Thèses sur le sujet « Caratterizzazione biologica di tumori »

Nell'ambito dell'attivita' di studio e di ricerca connessa al corso di Dottorato in Scienze delle Produzioni Animali e' stata studiata una collezione di genotipi di Dactylis glomerata L. reperiti in ambienti diversi della Sicilia per altitudine e latitudine al fine di caratterizzarli per gli aspetti morfologici, biologici, agronomici e genetici in vista di possibili programmi di selezione e incrocio. Nella prima parte della tesi si fa cenno alle caratteristiche climatiche della regione mediterranea e a quelle della Sicilia in particolare, come pure alla vegetazione tipica di questi ambienti. Si riporta un'ampia rassegna delle problematiche della foraggicoltura siciliana piuttosto povera nei suoi elementi caratterizzanti: specie coltivate e modalita' di utilizzazione dei foraggi. Si analizza il valore della biodiversita' ed il problema delle risorse genetiche disponibili nel bacino del Mediterraneo, con particolare riferimento alle specie foraggere. Si analizzano, sulla base della letteratura disponibile, le problematiche legate ai meccanismi di sopravvivenza delle graminacee foraggere negli ambienti temperati con particolare riferimento al meccanismo della dormienza estiva (summer-dormancy) che consente a specie come Dactylis glomerata e ad altre graminacee polienni degli ambienti temperati, di sfuggire alla carenza idrica (stress avoidance) del periodo estivo. Si descrive la suddetta specie e gli aspetti agronomici relativi alla sua coltivazione. Infine, si accenna alla problematica del miglioramento genetico con particolare riferimento alle tecniche di studio utilizzate per la Dactylis. Nella seconda parte si descrivono le tre linee nelle quali e' stata suddivisa la ricerca: caratterizzazione biologica ed agronomica di nove genotipi di Dactylis glomerata L. reperiti in ambienti della Sicilia caratterizzati da diversa intensita' dell'aridita' estiva (periodo secco di Bagnouls e Gaussen); individuazione e descrizione nei suddetti genotipi dei tratti della dormienza estiva; caratterizzazione molecolare del germoplasma basata su polimorfismi del DNA per la stima della variabilita' genetica e delle relazioni intraspecifiche. I dati acquisiti indicano che le popolazioni siciliane di Dactylis sono caratterizzate da un'ampia variabilita' genetica attestata dalla variabilità à   nei caratteri morfologici come l'altezza della pianta, biologici (epoca di spigatura), agronomici (capacita' produttiva). La dormienza estiva presenta una maggiore accentuazione nei genotipi provenienti dagli ambienti caratterizzati da una piovosita' superiore a 600 mm e da un periodo secco inferiore a 110 giorni. I risultati ottenuti aprono la strada ad altre e piu' approfondite ricerche necessarie a implementare le attuali conoscenze: la capacita' di approfondimento dell'apparato radicale, la persistenza in relazione al grado di dormienza, l'accumulo di carboidrati solubili durante l'estate utili alla ripresa vegetativa autunnale.
During the PhD program in Science of Animal Production', as part of the study and research, it has been studied a collection of genotypes of Dactylis glomerata L. found in different environments of Sicily for altitude and latitude in order to characterize the morphological, biological, agronomic and genetic traits for possible selection and crossing. The first part of the thesis focuses on the climatic characteristics of the Mediterranean region in genera, and those of Sicily in particular, as well as the typical vegetation of these environments. It contains an extensive review of the problems linked to the Sicilian grassland, rather poor in its elements: the cultivated species and methods of use of fodder. It is analyzed the value of biodiversity and the issue of genetic resources available in the Mediterranean basin, with particular reference to forage species. Analysis is based on the available literature, issues related to the mechanisms of survival of the species in arid environments. In particular, the mechanism of summer-dormancy that allows species such as Dactylis glomerata L. and other perennial grasses of temperate environments, to escape the water drought (stress avoidance) of the summer and therefore survive. It is described the above mentioned species and agronomic aspects related to its cultivation. Finally, it mentions the problem of genetic improvement with particular reference to techniques used for Dactylis. In the second part of this dissertation are reported three lines in which was split the research: biological and agronomical characterization of 9 genotypes of Dactlis glomerata L., collected in different environment of Sicily, which were characterized by different summer-drought intensity (drought period of Bagnouls and Gaussen); detection and description of summer dormancy traits of the above mentioned genotypes; germplasm molecular characterization based on DNA polymorphism in order to assess genetic variability of intraspecific relationships. Data collected indicate that Sicilian populations of Dactylis are characterized by wide genetic variability, shown by the variability in morphological, such as plant height, biological (time of earing) and agronomic traits (production capacity). The summer dormancy presents a great emphasis for the genotypes coming from those environments characterized by a rainfall exceeding 600 mm yr-1 and a dry period lower than 110 days. The obtained results pave the way for further and more detailed researches necessary to implement the knowledge gap: the ability of the root system to delve into the soil, the persistence in relation to the degree of dormancy, the accumulation of soluble carbohydrates during the summer to help vegetative re-growth in autumn.

In questo lavoro scientifico è stato studiato il contenuto di aloine e beta-polisaccaridi in piante di Aloe barbadensis (Aloe vera) ed Aloe arborescens, in relazione ad alcuni fattori di variabilità quali la specie, l’età, la tipologia di tessuto vegetale analizzato e le condizioni di coltivazione. Ulteriori analisi hanno permesso di studiare la loro stabilità in differenti matrici, il loro potere antiossidante ed antimicrobico, mediante studi in vitro. E’ stato inoltre effettuato un ulteriore studio, in vivo, somministrando un omogeneizzato d’Aloe arborescens fresco a bovine da latte in periparto, con lo scopo di valutare l’eventuale assorbimento di aloina, correlandolo ad eventuali effetti benefici. Nel derma è concentrata l’aloina, molto abbondante in piante di tre anni, mentre nella porzione fogliare interna gelatinosa, i beta-polisaccaridi. Il profilo fitochimico inoltre pare essere influenzato dalle condizioni di stress cui la coltura viene sottoposta, in particolare sembra che lo stress salino e la scarsa disponibilità in azoto, promuovano la sintesi delle principali bio-componenti studiate. Lo stesso contenuto inoltre è stato positivamente correlato al grado di luminosità percepita dalla coltura. Entrambe le componenti sono poco stabili e molto sensibili alle alte temperature, presentano inoltre ridotta capacità antiossidante. In sinergia con altre biocomponenti, pare possiedano proprietà antimicrobiche contro alcuni batteri patogeni, mentre entro certe dosi mostrano effetti pre-biotici, nei confronti di alcuni lattobacilli. E’ stato infine dimostrato dalla sperimentazione in vivo un assorbimento ematico di aloina, dimostrando in questo modo la sua sistemicità.
The relationship between Aloe main active components and plant age, specie and grow conditions has been investigated in Aloe barbadensis and A. arborescens, the commercially most used species of the genus. Aloin was mainly located in leaves outer green rid while beta-polysaccharides in inner parenchyma. Aloin concentration was higher in younger plants. Plants grown under decrising light intensities showed lower aloin and beta-polysaccharides concentrations. The content of these substances is improved by stress condition. The most antioxidant activity is located in the outer green rid of the leaves and it was slightly correlated to the total phenolic compounds content. Aloin and beta-polysaccharides stability in leaf homogenate was poor and temperature seemed to be quite more effective in reducing degradation. Antimicrobial effect against to phatogen microorganisms of anthraquinones aloin and alo-emodin and different Aloe extracts was confirmed. Prebiotic effects to Lactobacillus were discovered and a synergistic effect of several compounds was supposed. Systemic effect of aloin was explained by vivo experiments (on cows) because aloin is observed until 24 h after the oral administration of Aloe, thus metabolic and physiologic effects may be expected.

In questo lavoro scientifico è stato studiato il contenuto di aloine e beta-polisaccaridi in piante di Aloe barbadensis (Aloe vera) ed Aloe arborescens, in relazione ad alcuni fattori di variabilità quali la specie, l’età, la tipologia di tessuto vegetale analizzato e le condizioni di coltivazione. Ulteriori analisi hanno permesso di studiare la loro stabilità in differenti matrici, il loro potere antiossidante ed antimicrobico, mediante studi in vitro. E’ stato inoltre effettuato un ulteriore studio, in vivo, somministrando un omogeneizzato d’Aloe arborescens fresco a bovine da latte in periparto, con lo scopo di valutare l’eventuale assorbimento di aloina, correlandolo ad eventuali effetti benefici. Nel derma è concentrata l’aloina, molto abbondante in piante di tre anni, mentre nella porzione fogliare interna gelatinosa, i beta-polisaccaridi. Il profilo fitochimico inoltre pare essere influenzato dalle condizioni di stress cui la coltura viene sottoposta, in particolare sembra che lo stress salino e la scarsa disponibilità in azoto, promuovano la sintesi delle principali bio-componenti studiate. Lo stesso contenuto inoltre è stato positivamente correlato al grado di luminosità percepita dalla coltura. Entrambe le componenti sono poco stabili e molto sensibili alle alte temperature, presentano inoltre ridotta capacità antiossidante. In sinergia con altre biocomponenti, pare possiedano proprietà antimicrobiche contro alcuni batteri patogeni, mentre entro certe dosi mostrano effetti pre-biotici, nei confronti di alcuni lattobacilli. E’ stato infine dimostrato dalla sperimentazione in vivo un assorbimento ematico di aloina, dimostrando in questo modo la sua sistemicità.
The relationship between Aloe main active components and plant age, specie and grow conditions has been investigated in Aloe barbadensis and A. arborescens, the commercially most used species of the genus. Aloin was mainly located in leaves outer green rid while beta-polysaccharides in inner parenchyma. Aloin concentration was higher in younger plants. Plants grown under decrising light intensities showed lower aloin and beta-polysaccharides concentrations. The content of these substances is improved by stress condition. The most antioxidant activity is located in the outer green rid of the leaves and it was slightly correlated to the total phenolic compounds content. Aloin and beta-polysaccharides stability in leaf homogenate was poor and temperature seemed to be quite more effective in reducing degradation. Antimicrobial effect against to phatogen microorganisms of anthraquinones aloin and alo-emodin and different Aloe extracts was confirmed. Prebiotic effects to Lactobacillus were discovered and a synergistic effect of several compounds was supposed. Systemic effect of aloin was explained by vivo experiments (on cows) because aloin is observed until 24 h after the oral administration of Aloe, thus metabolic and physiologic effects may be expected.

Lo scopo della ricerca è stato quello di studiare le caratteristiche microbiologiche di ceppi di Bifidobacterium spp. isolati da feci umane e animali e da prodotti probiotici e quello di investigare le proprietà chimico-fisiche e alcune possibili attività biologiche dell esopolisaccaride (EPS) prodotto da un ceppo di Bifidobacterium longum . Gli studi sul profilo metabolico dei ceppi isolati, eseguiti utilizzando sistemi standardizzati, confermavano soltanto per 10 ceppi la probabile appartenenza al genere Bifidobacterium spp. I ceppi caratterizzati come probabili bifidobatteri erano saggiati per la capacità di resistere alle condizioni gastrointestinali e mostravano resistenza a pH 3 e alle differenti concentrazioni di sali biliari saggiate. Inoltre, i 10 ceppi esaminati per la loro sensibilità agli antibiotici mostravano delle MIC compatibili con i valori di cut-off riportati dall EFSA (2012) per il genere Bifidobacterium spp. I probabili bifidobatteri e i ceppi probiotici di Bifidobacterium spp. venivano studiati per la loro capacità di adesione, utilizzando le cellule HT-29, mediante metodo quantitativo colturale e osservazione mediante microscopio ottico ad immersione. I risultati mostravano differenti caratteristiche di adesione in relazione al ceppo saggiato, ma anche in relazione al tempo di incubazione. La capacità di adesione del ceppo Bifidobacterium longum W11 veniva ulteriormente indagata mediante microscopia elettronica a scansione che evidenziava la presenza di biopolimeri di probabile natura esopolisaccaridica, organizzati in una complessa struttura 3D e coinvolti nell adesione del ceppo. Le successive fasi della ricerca erano, quindi, focalizzate sullo studio approfondito di questo biopolimero di natura esopolisaccaridica. Dopo l estrazione, purificazione e idrolisi, utilizzando anche metodiche messe a punto da noi, l esopolisaccaride (EPS) veniva analizzato per la composizione chimica, mediante TLC, utilizzando piastre in silice e in cellulosa. Entrambi i tipi di piastre permettevano di identificare la presenza di glucosio e galattosio, che veniva confermata con una più accurata analisi cromatografica effettuata mediante HPLC. La ricerca dei determinanti genetici responsabili della sintesi dell EPS del ceppo B. longum W11 era effettuata mediante PCR e analisi bioinformatica dell intero genoma. I risultati ottenuti mostravano la presenza del gene cpsD , che codifica per la galactosil-transferasi e un cluster genico composto da 23 geni, (24,7 kb). L attività citotossica veniva saggiata in vitro su fibroblasti gengivali HF1 e tumorali Caco-2. Il saggio su fibroblasti non evidenziava alcun effetto citotossico, mentre quello su cellule tumorali Caco-2 mostrava una modesta diminuzione della vitalità cellulare sin dalla più bassa concentrazione saggiata. Tale decremento, tuttavia non era statisticamente significativo. L eventuale attività immunomodulante dell EPS era analizzata attraverso lo studio del pattern di citochine quali IL-1, IL-6, IL-10 e IFN-gamma, prodotte da cellule immunitarie isolate da PBMC di donatori volontari. I risultati hanno dimostrato per l EPS in esame un effetto di tipo immunomodulante. Inoltre, quando l EPS veniva saggiato in combinazione con ConA si evidenziava un incremento significativo dei livelli di IL-1, IL-6 e IFN-gamma e la riduzione significativa dei livelli di IL-10. I risultati della ricerca forniscono una buona base sperimentale per ulteriori indagini su altri aspetti non ancora investigati degli EPS ed in particolare dell EPS del ceppo B. longum W11, quali l effetto protettivo sul ceppo produttore dalle condizioni intestinali avverse e/o dall attività inibente degli antibiotici o altre eventuali proprietà biologiche.

Backround Botanicals and in particular plant food supplements (PFS) receive great acceptance by European consumers. Potentially, they can deliver significant health benefits at relatively low costs. However, quality and efficacy of these products remain a question of concern, and bottlenecks in risk and benefit assessments need to be solved. PlantLIBRA (PLANT food supplements: Levels of Intake, Benefit and Risk Assessment) is an European Community funded project aiming to foster the safe use of food supplements containing botanicals or their preparations, by evaluating the quality and health benefits of PFS, and by increasing science-based decision-making by regulators and food chain operators. Part of the project is dedicated to the methodology of benefit assessment for PFS, application and validation. The first step was to review the evidence for PFS benefit from epidemiological, clinical and intervention studies. A number of pathological conditions where PFS are commonly used were identified and inflammation was one of those. Considering the difficulties and the high costs in performing human studies, it is clear the necessity to develop in vitro models able to represent the in vivo conditions. We developed a gastric inflammation in vitro model which investigate whether infusions of green and black tea inhibit the NF-kB driven transcription in human epithelial gastric AGS cells. Materials and methods The literature review considered Olea europea L., Camellia sinensis L., Vitis vinifera L., Matricaria recutita L., Urtica dioica, L. Symphytum officinalis L., Calendula officinalis L., Curcuma longa L., Boswellia serrata Roxb., and Harpagophytum procumbens L. which are herbal material frequently used also as food. Electronic literature searches were conducted using the following databases: Cochrane library, Scifinder Scholar, Embase and Pubmed from 1970 to 2010. In the experimental work infusions were prepared with green and black tea of different brands, with or without caffeine, available on the Italian market. For comparison, a freeze-dried water extract of green tea dry water extract industrially prepared was also tested. Firstly, the phenolic content of green and black tea water extracts was determined by using Folin-Ciocalteu’s assay and the catechin content by HPLC-UV. Then, the anti-inflammatory activity in human epithelial gastric cells was evaluated by NF-kB assay. The antioxidant activity of the extracts was evaluated by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay. The decay of phenols and catechin content at the expiry date was also evaluated in two samples. Results The search retrieved 1830 publications. By applying the inclusion/exclusion criteria, the final number of papers was 138. Some plants showed promising results but it is advisable to conduct further studies with more homogeneous population and larger number of subjects by avoiding the heterogeneity of the herbal preparations considered. Surprisingly, it was impossible to draw conclusions for the anti-inflammatory effect of Camellia sinensis L. both as green and black tea. Considering these results and taking into account the difficulties and the high costs in performing human studies, it is clear the necessity to develop in vitro models able to represent the in vivo conditions. We developed a gastric inflammation in vitro model which investigate whether infusions of green and black tea inhibit the NF-kB driven transcription in human epithelial gastric AGS cells. Infusions were prepared with green and black tea of different brands, with or without caffeine, available on the Italian market. For comparison, a freeze-dried water extract of green tea dry water extract industrially prepared was also tested. Catechin and caffeine content were evaluated by HPLC analysis. The decay of phenols and catechin content three months after the expiry date was also evaluated in two samples. Inhibition of NF-B driven transcription and free radical scavenger activity were observed and the effect correlated with catechin levels. In one decaffeinated sample of green tea, the phenol and catechin content was very low, probably a consequence of caffeine removal. At the expiry date, the loss of catechin levels did not cause any reduction of the inhibition of NF-kB driven transcription. Conclusions For the plants considered relevant in inflammation area, it is advisable to conduct further studies with more homogeneous population and larger number of subjects by avoiding the heterogeneity of the herbal preparations considered. The in vitro model developed in this study could be useful to represent the in vivo physiological conditions. The results will be implemented with studies on biological activity of active compounds after gastro-intestinal metabolism.

La caratterizzazione della stabilità metabolica di un nuovo potenziale farmaco e l’identificazione del sistema enzimatico coinvolto nella sua biotrasformazione rivestono notevole importanza nello sviluppo di nuovi agenti terapeutici [Foti e Dalvie, Drug Metab Dispos, 44:1229, 2016]. Un primo obiettivo dell’attività svolta nell’ambito del Dottorato di Ricerca era rappresentato dalla valutazione della reattività nei confronti del tripeptide glutatione (GSH) di alcuni derivati del nitrobenzossadiazolo in fase di caratterizzazione preclinica, quali agenti antitumorali, rappresentati dall’inibitore di GSTP1-1 6-(7-nitro-2,1,3-benzossadiazol-4-iltio)esanolo (NBDHEX) e dai suoi analoghi MC3181, MC2753. I risultati ottenuti dimostrano come l’estere benzoico di NBDHEX (MC2753) presenti, a differenza di NBDHEX e MC3181, elevata stabilità in presenza di concentrazioni fisiologiche di GSH [Fulci et al., J Enzyme Inhib Med Chem, 32:240, 2017]. Successivi esperimenti, volti a valutare la stabilità di MC2753 all’azione di esterasi, hanno tuttavia dimostrato un’elevata suscettibilità del composto all’idrolisi mediata da carbossilesterasi (CES) microsomiali epatiche umane. La sostituzione della funzione esterea presente in MC2753 con una funzione ammidica ha permesso l’ottenimento di un composto (MC4351) molto promettente, in quanto dotato di stabilità all’azione di CES microsomiali e, a differenza di NBDHEX e MC3181, scarsamente reattivo vs. GSH. Alla luce di un possibile riposizionamento in ambito oncologico della pirimetamina (PYR) [Fang, Cancers (Basel), 6:494, 2014], sostanza nota per la sua attività antiprotozoaria, è stato inoltre intrapreso uno studio con l’obiettivo di ampliare le conoscenze sul suo destino metabolico. Studi di metabolismo epatico in vitro, condotti al fine di valutare la possibile glucuronidazione e/o ossidazione del farmaco in presenza di frazioni microsomiali umane e di ratto, hanno dimostrato come esso non vada incontro a glucuronidazione nelle due specie considerate. Per contro, l’incubazione di PYR con adenina dinucleotide fosfato ridotto (NADPH) e microsomi epatici di ratto, o microsomi epatici umani isolati da un soggetto trattato con fenobarbital, ha condotto alla formazione di almeno 3 prodotti di mono-ossigenazione, rilevati grazie ad analisi in cromatografia liquida accoppiata a rivelatore spettrofotometrico a serie di diodi e spettrometria di massa (LC-DAD-MS). È stato esaminato, inoltre, il metabolismo microsomiale epatico di una piccola batteria (n=6) di nuovi inibitori della polimerizzazione della tubulina, derivati del 7-fenilpirrolochinolinone (7-PPyQ). Particolarmente interessanti, in virtù della stabilità dimostrata in presenza di microsomi epatici umani sia in assenza (metabolismo idrolitico) sia in presenza di NADPH (metabolismo ossidativo), sono risultati gli N-benzoil derivati del 7-PPyQ denominati MG2718 e MG2854. Entrambi i composti sono attualmente in fase di screening per l’attività antineoplastica. Un ulteriore obiettivo dell’attività svolta nell’ambito del Dottorato di Ricerca riguardava la comparazione nelle specie uomo, ratto e topo della stabilità al metabolismo ossidativo citosolico epatico di una piccola batteria di aldeidi aromatiche, rappresentate dall’o-vanillina, un inibitore di NFkB dotato di significativa attività antitumorale [Marton et al., Anticancer Res, 36:5743, 2016] e alcuni suoi analoghi strutturali. Gli stessi composti sono in fase di screening per l’attività antineoplastica presso il Biological Research Centre (BRC) dell’Accademia delle Scienze Ungheresi di Szeged e il Dipartimento di Scienze del Farmaco dell’Università di Padova. Il progetto ha la finalità di identificare composti con attività biologica sovrapponibile o superiore all’o-vanillina e caratterizzati, al tempo stesso, da più elevata stabilità metabolica. I risultati sino ad ora ottenuti indicano un significativo coinvolgimento di aldeidi ossidasi (AOX) murine nel metabolismo citosolico di tutte le aldeidi aromatiche studiate e l’esistenza di profonde differenze interspecie tra l’uomo e il topo nel metabolismo di questi composti. Infine, in collaborazione con il Centro Ricerche Aptuit di Verona e la Molecular Modeling Section del DSF dell’Università di Padova è stato avviato un progetto con l’obiettivo di identificare inibitori selettivi di solfotrasferasi (SULT) umane che consentano l’esecuzione di studi di fenotipizzazione di reazione. Ad oggi, infatti non vi è la disponibilità di un panel completo di inibitori selettivi verso singole SULT. Gli studi sino ad ora condotti hanno portato all’identificazione di due potenti inibitori delle principali SULT epatiche coinvolte nel metabolismo degli xenobiotici ossia SULT1A1 e SULT1B1
Drug metabolism studies play an important role in drug discovery and development [Foti and Dalvie, Drug Metab Dispos, 44: 1229, 2016]. A first aim of this work was to evaluate the reactivity of some nitrobenzoxadiazole (NBD) derivatives, namely the experimental antitumor agent 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio)hexanol (NBDHEX) and its analogues MC3181 and MC2753, towards the tripeptide glutathione (GSH). The obtained results showed that, differently from NBDHEX and MC3181, the benzoic acid ester of NBDHEX (MC2753), was stable in the presence of a physiological concentration of GSH [Fulci et al., J Enzyme Inhib Med Chem, 32: 240, 2017]. Subsequent experiments, aimed at assessing the stability of MC2753 to esterases, demonstrated its high susceptibility to hydrolysis catalyzed by a human liver microsomal carboxylesterase(s). Substitution of the ester group of MC2753 with an amide group gave compound MC4351, which was stable in the presence of human liver microsomes (HLMs), and quite less reactive than NBDHEX and MC3181 towards GSH. In the perspective of a possible repositioning of the antiprotozoal drug pyrimethamine (PYR) in the oncological field [Fang, Cancers (Basel), 6:494, 2014], a study was undertaken to improve the knowledge on its metabolic fate. In vitro studies were therefore conducted to investigate the possible oxidation and/or glucuronidation of PYR by HLMs or rat liver microsomes (RLMs). PYR was found to be stable in the presence of uridine 5'-diphospho-glucuronic acid (UDPGA)-supplemented HLMs or RLMs. On the other hand, PYR underwent NADPH-dependent metabolism by phenobarbital-induced RLMs, as well as by HLMs from a subject receiving phenobarbital; liquid chromatograpy coupled to diode array detection and mass spectrometry (LC-DAD-MS) analysis indicated formation of at least three monoxygenated metabolites. In vitro microsomal stability experiments were also conducted on a small panel of derivatives of the experimental tubulin polymerization inhibitor 7-phenylpyrroloquinolinone (7-PPyQ). Among the studied compounds, the N-benzoyl derivatives of 7-PPyQ named MG2718 and MG2854 are of considerable interest, due to their stability in HLMs both in the absence (hydrolytic metabolism) and in the presence of NADPH (oxidative metabolism). Both compounds are currently being screened for antineoplastic activity. Further trials analyzed the liver cytosolic stability of a small panel of aromatic aldehydes including o-vanillin, an inhibitor of NFkB with significant antitumor activity [Marton et al., Anticancer Res, 36: 5743, 2016], and some of its structural analogues. The same compounds are currently being screened for antitumor activity at the Biological Research Center (BRC) of the Hungarian Academy of Sciences (Szeged), and at the Department of Pharmaceutical Sciences (DSF) of Padua University. The aim of the project is to identify o-vanillin analogues endowed with a better pharmacological profile, in terms of both anticancer efficacy and metabolic stability. The results obtained indicate a significant involvement of a murine aldehyde oxidase(s) (AOX) in the metabolism of all the studied aldehydes, and the existence of remarkable differences between human and mouse in the rate of liver cytosolic metabolism of these compounds. Finally, a collaborative project has been recently established with the Aptuit Research Center in Verona and the Molecular Modeling Section of the DSF of Padua University, to identify form-selective inhibitors of the main human sulfotransferases (SULTs) involved in drug metabolism. The studies have led to the identification of two potent inhibitors of two major hepatic SULTs, namely SULT1A1 and SULT1B1.

Human Polyomaviruses can establish a latent infection in the kidney of up to 80% of the adult population worldwide and JCV induces progressive multifocal leukoencephalopathy (PML) in immunodeficient individuals. Recently several mounting evidences point to the association of Polyomaviruses with human cancer, more notably brain tumors. To further investigate this hypothesis, brain biopsy tissue, cerebrospinal fluid (CSF) and peripheral blood (PB) were collected from 40 Italian individuals suffering of brain tumors. Using PCR we investigated the presence of LT-Antigen (LT) DNA fragment common to JCV, BKV and SV40. JCV DNA was found in 37.5% of tumor tissues, 11.1% of CSF and 5.4% of PB, whereas BKV DNA was found in 20 % of biopsies and SV40 was not detected in the studied samples. Since 55.5% of tissues from glioblastomas and 37.5% from meningiomas were positive for JCV LT DNA, we focused our attention on this viral agent. The study of JCV genotype distribution, based on sequencing of VP1, showed that mostly of the amplified strains were JCV type 1, whereas the analysis of TCR nucleotide sequence indicated the IR (Mad 4) organization as the most frequent. The late gene Agnoprotein DNA was amplified in 7 biopsies, 6 of which were glioblastomas. Moreover, we found, by means of RT-PCR, that LT-antigen was actively transcribed in 60 % of the JCV - positive tested biopsies. Altogether, the results from gene amplifications and gene expression analysis of the various brain tumor samples add further elements in favor of the possible association of JCV with CNS tumors, and especially with glioblastoma.

Osteogenic protein-1 (OP-1 or BMP-7) is a member of Bone Morfogenic Proteins’s family (BMPs) and consists of 431 amino acid. BMPs are multi-functional growth factors belonging to the transforming growth factor ? (TGF-?) superfamily. Implicated in a variety of functions as the formation of cartilage and bone, and the development of non-osteogenic tissues (heart, nerve), BMPs are secreted as a precursor approximately four times longer than the mature form, and share a C-terminal distinctive pattern ..C…CXGXC…CC…CXCX.. containing seven cysteines, the active region of the proteins. In this study we prepared a recombinant fusion protein, called TAT-OP1, including TAT sequence, an Arg rich peptide derived from HIV protein usually used to perform the cell transfection, and a portion of OP-1 sequence. The construct TAT-OP1, 162 aminoacids long, starts with an N-terminal 6His-tag followed by TAT sequence (all together 30 AA), a peptidase specific cleavage site (spanning 6 AA) and the C-terminal OP-1 domain (126 AA) containing the cysteines motive. Obtained by recombinant DNA technology, the protein TAT-OP1 has been purified by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) and RP-HPLC, then characterized by SDS-PAGE, aminoacid analysis, UV, CD, and mass spectrometry. In order to demonstrate the osteogenic potential of recombinant fusion protein TAT-OP1, we treated osteoblastic cell line MC3T3-E1 by using different treatment conditions (pulse- 200 nM and in continous- 5.5, 13.5 and 27 nM treatment). After 7 and 14 days of cellular treatment performed by application of both stimulation methods, the presence of calcium salt deposits, alkaline phosphatase activity and the expression of osteogenic markers (osteopontin, osteocalcin and Cbfa1/Runx2) were detected by colorimetric and immunoflorescence assays. To investigate the possible applications of this protein in bone tissue engineering, we developed a research model using adherent fibroblastic cells isolated from umbilical cord blood (UCBMSCs) and a three-dimensional (3D) synthetic scaffold, named Puramatrix Hydrogel TM to mimic the native micro-environment. Moreover, PLGA micro-beads were employed to allow a controlled release of TAT-OP1 with the aim to maintain a suitable level of protein for prolonged times, enhancing its stimulation efficacy. The primary cultures of UCBMSCs were separated by density-gradient method and were phenotypically characterized in 2D system for the expression of CD105, CD90, CD166, nestin, c-kit, CD31, CD34 and CD38 and for their multi-differentiative potential. As detected on MC3T3-E1 cells, TAT-OP1 demostrated to stimulate nodule calcium formation and the expression of alkaline phosphatase when the cells were treated by both of stimulation methods. After encapsulation into Puramatrix Hydrogel TM, the cellular response to TAT-OP1 stimulation was evaluated by using electron microscopy analysis, to detect the production of bone like ECM. After 27 days of stimulation with TAT-OP1 (200 nM), microfibrils were observed partially aggregated around the cells. Calcification nodules and Hydroxyapatite crystals were detected only in the cultures encapsulated into Puramatrix Hydrogel TM and treated with PLGA microspheres-controlled release system. Further investigations will define the utility of this technical approach to improve the in vitro study of osteogenic differentiation and the biological activity of TAT-OP1 for clinical application in the field of bone tissue engineering.

Purpose: Gastrointestinal stromal tumors (GIST) are commonly regarded as solitary tumors, and the occurrence of multiple lesions is considered an extraordinary event restricted to pediatric GISTs and rare hereditary conditions. Beyond these well-defined situations, the presentation of multiple synchronous lesions is commonly viewed as the result of the metastatic spreading of a single primitive GIST. Based on this axiom, patients with multifocal disease are by default classified as advanced stage and treated as such. Whether, indeed, the detection of several lesions in sporadic adult GIST patients may be suggestive of phenomena of tumor multiplicity still needs to be clarified. Experimental design: From a multicentric series of 442 consecutive cases, 79 of which diagnosed with advanced disease, we selected 5 patients who presented up to 4 distinct GIST nodules. Five additional cases with silimar characteristics were retrieved by collaborators. Clonal relationships of the synchronous lesions was assessed by comparing c-KIT/PDGFRA mutation and microsatellite pattern . Results: An independent origin of the syncronous lesions was assessed in 6 out of the 10 cases analyzed. Interestingly, in one patient one of the lesions stemmed from the peritoneum, ordinarily regarded as a site of metastasis. Conclusions: Our data indicate that a significant fraction of GIST patients with multifocal manifestations are actually affected by multiple primary GISTs, suggesting that mesenchymal cells of these subjects are somehow primed to transformation Thus, in the presence of multifocal GIST manifestations, an accurate characterization of the different tumor localizations should be taken into account for a proper patient staging and planning of the therapy.

Allo stato attuale RM dinamica e TC multifasica mediante l analisi dell enhancement consentono informazioni quali- quantitative della vascolarizzazione di piccoli tumori renali e quindi una più accurata caratterizzazione. TIPOLOGIA DELLO STUDIO ED OBIETTIVI Studio retrospettivo di piccole masse renali con diagnosi istologica, identificate con ecografia e/o con TC trifasica. OBIETTIVO PRIMARIO: Confrontare i risultati della RM dinamica e della TC trifasica nella valutazione quali- quantitativa dell enhacement dei carcinomi renali di piccole dimesioni. OBIETTIVO SECONDARIO: Valutare la possibilità dell analisi quali- quantitativa dell enhancement con RM dinamica e TC trifasica nella diagnosi differenziale dei tumori renali.

Gli estratti ottenuti da piante medicinali sono costituiti per lo più da miscele complesse di composti attivi chimicamente differenti, anche conosciuti come metaboliti secondari. L’attività biologica dei prodotti naturali non è da attribuire a un singolo composto, ma piuttosto alla moltitudine di molecole che agiscono in sinergia tra loro. Per questa ragione la determinazione di tutti i costituenti attivi rappresenta un punto cruciale per assicurare l’efficacia, attendibilità e sicurezza nell’uso dei prodotti medicinali a base di piante. Ancora oggi, il controllo di qualità ed autenticità delle materie prime vegetali è ostacolato dalla mancanza di metodi analitici validati e dalla limitata disponibilità di standard di riferimento. I metodi di analisi per gli estratti vegetali e per i prodotti nutraceutici devono essere costantemente messi a punto ed aggiornati, dal momento che sempre nuove combinazioni di sostanze vengono impiegate in nuove formulazioni. Questo progetto di Dottorato di ricerca si è basato sullo sviluppo e successiva applicazione di metodi innovativi per l’analisi di metaboliti secondari di origine vegetale. Particolare attenzione è stata rivolta all’analisi di piante di interesse farmaceutico (Cannabis sativa L., and Spathodea campanulata P. Beauv.) e nutraceutico (Morus alba L., Aloysia polystachya Griseb. et Moldenke). Oggetto di questa dissertazione sono anche i diversi saggi in-vitro, messi a punto per valutare l’attività biologica degli estratti in analisi. Nel primo Capitolo, è stata applicata la spettroscopia NMR per la determinazione dei principali cannabinoidi non psicoattivi presenti nelle infiorescenze femminili di Cannabis da fibra. Il metodo analitico è stato sviluppato e validato in conformità alle linee guida internazionali. Questa tecnica trova applicazione nel monitoraggio del materiale vegetale di partenza, per garantire una migliore riproducibilità nei test biologici e per assicurare efficacia e sicurezza nell’uso di prodotti farmaceutici derivati. Come proseguimento del lavoro, metodi separativi e non separativi per l’analisi dei cannabinoidi sono stati discussi e messi a confronto per comprenderne potenzialità e svantaggi. Alcune varietà di C. Sativa sono state selezionate per la preparazione di estratti ricchi in cannabinoidi non psicoattivi, di cui è stata valutata l’attività antiproliferativa su modelli cellulari. Nel secondo Capitolo, è presentato uno studio di caratterizzazione della composizione chimica di varietà di gelso Italiane, quali fonti di principi attivi nel contesto di nuovi approcci terapeutici per il diabete mellito. Questo studio, primo nel suo genere, prevede di selezionare le cultivar più idonee alla produzione di estratti standardizzati a base di attivi ipoglicemizzanti. Le proprietà antiglicative e antidiabetiche di estratti di foglie di gelso sono state testate e diverse strategie per ritardare il rilascio dei componenti attivi sono state sviluppate al fine di potenziarne le capacità terapeutiche. Nel terzo Capitolo è stata analizzata la composizione chimica di S. campanulata, mediante HPLC-ESI-MS2. L’obiettivo principale è stato quello di individuare i composti responsabili della documentata inibizione di H. pylori e fare luce sui meccanismi alla base dell’attività biologica. Nel quarto Capitolo è stata indagata la composizione fenolica di A. polystachya, mediante tre differenti tecniche MS accoppiate all’HPLC. Il metodo di analisi è stato sviluppato e validato per l’identificazione dei principali metaboliti, e alcuni di essi sono stati identificati per la prima volta in questa pianta.
Plant extracts mainly consist in complex mixtures of chemically different bioactive compounds also known as secondary metabolites. In most cases, the bioactivity of natural products is not ascribable to a single compound, but rather to a multitude of them acting in a synergistic way. In this view, the complete definition of all the phytochemical constituents represents a key point to ensure the efficacy, reliability, and safety in the use of herbal medicines. Even today, the quality and authenticity assessment of herbal raw materials is frequently impaired by the lack of validated analytical methods and by the limited availability of certified references. Techniques for the analysis of herbal extracts and nutraceuticals need to be developed and upgraded continuously since different combinations of ingredients are employed in new formulations. In view of the above, the current PhD project was focused on the development and application of innovative analytical methods for the analysis of plant bioactive secondary metabolites. Particular attention was paid to plants of pharmaceutical (Cannabis sativa L., and Spathodea campanulata P. Beauv.) and nutraceutical interest (Morus alba L., Aloysia polystachya Griseb. et Moldenke). Different in-vitro assays for the bioactivity evaluation of these plants’ extracts were also the object of this PhD Thesis. In Chapter 1, the NMR technique was applied for the determination of the main non-psychoactive cannabinoids in fiber-type Cannabis female inflorescences. The analytical method was developed and fully validated to show compliance with international requirements. This technique finds application in the monitoring of the plant material, to guarantee a better reproducibility for biological assays, and to ensure the efficacy and safety of Cannabis-derived products. As a continuation of this project, the potentialities and drawbacks of separation and non-separation methods for the analysis of cannabinoids were considered and compared. Finally, C. sativa non-psychoactive varieties were selected for the preparation of cannabinoids rich extracts to evaluate their antiproliferative activity, by using cellular models. In Chapter 2 the chemical composition of Italian mulberry was investigated, as a source of phytochemicals in the context of new therapeutic approaches for diabetes mellitus. The first aim was to assess the quality of the plant material in comparison to Far Eastern Asia cultivations, where mulberry has been considered as a medicine for the treatment of diabetes for decades. The antiglycative capacity and hypoglycaemic effect of leaf extracts were evaluated on different in vitro models, to understand the potentialities of mulberry for the therapy of hyperglycaemia. Finally, the development of novel strategies for delaying the release of mulberry active constituents and enhancing therapeutic results will be discussed and are intended as the conclusion of this research project. In Chapter 3 the chemical composition of S. campanulata was investigated by HPLC-ESI-MS2, to clarify which are the most active components responsible for the inhibition of H. pylori growth. The aim was also to disclose the mechanisms underlying the biological activity. In Chapter 4 the phenolic composition of A. polystachya was investigated by means of three different MS techniques coupled to HPLC. The analytical method was developed and validated for the identification of metabolites and some phenylpropanoids were detected in this plant for the first time.

Il cancro del colon-retto è una delle neoplasie più frequenti, ad alto tasso di mortalità, causato dall’interazione di fattori genetici e ambientali. Parallelamente al modello stocastico, secondo il quale tutte le cellule tumorali (CT) hanno una stessa probabilità di rigenerare un tumore, sta prendendo piede il modello che vede solamente in un piccolissimo sottogruppo di cellule staminali tumorali (CST) la capacità di dar luogo e sostenere la crescita tumorale. Dalla letteratura si evince come le CST mostrino deregolazioni a carico di geni implicati in: chemio-resistenza, transizione epitelio-mesenchimale (EMT), auto-rinnovamento incontrollato, processi peculiari delle CST, che favoriscono l’insorgenza di un fenotipo tumorale. Lo scopo del progetto di Dottorato è stato quello di isolare e caratterizzare le CST sia da linee cellulari tumorali che da biopsie di tumore al colon-retto, per identificare marcatori tumorali utili a delineare le fasi di progressione del tumore e di individuare potenziali bersagli terapeutici. Inoltre, ho sottoposto le CT e le CST di una linea di adenocarcinoma del colon-retto (HCA7), a trattamento con l’estratto naturale di T. cordifolia, pianta utilizzata della medicina Ayurvedica, ed uno dei suoi principi attivi, la berberina, allo scopo di verificarne l'efficacia antitumorale. Ho osservato importanti deregolazioni nelle popolazioni cellulari trattate, a carico di diversi geni coinvolti principalmente nella EMT, nella regolazione del ciclo cellulare e della apoptosi e nel favorire un fenotipo chemio-resistente. I livelli di espressione di questi geni sono risultati essere significativamente sotto-espressi, sia nelle CT trattate che nelle CST trattate. I risultati che ho ottenuto depongono a favore di un potenziale ruolo attivo della sostanza naturale sottoposta ad indagine, nel contrastare molti di quei processi fondamentali per lo sviluppo di un fenotipo tumorale. Inoltre, i miei dati avvallano anche l’ipotesi che vede le CST come potenziali bersagli terapeutici, per ottenere un effetto mirato su questa popolazione cellulare tumorale.
Colorectal cancer is one of the most frequent cancer, with a high mortality rate, caused by the interaction of genetic and environmental factors. Parallel to the stochastic model, according to which all tumor cells (CT) have the same probability of regenerating a tumor, there is a new model that look in a very small subset of cancer stem cells (CST) the responsible of tumor growth. In the literature, CSTs shows important deregulations on genes implicated in: chemo-resistance, epithelial-mesenchymal transition (EMT), uncontrolled self-renewal, peculiar processes of this small subpopulation, which favor the onset of a tumor phenotype . The aim of my PhD project was to isolate and characterize CSTs both from tumor cell lines and from colorectal cancer biopsies, in order to identify tumor markers useful for delineating the phases of tumor progression and identifying potential therapeutic targets. In addition, I treated the CT and CST of a line of colorectal adenocarcinoma (HCA7) with the natural extract of T. cordifolia, a plant used in Ayurvedic medicine, and one of its active ingredients, berberine, in order to verify its antitumor efficacy. I observed important deregulations in treated cell populations, dependent on several genes involved mainly in EMT, in cell cycle regulation and apoptosis, but also in promoting a chemo-resistant phenotype. The expression levels of these genes were found to be significantly under-expressed, both in the treated CTs and in the treated CSTs. The results I have obtained are in favor of a potential active role of the investigated natural substance, in countering many of those fundamental processes for the development of a tumor phenotype. Furthermore, my data also support the hypothesis that CSTs are potential therapeutic targets for the purpose of achieving a targeted effect on this cell tumor population.

L’attività di ricerca svolta in questa tesi di dottorato è stata incentrata sulla valorizzazione della biodiversità della foresta amazzonica tramite lo studio di piante aromatiche dell’Ecuador. Tali piante sono particolarmente ricche di oli essenziali, metaboliti secondari costituiti principalmente da molecole volatili odorose, note per essere spesso biologicamente attive. Proprio per via della loro fragranza, gli oli essenziali sono sovente contemplati nelle tradizioni etnomediche delle popolazioni indigene. Questo studio ha come punto di partenza le informazioni della medicina tradizionale con lo scopo di investigare piante poco conosciute potenzialmente interessanti per la salute dell’uomo (in campo farmaceutico, cosmetico ed alimentare). Dopo un’accurata ricerca in letteratura, sono state selezionate per essere studiate le seguenti piante: Chenopodium ambrosioides, Dacryodes peruviana, Piper carpunya, Schinus molle, Tagetes minuta, Endlicheria klugii, Ocotea cernua, Cymbopogon citratus, Ocimum micranthum e Ocotea quixos. Queste specie vegetali fanno parte di differenti famiglie proprio per abbracciare una maggior biodiversità possibile. Grazie ad una collaborazione con l’Universidad Politecnica Salesiana (Quito, Ecuador) e con l’Universidad Estatal Amazonica (Puyo, Ecuador), sono state distillate le droghe fresche delle piante ottenendone gli oli essenziali per arrivare poi ad un “fingerprinting” chimico e biologico. Gli oli essenziali sono stati caratterizzati chimicamente tramite gascromatografia accoppiata alla massa (GC-MS) e risonanza magnetica nucleare (NMR) per una determinazione qualitativa e quantitativa dei composti in essi presenti e successivamente sono stati testati per determinare diverse attività biologiche. Si è partiti dallo studio dell’attività antiossidante mediante il saggio del DPPH, dove l’olio essenziale di O. micranthum ha confermato eccellenti risultati. Sono stati eseguiti test di attività antimicrobica con batteri e funghi sia patogeni per l’uomo che fitopatogeni ed è stata approfondita la loro attività di sinergismo con farmaci di sintesi. Particolarmente interessante si è rilevata l’attività su funghi dermatofiti dove molti dei campioni sono risultati efficaci e il sinergisno con il fluconazolo degli oli essenziali di P. carpunya e S. molle nei confronti di vari ceppi di Candida spp. Sono stati effettuati anche esperimenti di attività antinfiammatoria, nei quali i risultati migliori si sono ottenuti con l’olio essenziale di C. ambrosioides. Per verificare invece la sicurezza per l’uomo sono stati eseguiti test di attività mutagena, dove tutti gli oli essenziali presi in considerazione sono risultati negativi. Infine, è stata realizzata una formulazione cosmentica contenente l’olio essenziale di O. micranthum, ossia quello che si è mostrato più attivo. Lo scopo era quello di trovare un’applicazione per i campioni più promettenti al fine di valorizzare la biodiversità della foresta Amazzonica.
The research activities performed in this PhD thesis focuses to promotion of Amazonian rainforest biodiversity by studying aromatic plants of Ecuador. Aromatics plant are reach of essential oils, secondary metabolites consisting mainly in fragrant volatile molecules known to be usually biologically active. Just for their fragrance essential oils are often known by ethnomedicine of indigenous populations. This study starts from information of traditional medicine to investigate poorly known plants potentially interesting for human health (in pharmaceutical, cosmetic and food environment). After careful literature research were choosen these plants Chenopodium ambrosioides, Dacryodes peruviana, Piper carpunya, Schinus molle, Tagetes minuta, Endlicheria klugii, Ocotea cernua, Cymbopogon citratus, Ocimum micranthum and Ocotea quixos. All of different families to consider greater biodiversity possible. Collaborating with the Universidad Politecnica Salesiana (Quito, Ecuador) and with Universidad Estatal Amazonica (Puyo, Ecuador), fresh crude drugs have been distilled to obtain essential oils (EOs) for a phytochemical and biological fingerprinting. The EOs have been chemically characterized through GC-MS and NMR for qualitative and quantitative determination of the compounds and tested for various biological activities. Was performed antioxidant activity with DPPH assay, where O. micranthum essential oil confirmed excellent results. Was performed antimicrobial assays for human or plant pathogens bacteria and fungi, and synergistic studies between essential oil and synthetic drugs where essential oils have been particular efficient against dermatophyte and P. carpunya and S. molle essential oils shown good synergism with fluconazole in Candida spp. Strains. Were conducted antinflamatory tests in which C. ambrosioides essential oil gave best results and mutagenic experiments to verify human safety that excluded potential mutagenic activities. Finally was made a cosmetics formulation with O. micranthum, the more active essential oil. The aims was precisely to find an application for best samples to increase in value the Amazonian biodiversity.

La microflora della rizosfera riveste un ruolo fondamentale sia nella difesa che nello sviluppo e crescita delle piante. Molti studi hanno dimostrato inoltre che i nematodi sono in grado d’influenzarne la composizione. I batteri a loro volta producono una varietà di composti (antibiotici, nutrienti, esoenzimi e altre molecole segnale), in grado d’indurre ulteriori cambiamenti. L’obiettivo di questo lavoro è stato quello di studiare i cambiamenti nella biodiversità della microflora batterica di un terreno proveniente da un’azienda biologica, conseguenti all'introduzione sperimentale di larve di Meloidogyne incognita e al trattamento con un nematocida (fenamifos). Seguendo un approccio metagenomico, l'RNA totale è stato estratto da campioni di 2 g di terreno, sequenziando la regione ipervariabile V4 del 16S rRNA batterico con piattaforma Illumina MiSeq. Le analisi bioinformatiche delle sequenze ottenute sono state eseguite con Pandaseq e Qiime. Sono stati rinvenuti 578 generi afferenti a 359 famiglie e 197 ordini, che definiscono 4878 OTU in 91 classi e 29 phyla, diversamente rappresentate nei campioni analizzati. Non tutte le sequenze hanno permesso un’identificazione di pari livello tassonomico per tutti i batteri presenti, per via della mancanza d’informazioni relative ai livelli tassonomici inferiori nei database di riferimento. Tra i generi comuni a entrambi i trattamenti sono stati osservati: Candidatus Solibacter, Streptomyces, Rubrobacter, Nitrospira e Steroidobacter, con frequenze variabili in ciascun campione. La presenza di M. incognita e il relativo trattamento nematocida hanno comportato l'introduzione o identificazione ex novo di batteri appartenenti a ulteriori taxa rispetto al controllo. L'analisi metagenomica ha anche mostrato una significativa variazione nella diversità batterica in relazione ai trattamenti effettuati sullo stesso terreno, confermando che essa non sia da considerare un dato statico e definitivo, ma sia soggetta a cambiamenti indotti da variabili ambientali presenti anche su scale e volumi molto ridotti. Dall'analisi delle informazioni ottenute dal sequenziamento e nonostante la comune origine dei campioni di terreno, il grado di biodiversità osservato suggerisce una componente iniziale legata all’eterogenea distribuzione di specie all’origine. Su questa base, il trattamento chimico e la presenza di M. incognita hanno indotto ulteriori cambiamenti sulla biodiversità, sia riducendo che incrementando alcuni generi rispetto ad altri. L'analisi della biodiversità osservata in entrambi gli esperimenti indica inoltre che una parte significativa, se non maggioritaria, delle specie batteriche sequenziate è ancora poco conosciuta dal punto di vista tassonomico. Ciò è indicato dalla presenza di OTUs appartenenti a generi come Pseudomonas e Bacillus per le quali non è ancora possibile assegnare una specie. In parallelo, le stesse conclusioni possono essere dedotte dalla presenza di altri taxa, per i quali non è ancora possibile definire una classificazione certa. Le specie di Bacillus associate a nematodi sono risultate numerose, includendo possibilmente potenziali agenti di biocontrollo. L’identificazione di nuovi antagonisti comporta vantaggi non solo economici, ma anche ambientali, grazie alla riduzione dell’impatto dei trattamenti nematocidi, garantendo sicurezza per operatori e consumatori e incrementando la sostenibilità nella gestione della rizosfera.
The rhizosphere microflora plays an important role in plants defense, development and growth. Many studies also showed that soil nematodes are capable of influencing its composition. Soil bacteria in turn produce a variety of compounds (antibiotics, nutrients, exoenzymes and other signal molecules), able to induce further changes. The objective of this work was to study the biodiversity changes of the bacterial microflora from an organic farm soil, following the experimental introduction of juveniles of Meloidogyne incognita and a treatment with a nematicide (fenamiphos). Following a metagenomic approach, total RNA was extracted from 2 g soil samples, sequencing the hypervariable V4 region of the bacterial 16S rRNA with an Illumina MiSeq platform. Bioinformatic analyses of the sequences obtained were performed with Pandaseq and Qiime. A totale of 578 genera belonging to 359 families and 197 orders was found, defining 4878 OTUs from 91 classes and 29 phyla, otherwise represented in the samples analyzed. Not all sequences allowed identification at the same taxonomic level for all bacteria, due to the lack of informations on lower taxonomic levels in the reference database. Among the genera common to both treatments we observed: Candidatus Solibacter, Streptomyces, Rubrobacter, Nitrospira and Steroidobacter, with varying frequencies in each sample. The presence of M. incognita and the nematicidal treatment led to the introduction or de novo identification of bacteria belonging to further taxa, when compared to the control. The metagenomic analysis also showed a significant variation in the bacterial diversity in relation to treatments carried out on the same soil, confirming that biodiversity should not be considered as static and determined, but undergoes changes induced by environmental variables also acting on very small scales and volumes. From the analysis of the sequence data obtained and despite the common origin of the soil samples, the degree of biodiversity observed suggests a component linked to the initial, heterogeneous distribution of species. On this basis, the chemical treatment and the presence of M. incognita induced further biodiversity changes, reducing or increasing certain genera more than others. The analysis of biodiversity observed in both experiments also indicates that a significant portion, if not the majority, of the bacterial species is still poorly understood by the taxonomic point of view. This is shown by the presence of OTUs belonging to genera such as Pseudomonas and Bacillus for which it is not yet possible to assign a species. In parallel, the same conclusions can be derived from the presence of other taxa, for which it is not yet possible to define a certain classification. Bacillus species increased in samples with nematodes, possibly including potential biocontrol agents. The identification of novel antagonists involves not only economic but also environmental benefits, thanks to the reduction of chemicals impacts, ensuring safety for operators and consumers and increasing the sustainability of rhizosphere management.

This thesis has been focused on the proteomic characterization of human saliva from donors of different ages, starting from birth up to adult age, and pediatric brain tumor tissues. The first study has been performed in order to compare the acid-insoluble fraction of saliva from preterm with at-term newborns and adults and establish if differences exist. In the second study medulloblastoma and pilocytic astrocytoma pediatric brain tumor extracts have been compared. In both studies 2- DE analysis was coupled with high resolution tandem mass spectrometry (MS/MS). The proteomic characterization of the acid-insoluble fractions of saliva from preterm newborns allowed to integrate data previously obtained on the acid-soluble fraction by HPLC-electrospray ionization (ESI)-mass spectrometry (MS), and to evidence several differences between preterm newborns, at-term newborns and adults. Spots differentially expressed between the three groups, according to image analysis of the gels, were submitted to in-gel tryptic digestion and the peptide mixture analyzed by high performance HPLC-ESI-MS/MS for their characterization. By this strategy, we identified three over-expressed proteins in atterm newborns with respect to preterm newborns and adults (BPI fold-containing family A member 1, two proteoforms of annexin A1, and keratin type 1 cytoskeletal 13), and several over-expressed proteins in adults (fatty acid-binding protein, S100A6, S100A7, two proteoforms of S100A9, several proteoforms of prolactin-inducible protein, Ig kappa chain, two proteoforms of cystatin SN, one proteoform of cystatin S and several proteoforms of α-amylase 1). Moreover, for the first time, it was possible to assign by MS/MS four spots of human saliva 2-DE, already detected by other authors, to different proteoforms of S100A9. The strategy applied used a sequential staining protocol to the 2-DE gels, first with Pro-Q Diamond, that allows specific detection of phosphoproteins, and successively with total protein SYPRO Ruby stain. In the second study, proteomic analysis of two pediatric brain tumor tissues pointed out differences between medulloblastoma, the prevalent malignant tumor in childhood, and pilocytic astrocytoma, the most common, that only rarely shows a malignant progression. Due to the limited availability of bioptic tissue, the study was performed on pooled tumor tissues, and was focused on acid-insoluble fraction to integrate the characterization performed by a group of colleagues in Rome on the acid-soluble fraction by high performance HPLC-ESI-MS/MS. The results indicated that the two tumors exhibit different proteomic profiles and evidenced interesting differential expression of several proteins. Among them, peroxiredoxin- 1, peptidyl-prolyl cis–trans isomerase A, heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1, mitochondrial isoform of malate dehydrogenase, nucleoside diphosphate kinase A, glutathione S-transferase P and fructose bisphosphate aldolase A resulted significantly over-expressed in medulloblastoma while glial fibrillary acidic protein, serotransferrin, α crystallin B chain, ferritin light chain, annexin A5, fatty acid-binding protein (brain), sorcin and apolipoprotein A-I resulted significantly over-expressed in pilocytic astrocytoma. In conclusion, the work done allowed to evidence the usefulness of using an integrated bottom-up/top-down approach, based on 2-DE-MS analysis and high performance MS in order to obtain a complete characterization of the proteome under investigation, revealing and identifying, not only peptides and small proteins, but also proteins with higher MW, that often it is not possible to identify by using exclusively a top-down ESI-MS approach.

Recent reports have shown that tumor growth is supported by a specific subpopulation of stem cells, known as cancer stem cells (CSCs) or tumor-initiating cells. This cells have stem-like features, such as self renewal,multipotency, high migration capacity, drug resistance and aberrant differentiation. CSCs have been detected in several kind of tumors and in cancer cell lines grown as non-adherent spheres in serum–free medium under intense stimulation whit growth factors. Presence of cancer stem-like cells in thyroid differentiated carcinoma has not yet fully investigated and the literature on such issue is still limited. The objective of this study was to identify and characterize CSCs from a cancer cell line from papillary thyroid carcinoma (B-CPAP) and a cell line, derived from human thyroid follicular cells (N-THY-ORI 3-1), as control. Thyrospheres from B-CPAP cells could be propagated up to ten generations, whereas those from N-THY-ORI 3-1 lasted only for four generations. The “stemness” profile was evaluated by functional assays and RT-PCR. B-CPAP sphere forming efficiency (SFE) and self renewal increased exponentially at every generation with maximum value at the 8th. By contrast, N-THY-ORI 3-1 SFE and self renewal progressively decreased along generations. RT-PCR showed mRNA expression of stem cell markers (Oct 4, Nanog, ABCG2) and early and thyroid late differentiation markers (PAX8, TTF1, Tg) in B-CPAP thyrosphere. In particular, ABCG2 expression significantly increased in thyrospheres at 9th generation. On the contrary, PAX8, TTF1 and Tg showed a decrease in thyrosphere along the generation of spheres, while p63 maintained the same expression in all samples. Thyrospheres from non tumorigenic cell line were positive for mRNA expression of stem cell markers (Oct4, Nanog, ABCG2,) and PAX8. In this cell line, Nanog and ABCG2 mRNA expression increased along the generations. To isolate stem-like cells in tumor and normal thyrospheres, we used the fluorescent dye PKH26. The single cells suspensions from thyrospheres were then FACS sorted. According to fluorescent intensity we selected two populations: the brightest fluorescent cells (PKH26 high), which constitute the putative stem cell population and the dimmest fluorescent cells (PKH26 low), which represent proliferating and differentiated cells. Both populations were able to form sphere, but only PKH26 high formed secondary spheres. The molecular analysis showed a higher stem cell marker mRNA expression in PKH26 high compare to PKH26 low cells. On the contrary TTF-1, PAX8 and Tg mRNA were more expressed in PKH26 low cells. Take together, our data show, for the first time, that B-CPAP and N-THY-ORI 3-cell lines contain cells with features and properties of stem cell.

Purpose: Focal pattern in multiple myeloma (MM) seems to be related to poorer survival and differentiation from diffuse to focal pattern on computed tomography (CT) has inter-reader variability. This study aims evaluate if Radiomic approach could help radiologists in differentiating diffuse from focal patterns on CT.
Methods: We retrospectively reviewed imaging data of 70 patients with MM with CT, PET-CT or MRI available before bone marrow transplant. Two general radiologist evaluated, in consensus, CT images to define a focal (at least one lytic lesion > 5 mm in diameter) or a diffuse (lesions < 5 mm, not osteoporosis) pattern. N = 104 Radiomics features were extracted and evaluated with an open source software. Results: We found, after feature reduction, 9 features were different (p < 0.05) in the diffuse and focal patterns AUC of the Radiologists versus Reference Standard was 0.64. Conclusion: A Radiomics approach improves radiological evaluation of focal and diffuse pattern of MM on CT.

Il Paclitaxel (PTX) è un potente agente chemioterapico approvato per il trattamento di numerosi tumori solidi. Tuttavia, la scarsa solubilità in acqua e l’elevata tossicità causano gravi effetti collaterali che pregiudicano severamente la qualità di vita dei pazienti, già compromessa dalla patologia. Il presente lavoro di tesi ha riguardato la preparazione mediante nano-precipitazione di micelle di un pro-farmaco del PTX (PTX2S), caricate con feoforbide a (PheoA), una molecola fotosensibile che illuminata ad una specifica lunghezza d’onda genera specie reattive all’ossigeno (ROS) e ossigeno di singoletto (1O2) capaci di uccidere le cellule tumorali. Le nanomicelle sono state caratterizzate in termini di stabilità in condizioni fisiologiche, capacità di loading e di rilascio del farmaco e sviluppo di ROS a seguito di irraggiamento con luce bianca. Inoltre, test preliminari in vitro eseguiti su cellule staminali mesenchimali umane (MSC) hanno dimostrato che le nanomicelle sono efficacemente internalizzate dalle cellule senza comprometterne la vitalità e la morfologia. Tali dati preliminari dimostrano che le MSC possono essere quindi utilizzate come vettori selettivi delle nanomicelle qui descritte.

Il controllo degli artropodi infestanti le derrate in post-raccolta si basa principalmente sull’utilizzo di molecole chimiche di sintesi. I loro residui – spesso presenti nei prodotti alimentari finiti – hanno destato nell’opinione pubblica crescenti preoccupazioni di ordine igienico sanitario. Anche la legislazione Europea – dal canto suo – impone limiti restrittivi alla loro presenza nei cibi e al loro uso. Nell’ambito delle tecniche alternative ai pesticidi di sintesi, gli oli essenziali mostrano interessanti potenzialità per il controllo degli insetti. Il lavoro svolto in questa tesi si è proposto di valutare l’efficacia insetticida di due oli essenziali commerciali, estratti da Cannabis sativa L. e Coridothymus capitatus (L.) Rchb. f., nel controllo di Tribolium castaneum Herbst, uno degli insetti più dannosi delle derrate. La loro caratterizzazione chimica ha permesso di individuare alcune molecole che presumibilmente sono responsabili dell’azione tossica nei confronti del coleottero. I risultati ottenuti mostrano un’attività insetticida di entrambi gli oli essenziali in condizione di temperatura modificata. All’interno di un moderno protocollo di lotta integrata agli insetti, gli oli essenziali potranno effettivamente rappresentare uno tra i diversi ausili tecnici alternativi agli insetticidi di sintesi, che puntino a ridurre al minimo la presenza di residui chimici nei prodotti alimentari.

La via di trasduzione del segnale di Hedgehog (Hh) gioca un ruolo cruciale nello sviluppo e nella tumorigenesi, nonchè nella proliferazione e mantenimento delle cellule staminali tumorali (CSCs). L’attivazione di questa via del segnale avviene in seguito al legame del ligando Hh con il recettore inibitorio Patched1 (Ptch1). Tale interazione rimuove l’effetto inibitorio che Ptch1 esercita su un altro recettore, Smoothened (Smo), che rappresenta il regolatore positivo chiave nella trasduzione del segnale. Questo evento consente il rilascio dei fattori trascrizionali zinc-finger della famiglia Gli (Gli1, Gli2 e Gli3), permettendone la traslocazione nucleare e la conseguente attività trascrizionale. Un'aberrante attivazione del signaling è responsabile dell'insorgenza di diversi tipi di tumore tra i quali il medulloblastoma, il rabdomiosarcoma, il carcinoma a cellule basali e molti altri. La carcinogenesi Hh dipendente è legata ad alterazioni genetiche e/o molecolari a carico dei componenti più importanti della via, quali ad esempio mutazioni attivanti del recettore Smo, inattivanti il recettore Ptch1 o il regolatore SuFu, traslocazioni di Gli1 o amplificazioni di Gli1 o Gli2, iperattivazione di Gli1 attraverso meccanismi non canonici. Dato il ruolo fondamentale nella tumorigenesi e nel mantenimento delle nicchie di cellule staminali tumorali, la via del segnale di Hh rappresenta oggi un attraente bersaglio terapeutico nel cancro. Negli ultimi anni la maggior parte delle ricerche sono state focalizzate sullo sviluppo di farmaci in grado di bloccare l’effetto attivatorio di Smo. Tra questi, il vismodegib (GDC-0449/Eridevige®) è stato il primo inibitore di Hh approvato dalla FDA nel 2012 per il trattamento del carcinoma a cellule basali. Tuttavia, diversi studi hanno portato alla luce alcuni limiti degli inibitori sin qui individuati, legati in particolare alla scarsa selettività, allo sviluppo di farmaco resistenza e all’attivazione dell’effettore finale della pathway, Gli1, mediata da altre vie oncogeniche. Queste evidenze sollevano la necessità di identificare nuovi e più efficaci inibitori di Hh in grado di vincere la farmaco resistenza e contrastare la crescita del tumore. Al fine di raggiungere questo obiettivo, abbiamo condotto uno studio innovativo di tipo computazionale finalizzato all’individuazione, caratterizzazione e ottimizzazione di nuove molecole in grado di bloccare il potenziale oncogenico di Hh. Attraverso uno screening in silico di una libreria di piccole molecole di origine naturale, sintetica o semi-sintetica e sfruttando la struttura cristallografica dei componenti chiave di nostro interesse, il recettore Smo e il fattore di trascrizione Gli1, abbiamo identificato nuovi efficaci inibitori della via di Hh. In particolare, abbiamo individuato la prima molecola in grado di impedire l’attività trascrizionale di Gli1, grazie alla sua capacità di legare direttamente questo fattore di trascrizione ed inibirne il legame con il DNA. L’efficacia di tali molecole nel bloccare la proliferazione cellulare e quindi la crescita del tumore, è stata comprovata da test effettuati, in vitro ed in vivo, su modelli tumorali caratterizzati da un’aberrante attivazione del signaling di Hh. I nostri risultati svelano il potenziale di queste molecole come nuovi e promettenti approcci terapeutici per la cura dei tumori associati alla via di Hh.

Landfilling is still the most widely used form of disposal of MSW in Europe. Eurostat (2015) reports that in 2013, with reference to the 28 member states, about the 31% of MSW produced were disposed of in landfills. The same data is estimated at national level; in Italy, with reference to 2013, the MSW disposed in landfill amounted to the 31% of the produced waste (ISPRA, 2015). One of the main environmental challenges associated with landfills is the generation of LFG produced by the anaerobic decomposition of the organic waste fraction. LFG is mainly composed by methane (CH4) and carbon dioxide (CO2), and its production lasts until the majority of the organic material in the waste is degraded, which can take several decades. As is common knowledge, suboptimal cover design and improper landfills management can lead to undesired LFG emissions. For this reason, landfills are considered significant anthropogenic sources of odours and greenhouse gases. This thesis deals with impact of emission produced from the disposal of MSW in landfill and innovative mitigation technologies. The role of landfill in modern waste management system as well as the related environmental problems are discussed in Chapter 1. Furthermore, the basic principles of the microbial methane oxidation process as a mitigation strategy for landfill methane emissions are described. Chapter 2 addresses investigations with monitoring field campaigns to study the emissions from a waste management site. The different sources present in the study case are compared in order to identify the main environmental issues. In particular, the diffusive emissions from the landfill covers, the emissions from the mechanical biological treatment plant and the emissions from the landfill gas recovery plant are compared both in terms of magnitude and in terms of emitted compound. In Chapter 3 the results derived from a project performed in collaboration with a landfill manager and the environmental protection agency of Tuscany are presented. The main objective of the study is to assess if the undesired odour emissions during waste disposal is due to sensory characteristics of waste or to degradation processes that may occur already in the early phase of disposal. The study was conducted on samples on MSW compost from mechanical biological facilities and sludge from wastewater treatment plants. The study was performed through different phases: monitoring on the daily cover to assess the emission rates during disposal; characterization of waste, particularly determination of biological stability parameters; study of the possible reactivation of aerobic or anaerobic degradation processes in waste samples with specific lab tests (controlled batch reactors); chemical analysis of compounds emitted during the tests. Chapter 4 provides insight into the microbial methane oxidation of landfill gas as innovative technology to reduce landfill impact. The chapter presents results of both field and laboratory investigations. In particular it reports the results derived from the monitoring of a pilot bio-covers system implemented in a Tuscan landfill to assess the capacity of methane oxidation in different substrates, particularly compost from source-selected organic fraction, MSW compost from mechanical biological facility and mixed compost. The substrates were characterized by several biological and chemical-physical parameters. The oxidation efficiency of the biocovers was determined by gas and temperature profiles, calculated methane oxidation rates using a mass balance as well as landfill gas flux measurements. Furthermore, some laboratory column tests were carried out in order to assess the performance of the materials used in the field test with a known inlet biogas flow.