Literatura académica sobre el tema "Ubiquitine ligases"

Le norovirus, un virus non-enveloppé à ARN simple brin positif (+) de la famille des Caliciviridae est très contagieux et résistant. Un important effort de recherche est mené pour comprendre les mécanismes de la pathogenèse norovirale. Le système immunitaire inné est principalement activé lors des infections à norovirus. L'ubiquitination est un processus post-traductionnel ATP-dépendant, qui régule de nombreuses étapes de cette réponse immunitaire en catalysant l’ajout de différents types de chaînes de polyubiquitine sur certains résidus lysine de protéines cibles de manière à réguler leur sort.Il est à noter que des niveaux accrus de polyubiquitination peuvent être mesurés dans des cultures de macrophages après infection avec la souche de norovirus murin S99 (MNoV_S99). Dans une première étude, nous avons évalué comment l'altération de la formation des chaînes de polyubiquitine pouvait affecter le cycle de vie de MNoV_S99. En utilisant la lignée cellulaire de macrophage Raw264.7, plusieurs lignées cellulaires stables ont été générées en surexprimant les constructions YFP-Ubiquitin_WT, _K29R, _K48R ou_K63R. Toutes les constructions non-WT codent une protéine de fusion d'ubiquitine dont une lysine a été mutée en un résidu arginine, empêchant ainsi la formation des chaînes de polyubiquitine correspondantes. Une expression significativement réduite de plusieurs marqueurs viraux ainsi qu’une diminution significative des titres viraux a pu être mesurée seulement dans les cellules K48R. Cette régulation négative n’était pas liée à une entrée virale perturbée, mais plutôt par une hypersécrétion constitutive de la cytokine pro-inflammatoire TNF générant ainsi un environnement hostile à la propagation du MNoV_S99. L’ajout de chaînes de polyubiquitine K48 sur un substrat entraîne généralement celui-ci vers la dégradation protéasomale. Nos données sont les premières à suggérer que le MNoV_S99 bénéficie de la régulation à la baisse d’un ou plusieurs composants cytosoliques anti-viraux, encore non identifiés, vraisemblablement sensibles à la dégradation protéasomale. Les E3-ubiquitine ligases jouent un rôle central dans le processus d'ubiquitination en sélectionnant les substrats à ubiquitiner. Il a été démontré que SMURF1, une ubiquitine ligase à domaine HECT, atténue la demi-vie de plusieurs agents pathogènes par le biais de l'ubiquitination K48.Dans la seconde étude présentée dans ce manuscrit, nous avons analysé le rôle joué par SMURF1 dans la propagation du MNoV_S99. Tout d’abord, nous avons identifié l’interaction de SMURF1 avec la principale protéine de capside norovirale VP1. Mais cette interaction n'est pas associée à l'ubiquitination de la capside virale, ce qui suggère que le virus lui-même n'est pas ciblé par la dégradation protéasomale. En effet, lorsque des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM), de souris, où Smurf1 est inactivé par rapport à des souris sauvages, ont été infectés par le MNoV_S99, nous avons mesuré une diminution significative de l'expression de plusieurs marqueurs viraux. De même, les titres viraux dans les cultures Smurf1-/-étaient significativement inférieurs à ceux des BMDM WT. Ceci suggère un rôle bénéfique de SMURF1 et de l'ubiquitination K48-dépendante dans le cycle de vie des norovirus. Ceci a été confirmé par le fait que les BMDM WT traités avec l'inhibiteur de protéasome MG132 ont montré une production de MNoV_S99 significativement réduite.Dans l'ensemble, nos données permettent de mettre en lumière un rôle bénéfique de l'activité protéasomale dans le maintien d'un environnement permissif dans la propagation de la souche S99 du norovirus murin<br>The Norovirus, a small non-enveloped single stranded positive-sense RNA virus, that belongs to the Caliciviridae family, is highly contagious and resistant and is a major causal agent of viral gastroenteritis resulting in a high human and socioeconomic cost. Due to a lack of approved therapy options, intensive research effort is on going to better understand the mechanisms of noroviral pathogenesis.Viral entry is known to trigger signals that activate the innate immune system in order to neutralize the pathogen. Ubiquitination is an ATP-dependent multistep posttranslational process, involved in the regulation of the immune response, in which a ubiquitin moiety is added to a substrate. Interestingly, we have measured increased levels of polyubiquitination following mouse norovirus (MNoV) infection in macrophages. Different types of polyubiquitin chains can be formed on a given target’s lysine residue which determines the fate of those proteins. In a first study we have evaluated how the alteration of polyubiquitin chain formation could affect the noroviral life cycle. Using the macrophage cell line Raw264.7, several stable cell lines were generated by overexpressing YFP-Ubiquitin_WT, _K29R, _K48Ror_K63R constructs. All non-WT constructs encode a ubiquitin fusion protein with one lysine mutated into an arginine residue, thus preventing the formation of their respective polyubiquitin chains. Upon infection with the murine norovirus S99 (MNoV_S99) strain, we measured a significantly reduced expression of the viral markers VP1, NS5 and double-stranded RNA in cells where the formation of polyubiquitin chains via lysine 48 was abrogated. The TCID50 titration method further confirmed the drop of norovirus production in these cells. This negative regulation could not be explained by perturbed viral entry, however, a constitutive hypersecretion of the pro-inflammatory cytokine TNF and downstream upregulation of IκBαphosphorylation followed by NF-κB nuclear translocation was found which could potentially impose a non-permissive environment for MNoV_S99 replication and propagation.Additionally, since K48-polyubiquitin chain formation is well described to target proteins toward proteasomal degradation, our data are the first to suggest that the MNoV_S99benefits from the down regulation of unidentified cytosolic component(s) that are cleared via the proteasome.E3-ubiquitin ligases play a central role in the ubiquitination process by selecting which substrates go through ubiquitination. SMURF1, a HECT domain ubiquitin ligase, wasshown to mitigate, via K48-ubiquitination, the half-life of several pathogens. In the second study presented in this manuscript, we have investigated the role played bySMURF1 in MNoV_S99 propagation. Interestingly, we have identified that SMURF1 can bind to the main noroviral capsid protein Vp1. But this interaction was not associated with ubiquitination of the viral capsid, suggesting that the virus itself is not targeted towards proteasomal degradation. Indeed, when bone marrow derived macrophages (BMDM), established from Smurf1 knock-out mice in comparison with WT mice, were infected with MNoV_S99 we measured significantly decreased expression of several viral markers. Similarly, viral titres in Smurf1-/- cultures were significantly lower than WT BMDMs. This hints at a beneficial role of SMURF1 and K48-dependent ubiquitination in the noroviral lifecycle. This was further confirmed when WT BMDMs treated with the proteasome inhibitor MG132 showed significantly reduced MNoV_S99 production.Taken together, our data shed light on a beneficial role of the proteasomal activity in maintaining a permissive environment for the propagation of the S99 mouse norovirus strain

Les courts ARN non codants tels que les microARN, les piARN et les siARN sont de petites molécules d’ARN de 20 à 30 nucléotides de long qui sont très bien conservées au cours de l’évolution. Elles s’associent à des protéines Argonautes afin de former un complexe effecteur appelé RISC (RNA induced silencing complex). Ces courtes séquences, ne codant pour aucune protéine, agissent comme de puissants régulateurs de l’expression des gènes. De nombreuses évidences supportent qu’une dérégulation du niveau d’expression de ces courts ARN non codants contribue au développement et au maintien de nombreuses pathologies telles que le cancer. De ce fait, il est essentiel pour la cellule de contrôler la stabilité des courts ARN non codants. Le contrôle de la maturation et de la stabilité de ces courts ARN non codants sont des mécanismes peu connus. L’objectif principal de mon doctorat a donc été de mieux comprendre comment le niveau des courts ARN non codants est contrôlé. Afin d’étudier plus en détail comment le niveau des microARN est régulé, nous avons identifié la phosphatase PPM-2 (PP2Cα chez l’humain) et l’E3 ubiquitine ligase HECD-1 (HectD1 chez l’humain) comme étant de nouveaux interacteurs du complexe de dégradation des microARN. Nous avons utilisé des approches de génétique et de biologie moléculaire chez le nématode C. elegans, pour étudier le rôle de la perte de fonction de ppm-2 et d’hecd1 dans la voie des courts ARN non codants. Nos travaux ont montré que la perte de fonction de ppm-2 induit des défauts développementaux qui sont associés à des défauts de la voie des microARN. De plus, l’absence de ppm-2 exacerbe les phénotypes développementaux observés dans des animaux où la voie des microARN est altérée. De manière intéressante, chez le mutant ppm-2, nous avons constaté que d’autres voies de courts ARN non codants, telles que la voie des piARN et celle de l’endosiARN nucléaire, sont affectées. Du point de vue moléculaire, nous avons observé une déstabilisation du niveau d’expression de plusieurs protéines Argonautes dans le mutant ppm-2. En effet, ces dernières sont envoyées à la dégradation par la voie du protéasome seulement chez des animaux mutés pour ppm-2. Concernant l’étude de HECD1, nous avons remarqué que la perte de fonction de cette ubiquitine ligase entrainait une diminution de la progéniture et une létalité embryonnaire attribuable à des défauts dans la gamétogénèse. De plus, nous avons observé une accumulation de miARN fonctionnels chez des animaux mutés pour hecd-1. L’ubiquitine ligase HECD-1 pourrait être impliquée dans la transcription ou la dégradation des miARN. En conclusion, nos résultats suggèrent que PPM-2 permet de contrôler la stabilité des protéines Argonautes en les dirigeant dans une voie alternative de dégradation et que l’ubiquitine ligase HECD-1 pourrait être impliquée dans la régulation des miARN en modulant leur transcription ou leur dégradation. Mes travaux de doctorat nous ont permis de mettre en lumière un nouveau modulateur des courts ARN non codants, PPM-2, qui agit via le contrôle de la régulation des Argonautes. Les avancées de la recherche dans le domaine des courts ARN non codants pourra permettre le développement de nouvelles thérapies.<br>Les courts ARN non codants tels que les microARN, les piARN et les siARN sont de petites molécules d’ARN de 20 à 30 nucléotides de long qui sont très bien conservées au cours de l’évolution. Elles s’associent à des protéines Argonautes afin de former un complexe effecteur appelé RISC (RNA induced silencing complex). Ces courtes séquences, ne codant pour aucune protéine, agissent comme de puissants régulateurs de l’expression des gènes. De nombreuses évidences supportent qu’une dérégulation du niveau d’expression de ces courts ARN non codants contribue au développement et au maintien de nombreuses pathologies telles que le cancer. De ce fait, il est essentiel pour la cellule de contrôler la stabilité des courts ARN non codants. Le contrôle de la maturation et de la stabilité de ces courts ARN non codants sont des mécanismes peu connus. L’objectif principal de mon doctorat a donc été de mieux comprendre comment le niveau des courts ARN non codants est contrôlé. Afin d’étudier plus en détail comment le niveau des microARN est régulé, nous avons identifié la phosphatase PPM-2 (PP2Cα chez l’humain) et l’E3 ubiquitine ligase HECD-1 (HectD1 chez l’humain) comme étant de nouveaux interacteurs du complexe de dégradation des microARN. Nous avons utilisé des approches de génétique et de biologie moléculaire chez le nématode C. elegans, pour étudier le rôle de la perte de fonction de ppm-2 et d’hecd1 dans la voie des courts ARN non codants. Nos travaux ont montré que la perte de fonction de ppm-2 induit des défauts développementaux qui sont associés à des défauts de la voie des microARN. De plus, l’absence de ppm-2 exacerbe les phénotypes développementaux observés dans des animaux où la voie des microARN est altérée. De manière intéressante, chez le mutant ppm-2, nous avons constaté que d’autres voies de courts ARN non codants, telles que la voie des piARN et celle de l’endosiARN nucléaire, sont affectées. Du point de vue moléculaire, nous avons observé une déstabilisation du niveau d’expression de plusieurs protéines Argonautes dans le mutant ppm-2. En effet, ces dernières sont envoyées à la dégradation par la voie du protéasome seulement chez des animaux mutés pour ppm-2. Concernant l’étude de HECD1, nous avons remarqué que la perte de fonction de cette ubiquitine ligase entrainait une diminution de la progéniture et une létalité embryonnaire attribuable à des défauts dans la gamétogénèse. De plus, nous avons observé une accumulation de miARN fonctionnels chez des animaux mutés pour hecd-1. L’ubiquitine ligase HECD-1 pourrait être impliquée dans la transcription ou la dégradation des miARN. En conclusion, nos résultats suggèrent que PPM-2 permet de contrôler la stabilité des protéines Argonautes en les dirigeant dans une voie alternative de dégradation et que l’ubiquitine ligase HECD-1 pourrait être impliquée dans la régulation des miARN en modulant leur transcription ou leur dégradation. Mes travaux de doctorat nous ont permis de mettre en lumière un nouveau modulateur des courts ARN non codants, PPM-2, qui agit via le contrôle de la régulation des Argonautes. Les avancées de la recherche dans le domaine des courts ARN non codants pourra permettre le développement de nouvelles thérapies.<br>Small non-coding RNAs, like microRNAs, piRNAs or siRNAs, are small RNA molecules, 20 to 30 nucleotides long that are conserved during evolution. They form an induced silencing complex (RISC) in association with Argonaute proteins to regulate gene expression. Small non-coding RNAs are involved in the regulation of genes implicated in cell proliferation, differentiation and development. Many evidences support that deregulation of the expression level of those small non-coding RNAs contribute to the development of pathologies such as cancer. It is therefore essential for cells to control small non-coding RNA stability. The control of maturation and stability of those small molecules are poorly understood. The main objective of my doctorate was to better understand how the stability of small non-coding RNAs is controlled. In order to study in more detail how miRNAs are regulated, we identified two factors involved in miRNA turnover in C. elegans. We found that the phosphatase PPM-2 (PP2Cα in human) and the E3 ubiquitin ligase HECD-1 (HectD1 in human) are new components of the miRNA degradation complex. Using the power of the nematode C. elegans and molecular biology, we characterized the role of the loss of function of PPM-2 and HECD-1 in small non-coding RNA pathways. Loss of this phosphatase induces developmental defects which are associated with a defect in the miRNA pathway. Genetically, the phosphatase mutant exacerbates the phenotypes that are observed in animals where the miRNA pathway is affected. Interestingly, we further observed that the loss of the phosphatase affects other small non-coding RNA pathways like the piRNA and the siRNA pathways. At the molecular level, we observed a decrease in the expression level of many Argonaute proteins in phosphatase mutant animals. Upon blocking proteasomal degradation with MG132, we noticed that Argonaute proteins are sent to proteasomal degradation in phosphatase mutant animals. Concerning HECD-1, we noticed that the loss of function of the E3 ubiquitin ligase leads to the decrease of progeny and embryonic lethality due to defects in gametogenesis. Moreover, we observed an accumulation of functional miRNAs. This protein can be implicated in transcription or turnover of miRNAs. VIIn conclusion, our data suggest that PPM-2 controls the stability of Argonaute proteins by sending them through an alternative degradation pathway and that HECD-1 could be implicated in miRNA regulation by modulating their transcription or degradation. My doctoral work helped to highlight a new modulator of small non-coding RNAs, PPM-2, which acts through the regulation of Argonaute protein. A better understanding of the mechanisms controlling the stability and the function of these strong regulators will be useful to develop new therapies.<br>Small non-coding RNAs, like microRNAs, piRNAs or siRNAs, are small RNA molecules, 20 to 30 nucleotides long that are conserved during evolution. They form an induced silencing complex (RISC) in association with Argonaute proteins to regulate gene expression. Small non-coding RNAs are involved in the regulation of genes implicated in cell proliferation, differentiation and development. Many evidences support that deregulation of the expression level of those small non-coding RNAs contribute to the development of pathologies such as cancer. It is therefore essential for cells to control small non-coding RNA stability. The control of maturation and stability of those small molecules are poorly understood. The main objective of my doctorate was to better understand how the stability of small non-coding RNAs is controlled. In order to study in more detail how miRNAs are regulated, we identified two factors involved in miRNA turnover in C. elegans. We found that the phosphatase PPM-2 (PP2Cα in human) and the E3 ubiquitin ligase HECD-1 (HectD1 in human) are new components of the miRNA degradation complex. Using the power of the nematode C. elegans and molecular biology, we characterized the role of the loss of function of PPM-2 and HECD-1 in small non-coding RNA pathways. Loss of this phosphatase induces developmental defects which are associated with a defect in the miRNA pathway. Genetically, the phosphatase mutant exacerbates the phenotypes that are observed in animals where the miRNA pathway is affected. Interestingly, we further observed that the loss of the phosphatase affects other small non-coding RNA pathways like the piRNA and the siRNA pathways. At the molecular level, we observed a decrease in the expression level of many Argonaute proteins in phosphatase mutant animals. Upon blocking proteasomal degradation with MG132, we noticed that Argonaute proteins are sent to proteasomal degradation in phosphatase mutant animals. Concerning HECD-1, we noticed that the loss of function of the E3 ubiquitin ligase leads to the decrease of progeny and embryonic lethality due to defects in gametogenesis. Moreover, we observed an accumulation of functional miRNAs. This protein can be implicated in transcription or turnover of miRNAs. VIIn conclusion, our data suggest that PPM-2 controls the stability of Argonaute proteins by sending them through an alternative degradation pathway and that HECD-1 could be implicated in miRNA regulation by modulating their transcription or degradation. My doctoral work helped to highlight a new modulator of small non-coding RNAs, PPM-2, which acts through the regulation of Argonaute protein. A better understanding of the mechanisms controlling the stability and the function of these strong regulators will be useful to develop new therapies.

L'ubiquitination joue un rôle clé dans le maintien de l'homéostasie cellulaire en régulant la fonction et/ou la dégradation des protéines. Les E3 ubiquitine ligases sont les acteurs clés du mécanisme d'ubiquitination en transférant la molécule d'ubiquitine sur le substrat. Parmi les E3 ubiquitine ligases, WWP1 est fréquemment amplifiée dans de nombreux cancers, notamment les cancers mammaires, et est associée à un mauvais pronostic. En accord avec ces observations, WWP1 favorise la survie et la prolifération cellulaire et inhibe l'apoptose. Mes travaux de thèse ont permis d'identifier la protéine CYYR1, qui n'avait jusqu'à ce jour pas de fonction cellulaire connue, comme étant un nouveau régulateur de la E3 ubiquitine ligase WWP1. Nous montrons que CYYR1 interagit avec WWP1 de façon PY/WW-dépendante au niveau des endosomes tardifs, et que cette interaction conduit à l'induction de l'auto-polyubiquitination en chaîne K63 de WWP1 et à sa dégradation lysosomale. Par ailleurs, nous observons que la protéine à domaine UIM, ANKRD13A, lie CYYR1 et la forme polyubiquitinée de WWP1 et est impliquée dans la dégradation de WWP1 induite par CYYR1. De plus, nous montrons que l'expression de CYYR1 limite la croissance des cellules cancéreuses mammaires dépendante et indépendante d'ancrage via ses motifs PY. Enfin, nous observons que l'expression de CYYR1 est diminuée dans les cancers mammaires et associée à un pronostic favorable. Ensemble, mes travaux de thèse ont permis de mettre en évidence un nouveau mécanisme de régulation de la E3 ubiquitine ligase WWP1 impliquée dans la tumorigenèse<br>Ubiquitination plays a crutial role in cellular homeostasis by regulating the function and/or the degradation of proteins. E3 ubiquitin ligases are key component of the ubiquitination reaction by transferring the ubiquitin molecule on the substrate. Among E3 ubiquitin ligases, WWP1 is frequently amplified in numerous cancers, such as breast cancers, and associated with poor prognosis. Consistent with these observations, WWP1 stimulates cell proliferation and survival and inhibits apoptosis. My thesis works led to identify the protein CYYR1, which as to date no know cellular function, as a novel regulator for the E3 ubiquitin ligase WWP1. We show that CYYR1 interacts with WWP1 in a PY/WW-dependent manner at late endosomes and that this interaction leads to induce the K63-linked auto-polyubiquitination of WWP1 resulting to its lysosomal degradation. Furthermore, we observe that the UIM-containing protein ANKRD13A binds CYYR1 and the polyubiquitinated form of WWP1 and is implicated in CYYR1-mediated WWP1 degradation. Moreover, we show that CYYR1 limits breast cancer anchorage-dependent an independent cell growth via its PY motifs. Finally, we highlight that CYYR1 expression is decreased in breast cancer and is associated with beneficial clinical outcome. Taken together, my thesis works describe a novel mechanism of regulation for the E3 ubiquitin ligase WWP1 implicated in tumorigenesis

Les facteurs de transcription NFAT (facteur nucléaire des cellules T activées) jouent un rôle physiologique important dans le développement et le fonctionnement de nombreux organes, notamment dans le système immunitaire et le système nerveux. Par conséquent, leur dérégulation a été impliquée dans diverses maladies humaines telles que le cancer, les maladies neurodégénératives et les maladies auto-immunes. La régulation de l'activité de NFAT par translocation nucléo-cytoplasmique a été largement étudiée. En revanche, la régulation du niveau protéique de NFAT par le système ubiquitine-protéasome est encore mal comprise. Pourtant, les protéines NFAT ont une durée de vie courte et la régulation de leur stabilité est donc essentielle pour le contrôle de leur activité.Dans une étude précédente, mon groupe a montré que l'E3 ubiquitine-ligase Trim17 se lie à NFATc3 mais ne favorise pas son ubiquitination et tend plutôt à stabiliser la protéine. Les résultats préliminaires obtenus suggéraient que Trim39, un partenaire de Trim17, pourrait être une E3 ubiquitine-ligase pour NFATc3 et que la SUMOylation de NFATc3 modulait sa stabilité. L'objectif de ma thèse était donc de comprendre les mécanismes par lesquels Trim39, Trim17 et SUMO régulent la stabilité de NFATc3.Au cours de ma thèse, j'ai caractérisé Trim39 comme une E3 ubiquitine-ligase de NFATc3. En effet, mes résultats indiquent que la surexpression de Trim39, mais pas de son mutant inactif, induit l'ubiquitination de NFATc3 dans les cellules. En revanche, la déplétion de Trim39 endogène diminue le niveau d'ubiquitination de NFATc3. La protéine Trim39 recombinante induit directement l'ubiquitination de NFATc3 in vitro. De plus, la surexpression de Trim39 diminue les niveaux protéiques de NFATc3 alors que la déplétion de Trim39 les augmente. J'ai également montré que Trim17 inhibe l'ubiquitination de NFATc3 induite par Trim39, à la fois dans les cellules et in vitro. Trim17 agit à la fois en réduisant l'activité E3 ubiquitine-ligase intrinsèque de Trim39 et en empêchant l'interaction entre NFATc3 et Trim39. En outre, j'ai montré qu'un mutant de NFATc3 ne pouvant être SUMOylé est moins ubiquitiné et plus stable que la forme sauvage de NFATc3, ce qui suggère que la SUMOylation de NFATc3 est importante pour son ubiquitination et sa dégradation. En outre, j'ai identifié un motif d'interaction à SUMO (SIM) dans la séquence de Trim39, par lequel Trim39 lie les polymères de SUMO2. La mutation de ce SIM dans Trim39 ou des sites consensus de SUMOylation dans NFATc3 diminue l'interaction entre Trim39 et NFATc3, et l'ubiquitination de NFATc3 induite par Trim39. Ces résultats suggèrent fortement que Trim39 reconnaît et ubiquitine préférentiellement les formes SUMOylées de NFATc3 et agit donc comme une « E3 ubiquitine-ligase guidée par SUMO » (STUbL) pour NFATc3. Enfin, nous avons mesuré l'impact de ces mécanismes sur la fonction physiologique de NFATc3. J'ai tout d'abord montré que Trim39 diminue l'activité transcriptionnelle de NFATc3. En outre, à l'aide de cultures primaires de neurones granulaires du cervelet, nous avons montré que la mutation des sites de SUMOylation de NFATc3 et la déplétion de Trim39 endogène aggravent l'apoptose neuronale, probablement en stabilisant la protéine NFATc3. En conclusion, l’ensemble de mes données indiquent que Trim39 module l'apoptose neuronale en agissant comme une STUbL pour NFATc3 et en contrôlant sa stabilité<br>NFAT (Nuclear factor of activated T cells) transcription factors play important physiological roles in the development and function of many organs, notably in the immune system and nervous system. As a consequence, their dysregulation has been implicated in various human diseases such as cancer, neurodegenerative diseases, and auto-immune diseases. The regulation of NFAT activity by calcium-dependent nuclear-cytoplasmic shuttling has been extensively studied. In contrast, the regulation of NFAT protein level by the ubiquitin-proteasome system is still poorly understood. However, NFATs are short-lived proteins and regulation of their stability is critical for controlling their activity.In a previous study, my group has shown that the E3 ubiquitin-ligase Trim17 binds NFATc3 but does not promote its ubiquitination and rather stabilizes it. Preliminary results suggested that Trim39, a partner of Trim17, might be an E3 ubiquitin-ligase for NFATc3 and that SUMOylation of NFATc3 might modulate its stability. Therefore, the goal of my PhD was to understand the mechanisms through which Trim39, Trim17, and SUMO regulate the stability of NFATc3.During my PhD, I have characterized Trim39 as an E3 ubiquitin-ligase of NFATc3. Indeed, my results indicate that overexpression of Trim39, but not its inactive mutant, induces the ubiquitination of NFATc3 in cells. In contrast, silencing of endogenous Trim39 decreases the ubiquitination level of NFATc3. Recombinant Trim39 directly induces the ubiquitination of NFATc3 in vitro. Moreover, overexpression of Trim39 decreases the protein levels of NFATc3 whereas the silencing of Trim39 increases it. I have also shown that Trim17, which can bind Trim39, inhibits Trim39-mediated ubiquitination of NFATc3, both in cells and in vitro. Trim17 acts by both reducing the intrinsic E3 ubiquitin-ligase activity of Trim39 and by preventing the interaction between NFATc3 and Trim39. Furthermore, I found that a SUMOylation-deficient mutant of NFATc3 is less ubiquitinated and more stable than the wild type NFATc3, suggesting that SUMOylation of NFATc3 is important for its ubiquitination and degradation. Importantly, I identified one SUMO interacting motif (SIM) in the sequence of Trim39 through which Trim39 binds SUMO2 polymers via one of these SIMs. Mutation of this SIM in Trim39 or SUMOylation consensus sites in NFATc3 decreased the interaction between Trim39 and NFATc3, and the ubiquitination of NFATc3 mediated by Trim39. These results strongly suggest that Trim39 binds and ubiquitinates preferentially the SUMOylated forms of NFATc3 and therefore acts as a SUMO-targeted E3 ubiquitin-ligase (STUbL) for NFATc3. Finally, we have measured the impact of these mechanisms on the physiological function of NFATc3. I first found that Trim39 decreases the transcriptional activity of NFATc3. Furthermore, using primary cultures of cerebellar granule neurons as a model, we have shown that the mutation of the SUMOylation sites of NFATc3 and silencing of endogenous Trim39 enhances neuronal apoptosis, probably by stabilizing the NFATc3 protein. Taken together, these data indicate that Trim39 modulates neuronal apoptosis by acting as a STUbL for NFATc3 and by controlling its stability

La division cellulaire est l’un des processus cellulaires les plus complexes. Pour que cette division se déroule correctement, la cellule doit répliquer de manière fiable l’intégralité de son génome. Durant ce processus, la réplication de l’ADN est initiée a des sites prédéfinis du génome, appelés « origines de réplication ». Vu qu’un dysfonctionnement de l'activité des origines est lié à plusieurs pathologies humaines, leur activation doit être hautement régulée. Plusieurs protéines ont été trouvées aux origines de la réplication, mais aucune n’explique comment ces origines sont reconnues et sélectionnées pour l’activation. Notre groupe de recherche vise à comprendre comment les origines de réplication sont régulées dans les cellules de métazoaires. Dans ce but, une approche protéomique a été réalisée pour définir l'interactome des origines de réplication humaine, dans l’objectif d'identifier de nouveaux facteurs qui pourraient être impliqués dans la régulation des origines. À l'aide de cette approche, une nouvelle ubiquitine ligase, nommée OBI1 (ORC-ubiquitine-ligase-1), a été identifiée avant mon arrivée au laboratoire. OBI1 se lie au complexe de reconnaissance des origines (complexe ORC) et mon projet vise à mieux caractériser le rôle de cette nouvelle protéine dans la réplication de l'ADN. Notre stratégie expérimentale est basée sur deux modèles différents: un modèle in vivo de cellules humaines en culture et un système de réplication de l'ADN in vitro dérivé d'œufs de Xénope.Nos analyses sur des cellules humaines ont d’abord révélé qu’OBI1 était crucial pour la prolifération cellulaire. Cette observation a été ensuite attribuée à son rôle dans la réplication de l’ADN et plus précisément dans l’activation des origines de réplication. En effet, la déplétion d’OBI1 a montré une diminution de recrutement à la chromatine de facteurs impliqués dans l’activation des origines. De plus, une analyse fonctionnelle a montré qu'OBI1 multiubiquitine ORC3 et ORC5, deux sous-unités du complexe ORC. Cette ubiquitination a été ensuite liée au rôle d’OBI1 dans l’activation des origines de réplication, après que la surexpression des mutants ORC3 / 5 non-ubiquitinables ait donné des résultats similaires à ceux observés lors de la déplétion d’OBI1. Dans l’ensemble, nos résultats ont démontré qu’OBI1 est une protéine essentielle à l’activation des origines et nous ont permis de mettre en place une hypothèse suggérant qu’en ubiquitinant ORC3/5, OBI1 pourrait jouer un rôle dans la sélection des origines destinées à l’activation, parmi toutes les origines définies antérieurement. Après cette étude, maintenant publiée, nous avons voulu aborder le rôle de la multiubiquitination des ORC dans l’activation des origines. Nos expériences préliminaires suggèrent un rôle de l'histone acétyl-transférase (HAT) GCN5 / KAT2A.Dans la deuxième partie de mon projet, nous avons utilisé le système in vitro, basé sur des extraits d'œufs de xénope, pour étudier le rôle de l'OBI1 et de l'ubiquitination dans l'activation des origines de réplication. Nos analyses ont confirmé la conservation d’OBI1 chez Xenopus Laevis et son recrutement a la chromatine lors de la réplication. Nous avons montré que l'ubiquitination se produit sur la chromatine lors de l'activation de l'origine. De plus, en utilisant des inhibiteurs de E1, nous avons constaté que l’ubiquitination est importante pour l’activation des origines. De façon intéressante, la déplétion de OBI1 dans ce système embryonnaire a suggéré un rôle diffèrent d’OBI1 dans l’activation des origines dans le système embryonnaire comparé aux conditions plus somatiques.Finalement, la découverte de ce nouveau facteur d'initiation a fourni des informations essentielles sur le rôle de l'ubiquitination et d’OBI1 dans l'activation et la sélection des origines de réplication. Une telle sélection pourrait également participer à la régulation du « timing » de la réplication de l'ADN<br>Cell division is one of the most complex processes a cell undergoes. For this to happen properly, the genetic material stored in a cell must be faithfully copied or replicated. During this process, DNA replication is initiated at pre-defined sites in the genome, called "origins of replication". The activation of these origins is highly regulated, as a dysfunction in origin activity is linked to several human pathologies. Several proteins have been found at replication origins, but none of them explain how to be activated origins are recognized and selected. Our research group aims to understand how DNA replication origins are regulated in metazoan cells, to this aim, a proteomic approach was performed to define the interactome of human replication origins. Our goal was to identify new factors that could be involved in replication origin regulation. Using this methodology, a novel E3 ubiquitin ligase, named OBI1 (for ORC-ubiquitin-ligase-1), was identified prior to my arrival in the laboratory. OBI1 binds the origin recognition complex (ORC complex) and my project aimed at further characterizing the role of this new protein in DNA replication. Our experimental strategy used two different model systems: an in-vivo model based on human cells in culture, and an in-vitro DNA replication system derived from Xenopus eggs.Our analyses in human cells revealed that OBI1 was a crucial gene involved in cellular proliferation, this observation was later attributed to OBI1’s role in DNA replication and more specifically, to replication origin activation. Indeed, OBI1 knockdown resulted in a deficient origin firing and a decrease in the chromatin recruitment of factors involved in origin firing. A further functional analysis showed that OBI1 multiubiquitylates two subunits of the ORC complex, ORC3 and ORC5. This ubiquitylation was directly linked to OBI1’s role in origin firing, after the over-expression of non-ubiquitylable ORC3/5 mutants yielded similar results to OBI1’s knock down. Altogether, our results demonstrated that OBI1 encoded for a protein essential for origin activation, and allowed us to propose its main role: by multiubiquitylating a subset of the ORC complex, OBI1 could select the replication origins to be activated amongst all the potential replication origins set in G1 phase of the cell cycle. After this set of experiments, now published, we wanted to address the mechanistic impact of the multiubiquitylation of ORC on origin activation. Our preliminary experiments suggest a role of the histone acetyl-transferase (HAT) GCN5/KAT2A in the “OBI1 pathway”In the second part of my project, we used the in vitro DNA replication system, based on Xenopus laevis egg extracts, to study the role of OBI1 and ubiquitylation in origin activation. Our in-vitro analyses confirmed the conservation of OBI1 in Xenopus Laevis and its recruitment to the chromatin during DNA replication. We showed that de novo ubiquitylation takes place on chromatin during origin activation. Moreover, using E1 inhibitors, we found that active ubiquitylation is important for efficient origin firing. Interestingly, our loss of function experiments suggested that OBI1’s impact on origin activation could defer in early development when compared to somatic-like conditions.Taken together, the discovery of this new replication initiation factor provided key information on the role of ubiquitylation in general and OBI1 in particular on origin activation and selection. Such selection could participate as well in the regulation of the timing of DNA replication

Les modifications post-traductionnelles des protéines (phosphorylation, l'acétylation ou l'ubiquitinylation) permettent de réguler leur activité, stabilité, localisation ou interactions avec d'autres facteurs. Les complexes permettant la modification par l'ubiquitine ou Sumo bien que d'organisation similaire sont composés de protéines différentes : une ligase El qui active le résidu, une ligase E2 permettant le transfert de l'ubiquitine sur le substrat et une ligase E3 qui assure la spécificité de reconnaissance du substrat. Plusieurs familles de ligases E3 ont été décrites mais seule la famille de protéines à domaine RING Finger présente des membres impliqués dans les complexes de la sumoylation et de l'ubiquitinylation. Afin de caractériser de nouveaux partenaires des ligases à domaine RING Finger hSIAHl et hSIAH2 (human Seven In Absentia homolog), nous avons développé une expérience de double-hybride chez la levure en utilisant hSIAH2 pour appât. La caractérisation des partenaires ainsi isolés a fait l'objet de mon projet de thèse. J'ai mis en évidence des protéines impliquées dans l'ubiquitinylation (Ubiquitine, Ubc5 ou hSIAH) et la sumoylation (PIAS, SUMO et Ubc9). J'ai ainsi démontré que hSIAH2 est capable de former des homodimères et des hétérodimères avec hSIAH et que cette dimérisation permet de réguler la propre stabilité des deux protéines. D'autre part, j'ai montré que hSIAH2 catalyse l'ubiquitinylation de PIAS et sa dégradation par le protéasome. L'ensemble de ce travail a mis en évidence le rôle spécifique de hSIAH2 dans la régulation de la stabilité d'intermédiaires essentiels, à la fois, aux complexes d'ubiquitinylation et de sumoylation<br>After synthesis, proteins are targeted to post-translational modifications such as acetylation, phosphorylation or ubiquitination. These mechanisms regulate their function, stability, localization or interaction with partners. Modification process by ubiquitin or sumo named ubiquitination or sumoylation respectively involve complexes with similar organization but compose of different enzymes. Their organization relies on Sumo or ubiquitin activating El enzyme, transferring E2-ligase and E3-ligase or sub-complex conferring the substrate specific récognition. El-ligase is unique for each complex, whereas E2 and E3-ligases are multiple. Among E3-ligase families, RING Finger protein family only has been involved in both modifications complexes. Two human homologs of Drosophila Seven In Absentia (hSIAHl et hSIAH2), belong to RING Finger E3-ligase family. In a yeast two hybrid assay, we have identified new SIAH interacting proteins. Their characterization has been the purpose of my PhD project. We have characterized partners implicated in both ubiquitination (ubiquitin, Ubc5 or hSIAH) and sumoylation (Sumo, Ubc9 and PIAS) pathways. In a first attempt, I have demonstrated that hSIAH proteins can form homo- or hetero-dimers. Dimerization régulates their stability via a proteasome dependent degradation. I have also demonstrated that hSIAH2 catalyzes the proteasome dependent degradation of PIAS1, a sumo E3-ligase. Altogether this study evidences an important rôle for hSIAH2 in the regulation of the stability of ubiquitination and sumolation complexes

La GTPase Rac1 est une protéine de signalisation intracellulaire qui joue notamment un rôle clé dans la prolifération cellulaire. Notre laboratoire a montré que la toxine CNF1, produite par les Escherichia coli pathogènes, catalyse l’activation de Rac1. Nous avons également identifié le rôle de la E3 ubiquitine-ligase HACE1, un suppresseur de tumeur avéré, dans la régulation par ubiquitylation de Rac1 actif. S’il est prouvé que la forme activée de Rac1 est une cible d’HACE1, le mode d’interaction de ces deux protéines reste à définir ainsi que le rôle de ces interactions dans l’infection et le cancer. L’objectif de mon travail a été de caractériser les interactions moléculaires entre HACE1 et Rac1. Nous avons testé l’hypothèse que des mutations ponctuelles d’HACE1 identifiées dans les cancers pourraient interférer avec son interaction avec Rac1 et sa capacité de contrôle de la croissance cellulaire. J’ai ainsi pu mettre en évidence que 13 mutations somatiques d’HACE1 issues de tumeurs séquencées altèrent sa fonction de contrôle de la croissance cellulaire. De plus, l’étude de ces mutations nous a permis d’identifier un groupe d’acides aminés, situés sur les ankyrin-repeats 5 à 7 d’HACE1, qui contrôle l’interaction d’HACE1 avec Rac1 et de ce fait son ubiquitylation. Enfin dans cette étude nous précisons le rôle du domaine intermédiaire d’HACE1 (MID) dans la spécificité d’interaction de la ligase avec la forme active de Rac1. In fine, la caractérisation de mutants d’interaction entre HACE1 et Rac1 ainsi que l’effet de la toxine CNF1 sur cet axe de signalisation doit nous renseigner sur l’importance de cette voie de régulation dans le cancer et l’infection<br>The small GTPase Rac1 plays a key role in various intracellular signaling pathways including cell proliferation. Our laboratory has shown that the CNF1 toxin, produced by pathogenic Escherichia coli, catalyzes the activation of Rac1. We also identified the role of the E3 ubiquitin-ligase HACE1, a tumor suppressor, in the regulation by ubiquitylation of active Rac1. If the activated form of Rac1 is proved to be a target of HACE1, the mode of interaction between these two proteins remains to be define as well as the role of these interactions in infection and cancer. The aim of my work was to characterize the molecular interactions between HACE1 and Rac1. We tested the hypothesis that HACE1 point mutations identified in cancers could interfere with its interaction with Rac1 and its ability to control cell growth. We showed that 13 cancer-associated somatic mutations of HACE1, led to a defective control of cell proliferation. Moreover, the study of these mutations allowed us to identify a group of amino acids, located on the ankyrin-repeats 5 to 7 of HACE1, which controls the interaction of HACE1 with Rac1 and thus its ubiquitylation. We also identified a role for the intermediate domain of HACE1 (MID) in conferring the specificity of association of HACE1 to the active form of Rac1. Ultimately, the characterization of interaction mutants between HACE1 and Rac1 as well as the effect of the CNF1 toxin on this signaling axis will give us more insight on this regulatory pathway in cancer and infection

L’incidence du mélanome a augmenté de façon considérable lors des trente dernières années avec un doublement tous les dix ans. Le mélanome ne représente que 5% des cancers cutanés mais entraîne 80% de décès, ce qui constitue un problème majeur de santé publique. En effet, cette tumeur est extrêmement agressive et possède un fort potentiel métastatique. Dès l’apparition de métastases, le pronostic vital devient fortement défavorable. Malgré des avancées thérapeutiques majeures, de nombreux patients sont encore réfractaires à ces nouveaux traitements. La compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de cette tumeur reste donc un enjeu de premier ordre. Le séquençage d'exomes a conduit à l'identification d'une mutation dans le gène RAC1 (la mutation P29S) constituant une des mutations somatiques les plus fréquentes dans le mélanome (après les mutations BRAFV600, NRASQ61 et NF1). RAC1 est une petite GTPase qui fonctionne dans plusieurs processus cellulaires. Dans des conditions physiologiques, l'activité de RAC1 est principalement contrôlée par des protéines activatrices de l'activité GTPase (GAPs) et des facteurs d'échange Nucléotidique (GEF). GAPs et GEFs contrôlent le niveau de RAC1-GTP et régulent donc son activité. L'activité de RAC1 est aussi dépendante de son niveau d'expression protéique qui est contrôlé par des E3 ubiquitine ligases, parmi lesquelles HACE1. HACE1 est considérée comme un suppresseur de tumeur. De façon inattendue, les données obtenues montrent clairement que HACE1 favorise les propriétés migratoires et tumorigéniques des cellules de mélanome<br>Melanoma incidence has considerably increased over the last thirty years, with a doubling every ten years. Melanoma accounts for only 5% of cutaneous cancers but causes more than 80% of deaths, which is a major public health problem. Indeed, this tumor is extremely aggressive and has a high metastatic potential. After the onset of metastases, the prognosis becomes highly unfavorable. Despite major therapeutic advances, many patients are still refractory to these new treatments. Understanding the mechanisms involved in the development of this tumor and the identification of new therapies remain a major issue. The sequencing of exomes led to the identification of a mutation in the RAC1 gene (P29S) constituting one of the most frequent somatic mutations in melanoma (after the BRAFV600, NRASQ61 and NF1 mutations). RAC1 is a small GTPase that is involved in several key cellular processes. Under physiological conditions, the activity of RAC1 is mainly controlled by GTPase activating proteins (GAPs) and Nucleotide Exchange (GEF) exchange factors. GAPs and GEFs control the level of RAC1- GTP and thus regulate its activity. The activity of RAC1 is also dependent on its protein level of expression which is controlled by E3 ubiquitin ligases, including HACE1. HACE1 is considered a tumor suppressor. Unexpectedly, our data clearly show that HACE1 promotes migratory and tumorigenic properties of melanoma cells. Indeed, inhibition of HACE1 alters migration of melanoma cells in vitro, as well as in vivo pulmonary colonization in mice. Transcriptomic analysis of 4 melanoma cell lines demonstrated that HACE1 suppression inhibits ITGAV and ITGB1 expression

Les cellules différenciées peuvent changer de destin cellulaire de manière induite ou naturelle. Afin de comprendre et connaître les acteurs et mécanismes contrôlant les processus de reprogrammation, notre laboratoire étudie le changement d'identité (ou transdifférenciation, Td) naturel d’une cellule épithéliale rectale (nommée Y) en motoneurone (nommé PDA) chez Caenorhabditis elegans. Les travaux préliminaires ont montré qu’il existe une synergie entre les modifications d’histone (jmjd-3.1 et wdr-5.1) et l’ubiquitination (sel-10). SEL-10 est une ubiquitine ligase E3 possédant un domaine Fbox et une répétition de domaines WD40. Dans cette étude, nous avons pu mettre en évidence : i) une implication du domaine Fbox, des indications sur la localisation intracellulaire de SEL-10 et un rôle inattendu du protéasome au sein de la Td. ii) un rôle de SEL-10 dans la robustesse de la Td (résistance aux stress environnementaux). iii) sel-10, jmjd-3.1 et wdr-5.1 agissent sur la transcription de gènes impliqués dans la transdifférenciation (testé par smFISH). Ainsi qu’une caractérisation du motif d’expression marqueur de Td cog-1 au cours de la redifférenciation<br>Differentiated cells can change their cellular fate induced or naturally. In order to understand the mechanisms controlling reprogramming processes, our laboratory is studying the natural change in identity (or transdifferentiation, Td) of a rectal epithelial cell (named Y) and motor neuron (named PDA) in Caenorhabditis elegans.Preliminary work has shown that there is a synergy between histone modifications (jmjd-3.1 and wdr-5.1) and ubiquitination (sel-10). SEL-10 is an E3 ubiquitin ligase with a Fbox domain and WD40 repeat domain.In this study, we highlight: i) the Fbox domain involvement in the Td, indications about the intracellular localization of SEL-10 and an unexpected role of the proteasome within TD. ii) a role of SEL-10 in the robustness of the Td. iii) sel-10, jmjd-3.1 and wdr-5.1 act on gene transcription in transdifferentiation. This one was tested by smFISH and allowed the characterization of the cog-1 transdifferentiation marker expression pattern during redifferentiation