Littérature scientifique sur le sujet « ARN longs non-Codant »

Le cancer du sein représente à l’échelle mondiale le deuxième cancer le plus fréquent et la première des tumeurs malignes de la femme. Actuellement, seuls certains biomarqueurs (RO, RP, récepteur HER2, index Ki67) et la signature transcriptomique PAM50 sont pris en compte dans la classification morphologique et l’orientation thérapeutique. Les analyses transcriptomiques à haut débit ont révélé que plus de 80% du génome humain est transcrit en ARN. Parmi les ARNs non codants, les transcrits dont la longueur est supérieure à 200 nt sont arbitrairement qualifiés de longs ARNs non codants (lncRNAs). Les lncRNAs jouent un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie cellulaire et présentent des profils d’expression anormaux dans diverses pathologies, dont le cancer. L’objectif principal de mon projet de thèse a consisté à analyser l’expression des lncRNAs, leur fonctionnalité et leur rôle dans l’oncogénèse mammaire. La première partie s’est focalisée sur l’étude des gènes ANRIL (ainsi que 10 gènes de la même voie de signalisation) et MALAT1, deux lncRNAs dont les mécanismes d’action et la signification clinique au cours de la cancérogénèse mammaire sont encore controversés. ANRIL et MALAT1 sont respectivement surexprimés dans 20% et 14% des tumeurs de notre série, confirmant leurs rôles pro-oncogénique dans la cancérogénèse mammaire. La surexpression de MALAT1 se traduit en RNA-FISH par la présence de volumineux speckles intranucléaires. La complexité de leur dérégulation est liée à la présence d’isoformes et de réseaux d’interactions avec les mRNAs et les miRNAs. Concernant les sous-unités appartenant aux complexes Polycomb PRC2 et PRC1qui interagissent avec ANRIL, EZH2 (PRC2) est normalement ciblé par 3 miRNAs onco-suppresseurs (miR-26A1, miR-125B et miR-214) qui sont sous-exprimés dans notre série de CCIs. Les 2 oncomiRs miR-181B1 and miR-181A2 qui ciblent et inactivent CBX7 (PRC1), apparaissent surexprimés dans notre série, en relation avec l’activation de l’oncogène HMGA1. Concernant MALAT1, le complexe de biogénèse des miRNAs Drosha-DGCR8-Microprocesseur régule l’expression d’un variant d’épissage ∆-MALAT1 et ce dernier est impliqué dans l’activation de la voie PI3K/Akt. Des corrélations significatives sont observées entre MALAT1 et des gènes impliqués dans l’épissage alternatif, le cycle cellulaire, l’apoptose, la réparation de l’ADN et la migration cellulaire. Les profils transcriptomiques aberrants de ces 2 lncRNAs semblent caractéristiques des carcinomes mammaires. Ainsi, ANRIL (i) présente une association positive inattendue avec le cluster p16-CDKN2A/p15-CDKN2B/p14-ARF dans notre série, alors que cette association apparait négative dans les carcinomes de prostate et (ii) inactive épigénétiquement les miRNAs onco-suppresseurs miR-99a/miR-449a dans les carcinomes gastriques et non dans notre série de CCIs. D’un point de vue clinique, deux signatures pronostiques indépendantes ont pu être identifiées, l’une intégrant les 2 partenaires protéiques d’ANRIL appartenant aux complexes Polycomb (surexpression d’EZH2 / sous-expression de CBX7), et l’autre représentée par la sous-expression de Δ-MALAT1, observée dans 20% des tumeurs de notre série. La présence de variants d’épissage alternatifs, de réseaux d’interactions multiples et d’une spécificité d’organe devra être prise en compte lors de l’évaluation des thérapies épigénétiques ciblant ANRIL (inhibiteurs des bromodomaines et des oncoMIRs) ou MALAT1 (ASOs) dans les cancers du sein. La deuxième partie du projet de thèse a consisté en l’analyse du transcriptome non codant des carcinomes mammaires par une stratégie pangénomique, afin d’identifier de nouveaux types de lncRNAs, tels les nouveaux lncRNAs antisens, circulaires et associés à des séquences ultra-conservées ou induisant des résistances médicamenteuses
Breast cancer is the second most common cancer and the first malignancy of women. Currently, only few biomarkers (ER, PR, receptor HER2, index Ki67) and transcriptomic signature PAM50 are included in the morphological classification and therapeutic orientation. Transcriptome genome-wide analyses unexpectedly revealed that over 80% of the DNA is transcribed into RNA. Among these noncoding RNAs, transcripts longer than 200 nt are arbitrarily qualified as long noncoding RNAs (lncRNAs). LncRNAs play a crucial role in maintenance of cellular homeostasis and present abnormal expression patterns in various diseases, including cancer. The main objective of my project was to analyze expression of lncRNAs, their functionality and their roles in breast oncogenesis. The first part focused on the study of ANRIL and MALAT1 genes, two lncRNAs whose mechanisms of action and clinical significance in breast carcinogenesis are still controversial. ANRIL and MALAT1 respectively overexpressed in 20% and 14% of tumors in our series, confirming their pro-oncogenic roles in mammary carcinogenesis. MALAT1 overexpression results in RNA-FISH by presence of huge intranuclear speckles. Complexity of their deregulation is associated with presence of various isoforms and interaction networks with miRNAs, mRNAs and other lncRNAs. Concerning PRC2/PRC1 polycomb sub-units interacting with ANRIL, EZH2 (PRC2) is normally targeted by 3 onco-suppressor miRNAs (miR-26A1, miR-125B and miR-214) that are under-expressed in our series of CCIs. The 2 oncomiRs miR-181B1 and miR-181A2 that normally target and inactivate CBX7 (PRC1) appear overexpressed in our series of CCIs, resulting from activation of the oncogene HMGA1. Concerning MALAT1, the miRNAs biogenesis complex Drosha-DGCR8-Microprocessor regulates expression levels of the splicing variant Δ-MALAT1 and the latter is involved in activation of PI3K/Akt pathway. Significant correlations were observed between MALAT1 and genes involved in alternative splicing, cell cycle, apoptosis, DNA repair and migration. Aberrant transcriptomic profiles of these two lncRNAs seem characteristics of mammary carcinomas. Thus, ANRIL (i) presents an unexpected positive association with the p16-CDKN2A/p15-CDKN2B/p14-ARF cluster in our series of CCIs, whereas this association appears negative in prostate carcinomas and (ii) epigenetically inactivates onco-suppressor miRNAs miR99a/miR-449a in gastric carcinomas, but not in our series. From a clinic point of view, two independent prognostic signatures were identified, one incorporating two protein partners of ANRIL belonging to the polycomb complexes (EZH2 overexpression / CBX7 under-expression) and the other represented by under-expression of the variant Δ-MALAT1 observed in 20% of tumors in our series. The presence of alternative splice variants, multiple interactions with mRNAs and miRNAs and organ specificity should be considered when evaluating epigenetic antitumoral drugs designed to target ANRIL (bromodomains and oncoMIRs inhibitors) and MALAT1 (ASOs) in breast cancers. The second part of the project involved analysis of non-coding transcriptome of mammary carcinomas to identify new types of lncRNAs, including new antisens lncRNAs, circular lncRNAs, induced lncRNAs, noncoding ultraconserved transcripts and lncRNAs associated with resistance to systemic treatments. The preliminary analysis performed on a small cohort of breast cancers (n=8) will allow the implementation of the main (n=40) which will enhance robustness of identified signatures

Les cancers bronchopulmonaires non à petites cellules (CBNPC) sont la première cause de décès par cancer, les adénocarcinomes étant la forme la plus fréquente. Malgré une prise en charge précoce, ils constituent, par leur taux de récidive important et leur mauvais pronostic, un véritable problème de santé publique. Nous nous intéressons à l'hypoxie, un facteur agressivité des ADC, et à la famille des longs ARNs non codants (lncARNs), dérégulés dans de nombreux cancers et en réponse à l'hypoxie, mais peu caractérisés sur le plan structural et fonctionnel. Ces transcrits représentent un espoir pour le développement de nouvelles thérapies. Au cours de ma thèse, j'ai identifié une dizaine de lncARNs régulés par l'hypoxie in vitro et in vivo dans des ADC de stades précoces. j'ai caractérisé NLUCAT1, un transcrit nucléaire induit par l'hypoxie. L'invalidation de ce transcrit par le système CRISPR/Cas9 a révélé une diminution de la prolifération et de l'invasion cellulaires, et une augmentation du stress oxydatif et de la sensibilité au cisplatine, traduisant un potentiel rôle pro-oncogénique de ce transcrit dans les ADC. L'analyse du transcriptome a révélé une répression des réseaux de gènes contrôlés par NRF2, HIF et NFkβ dans les cellules déficientes pour NLUCAT1. Nous avons notamment identifié des gènes de la réponse anti-oxydante régulés par NRF2 dont l'ARN interférence mime en partie les conséquences de l'inactivation de NLUCAT1 sur l'apoptose. Nos résultats démontrent que NLUCAT1 exerce des activités pro-tumorales dans les ADC et suggère qu'il pourrait représenter une cible thérapeutique potentielle dans ce type de cancer
Non Small Cell Lung Cancer (NSCLC) is the leading cause of cancer death worldwide, with poor prognosis and a high rate of recurrence despite early surgical removal. It is therefore essential to identify new prognostic markers and new therapeutic targets. We are interested in gene regulation related to hypoxia, a factor associated with relapse of lung adenocarcinomas (LUAD). The roles of long non coding RNAs (incRNAs) in cancer development and hypoxic response are largely unexplored. A transcriptome profiling of early-stage LUAD samples indicated that a set of incRNAs was correlated to a metagene hypoxic signature. Some of these transcripts were also sensitive to hypoxia in LUAD cell lines. We focused on a new "hypoxaLinc", named NLUCAT1 that is strongly up-regulated by hypoxia in vitro and correlated to hypoxic markers and bad prognosis in LUAD samples. Full molecular charactherization of NLUCAT1 showed that LUCAT1 is mainly regulated by NF-kβ and NRF2 transcription factors. Targered deletion of NLUCAT using CRISPR/CAS9 in A549 LUAD cell line, revelated a decrase in proliferative and invasive properties, an increase in oxidative stress and a higher sensisivity to displatin-induced apoptosis. We identified genes of the NRF2-regulated and anti-oxidant response whose RNA interference partially mimicked the consequences of NLUCAT1 inactivation on ROS-dependent caspase activation. Overall, our data strongly demonstrate that NLUCAT1 exerts pro-tumoral activities in early stages hypoxic LUADs ans suggest it could represent a new potential therapeutic target in lung cancer

Seul 1,2% du génome code des protéines :98,8% est non-codant,cependant 93% du génome est transcrit, principalement en longs ARN non-codants (lncRNA). Or ces lncRNA constituent une nouvelle classe de régulateurs génomique agissant à tous les niveaux d’expression des gènes et ils sont fortement spécifiques du tissu,modulés au cours du temps et en conditions physiopathologiques.Ainsi,nous proposons que chaque cellule spécifiée exprime son répertoire de lncRNA spécifique avec une carte des zones de chromatines ouvertes renseignant son identité cellulaire.Dans cette perspective,nous avons isolé par FACS 2types cellulaires impliqués dans des pathologies: i) des neurones dopaminergiques humains(nDA) différenciés à partir d’hiPS et ii) des neurones DA et sérotoninergiques (n5-HT)murins.Sur ces 2types neuraux isolés,nous avons identifié 1363 lncRNA exprimés dans les nDA (dont 989nouveaux) constituant le répertoire des neurones DA et 1257 lncRNA dans les n5-HT (719nouveaux) constituant le répertoire des n5-HT.Or leur comparaison a montré que seuls 194 lncRNA sont communs aux 2types cellulaires:la majorité des lncRNA est exprimée soit dans les nDA soit dans les n5-HT,attestant leur spécificité cellulaire.De plus,39%des zones de chromatines ouvertes/potentiellement régulatrices des nDA ne sont pas non plus retrouvées dans les n5-HT.Ainsi, nous avons généré un catalogue d’éléments non codants constituant des signatures moléculaires spécifiques des nDA et n5-HT,ouvrant de nouvelles pistes physiopathologiques:Dans cette optique,les signatures non codantes DA ont été comparées avec les SNP associés à la maladie de Parkinson et des études de fonction sur des lncRNA candidats ont été réalisées
Only 1.2% of the genome codes for proteins; 98.8% is thus non-coding, despite 93% of the human genome being actively transcribed, mostly in long non-coding RNA (lncRNA).These lncRNA constitute a new class of genomic regulator capable of acting at all levels of gene expression and their expression is highly tissue-specific,modulated during the time and under normal/pathological conditions.Thus, we propose that each specified cell expresses a specific repertoire of lncRNA correlated to open/active chromatin regions specifying its cellular identity.In this context, we isolated by FACS 2neural types involved in many pathologies: i) human dopaminergic neurons (nDA) differentiated from hiPS and ii) DA and serotoninergic (n5-HT) neurons. From these 2neural types, we identified 1,363 lncRNA in nDA (among which 989 new, whether 73%) constituting the repertoire of nDA, and 1,257 lncRNA (among which 719 new) constituting the repertoire of n5-HT. Moreover,their comparison has shown that only 194 lncRNA are common to both neural types:thus the majority of lncRNA is expressed either in nDA or in n5-HT, indicating a high degree of cell-specificity.In addition, 39% of open chromatin regions, potentially regulatory, were also not detected in the n5-HT.Thus, we have generated DA and 5-HT specific catalogues of non-coding elements of the genome, which constitute DA and 5-HT specific molecular signatures, that could participate in deepening our knowledge regarding nDA or n5-HT development and dysfunctions. With this in mind,these DA specific elements have been compared with the SNP described as Parkinson Disease risk variants and candidate lncRNA were selected to perform studies of function

Les cancers broncho-pulmonaires non à petites cellules, et plus particulièrement les adénocarcinomes (ADC), constituent la première cause de mortalité due au cancer dans les pays développés. Malgré des prises en charge précoces, leur fort taux de récidive, nécessite l'identification de nouveaux marqueurs pronostics et de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans cette optique, nous nous intéressons à l'hypoxie, un facteur d’agressivité tumoral, et à la famille émergente des longs ARNs non codants qui régulent l’expression génique par le biais de complexes ribonucléoprotéiques. Des analyses transcriptomiques de cohortes de patients d’ADC pulmonaires ont permis l’identification d'une quarantaine de longs ARNs non codants (lncARN) corrélés au statut hypoxique des tumeurs et/ou à un mauvais pronostic vital. Nous nous sommes focalisés sur deux candidats, NLUCAT1 et LINC01116, induits par l'hypoxie et associés à une diminution de la survie des patients. NLUCAT1 est un transcrit nucléaire de 9800 nt dont l’invalidation par le système CRISPR/Cas9 réduit les propriétés prolifératives et invasives des cellules et augmente la production de RLO et l'apoptose induite par le cisplatine ou un stress oxydatif. L’analyse comparative des transcriptomes de cellules invalidées ou non pour NLUCAT1 a révélé son implication dans la régulation du stress oxydatif via un rétrocontrôle positif sur des gènes de la réponse anti-oxydante. Par ailleurs, LINC01116 est cytosolique et exprimé conjointement dans les cellules cancéreuses et dans les cellules endothéliales du microenvironnement tumoral. J'ai montré que des siARNs réduisent l'adhésion et augmentent la perméabilité trans-endothéliale suggérant des défauts au niveau des contacts intercellulaires. J'ai ensuite entrepris l'étude du mode d'action de LINC01116 par l'identification de ses partenaires protéiques. Des expériences de "RNA pulldown" couplées à de la spectrométrie de masse ont permis d’identifier les protéines ILF3 et PABPC1. Ces interactions ont été validées par des expériences inverses d'immunoprécipitation d'ARN (RIP). L’implication de ces protéines dans le mode d’action de LINC01116 nécessite des études complémentaires.L’ensemble des résultats collectés durant ma thèse ont mis en évidence l’action pro-tumorale du transcrit NLUCAT1 dans les ADC et l'implication de LINC01116 dans la modification du microenvironnement vasculaire tumoral. Ces transcrits, associés à un mauvais pronostic des ADC, pourraient représenter des cibles thérapeutiques potentielles pour la prise en charge des patients
Lung cancers, and notably Lung Adenocarcinomas (LUAD) are the leading cause of cancer death worldwide. Their high rate of recurrence despite early, requires new prognostic markers and new therapeutic targets. The combined study of local cohort (CHU of Nice) and large scale (TCGA) transcriptomes of LUAD allowed the identification of a shortlist of 28 long non-coding RNAs (lncRNA) correlated with hypoxia, a factor of tumor aggressiveness, and a poor prognosis. LncRNAs are transcripts that modulate gene expression through the recruitment of proteins and/or nucleic acids and represent an interesting source of new therapeutic targets. Two lncRNAs candidate were selected and molecular characterization was undertaken by sequencing, RT-PCR and smRNA FISH and concern the nuclear lncRNA NLUCAT1 of 9,8kb and the cytosolic lncRNA LINC01116 of 1,2kb. Experiments with loss of function via CRISPR/Cas9 systems, interference RNA and gain of function allowed to characterize the function of these transcripts. Invalidation of NLUCAT1 by CRISPR/Cas9 reduces proliferation, migration, invasion and increases cisplatin sensitivity and ROS production. Bioinformatic analysis of transcriptomes from cells invalidated or not for NLUCAT1 has demonstrated its involvement in the mechanisms of regulation of oxidative stress via a positive feedback from the NRF2 antioxidant pathway. On the other hand, lncRNA LINC01116 is mainly expressed in endothelial cells of the tumor microenvironment and its inhibition by interfering RNA reduces the adhesion capacities and increases the permeability of the endothelium. Mechanistic characterization was perform for LINC01116 via RNA pulldown-MS co-precipitation experiments and idenfied a list of potential partner proteins. The proteins of RNA metabolism and stability, ILF3 and PABPC1 were identified and their interactions with LINC01116 were validated by RNA immunoprecipitation (RIP). Overall, during my thesis, I determine the pro-tumoral action of the NLUCAT1 in LUAD and the involvement of LINC01116 in the modification of the tumor microenvironment. These two transcripts could represent potential therapeutic targets in the management of lung cancer

Les longs ARN non codants (lncRNAs) sont définis comme des transcrits de plus de 200nt et n'ayant pas de potentiel codant. Des études récentes ont démontré que les lncRNAs pouvaient être impliqués dans la régulation de la transcription, de la traduction, de la différenciation cellulaire, de l'expression génique, du cycle cellulaire et des modifications de la chromatine. De plus, il a été montré un impact fonctionnel de certains lncRNAs dans le processus de cancérogenèse mais nos connaissances actuelles sur ces molécules dans le cancer, et plus particulièrement dans la leucémie, restent extrêmement limitées. Au cours de cette étude, nous avons analysé l'expression des lncRNAs par RNA-sequencing sur 40 patients atteints de leucémie aiguë myéloblastique (LAM) à caryotype normal. Parmi les 11065 lncRNAs exprimés dans nos échantillons, nous avons identifié une signature de lncRNAs associée à la mutation de NPM1. Afin de mettre en évidence les fonctions putatives des lncRNAs sélectionnés, nous avons utilisé un algorithme de prédiction d'interaction protéine/ARN. De manière intéressante, plus de la moitié des lncRNAs présentent des sites d'interactions potentiels à SUZ12, une sous unité du complexe PRC2 (Polycomb repressive complex 2), connu pour être recruté par des lncRNAs pour la régulation épigénétique de gènes cibles. Par RNA immunoprécipitation (RIP) de SUZ12, nous avons pu démontrer que le lncRNA XLOC_087120 interagissait avec SUZ12. De plus, son expression est anti-corrélée avec celle des gènes voisins codants des histones, suggérant un rôle dans la régulation négative des histones par ce lncRNA. L'impact de la dérégulation de XLOC_087120 sur les histones a été confirmé par des expériences de surexpression et d'inhibition de ce lncRNA dans des lignées de LAM. De plus, même si la mutation NPM1 ne semble pas affecter directement l'expression de ce lncRNA, des expériences d'infection de la forme mutée de NPM1 dans une lignée LAM ont montré que NPM1 pourrait réguler la localisation nucléaire/cytoplasmique de XLOC_087120 et moduler sa fonction de répresseur. En conclusion, ces données suggèrent que les lncRNAs sont des facteurs clés dans la pathogenèse des LAMs
Long noncoding RNAs (lncRNAs) are defined as RNA transcripts that are larger than 200 nt but do not appear to have protein- coding potential. Recent studies have demonstrated that lncRNAs regulate many processes such as transcription, translation, cellular differentiation, gene expression regulation, cell cycle regulation, and chromatin modification. Cumulative evidence points towards an important role of lncRNAs in cancer initiation, development, and progression. However, our overall knowledge of lncRNAs in cancer, including leukemia, remains extremely limited. In this study, we investigated lncRNA expression by RNA-sequencing in 40 acute myeloid leukemia (AML) patients with normal karyotype. Among 11065 lncRNA expressed in our samples, we identified specific lncRNA signature associated with the presence of NPM1 mutation. To go further into the putative function of these lncRNAs, we used catRAPID Omics algorithm to predict potential protein partners. Interestingly, the majority of the selected lncRNAs contains putative SUZ12 binding sites, a PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) component known to be linked to lncRNAs and to epigenetically regulates target genes. By using SUZ12 RNA Immunoprecipitation, we identify one lncRNA named XLOC_087120 linked to SUZ12. XLOC_087120 is located in a region enriched in histone genes. Pearson correlation showed a significative anti-correlation between XLOC_087120 and histone neighboring coding gene expression suggesting a role of this lncRNA in the regulation of histone genes. The impact on histone genes expression was confirmed by overexpression and inhibition of XLOC_087120 in AML cell lines. Overexpression of NPM1 mutant in an AML cell line showed that NPM1 modulates the nuclear/cytoplasmic localization of XLOC_087120 and consequently its repressive function. Altogether, these data suggest that lncRNAs should be considered as key players in the pathogenesis of acute myeloid leukemias

Les applications des cellules souches pluripotentes humaines (CSP) dans le domaine biomédical sont particulièrement prometteuses, aussi bien au niveau expérimental qu’au niveau clinique. Leur utilisation comme source inépuisable de cellules permettant de tester et développer de nouvelles molécules thérapeutiques (notamment par modélisation de pathologies in vitro, criblage haut-débit et tests de cytotoxicité) s’ajoute à l’important potentiel qu’elles présentent en médecine régénérative et en thérapie cellulaire. Utilisables comme matériel biologique permettant de restaurer partiellement ou totalement un organe ou un tissu défaillant, il reste essentiel de vérifier l’intégrité génétique des lignées cellulaires utilisées afin de garantir une utilisation sécurisée pour le patient. Parmi les facteurs responsables de l’apparition d’anomalies génétiques chez les CSP, les conditions cultures jouent un rôle essentiel. Des techniques de culture inadaptées peuvent facilement provoquer l’émergence d’une instabilité génomique. Toute altération doit être détectée et documentée afin de pouvoir définir des critères d’acceptation préalable à leur utilisation clinique.Les CSP sont des cellules particulièrement sensibles au stress qui peut résulter de techniques de repiquage inappropriées. La dérive génétique qui découle de ce stress peut être précoce et apparaître dès les premiers passages des lignées cultivées. Notre équipe a pu tester de nombreuses méthodes de repiquage sur différentes lignées cellulaires pluripotentes. Nous avons notamment observé que des anomalies génétiques majeures caryotypiques (trisomies) et infra-caryotypiques (SNPs) ainsi que des changements phénotypiques (survie augmentée, acquisition de mobilité) apparaissaient rapidement suite à l’utilisation de techniques de repiquage basées sur l’utilisation d’enzyme de dissociation (TryPLE). Ces altérations apparaissent dans des lignées qui s’adaptent progressivement à la dissociation en cellules uniques (dissociation « single-cell ») provoquées par ces enzymes.Notre équipe étudie les conséquences cellulaires liées à ce phénomène d’adaptation des CSP provoquée par la dissociation « single-cell ». Grâce à des techniques de séquençage dernière génération (RNA-Seq), nous avons comparé les profils transcriptomiques de CSP repiquées par des techniques standard (comme le passage mécanique) et par des techniques basées sur la dissociation « single-cell » (comme le passage enzymatique par TryPLE). Cette comparaison a montré au niveau transcriptionnel une surexpression spectaculaire d’ARNs non codants appartenant à une classe récemment décrite : les longs ARNs non codants (lncRNAs).L’objectif principal de ce travail de thèse a été d’évaluer le niveau d’implication de ces lncRNAs dans le processus d’adaptation des CSP en culture, et leur rôle fonctionnel potentiel. Nous avons ainsi dans un premier temps déterminé in silico quels lncRNAs étaient différentiellement exprimés dans les CSP adaptées, et après validation expérimentale par biologie moléculaire des candidats les plus prometteurs, nous avons utilisé des tests fonctionnels (notamment par RNA interférence (siRNA)) afin de déterminer le rôle de ces lncRNAs dans la machinerie cellulaire et la pluripotence des CSP. Autour de ce projet principal, nous avons essayé de comprendre les mécanismes régissant les changements phénotypiques et comportementaux provoquées par la dissociation « single-cell ». Nous avons notamment pu suggérer la mise en place d’un phénomène de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) chez des CSP dissociées. Enfin, l’attractivité que représente un sujet d’étude récent comme les lncRNAs et la disponibilité croissante de publications les concernant nous ont poussé à publier une revue approfondie ainsi qu’une méta-analyse sur l’implication des longs ARN non codants dans le développement précoce de l’embryon et dans les cellules souches pluripotentes
The actual and future applications of human pluripotent stem cells (PSC) in the biomedical field are highly promising. Their use for the discovery of new therapeutic drugs through the development of high-throughput screening tests, cytotoxicity tests and in vitro disease modeling has been added to their tremendous interests in regenerative medicine and cellular therapy. As a source of biological material that can be used to restore partially or totally the lost functions of a damaged organ or tissue, or as a source of normal cells to study human development or test putative new drugs, their genomic integrity has to be thoroughly assessed. Therefore, an effective optimization of their culture conditions has to be considered, in order to control the absence of genomic instability and prevent their potential emergence. Any genetic or epigenetic alteration resulting from cell culturing must be detected in order to define and characterize acceptance criteria for scientific and medical purposes.PSC are particularly sensitive to stress resulting from unappropriated passaging techniques, which cause rapid genetic drift. Indeed, our team observed that many genomic abnormalities arise from aggressive single cell, enzymatic based, passaging methods, and that substantial phenotypical changes such as increased survival after cell dissociation and variation in cell shape can then occur.In order to understand the mechanisms governing the emergence of those adverse alterations, the team focused on the consequences resulting from the adaptation of PSC to single-cell dissociation. By using new generation sequencing techniques as RNA-Seq, we compared transcriptomics of PSC passaged by standard techniques (such as mechanical passaging) versus single-cell enzymatic dissociation (such as TRyPLE-based single-cell passaging). This comparison showed that the most striking difference in the gene expression pattern between adapted and non adapted cells concerned the dramatic overexpression of RNAs from a recently discovered class: long non-coding RNAs (lncRNAs).The aim of this thesis work was to determine to which extent some of these lncRNAs were functionally linked to adaptation of PSC. In order to address this matter, we first investigated in silico which lncRNAs were upregulated by single-cell dissociation, and after experimental validation of lncRNA candidates by molecular biology, we performed functional in vitro analysis (notably by siRNA-mediated loss of function) and sought their cellular localization in order to decipher their role in the cellular machinery and their level of implication. Beside this main project, other auxiliary projects were grafted. The observation of major changes in cell phenotype and behavior led to the investigation of the global mechanisms governing these modifications, underlining the potential role of epithelial-to-mesenchymal transition provoked by single-cell dissociation. Finally, the global attractiveness of lncRNAs and the emergence of exponential documentation concerning non-coding RNAs prompted the writing of an extensive review and meta-analysis concerning the implications of lncRNAs during embryo development and in pluripotent stem cells

Le développement du séquençage ARN, ou RNAseq, a permis l'essor de la recherche intensive de biomarqueurs dans de nombreux domaines de la biologie. L’information complète du transcriptome contenue dans les données de sorties, permet à un bioinformaticien assidu de dépasser les connaissances actuelles et d’accéder, grâce à des pipelines informatiques avancés, à d’innombrables signatures d’intérêts inédites. Dans cette thèse nous mettons en avant que ces marqueurs potentiels, essentiellement explorés pour répondre à des problématiques clinique en conditions pathologiques, peuvent être utilisés pour affiner la caractérisation de types de cellules sans marqueurs strictement spécifiques. Nous nous sommes intéressés aux cellules souches mésenchymateuses (MSCs), un type de cellules souches adultes multipotentes, fortement utilisées en clinique mais ne possédant pas de marqueurs positifs strictement spécifiques.Notre étude se concentre sur la recherche des ARN longs non-codants non annotés. Ces ARNs, aussi nommés "lncRNA", constituent une classe émergente de transcrits encore peu explorée à ce jour. De plus, cette catégorie démontre une spécificité conditionnelle et tissulaire élevée. Nous avons élaboré un pipeline d’analyse RNAseq optimisé pour la reconstruction et la quantification de lncRNAs non annotés.En utilisant les données publiques de RNAseq, venant de différentes sources de MSCs et d'autres types de cellules, nous avons identifié de nouveaux lncRNA non annotés exprimés spécifiquement dans les MSCs.Nous avons développé pour ce projet Kmerator.jl, un outil qui permet de décomposer un transcrit en sous séquences spécifiques (k-mers) afin de chercher et quantifier plus rapidement la signature de nos candidats dans un grand nombre de données RNAseq. Kmerator a également été utilisé dans d'autres applications pour tester la qualité des données RNA-seq disponibles en accés public.Après validation de ces nouveaux biomarqueurs de MSCs par qPCR, nous avons eu recours à plusieurs outils informatiques pour prédire leurs fonctions potentielles. Enfin, nous avons analysé des données RNAseq « single-cell » pour aborder l’hétérogénéité d’expression au sein des populations MSCs
The development of RNA sequencing, or RNAseq, have opened the path of intensive biomarkers research in many areas of biology. The complete information of the transcriptome contained in the output data, allows a bioinformatician to surpass the current knowledge and to access, thanks to advanced computer pipelines, to signatures of new interest. In this thesis, we are showing that these potential markers, classically used in clinical and pathological conditions, can be used to characterize cell types without extensive markers profile. We have studied mesenchymal stem cells, a type of adult multipotent stem cells, strongly used in clinics but without strickly specific positive markers. Our study mainly focuses on the search for non-annotated, long non-coding RNAs. These RNAs, also called "lncRNA", constitute an emerging class of transcripts and are still lightly explored.In addition, this category presents a highly tissue-related specificity. We have developed an optimized RNAseq pipeline for the reconstruction and quantification of non-annotated lncRNAs.Using public data from RNAseq, coming from different sources of MSC and other cell types, we have identified new non-annotated lncRNAs clearly and specifically expressed in MSCs. to complete this project, we developed Kmerator.jl, a bioinformatical tool that allows to decompose a transcript in k-mer, and select specific sub-sequences, in order to search and quantify at a faster rate the signature of our candidates in a large number of RNAseq dataset. After validation of these new biomarkers of MSCs by qPCR, we used several computer tools to predict their potential functions. Finally, we analyzed single-cell RNAseq data to address the heterogeneity of expression within MSC populations

Topaz1 (pour Testis and Ovary specific PAZ domain gene 1) est un gène très conservé chez les vertébrés qui présente une expression spécifique dans les cellules germinales. La caractérisation du modèle murin dépourvu du gène Topaz1 a mis en évidence son rôle indispensable pour la fertilité mâle. Les souris mutantes présentent un arrêt de la spermatogenèse lors de la première division méiotique. Les spermatocytes Topaz1-/- bloqués en fin de prophase I de méiose présentent un défaut d’alignement des chromosomes le long de la plaque métaphasique. D'un point de vue histologique, les différences observées entre les testicules de souris Topaz1-/- et Topaz1+/+ apparaissent entre 15 (P15) et 20 (P20) jours après la naissance. Une première analyse transcriptomique par puce à ADN a montré que 10% des gènes dérégulés (DEGs) à P20 sont des ARN non codants longs (lncRNAs). Au cours de cette thèse, des analyses transcriptomiques à haut débit (RNAseq) ont été réalisées à P16 et P18 afin de mieux caractériser le phénotype testiculaire des souris dépourvues du gène Topaz1. Dès P16, le transcriptome testiculaire est perturbé et le nombre de DEGs est multiplié par 10 à P18. Des gènes associés au centrosome, centriole, à la dynamique des microtubules et à la spermatogenèse appartiennent aux voies moléculaires les plus perturbées. De plus, un quart des DEGs sont des lncRNAs. Trois d'entre eux, dérégulés à P16 et à P18, ont été étudiés par hybridation in situ et biologie moléculaire et sont spécifiques des cellules germinales. Puis une lignée de souris exempt d'un de ces lncRNA a été générée grâce à la technologie CripsR/Cas9. Ces animaux mutants se développent normalement et sont fertiles pour les deux sexes.Néanmoins, les souris mâles mutantes présentent une diminution de plus de 50% de la concentration de spermatozoïdes épipidymaires ainsi qu’une modification de paramètres de motilité par rapport à des souris sauvages. Des nouvelles analyses RNAseq ont été réalisées afin d'étudier le transcriptome testiculaire de ces souris. Elles mettent en évidence que ce lncRNA régule un nombre important de gènes codants pour les protéines (environ 80% des DEGs à P18). Là encore, certains d'entre eux régulent la dynamique des microtubules, la spermatogenèse et la génération des gamètes haploïdes.En conclusion, le gène Topaz1 murin est donc essentiel pour la mise en place d’un fuseau bipolaire en fin de prophase I de méiose et son absence empêche la première division méiotique. La dérégulation d’un nombre important de gènes codants pour des protéines du centrosome, des microtubules et de la spermatogenèse ainsi que la forte répression de l'expression de lncRNAs au sein du testicule murin laisse à penser que des complexes ARNs-protéines se forment au cours de la méiose.Dans cette étude, la suppression d'un de ces lncRNA ne perturbe pas la fertilité des souris bien que la concentration spermatique soit réduire de moitié. Chez l'homme, une telle baisse pourrait conduire à des infertilités masculines. Une mutation du gène Topaz1 chez l'homme pourrait aussi induire une azoospermie non obstructive. L'étude des complexes ARN-protéines pourrait représenter un nouveau champ d’investigation dans l’étude des infertilités et notamment de la régulation de la méiose
Topaz1 (Testis and Ovary specific PAZ domain gene 1), a germ cell specific factor, is a highly conserved gene in vertebrates. The study of the Topaz1-inactivation mouse model demonstrated its essential role for male fertility. The absence of Topaz1 in mutant mice caused spermatogenesis arrest during the first meiotic division. Topaz1-/- spermatocytes, blocked at the end of meiotic prophase I, showed chromosome misalignment along the metaphase I plate. Histological experiments specified that the differences observed between Topaz1-/- and Topaz1+/+ mouse testes appeared between 15 (P15) and 20 (P20) days post-partum. Previously, transcriptomic analyses using a whole-genome expression array indicated that 10% of P20-deregulated genes (DEGs) were long non-coding RNAs (lncRNAs). During this thesis, high throughput transcriptomic analyses (RNAseq) were performed at P16 and P18 in order to better characterise the testicular phenotype of mice lacking the Topaz1 gene. From P16, the testicular transcriptome was disturbed and the DEGs number was multiplied by 10 at P18. Genes associated with centrosome, centriole, microtubule dynamics and spermatogenesis belonged to the most disturbed molecular pathways. Moreover, a quarter of DEGs were lncRNAs. Three of them, deregulated at P16 and P18, were studied by in situ hybridization and molecular biology techniques. They were germ cell specific. Thus, a new mouse model deleted for one of these lncRNAs was generated using CRISPR/Cas9 technology. These mutant mice developed normally and were fertile in both sexes. However, mutant male mice presented a more than 50% decrease in the epididymal sperm concentration as well as a change in motility parameters compared to wild-type mice. New RNAseq analyses were realised to study testicular transcriptome of these mice. These showed that this lncRNA regulates a large number of protein-coding genes (approximately 80% of the DEGs at P18). There again, some of them regulated microtubule dynamics, spermatogenesis and haploid gamete generation.In conclusion, this work shows that the murine Topaz1 gene is therefore essential for the establishment of the bipolar spindle during the transition from late prophase I to metaphase I and its absence prevents the first meiotic division. The deregulation of a significant number of protein-coding genes of the centrosome, microtubule movements and spermatogenesis, as well as the strong repression of lncRNAs expression within mouse testis, suggests that RNAs-proteins complexes are formed during meiosis.In this study, deletion of one of these lncRNA did not affect fertility in mice even though sperm concentration was halved. In men, such a decrease could lead to male infertility. A mutation of the Topaz1 gene in men could also induce non-obstructive azoospermia. The study of RNAs-proteins complexes could represent a new field of investigation in the understanding of infertility, particularly in meiotic regulation

Les cancers du sein triple négatifs (CSTN) sont un sous-type hétérogène représentant 12% à 24% de tous les cancers du sein. Ils ont les plus mauvais pronostics et touchent souvent les femmes jeunes. Le traitement au stade localisé repose essentiellement sur la chimiothérapie, sans thérapie ciblée (hors cas de mutations germinales de BRCA). Quasiment toutes les patientes reçoivent la même chimiothérapie néoadjuvante (CNA) avec anthracyclines et taxanes, ce qui grève leur survie en l’absence de réponse complète pathologique (RCp). L’intensification thérapeutique est la tendance actuelle, notamment avec l’addition d’immunothérapie, afin d’améliorer taux de RCp et survie. Les signatures d’expression génique standard ne pas utilisables en pratique clinique pour prédire la chimiorésistance des CSTNs à la CNA, alors qu’elles permettraient de sélectionner les patientes pour une intensification thérapeutique. D’où l’intérêt d’explorer les transcrits issus des 90% du génome restant, constitué de régions non codantes et non référencées. Parmi eux, les ARNs longs non-codant (lnc) qui se caractérisent par une longueur d’au moins 200 nucléotides présentent l’intérêt pour certains d’entre eux d’avoir une expression tissu- voire cancer- spécifique. De plus, certains ARNs lnc ont un rôle démontré dans différents mécanismes de chimiorésistance. Les ARNs lnc ne sont cependant pas bien annotés dans le génome humain et de nouveaux transcrits non référencés, codant ou non, et de nouvelles isoformes de gènes connus, sont découverts quotidiennement.Mon 1er objectif de thèse était d’évaluer le transcriptome non référencé en tant que réservoir potentiel de biomarqueurs prédictifs de chimiorésistance des CSTN à la CNA. Nous avons analysé une cohorte de 78 CSTNs avant CNA, et comparé les cas chimiosensibles (chS) et chimiorésistants (chR) selon le score RCB (Residual Cancer Burden). Nous avons comparé l’analyse d’expression génique différentielle standard (DE-seq) sur les gènes annotés, et sur de nouveaux ARNs lnc détectés grâce à un profiler ARN, et une analyse non biaisée par les annotations génomiques, de fragments de transcrits différentiels. L’analyse non biaisée a permis d’obtenir la meilleure séparation des cas chS et chR dans notre cohorte exploratoire. Nous avons ensuite évalué cette approche sur une cohorte indépendante, et nous l’avons optimisée, en considérant les régions génomiques d’expression différentielle. Ceci nous a permis d’obtenir une signature reproductible entre les deux cohortes. Au total, ces résultats montrent le potentiel d’une approche non référencée pour générer une signature de chimiorésistance précoce des CSTN. Des validations supplémentaires sont nécessaires sur des cohortes plus larges.Mon 2nd objectif de thèse était d’évaluer les ARNs lnc en tant que potentiels acteurs/cibles thérapeutiques dans les CSTNs chR. Nous avons sélectionné les ARNs lnc surexprimés dans les CSTNs chR pre-CNA (versus les CSTNs chS pre-CNA) et dans les CSTNs chR post-CNA (versus les CSTNs chR pre-CNA). En intégrant leurs niveaux et spécificités d’expression, leurs localisations génomiques et les données préexistantes suggérant une fonction potentielle, nous avons retenu trois ARNs lnc (AL450326.1, LINC02609 et MIR503HG). Nous avons évalué l’impact de l’inactivation de leur expression sur la cytotoxicité du Docetaxel dans un modèle de lignée cellulaire de CSTN. L’inactivation de l’expression de chacun des trois ARNs lnc a induit une cytotoxicité accrue du Docetaxel. Une clonogénicité spontanée diminuée et une mort cellulaire accrue sous Docetaxel ont de plus été observées après la déplétion d’AL450326.1 et de LINC02609. Au total, nous avons identifié trois ARNs lnc jouant un rôle dans la chimiorésistance des CSTN. Des tests fonctionnels supplémentaires sont nécessaires pour en décrypter les mécanismes, avec pour objectif à long terme d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques contrant la chimiorésistance des CSTNs à la CNA
Triple-negative breast cancers (TNBC) represent a heterogeneous subtype of breast cancers including 12% to 24% of all cases, having the poorest prognoses and often affecting young women. Treatment at localized stage is mainly based on chemotherapy, with no targeted therapy (except germline BRCA mutated patients). Nearly all patients receive the same Neo-Adjuvant Chemotherapy (NAC) with anthracyclines and taxanes, that badly impacts survival in the absence of pathological complete response (pCR). Therapeutic intensification, notably with addition of immunotherapy, is the current trend to increase pCR rate and improve survival. Standard gene expression signatures have failed to provide effective tools to predict TNBC chemoresistance, probably due to their incomplete nature, as they are mostly based on expression of protein coding genes and/or referenced transcripts and up to date there is no clinically useful transcriptomic signature predicting TNBC chemoresistance to NAC. Such a predictive signature would allow patient selection for therapeutic intensification. Therefore, it is important to explore the remaining 90% of the genome consisting of non-coding and non-referenced regions. One class of non-coding RNAs that is of great interest are long non-coding (lnc) RNAs, that are at least 200 nucleotides long, some of them being specifically expressed in cancer. Moreover, some lncRNAs have been shown to be implicated in different mechanisms of chemoresistance. LncRNAs are not fully well annotated in the human genome and new unreferenced transcripts, coding or not, and new isoforms of known genes are discovered daily.Therefore, the first goal of my PhD was to assess reference-free transcriptome as a potential reservoir of predictive biomarkers of TNBC chemoresistance. A cohort of 78 TNBCs before NAC was analyzed, comparing chemosensitive (chS) and chemoresistant (chR) cases based on international Residual Cancer Burden (RCB) score. A standard differential gene expression analysis (DE-seq) on annotated genes, and on new lncRNAs detected with a de novo RNA-profiler, and a reference-free analysis of differential fragments of transcripts without annotation bias were compared. Reference-free approach showed best separation of chS and chR patients in the training cohort. Further, based on comparison with an independent validation cohort, an optimized approach was proposed, where specific genomic regions with differential expression were selected. This technique gave a reproducible signature of chemoresistance between the two cohorts. In all, these results show the potential of a reference-free approach to generate a transcriptomic signature as predictive biomarker of early TNBC chemoresistance. Further investigation is needed to validate the signature using larger validation cohorts.The second objective of my PhD was to assess lncRNAs as potential actors/therapeutic targets in chR TNBCs. For that we selected lncRNAs upregulated in chR pre-NAC TNBCs (compared with chS pre-NAC TNBCs) and in chR post-NAC TNBCs (compared with chR pre-NAC TNBCs). Considering lncRNAs level and specificity of expression, genomic position, and pre-existing data of their potential function, three lncRNAs (AL450326.1, LINC02609 and MIR503HG) were retained for functional analysis. By knocking down levels of these lncRNAs in TNBC cell line model, an impact on Docetaxel cytotoxicity was assessed. All three lncRNAs knock downs showed an improved Docetaxel induced cytotoxicity. Knock down of AL450326.1 and LINC02609 resulted in a decreased spontaneous clonogenicity and increased Docetaxel induced cell death, giving a first indication of their mode of action. In all, we identified three lncRNAs playing a role in NAC chemoresistance. Further functional studies will allow to decipher the mechanisms by which the identified lncRNAs affect chemoresistance with the ultimate goal to identify new therapeutic approaches to circumvent NAC chemoresistance of TNBCs

En dépit des avancées thérapeutiques récentes, le MM reste à ce jour une maladie incurable, dont les voies moléculaires impliquées dans l’hétérogénéité clinique, la progression, et l’agressivité du MM restent encore relativement peu connues. Au cours de cette dernière décennie, le rôle des lncRNAs a été de plus en plus étudié. En effet, les données génomiques, les études globales d’expression spatio-temporelle et l’existence de plusieurs lncRNAs démontrés comme impliqués dans différentes voies physiologiques suggèrent que les lncRNAs sont des régulateurs transcriptionnels et post-transcriptionnels importants, et la dérégulation de leur expression a maintenant été observée dans de nombreux cancers. Dans ce contexte, l’objectif principal de ma thèse a été de d’identifier les lncRNAs potentiellement impliqués dans le MM, et de caractériser les voies moléculaires via lesquelles ils exercent leur fonction. Pour étudier le rôle des lncRNAs dans le MM, nous avons dans un premier temps utilisé une analyse de données transcriptomiques publiées de plasmocytes tumoraux de patients atteints de MM au diagnostic, afin d’extraire les données concernant spécifiquement les lncRNAs. Grâce à cela, nous avons pu identifier 105 lncRNAs dont l’expression est dérégulée dans le MM, dont CRNDE, un lncRNA précédemment identifié comme oncogène dans plusieurs cancers.CRNDE est surexprimé dans les plasmocytes de patients atteints de MM comparé aux plasmocytes contrôle dans notre propre cohorte de patients de l’hôpital Saint-Louis. De plus, nous avons observé qu’une forte expression de CRNDE est corrélée à un mauvais pronostic. En utilisant une approche de délétion par la technique de CRISPR/Cas9 dans une lignée de MM, nous avons pu démontrer que CRNDE régule la prolifération, l’apoptose, ainsi que la tumorigénicité de ces cellules. Ce modèle cellulaire nous a également servi pour montrer que CRNDE régule l’expression du récepteur à l’IL6, et que la diminution de la prolifération observée dans les clones CRNDEΔ/Δ semble être en grande partie due à une perte de réponse à l’IL6, une cytokine jouant un rôle central dans la physiologie du MM.L’ensemble de ces résultat ont permis de démontrer un rôle important d’un lncRNA dans le MM, CRNDE, ainsi que de déterminer le mécanisme d’action par lequel il exerce son effet
Multiple myeloma (MM) is a malignancy of antibody-secreting plasma cells which remains incurable. MM is characterised by a wide clinical and prognostic spectrum, even within groups bearing the same primary cytogenetic event, for which the secondary molecular mechanisms responsible are still incompletely understood. Long non-coding RNAs (lncRNAs) are now recognised as an important class of regulatory molecules which are increasingly implicated in tumorigenesis and cancer progression. While recent studies have demonstrated prognostically relevant changes in the lncRNA expression profile in MM, the functional significance and molecular pathways downstream of these changes remain poorly characterised. In this study we have undertaken a thorough functional and molecular characterisation of the effect in MM cells of Colorectal Neoplasia Differentially Expressed (CRNDE), a known oncogenic lncRNA which has been previously implicated in diverse solid and haematological malignancies. CRNDE is overexpressed in plasma cells of MM patients, where it is a poor prognostic marker. CRISPR-mediated deletion of the CRNDE locus decreases proliferation and adhesion properties of MM cells in vitro and reduces tumour growth in an in vivo xenograft model. Transcriptomic profiling in CRNDE-deleted cells demonstrated that CRNDE activates expression of a number of genes previously implicated in the aetiology of MM, including the gene encoding the receptor of IL6 (IL6R), a cytokine critical for MM cell proliferation and survival. We further demonstrate that deletion of the CRNDE locus impacts upon IL6 signalling and proliferative responses in MM cells. Altogether this study reveals a novel mechanistic pathway by which the lncRNA CRNDE impacts upon MM growth and disease progression, by regulating the expression of IL6R and thus controlling response to IL6 signalling