Littérature scientifique sur le sujet « ADN – Réplication – Dynamique »

La réplication de l'ADN se fait par le biais d'un complexe protéique appelé réplisome. La compréhension des aspects structuraux et dynamique nécessite sa reconstitution in vitro à partir des sous-unités individuelles. Chez tous les organismes vivants, la phase d'élongation de l'ADN, effectuée par les ADN polymérases, met en jeu un facteur de processivité (PCNA) qui est chargé sur l'ADN par un facteur de chargement (RF-C). Généralement, les protéines des archées, impliquées dans la réplication de l'ADN, ont plus de similitudes avec leurs homologues eucaryotes que bactériens. L'étude présentée ici a porté sur les mécanisme de chargement du PCNA et de la synthèse d'ADN chez l'Euryarchaea hyperthermophile Pyrococcus abyssi. Afin de mieux cerner certaines interactions protéine-protéine et protéine-ADN, des versions mutantes du PCNA et des ADN polymérases (Pol B et Pol D) ont été produites. Il a été montré que le PCNA est capable de se charger spontanément sur l'ADN ; ce chargement est stimulé par le RF-C mais également par la Pol B qui stabilise son facteur de processivité par un motif essentiel. D'un autre côté, le complexe PCNA/Pol B est déstabilisé en présence d'ARN et de dNTPs. De plus, il a été montré que la Pol D présente plus d'un motif de liaison au PCNA. Malgré ce motif additionnel, la Pol D est déplacé du PCNA par la Pol B. Ces résultats, couplés à ceux précédemment obtenus, permettent de proposer un modèle moléculaire dynamique de la fourche de réplication pour le phylum Euryarchaea.

L'environnement des organismes vivants est par définition fluctuant, toutes variations aléatoires du milieu de vie constituent un stress pour les cellules. Au fil de l'évolution, une forte pression de sélection a façonné le fonctionnement cellulaire jusqu'aux réponses complexes élaborées par les organismes vivants. Mes travaux s'inscrivent autour des mécanismes moléculaires de la réponse au stress et plus particulièrement les stress génotoxiques. La première partie de l'étude décrit finement la réplication de l'ADN en condition de stress réplicatif. Ainsi, nous avons montré que les pools de dNTPs sont limitants pour la progression des fourches de réplication en phase S normale et en stress, et que leurs niveaux conditionnent le programme temporel de réplication. De plus, nous avons mis en évidence un mécanisme d'adaptation au stress réplicatif et aux dommages constitutifs dans des mutants caractérisés par de l'instabilité génétique (CIN) via l'activation du checkpoint de dommage conduisant à l'expansion des pools de dNTPs. Pour finir, nous montrons que l'augmentation des niveaux de dNTPs facilite la réplication en présence de lésions de l'ADN, d'une manière indépendante des ADN polymérases translésionnelles. Le second projet apporte de nouveaux éléments sur le rôle de Crt10 in vivo, préalablement identifié comme un régulateur transcriptionnel des gènes de la Ribonucléotide Réductase (RNR). Nos données indiquent que les mutants crt10Δ ont des niveaux de dNTP similaires à ceux des cellules sauvages, et que cette mutation a un très faible impact sur l'expression des gènes RNR, malgré un phénotype de vitesse de progression des fourches accrue. Nous montrons que le mutant crt10Δ est caractérisé par un défaut d'entrée en phase S et d'initiation des origines de réplication. L'origine de ce défaut pourrait résider dans les fonctions de Crt10 impliquant la régulation de la biosynthèse des ribosomes au sein du complexe Rtt101-Mms1. Le troisième projet identifie MRX (Mre11-Rad50-Xrs2) comme un acteur de la voie de terminaison des ARN non codants. MRX s'associe à des loci recrutant également le complexe de terminaison Nrd1-Nab3-Sen1 à l'échelle du génome entier. L'inactivation de RAD50 se traduit par une perte d'efficacité de terminaison et l'accumulation de transcrits bicistroniques, ainsi qu'une dérégulation du niveau d'ARNs non codants instables (CUT) et de leurs gènes associés. Tout comme Sen1, MRX pourrait intervenir dans la résolution des collisions entre les machineries de transcription et de réplication
A fluctuating environment is a powerful mean of selection for living organisms, which evolved complex signaling networks to integrate these variations and direct swift and efficient cellular responses. The aim of my work is the identification and characterization of molecular mechanisms involved in the tolerance of replicative stress and DNA damage. First, we show that changes in dNTP pools affect several aspects of replication dynamics in budding yeast. dNTP levels are limiting for normal S-phase progression and determine the temporal program of replication during a replicative stress. Interestingly, we also observed that chromosomal instability (CIN) mutants display expanded dNTP pools due to the constitutive activation of the DNA damage checkpoint. Since increased dNTP levels promote forks progression in the presence of DNA lesions, we propose that CIN mutants adapt to chronic replicative stress by upregulating dNTP pools. Secondly, we bring new lights on the role of Crt10 in vivo, which has been initially identified as a negative regulator of Ribonucleotide Reductase (RNR) genes expression. Deletion of CRT10 neither leads to expanded dNTP pools, nor to a massive deregulation of RNR genes, although crt10Δ cells exhibit faster fork progression. The crt10Δ mutant accumulates at the G1/S transition and exhibits a strong defect of origin firing that could account for its replication phenotype. Moreover, we observed a global decrease in ribosome biogenesis in crt10Δ. The physical interaction of Crt10 with several members of the ribosome biogenesis pathway and its role in the Rtt101-Mms1 complex suggest that Crt10 may regulate ribosome levels in vivo. At last, we identified MRX (Mre11-Rad50-Xrs2) as a bona fide member of the transcription termination of non-coding RNA (ncRNA). ChIP-seq reveals that MRX localized at the same loci than the Nrd1-Nab3-Sen1 complex in vegetative growth. rad50Δ cells exhibit transcriptional read-through and upregulation of unstable cryptic transcripts (CUTs) leading to a misregulation of their associated gene. Finally, MRX seems to be involved in the resolution of branched structures emanating from collision between transcription and replication machineries, as it is the case for Sen1

Haloferax volcanii est une archée appartenant au phylum euryarchaeota et à la classe des Halobacteriales. Les mécanismes liés à la réplication et à la réparation chez les archées sont très similaires à ceux rencontrés chez les eucaryotes, faisant d’H. volcanii un des organismes modèle pour l’étude de la réplication et de la biologie des archées, notamment car de nombreux outils génétiques sont disponibles chez cet organisme. De plus, H. volcanii possède la particularité de pouvoir avoir toutes ses origines de réplication supprimées, soulevant beaucoup de questions sur les mécanismes impliqués. Plusieurs hypothèses ont été émises sur la façon dont cette souche initie sa réplication, basées soit sur la dérivation des mécanismes liés à la réparation de l’ADN, soit sur un mécanisme d’initiation de la réplication indépendant des origines. Afin d’étudier ces mécanismes liés à la réplication, j’ai construit une souche d’H. volcanii capable d’incorporer des analogues de la thymidine dans l’ADN lors de sa synthèse grâce à la délétion de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de la thymidine. Des temps de cultures courts de la souche en présence d’un analogue permet son incorporation au niveau des zones actives de réplication pour marquer spécifiquement l’ADN néosynthétisé. L’immunodétection de l’analogue incorporé à l’ADN, en travaillant en cellule entière avec un microscope à fluorescence, permet la localisation de l’ADN néosynthétisé, reflétant ainsi les régions où la réplication est active. Ces analyses révèlent majoritairement 2 à 3 régions de réplication actives dans des cellules en prolifération, sans localisation particulière. Ces régions ont déjà été observées en étudiant la localisation d’une protéine clé de la réplication (RPA2) fusionnée à la protéine verte fluorescente GFP, confirmant sa localisation aux zones actives de réplication. Une étonnante variabilité observée d’une cellule à l’autre et suggère une initiation probabiliste de la réplication. Il est également étonnant de n’observer qu’aussi peu de zones actives de réplication, comparé au fort taux de polyploïdie de cette souche. Se pose alors la question de ce à quoi correspondent ces zones de réplication. Pour cela, j’ai développé chez H. volcanii la technique de peignage moléculaire permettant d’isoler des molécules individuelles d’ADN et révéler spécifiquement les analogues incorporés pour pouvoir déterminer le nombre de copies du chromosome qui sont actives lors de la réplication, ainsi que le nombre d’origines actives sur chacune des copies. J’ai également développé une technique de Time-lapse dans le but de suivre ces régions au cours du temps en observant les divisions cellulaires directement sous le microscope
Haloferax volcanii is an archaea belonging to the phylum euryarchaeota and the class Halobacteriales. The mechanisms related to replication and repair in archaea are very similar to those found in eukaryotes, making H. volcanii a relevant model organisms for the study of replication and archaeal biology, especially since many genetic tools are available. Interestingly, all replication origins can be removed from the chromosome of H. volcanii, raising many questions about the mechanisms involved. Several hypotheses have been proposed on how this strain initiates its replication, either relying on recombination-dependent replication initiation or an origin-independent mechanism. In order to study these replication-related mechanisms, I have constructed a strain of H. volcanii able to incorporate thymidine analogues into DNA during its synthesis by deleting genes involved in the thymidine biosynthesis pathway. A short-time cultures of the strain in the presence of an analogue allows its incorporation in nascent DNA. By immunodetection of the analog coupled to fluorescence microscopy observation of whole cells, it is possible to investigate the localization of neosynthesized DNA,which reflect the regions where replication is active. These analyses revealed mainly 2 to 3 active replication regions per cell, without any particular location. These regions had already been observed by studying the localization of a key replication protein (RPA2) fused to the fluorescent green protein GFP, confirming its location in active replication areas. A surprising variability in the number of replication foci from one cell to another was observed, suggesting a probabilistic initiation of replication. It is also surprising to observe so few active replication areas compared to the high polyploidy of this strain. This raises the question of what these replication areas correspond to. For further understanding, I developed for H. volcanii molecular combing, to isolate individual DNA molecules and specifically reveal incorporated analogues to determine the number of copies of the chromosome that are being replicated, as well as the number of active origins on each of the copies. I have also developed time-lapse approach to track these regions over time by monitoring cell proliferation directly under the microscope

Les cellules souches embryonnaires (ES) et induites à la pluripotence (iPS) portent de grands espoirs pour la médecine régénératrice du fait de leur capacité d’auto-renouvellement et de différenciation. Une question cruciale est de savoir comment ces cellules mettent en place et maintiennent l’épigénome pluripotent. Les cellules ES et iPS ont un cycle cellulaire particulier, avec un temps de doublement rapide, une phase G1 courte et une phase S représentant 60-70% du cycle cellulaire. Au cours de ce projet, nous avons essayé de voir si les chromosomes dans les cellules ES murines et humaines étaient répliqués de façon particulière qui aiderait à maintenir l’état pluripotent.Les chromosomes mammifères sont dupliqués grâce au recrutement de ~20000 origines de réplication qui sont organisés dans des clusters. Ces clusters forment des foyers de réplication qui sont régulés dans le temps pendant la phase S et dans l’espace nucléaire. Certains de ces domaines topologiques changent leur timing de réplication pendant la différenciation ou la reprogrammation. Néanmoins les mécanismes exacts impliqués dans ce processus et leurs conséquences sur l’expression génique ne sont pas connus.Nous avons étudié la dynamique de réplication dans des cellules pluripotentes murines et humaines à l’échelle de molécules individuelles par la technique de peignage moléculaire de l’ADN. Nous avons comparé les vitesses de fourches, les distances inter-origines et la densité de fourches dans des cellules différenciées (MEF) et pluripotentes (mES), ainsi que pendant la différenciation de ces dernières. Les vitesses de fourches de réplication sont légèrement moins élevées dans les cellules souches embryonnaires que dans les fibroblastes (1.8 vs 2.0 kb/min), et les distances inter-origines intra-cluster sont équivalentes. Par contre, la densité globale instantanée de fourches est divisée par deux dans les cellules ES (1 fourche/Mb) par rapport aux fibroblastes. Un résultat similaire est retrouvé dans les cellules souches embryonnaires humaines (H9) comparées aux fibroblastes (BJ).Afin de tester si cette densité de fourches basse est compensée par un allongement de la phase S, nous avons développé une technique basée sur deux marquages aux analogues de la thymidine. Elle permet une mesure de la durée de la phase S sur des populations asynchrones de cellules. Nous avons trouvé que la phase S a la même durée dans les cellules mES et MEF (~8.4h). Une question intéressante est donc comment les cellules ES peuvent répliquer la même quantité de l’ADN, dans la même durée mais en utilisant deux fois moins de fourches ? Nous proposons que la plus faible densité instantanée en origines serait compensée par une fréquence plus élevée de l’activation des foyers de réplication. Cette fréquence élevée pourrait participer au maintien de la structure épigénétique responsable de la pluripotence ou de l’auto-renouvellement
Embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have a great potential for regenerative medicine due to their capacity to self-renew indefinitely and to generate multiple cell types, but the key question of how they establish and maintain a pluripotent epigenome is not resolved. Interestingly all ES and iPS cells display a peculiar cell cycle with rapid doubling time, very short G1, and S phase representing 60-70% of the total cell cycle. In this work we tried to see whether chromosomes in mouse and human ES cells are replicated in a special way that might be used to set up the pluripotency state or to define cell identity. Mammalian genomes are duplicated by the firing of ~20,000 replication origins, organized in ~3000 small clusters forming replication foci that are spatially and temporally regulated during S phase. It has been shown that many of these topologically-associated domains change their replication time upon cell differentiation or reprogramming, but the exact mechanisms involved remain poorly understood. Here we used DNA combing to compare fork velocity (FV), local inter-origin distances (IOD) and global instant fork density (GIFD) between pluripotent mouse ES cells and fibroblasts (MEF), as well as during the differentiation of mES cells into embryoid bodies (EB) and neural precursors. We found that FV is slightly reduced (1.8 vs 2.0 kb/min) and IOD basically unchanged in mES compared to MEF. In contrast GIFD, which represents the density of forks active at any moment during S phase, shows a strong reduction from 2 forks/Mb in MEF to 1 fork/Mb in mES cells. We found a similar drop in GIFD in human ES cells (H9) compared to fibroblasts (BJ). To test whether this lower fork density is compensated by an extension of S phase, we developed a dual pulse/chase protocol to measure S-phase length in asynchronous populations by FACS. Using this assay, we found that S-phase length is identical (~8.4 hr) in both mES and MEF cells, despite the GIFD drop in the former. This raises an interesting question: how can ES cells replicate the same amount of DNA, in the same time and with similar fork velocity, but using a 2-fold lower instant fork density? We propose that the lower GIFD (amplitude) is compensated by a higher frequency of replication foci activation, which is not detected by the GIFD pulse protocol. This higher frequency of replication foci activation could play a role in the establishment and/or maintenance of a chromatin structure permissive for pluripotency or self-renewal

Chez les eukaryotes, la duplication des chromosomes est initiée à partir des origines de réplication selon une chorégraphie spatio-temporelle bien définie qui contribue au bon déroulement des autres évènements du cycle cellulaire, assurant ainsi la transmission correcte du patrimoine génétique. Ce programme spatio-temporel n'est pas rigide et peut varier selon le type cellulaire et s'adapter aux conditions physiologiques. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, par exemple, la méiose est un exemple de différentiation cellulaire au cours de laquelle une cellule diploïde va générer quatre cellules haploïdes génétiquement différentes, et où la phase de réplication des chromosomes est deux à trois fois plus longue que lors du cycle végétatif. Mon travail de thèse a consisté principalement à définir les causes de cette extension, en utilisant la technique très résolutive du peignage moléculaire de l'ADN qui permet, à partir de molécules uniques, de déterminer la cinétique d'activation des origines et la progression des fourches de réplication. L'analyse d'un chromosome isolé (Chr. VI) indique que les mêmes origines sont utilisées en mitose et méiose, mais selon un programme d'activation différent. Nos résultats suggèrent aussi qu'en méiose les fourches de réplication ralentiraient au niveau de sites de pause. J'ai alors tenté d'élucider les causes moléculaires de ces pauses et leur lien éventuel avec la mise en place de la recombinaison méiotique, une étape fondamentale pour la ségrégation correcte des chromosomes et le brassage génétique lors de la formation des gamètes. Ce processus est initié par la formation des Cassures Double Brin (CDB) qui requiert l'intervention d'un complexe protéique spécifique de la méiose, constitué notamment de Mer2, Rec114 et Spo11. La dynamique de réplication a été étudiée dans des souches mutées pour ces protéines. Parallèlement à ces travaux sur la méiose, j'ai aussi amélioré la technique du peignage moléculaire et démontré son utilité pour déterminer avec précision la fin de la réplication des chromosomes, une donnée qui n'était pas accessible par les techniques classiques. J'ai ainsi pu montrer que des cellules dépourvues en Cdc14, une protéine phosphatase essentielle pour la ségrégation de l'ADN ribosomique (rDNA) et la sortie de mitose, terminaient la réplication plus tardivement que les cellules contrôles. Le fort retard de réplication du rDNA dans le mutant cdc14-1 pourrait être responsable de son défaut de ségrégation en anaphase
The duplication of chromosomes in eukaryotes initiates from numerous origins that are activated during S phase according to specific spatio-temporal replication programs. These replication programs are connected to downstream cell cycle events and contribute to accurate transmission of the genetic material to progeny, yet they are flexible and can adapt to varying physiological conditions. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, for example, meiosis can be considered as a differentiation program whereby a diploid cell gives rise to four genetically different haploid cells. Interestingly, premeiotic DNA replication is usually two to three times longer than during vegetative cell division (mitosis), in multiple organisms, yet no one really knows why. The aim of my thesis work was to uncover the reasons for this S phase extension in meiosis, using a state-of-the-art imaging technique called DNA combing. With this technique that I contributed to improve, the firing of origins as well as replication fork progression rates can be monitored on the level of single DNA molecules. My data indicate that the same number of origins is used in mitosis and meiosis. However, by focusing on a single chromosome (Chr. VI) we discovered that, although the same set of origins is used, it is activated following a different program. A first subset of origins fires with high efficiency, then replication forks seem to pause for a long while before a second subset of origins fires. I tried using various mutants to determine the nature of these replication pausing sites and their potential link with the induction of meiotic recombination, which is essential for correct chromosome segregation in meiosis. This process begins with the formation of double-strand breaks (DSBs) that require the concerted action of a number of meiotic-specific proteins, among which Mer2, Rec114 and Spo11. In order to see if these DSB proteins are responsible the lengthening of S in meiosis, I analyzed replication dynamics in strains lacking these proteins. Besides this work, I also demonstrated the utility of DNA combing for defining when DNA replication is completed in mitotic cells, a measure that was not available from current techniques. This way I was able to show that yeast cdc14-1 cells, defective for a conserved protein phosphatase needed for ribosomal DNA (rDNA) segregation and mitotic exit, finish rDNA replication much later than control cells. It is likely that the failure of cdc14-1 cells to finish rDNA replication in time is responsible for its non-segregation in anaphase

Leishmania est un parasite eucaryote divergent responsable d’un large spectre de maladies à travers le monde. Ce parasite est caractérisé par une aneuploïdie mosaïque, constitutive, c’est-à-dire qu’au sein d’une population chaque cellule comporte une combinaison unique de mono-, di- et trisomies de chacun de ses 36 chromosomes. L’aneuploïdie mosaïque est générée et maintenue chez les générations suivantes grâce à un taux élevé de répartition asymétrique des chromosomes lors de la mitose, entrainant le gain ou la perte de chromosomes entiers. Ceci implique une régulation non-conventionnelle de la réplication, suivie d’une ségrégation permissive des chromosomes.L’objectif général de cette étude était de comprendre la dynamique de la réplication de l’ADN ainsi que de cartographier les sites d’initiation de la réplication chez Leishmania, en utilisant la technique du peignage moléculaire d’une part et celle du ChIP-seq d’une autre part. Nous avons ainsi pu caractériser les différents paramètres de progression de la fourche de réplication. Un des résultats majeurs qui ressort de cette étude est que Leishmania possède les plus grandes distances inter-origines et la plus grande vitesse de réplication parmi les autres eucaryotes déjà étudiés. Nous avons également pu estimer que le génome de Leishmania possède environ 168 origines de réplication. Afin d’étudier les acteurs impliqués dans la réplication de l’ADN chez Leishmania, nous avons développé l’outil génétique CRISPR/Cas9. Pour développer cet outil, nous avons basé notre approche sur une stratégie à deux vecteurs : l’un permet l’expression du single guide (sg)RNA et l’autre celle de l’endonucléase Cas9. La validation de cet outil génétique a été réalisée par le knock-out du locus PFR2 codant une protéine flagellaire. Dans un second temps, nous avons fait évoluer le CRISPR/Cas9 vers un système inductible pour réaliser les knock-out et des étiquetages au locus endogène de protéines d’intérêt. Nous avons utilisé ce nouveau système pour étudier la fonction de deux protéines potentiellement impliquées dans le complexe de reconnaissance des origines de réplication. Malgré une fuite du système, nous avons pu réaliser le KO des gènes Orc1b et Orc1/Cdc6 et suivre la progression du cycle cellulaire. Nous avons pu constater que la perte de ces gènes conduisait à un défaut de croissance ainsi qu’à l’apparition de cellules sans noyau. L’insertion d’une étiquette au locus endogène d’Orc1b nous a parmi de confirmer la localisation que nous avions obtenue avec une construction épisomale et va permettre d’étudier plus précisément le rôle de cette protéine.En conclusion, nous avons mis en évidence des paramètres de réplication originaux et démontré, en utilisant le CRISPR/Cas9, que les protéines Orc1b et Ocr1/Cdc6 étaient impliquées dans la duplication du noyau de Leishmania, ce qui est en accord avec leur rôle putatif dans la réplication de l’ADN
Leishmania, a protozoan parasite which causes a large range of diseases worldwide, is characterized by a constitutive 'mosaic aneuploidy', i.e. each cell in a population possesses a unique combination of mono-, di- and trisomies for each of its 36 heterologous chromosomes. Mosaic aneuploidy is generated and maintained via high rates of asymmetric chromosomal allotments during mitosis, leading to the gain or loss of whole chromosomes. This implies an unconventional regulation of the replication, followed by a permissive segregation.The main objective of this study was to unravel DNA replication dynamics and to map the replication initiation sites in Leishmania using DNA combing and ChIP-seq analyses. First, we have characterized DNA replication fork parameters. One of the major findings of this study was that Leishmania exhibits the fastest replication speed and the largest interorigin distances among the eukaryotes tested so far. We have also estimated that the Leishmania major genome possesses 168 origins of replication.To study the actors involved in DNA replication, we first had to develop novel genetic tools. The CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated endonuclease 9) system is a recently discovered powerful technique for genome editing. In order to adapt this system to Leishmania, we have chosen a two-plasmid strategy: one for the expression of the single guide (sg) RNA and a second for the expression of the endonuclease CAS9. The proof of concept has been based on the disruption of the paraflagellar rod-2 (PFR2) loci by the CRISPR-Cas9 system. In a second attempt, we have developed an inducible CRISPR-Cas9 system, both to obtain knock outs and to perform marker-free endogenous gene tagging. We used the system to investigate the function of Origin Recognition Complex proteins. Although the system was leaky, the genome was edited as expected. We thus deleted Orc1b and Orc1/Cdc6 and monitored the cell cycle progression of the parasite. We found that the depletion of these nuclear proteins lead to a growth defect and to the appearance of zoids (anucleated cells). The endogenous tagging of Orc1b confirmed the localization previously obtained using an episomal expression vector, and will allow further investigation on the role of this protein.In total, we have shown the presence of original replication dynamics parameters in Leishmania, and using CRISPR Cas9, we have demonstrated that Orc1b and Orc1/Cdc6 are involved in the nuclear duplication of Leishmania, in agreement with their putative in DNA replication

Les mitochondries sont des organelles semi-autonomes : leur biogenèse nécessite une contribution importante du génome nucléaire. Celui-ci code non seulement pour une très grande majorité des protéines de structure des mitochondries mais aussi pour l'ensemble des protéines nécessaires à la réplication et à l'expression de l'ADNmt. Ce manuscrit présente une étude en trois parties de la biogenèse mitochondriale : - durant l'ovogénèse chez Xenopus laevis une approche cytologique décrit la mise en place, l'évolution spatiale et l'activité de réplication de deux populations mitochondriales durant la croissance de l'ovocyte. Cette étude montre que la probabilité de réplication d'une mitochondrie dépend de sa localisation dans la cellule. - les chondrocytes articulaires sont les constituants cellulaires du cartilage. Les activités de réplication et de transcription du génome mitochondrial étudiées par hybridation moléculaire, montrent une forte augmentation lors de la mise en culture de ces cellules. L'analyse suggère la présence de contrôles transcriptionnels et post-transcriptionnels de la biogénèse mitochondriale. - la seule grande région non-codante de l'ADNmt contient l'origine de transcription du brin L et les origines de transcription et de réplication du brin H. Le clonage de l'ADNmt du lapin "Fauve de Bourgogne" et la séquence de sa région non-codante mettent en évidence une organisation originale de celle-ci. La présence de deux groupes de répétitions directes (20 pb et 153 pb) fait l'objet de remaniements séquentiels chez E. Coli et est responsable de l'hétéroplasmie rnitochondriale du lapin.

Chez les eucaryotes, la réplication de l'ADN commence à partir de multiples origines activées à différents moments de la phase S. Chaque origine forme deux fourches de réplication divergentes où a lieu la synthèse de l'ADN. Mais alors que la duplication du génome dépend de l’avancée des fourches, les déterminants de leur progression demeurent peu connus, et on ne sait toujours pas si les fourches se déplacent à une vitesse variable ou constante le long des chromosomes. Mes travaux de thèse ont consisté à réaliser chez la levure S. cerevisiae la première carte génomique de progression des fourches de réplication basée sur la vitesse individuelle des fourches. Notre laboratoire a mis au point une méthode de cartographie de la réplication en molécule unique basée sur la détection par séquençage nanopore d'un analogue de la thymidine, le BrdU, incorporé pendant la réplication. En me basant sur cette technique, j’ai développé, en association avec des bioinformaticiens du laboratoire, un outil de mesure de la vitesse des fourches nommé NanoForkSpeed (NFS). Après détection du BrdU incorporé dans l'ADN de cellules asynchrones lors d'un court marquage, NFS procède à une segmentation des signaux pour identifier les fourches de réplication, les orienter et extraire leur vitesse ; la séquence des lectures donne quant à elle immédiatement la localisation des fourches. J'ai par ailleurs créé la souche BT1, qui incorpore très efficacement le BrdU tout en conservant une croissance similaire à celle de levures sauvages, ce qui m'a permis d'étudier la progression des fourches de réplication dans des conditions physiologiques. La vitesse moyenne des fourches mesurée par NFS dans les cellules BT1 est de 2,1 kb/min, en accord avec les précédentes estimations chez S. cerevisiae. NFS est aussi capable de détecter le ralentissement des fourches induit par l’hydroxyurée ainsi que les changements de vitesse dans des mutants où la progression du réplisome est altérée. Le débit de NFS surpassant celui des méthodes en molécule unique actuelles, plus de 125000 vitesses de fourches de réplication ont pu être positionnées sur les chromosomes de S. cerevisiae pour générer la première carte génomique de progression des fourches basée sur des mesures individuelles jamais obtenue chez un organisme. Cette carte a révélé une progression homogène des fourches sur l’ensemble du génome de la levure à l'exception de forts ralentissements au niveau des sites de pauses déjà identifiés chez cet organisme, à savoir les centromères, les télomères, l'ADN ribosomique et certains gènes d'ARN de transfert. En parallèle de NFS, j’ai développé Nanotiming, une nouvelle technique d'analyse du programme temporel de réplication du génome de S. cerevisiae. Nanotiming repose sur la quantification du taux de BrdU dans les lectures nanopores : la concentration en thymidine augmentant au cours de la phase S chez la levure, le taux de BrdU sera ainsi plus faible dans les régions se répliquant tardivement que dans celles se répliquant précocement. Contrairement aux approches actuelles basées sur l’analyse de l'augmentation du nombre de copies au cours de la phase S qui sont soit peu résolutives, soit fastidieuses car impliquant une synchronisation ou un tri cellulaire, Nanotiming requière simplement le marquage de cellules asynchrones avec du BrdU pendant un doublement. Les profils obtenus tant dans une souche sauvage que dans une souche où Rif1, un régulateur-clé du programme temporel de réplication, a été inactivé sont remarquablement similaires à ceux établis par les méthodes à haute résolution actuelles, validant mon approche. Outre sa simplicité, Nanotiming ouvre également la voie à l'analyse à haut débit du programme temporel de réplication en molécule unique, et à l'étude approfondie des variations inter-individuelles
In eukaryotes, DNA replication initiates from multiple origins activated throughout S-phase. Each origin forms two diverging replication forks that synthesize DNA. Although genome duplication depends on a proper fork progression, the governing factors are poorly understood, and little is known about replication fork velocity variations along eukaryotic genomes. My thesis project aimed at generating in the budding yeast S. cerevisiae the first ever genome-wide map of fork progression based on individual fork rates. Our laboratory has recently introduced a high-throughput, high-resolution, single molecule-based replication mapping technique relying on the detection by nanopore sequencing of 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU), a thymidine analogue incorporated in replicating DNA. In collaboration with bioinformaticians, I have developed NanoForkSpeed (NFS), a method capable of positioning, orienting and extracting the velocity of replication forks from BrdU tracks synthesized during a brief pulse-labelling of asynchronously growing cells. In addition, I have engineered the BT1 yeast strain which exhibits highly efficient BrdU incorporation and wild-type growth, allowing the measurement of fork progression in physiologically relevant conditions. NFS retrieves previous S. cerevisiae mean fork speed estimates (≈2 kb/min) and precisely quantifies speed changes in cells with altered replisome progression or exposed to hydroxyurea. The positioning of >125,000 fork velocities provides a genome-wide map of fork progression based on individual fork rates, showing a uniform fork speed across yeast chromosomes except for a marked slowdown at known pausing sites, namely centromeres, telomeres, the ribosomal DNA and some tRNA genes. During my PhD, I have also created Nanotiming, a novel method to study the replication timing (RT) of S. cerevisiae's genome. Nanotiming relies on the quantification of BrdU rates in nanopore reads: since thymidine concentration increases during S-phase in yeast, BrdU incorporation will be lower in late replicating than in early replicating regions. In contrast to reference techniques based on DNA copy number analysis, which are either low-resolution or difficult to implement as they require cell synchronization or sorting, Nanotiming only demands the labeling of asynchronously growing yeast cells with BrdU during one doubling. RT profiles obtained both in wild-type cells and in a mutant strain where Rif1, a key RT regulator, has been inactivated are remarkably similar to those established by high-resolution methods, validating my approach. In addition to its simplicity, Nanotiming also paves the way for high-throughput analysis of single molecule RT and in-depth study of inter-individual RT variability

Chez les organismes multicellulaires, les mécanismes moléculaires impliqués dans sa mise en place du programme spatio-temporel de réplication ne sont actuellement pas clairement élucidés. Afin d'améliorer leur compréhension, nous avons créé un domaine synthétique de réplication précoce dans une région génomique aviaire se répliquant en milieu de phase S en y insérant deux réplicons autonomes espacés de 30 kb. Nous montrons l'existence d'une proximité spatiale entre les deux réplicons autonomes qui suggère que la formation du domaine synthétique précoce pourrait s'établir par le biais de contacts moléculaires donnant lieu à la formation d'une boucle de chromatine. Nous analysons l'influence de l'avancement du moment de réplication sur la permissivité transcriptionnelle et la structure chromatinienne de la région et nous montrons que l'avancement du moment de réplication semble contrôler plus strictement la répression d'un construit rapporteur central, suggérant qu'une réplication précoce favoriserait un meilleur verrouillage des promoteurs tissu-spécifiques riches en CpGs. Enfin, nous analysons l'impact de la perte des éléments cis-régulateurs du moment de réplication au cours de la transition G1/S. Nous montrons que les éléments qui contrôlent le moment de réplication doivent être maintenus après le point de transition où s'établit le programme temporel de réplication pour un maintien fidèle du programme temporel d'un cycle cellulaire à l'autre sur l'origine proximale. Nos résultats indiquent que l'information du moment de réplication de la région n'est pas transférée sur l'origine au moment de la transition mais reste portée par l'environnement chromatinien
Large genomes of multicellular organisms are replicated according to a conserved and precise temporal program, however, molecular mechanisms involved in the coordination of origin firing during the S-phase remain unresolved. To further investigate these aspects of replication timing we have inserted two autonomous replicons spaced out by 30 kb in a naturally mid-late replicated region of chromosomel in DT40 to create a synthetic early replicated domain. We observed a spatial proximity between the two flanking advanced replicons indicating that the synthetic early domain formation may be associated with a molecular connection between the two advanced replicons spaced out by 30kb with the potential formation of a chromatin loop. We also analyzed the impact of the earlier replication timing on transcriptional permissiveness and chromatin structure of a reporter construct lying in the central part of the early synthetic domain. We observed a more tightly controlled repression of the reporter gene associated with an earlier replication. This result supports the view that earlier replication timing favors a better locicing of tissue-specific promoters with high CpG content. Finally, we analyzed the impact of the loss of cis-regulatory elements contolling the replication timing (TC) at the G 1/S transition. We found that TC elements have to be maintained alter the timing decision point (TDP) to ensure the correct temporal program of replication at the proximal origin in the following S-phase. Our results indicate that the timing information is not transferred to the origin at the TDP but is carried by the local chromatin environment

Ce travail de thèse porte sur l’étude de la réplication chez les archées, qui constituent le troisième domaine du vivant avec les bactéries et les eucaryotes. L’organisme modèle que nous avons utilisé est l'archée halophile Haloferax volcanii car les outils génétiques disponibles permettent d’exprimer des protéines fusionnées à la Protéine Fluorescente Verte (GFP) dans cet organisme mésophile et aérobe et ainsi de localiser les protéines d’intérêt dans des cellules vivantes. Nous nous sommes ainsi intéressés à la localisation cellulaire de quatre protéines de la réplication qui ont été fusionnées à la GFP et exprimées sous contrôle de leur propre promoteur : (i) la protéine ‘Flap Endonuclease 1’ (FEN1), qui intervient dans la maturation des fragments d’Okazaki, (ii) la protéine ‘Origin Recognition Complex’ (ORC1) impliquée dans la reconnaissance des origines de réplication, (iii) la protéine ‘Proliferating Cellular Nuclear Antigen’ (PCNA), anneau de processivité des ADN polymérases réplicatives, et (iv) la protéine de fixation à l’ADN simple-brin ‘Replication Protein A’ (RPA2) essentielle à la réplication chez H. volcanii. Seule la protéine PCNA n’a pu être exprimée en fusion avec la GFP, suggérant que la protéine fusion n’est pas fonctionnelle. GFP::Orc1 et GFP::Fen1 ont été exprimées dans la cellule mais ne présentent pas de localisation spécifique reflétant un rôle de ces protéines dans la réplication de l’ADN. En revanche des foyers de fluorescence de la protéine fusion GFP::Rpa2 ont été observés, dont le nombre augmente significativement dans des cellules exposées à l’aphidicoline, drogue inhibant la synthèse de l’ADN et induisant ainsi un stress réplicatif. Cependant une localisation différente de la protéine GFP::Rpa2 a été observée lorsque les cellules sont exposés à la phléomycine, qui induit notamment des cassures double-brin de l‘ADN. Dans ces cellules, GFP::Rpa2 forme un foyer de fluorescence massif qui colocalise avec l’ADN compacté dans la grande majorité des cellules observées. Nos résultats suggèrent donc que la localisation spécifique observée pour GFP::Rpa2 reflète son rôle dans la réparation de l’ADN et/ou le redémarrage des fourche de réplication arrêtées
The aim of this thesis project was to improve our understanding of DNA replication in archaea, the third domain of life with bacteria and eukarya. The model organism chosen for these studies is the halophilic archaea Haloferax volcanii, a mesophilic aerobe for which genetics tools allow studying in living cells the localization of proteins fused to the Green Fluorescent protein (GFP). Four proteins involved in DNA replication were fused to the GFP and expressed under the control of their own promoter: (i) the ‘Flap Endonuclease 1’ (FEN1), involved in Okazaki fragments maturation, (ii) the ‘Origin Recognition Complex’ (ORC1), involved in DNA replication origin recognition, (iii) the ‘Proliferating Cellular Nuclear Antigen’ (PCNA), processivity factor of replicative DNA polymerases, and (iv) the ‘Replication Protein A’ (RPA2), single-stranded DNA binding protein essential for DNA replication in H. volcanii. Only the PCNA fusion to the GFP was not successful, suggesting that the GFP hinders essential roles of PCNA in DNA replication. Fen1 and Orc1 were successfully fused to the GFP and expressed in living cells, but specific localization in cells related to growth phase, reflecting different replication dynamics, were not observed. In contrast, we could observed fluorescent foci formed by the fully functional GFP::Rpa2 protein that actively responded to DNA damage in H. volcanii cells. The number of these fluorescent foci per cell was constant during cell growth but it significantly increased in cells exposed to aphidicoline, which inhibits DNA synthesis during replication. When cells were treated with phleomycine, a DNA damaging agent mainly causing double-strand breaks, formation of a massive fluorescent focus coinciding with DNA compaction was observed. Our results suggest that the specific cellular localization of GFP::Rpa2 observed reflects Rpa2 roles in DNA repair and/or DNA replication fork restart