Littérature scientifique sur le sujet « BIO/13 BIOLOGIA APPLICATA MED/04 PATOLOGIA GENERALE »

Introduction: Cellular retinoic acid metabolism and homeostasis; Epigenetic gene regulation by retinoic acid; Retinoic acid signalling in breast development and morphogenesis; Disruption of epigenetic retinoic acid signalling in breast tumorigenesis. Scope of the thesis Materials and Methods Experimental Work: An impaired RA signal leads to RARbeta2 epigenetic silencing and RA resistance; Impairment of RA-RARalfa signalling leads to the concerted epigenetic silencing of RARbeta2 and CRBP1 in untransformed human breast epithelial cells; Mechanistic relationship between RARbeta2 and CRBP1 transcription and different phenotypes of breast epithelial cell transformation: Implications for predicting breast cancer risk; CRABP2 downregulation results in epigenetic dysregulation of RA signalling and consequent breast epithelial cell transformation. General Discussion Summary References Curriculum Vitae

2014 - 2015
The urokinase type plasminogen activator (uPAR) is a three domain GPI-anchored cell surface receptor. uPAR expression is strongly up-regulated and represents a negative prognostic factor in various tumors, including hematologic malignancies. uPAR expression is post-transcriptionally regulated by RNA binding proteins (RBPs). RBPs bind specific sequences in the 3’untranslated region (3’UTR) of uPAR-mRNA, stabilizing or destabilizing the transcript. The 3’UTR of transcripts from a large number of genes includes target sequences also for small translational repressors RNAs (miRNAs). miRNAs play key roles in many cellular pathways; their aberrant expression is a common feature of various malignancies. We selected three miRNAs miR-146a, miR-335 and miR-622 that could bind the 3’UTR of uPAR-mRNA; these three miRNAs, as reported in literature, are expressed in CD34+ HSC or in acute myeloid leukemia (AML) cells and can act as oncosuppressors by inhibiting oncogene expression. We found that selected miRNAs regulate uPAR expression by directly targeting its 3’UTR in AML cell lines. Indeed, uPAR expression is reduced by their overexpression and increased by their specific inhibitors. Overexpression of selected miRNAs impaired cell migration, invasion and proliferation of AML cell lines. Interestingly, we found an inverse relationship between uPAR expression and miR- 146a and miR-335 levels in AML blasts. This suggests their possible role in regulating uPAR expression also in vivo. We also investigated the capability of uPAR-3’UTR to act as competing endogenous RNA (ceRNA). We showed that uPAR-3’UTR overexpression up-regulates uPAR expression and expression of other targets of selected miRNAs; these results suggest that uPAR-3’UTR may recruit selected miRNAs, allowing translation of their targets, thus acting as ceRNA. [edited by Author]
XIV n.s.

La lamina nucleare (NL) è un reticolo di proteine fibrillari che riveste la superficie interna della membrana nucleare. Essa è principalmente composta da filamenti intermedi di tipo V , chiamati lamìne, e proteine ausiliari ad esse associate (lamin-associated proteins, LAPs). Nei mammiferi le lamìne sono codificate da tre geni : LMNA, che codifica per la lamìna A e lamìna C (lamìne di tipo A), LMNB1 e LMNB2 che codificano rispettivamente per la lamìna B1 e B2 (lamìne di tipo B). Lamìne e LAPs si associano a formare una matrice tridimensionale densa e dinamica che stabilisce numerose interazioni, sia stabili che transitorie, con diverse classi di molecole biologiche: DNA, fattori di trascrizione, proteine strutturali. Tutte queste interazioni sono essenziali per fornire stabilità strutturale e preservare l’integrità nucleare, per collegare fisicamente e funzionalmente la lamina nucleare al citoscheletro e per organizzare la cromatina. In questo modo, oltre a svolgere un ruolo strutturale fondamentale, la lamina nucleare risulta ricoprire ruoli chiave anche nei processi di meccanotrasduzione del segnale e nella regolazione dell’espressione genica ed epigenetica. Mutazioni a carico dei geni che codificano per le lamìne nucleari sono associate ad un'ampia ed etogenea classe di patologie note come laminopatie. Tra queste, una delle più controverse ed interessanti è la Hutchison-Gillford Progeria Syndrome (HGPS), una malattia genetica rara dovuta a una mutazione puntiforme nel gene LMNA. Tale mutazione risulta nella produzione di una versione tronca della lamìna A, mancante di 50 amminoacidi, conosciuta come Progerina. HGPS è principalmente caratterizzata da alterazioni morfologiche del nucleo e invecchiamento precoce. I soggetti affetti da Progeria, infatti, fin dai primi anni di vita sviluppano condizioni patologiche tipiche dell’età senile quali cataratta, diabete e l'osteoporosi pur preservando le normali funzioni congnitive. Questi pazienti muoiono tipicamente per complicanze cardiovascolari intorno ai 14 anni di età, in media. Considerando la sindrome di Hutchinson-Guilford come un esempio estremo di ciò che alterazioni della lamina nucleare comportano, durante il mio dottorato di ricerca ho investigato diversi aspetti riguardanti la biologia della lamina nucleare con particolare interesse all'impatto che perturbazioni strutturali della lamina nucleare possono avere sulle normali funzioni cellulari, la meccanica cellulare, la regolazione dell'espressione genica e l’ interconnessione esistente tra integrità della lamina nucleare, processo di invecchiamento e stress ossidativo. Per ottenere una visione d’insieme del contributo della lamina nucleare sia in condizioni fisiologiche che patologiche, sono state adottate strategie di ricerca basate su approcci interdisciplinari e integrativi in grado di tenere conto degli aspetti strutturali, meccanici e molecolari. Per fa questo, in prima instanza sono state effetuate delle analisi bionformatiche: tutti i dati di trascrittomica relativi a pazienti HGPS, presenti in database pubblici e in letteratura, sono stati raccolti e analizzati rispetto a dati equivalenti ottenuti da controlli sani. Tale analisi ha permesso di delineare profilo di espressione genica tipico di pazienti HGPS e di individuare i pathways deregolati in presenza della patologia. È stato inoltre studiato l’impatto che alterazioni della lamina nucleare hanno sulle connessioni fisiche e funzionali che questa stabilisce sia con elementi nucleari ed extra-nucleari, in un modello cellulare in cui è possibile indurre sperimentalmente, in modo controllato, l’espressione della forma mutata di Lamìn A responsabile dell’ HGPS. Tale modello cellulare ricapitola fedelmente il peculiare fenotipo cellulare dei pazienti risultando essere una valida alternativa all’utilizzo di linee primarie derivanti dai pazienti. Infine, l'interdipendenza tra stress ossidativo, invecchiamento e lamìne nucleari è stata investigata in un nuovo modello cellulare di stress ossidativo sviluppato nel nostro laboratorio, efficiente nel ricapitolare il processo di invecchiamento, in vitro.
ABSTRACT The nuclear lamina (NL) is a fibrillary protein network lining the inner surface of the nuclear envelope. It is mainly composed by type V intermediate filaments called lamins and lamin-associated proteins. Three lamin genes are present in Mammals: LMNA, which encodes lamin A and lamin C (Atype lamins), as well as, LMNB1 and LMNB2 that encode lamin B1 and B2 (B-type lamins) respectively. Lamins and LAPs associate to form a dense and dynamic three-dimensional matrix that establishes a huge number of stable and transient interactions with different classes of molecules: DNA, transcription factors, nuclear pore complexes and structural proteins of the cytoskeleton. All of these interactions are essential to provide nuclear structural stability and integrity, to physically and functionally link nuclear lamina to the cytoskeleton and to organizes chromatin. Thus NL, in addition to play a fundamental structural role, it is also a key player in cellular mechanotransduction processes and gene expression and epigenetic regulation. Mutations in genes encoding for lamins are associated with a wide a range of diseases, named laminopathies. Among these, the most interesting one is Hutchison-Gilford Progeria Syndrome (HGPS), a rare fatal genetic disorder due to do a point mutation in LMNA. This mutation results in the production of a truncated version of lamina A, lacking 50 amino acids, known as Progerin. HGPS is mainly characterized by morphological changes in the nucleus and premature aging. HGPS patients indeed, from their first years of life, develop pathological conditions typical of the elderly such as cataracts, diabetes and osteoporosis while preserving the normal cognitive functions. These patients typically die from cardiovascular complications around 14 years of age, on average. Considering Hutchinson-Guilford Progeria Syndrome as an extreme example of what nuclear lamina aberration entails, during my PhD I investigated many aspects of nuclear lamina biology with particular regard to the impact of nuclear lamina structural perturbations on cell functions, mechanics, gene expression regulation and the interconnection existing between nuclear lamina integrity, ageing process and oxidative stress. Indeed, to gain a comprehensive picture of nuclear lamina biology in health and disease, it has been adopted interdisciplinary and integrative research strategies able to take into account structural, mechanical and molecular aspects. Bioinformatics study has been performed: public available transcriptomic data of HGPS patients have been analysed with respect of those of healthy matched controls. This analysis allowed to delineate the typical global gene expression profile of HGPS patients and to identify all the deregulated pathways in the presence of the pathology. Moreover, impacts of lamina alterations on its physical and functional connections with extra-nuclear and nuclear elements have been studied in an inducible expression cellular model of the mutated form of Lamin A responsible for HGPS. This cellular model faithfully recapitulates the peculiar cellular phenotype of the HGPS patients resulting to be a valid alternative to primary cell lines deriving from the patients.Finally, the interdependence between oxidative stress, ageing and lamins has been investigated in a novel oxidative stress cellular model developed in our laboratory, that is also efficient in recapitulating typical ageing profile.

Transformed cells undergo profound reprogramming of cellular metabolism to ensure high rate of proliferation (Hanahan D, 2011). Mitochondria are important for both bioenergetics and biosynthetic pathways, which have to be coordinated. Different cancer types heterogeneously express mitochondrial genes likely reflecting the existence of different mitochondrial pathways providing adaptation to altered needs of cancer cell metabolism. In this work we explored this hypothesis in breast cancer. Breast cancer is heterogeneous disease classified according to diverse clinical and pathological features, histochemical markers and oncogenic transcriptional programs, that identify five breast cancer subtypes (basal-like, Her2-enriched, Luminal A, Luminal B and normal-like) (Sørlie T et al., 2001; Perou CM et al., 2000). So far, the mitochondrial transcriptional patterns were not considered as a basis of classification. In this work we define for the first time breast cancer Mitochondrial Tumour Subtypes (MTSs), upper fork (UF) and lower fork (LF), according to their nuclear-encoded mitochondrial transcription profile. UF and LF are characterised by two groups of mitochondrial genes co-regulated in opposite way. The classification was performed applying the MCbiclust algorithm (Bentham et al., 2016, preprint) to a mitochondrial gene set (MitoCarta, Pagliarini et al., 2008). The experimental characterisation of UF and LF revealed distinct bioenergetics and metabolic features. Interestingly, in basal condition UF has higher mitochondrial content, characterised by higher expression of CI and CIV resulting in higher respiration rate. At cellular level metabolism, UF and LF revealed different arrangement of metabolic enzymes belonging to particular pathways of the intermediate metabolism, UF cells express enzymes of which substrates are glucose-derived, whereas LF cells preferentially use enzymes exploiting glutamine-derived substrates. Moreover, metabolic flux analysis confirmed the substrate preference driven by the MTSs to feed into the TCA cycle, in particular UF cells mitochondria prefer glucose derived pyruvate while LF mitochondria catabolise glutamine. In addition, experiments in restricted nutrient conditions were carried out. These further confirmed which is the substrate preferentially used by MTSs to sustain cell functionality. Moreover, the same experiments also revealed the activation of different mitochondrial biogenesis programs during deprivation treatments, both looking at mitochondrial protein expression and mtDNA content. Overall, the mitochondrial biogenesis pattern associated with the MTSs drives nutrient choice and metabolic program, leading to a definition of the concept of substrate preference, new insight in the field of reprogramming of bioenergetics and cancer metabolism.
Le cellule tumorali vanno incontro a profonde modifiche del proprio metabolismo cellulare per assicurarsi un alto tasso di proliferazione (Hanahan D, 2011). I mitocondri sono una sede importante sia per la produzione di energia che per i processi biosintetici, pertanto queste vie devono essere opportunamente coordinate. Molti tipi di cancro esprimono geni mitocondriali in modo eterogeneo, questo probabilmente riflette l’esistenza di diverse vie mitocondriali in grado di fornire diverse capacità di adattamento ad un metabolismo alterato, come lo è il profilo metabolico associato ai tumori. In questo lavoro abbiamo esplorato questa ipotesi nel modello tumorale del cancro alla mammella. Il cancro alla mammella rappresenta una malattia comunemente classificata sulla base di caratteristiche cliniche e patologiche, marcatori istochimici e programmi di trascrizione genica che identificano cinque sottotipi di tumore alla mammella (basal-like, Her2-enriched, Luminal A, Luminal B e normal-like) (Sørlie T et al., 2001; Perou CM et al., 2000). Tuttavia, l’espressione di geni mitocondriali non è stata finora considerata nella classificazione di questi tumori. In questo lavoro definiamo per la prima volta sottotipi tumorali mitocondriali di cancro alla mammella (MTSs), upper fork (UF) e lower fork (LF), definiti sulla base del loro profilo di trascrizione di geni mitocondriali di codificazione nucleare regolati in modo opposto. La classificazione è stata fatta utilizzando l’algoritmo MCbiclust (Bentham et al., 2016, preprint) su un set di geni mitocondriali (MitoCarta, Pagliarini et al., 2008). Dalla caratterizzazione sperimentale di UF e LF sono emerse caratteristiche bioenergetiche e metaboliche distintive. In particolare, in condizioni basali UF ha un maggiore contenuto mitocondriale, caratterizzato da una maggiore espressione dei complessi I e IV della catena respiratoria, che culmina in un tasso di respirazione maggiore. A livello di metabolismo cellulare, UF e LF mostrano un diverso assetto di enzimi metabolici appartenenti a particolari vie del metabolismo intermedio. In particolare le cellule dell’UF esprimono enzimi i cui substrati sono derivati dal glucosio, mentre le cellule di LF preferiscono utilizzare enzimi i cui substrati sono derivati dalla glutammina. Inoltre l’analisi dei flussi metabolici ha confermato la preferenza di substrato determinata dai MTSs per alimentare il ciclo di Krebs. In particolare i mitocondri delle cellule dell’UF preferiscono il piruvato derivato dal glucosio, mentre i mitocondri di LF catabolizzano la glutammina. In aggiunta, sono stati eseguiti esperimenti con concentrazioni di nutrienti ridotte, i quali, in accordo con i risultati precedenti, hanno ulteriormente confermato i substrati preferenzialmente utilizzati dai MTSs per sostenere la funzionalità cellulare. Inoltre gli stessi esperimenti hanno rivelato l’attivazione di diversi programmi di biogenesi mitocondriale indotti dai trattamenti, sia a livello di espressine di proteine mitocondriali che in termini di contenuto di DNA mitocondriale. Complessivamente, il pattern di biogenesi mitocondriale associato ai sottotipi tumorali mitocondriali determina la scelta di nutrienti e programmi metabolici, portando così alla definizione del concetto di preferenza di substrato, il quale fornisce una nuova visione nel campo della riprogrammazione bioenergetica e metabolica del cancro e la possibilità di classificare sottotipi tumorali sulla base dell’espressione dei geni mitocondriali.

Using biochemical and genetic approaches we have been able to identify the genetic defect underlying mitochondrial complex I deficiency in 3 patients out of the 12 patients in the cohort. The patient cohort investigated in this study is genetically heterogeneous, originating from several different geographical areas: England, France, the Middle East, Israel, India and Pakistan. They presented with different clinical phenotypes: Leigh syndrome, congenital lactic acidosis, hypertrophic cardiomyopathy, encephalopathy, developmental delay, Alpers’ disease. After having excluded the mitochondrial DNA molecule for carrying mutations in muscle (analysis carried out by the diagnostic laboratories’ staff, at the National Hospital for Neurology, Queen Square, London), a biochemical investigation was undertaken in patients’ fibroblasts: the complex I activity defect was confirmed in this tissue as well for all the patients, and Blue Native studies were carried out. Antibodies against several subunits of complex I identified various subassemblies of the ~1MDa holoenzyme in several patients; in some others various degrees of reduction in holo-complex I content were observed. Analysis of the complex I pattern on Blue Native gels led the genetic screening towards a subset of genes, already known to be involved in complex I deficiency. Two families were also run on the Affymetrix 10K SNP chip array and then a homozygosity mapping approach was undertaken on the assumption that the affected individuals inherited two copies of the same ancestral mutated allele from a common ancestor (autozygosity). A subsequent bioinformatics analysis (also involving the implementation of the Maestro and MitoCarta databases) allowed the selection of a subgroup of genes that could possibly bear the genetic defect; this was done taking into account the Blue Native complex I pattern as well. Genetic screening identified a novel 8bp frameshift deletion (c.377_384del; Q126fsX2) in the NDUFS4 gene as cause of the disease in a patient from the first pedigree analyzed by homozygosity mapping. Her cousin was heterozygous for the same defect, but no other mutation has been identified, leaving this complex I deficiency case unsolved. In the second pedigree analyzed by homozygosity mapping approach, a homozygous mutation in a novel complex I assembly factor never previously linked to human disease has been identified. The c.1054C>T; R352W mutation in FOXRED1 segregated with disease in the family and was not found in 268 healthy control alleles. Western blot analysis showed a reduced steady-state level of FOXRED1 in patient fibroblasts and restoration of complex I activity after lentiviral transduction of patient fibroblasts with wild-type FOXRED1 cDNA. Finally, by candidate gene sequencing, two novel compound heterozygous mutations in NDUFAF1 were identified in a third patient: c.631C>T; R211C and c.733G>A; G245R. In summary, this study allowed the identification of mutations in (i) one complex I subunit, NDUFS4, already associated with complex I deficiency; (ii) one novel complex I assembly factor: FOXRED1; (iii) and NDUFAF1, a known complex I assembly factor whose mutations give a similar complex I Blue Native pattern to the one observed in our patient. In conclusion our combined approach proved to be efficient in the identification of the genetic defect in patients affected with complex I deficiency.

Sono stati condotti studi sul signaling molecolare che sottende i processi differenziativi neuronali, utilizzando come modello sperimentale cellule staminali mesenchimali isolate da polpa dentaria umana (hDPSCs). Infatti, ancora oggi non sono stati completamente chiariti i meccanismi di attivazione delle vie che portano la cellula staminale a differenziare, così come poco conosciuto risulta essere il ruolo di particolari strutture chiamate rafts lipidici. Sulla base della letteratura medica, inoltre, interessante risulta essere il ruolo svolto da un particolare componente dei rafts lipidici, la Proteina Prionica Cellulare (PrPC), la cui espressione viene modulata a seconda del grado di differenziamento della cellula staminale e che sembra essere coinvolta nel signaling molecolare del processo di differenziamento neuronale. Il disegno sperimentale è stato articolato nelle seguenti fasi: - Studio dei rafts lipidici mediante l’utilizzo di sostanze che interferiscono con i rafts lipidici, quali PDMP, inibitore competitivo della glucosilceramide sintetasi che blocca la sintesi dei gangliosidi arrestando la formazione dei rafts lpidici,) e MβCD (induttore di efflusso di colesterolo dalla membrana con conseguente scompaginamento dei microdomini; - Valutazione delle vie di segnalazione che si attivano o inattivano in risposta a stimoli neuroinduttivi; - Ruolo della PrPC nel processo differenziativo neuronale delle hDPSCs. Dopo aver richiesto ed ottenuto l’approvazione del Comitato Etico dell'Azienda Policlinico Umberto I (Rif. CE:4336), le cellule sono state isolate seguendo una specifica procedura. In seguito, è stata effettuata una caratterizzazione preliminare delle hDPSCs che ha dimostrato come tali cellule soddisfino i requisiti indicati nelle linee guida della Società Internazionale per le Terapie Cellulari (ISCT). Infatti, le hDPSCs coltivate in vitro presentano adesione alla plastica in condizioni di coltura standard ed esprimono antigeni di superficie caratteristici delle cellule staminali mesenchimali. Inoltre, le hDPSCs sono in grado di differenziare in cellule della linea neuronale dopo coltura in terreni addizionati con specifici supplementi e fattori di crescita. Dal momento che in letteratura è documentato il coinvolgimento dei gangliosidi nel differenziamento neuronale, è stata effettuata anche la caratterizzazione lipidica delle hDPSCs di controllo e neuroindotte. I risultati ottenuti, che confermano ed estendono gli studi precedenti, mostrano come il GD1a ed il GM3 siano presenti sia prima sia dopo neuroinduzione. Al contrario, il GM2 è esclusivamente espresso dalle staminali di controllo mentre il GD3 è espresso nelle neuroindotte. Inoltre, dall’analisi in immunofluorescenza, la distribuzione del segnale delle molecole gangliosidiche sulla membrana plasmatica è risultata essere non uniforme, fatto questo che indica la presenza di microdomini di membrana arricchiti in GM2 nelle hDPSCs di controllo e GD3 nelle hDPSCs neuroindotte. E’ stata quindi indagata la distribuzione dei gangliosidi nei microdomini, in quanto componenti chiave costitutivi dei rafts lipidici, nonché porzioni specializzate di membrana plasmatica cellulare che servono a concentrare i recettori specifici di membrana e che forniscono anche un’ancora per le proteine ​​di trasduzione del segnale. Dalle indagini è risultato che il GM2 è arricchito nelle frazioni 4, 5 e 6, corrispondenti ai rafts lipidici. Inoltre, è stata condotta l’analisi in immunoblot della distribuzione di EGF-R, la quale ha mostrato che anche tale recettore è presente principalmente nelle frazioni 4, 5 e 6. In letteratura sono riportati risultati discordanti sulla presenza di EGF-R all’interno dei rafts lipidici; tale presenza può infatti dipendere dal tipo di cellula, dall'uso di diversi detergenti e dalla composizione in gangliosidi delle cellule stesse. Al fine di dimostrare che la deplezione del ganglioside inibisce il differenziamento neuronale delle hDPSCs indotto da EGF/bFGF, sono state analizzate cellule pretrattate con [D]-PDMP, inibitore competitivo della glucosilceramide sintetasi che blocca la sintesi dei gangliosidi arrestando la formazione dei rafts lipidici. Come evidenziato dai dati sperimentali, dopo pretrattamento con [D]-PDMP e successivo stimolo con EGF/bFGF, l’espressione gli antigeni neuronali β3-tubulina, NFH e GAP43 risultano notevolmente ridotti. Risultati del tutto analoghi sono stati ottenuti su cellule non trattate o pretrattate con MβCD, un composto che è in grado di indurre un particolare efflusso di colesterolo dalla membrana inibendo in tal modo i rafts lipidici. Inoltre, partendo dall’assunto che sia Erk 1/2 sia Akt siano coinvolti nella differenziazione neuronale delle cellule staminali embrionali e che il trattamento con EGF aumenti la fosforilazione di ERK e AKT, è stato indagato il ruolo dei rafts lipidici nella fosforilazione di queste proteinchinasi. Utilizzando specifici anticorpi, anti-fosfo ERK 1/2 (p-ERK1/2) e anti-fosfo Akt (p-Akt), è stato possibile osservare che il trattamento con EGF aumenta significativamente i livelli di fosforilazione di Erk 1/2 ed Akt mentre tale fosforilazione, in entrambe le proteinchinasi, diminuisce nettamente in campioni pretrattati con [D]-PDMP. Risultati del tutto simili sono stati trovati dopo pretrattamento delle hDPSCs con MβCD. I dati, nel loro insieme, indicano che tutti i principali componenti costitutivi dei rafts lipidici, siano essenziali per il ruolo che i rafts stessi svolgono nel differenziamento cellulare, suggerendo quindi che queste porzioni specializzate di membrana possano rappresentare siti specifici dove complessi pathway multimolecolari di segnalazione, tra cui lipidi (gangliosidi, colesterolo) e proteine ​​(EGF-R), svolgono un ruolo chiave nella differenziazione neuronale di hDPSCs. Come documentato in letteratura, tra le diverse proteine localizzate all’interno dei rafts lipidici vi è la PrPC, inserita nella superficie cellulare mediante un’ancora costituita da glicosilfosfatidilinositolo (GPI). Recenti studi riportano come l’espressione della PrPC sia modulata a seconda del grado di differenziamento della cellula staminale e documentano come tale proteina sia coinvolta nel signaling molecolare del processo differenziativo neuronale di cellule progenitrici. Dunque, sulla base dell’ipotesi che la PrPC possa avere un ruolo anche nel processo differenziativo neuronale delle cellule staminali mesenchimali, è stata verificata l’espressione della proteina nelle hDPSCs sia di controllo sia neuroindotte. Già nelle staminali a 21 gg dalla separazione della polpa è stato possibile rilevare la presenza della PrPC, divenuta più marcata a 28 gg, per raggiungere significative percentuali di espressione dopo neuroinduzione. Ad ulteriore conferma dei dati ottenuti in citofluorimetria, è stato eseguito sia un Immunoblot sia una Immunomfluorescenza su cellule di controllo e neuroindotte, utilizzando in entrambi i casi l’anticorpo anti-Prp. Poiché in letteratura è documentato che la PrPC è associata ai gangliosidi all'interno dei rafts lipidici, è stata verificata la sussistenza di tale associazione anche nelle hDPSCs. E’ stato osservato come il GM2 associ con la PrPC nei campioni di controllo ma non nei neuroindotti mentre il GD3 associ con la PrPC nei campioni neuroindotti ma non in quelli di controllo. E’ stato inoltre verificato come l’EGF-R, invece, associ con la PrPC nei campioni di controllo e, ancora più marcatamente, nei campioni neuroindotti. D'altra parte, è stato dimostrato che il recettore EGF è il componente di un complesso di segnalazione, locato all'interno dei microdomini, coinvolto in diverse funzioni di cellule di neuroblastoma (N2a); questi dati, inoltre, indicano che la PrPC fa parte dei complessi di membrana che regolano la segnalazione di EGF/EGF-R. Sulla base di queste evidenze, dunque, è stato ipotizzato che, dopo l'induzione neuronale, l’EGF-R sia reclutato all'interno dei rafts lipidici dove, interagendo con la PrPC, inneschi la trasduzione del segnale. Infatti, i rafts lipidici sono strutture in grado di concentrare recettori specifici, coinvolti nell'avvio della trasduzione del segnale, sulla membrana plasmatica. E’ stato quindi indagato se, durante la differenziazione neuronale delle hDPSCs, la PrPC fosse in grado di regolare le vie di trasduzione del segnale indotte dall’EGF/EGF-R. Infatti, come riportato da altri autori, la PrPC è in grado di regolare l'attivazione di MAP chinasi e Protein Kinase B mediante la modulazione di EGF-R nelle cellule N2a e SK-N-SH. In questo contesto è stato ipotizzato che, nelle hDPSCs, la PrPC possa essere in grado di regolare l'attivazione di ERK 1/2 e Akt. In effetti, come emerso dai dati sperimentali, il pretrattamento con siRNA PrP per 72 ore ha comportato una riduzione dell'attivazione di ERK 1/2 e Akt indotta da EGF. Dunque, nel modello cellulare preso in esame, è stato dimostrato che l'attivazione delle protein chinasi (ERK 1/2 e Akt) è stata mediata dalla PrPC e che l'associazione con l’EGF-R è aumentata dopo l'induzione neuronale. Poiché alcuni autori hanno evidenziato il ruolo della PrPC durante il processo di differenziazione cellulare e, in particolare, il contributo della PrPC all'acquisizione del fenotipo neuronale modulando l'attività dell'integrina β1, è stato indagato il ruolo della PrPC nel processo di differenziazione neuronale delle hDPSCs. A tale scopo è stato silenziato il gene PRNP in modo da ridurre drasticamente l’espressione della PrPC; questo processo ha influenzato il differenziamento neuronale delle hDPSCs, come mostrato dalla netta riduzione dell’espressione dei marcatori neuronali testati su hDPSCs neuroindotte e pretrattate con siRNA PrP. Nel loro insieme, i dati indicano che la PrPC sia espressa nelle hDPSCs non trattate e che tale espressione aumenti nel corso della neuroinduzione, per raggiungere il picco nelle hDPSCs neuroindotte. Inoltre, è stato dimostrato come la PrPC regoli il signal pathway indotto da EGF/EGF-R durante il differenziamento neuronale delle hDPSCs e che il silenziamento del gene PRNP porti ad una mancata espressione dei tipici marcatori neuronali. Concludendo, dunque, è possibile affermare che: l’integrità dei rafts lipidici è essenziale nel processo differenziativo neuronale delle hDPSCs; la PrPC interagisce, all’interno dei rafts lipidici, con l’EGF-R, giocando un ruolo chiave nel complesso di segnali multimolecolari coinvolti nel differenziamento neuronale delle hDPSCs. Il coinvolgimento della PrPC nel processo differenziativo neuronale delle cellule staminali risulta di grande interesse, poiché apre alla possibilità di applicazioni pratiche nell’ambito delle neuropatologie degenerative (e.g. Alzheimer, Parkinson, Sclerosi multipla) in quanto possibile target molecolare per la rigenerazione del tessuto nervoso.