell’ipertensione, blocca tutte le attività dell’Ang II mediate dal recettore AT1R, indipendentemente dall’origine e dalla via di sintesi dell’Ang II; l’ormone, perciò, si rende disponibile per il legame con il suo recettore AT2R, la cui stimolazione determina vasodilatazione, effetti antifibrotici e antinfiammatori e determina una riduzione, a lungo termine, dose-dipendente, della pressione arteriosa. Inoltre, è stato dimostrato che l’Olmesartan possiede attività antiossidante in quanto riduce i livelli plasmatici del marker di stress ossidativo 8-isoprostano (Fliser D et al, 2005), e attiva il sistema del monossido d’azoto (NO) attraverso un aumento della fosforilazione della eNOS (Oyama N et al, 2010; Kanematsu Y et al, 2006). Con il nostro studio abbiamo valutato un possibile effetto antiossidante e vasoprotettivo dell’Olmesartan Medoxomil in pazienti ipertesi essenziali, utilizzando un approccio biologico molecolare. Lo studio è stato effettuato in tempi differenti utilizzando due coorti di pazienti con caratteristiche cliniche simili trattati per 6 mesi con Olmesartan Medoximil. Sulla prima coorte sono stati analizzati markers di stress ossidativo e della pathway del rimodellamento cardiovascolare, oltre che i livelli di LDL ossidate; sulla seconda coorte di pazienti sono stati valutati oltre che l’espressione proteica di HO-1, i livelli palsmatici di CGRP e il numero e la sopravvivenza delle EPC circolanti. In particolare, nella prima fase sono state valutate p22phox subunità della NADPH ossidasi essenziale per la produzione di anione superossido, ed Heme Oxigenase-1 (HO-1), isoforma inducibile di HO, in grado di proteggere dallo stress ossidativo. Abbiamo, inoltre, valutato lo stato di fosforilazione delle ERK, proteine effettrici dello stress ossidativo nel rimodellamento cardiovascolare, e lo stato di marker plasmatici di stress ossidativo come le lipoproteine ossidate a bassa densità (LDL ossidate), cruciali nello sviluppo della reazione infiammatoria cronica a livello della tonaca intima delle arterie. Nella seconda fase dello studio abbiamo preso in considerazione gli effetti vasoprotettivi dell’Olmesartan valutando parametri quali: HO-1, proteina che oltre ad avere una potente attività anti-ossidante ed anti-infiammatoria, è contraddistinta da un potente effetto favorente la re-endotelializzazione, giustificato dalla sua capacità di aumentare il numero e di ridurre l’invecchiamento di cellule progenitrici endoteliali (EPC) circolanti ed il CGRP, peptide stimolato dall’HO-1 che protegge l’endotelio e previene l’invecchiamento delle EPC circolanti mediato da Ang II. Inoltre, sono stati valutati il numero e la sopravvivenza delle EPC circolanti. I risultati della prima fase hanno dimostrato come il farmaco Olmesartan, oltre a normalizzare la pressione arteriosa in pazienti ipertesi essenziali già a 3 mesi di terapia, ha ridotto significativamente i livelli di espressione proteica di p22phox già a 3 mesi di terapia rispetto al basale (rispettivamente 0.71±0.26 vs 0.93±0.24 unità densitometriche (u.d.), p<0.001), riduzione che è risultata significativa anche a 6 mesi rispetto sia al basale (0.45±0.12 vs 0.93±0.24 u.d., p<0.001) che a 3 mesi (0.45±0.12 vs 0.71±0.26 u.d., p<0.02). Il trattamento con Olmesartan ha ridotto significativamente anche i livelli di fosforilazione delle ERK 1/2 sia dopo 3 mesi rispetto al baseline (rispettivamente 0.39±0.14 vs 0.56±0.11 u.d., p=0.001) che a 6 mesi di terapia, rispetto al basale (0.19±0.08 vs 0.56±0.11, u.d., p=0.001) e rispetto a 3 mesi (0.19±0.08 vs 0.39±0.14 u.d., p=0.001). I livelli di LDL ossidate sono risultati significativamente ridotti dopo 6 mesi di terapia, sia rispetto al basale (171.92±61.83 vs 300.84±109.13 ng/ml, p=0.001), che rispetto a 3 mesi (171.92±61.83 vs 270.06±100.34 ng/ml, p=0.002) mentre a 3 mesi rispetto al basale la riduzione non era significativa (270.06±100.34 vs 300.84±109.13 ng/ml, p=ns). Il trattamento con Olmesartan ha, invece, determinato un significativo aumento dei livelli di espressione proteica di HO-1 rispetto al basale sia a 3 mesi di terapia (1.10±0.19 vs 0.77±0.071 u.d., p=0.001) che a 6 mesi (1.11±0.19 vs 0.77±0.071 u.d., p=0.001), mentre la variazione non è risultata significativa tra 3 e 6 mesi di trattamento (1.10±0.19 vs 1.11±0.19 u.d., p=ns). Nella seconda parte dello studio, confermando quanto riscontrato precedentemente, il trattamento con Olmesartan ha incrementato significativamente i livelli di espressione proteica di HO-1 rispetto al basale sia a 3 mesi (0.95±0.21 vs 0.81±0.21 u.d., p=0.031) che a 6 mesi (1.1±0.26 vs 0.81±0.21 u.d., p=0.001) con un aumento significativo anche nel confronto tra 3 e 6 mesi (0.95±0.21 vs 1.1±0.26 u.d., p=0.01). L’Olmesartan ha, inoltre, indotto un significativo aumento dei livelli plasmatici di CGRP dopo 6 mesi di terapia sia rispetto al basale (263.91±43.08 vs 198.81±51.98 pg/ml, p=0.001), che rispetto a 3 mesi (263.91±43.08 vs 218.97±41.13 pg/ml, p=0.03). Un aumento nel numero di EPC circolanti, espresse come CD34+KDR+, CD133+KDR+ e CD34+CD133+KDR+, è risultato significativo a 6 mesi di trattamento con Olmesartan sia rispetto al basale (rispettivamente 112.89±53.44 vs 35.11±25.98, p=0.005 per CD34+KDR+; 107.60±37.09 vs 20.90±14.58, p=0.0001 per CD133+KDR+; 38.11±19.64 vs 3.67±3.61, p=0.0007 per CD34+ CD133+KDR+) che a 3 mesi (112.89±53.44 vs 59.11±35.30, p=0.002 per CD34+KDR+; 107.60±37.09 vs 49.50±45.20, p=0.003 per CD133+KDR+; 38.11±19.64 vs 15.78±18.59, p=0.0028 per CD34+ CD133+KDR+). L’apoptosi delle cellule EPC, valutata mediante analisi citofluorimetrica del legame tra annessina V e fosfatidilserina espressa sulle cellule CD133+KDR+, è risultata significativamente ridotta già a 3 mesi di trattamento con Olmesartan (27.24± 9.64% vs 44.28 ± 12.38%, p<0.01) e si è ulteriormente ridotta in modo significativo a 6 mesi sia rispetto al basale (16.83±15.68% vs 44.28 ±12.38%, p<0.001) che rispetto a 3 mesi (16.83±15.68 vs 27.24±9.64% %, p< 0.004) (Calò LA et al, 2014). In conclusione, questo studio dimostra un effetto inibitorio dell’Olmesartan sullo stress ossidativo e sulle proteine correlate coinvolte nel signalling intracellulare dello stress ossidativo in pazienti con ipertensione essenziale. Inoltre, dimostra che l’Olmesartan possiede un effetto vasoprotettivo mediato dalla riduzione dello stress ossidativo indotto dall’Ang II e dall’aumento degli effetti benefici del CGRP sulla disfunzione endoteliale, dovuti anche all’aumento del numero delle EPC circolanti e della loro sopravvivenza/funzionalità. I nostri dati, inoltre, forniscono un razionale meccanicistico dell’azione anti-ossidante, anti-infiammatoria e vasoprotettiva, forniscono il razionale meccanicistico agli effetti anti-aterosclerotici, antiinfiammatori e di anti-remodeling di Olmesartan riportati da trials clinici come MORE (Stumpe KO et al 2007), OLIVUS (Hirohata A et al, 2010), EUTOPIA (Fliser D et al, 2004) e VIOS (Smith RD et al, 2006)