Thèses sur le sujet « B-060 »

Despite several recent advancements in the treatment of B lymphoproliferative disorders, still a considerable number of lymphoma cases either cannot be cured or become incurable when relapsing. This issue reflects the need for better and more effective therapies that can be designed once novel pathogenic mechanisms have been designed and suitable preclinical models have been established. Therefore, aim of this thesis was to understand the molecular mechanisms leading to mature B lymphoid malignancies by using different mouse models, in order to identify novel potential therapeutic targets and obtain useful models for preclinical studies. In chapter 2 we show the establishment of a new xenograft model obtained by injecting the CLL cell line MEC1 into immunodeficient Rag2‒/‒gammac‒/‒ mice. This model resembles the aggressive form of human CLL and is conceivably useful to test the efficacy of new therapeutic agents. In chapter 3 we show that HS1 is involved in the trafficking and homing of leukemic B cells and that its deficiency is responsible for an earlier onset of the disease and a reduced survival in the Emu-TCL1 mouse model of CLL. The same animal model was used to investigate the role of TLR pathway in CLL. In chapter 4 we report that the absence of TIR8 accelerates the appearance of the disease and favors the progression into an aggressive form characterized by the accumulation of “prolymphocytoid” cells. Finally in chapter 5 we demonstrate that mice lacking the negative regulator SIGLEC-G are susceptible to B cell lymphoma development with age indicating that the downregulation of SIGLEC10 may be involved in the malignant transformation of human B lymphocytes.

B-cell Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL) is the most common leukemia in adults and is characterized by the accumulation of clonal CD19+/CD5+/CD23+ B lymphocytes, due to uncontrolled growth and resistance to apoptosis. Leukemic cells from B-CLL show reduced crosslink with specific molecules and high susceptibility to microtubule disrupting drugs, which suggest cytoskeletal alterations. Microtubules play a crucial role in the vital functions of neoplastic cells, including mitosis, motility and cell-cell contact, and for this reason they became an important target in cancer therapies. In particular, tubulin, a cytoskeletal member, is the target of specific drugs, named microtubule inhibitors. Among these inhibitors, nocodazole induces tubulin depolimerization, mitotic process blocking and shows an apoptotic effect in B leukemic cells. The aim of this study was to define the effects of nocodazole on B-CLL cells. First of all, we verified nocodazole capability to favour the depolymerization of tubulin cytoskeleton in different cell types. In addition, we tested nocodazole-induced apoptosis in normal and leukemic B cells, in cell lines (Jurkat, Raji, and K562), in mesenchymal stromal cells (MSCs), and in T lymphocytes of B-CLL patients. Our data pointed out the high specificity of nocodazole for B-CLL cell apoptosis (leukemic cells: 57±25% vs normal B cells: 98±6%, p<0.0001; data are expressed as mean±standard deviation (SD) of percentage of viable cells after treatment with nocodazole) and the absence of toxicity to others cell types. Growing evidence suggests that the marrow microenvironment, where MSCs are present, protects B-CLL cells from conventional anti-neoplastic drugs. The cultures of neoplastic B cells with MSCs and nocodazole demonstrated that nocodazole is able to overcome MSC protective effect, even after survival signal supplemental, such as CD40L or plasma from the same patients. The action mechanism of nocodazole in B-CLL cells is still under investigation. However, we observed that nocodazole is able to turn off the increased basal tyrosine phosphorylation of leukemic cells mediated by Src-kinase Lyn through the down-modulation of Lyn active site. Since the specific inhibition of Lyn induces B-CLL cells apoptosis, this linking will be further investigated. The results obtained in this study suggest a future role of nocodazole as a possible agent for treatment of B-CLL, for its extreme selectivity, the absence of toxicity and its ability to counteract the protective effect provided by marrow microenvironment.
La Leucemia Linfatica Cronica di tipo B (LLC-B) è la forma più comune di leucemia nell’adulto ed è caratterizzata dall’accumulo clonale di piccoli linfociti B CD19+/CD5+/CD23+, dovuto sia ad una crescita incontrollata che ad una resistenza all’apoptosi. Le cellule leucemiche di LLC-B presentano inoltre alcune anomalie, come ridotta capacità di legare specifiche molecole e suscettibilità a farmaci che distruggono i microtubuli, che indicano la presenza di alterazioni a livello citoscheletrico. Il ruolo cruciale che i microtubuli rivestono nelle funzioni vitali delle cellule neoplastiche, quali mitosi, motilità e contatti cellula-cellula, li ha resi un importante target nelle terapie anti-tumorali. In particolar modo la tubulina, componente dei microtubuli, è il bersaglio di una categoria specifica di farmaci anti-tumorali, gli inibitori dei microtubuli; di questa famiglia fa parte anche il nocodazolo, un agente sintetico che induce la depolimerizzazione della tubulina, arresta il processo mitotico ed ha una peculiare specificità nell’indurre l’apoptosi nelle cellule B di LLC-B. Sulla base di queste considerazioni, abbiamo voluto approfondire gli effetti ed il meccanismo d’azione del nocodazolo sulle cellule di LLC-B. Dopo aver verificato che il nocodazolo sia effettivamente responsabile della depolimerizzazione dei filamenti di tubulina citoscheletrica in numerosi tipi cellulari, abbiamo valutato l’effetto apoptotico indotto dal nocodazolo in cellule B normali e di LLC-B, in linee cellulari (Jurkat, Raji e K562), in cellule stromali mesenchimali (MSC) e nei linfociti T residui di pazienti affetti da LLC-B. I risultati ottenuti evidenziano l’estrema selettività del nocodazolo nell’indurre l’apoptosi nelle sole cellule B di LLC-B (linfociti B di LLC-B: 57±25% vs B normali: 98±6%, p<0,0001; dati espressi come media±deviazione standard (DS) della percentuale di cellule vive dopo trattamento con nocodazolo) e l’assenza di tossicità nei confronti delle altre popolazioni cellulari prese in esame. Studi recenti suggeriscono che il microambiente midollare, in cui si trovano anche le MSC, sia in grado di proteggere le cellule leucemiche dall’azione dei farmaci chemioterapici convenzionali. La co-coltura di MSC e cellule B di LLC-B in presenza di nocodazolo ha dimostrato che tale inibitore è in grado di annullare l'effetto protettivo esercitato dalle MSC, nonostante la presenza di segnali di sopravvivenza quali CD40L o plasma ricavato dagli stessi pazienti. I meccanismi d’azione del nocodazolo rimangono ancora da chiarire, tuttavia abbiamo osservato come nelle cellule leucemiche di LLC-B il nocodazolo sia in grado di ridurre l’aumentata fosforilazione tirosinica basale mediata dalla Src-chinasi Lyn, mediante down-regolazione del sito attivatorio di Lyn. Dal momento che abbiamo dimostrato che l’inibizione specifica di Lyn induce apoptosi nelle cellule di LLC-B, questi primi risultati diventano rilevanti e dovranno essere ulteriormente indagati. In conclusione, i risultati ottenuti in questo studio hanno evidenziato l’estrema selettività del nocodazolo nell’indurre apoptosi nei linfociti B leucemici, l’assenza di tossicità in vitro e la capacità di contrastare l’effetto protettivo fornito dal microambiente midollare, suggerendo un futuro ruolo di questa sostanza quale possibile agente terapeutico per la cura della LLC-B.

CK2 is a highly conserved Ser/Thr protein kinase, consisting of two catalytic (a) and two regulatory (b) subunits assembled to form a tetramer. It is involved in a broad variety of cellular processes, among which survival, proliferation, differentiation, DNA damage and other stress responses, leading to the activation of context-specific transcription factors such as c-Myc and NF-kB. This kinase has been found overexpressed in several solid tumors and hematologic malignancies, and its overexpression seems to be an unfavorable prognostic marker. It has been fully demonstrated that CK2 acts as a potent antiapoptotic factor that promotes a “non-oncogene addiction” phenotype in cancer cells. In other words, high CK2 levels and activity contribute to create a cellular environment favorable to the establishment and maintenance of a neoplastic phenotype. In particular, it was recently shown that many B-cell derived tumors, like multiple myeloma, mantle cell lymphoma and chronic lymphocytic leukemia, rely on high CK2 activity and that its downmodulation induces malignant cell death without significantly affecting normal B lymphocytes. Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL) is an aggressive B-cell derived neoplasia that originates from follicles and is the most common type of non-Hodgkin lymphoma, accounting for about 40% of all cases. It is divided into two subtypes: Germinal Center B-cell like (GCB) and Activated B-Cell like (ABC) DLBCL, characterized by different genetic lesions and, therefore, variable response to therapy. Up to one-third of patients does not achieve cure with initial therapy and has refractory disease or relapse. The standard salvage treatment for these patients is autologous stem cell transplantation, but success rates are poor and most of them succumb to the disease. These facts clearly demonstrate the need for new rational combination therapeutics. It is well known that the B-Cell Receptor (BCR) signalling strongly influences B-cell development and is fundamental for peripheral B-cell survival. After BCR ligation by the antigen, the signal is transduced across the plasma membrane and propagated inside the cell through a group of intracellular proteins, which interact to form a complex, called signalosome. Among these proteins there are the tyrosine kinases SYK and BTK, the phospholipase PLCg2 and the adaptor BLNK. Once activated by SYK, BTK phosphorylates PLCg2, which in turn generates IP3 thus causing Ca++ release from the endoplasmic reticulum stores. Ca++ acts in the cytoplasm as a second messenger that binds several Ca++-dependent proteins that are then able to activate transcription factors, like NFAT and NF-kB, modifying gene expression. The result of this process consists in activation, expansion, antigen presentation and B-cell differentiation. For these reasons, it comes as no surprise that inhibitors targeting the BCR signalling have shown promising therapeutic outcomes for patients with B-cell lymphomas. Here we show that a and b subunits of protein kinase CK2 are overexpressed in ABC- and GCB-DLBCL primary patient samples and immortalized cell lines when compared with normal counterparts. Moreover, we demonstrate that CK2 inhibition with CX-4945, an ATP-competitive CK2 inhibitor currently under clinical trials, causes apoptosis of DLBCL cell lines in a dose and time dependent fashion, and that malignant cell death is significative even at low drug doses not toxic to normal counterparts. We also reveal that the downmodulation of CK2 catalytic activity leads to a reduction in Ca++ release from the endoplasmic reticulum stores, and impairs AKT and NF-kB RELA phosphorylation after BCR stimulation. These findings propose a role for CK2 downstream of the BCR engagement, in controlling survival pathways crucial for B-cell endurance. Furthermore, we found out that CX-4945 synergises with inhibitors of kinases, like SYK and BTK, essential in spreading the BCR signal, thus proving that this drug combination enhances DLBCL cell death and could be considered an effective therapeutic strategy.
CK2 è una Ser/Thr chinasi altamente conservata dal punto di vista evolutivo, costituita da due subunità catalitiche (a) e due subunità regolatorie (b) unite a formare un tetramero. Essa è coinvolta in numerosi processi cellulari, tra cui sopravvivenza, proliferazione, differenziamento, risposta al danno al DNA e ad altri stress, portando in definitiva all’attivazione di specifici fattori di trascrizione, come c-Myc ed NF-kB. Questa chinasi è stata trovata sovrespressa in svariati tumori solidi e neoplasie ematologiche, portando ad una correlazione tra alti livelli di CK2 e prognosi sfavorevole. È stato ampiamente dimostrato che CK2 agisce come un potente fattore antiapoptotico nelle cellule tumorali, promuovendo un meccanismo definito “non-oncogene addiction”. In altre parole, l’overespressione e l’aumento dell’attività catalitica dell’enzima contribuiscono notevolmente a creare un ambiente intracellulare favorevole allo sviluppo e al consolidamento di un fenotipo neoplastico. In particolare, è stato recentemente dimostrato che molte neoplasie, derivate dalla trasformazione maligna dei linfociti B, come il mieloma multiplo, il linfoma mantellare e la leucemia linfatica cronica, dipendono da un’aumentata attività di CK2 per il loro mantenimento; infatti, una sua inibizione è in grado di indurre apoptosi cellulare. Il linfoma diffuso a grandi cellule (DLBCL) è una neoplasia di tipo aggressivo derivata dalla trasformazione dei linfociti B nel follicolo ed è il tipo più comune di linfoma non-Hodgkin, rappresentando circa il 40% di tutti i casi. È suddiviso in due sottotipi: uno di derivazione da cellule B del centro germinativo (GCB), l’altro di derivazione da cellule B post centro germinativo (ABC), che sono caratterizzati da differenti alterazioni genetiche e, di conseguenza, da una differente risposta alla terapia. Fino a un terzo dei pazienti non raggiunge la cura con la terapia iniziale e sviluppa una malattia refrattaria o ricade. Il trattamento di salvataggio standard per questi pazienti è il trapianto autologo di cellule staminali, ma il tasso di successo è scarso e la maggior parte di essi non sopravvive alla malattia, dimostrando chiaramente la necessità di nuove terapie di combinazione. È risaputo che il segnale generato dal recettore dell’antigene B (BCR) è in grado di influenzare il differenziamento del linfocita B nella milza e la sua sopravvivenza a livello periferico. In seguito al legame del recettore da parte dell’antigene, il segnale viene trasmesso attraverso la membrana plasmatica e propagato all’interno tramite un gruppo di proteine intracellulari, che si combinano a formare un complesso denominato signalosoma. Tra queste proteine figurano le tirosin chinasi SYK e BTK, la fosfolipasi PLCg2 e l’adattatore BLNK. Una volta attivata da SYK, BTK è in grado di fosforilare PLCg2, che, a sua volta, genera IP3, il quale induce il rilascio di Ca++ dal reticolo endoplasmatico. Il Ca++ agisce nel citoplasma come secondo messaggero, interagendo con varie proteine Ca++-dipendenti, che attivano fattori di trascrizione, come NFAT e NF-kB, modificando, in tal modo, l'espressione genica. Il risultato di questo processo consiste in attivazione, espansione, presentazione dell’antigene e differenziamento del linfocita B. Non sorprende, perciò, che gli inibitori della cascata del segnale del BCR abbiano dimostrato risultati terapeutici promettenti in pazienti con linfomi di tipo B. In questo lavoro di tesi si evidenzia che le subunità a e b di CK2 sono sovrespresse sia in campioni primari, che in linee cellulari immortalizzate di ABC- e GCB-DLBCL, rispetto alle controparti non neoplastiche. Inoltre, si dimostra che l'inibizione di CK2 con CX-4945, un inibitore di CK2 attualmente in trial clinici, provoca l'apoptosi di linee cellulari di DLBCL in maniera dose e tempo dipendente e che l'aumento della morte delle cellule neoplastiche è significativa anche alle dosi di farmaco che non uccidono le cellule normali. Inoltre, l’abbassamento dell’attività catalitica di CK2 porta ad una riduzione del Ca++ rilasciato dal reticolo endoplasmatico, e compromette la fosforilazione di AKT e NF-kB RELA, in seguito a stimolazione del BCR. Questi risultati propongono un ruolo per CK2 a valle del BCR, nel controllo di vie del segnale pro sopravvivenza centrali per il linfocita B. Infine, si evidenzia che il CX-4945 sinergizza con inibitori di chinasi essenziali per la propagazione del segnale del BCR, quali SYK e BTK, provando che questa combinazione di farmaci aumenta la morte delle cellule linfomatose e può considerarsi un’efficace strategia terapeutica.

B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is the most common form of leukemia in adults. It is characterized by the accumulation of clonal CD5+ B lymphocytes due to uncontrolled growth and resistance to apoptosis. The Src tirosin kinase Lyn plays an important role in the survival of B lymphocytes. We previously observed that this kinase is overexpressed, constitutively active and anomalously distributed in malignant B cells as compared to normal B lymphocytes. Moreover we also found that one of its substrates, HS1, is overexpressed and involved in survival of B neoplastic cell; now we focused our attention on protein named cortactin, since this protein is homolog of HS1, a putative substrate of Lyn and it is overexpressed in many tumors. In this study, by western blotting analysis and real-time RT-PCR, we demonstrated that in B neoplastic cells the protein cortactin is overexpressed with respect to normal B lymphocytes. When the expression level was correlated with somatic hypermutations of immunoglobulin heavy-chain variable region, one of the most important prognostic factors for B-CLL, we observed that the level of cortactin is higher in patients with poor prognosis with respect to those with favorable one. Moreover, we demonstrated that in neoplastic B lymphocytes cortactin overexpression correlated with both migration index and MMP9 production, suggesting that in these patients cortactin could be involved in the disease diffusion. As reported in literature, cortactin can regulate cellular migration not only by its overexpression, but also by the expression of mRNA splicing variants. We found that normal B cells expressed only the SV1 splice variant, while in the neoplastic B lymphocytes about half of our patients expressed the WT variant. Since it has been reported that WT variant increases cell migration, we hypothesized that the expression of WT isoform could be another mechanism by which cortactin can modulate F-actin dynamics and cell migration. All these findings converge to support a negative role of cortactin in clinical course of B-cell chronic lymphocytic leukemia, suggesting that cortactin could be involved in patogensis and progression of B-LLC.
La leucemia linfatica cronica di tipo B (LLC-B) è la forma più comune di leucemia dell’adulto ed è caratterizzata dall’accumulo clonale di piccoli linfociti B CD5+ dovuto sia ad una crescita incontrollata che ad una resistenza all’apoptosi. Un ruolo importante nella sopravvivenza dei linfociti B leucemici è giocato dalla chinasi Lyn. Qualche anno fa abbiamo dimostrato che la Src chinasi Lyn è sovraespressa, costitutivamente attiva e distribuita in maniera anomala nelle cellule B neoplastiche rispetto ai linfociti B normali. Considerato che uno dei suoi substrati, la proteina HS1, si trova sovraespressa e coinvolta nella sopravvivenza del clone neoplastico, abbiamo focalizzato l’attenzione su un altro putativo substrato di Lyn: la proteina cortactina poiché omologa di HS1 e sovraespressa in diversi tumori. Mediante western blotting e real-time RT-PCR in questo studio abbiamo dimostrato che i linfociti B leucemici esprimono una maggiore quantità di cortactina rispetto ai linfociti B di soggetti sani. Correlando i dati di espressione con uno dei fattori prognostici più importanti della LLC-B, la presenza o assenza di ipermutazioni somatiche (SHM), abbiamo evidenziato che i livelli di espressione della cortactina sono più elevati in pazienti a prognosi sfavorevole (SHM-) rispetto a quelli a prognosi favorevole (SHM+). Inoltre, abbiamo dimostrato che nei linfociti B neoplastici la sovraespressione della cortactina correla sia con l’indice di migrazione cellulare (IdM) che con la produzione della metalloproteasi di matrice 9 (MMP-9), suggerendo come nei pazienti con LLC-B la cortactina possa essere in qualche modo coinvolta nel processo di invasione dei linfonodi e della milza. Come riportato in letteratura, la cortactina può influenzare la migrazione cellulare non solo attraverso la sua sovraespressione, ma anche mediante l’espressione di diverse varianti di splicing. Il nostro studio ha evidenziato che nei linfociti B normali è presente solo la variante di splicing SV1, mentre nei linfociti B di circa il 50% dei nostri pazienti è maggiormente espressa quella WT. Poiché è noto in letteratura che la variante WT rende alcuni tipi di cellule tumorali più aggressivi e mobili, si potrebbe pensare che l’espressione di tale isoforma abbia un ruolo rilevante nella diffusione della LLC-B. In conclusione, i dati finora ottenuti convergono tutti nell’affermare un ruolo negativo della cortactina nel decorso clinico della leucemia linfatica cronica di tipo B, suggerendo, quindi, che la cortactina possa essere coinvolta nella patogenesi della LLC-B.

Protein kinase CK2 and CK1 are a pleiotropic and evolutionary conserved serin-threonin kinase that is involved in several cellular processes. A number of studies revealed many mechanisms through which this kinase regulates cell cycle, apoptosis, cell survival and tumorigenesis. CK2 participates in many developmental pathways, of which particularly relevant for hemo-lymphopoiesis are those dependent on Hedgehog, NF-κB and STAT3, which regulate cell differentiation, proliferation, self-renewal as well as lineage choice commitment.. CK1 regulates also molecular pathways which are important for multiple myeloma plasma cells survival, like WNT/β-catenin pathway and PI3K/AKT pathway. However, despite all this data, little is known about the role of CK2 and CK1 in B-lymphopoiesis and lymphomagenesis. To elucidate the physiological and pathogenetic role of CK2 and CK1 in B-lymphocytes, we generated B cell specific conditional KO mice, were we studied the effects of deletion during normal B cell development with multiparameter flow cytometry analysis. In the bone marrow (BM), CK2β KO mice displayed a reduction of B cells, especially of the recirculating population of transitional and follicular (FO) B-cells. In peripheral blood and spleen the number of B-cells was markedly reduced. In the spleen of CK2β KO we observed an imbalance between the amount of FO and marginal zone (MZ) B-cells was found with an absolute reduction of FO B cells by approximately 2-folds and an increase of MZ B-cells and MZB cell precursors by up to three folds.. In vitro class-switch recombination assays demonstrated impairment in IgG1 and IgG3 class-switch and a marked reduction of the generation of antibody-producing cells. In CK1 KO mice we observed the totally absence of mature B cells and the presence of early precursors B cells. CK1 HET mice showed a reduction of B cells in bone marrow and an light imbalance of FO B cells an MZB cells in spleen. In vitro class-switch recombination assays doesn’t showed significant difference between HET and CTRL mice in IgG1 and IgG3 class-switch. Here, we found that the β subunit of protein kinase CK2 is a novel regulator of peripheral B cell differentiation. CK2β has a role in regulation of the GC reaction and in homeostasis of FOB and MZB cells. Furthermore we found that CK1 has a pivotal role in early B cells development. On one side our data enrich the knowledge on the mechanisms regulating B-cell development, on the other side they inform about the potential mechanisms altered by CK2 and CK1 during B-cell tumorigenesis.
Protein kinase CK2 and CK1 are a pleiotropic and evolutionary conserved serin-threonin kinase that is involved in several cellular processes. A number of studies revealed many mechanisms through which this kinase regulates cell cycle, apoptosis, cell survival and tumorigenesis. CK2 participates in many developmental pathways, of which particularly relevant for hemo-lymphopoiesis are those dependent on Hedgehog, NF-κB and STAT3, which regulate cell differentiation, proliferation, self-renewal as well as lineage choice commitment.. CK1 regulates also molecular pathways which are important for multiple myeloma plasma cells survival, like WNT/β-catenin pathway and PI3K/AKT pathway. However, despite all this data, little is known about the role of CK2 and CK1 in B-lymphopoiesis and lymphomagenesis. To elucidate the physiological and pathogenetic role of CK2 and CK1 in B-lymphocytes, we generated B cell specific conditional KO mice, were we studied the effects of deletion during normal B cell development with multiparameter flow cytometry analysis. In the bone marrow (BM), CK2β KO mice displayed a reduction of B cells, especially of the recirculating population of transitional and follicular (FO) B-cells. In peripheral blood and spleen the number of B-cells was markedly reduced. In the spleen of CK2β KO we observed an imbalance between the amount of FO and marginal zone (MZ) B-cells was found with an absolute reduction of FO B cells by approximately 2-folds and an increase of MZ B-cells and MZB cell precursors by up to three folds.. In vitro class-switch recombination assays demonstrated impairment in IgG1 and IgG3 class-switch and a marked reduction of the generation of antibody-producing cells. In CK1 KO mice we observed the totally absence of mature B cells and the presence of early precursors B cells. CK1 HET mice showed a reduction of B cells in bone marrow and an light imbalance of FO B cells an MZB cells in spleen. In vitro class-switch recombination assays doesn’t showed significant difference between HET and CTRL mice in IgG1 and IgG3 class-switch. Here, we found that the β subunit of protein kinase CK2 is a novel regulator of peripheral B cell differentiation. CK2β has a role in regulation of the GC reaction and in homeostasis of FOB and MZB cells. Furthermore we found that CK1 has a pivotal role in early B cells development. On one side our data enrich the knowledge on the mechanisms regulating B-cell development, on the other side they inform about the potential mechanisms altered by CK2 and CK1 during B-cell tumorigenesis.

In the growing field of polycyclic aromatic hydrocarbons, the doping by heteroatoms has emerged as one of the most versatile approaches to tune the optoelectronic properties of the materials. In particular, borazine derivatives attracted a lot of attention in the last years. While their synthesis, functionalisation and possible use in a broad spectrum of applications have previously been investigated, the effect of different substituents on the formation of the borazine ring and its functionalisation at the boron site has yet to be addressed. This doctoral thesis aims at filling this gap through an in-depth study of the synthesis of novel borazines derivatives. Before addressing the detailed investigations of this thesis work, Chapter I of this manuscript introduces a brief insight into the history and generalities of borazines in the literature since its discovery in 1926 by Stock and Poland. This Chapter also includes the description of the synthetic approaches used for their production, as well as the chemical properties, stability and material applications. The second Chapter of this manuscript describes the investigations developed toward the elucidation of the substituent’s effect during the functionalisation at the boron site of the borazine core. Following a [1+1’+1+1’+1+1’] hexamerisation route toward the formation of the borazine core (using an amino precursor and boron trichloride), the latter can be further functionalised by the addition of a nucleophile, which leads to the formation of stable borazine derivatives. Accordingly, the synthesis of multiple borazine moieties has been performed, using only one type of amino-precursor (aniline) and different organometallic derivatives during the functionalisation step. These organometallic moieties consist of aryl groups that contain one or two ortho-substituents, which allows for a partial- or full-protection of the borazine core, respectively. In the first case, the control of the stereoselectivity of the process in a reaction in which two different isomers (cc and ct) can be formed, is the main focus of this study. Finally, the chemical compatibility and the stability of this novel class of partially-protected borazine moieties developed along this doctoral thesis is also discussed. Encouraged by the results obtained in Chapter II, the study developed in Chapter III aims at bringing light to the effect of the substituents on the formation of the borazine core together with the subsequent functionalisation toward the preparation of stable borazine moieties. For this purpose, the formation of the borazine core has been followed by reaction of different amino-precursors with boron trichloride. The later functionalisation at the boron site can lead to the formation of stable borazine derivatives, depending on the nature of the amino precursor.

B-cell Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL) is the most common leukemia in adults and is characterized by the accumulation of mature clonal CD5+ B lymphocytes in peripheral blood, bone marrow and lymphoid tissues. The defect in programmed cell death favours the disease progression through a prolonged survival of malignant cells and the induction of the drug-resistance. The defective apoptosis of B-CLL cells is not only due to intrisic defects of the leukemic clone, but also to extrinsic factors that influence its behavior in the tissue microenvironment. Since the accumulation of monoclonal B cells is also supported by their interaction with surrounding cells, we focused our attention on mesenchymal stem cells (MSCs) in order to evaluate their role in survival and localization of neoplastic clone. MSCs can be isolated, expanded with high efficiency and induced to differentiate into multiple mesenchymal lineages under appropriated colture conditions. In addition, they show crucial immunoregulatory properties suppressing several T-, B- and NK-cell functions and affecting dendritic cell activities. In the present study MSCs isolated from the bone marrow of 47 B-CLL patients were expanded ex vivo and characterized through fluocytometric analysis and differentiation coltures (adipocytes and osteocytes). While MSCs from B-CLL patients exhibited normal phenotype and differentiation capacities, when co-coltured with neoplastic B cells they exherted an anti-apoptotic effect reducing lymphocyte apoptosis. After 7 days of colture in presence of CLL-MSC, we observed a relevant extended survival of leukemic cells, but not of normal B lymphocytes. The same effect was observed on B-CLL cells isolated from 3 patients treated with pro-apoptotic compounds, suggesting an involvement of MSCs in drug-resistance. Finally, chemotaxis tests showed the ability of MSCs to produce molecules promoting migration and localization of neoplastic B cells in bone marrow. Taken together, these findings suggest that MSCs derived from patients with B-CLL, despite an apparent normal phenotype and normal differentiation ability, provide survival signals to neoplastic cells extending their lifespan and producing chemotattic factors favouring their accumulation in the bone marrow.
La leucemia linfatica cronica di tipo B (LLC-B) è la forma più comune di leucemia nell’adulto ed è caratterizzata dall'accumulo clonale di piccoli linfociti B CD5+ nel sangue periferico, nel midollo osseo e negli organi linfatici, dovuto sia ad un aumento della proliferazione che ad un difetto dei meccanismi di morte cellulare programmata. La resistenza all’apoptosi in questi linfociti favorisce la progressione della malattia attraverso un’aumentata sopravvivenza del clone neoplastico e l’induzione della resistenza ai farmaci citostatici. Tali alterazioni sono imputabili sia a fattori intrinseci che a fattori estrinseci derivanti dal microambiente. Poiché l’aumentata sopravvivenza ed il progressivo accumulo del clone linfocitario risultano selettivamente favoriti dall'interazione con cellule accessorie non tumorali presenti nel microambiente in cui esso risiede, in questa tesi abbiamo focalizzato l’attenzione sulle cellule mesenchimali staminali (MSC), allo scopo di valutare il loro ruolo nella sopravvivenza e nella compartimentalizzazione del clone B leucemico. Le MSC costituiscono una frazione esigua (inferiore allo 0,01%) della popolazione di cellule midollari, sono cellule staminali multipotenti in grado di differenziare in diversi tessuti di origine mesenchimale; sono inoltre dotate di proprietà immunomodulatorie verso linfociti B, T, Natural Killer e cellule dendritiche. In questa tesi le MSC sono state isolate dal sangue midollare di 47 pazienti affetti da LLC-B e sono state caratterizzate fenotipicamente e funzionalmente mediante analisi citofluorimetrica (positività per CD73, CD90 e CD105, negatività per CD31, CD34 e CD45) e colture differenziative (adipociti ed osteociti) confrontandole con MSC di donatori sani. Successivamente si sono allestite co-colture di linfociti B di pazienti affetti da LLC e MSC allo scopo di valutare l’effetto delle MSC sul clone neoplastico di LLC. Le MSC ottenute dai pazienti non hanno presentato alterazioni dal punto di vista fenotipico né funzionale rispetto alle MSC di donatori sani, tuttavia esse hanno sviluppato interazioni capaci di favorire la sopravvivenza del clone leucemico. Gli esperimenti di co-coltura hanno dimostrato infatti che le MSC esercitano un effetto anti-apoptotico sui linfociti B neoplastici, documentato da un aumento significativo della sopravvivenza delle cellule B di LLC dopo 7 giorni di coltura, effetto verificatosi anche con MSC di donatori sani e invece molto meno marcato nei linfociti B normali. Tale attività anti-apoptotica si è osservata, seppur di minore intensità, anche nei linfociti B di pazienti sottoposti a trattamento chemioterapico in vivo con Fludabarina e Ciclofosfamide, suggerendo che le MSC possano essere implicate anche nei meccanismi di chemio resistenza del clone di LLC. Infine l’analisi della migrazione cellulare dei linfociti B patologici in presenza di terreno condizionato derivante dalle colture di MSC ha dimostrato la capacità delle MSC di produrre stimoli chemiotattici in grado di richiamare in sede midollare il clone maligno, ma non i linfociti B normali. I dati riportati suggeriscono che le MSC nei pazienti affetti da LLC-B, sebbene non mostrino alterazioni dal punto di vista fenotipico e funzionale, svolgono un ruolo attivo nel favorire la sopravvivenza e la compartimentalizzazione delle cellule B neoplastiche a livello midollare.

B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is the most common leukemia in adults and it is characterized by the accumulation of monoclonal small CD5+ B lymphocytes, in peripheral blood, bone marrow and lymphoid organs. The clinical course encompasses indolent to aggressive disorders, the latter requiring intensive therapeutic intervention. In the past, several clinical and biological prognostic factors have been proposed, including clinical stage, lymphocyte doubling time, bone marrow infiltration, percentage of prolymphocytes, serum β2 microglobulin, tymidine kinase and soluble CD23 levels. Even if these factors correlate with the clinical outcome of the CLL, they were not able to predict the evolution of the disease in patients at the earliest stages of disease. For this reason novel prognostic factors able to predict at diagnosis the clinical evolution of the disease and stratifying patients into groups with a different risk degree have been recently identified. During the three years of this project we collected pheripheral blood samples from 247 patients affected by B-CLL referring to our Hematology and Clinical Immunology Unit and we evaluated the prognostic role of some new factors, including: somatic hypermutations of the Ig variable region genes (SHM), BCR VH repertoire, expression of CD38, CD305 and ZAP-70 in leukemic cells. By flow cytometry, we compared two techniques for ZAP-70 analysis: the isotype control and the ratiometric method. Between the two methods we selected the second one because it was indipendent of the operator and more reproducible. Then we standardized this method for our laboratory instruments. We optimized threshold value for ZAP-70 expression and we selected the cut-off that had greatest sensitivity and specificity. Finally we compared the results obtained from 4 different monoclonal antibodies (MoAb) anti-ZAP-70, identifying two MoAb for the detection of ZAP-70: the anti-ZAP70 Alexa Fluor 488, Caltag Laboratories and anti-ZAP70 FITC, Upstate Cell Signaling Solution. The analysis of LAIR-1 showed that it was reduced in CLL patients (41% ± 32) with respect to in healthy subjects (84% ± 1) and, in particular high-risk patients (stage 3 and 4) had less protein expression than lower-risk group (stage 0-2). Our data confirmed the prognostic role of SHM in CLL: the median survival times for mutated and unmutated patients were 260 and 99 months, respectively (p<0,001). The evaluation of the VH repertoire highlighted a prevalent expression of the gene families VH3 (58% of the patients), VH1 (18% of the sample) and VH4 (18%). The expression of VH1 genes was associated with an unmutated IgVH status (58% of CLL patients); the expression of VH4 family was associated to a mutated status (SHM≥2%) and to a median global survival of 220 months, significantly higher when compared to the average of the whole sample (p<0,001). We also demostrated a prognostic role for CD38 and ZAP-70 expression: the median overall survival for CD38 negative and positive patients was 123 and 250 months, respectively (p<0,01); the median survival for the ZAP-70 positive and negative patients was 135 and 220 months (p<0,01). We analyzed the correlations between these prognostic factors. Statistical analysis showed a significant correlation between CD38 expression and the unmutated IgVH status (p<0,01) and between ZAP-70 expression and the absence of hypersomatic mutation (p<0,05). LAIR-1 was less expressed in both SHM negative patients and in CD38 positive patients. Our data confirm the utility of new prognostic factors as far as they may predict the clinical evolution of the disease. However, the mutational status of variable heavy chain Ig genes at present represents the most reliable and mandatory prognostic factor. ZAP-70 evaluation by flow cytometry tecnology is promising but every laboratory should standardize appropriate methods according to the instruments and reagents available in their setting.
La leucemia linfatica cronica di tipo B (LLC-B) è la forma più comune di leucemia dell'adulto ed è caratterizzata dall’accumulo nel sangue periferico, nel midollo osseo e negli organi linfatici di piccoli linfociti B monoclonali esprimenti il marcatore CD5. È una patologia eterogenea, la cui evoluzione varia da un decorso clinico indolente, che non necessita di alcuna terapia, ad una rapida progressione che richiede un trattamento. L’identificazione di fattori che permettano di stratificare pazienti a prognosi differente fin dalle fasi iniziali della malattia è uno dei principali obiettivi degli studi riguardanti la LLC-B. Negli anni sono stati definiti fattori di prognosi classici (il tempo di raddoppiamento linfocitario, l’infiltrazione del midollo osseo, la percentuale di prolinfociti, i livelli di β2 microglobulina, di timidina chinasi e di CD23 solubile), e, più recentemente, fattori prognostici correlati a caratteristiche molecolari del clone leucemico, tra i quali la presenza di alterazioni citogenetiche, lo stato mutazionale dei geni della catena pesante delle immunoglobuline (SHM), l’espressione dell’enzima telomerasi e di molecole quali CD38 e ZAP-70. Un possibile fattore prognostico, ancora in fase di valutazione, è infine il leucocyte-associated Ig-like receptor-1 (LAIR-1 o CD305), un recettore inibitorio, espresso sulla superficie delle cellule B, che può indurre la defosforilazione di diverse chinasi. Il progetto di ricerca sviluppato nei tre anni di dottorato mirava a definire il valore di alcuni fattori prognostici di recente definizione (CD38, CD305, ZAP-70 e SHM) e le possibili correlazioni esistenti tra essi. In particolare, poiché le modalità di determinazione dell’espressione della chinasi ZAP-70 sono oggetto di discussione a livello internazionale, una parte rilevante del triennio di questo dottorato di ricerca è stata dedicata alla valutazione ed alla comparazione di diversi metodi sperimentali, al fine di identificare un procedimento affidabile e ripetibile per la quantificazione di questa proteina. L’individuazione di un metodo affidabile e riproducibile per l’analisi di ZAP-70 mediante analisi citofluorimetrica ha portato alla scelta del metodo raziometrico, che valuta l’intensità media di fluorescenza di ZAP-70 nei linfociti B patologici in rapporto all’intensità media di fluorescenza della proteina nei linfociti T. Il metodo si è rivelato infatti più indipendente dall’operatore rispetto alle altre metodiche analizzate. Una volta stabilito il metodo più appropriato, abbiamo adeguato la metodica alla strumentazione del nostro laboratorio di Ematologia e Immunologia Clinica. Abbiamo quindi stabilito il valore soglia che meglio distingueva tra pazienti positivi e negativi e che ci permetteva di ottenere le maggiori specificità e sensibilità e abbiamo infine confrontato i dati ottenuti dall’utilizzo di diversi anticorpi monoclonali in grado di riconoscere la proteina ZAP-70 dimostrando che i due anticorpi che davano risultati maggiormente riproducibili e più simili tra loro erano l’anticorpo anti-ZAP70 Alexa Fluor 488, Caltag Laboratories e l’anticorpo anti-ZAP70 FITC, Upstate cell signaling solution. Per quanto riguarda gli altri fattori prognostici esaminati, abbiamo innanzitutto confermano il ruolo prognostico delle SHM nei 247 pazienti da noi analizzati e afferenti all’Unità operativa di Ematologia e Immunologia Clinica. Infatti il valore medio di sopravvivenza globale per i pazienti con SHM≥2% rispetto alle sequenze germline è risultato pari a 260 mesi e 99 mesi rispettivamente (p<0,001). La valutazione del repertorio VH ha evidenziato una prevalente espressione della famiglia VH3 (58% del campione). Le altre famiglie VH più rappresentate erano la famiglia VH1 (18% del campione) e VH4 (18%). L’espressione della famiglia VH1, era associata ad un’elevata probabilità di avere uno stato mutazionale <2% delle IgVH (58%). L’espressione della famiglia VH4, invece, si associa ad uno stato mutato (≥2%) delle IgVH (67%) e ad una sopravvivenza globale media di 220 mesi, significativamente superiore rispetto alla media dell’intero campione (p<0,001). Anche CD38 e ZAP-70 hanno dimostrato un ruolo prognostico importante: la sopravvivenza globale media per i pazienti CD38 positivi e negativi era pari rispettivamente a 123 mesi e 250 mesi (p=0,002); la sopravvivenza globale media per i pazienti ZAP-70 positivi e negativi era pari a 135 e 220 mesi (p=0,009). Lo studio dell’espressione di LAIR-1 ha dimostrato che questo recettore è espresso mediamente in quantità minore (41%±32) rispetto ai soggetti sani (84%±1), ed in particolare i pazienti ad alto rischio (stadio 3 e 4) avevano un’espressione minore della proteina rispetto al gruppo a minor rischio (stadio 0-2). Abbiamo valutato l’esistenza di correlazioni tra i diversi fattori prognostici. Abbiamo così rilevato una correlazione statisticamente significativa tra l’espressione di CD38 e l’assenza di ipermutazioni somatiche (p<0,01). Analogamente, abbiamo osservato una correlazione tra la positività di espressione di ZAP-70 e la mancanza di SHM (p<0,05). Per quanto riguarda LAIR-1, il recettore risulta espresso in quantità minore sia nei pazienti con SHM<2% sia in quelli CD38 positivi, mentre non è emersa alcuna differenza quando si sono considerati i pazienti per l’espressione di ZAP-70. I risultati ottenuti confermano l’efficacia dei fattori prognostici innovativi nel predire fin dal momento della diagnosi il possibile decorso clinico della malattia. Lo stato mutazionale rimane il fattore prognostico di riferimento e attualmente non sostituibile. Per quanto riguarda la proteina ZAP-70, promettente per la praticità e la rapidità della metodica impiegata per la sua valutazione, va sottolineato che ogni laboratorio deve standardizzare la metodica adeguandola agli strumenti ed ai reagenti in dotazione.

B-cell Non-Hodgkin Lymphomas (B-NHL) are a heterogeneous group of cancers, broadly diffused worldwide and often relapsing after standard treatment and rituximab. Therapeutic vaccines targeting B-NHL idiotype (Id) represent a promising approach to maintain the complete response induced by standard treatments. However, customized idiotypic vaccination still remains a non-approved, experimental therapeutic option, mostly due to the personalized use and penalized by the lack of reliable clinical or biological markers of patient eligibility and responsiveness. Nevertheless, the molecular characterization of different lymphoid tumor histotypes revealed a set of stereotyped immunoglobulins among distinct B-cell lymphoma types. On this ground, we focused our attention on the IGHV1-69 protein, frequently expressed in HCV-associated lymphomas, chronic lymphocytic leukaemia, and auto-immunity related lymphoproliferations, and we characterized the ex vivo immunogenicity of this protein. Seventy IGHV1-69 sequences obtained from patients affected by different B-NHLs or pre-malignant lymphoproliferations were compared to design an optimized sequence characterized by the highest degree of similarity among studied cancers, and thus CDR3 hypervariable region free. Within this “immunogenically” optimized sequence, we identified 13 potential HLA class-I cytotoxic T lymphocyte (CTL) epitopes and synthesized the corresponding pentamers (Pent). We assessed by flow cytometry the presence and extent of epitope-specific T-cell responses in peripheral blood of patients with IGHV1-69+ B-cell lymphoproliferative disorders and healthy donors, and validated these data in IFN-γ ELISPOT (Enzyme-linked immunosorbent spot) assays. Finally, we boosted in vitro IGHV1-69-specific responses by stimulating peripheral blood lymphocytes (PBL) from donors and patients with different protocols for the generation of epitope-specific CTL cultures. Interestingly, the IGHV1-69 Pent+ population observed in patients’ samples was generally larger than in donors, supporting the existence of spontaneous memory T-cell responses against IGHV1-69, at least for some HLA-restrictions. Surprisingly, in patients’ samples, IGHV1-69-recognizing T cells displayed higher IFN-γ release in ELISPOT assays compared to viral-specific T cells. Moreover, we obtained peptide-specific CTL lines, which showed a weak but specific lysis against peptide-pulsed targets, especially when derived from patients’ PBLs. In addition, we were able to generate IGHV1-69-epitope specific CTL clones from healthy donors CD8+ T cells, employing synthetic artificial APC, developed to elicit and expand low-avidity tumor-directed human CTL lines. Finally, IGHV1-69-induced CTL lines showed specific lysis also towards an IGHV1-69 naturally expressing cell line, suggesting that IGHV1-69 memory T-cell responses could be boosted for therapeutic purposes. These results show that IGHV1-69 constitutes a potential target for the development of a subset-specific Id vaccine. Furthermore, multimer (tetramers and pentamers) and ELISPOT immune-monitoring may partially overcome the main limitations of current Id-targeting vaccinations and further improve their clinical efficacy.
I Linfomi Non-Hodgkin a cellule-B (B-NHL) rappresentano un gruppo eterogeneo di patologie, ampiamente diffuse nel mondo e caratterizzate da frequenti ricadute in seguito a trattamenti standard o terapia con rituximab. Vaccini terapeutici che hanno come bersaglio l’Idiotipo (Id) dei B-NHL, costituiscono un approccio promettente nel mantenere la risposta completa indotta con trattamenti standard. Tuttavia, i vaccini idiotipici personalizzati rappresentano ancora un approccio terapeutico sperimentale e non approvato su larga scala, principalmente perché paziente-specifici e perché privi di marcatori attendibili per l’identificazione di pazienti elegibili e di risposta alla terapia. Ciononostante, la caratterizzazione molecolare di differenti istotipi di tumori di origine linfoide, ha rivelato la presenza di una serie di immunoglobuline stereotipate anche fra linfomi di diverso tipo. Su questi presupposti, abbiamo focalizzato la nostra attenzione sulla proteina IGHV1-69, frequentemente espressa in linfomi associati all’infezione da HCV, nella leucemia linfatica cronica (CLL) e in linfoproliferazioni associate ad auto-immunità, e abbiamo valutato in vitro l’immunogenicità di questa proteina. Inizialmente, abbiamo confrontato 70 sequenze relative alla proteina IGHV1-69 e ottenute da pazienti affetti da differenti B-NHLs o linfoproliferazioni pre-maligne, allo scopo di ideare una sequenza ottimizzata, caratterizzata dal maggior grado di similarità fra i tumori presi in esame, e pertanto priva della regione ipervariabile CDR3. All’interno di questa nuova sequenza, abbiamo identificato 13 epitopi potenzialmente riconoscibili da linfociti T citotossici (CTLs) nell’ambito di 7 alleli HLA di classe I, e abbiamo sintetizzato i corrispondenti pentameri (Pent). Tramite citofluorimetria a flusso abbiamo quindi valutato la presenza di risposte T-cellulari specifiche per gli epitopi derivati da IGHV1-69, in campioni di sangue periferico ottenuti da pazienti affetti da linfoproliferazioni esprimenti IGHV1-69 e da donatori sani. Abbiamo inoltre validato questi dati tramite saggi ELISPOT (Enzyme-linked immunosorbent spot) per l’identificazione del rilascio di IFN-γ. Infine abbiamo stimolato in vitro le risposte specifiche per IGHV1-69, inducendo i linfociti del sangue periferico (PBLs) di donatori sani e pazienti, attraverso diversi protocolli per la generazione di colture CTL epitopo-specifiche. E’ stato interessante osservare come nei campioni ottenuti da paziente la popolazione di linfociti T CD8+ positiva ai pentameri specifici per gli epitopi di IGHV1-69 sia risultata generalmente più numerosa della corrispondente popolazione osservata in donatori sani. Questo dato supporta l’esistenza di risposte memoria T cellulari nei confronti di IGHV1-69, almeno in alcune restrizioni HLA. Inoltre, nei campioni ottenuti da paziente le cellule T specifiche per gli epitopi di IGHV1-69 hanno rivelato in saggi ELISPOT un maggior rilascio di IFN-γ rispetto ai linfociti T specifici per epitopi virali. In aggiunta, stimolando parallelamente PBLs di donatori sani e pazienti, abbiamo ottenuto linee CTL peptide-specifiche, in grado di riconoscere debolmente, ma in modo specifico target caricati con il peptide d’interesse, soprattutto quando derivate da PBLs di pazienti. Inoltre, tramite l’utilizzo di antigen-presenting cells artificiali, prodotte allo scopo di indurre ed espandere linee CTL caratterizzare da bassa affinità nei confronti di antigeni tumorali, abbiamo anche generato cloni CTL specifici per un epitopo di IGHV1-69 a partire da linfociti T CD8+ di donatori. Infine, si è evidenziato che colture CTLs indotte in seguito a stimolo con epitopi derivanti da IGHV1-69, sono in grado di riconoscere in modo specifico una linea cellulare naturalmente esprimente IGHV1-69, suggerendo in questo modo che le risposte memoria T-cellulari specifiche per IGHV1-69, possano essere stimolate ed espanse a scopi terapeutici. Questi risultati dimostrano che IGHV1-69 costituisce un target potenziale per lo sviluppo di un vaccino Id applicabile su un sottogruppo di linfomi a cellule B. Inoltre, l’immunomonitoraggio tramite marcatura con multimeri (tetrameri o pentameri) e saggi ELISPOT potrebbe eludere almeno parzialmente i principali limiti degli attuali vaccini idiotipici, al fine di incrementare ulteriormente la loro efficacia clinica.

This study begins with the clinical observation of muscolo-skeletal involvement in leukaemia. Bone metabolism alterations have been reported before diagnosis, and persist during therapy and follow up. The Receptor Activator Nuclear Factor Kappa B Ligand (RANKL), also known as CD254, represents the major pathway that regulates bone metabolism. This ligand can exist either as a soluble form either as membrane form (CD254). The ligand is expressed mainly by bone forming cells osteoblasts (OBs) and its receptor RANK is expressed by bone resorbing cells osteoclasts (OCs). Upon the binding of the ligand to its receptor osteoclasts precursor are induced to fuse into a multinucleate cell, able to resorb bone substrates. Flow cytometry analysis showed that membrane CD254 was up regulated in B ALL patients at diagnosis compared with control patients (Stop therapy and maintenance). Co-colture of CD14+ osteoclast precursors have been performed in order to assess the ability of CD14+ to fuse into multinucleate cells and eventually to resorb bone substrate. We evaluated the ability of a leukaemia cell line SEM, showing CD254 expression to influence CD14+ cells to differentiate and digest bone. Subsequently we co-coltured primary bone marrow cells from patients at diagnosis and controls and the ability to induce multinucleation of CD14+ cells were evaluated. Gene expression profile (GEP) was performed in order to see if RANKL involved pathways were altered in patients at diagnosis. We found that osteoclastogenic pathway, and osteoclast specific genes involved in osteopetrosis were down regulated. In this context of interaction we decided to focus on the cell communication through circulating membrane vesicles. Known with the generic term of extracellular vesicles (EVs), those can be isolated from the peripheral and bone marrow plasma. Here they have been isolated and analysed by flow cytometer for specific B leukemic (CD19), platelets (CD61) and bone (CD254) markers. The results showed that the overall number of EVs in peripheral blood plasma from diagnosis was reduced compared to the controls. Only few CD19+ vesicles were present in the peripheral blood plasma of diagnosis. In conclusion this study highlights the importance of the interaction between blasts cells and the bone metabolism, suggesting leukaemia can actively influence osteoclasts precursors.
Lo studio parte dall’osservazione che i pazienti pediatrici affetti da leucemia, presentano un interessamento osseo ancora prima della diagnosi e che persiste durante e dopo la terapia. La principale via regolatrice del metabolismo osseo è quella del Receptor Activator Nuclear Factor Kappa B Ligand (RANKL), anche noto come CD254. Questo ligando esiste sia in forma solubile sia di membrana (CD254). Il CD254 è espresso soprattutto dagli Osteoblasti (OBs), le cellule responsabili della formazione dell’osso, mentre il suo recettore, RANK, dagli Osteoclasti (OCs), le cellule deputate al riassorbimento. Gli osteoclasti degradano l’osso dopo l’attivazione attraverso il legame del RANKL. Altre cellule possono esprimere il RANKL e l’alta espressione del RANKL è associata alla capacità delle cellule di indurre osteolisi. L’analisi al citofluorimetro ha dimostrato che l’espressione della forma di membrana CD254 è up-regolata nei pazienti all’esordio B LLA Common rispetto ai controlli fuori terapia o a fine mantenimento. Mediante esperimenti di co-cultura è stata studiata la capacità dei blasti di influenzare il differenziamento dei precursori degli osteoclasti. E’ stata valutata quindi la capacità dei precursori CD14+ di fondersi a formare una cellula multinucleata, l’osteoclasto maturo, il quale in seguito diventa attivo e in grado di degradare la matrice ossea. La capacità di degradazione dell’osso è stata valutata usando una linea cellulare leucemica (SEM) esprimente il CD254, messa in co coltura con i CD14+. Le cellule coltivate in un terreno contenente frammenti di osso sono state in grado di degradare il substrato osseo. E’ stata poi valutata la capacità di multinucleazione da parte dei blasti da BM degli esordi ed esprimenti CD254 rispetto a quella dei controlli. Si è visto che l’alta espressione del RANKL sui blasti CD19+ dei pazienti alla diagnosi induce multinucleazione dei CD14+. Inoltre studi di Gene Expression Profile (GEP) sono stati fatti per valutare se ci fosse un’alterazione dei geni coinvolti nell’osteoclastogenesi e nell’osteopetrosi e alcuni di questi sono risultati down regolati in modo significativo. In questo network d’interazioni cellulari abbiamo voluto studiare un aspetto della comunicazione cellulare che riguarda le Microvescicole circolanti o “Extracellular Vesicles” (EVs). Le EVs sono state caratterizzate al citometro per l’espressione di marcatori di leucemia (CD19), piastrine (CD61) e per il metabolismo osseo (CD254). I risultati indicano che la produzione di EVs negli esordi dei pazienti B ALL è down regolata e che solo poche vescicole esprimono il CD19. Nel complesso questi dati suggeriscono che esiste un coinvolgimento diretto dei blasti nella via che regola il metabolismo osseo e che i blasti possono influenzare gli osteoclasti.

B-cell acute lymphoblastic leukaemia (B-ALL) is one of the most common paediatric disorders characterized by an accumulation of B-cell blasts reminiscent of normal stages of differentiation and by infiltration of various extramedullary sites. B-ALL patients that respond poorly to glucocorticoid therapy when diagnosed are usually predicted to undergo relapse. Therefore understanding the biological mechanisms underlying this poor responsiveness is crucial for the development of more effective therapies. FOXM1 belongs to the Forkhead Box (FOX) superfamily of transcriptional factors and is a major regulator of cell proliferation and cell cycle progression. Its expression increases at the entry of cell cycle S-phase, remains stable during G2/M phase, and finally, is degraded at the mitotic exit. FOXM1 is a bona fide proto-oncogene and its up-regulation is often associated with a high proliferation rate, resistance to drugs and poor prognosis of many tumours, as well as with the development and progression of many malignancies. Therefore, downregulation of FOXM1 expression and activity might be a key strategy to inhibit tumour progression. In the first study we investigated the potential role of FOXM1 in B-ALL cell proliferation, aiming to understand if FOXM1 can be targeted to either increase the efficiency of chemotherapeutic treatment, or to overcome drug resistance in this haematological malignancy. We observed that FOXM1 protein and mRNA levels are higher in B-ALL patients and cell lines when compared to lymphocytes of healthy donors (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs). We then downregulated FOXM1 in REH and NALM-6 cell lines using a specific FOXM1 siRNA or thiostrepton treatment: there was a significant reduction in cell proliferation, cell cycle arrest in G2/M and an increase in sub-G1 cells. Importantly, we observed that thiostrepton acts in synergy with conventional chemotherapeutic agents, increasing their efficiency and partially reversing the glucocorticoid resistance in REH cells. Altogether, our results suggest that FOXM1 inhibition could be a useful strategy to increase the efficacy of existing therapeutics for B-ALL and to overcome drug resistance. In the second study we focused our attention on another FOX family member: the transcription factor FOXO3a. Although FOXO3a is mainly described as a bona fide tumour suppressor, literature reveals that it might also play a role as a proto-oncogene, by inducing cancer development and drug resistance according to the cellular context. FOXO3a transcriptional activity is regulated by a complex array of post-translational modifications. Amongst there, phosphorylation and acetylation are the major regulators of FOXO3a subcellular localization and transcriptional function. In this work, we investigated whether FOXO3a is involved in dexamethasone responsiveness of B-lymphoblastic leukaemia (B-ALL). Western blot and immunostaining data showed that FOXO3a becomes active only in sensitive cells following dexamethasone treatment. In dexamethasone sensitive cells (RS4;11 and SUP-B15), FOXO3a translocates from the cytoplasm to the nucleus, where it induces the expression of BIM, p27 and the activation of apoptosis signature through caspase-3 cleavage. Moreover knockdown experiments clearly reveal that FOXO3a expression and function is fundamental for dexamethasone mediated cytotoxicity. We then performed a series of experiments to clarify if its activity is regulated by phosphorylation and/or acetylation. More importantly, two post-translational modifications, phosphorylation on Ser7 and acetylation on Lys242 and Lys245, appeared to be crucial for dexamethasone-mediated FOXO3a activation in sensitive cells. Clarifying which are the biological processes that prevent these post-translational modifications from occurring in dexamethasone-resistant REH cells, might pave the way to overcoming glucocorticoid resistance in B-ALL
La leucemia linfoblastica acuta di tipo B (B-ALL) è un tumore caratterizzato dall’accumulo nel midollo osseo di linfociti immaturi, blasti, di tipo B che successivamente invadono il sangue, raggiungendo anche i linfonodi, la milza, il fegato e il sistema nervoso centrale. I pazienti B-ALL che alla diagnosi non rispondono al trattamento con glucocorticoidi, sono spesso soggetti a prognosi infausta e a ricaduta della malattia. Comprendere quindi quali siano i meccanismi molecolari sottostanti a questa resistenza ai glucocorticoidi permetterebbe di evitare fenomeni di ricaduta e potenzialmente di trovare nuove efficaci terapie antitumorali. FOXO3a e FOXM1 appartengono alla stessa famiglia di fattori di trascrizione denominati forkhead. Sebbene non sia ancora stato chiarificato quale sia il ruolo svolto da questi due fattori di trascrizione nelle B-ALL, i lavori riportati in letteratura dimostrano che FOXO3a e FOXM1 generalmente svolgono ruoli opposti all’interno della cellula. FOXM1 infatti è un importante oncogene che regola principalmente la proliferazione cellulare promuovendo la progressione tumorale. Per questo motivo, FOXM1 è spesso sovraespresso in diversi tipi di tumori, contribuendo quindi alla resistenza terapeutica e alla progressione tumorale. FOXO3a al contrario è un noto soppressore tumorale la cui attivazione è fondamentale per favorire la citotossicità di molti composti chemioterapici. Tuttavia la sua localizzazione intracellulare ed attività trascrizionale sono regolate da una complicata rete di modificazioni post-traslazionali, quali la fosforilazione, l’acetilazione, la metilazione e l’ ubiquitinazione. Nella prima parte di questo studio abbiamo quindi esaminato se questi due fattori di trascrizione, FOXO3a e FOXM1, svolgono un ruolo nelle B-ALL. In particolare abbiamo analizzato se FOXM1 è coinvolto nella proliferazione cellulare e nella risposta al trattamento chemioterapico. Inoltre abbiamo svolto una serie di esperimenti per comprendere se FOXO3a è coinvolto nella risposta al trattamento coi glucocorticoidi (desametasone) e se la sua attività trascrizionale viene modulata da modificazioni post transazionali quali la fosforilazione e l'acetilazione. I dati ottenuti hanno dimostrato che entrambi i fattori di trascrizione, FOXM1 e FOXO3a svolgono un ruolo chiave nelle leucemie B-ALL. FOXM1 è un importante regolatore della proliferazione tumorale, infatti la sua downregolazione provoca una significativa diminuzione della proliferazione cellulare associata all’arresto del ciclo cellulare in G2/M. FOXM1 inoltre risulta essere un importante target terapeutico per le B-ALL in quanto la sua inibizione può significativamente incrementare l’effetto citotossico dei chemioterapici che sono normalmente utilizzati per trattare i pazienti affetti da B-ALL. Il fattore di trascrizione FOXO3a gioca un ruolo centrale nel mediare la risposta al trattamento con desametasone. Infatti, in seguito al trattamento, FOXO3a diventa trascrizionalmente attivo solo nelle cellule che sono sensibili (RS4;11 e SUP-B15). FOXO3a trasloca nel nucleo dove regola l’espressione di geni proapoptotici. Diversamente nelle cellule resistenti al desametasone, REH, FOXO3a rimane inattivo e localizzato nel citoplasma. Inoltre, FOXO3a diventa maggiormente fosforilato e acetilato, nei siti Ser7 e Lys242/245 rispettivamente, solo nelle cellule sensibili, suggerendo che probabilmente queste due modificazioni post-translazionali contribuiscono nel promuovere la sua attivazione trascrizionale. Nella seconda parte dello studio ho analizzato il meccanismo molecolare di due classi di composti antitumorali, gli arilamino triazoli e le fenilcinammidi, entrambi sintetizzati per inibire, in maniera selettiva, la proliferazione ed indurre morte cellulare nelle cellule tumorali. In particolare, è stato studiato l'effetto di tali molecole sulla polimerizzazione della tubulina, sul ciclo cellulare e sull'attivazione dell'apoptosi per la delucidazione di un possibile meccanismo d'azione. I composti testati hanno mostrato attività antiproliferativa comparabile o superiore rispetto ai composti di riferimento. Per quanto riguarda il meccanismo d'azione, in generale, entrambi questi composti inducono un blocco del ciclo cellulare in fase G2/M il quale porta all'attivazione del processo apoptotico caspasi- dipendente. Tuttavia gli arilamino triazoli agiscono principalmente come inibitori della polimerizzazione della tubulina, mentre le fenilcinammidi agiscono riducendo significativamente i livelli di antiossidante intracellulare glutatione, provocando quindi un aumento dello stress ossidativo intracellulare che in ultima analisi porta ad apoptosi

Epstein-Barr Virus (EBV) is involved in a wide range of malignancies, particularly in immunocompromised subjects. Besides immunodepression, chronic immune activation may induce B-cell stimulation leading to an expansion of EBV-infected cells, thus increasing the risk of EBV-related malignancies. The factors that may contribute to HIV-1-induced B cell activation and expansion of EBV-infected cells are largely unknown. In Africa EBV primary infection occurs during infancy and early childhood and EBV-associated lymphomas represent an important cause of morbidity and mortality in children. High levels of EBV represent a risk factor for the onset of EBV-related malignancies. To date, no data are available about EBV-infection and related malignancies in the context of HIV-1 infection in African children; this may be partly due to lack of access of laboratory analyses in developing countries. The use of Dried Blood Spot (DBS) may represent an easy method to collect and store blood samples and allow their reliable transport to specialized laboratories. My PhD research focused on the following themes: 1) the relationship between markers of immune activation and EBV load in HIV-1 infected patients. 2) EBV infection in HIV-1 infected and uninfected children in African countries. 3) a new application of Dried Blood Spot to type and quantify EBV and to identify B cell clonality in order to diagnose and monitor B-cell malignancies. 1) EBV load and immune activation in HIV-1-infected patients A total of 156 HIV-1-infected patients were included in this study, 85 of which were under antiretroviral therapy (ART). EBV-DNA was detected in 114 patients, and in all but 3 it was EBV type 1. The median [interquartile] EBV-DNA load was 43[1-151] copies/105 cells and it was higher in patients with detectable HIV-1 plasma viremia, despite good immunological status (CD4>500 cells/µl), than in patients with undetectable HIV-1 plasma viremia regardless of immunological status (46[5-136] vs 17[1-56] copies/105 cells, p=0.008). Patients with high EBV-DNA load (>median value) presented higher levels of LPS and proinflammatory cytokines (IL-6, IL-10 and TNF-α) than patients with low EBV load. Furthermore, percentages of activated B-cells correlated with EBV-DNA load (r=0.754; p<0.001). Overall, these findings indicate a strong association between HIV-1 viremia, markers of immune activation and EBV load, and suggest that persistence of HIV-1 viremia and immune activation, regardless of peripheral CD4 cell depletion/repopulation, may favour the expansion of EBV-infected cells. 2) Association between NHL and blood levels of EBV in children in Tanzania, and dynamics of EBV in HIV-1-infected children in Uganda A matched case-control study was performed in children with Non-Hodgkin’s Lymphoma (NHL) admitted to three clinical centers in Tanzania, and their age-matched controls. Blood samples were collected on DBS. 21 out of 35 (60%) NHL patients and only 21 out of 70 (30%) controls presented EBV detectable in peripheral blood, thus showing a significant association between NHL and EBV in blood (OR=4.77 [95% CI 1.71–13.33], p=0.003). Furthermore, EBV-DNA levels were higher in cases compared to EBV-positive controls (p=0.024). Overall, these findings indicate that EBV-DNA load in peripheral blood might have diagnostic relevance. In a second study, blood samples from 213 HIV-1-infected children were collected on DBS at the Nsambya Home Care, Kampala, Uganda. 92 out of 140 (66%) children on ART and 57 out of 73 (78%) ART-naive children were found to be EBV-positive. After adjusting for CD4 Z-score, age and WHO stage, children on ART presented less odds of having detectable EBV than ART-naive children (OR=0.39 [95% CI 0.16-0.94], p=0.036). EBV load was significantly higher in ART-naive children than those on ART (4.22 [3.87-4.58] vs 3.99 [3.55-4.33] log10 copies/ml; p=0.016). Levels of 16S rDNA, a marker of microbial translocation, were significantly higher in ART-naive children than those on ART (2.16 [2.11-2.28] vs 2.09 [2.02-2.22] log10 copies/μl; p=0.007) and correlated with EBV-DNA levels (r=0.382, p=0.016), suggesting that circulating microbial products lead to B cell activation and expansion of EBV-infected B cells. Treatment with ART, likely by limiting HIV-1 load and thus the HIV-1-driven immune activation, may restrict EBV replication and expansion of EBV-infected cells. 3) Detection of clonal B-cell populations from DBS sampling: a tool for the diagnosis and monitoring of B-cell malignancies Firstly, through blood samples from donors, we ensured that DBS contains sufficient lymphocytes to perform a clonality assay without yielding false positive results. Using Namalwa cells that contain 2 EBV copies/cell, we found a good relationship between the expected and detected EBV-DNA copies (r=0.987, p<0.0001) and we established that a clonal B-cell population on DBS was detected when there were at least 200 clonal cells in the analysed sample. Moreover, very similar clonal results were obtained between DNA from DBS and fresh whole blood from patients with chronic lymphocytic leukemia. This study demonstrated the possibility to perform clonality testing on DBS sampling, thus improving the diagnostic and monitoring options. Conclusions In these studies, we found a significant relationship between markers of microbial translocation, levels of pro-inflammatory cytokines and EBV-DNA levels in both HIV-1 infected adults and children, suggesting that cell activation driven by HIV-1 antigens may result in chronic B cell stimulation and expansion of EBV-infected B cells, a risk factor for the development of EBV-related malignancies. Of interest, we found that EBV-DNA levels were higher in patients with a gain in CD4 lymphocytes, but incomplete suppression of HIV-1 viremia than in patients with undetectable plasma viremia, regardless their CD4 cell number. The relationship between immune activation and EBV levels was also supported by the findings in HIV-1 infected children in Uganda. Moreover, we found that EBV-DNA and 16S rDNA levels were significantly lower in children on ART than in those ART-naive, suggesting that treatment with ART, likely by limiting immune activation, may prevent B cell stimulation and expansion of EBV-infected B cells. These observations may become particularly interesting to plan future therapeutic strategies in HIV-1 infected patients. We also found that NHLs are strongly associated with EBV load in peripheral blood, suggesting that high levels of EBV in blood might have diagnostic and prognostic relevance for the diagnosis and monitoring of EBV-related B cell malignancies. In this context we assessed that DBS sampling was also suitable to identify the presence of a B cell clonal population. Our results showed it is possible to perform clonality testing on DBS sampling, thereby improving the diagnostic and monitoring capability of B cell lymphomas in resource-limited settings.
Il virus di Epstein-Barr (EBV) è coinvolto nello sviluppo di un ampio spettro di malattie linfoproliferative, in particolare nei soggetti immunocompromessi. Oltre all’immunodepressione, l’attivazione immunitaria cronica può indurre la stimolazione della cellula B, promuovendo l’espansione delle cellule infettate da EBV. I fattori che possono contribuire all’attivazione e all’espansione delle cellule B infettate da EBV, anche nei soggetti con infezione da HIV-1, sono per lo più sconosciuti. In Africa l’infezione primaria da EBV insorge durante la prima infanzia e i linfomi associati ad EBV sono un'importante causa di morbidità e mortalità nei bambini. Elevati livelli di EBV costituiscono un fattore di rischio per l’insorgenza dei tumori associati al virus. Ad oggi, non sono disponibili dati circa l’infezione da EBV e le patologie associate nei bambini africani con infezione da HIV-1. La mancanza di questi dati è in parte dovuta alla difficoltà di analisi di laboratorio nei Paesi in via di sviluppo. L'utilizzo di Dried Blood Spot (DBS) potrebbe rappresentare un metodo semplice per raccogliere, conservare campioni di sangue, e consentire il loro trasporto in laboratori specializzati. Gli scopi della ricerca svolta durante il corso di Dottorato sono stati i seguenti: 1) studiare la relazione tra viremia di EBV e marcatori di attivazione immunitaria nei soggetti con infezione da HIV-1. 2) studiare l’infezione da EBV nei bambini africani con infezione da HIV-1 e/o con tumori EBV-correlati. 3) sviluppare una nuova applicazione di DBS per la rilevazione della clonalità delle cellule B, per la diagnosi e il monitoraggio della patologia neoplastica. 1) Viremia di EBV e attivazione immunitaria in soggetti con infezione da HIV-1 Nello studio sono stati inclusi 156 pazienti con infezione da HIV-1. 85 pazienti erano in terapia antiretrovirale (ART). Il DNA di EBV è stato rilevato in 114 pazienti, e in tutti i casi tranne 3 era EBV tipo 1. I livelli mediani di EBV-DNA erano di 43[1-151] copie/105 cellule. I livelli di EBV erano più elevati nei soggetti con plasmaviremia di HIV-1 rilevabile, nonostante un buono stato immunologico (CD4>500 cellule/µl), rispetto a pazienti con plasmaviremia di HIV-1 non rilevabile, indipendentemente dallo stato immunologico (46[5-136] vs 17[1-56] copie/105 cellule, p=0.008). Pazienti con alti livelli di EBV-DNA (> valore mediano) avevano livelli più alti di lipopolisaccaride batterico (LPS) e di citochine proinfiammatorie (IL-6, IL-10 e TNF-α) rispetto a pazienti con bassa viremia di EBV. Inoltre, la percentuale di cellule B attivate correlava con i livelli di EBV (r=0.754; p<0.001). Nell'insieme, questi dati indicano una significativa associazione tra plasmaviremia di HIV-1, marcatori di attivazione immunitaria e citoviremia di EBV e suggeriscono che la persistenza di HIV-1 e l’attivazione immunitaria, indipendentemente dalla ripopolazione dei linfociti CD4 periferici, possono favorire l’espansione delle cellule B infettate con EBV. 2) Associazione tra livelli di EBV e NHL nei bambini della Tanzania e parametri relativi a EBV nei bambini con infezione da HIV-1 in Uganda E' stato condotto uno studio caso-controllo in bambini con linfomi non-Hodgkin (NHL) ammessi in tre centri clinici della Tanzania e controlli comparabili per età. I campioni di sangue sono stati raccolti in DBS. Ventuno di 35 (60%) pazienti con NHL e solo 21 di 70 (30%) controlli avevano EBV rilevabile nel sangue periferico (OR=4.77 [95% CI 1.71–13.33], p=0.003). Inoltre, i livelli di EBV erano più alti nei casi NHL rispetto ai controlli EBV-positivi (p=0.024). Nell'insieme, questi dati indicano che la viremia di EBV nel sangue periferico potrebbe avere rilevanza diagnostica. In un secondo studio, i campioni di sangue di 213 bambini con infezione da HIV-1 sono stati raccolti su DBS presso l’ospedale Nsambya, in Kampala, Uganda. Novantadue di 140 (66%) bambini in ART e 57 di 73 (78%) naive sono risultati positivi per EBV. In un'analisi multivariata per CD4 Z-score, età e stadio WHO, bambini in ART avevano minori probabilità di avere EBV rilevabile rispetto ai bambini naive (OR=0.39 [95% CI 0.16-0.94], p=0.036). La viremia di EBV era significativamente più elevata nei bambini naive rispetto a quelli in ART (4.22 [3.87-4.58] vs 3.99 [3.55-4.33] log10 copie/ml; p=0.016). I livelli di 16S rDNA, utilizzato come marcatore di traslocazione microbica, erano significativamente più elevati nei bambini naive rispetto a quelli in ART (2.16 [2.11-2.28] vs 2.09 [2.02-2.22] log10 copie/μl; p=0.007) e correlavano con i livelli di EBV-DNA (r= 0.382, p=0.016), suggerendo che i prodotti microbici circolanti promuovono l’attivazione e l’espansione della cellula B infettata da EBV. Il trattamento con ART, probabilmente limitando la viremia di HIV-1 e la conseguente attivazione immunitaria, può ridurre la replicazione di EBV e l’espansione delle cellule infettate da EBV. 3) Rilevabilità delle popolazioni clonali B da campioni di DBS: uno strumento per la diagnosi e il monitoraggio dei tumori delle cellule B In primo luogo, utilizzando campioni di sangue di diversa origine, è stato verificato che i DBS contenessero un numero sufficiente di linfociti per stimare la clonalità senza ottenere risultati falsi positivi. Mediante l'impiego di cellule Namalwa, che contengono 2 copie di EBV/cellula, è stata trovata una ottima correlazione tra i risultati attesi e le copie di EBV rilevate (r=0.987, p<0.0001); si è potuto quindi stabilire che una popolazione clonale B è rilevabile su DBS quando sono presenti almeno 200 cellule clonali nel campione analizzato. Inoltre, sono stati ottenuti risultati molto simili per la clonalità cellulare analizzando il DNA ottenuto da DBS e da sangue fresco di pazienti con leucemia linfatica cronica. Questo studio, dimostrando che è possibile valutare la clonalità su campioni di sangue conservato su DBS, allarga le opzioni diagnostiche e di monitoraggio. Conclusioni In questi studi abbiamo trovato una relazione significativa tra marcatori di traslocazione microbica, livelli di citochine pro-infiammatorie e livelli di EBV-DNA negli adulti e nei bambini con infezione da HIV-1. Di interesse e in accordo con studi precedenti, abbiamo anche dimostrato che i livelli di EBV sono più elevati nei pazienti con aumento di linfociti CD4 ma incompleta soppressione della viremia di HIV-1 rispetto a pazienti con plasmaviremia non rilevabile, indipendentemente dal numero di linfociti CD4. Nell'insieme, questi dati suggeriscono che l'attivazione immunitaria indotta da HIV-1 può risultare nella stimolazione e nell’espansione delle cellule B infettate con EBV, un fattore di rischio per lo sviluppo di neoplasie EBV-associate. La relazione tra attivazione immunitaria e livelli di EBV è risultata anche negli studi effettuati nei bambini con infezione da HIV-1, dove abbiamo trovato che i livelli di EBV-DNA e di 16S rDNA erano significativamente più elevati nei bambini in ART rispetto a quelli naive. Il trattamento con ART, probabilmente limitando l’attivazione immunitaria, potrebbe prevenire la stimolazione della cellula B e l’espansione della cellula B. Queste osservazioni possono essere di particolare interesse anche per pianificare strategie terapeutiche nei soggetti con infezione da HIV-1. Inoltre, la dimostrazione che i linfomi NHL sono significativamente associati ad elevati livelli di EBV nel sangue periferico, suggerisce che la determinazione di EBV nel sangue potrebbe avere una rilevanza diagnostica e prognostica per le neoplasie delle cellule B associate ad EBV. In questo contesto abbiamo potuto stimare che i campioni di DBS sono anche idonei ad identificare la presenza di una popolazione clonale B. Questo è importante perché estende le opzioni di diagnosi e monitoraggio dei linfomi B anche dove non sono di facile accesso queste analisi.

This diploma thesis deals with the static assessment of selected parts of the panel building of the former boarding school, for which adaptation to separate housing units and extension of one floor is planned. Upon the planned change of layout, extensions of the original door openings and new openings are proposed. The work assesses the object in its original state with the included unprofessional interference in statics during its use, and the object in the final state with planned modifications of the openings and proposes solutions to secure unsatisfactory areas to suit the new state loads

Notre objectif étant de procéder à une analyse des aspects formels du dîwân de Jamîl Buṯayna (poète arabe et héros de roman mort aux environs de 701) nous avons commencé par donner du texte une édition intégralement vocalisée et métriquement cohérente à partir de quatre éditions publiées antérieurement. A partir de cette édition, une analyse syllabique intégrale du diwân a été possible grâce au logiciel Xalîl élaboré par Djamel Eddine Kouloughli ainsi qu'un lexique fréquentiel. Dans le deuxième tome, nous avons procédé, à partir de l'analyse syllabique, à une analyse métrique. Le principal résultat de cette analyse a été la mise en évidence d'une systématisation du respect des zones de stabilité qui était sujettes à variation dans la poésie arabe ancienne. L'autre aspect de l'analyse a consisté dans l'extraction des formules du dîwân ; nous avons suivi pour cela une méthode originale que nous avons appelée : prospection guidée métriquement. Cette méthode a permis non seulement de détecter un grand nombre de formules en usage jusqu'au XIIIe siècle, date à laquelle nous avons arrêté l'analyse, mais elle a également mis en évidence l'existence de nombreux vers ou fragments de poèmes que l'on retrouve particulièrement dans les diwân de Jamîl Buṯayna, Majnûn Laylâ, Kuṯayyir Azza, Nuṣayb b. Rabâḥ et Qays b. Ḏariḥ qui constituent un fond commun sans doute à la portée de tous à l'époque et qu'il est donc vain de parler à ce propos de plagiat ou d'antériorité.

Maintenance of telomere length, required for the unlimited cell proliferation displayed by cancer cells, is provided by telomerase, a ribonucleoprotein complex containing a specialized reverse transcriptase, encoded by TERT gene, that uses an internal RNA template to maintain telomeres length, thus playing a critical role in tumor formation and progression. TERT is usually repressed in normal somatic cells, but is detectable in the vast majority of tumors. Recent studies have suggested that TERT, besides maintaining telomere, is involved in other cellular functions, and it may contribute to carcinogenesis also via telomere length-independent mechanisms; therefore its inhibition could represent a promising strategy to improve cancer treatment, regardless of telomere length. The possible therapeutic effects of BIBR1532 (BIBR), a specific TERT inhibitor, have been evaluated in different cellular backgrounds, but no data are currently available regarding Epstein-Barr virus (EBV)-driven and virus-unrelated B-cell malignancies. The aim of this study was to characterize the biological effects of short-term TERT inhibition by BIBR on EBV-immortalized lymphoblastoid cell lines (LCLs) and fully transformed Burkitt’s lymphoma (BL) cell lines; in addition, we investigated the effects of short-term BIBR treatment in vivo in wild type zebrafish embryos. We found that short-term inhibition of TERT by BIBR, in in vitro models of B-cell malignancies, led to decreased cell proliferation, accumulation of cells in the S-phase and ultimately increased apoptosis. The cell cycle arrest and apoptosis, consequent upon short-term TERT inhibition, were associated with and likely dependent on the activation of the DNA damage response (DDR), highlighted by the increased levels of γH2AX and activation of ATM and ATR pathways. Analyses of the mean and range of telomere lengths and telomere dysfunction-induced foci indicated that DDR after short-term TERT inhibition was not related to telomere dysfunction, thus suggesting that TERT, besides stabilizing telomere, may protect DNA via telomere-independent mechanisms. Notably, TERT-positive LCLs treated with BIBR in combination with fludarabine or cyclophosphamide showed a significant increase in the number of apoptotic cells with respect to those treated with chemotherapeutic agents alone. In agreement with in vitro results, short-term inhibition of Tert by BIBR in wild type zebrafish embryos reduced cell proliferation, induced an accumulation of cells in S-phase, increased apoptosis, and triggered the activation of DDR. These effects were telomere length-unrelated, since the range of telomere length was not affected by the short-term BIBR treatment and the DNA damage foci were distributed randomly, rather than specifically located at telomeres. All these effects were specifically related to Tert inhibition since BIBR treatment showed no effect in Tert-negative zebrafish embryos. Taken together these data demonstrate that TERT inhibition impairs cell proliferation and induces pro-apoptotic effects unrelated to telomere dysfunction, enforcing the concept that TERT per se exerts telomere length-independent tumor-promoting effects, and thus supporting the introduction of TERT inhibitors to complement current anticancer treatment modalities.
Il mantenimento dei telomeri, necessario per la proliferazione illimitata delle cellule tumorali, è esercitato dalla telomerasi, un complesso ribonucleoproteico contenente una trascrittasi inversa specializzata, codificata dal gene TERT, che utilizza un templato ad RNA per sintetizzare nuove sequenze telomeriche, svolgendo quindi un ruolo critico nella formazione e nella progressione dei tumori. TERT viene infatti solitamente represso in normali cellule somatiche, mentre è rilevabile nella maggior parte dei tumori. Studi recenti hanno suggerito che TERT è coinvolto in altre funzioni cellulari e può contribuire alla carcinogenesi anche attraverso meccanismi indipendenti dal mantenimento dei telomeri, quindi la sua inibizione potrebbe rappresentare una strategia promettente per migliorare il trattamento antitumorale, al di là dell’effetto sui telomeri. I possibili effetti terapeutici di BIBR1532 (BIBR), un inibitore specifico del TERT, sono stati valutati in diversi contesti cellulari, ma non sono attualmente disponibili dati ottenuti su modelli di neoplasie delle cellule B sia associate al virus di Epstein-Barr (EBV) che virus-indipendenti. Lo scopo di questo studio era di caratterizzare gli effetti biologici dell'inibizione di TERT a breve termine da parte del BIBR su linee cellulari linfoblastoidi immortalizzate da EBV (LCL) e su modelli in vitro di linfoma di Burkitt (BL); inoltre, sono stati studiati gli effetti del trattamento con BIBR a breve termine in vivo negli embrioni di zebrafish. I risultati ottenuti hanno dimostrato che l'inibizione a breve termine di TERT da parte di BIBR, in modelli in vitro di tumori delle cellule B, ha portato a una diminuzione della proliferazione cellulare, all'accumulo di cellule nella fase S e infine all'aumento dell'apoptosi. L'arresto del ciclo cellulare e l'apoptosi, conseguenti all'inibizione di TERT a breve termine, erano associati e probabilmente dipendenti dall'attivazione della risposta al danno del DNA, come evidenziato dall’aumento dei livelli di γH2AX e dall'attivazione dei pathway di ATM e ATR. L’analisi della media e del range di lunghezza dei telomeri e dei foci di danno al DNA ha indicato che la risposta al danno attivata in seguito all’inibizione TERT a breve termine non era legata a disfunzioni telomeriche, suggerendo quindi che TERT, oltre a stabilizzare il telomero, può proteggere il DNA tramite meccanismi telomero-indipendenti. In particolare, LCL-TERT positive trattate con BIBR in combinazione con fludarabina o ciclofosfamide hanno mostrato un aumento significativo del numero di cellule apoptotiche rispetto a quelle trattate con agenti chemioterapici da soli. In accordo con i risultati in vitro, l'inibizione a breve termine di Tert da parte del BIBR in embrioni di zebrafish ha ridotto la proliferazione cellulare, indotto un accumulo di cellule nella fase S, aumentato il tasso di apoptosi e innescato l'attivazione della risposta al danno al DNA. Questi effetti non erano legati a disfunzioni telomeriche, poiché il range di lunghezza dei telomeri non era influenzato dal trattamento a breve termine con BIBR e i foci di danno al DNA erano distribuiti casualmente, piuttosto che localizzati in modo specifico sui telomeri. Tutti questi effetti erano specificamente associati all'inibizione di Tert poiché il trattamento con BIBR non mostrava alcun effetto negli embrioni di zebrafish Tert-negativi. Nel complesso questi dati dimostrano che l'inibizione del TERT compromette la proliferazione cellulare e induce effetti pro-apoptotici non associati a disfunzioni telomeriche, rafforzando il concetto che TERT esercita di per sé funzioni pro-tumorali indipendenti dalla lunghezza del telomero e quindi supportando l'introduzione di inibitori di TERT per integrare le attuali modalità di trattamento antitumorale.

Carbohydrates are among the most abundant molecules found on the cell surfaces of bacteria, parasites, and viruses. Apart from the conventional roles of carbohydrates as energy sources and structural polymers, carbohydrates are also associated with cancer metastasis, protein stabilization, pathogen infection and the immune response. Cells of our body have sensors made out of carbohydrates on outer surface of plasma membrane and acts as sensors and can detect many kinds of stimuli, and can signal the immune system to respond. Carbohydrate-protein molecular recognition processes have pivotal roles in infections and in immune response to pathogens. To date, several vaccines based on isolated capsular polysaccharides (CPSs) are marketed against infectious diseases. However, the use of isolated capsular polysaccharide poses several limitations, as natural sources are generally limited and the isolation is very challenging. Additionally, the isolated polysaccharides are heterogeneous and often contains impurities. Furthermore, limited protection of certain CPS antigens impairs the efficiency of vaccines. To overcome limitations associated with isolated polysaccharides, synthetic oligosaccharides present an effective alternative with great potential to understand glycan immunology and rationally design effective antigens. Consequently, characterization and reconstruction of carbohydrate epitopes with authentic composition has become one of the major target in glycoscience. To this end, strategies are needed to facilitate the streamlined design and generation of these antigens. This thesis concerns the development of an effective synthetic strategy to obtain Group B Streptococcus (GBS) type II oligosaccharide for vaccine development. GBS, a Gram-positive bacterium, inhabits the intestinal and genitourinary tract of 10‐30% of humans. GBS is one of the primary causes of bacterial infections among neonates and pregnant women, resulting in many severe diseases such as sepsis, meningitis, abortion, and so on. Type II GBS is one of the predominant GBS serotypes and is associated with about 15% of the invasive infections in adults and infants; therefore, represents an important human pathogen. The development of effective preventive vaccine against GBS is much needed to help pregnant women protect their newborns. This thesis describes the effective synthetic strategy to synthesize GBS type II oligosaccharide to be applied for vaccine development. Herein, we present a new and convenient synthesis of the repeating unit of GBS type II capsular polysaccharide. The structure of GBS type II was elucidated in 1983 and the repeating unit of GBS type II is a heptasaccharide composed of α-Neu5Ac (2-3)-ß-D-Gal-(1-4)- ß-D-GlcNAc-(1-3)-[-ß-D-Gal-(1-6)]-ß-D-Gal-(1-4)-ß-D-Gal-(1-3)-ß-D-Glc. The presented synthetic strategy is based on the five subcomponents derived from the retro synthetic analysis. Suitably protected lactosamine and lactose derivatives are pivotal building blocks in our synthesis and both disaccharide fragments have been achieved from the cheap and readily available lactose. Having started from two disaccharides saves the efforts of glycosylation and reduces the number of synthetic steps. The building blocks have been obtained in good overall yield following the optimized synthetic approach. The synthesis of backbone linear chain trisaccharide [ß-D-Gal-(1-4)-ß-D-Gal-(1-3)-ß-D-Glc] and pentasaccharide [ß-D-Gal-(1-4)-ß-D-GlcNAc-(1-3)-ß-D-Gal-(1-4)-ß-D-Gal-(1-3)-ß-D-Glc] has been achieved in excellent yield (~80% yield). The final steps of the synthesis comprise- the incorporation of ß-D-Gal unit into the linear chain pentasaccharide (currently ongoing) followed by the enzymatic introduction of sialic acid (NeuNAc unit) and subsequent deprotection to yield the repeating unit of GBS type II capsular polysaccharide. To conclude, in this thesis we present an efficient and easy handling synthetic approach to the heptasaccharide repeating unit of GBS type II. Readily available and cheap dairy side-product lactose has been used as a key structure in the presented scheme, allowing the efficient synthesis of the pentasaccharide backbone of the target compound. The synthetic GBS II fragments will be used for glycan array and structural studies and immunochemical characterization with specific monoclonal antibodies. This thesis comprises of four main chapters and the experimental section containing the methods and synthetic procedures for the discussed schemes. Chapter one is a general introduction and deals with the necessity and the social importance of the described project. Chapter two of the thesis outlines the scientific background and pathogenesis of GBS, carbohydrates and their biological importance, and general introduction of vaccines and how the carbohydrates can be used as a suitable vaccine candidate. Chapter two establishes the importance of synthetic carbohydrates and how the synthetic carbohydrates can be used to develop suitable effective vaccines against GBS diseases. Chapter three of the thesis contains the general introduction and structural features of GBS II CPS and the retrosynthetic analysis of GBS II CPS to identify the building blocks for the synthesis of GBS CPS II. Chapter four of the thesis summarizes the synthetic strategies and results to achieve the building blocks described in chapter three and the recombination of fragments to achieve the final molecule GBS II CPS repeating unit. The last part of the thesis will consists of the experimental methods and synthetic procedures to achieve the proposed molecule along with the characterization data.

Serine-threonine protein kinase CK2 has been recently involved in the pathogenesis of B-cell tumors, such as B acute lymphoblastic leukemia, B chronic lymphocytic leukemia, mantle cell lymphoma and multiple myeloma. CK2 acts through a “non-oncogene” addiction mechanism to propel tumor growth, protecting from apoptosis by a phosphorylation-dependent “shielding” mechanism of pro-survival molecules and stimulating oncogenic kinases by helping folding and enzymatic activity. In addition existing data on CK2 function in B-cell tumors suggest that this kinase might act as a “hub” downstream signals from surface membrane molecules, like the B-cell (BCR), growth factor and cytokine receptors, as well as from cell-intrinsic pathways – like proteotoxic and DNA-damage-related stress cascades. To gain insights into the role of CK2 in B-lymphopoiesis and, consequently, in B-cell tumors, we generated CK2β conditional knockout (KO) mice in B-cells by crossing CK2β-Flox/Flox mice with CD19-CRE transgenic mice. CK2 kinase activity was decreased in CK2β KO B-cells. In the bone marrow (BM), CK2β KO mice displayed a reduction of B-cells, especially of the recirculating population of transitional and follicular (FO) B-cells. Pro-B and pre-B-cell progenitors were slightly reduced in number. In peripheral blood, lymph-nodes, spleen and peritoneal cavity the number of B-cells was markedly reduced. CK2β KO mice displayed lower levels of all the immunoglobulin classes in the serum. In the spleen of CK2β KO we observed an imbalance between the amount of FO and marginal zone (MZ) B-cells was found with an absolute reduction of FO B cells by approximately 2-folds and an increase of MZ B-cells and MZB cell precursors by up to three folds. Histological and immunofluorescence (IF) analysis revealed a change of size/shape of spleen follicles and a significant expansion of the inter-follicular, marginal zone areas, which appeared to invade the follicle with larger cells. In vitro class-switch recombination assays demonstrated impairment in IgG1 and IgG3 class-switch and a marked reduction of the generation of antibody-producing cells. In vivo sheep red blood cells (SRBC) treatment (T-cell dependent response) showed a conserved up-regulation of germinal center (GC) markers, such as CD38, GL7 and PNA. Nonetheless, the architecture of the reactive follicles was found markedly changed. The analysis of FO, GC and MZ-associated genes showed normal levels of Bcl6, elevated levels of Lrf mRNA and, more significantly, a marked up-regulation of Notch2 target genes, such as hes1 and deltex1, in CK2β KO B-cells. In vivo Notch2 blockage with neutralizing antibodies markedly reduced the MZB cell number in CK2β KO mice, indicating a Notch2-dependent MZB expansion associated with CK2β loss. High throughput RNAseq analysis was also performed and revealed significant alterations in FOB and MZB-regulating pathways. Here, we found that the β subunit of protein kinase CK2 is a novel regulator of peripheral B cell differentiation. CK2β sustains a proper BCR signal, controls the GC reaction and negatively regulates Notch2 signaling, acting as a master regulator of follicular/marginal zone architecture and terminal homeostasis of FOB and MZB cells. On one side our data enrich the knowledge on the mechanisms regulating B-cell development, on the other side they inform about the potential mechanisms altered by CK2 during B-cell tumorigenesis.
CK2 è una serin-treonin chinasi pleiotropica costituita da due subunità α catalitiche e due subunità β regolatorie. Recentemente questa proteina è stata coinvolta nella patogenesi di neoplasie delle cellule B del sistema ematopoietico, come la Leucemia Linfatica Cronica (CLL), il Linfoma Mantellare (MCL) ed il Mieloma Multiplo(MM). CK2 agisce attraverso un meccanismo definito "non - oncogene addiction", favorendo la sopravvivenza delle cellule neoplastiche proteggendole dall’ apoptosi, attraverso la fosforilazione di proteine pro-sopravvivenza e stimolando chinasi oncogeniche attivando, in questo modo, la loro attività enzimatica. Alcuni studi inerenti il ruolo di CK2 nelle neoplasie di tipo B, suggeriscono che questa chinasi potrebbe agire a valle di recettori di fattori di crescita e citochine. Sulla base di questi dati, per ottenere maggiori informazioni sul ruolo di CK2 nella B-linfopoiesi e, di conseguenza, su un suo ipotetico ruolo nello sviluppo di neoplasie B, abbiamo generato un knockout (KO) condizionale della subunità β di CK2 esclusivamente nei linfociti B, incrociando topi CK2β Flox / Flox con topi transgenici CD19 - CRE. Mediante approfondite analisi abbiamo dimostrato che l'attività chinasica di CK2 risulta diminuita nelle cellule di topi CK2β KO. Nel midollo osseo, i topi KO evidenziano una riduzione delle cellule B, in particolare della popolazione di linfociti B ricircolanti, mentre l’analisi dei precursori dei linfociti B, cioè i pro-B e i pre-B, evidenzia che essi sono solo leggermente ridotti. In sangue periferico, milza e cavità peritoneale si ha una marcata riduzione dei linfociti B, in più i topi CK2β KO presentano nel siero una ridotta quantità di immunoglobuline di tutte le classi (ipogammaglobulinemia). Un’analisi approfondita dei linfociti B splenici ha evidenziato che nei topi CK2β KO si ha uno squilibrio tra la quota di linfociti B della zona follicolare (FO) ed i linfociti B della zona marginale (MZ). L’analisi istologica e l’immunofluorescenza, effettuate su milze di topi CK2β KO, hanno rivelato entrambe un cambiamento di dimensione/forma dei follicoli ed una significativa espansione della zona marginale, che sembra invadere il follicolo stesso. Attraverso un approccio in vitro abbiamo valutato lo switch isotipico, dimostrando che, nei topi CK2β KO, si ha una compromissione dello switch verso IgG1 e IgG3 ed una marcata riduzione della produzione di cellule secernenti anticorpi. In vivo, il trattamento con globuli rossi di montone (SRBC) ha mostrato una conservata regolazione di marcatori del centro germinativo (GC), quali CD38, GL7 e PNA; tuttavia, l'architettura dei follicoli nei topi CK2β KO presenta, rispetto ai topi di controllo, un evidente cambiamento architettonico/topografico. L'analisi, mediante Real-Time PCR, di geni associati alle zone follicolare e marginale, oltre che al centro germinativo, ha messo in luce, che i topi CK2β KO hanno livelli normali di bcl6 , elevati livelli di espressione di lrf e, soprattutto, una mancata up-regolazione di geni coinvolti nel pathway di Notch2, come hes1 e deltex1. Sulla base di quest’ultimo dato, abbiamo ritenuto risolutivo bloccare in vivo il recettore Notch2, mediante l’utilizzo di uno specifico anticorpo neutralizzante evidenziando, nei topi CK2β KO, una notevole riduzione del numero dei linfociti B marginali. Un’analisi “High-Throughput” , mediante RNA-seq, ha rivelato, nei topi CK2β KO, una significativa alterazione dei processi che regolano la formazione di MZB o FoB. Dai risultati di questo studio si può, quindi, ipotizzare che la subunità β della protein chinasi CK2 sia un nuovo regolatore del processo di differenziamento dei linfociti B periferici. Inoltre, CK2β sembra implicata nella corretta trasmissione del segnale a valle del BCR, nella reazione di formazione del GC e nella regolazione del pathway di Notch2. Possiamo, perciò, definirla un nuovo “master regulator” del differenziamento di FoB e MZB e della definizione dell’architettura topografica della zona marginale della polpa bianca splenica. In conclusione, i dati ottenuti con questo lavoro di tesi, da un lato arricchiscono la conoscenza dei meccanismi che regolano lo sviluppo dei linfociti B, dall'altro ci danno informazioni sui potenziali meccanismi su cui agisce CK2 durante lo sviluppo di neoplasie dei linfociti B.

In this thesis, we extend the G-expectation theory to infinite dimensions. Such notions as a covariation set of G-normal distributed random variables, viscosity solution, a stochastic integral drive by G-Brownian motion are introduced and described in the given infinite dimensional case. We also give a probabilistic representation of the unique viscosity solution to the fully nonlinear parabolic PDE with unbounded first order term in Hilbert space in terms of G-expectation theory.

The fact that silent cinema is not to be considered just as a precursor to sound cinema, in an evolutionary sense, is today well acknowledged. The studies of scholars such as Tom Gunning, André Gaudreault, Richard Abel, Noël Burch and Charles Musser have moreover invited to consider what the “silent era” harbored not just as another cinema than the “sound” one, but as a number of “other” ways to conceive cinema, each one of them needing an accurately different approach, whatever is the chosen perspective (historiographical, aesthetic, sociologic, etc.) to look at them from. However, it is strange how one of these perspectives seems to be reluctant in accepting this awareness towards the silent production. It is the musical perspective: even if studies that deal with silent film music according to the specific features of the different languages of the silents have been developed indeed (most notably, the ones by Rick Altman), they nonetheless remain a minority. The panorama of discourses about film music, as of 2010, can still include authoritative contributions saying that «almost nothing has changed from the beginnings to present days» in the general way in which music interacts with moving images. Signs of this attitude are to be found even in the field of film preservation. Film archives devoted to silents, in fact, do not often accompany their film collections with pertinent music collections. There are, of course, meaningful exceptions, like the silent music collections at the Library of Congress or at the MoMA, or the Eyl/Van Houten Collection at the Nederlands Filmmuseum. But they are, precisely, exceptions. This situation apparently clashes with the need for «painstaking historical research» that Rick Altman recommends to be at the core of contemporary studies on silent films. A research done within an archive of silent film, in fact, is likely to be incomplete on the side of music and sound practices. Musicians of the silent era interacted with films by staying at the side of the screen, in the shadows next to the light of the projector: it is quite ironic how the discourse on their music, now, is again confined in a “shadow” – a metaphoric one, though - which borders with the “light” of the modern studies on silent cinema, but cannot proficiently interact with it. «It is time», as Altman said, «to include sound in silent cinema’s historiographical revival». A complete silent film music archive should be at the interface between a music library and a performing arts collection. Written scores, during the silent era, were a minority: the greatest part of the musical practice was instead based on cue sheets, compilations, repertoires, or even improvisations –which cannot of course have left any trace outside occasional accounts from audience members or the performers themselves. Moreover, practices of non-musical sonorization where often complementary to and concurrent with music performances: so, there is an evident need to keep record of them too. In addition to that, it must be remembered that, especially since the 1980 Thames Television presentation of Abel Gance’s Napoléon, reconstructed by Kevin Brownlow with new music by Carl Davis, the repertoire of the music for the silents started to grow again. In the last 30 years, the venues where silent film are screened in a way respectful of historical practices multiplied, as well as the production of appropriate music accompaniments founded on complete scores, but also, again, on cue sheets and improvisations, just like during the actual silent age. It seems reasonable for this “new” tradition of music for silents to be preserved alongside the historical documents which are its origin and source of inspiration. My Ph. D. thesis uses these considerations as a premise to reconstruct and study a special and circumscribed collection of silent film music: the repertoire played at the international silent film festival Le Giornate del Cinema Muto from 1982 to present days. The accuracy shown by this festival in the presentation and divulgation of silent film music practices provides in fact a solid ground for a project of this kind. In addition to that, Le Giornate have already expressed, in 2009, the intention of having such an archive developed in Pordenone, after a suggestion I advanced during the XI Collegium organized by the festival. The thesis is divided into two parts. The first one includes an introductory chapter, where problems about the archival preservation of musical sources pertinent to silent film music are discussed; then, a first chapter deals with an outline of the history of music for silent films, choosing a non-linear approach based on the insurgence of musical practices more than on a chronological succession; finally, the first part is concluded by a chapter describing the aesthetic of music for silent films, comprehensive of a review of the pertinent literature and a description of the audiovisual strategies used by the composers. The second part is the repertoire of the music that has been performed live at Le Giornate del Cinema Muto on the basis of written scores. 115 films are listed following the 29 editions of the Festival, with full filmographic information. Each film is accompanied by a short analysis of the main audiovisual strategies. The sources of this research are mainly the audiovisual recordings of the screenings at le Giornate del Cinema Muto preserved at La Cineteca del Friuli, Gemona. Other details have been collected through conversations (in person or via email) with some of the authors of the music: Gillian B. Anderson, Neil Brand, Günter A. Buchwald, Philip Carli, Antonio Coppola, Berndt Heller, Stephen Horne, Maud Nelissen, Donald Sosin and Gabriel Thibaudeau.
Il fatto che il cinema muto non possa essere considerato un mero precursore del cinema sonoro, secondo una logica «biologica e teleologica», è oggi ampiamente riconosciuto. Le riflessioni di studiosi quali Tom Gunning, André Gaudreault, Richard Abel, Noël Burch e Charles Musser hanno inoltre invitato a considerare il muto non solo come un altro cinema rispetto al sonoro, ma come un sistema di pratiche cinematografiche concorrenti ed essenzialmente diverse da quella del sonoro, decisamente mal raccolte sotto l’etichetta generica “cinema muto”. Ciascuna di queste maniere cinematografiche, numerose e dall’identificazione e denominazione controversa– cinematografia-attrazione, cinema dei primi tempi, cinema primitivo, ecc. – necessita di distinti strumenti d’analisi, quale che sia il punto di vista (storiografico, estetico, sociologico, ecc.) scelto per studiarla. È tuttavia strano come uno di questi possibili punti di vista si stia ancor oggi dimostrando piuttosto riluttante nell’accettare tale genere di consapevolezza nei confronti del muto. Si tratta del punto di vista musicale. È vero che non sono mancati gli studi teorici capaci di trattare la musica per il cinema muto tenendo conto della molteplicità e delle differenti necessità dei linguaggi visivi di quell’epoca: Rick Altman ha in particolare offerto alcune delle riflessioni più interessanti in tal senso. Ma tali riflessioni sono rimaste una minoranza. Il panorama dei discorsi sulla musica per film nel 2010 è ancora in grado di accogliere contributi importanti che tuttavia non differenziano le strategie audiovisive del sonoro da quelle del muto, sostenendo che nella maniera generale in cui la musica interagisce con l’immagine in movimento «poco o nulla è cambiato dalle origini ad oggi». Segni di questa tendenza si riscontrano persino nell’ambito della preservazione dei film. Gli archivi cinematografici attivi nella conservazione del muto, infatti, raramente accompagnano le loro collezioni con archivi paralleli destinati alla documentazione relativa alla musica. Esiste, bisogna riconoscere, la consapevolezza dell’importanza che i documenti musicali possono avere nelle operazioni di restauro e preservazione dei film. Esistono inoltre casi particolari di raccolte di musica per il muto gestite in sinergia con archivi di film, come le collezioni di musica per il muto conservate alla Library of Congress di Washington, DC, o al Museum of Modern Arts (MoMA) di New York, oppure la Eyl/Van Houten Collection presso il Nederlands Filmmuseum. Ma si tratta di eccezioni: e fino alla fine degli anni ’80 in effetti non esistevano significative raccolte di musica per il cinema muto al di fuori di quella del MoMA. Questo stato delle cose sembra in apparente contrasto con la necessità di una «ricerca storica coscienziosa» che Altman raccomanda parlando dell’approccio contemporaneo al muto. Infatti, allo stato attuale delle cose, una ricerca sul muto svolta in un singolo archivio rischia plausibilmente di essere molto carente sul versante delle pratiche sonore e musicali. Durante l’epoca del muto, i musicisti interagivano con i film restando accanto allo schermo, nell’ombra vicina alla luce del proiettore. È piuttosto ironico come oggi i discorsi sviluppati attorno alla loro musica siano nuovamente costretti in un’“ombra” – metaforica, stavolta – che sta ai confini della “luce” costituita dai moderni studi sul cinema muto, senza però poter ben interagire con essa. «È tempo», come ha scritto Altman, «di includere il suono nella rinascita storiografica del cinema muto». Un archivio della musica per il cinema muto dovrebbe porsi all’intersezione tra una biblioteca musicale ed una collezione di materiali legati alle arti performative. Le partiture scritte, durante l’epoca del muto, erano infatti una minoranza: la maggior parte della pratica musicale si fondava su cue sheet, compilazioni, repertori o improvvisazioni – che non possono aver lasciato alcuna traccia al di fuori di occasionali resoconti di membri del pubblico o degli stessi musicisti. In più, pratiche di sonorizzazione non musicali erano spesso concomitanti e complementari alle esecuzioni: esiste dunque una chiara urgenza di preservare anche qualsiasi tipo di documentazione parli di esse. In aggiunta a ciò, occorre ricordare che, almeno dalla presentazione del 1980 del Napoleon di Abel Gance prodotta da Thames Television, che ha mostrato il film ricostruito da Kevin Brownlow con una nuova musica di Carl Davis, il repertorio della musica per il muto ha cominciato a crescere di nuovo. Negli ultimi trent’anni, i luoghi dove i film muti vengono proiettati in maniera rispettosa di pratiche musicali storiche si sono moltiplicati, assieme alla produzione di partiture, cue sheet e improvvisazioni. Sembra ragionevole offrire a questa “nuova” tradizione di musica per il muto un posto accanto ai documenti che ne sono origine ed ispirazione. La mia tesi di dottorato utilizza queste considerazioni come premessa per ricostruire e studiare una collezione particolare e circoscritta di musica per il cinema muto: il repertorio di partiture eseguite al Festival internazionale Le Giornate del Cinema Muto, dal 1982 al 2010. L’accuratezza filologica dimostrata da tale Festival nella presentazione e nella divulgazione delle pratiche musicali del muto offre infatti una solida base per studi di questo genere. Inoltre, Le Giornate del Cinema Muto hanno già espresso, nel 2009, l’intenzione di fondare concretamente un archivio come quello sopra descritto, in seguito ad un suggerimento da me avanzato nel corso del XI Collegium di studi organizzato dalla manifestazione. La tesi è divisa in due parti. La prima include un capitolo introduttivo, dove vengono discussi problemi riguardanti la conservazione archivistica delle fonti musicali pertinenti alla musica per il muto; dopodiché, un primo capitolo tratta della storia della musica per il muto, scegliendo un approccio non lineare guidato dallo sviluppo delle pratiche musicali, e non da una consequenzialità cronologica; infine, la prima parte si conclude con un capitolo descrivente l’estetica della musica per il muto, nel quale si offre una rassegna della letteratura sull’argomento ed una descrizione delle strategie audiovisive utilizzate dai compositori. La seconda parte presenta il repertorio della musica che è stata eseguita a Le Giornate del Cinema Muto sulla base di partiture scritte. Si tratta di un elenco di 115 film, coprente la 29 edizioni del Festival e completo di informazioni filmografiche. Ogni scheda di film è accompagnata da una breve analisi delle principali strategie audiovisive. Le fonti di questa ricerca sono principalmente le registrazioni audiovisive delle proiezioni a Le Giornate del Cinema Muto conservate presso La Cineteca del Friuli, Gemona. Altri dettagli si sono ottenuti tramite conversazioni (di persona o tramite email) con alcuni degli autori delle musiche: Gillian B. Anderson, Neil Brand, Günter A. Buchwald, Philip Carli, Antonio Coppola, Berndt Heller, Stephen Horne, Maud Nelissen, Donald Sosin e Gabriel Thibaudeau.

Background: â-catenin is a central component of the cadherin cell adhesion complex but also it plays an essential role in the canonical-Wingless/Wnt signaling pathway. In vertebrates, one of the initial steps for the establishment of the correct dorso-ventral (D/V) pattern in the embryo is the cytoplasmic accumulation followed by nuclear localization of â-catenin in the cells of the prospective dorsal side of the embryo. In zebrafish there are two â-catenins, 92,7% identical. The mutant fish line Ichabod (ich), with a mutation in the region of the â-catenin2 promoter that causes a decrease in the maternal accumulation of â-catenin2 protein in the embryos, fail to nuclear localize â- catenins and to form a dorsal organizer, so the embryos become ventralized. Aims: Taking advantage of the zebrafish model and in particular of this fish line, we investigated the regulation of â-catenins nucleus-cytoplasm translocation and in particular why in ich â-catenin1 cannot compensate for the loss of â-catenin2. Materials and Methods: We analyzed by real-time PCR the levels of six genes involved in the canonical Wnt pathway: axin1 and axin2, pygopus1 and pygopus2, bcl9 and bcl9-2. Results: Unexpectedly, they are all up-regulated in ich embryos before and after mid-blastula-transition (MBT). Thus, ich embryos may have an overactive destruction complex, resulting in an increased degradation of â- catenin1. This is consistent with our finding that microinjection of a dominant negative Axin2 (it destroys the degradation complex) in ich embryo partially rescue ich phenotype. Conclusions: Our results confirm in vivo, previous in vitro work showing that the two zebrafish â-catenins C-terminal domain are important for the stability of the protein, probably because shielding it from the â-catenin destruction complex. This, results in higher stability of â-Catenin2 than â-Catenin1. These data are the first in vivo indication that differences in the â-catenins CTD result in different stability of these proteins

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2018.
El objetivo general de esta tesis doctoral consiste en diseñar, sintetizar y caracterizar a través de diversas técnicas, nuevos materiales que posean potenciales aplicaciones en dispositivos tecnológicos, con propiedades ferroeléctricas, magnéticas, multiferroicas y/o magnetorresistentes. Para obtener los materiales propuestos, se hizo uso de dos métodos de síntesis, siendo el más explorado el método cerámico tradicional. La síntesis fue lograda con éxito en la mayoría de los casos. Todos los materiales presentados en la tesis tienen estructura de tipo perovskita con fórmula ABO3, AA’BB’O6 o A2BB’O6, en donde B suele ser un catión de los metales de transición 3d; y B’ generalmente es un catión de los metales de transición 4d o 5d o un ion diamagnético del bloque p. Este tipo de estructuras han sido ampliamente estudiadas debido a que exhiben múltiples propiedades interesantes en aplicaciones tecnológicas. Los materiales obtenidos no han sido previamente informados en la literatura, generando un impacto positivo en la ciencia de materiales, lo cual es un aspecto fundamental del grupo de investigación al cual pertenezco. Estos nuevos compuestos obtenidos se describen en esta tesis de manera resumida de la siguiente forma:  La serie de perovskitas Ba1+xLa1-xMnSbO6 con 0,1 ≤ x ≤ 0,7, cuya síntesis fue realizada a través del método cerámico tradicional, fue caracterizada estructuralmente mediante las técnicas de difracción de rayos X de polvos y difracción de neutrones de polvos. Por medio de estas técnicas, se pudo determinar que las perovskitas dobles formadas poseen un grupo espacial I 2/m para pequeños valores de x, generándose una transición de fase, que pasa a una estructura tetragonal con grupo espacial I 4/m a partir de x = 0,3. A través de espectroscopía de emisión de rayos X, se determinó el estado de oxidación del Mn, observándose una mezcla de Mn2+ y Mn3+. Los cationes Mn2+/3+ y Sb5+ se distribuyen de manera altamente ordenada en los sitios octaédricos. Por otro lado, la caracterización magnética se realizó mediante medidas de magnetización vs. temperatura y vs. el campo magnético, lo que ha sido importante para poder entender y explicar el comportamiento magnético de cada una de las muestras, corroborando la existencia de nanoclusters magnéticos con supermomentos. Además, esta mezcla de estados de oxidación para el Mn le da ciertas características magnéticas notables al sistema. Es importante mencionar que al haber contado con estas técnicas para la caracterización de las perovskitas, se logró obtener una correlación más clara entre estructura y propiedades.  La familia de perovskitas CaLaBSbO6 con B = Mn, Co y Ni; obtenida a partir del método cerámico tradicional, fue caracterizada mediante DRXP, medidas magnéticas y espectroscopía de emisión de rayos X. Estos materiales cristalizan con el grupo espacial monoclínico P21/n y poseen una alta distorsión de la estructura a través del giro de los octaedros, los cuales poseen ángulos de giro grandes. De las medidas magnéticas, se observa un comportamiento complejo que es más notable para el caso de B = Mn, observándose distintos fenómenos como XIV fase de Griffith y superparamagnetismo, entre otros. Por medio de la caracterización espectroscópica, se pudieron determinar los estados de oxidación para el Mn y Co en cada uno de los compuestos.  La familia de perovskitas La2MnB’O6 con B’ = Zr, Ti; se obtuvo por vía seca y fue caracterizada estructuralmente por DRXP y DNP. Con esta última técnica se pudo definir el grupo espacial con el que cristaliza cada perovskita, siendo Pnma para B’ =Zr y P21/n para B’ = Ti. Además, a bajas temperaturas las estructuras magnéticas correspondientes son inconmensuradas, siendo el primer antecedente de este tipo de estructuras en el grupo de investigación de Nuevos Materiales del Departamento de Fisicoquímica de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Nacional de Córdoba, lo que permite incursionar en la formación y estudio de este tipo de estructuras, las cuales pueden inducir estados ferroeléctricos que consigan acoplarse más fuertemente al ordenamiento magnético en comparación con materiales multiferroicos convencionales. En el caso de la muestra con B’ = Zr, se realizaron las medidas magnéticas, observándose un comportamiento superparamagnético.
2020-12-31
Arciniegas Jaimes, Diana Marcela. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Carbonio, Raul Ernesto. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Fisicoquímica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Fisicoquímica de Córdoba; Argentina.
Bercoff, Paula Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Física Enrique Gaviola; Argentina.
Dassie, Sergio Alberto. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Fisicoquímica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Fisicoquímica de Córdoba; Argentina.
Reinaudi, Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Teórica y Computacional. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Fisicoquímica de Córdoba; Argentina.
Aurelio, Gabriela. Comisión Nacional de Energía Atómica. Gerencia de Área Investigación y Aplicaciones No Nucleares. Departamento de Haces de Nuetrones del RA10 - CAB; Argentina.