Tesis sobre el tema "Tumor pathologies"

2014 - 2015
Over the last 30 years a growing interest has been direct toward the biomolecular recognition of calixarene derivatives and more in particular to the interaction with druggable target(s).1,2 The aim of this PhD thesis was the synthesis and the study of calixarenes that were able to interact with biomolecules involved in tumor pathologies. One of the main topic of this work was the synthesis of calix[4]arene conjugates bearing pyrenylisoxazolidine moieties at the exo rim which could act as potential DNA intercalators. The in vitro cytotoxic activity against different human tumor cell lines was also tested. Moreover, the biomolecular recognition abilities of designed calixarenes was studied through a chemical proteomics approach. As calix[n]arene scaffolds are particularly suitable for the synthesis of multivalent ligands,3 the attention was also focused on the synthesis of multivalent iminosugar-calix[8]arene conjugates for the inhibition of glycosidases. The synthesis, characterization and all the biomolecular recognition studies were herein described. [edited by author]
XIV n.s.

Cette thèse explore l'application de nouvelles approches de machine learning (ML) pour l'analyse de données en pathologie numérique, en se concentrant sur des pathologies tumorales rares. Trois études principales sont détaillées, chacune utilisant diverses techniques de ML pour améliorer la compréhension et le traitement de ces maladies.La première étude se concentre sur les lymphomes primitifs du système nerveux central (SNC), un cancer rare du système nerveux central. L'objectif est d'analyser des lames numériques pour prédire l'évolution clinique des patients et identifier des sous-groupes moléculaires spécifiques. Cette analyse permet d'améliorer la stratification des patients, offrant l'espoir de traitements plus personnalisés. L'utilisation de techniques avancées de ML a permis d'identifier des modèles distincts d'évolution clinique et de classification moléculaire.La deuxième étude porte sur les tumeurs ovariennes liées à un syndrome neurologique paranéoplasique anti-Yo, une condition rare où des tumeurs ovariennes provoquent des symptômes neurologiques extit{via} des réponses immunitaires aberrantes. En utilisant des approches de segmentation automatique et d'analyse de texture par pathomique, cette étude a permis de classifier les tumeurs associées à une dégénérescence cérébelleuse paranéoplasique anti-Yo. Les résultats montrent une identification prometteuse de ces syndromes et des différences significatives dans l'infiltrat immunitaire, ouvrant de nouvelles avenues pour comprendre les interactions entre tumeurs et système immunitaire.La troisième étude propose une nouvelle méthode de normalisation des images de lames numériques en coloration hématoxyline-éosine (HE) basée sur le transport optimal. Cette méthode vise à améliorer la comparabilité et la qualité des images pour les tâches de classification et de segmentation. En démontrant l'intérêt de cette approche, l'étude montre comment le transport optimal peut standardiser les images de pathologie numérique, facilitant une analyse plus précise et fiable. Cette avancée technique représente un pas important vers l'intégration de méthodes de ML robustes dans la pratique clinique quotidienne.Ces études montrent le potentiel des techniques de ML pour améliorer la classification, la segmentation et l'analyse des tumeurs rares, offrant des perspectives prometteuses pour la recherche clinique et le traitement personnalisé des patients
This thesis explores the application of new machine learning (ML) approaches for data analysis in digital pathology, focusing on rare tumor pathologies. Three main studies are detailed, each using various ML techniques to improve the understanding and treatment of these diseases.The first study focuses on primary CNS lymphomas, a rare cancer affecting the central nervous system. The objective is to analyze digital slides of these lymphomas to predict the clinical outcomes of patients and identify specific molecular subgroups. This analysis aims to improve patient stratification and offer more personalized treatments. The use of advanced ML techniques has enabled the identification of distinct clinical progression patterns and molecular classification.The second study addresses ovarian tumors linked to anti-Yo paraneoplastic neurological syndrome, a rare condition where ovarian tumors cause neurological symptoms through aberrant immune responses. By utilizing automatic segmentation and pathomic texture analysis approaches, this study has classified tumors associated with paraneoplastic cerebellar degeneration. The results show promising identification of these syndromes and significant differences in immune infiltrates, opening new avenues for understanding interactions between tumors and the immune system.The third study proposes a new method for normalizing digital slide images in HE staining based on optimal transport. This method aims to improve the comparability and quality of images used for classification and segmentation tasks. By demonstrating the benefits of this approach, the study shows how optimal transport can help standardize digital pathology images, facilitating more precise and reliable analysis. This technical advancement represents an important step toward integrating robust ML methods into everyday clinical practice.These studies highlight the potential of ML techniques to enhance the classification, segmentation, and analysis of rare tumors, offering promising prospects for clinical research and personalized patient treatment

La glycogénose de type I (GSDI) est une maladie génétique rare, due à une déficience en glucose-6 phosphatase (G6Pase), enzyme clé de la production endogène de glucose. En plus des hypoglycémies sévères, la perte de l'activité G6Pase conduit à l'accumulation de glycogène, mais aussi de lipides dans le foie et les reins. A long-terme, la plupart des patients développent des tumeurs hépatiques et une maladie rénale chronique (MRC).Le but de cette thèse a été de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans la carcinogenèse hépatique et la MRC grâce à des modèles murins viables et uniques, avec une délétion de la G6Pase spécifiquement dans le foie ou les reins, reproduisant respectivement toutes les caractéristiques de la pathologie hépatique ou rénale.Au niveau du foie, notre étude a permis de mettre en évidence une reprogrammation métabolique « Warburg-like » très similaire à celle des cellules cancéreuses, associée à une perte des défenses cellulaires et des suppresseurs de tumeur. De plus, nous avons montré que les adénomes hépatocellulaires, se transformant ensuite en carcinomes, se développent en absence de fibrose, en accord avec l'absence d'activation des voies pro-fibrotiques. Au niveau des reins, l'étude de la MRC a mis en évidence le développement de kystes rénaux chez les souris atteintes de GSDI, observés aussi chez les patients à un stade avancé de la MRC. Finalement, une dernière étude portant sur l'activation de l'oxydation des lipides, par un traitement des souris au fénofibrate, a permis de suggérer le rôle délétère de l'accumulation des lipides dans le développement des pathologies hépatique et rénale
Glycogen storage disease type I (GSDI) is a rare genetic disease, due to a deficiency in glucose-6 phosphatase (G6Pase), a key enzyme in the endogenous glucose production. Besides severe hypoglycemia, the loss of G6Pase leads to the accumulation of glycogen and lipids in the liver and kidneys. On the long term, most patients develop hepatic tumors and chronic kidney disease (CKD).The goal of this thesis was to characterize the molecular mechanisms involved in hepatic carcinogenesis and CKD, thanks to viable and unique mouse models with specific deletion of G6Pase in the liver or kidneys, which exhibit all hallmarks of hepatic and renal pathologies, respectively.On a hepatic level, our study allowed us to highlight a « Warburg-like » metabolic reprogramming, very similar to what is observed in cancer cells, associated with a loss of cellular defenses and tumor suppressors. Furthermore, we showed that formation of hepatocellular adenoma, which transform later in carcinoma, occurs in the absence of liver fibrosis, due to the fact that pro-fibrotic pathways are not activated. In the kidneys, the study of CKD highlighted the development of renal cysts in mice with GSDI, as well as in the patients presenting an advanced stage of CKD. Finally, the last study on the activation of the oxidation of lipids, by treating the mice with fenofibrate, allowed us to suggest a deleterious role of lipid accumulation in the development of the hepatic and renal pathologies

La glycogénose de type I (GSDI) est une maladie génétique rare, due à une déficience en glucose-6 phosphatase (G6Pase), enzyme clé de la production endogène de glucose. En plus des hypoglycémies sévères, la perte de l'activité G6Pase conduit à l'accumulation de glycogène, mais aussi de lipides dans le foie et les reins. A long-terme, la plupart des patients développent des tumeurs hépatiques et une maladie rénale chronique (MRC).Le but de cette thèse a été de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans la carcinogenèse hépatique et la MRC grâce à des modèles murins viables et uniques, avec une délétion de la G6Pase spécifiquement dans le foie ou les reins, reproduisant respectivement toutes les caractéristiques de la pathologie hépatique ou rénale.Au niveau du foie, notre étude a permis de mettre en évidence une reprogrammation métabolique « Warburg-like » très similaire à celle des cellules cancéreuses, associée à une perte des défenses cellulaires et des suppresseurs de tumeur. De plus, nous avons montré que les adénomes hépatocellulaires, se transformant ensuite en carcinomes, se développent en absence de fibrose, en accord avec l'absence d'activation des voies pro-fibrotiques. Au niveau des reins, l'étude de la MRC a mis en évidence le développement de kystes rénaux chez les souris atteintes de GSDI, observés aussi chez les patients à un stade avancé de la MRC. Finalement, une dernière étude portant sur l'activation de l'oxydation des lipides, par un traitement des souris au fénofibrate, a permis de suggérer le rôle délétère de l'accumulation des lipides dans le développement des pathologies hépatique et rénale
Glycogen storage disease type I (GSDI) is a rare genetic disease, due to a deficiency in glucose-6 phosphatase (G6Pase), a key enzyme in the endogenous glucose production. Besides severe hypoglycemia, the loss of G6Pase leads to the accumulation of glycogen and lipids in the liver and kidneys. On the long term, most patients develop hepatic tumors and chronic kidney disease (CKD).The goal of this thesis was to characterize the molecular mechanisms involved in hepatic carcinogenesis and CKD, thanks to viable and unique mouse models with specific deletion of G6Pase in the liver or kidneys, which exhibit all hallmarks of hepatic and renal pathologies, respectively.On a hepatic level, our study allowed us to highlight a « Warburg-like » metabolic reprogramming, very similar to what is observed in cancer cells, associated with a loss of cellular defenses and tumor suppressors. Furthermore, we showed that formation of hepatocellular adenoma, which transform later in carcinoma, occurs in the absence of liver fibrosis, due to the fact that pro-fibrotic pathways are not activated. In the kidneys, the study of CKD highlighted the development of renal cysts in mice with GSDI, as well as in the patients presenting an advanced stage of CKD. Finally, the last study on the activation of the oxidation of lipids, by treating the mice with fenofibrate, allowed us to suggest a deleterious role of lipid accumulation in the development of the hepatic and renal pathologies

L'imaging a risonanza magnetica (MRI) è sempre più utilizzato in ambiente medico per la sua abilità di produrre in modo non invasivo immagini di altà qualità dell'interno del corpo umano. Sin dalla sua introduzione nei primi anni 70, techiche di acquisizione via via più complesse sono state proposte, portando l'MRI ad essere utilizzata su uno spettro di applicazioni sempre più ampio. Le tecniche più innovative, tra cui la risonanza magnetica funzionale e di diffusione, richiedono tecniche di analisi ed algoritmi di elaborazione molto complessi per estrarre informazioni utili dai dati acquisiti. Lo scopo di questa tesi è stato quello di sviluppare e ottimizzare tecniche avanzate di elaborazione per applicarle all'analisi di dati di risonanza magnetica sia in ambiente preclinico che clinico. Durante il corso di dottorato sono stato coinvolto attivamente in diversi progetti di ricerca, ed ogni volta mi sono trovato ad affrontare problematiche diverse. In questa tesi, tuttavia, saranno riportati i risultati ottenuti nei tre progetti più interessanti a cui ho preso parte. Tali progetti avevano come obiettivo (i) l'implementazione di un protocollo sperimentale innovativo per imaging funzionale in animali da laboratorio, (ii) lo sviluppo di nuovi metodi per l'analisi di dati di Dynamic Contrast Enhanced MRI in modelli sperimentali di tumore e (iii) l'analisi di dati di diffusione in pazienti affetti da ischemia cerebrale. Particolare enfasi sarà posta sugli aspetti tecnici che riguardano gli algoritmi ed i metodi di elaborazione utilizzati nel processo di analisi.
Magnetic resonance imaging (MRI) is increasingly being used in medical settings because of its ability to produce, non-invasively, high quality images of the inside of the human body. Since its introduction in early 70’s, more and more complex acquisition techniques have been proposed, raising MRI to be exploited in a wide spectrum of applications. Innovative MRI modalities, such as diffusion and functional imaging, require complex analysis techniques and advanced algorithms in order to extract useful information from the acquired data. The aim of the present work has been to develop and optimize state-of-the-art techniques to be applied in the analysis of MRI data both in experimental and clinical settings. During my doctoral program I have been actively involved in several research projects, each time facing many different issues. In this dissertation, however, I will report the results obtained in three most appealing projects I partecipated to. These projects were devoted (i) to the implementation of an innovative experimental protocol for functional MRI in laboratory animals, (ii) to the development of new methods for the analysis of Dynamic Contrast Enhanced MRI data in experimental tumour models and (iii) to the analysis of diffusion MRI data in stroke patients. Particular emphasis will be given to the technical aspects regarding the algorithms and processing methods used in the analysis of data.

La thèse s’inscrit dans un projet de recherche global visant à caractériser les tumeurs thyroïdiennes sur le plan moléculaire, afin de mieux comprendre leur physiopathologie et afin d’identifier des biomarqueurs (signatures moléculaires) qui pourront être utilisés pour le diagnostic, le pronostic et leur traitement. Parmi celles-ci, nous distinguons les adénomes autonomes (AA) et folliculaires (FTA) tumeurs bénignes encapsulées, et les carcinomes, tumeurs malignes. Ceux-ci sont eux-mêmes subdivisés en carcinomes différenciés, folliculaires (FTC) ou papillaires (PTC), et peuvent évoluer en carcinomes anaplasiques (ATC), totalement dédifférenciés. Un autre type de tumeurs bénignes différenciées, très rares, existe: l’hyperthyroïdie non auto-immune familiale (FNAH). Ces tumeurs sont causées pour la plupart par des mutations qui activent de manière constitutive des cascades de signalisation, essentiellement la cascade de l’AMPc et la cascade des MAPK. Le but de notre thèse était de valider un système expérimental in vitro des PTC, d’étudier les profils d’expression génique des FNAH et de les comparer avec ceux des AA, et de définir les profils ARNm et miRNA des ATC pour les comparer à ceux des PTC pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Pour réaliser ces objectifs, nous avons utilisé la technologie des microarrays qui permet d’analyser simultanément l’expression de milliers de gènes dans différentes conditions. Nous avons donc utilisé une approche multidisciplinaire alliant une partie expérimentale et une partie bioinformatique.

La première partie du travail a consisté à réaliser un modèle d’étude in vitro pour caractériser les PTC au niveau moléculaire. A cet effet, des cultures primaires de thyrocytes ont été traitées avec de l’EGF et du sérum pendant différents temps (1,5h, 3h, 16h, 24h et 48h) ce qui stimule la cascade des MAPK, activée constitutivement dans les PTC. Nous avons hybridé sur des lames microarrays maison les différents échantillons et nous avons montré que les cultures primaires stimulées pendant des temps longs (24h et 48h) ont des profils d’expression génique qui ressemblent à ceux des PTC et constituent donc un bon modèle d’étude de cette tumeur.

La seconde partie a pour objectif de définir les phénotypes moléculaires et fonctionnels des FNAH et de les comparer aux AA. Ces deux pathologies résultent d’une mutation dans le récepteur de la TSH (TSHR) activant de manière constitutive la cascade de l’AMPc. Dans le cas des FNAH, la mutation est héréditaire et toute la glande est affectée contrairement aux AA où la mutation survient plus tard, généralement à l’âge adulte, et où seule une partie de la glande est affectée. Nous avons comparé le profil d’expression génique des FNAH avec celui des AA, par hybridation sur des lames microarrays HEEBO. L’intégration de ces différentes données montre que les AA et les FNAH sont deux sous-types différents de la même maladie: l’hyperthyroïdie génétique. Les caractéristiques de chacun de ces sous-types dépendent de l’intensité de la mutation, du nombre de cellules initialement affectées et du stade de développement au moment duquel la mutation survient.

Dans la dernière partie de ce travail, nous avons caractérisé les ATC au niveau du profil d’expression des ARNm et des miRNA par hybridation respectivement sur lames Affymetrix ou sur lames miRNA maison et au niveau de leur état mutationnel du gène p53. Le profil d’expression génique des ATC a été comparé avec celui des PTC afin de mettre en évidence des gènes différentiellement exprimés entre les 2 types de cancers, que nous avons ensuite tenté d’invalider par siRNA, dans un modèle in vitro de lignée cellulaire thyroïdienne dérivée d’un ATC (8505C). Les résultats obtenus jusqu’ici ne sont malheureusement pas prometteurs. Le profil d’expression des miRNA nous a permis d’identifier une signature de 34 miRNA caractéristique des ATC.

Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques
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Auf der Basis der Obduktionsprotokolle der Jahre 2000-2009 des Institutes für Pathologie des Universitätsklinikums Leipzig wurden die Häufigkeiten und Verteilungen maligner Tumoren sowie der zu Lebzeiten nicht bekannten malignen Tumoren untersucht. Bei insgesamt 4592 durchgeführten Sektionen wurden in 263 Fällen zu Lebzeiten nicht bekannte maligne Tumoren diagnostiziert. Dies entsprach 5,7% des gesamten Sektionsgutes bzw. 20,2% aller nachgewiesenen Malignome. Nach Analyse der pTNM-Klassifikation wurden 70,9% der Malignome in den Tumorkategorien pT1 und pT2 erfasst. In 24,7% der Fälle traten Lymphknotenmetastasen, in 19,4% Fernmetastasen auf. 23,2% der postmortal entdeckten Malignome waren todesursächlich. Über die Hälfte der Obduzierten mit klinisch nicht bekannten Tumoren waren 70 Jahre oder älter. Die häufigsten klinisch nicht bekannten malignen Tumoren waren die Prostatakarzinome (23,9%), die kolorektalen Karzinome (16,3%), die Nierentumoren (13,0%), die Lungenkarzinome (12,7%) sowie die Leberkarzinome (6,5%). Patienten mit synchronen Doppel- beziehungsweise Dreifachtumoren traten bei 1,8% des Sektionsgutes auf. Der Anteil nicht erkannter maligner Tumoren an den Mehrfachmalignomen betrug 41,7%. Diese Sektionsanalyse bestätigte, dass auch im 21. Jahrhundert trotz der rasanten Entwicklungen in Medizin und Technik weiterhin maligne Tumoren erst bei der Autopsie festgestellt werden.

Thyroid carcinomas are the most common endocrine tumors in humans. There are three major types of carcinomas of thyrocyte origin, including papillary, follicular, and anaplastic carcinomas. Papillary thyroid carcinoma (PTC) is the most common type of thyroid malignancy accounting 80% of thyroid cancer cases, and present several histologic variants, namely classical (45%), follicular (18%), solid, diffuse-sclerosing, cribriform, … .Specific genetic events represent early initiating and late triggering events. Several genetic lesions have been identified in various thyroid carcinomas and some of them are specifically associated to one type thyroid cancer. For instance, RET/PTC is the most common molecular event in the radiation-associated PTC in childhood.

In the first part of the work, we studied two transgenic mouse models: the Tg-RET/PTC3 (Tg-RP3) mouse and the Tg-E7 mouse. Both strains express the human origin transgene (RET/PTC3 rearrangement or E7) exclusively in the thyroid under the control of the bovine thyroglobulin promoter.

Our study of these two models showed:

In both E7 and RET/PTC3 mouse models, the thyroids exhibited hyperplasia with own 'oncogene-dependent' follicular cell characteristics. Small follicular cells with hyperchromatic nuclei with an increased nucleus/cytoplasm ratio were numerous in the E7 mice, and large cells with convex apical border, a decreased nucleus/cytoplasm ratio, a pale nucleus and dispersed chromatin were found in the RET/PTC3 mice.

At 6, 10 months and later on, E7 mice developed huge heterogeneous, normal functional thyroid goiter, with no tumor formation.

As in previous studies on transgenic RET/PTC3 mouse models, the generally encountered features such as solid tumours were present. We also observed conventional variant of human PTC at late age (since 11 month-old) with quite low incidence (4%). In addition to solid and conventional variant PTCs, 28% of mice developed a peculiar big size thyroid tumor pattern with “proliferative papillary cystic changes with spindle cells and remodelling” and macrophage infiltration in the cysts at as early as 2 month of age; this kind of tumor histologically resembles the rare human young age 'diffused sclerosing' variant PTC (DSVP), but disappeared after 6 month. The other peculiar tumor exhibits morphological similarity with another rare human FAP-associated (Familial Adenomatous colonic polyposis) cribriform PTC, which showed a mixed architecture of several histological patterns (solid, follicular, cribriform). At 6 months, 26% of mice presented the cribriform tumor pattern.

From the analyse of the proliferation index in the two models, we conclude that RET/PTC3 fusion protein over stimulates MAPK and Akt/PKB-signalling pathways, through Ras-Raf-Mek-Erk, Ras-PI3-K/Akt/PKB, particularly in the large cells which were strongly positive for three proliferation markers. E7 bypasses these two pathways, by directly binding to Rb1 protein and releasing the E2F transcription factor which induces cell proliferation.

So RET/PTC3 and E7 mice present several morphologic features which mimic human PTC tumors; RET/PTC3 could therefore be used as a partial model for human PTCs.

Further investigation of gene expression will allow the characterization of the molecular phenotype of the observed variants.

In the second part of the work, we attempted to generate by xenobiotic administration an in vivo model of thyroid carcinoma. Chronic exposure of CD1 mice to acrylamide in the drinking water during 6 and 8 months at doses of 3mg/kg per day similar to those causing thyroid tumorigenesis after 2 years in rats, did not induce any thyroid tumors whatever the level of thyroid stimulation.

Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques
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Les tumeurs thyroïdiennes représentent les tumeurs endocrines les plus fréquentes. Parmi ces tumeurs les adénomes autonomes sont des tumeurs bénignes se développant secondairement à l’activation constitutive de la voie de l’AMPc. Cette activation est secondaire à des mutations somatiques survenant à différents niveaux de la cascade de signalisation induite par l’activation du récepteur TSH. La pathologie thyroïdienne maligne est essentiellement représentée par les carcinomes papillaires de la thyroïde pour lesquelles de nombreuses modifications génétiques ont été décrites, les plus fréquentes étant les réarrangements impliquant la tyrosine kinase Ret. Différents modèles de souris transgéniques ont été développés et représentent d’excellents outils pour étudier in vivo l’expression génique secondaire aux mutations initiales. Nous avons choisis d’utiliser la technologie des microarrays pour analyser simultanément l’expression de milliers de gènes dans différents modèles de souris transgéniques développant des pathologies thyroïdiennes bénignes et malignes .Au cours de cette thèse de doctorat, nous avons déterminé à l’aide de microarrays le profil d’expression génique de souris exprimant à la surface des cellules thyroïdiennes de manière spécifique le récepteur A2a de l’adénosine, ce qui mène à l’activation constitutive de la voie de l’AMPc et au développement d’une hyperthyroïdie sévère associée à un énorme goitre. Cette étude nous a permis d’identifier des gènes dont le rôle potentiel dans le développement de tumeur bénigne était jusqu’à lors inconnu. Nous avons également comparé deux modèles murins développant des tumeurs malignes de la thyroïde. D’une part les souris exprimant le réarrangement Ret/PTC3, très commun dans les carcinomes papillaires de la thyroïdes issus de la première vague de cancer survenu après la catastrophe de Chernobyl, d’autre part les souris exprimant l’oncoprotéine E7 dérivée de l’HPV16 responsable du cancer du col de l’utérus. Les différences et les similarités entre ces deux lignées et différentes pathologie humaine ont été décrites.

La PCR quantitative en temps réel a été utilisé pour confirmer et quantifier la différence d’expression des gènes d’intérêts entre les thyroïdes de souris contrôles de même souche et les thyroïdes issues de souris transgéniques. La PCR en temps réel permet de monitorer à l’aide d’un signal fluorescent émis lors de l’hydrolyse d’une sonde, la quantité d’amplicons produite dans la réaction. La courbe d’amplification se caractérise par une phase exponentielle, suivie par une phase non exponentielle se terminant par un plateau. Contrairement aux idées reçues, nous avons pu démontrer que le plateau était expliqué par la déplétion de la sonde hydrolysée par la Taq polymérase lors de la réaction d’amplification. Dès lors que l’hydrolyse de la sonde reflète quantitativement la synthèse d’amplicons, la fluorescence produite dans la phase exponentielle de la réaction reflète la concentration des amplicons produits. Nous avons donc, sur base de ces observations pu estimer la quantité d’ADN complémentaire engagé dans la réaction en se basant directement sur les données de fluorescence d’une seule courbe de PCR en temps réel sans passer par une courbe de calibration utilisant une quantité connue d’ADN complémentaire.
Doctorat en Sciences médicales
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L’hétérogénéité tumorale (HT) est un trait caractéristique du cancer. Elle peut être rencontrée chez la majorité des tumeurs malignes solides, au travers de la clinique, la biologie, l’histologie, et la génétique. Au-delà de l’hétérogénéité inter-patient, on distingue l’hétérogénéité spatiale, qui regroupe l’hétérogénéité au sein de la tumeur primitive, entre tumeur primitive et métastases, entre métastases, au sein d’une métastase et l’hétérogénéité temporelle, qui fait référence à l’évolution de la tumeur au cours du temps de manière spontanée ou sous l’effet des traitements. L’HT explique la survenue inéluctable de la résistance aux thérapies anticancéreuses actuelles. L’objectif général de cette thèse était d’explorer l’hétérogénéité tumorale au plan clinique, histologique et génétique en utilisant le modèle d’hépatectomies pour métastases d’origine colo-rectales. Dans l’article 1, nous avons étudié la réponse histologique à la chimiothérapie chez des patients opérés de métastases hépatiques colo-rectales après chimiothérapie systémique ou intra-artérielle. Ainsi, nous avons montré que la réponse histologique complète était plus souvent observée après administration d’oxaliplatine par voie intra-artérielle et était associée à un meilleur pronostic. Cependant la réponse histologique complète n’est observée que chez une minorité de patients. Nous avons émis l’hypothèse qu’une réponse histologique incomplète représentent un groupe hétérogène de patients, ayant des pronostics différents. Ceci nous a conduit à proposer dans l’article 2 une méthode reproductible pour évaluer la réponse histologique, incorporant taille et nombre de nodules. La relecture des lames de pièces d’hépatectomie nous a conduit à observer une hétérogénéité de la réponse histologique au sein d’un même patient (hétérogénéité intermétastatique) et de l’aspect histologique (nécrose, fibrose). Nous avons ensuite exploré la valeur pronostique de cette hétérogénéité et chercher à identifier les facteurs prédictifs de cette hétérogénéité. Une réponse dissociée (une différence de réponse histologique > 50% entre deux nodules chez un même patient) a été observée chez 20% des patients et ne modifiait pas le pronostic. Chez les patients ayant une hétérogénéité pathologique, une discordance (mutation et absence de mutation pour les gènes KRAS, BRAF, NRAS et PI3K) entre les métastases a été mis en évidence dans 28% des patients analysés (article 3). Afin d’étudier l’hétérogénéité génétique selon le site tumoral et le type de prélèvements, nous avons utilisé les données disponibles de la plateforme de biologie moléculaire (article 4). Nous avons ainsi mis en évidence que les métastases hépatiques étaient moins souvent mutées pour KRAS, NRAS, BRAF que les tumeurs primitives ou les lésions pulmonaires. Nous avons ensuite recherché une hétérogénéité génétique intra-métastatique pour KRAS, NRAS, BRAF et PI3K au sein d’une métastase hépatique colo-rectale (article 5). Parmi les 54 patients ayant une tumeur unique analysable (2 prélèvements par tumeur), une discordance pour KRAS (N=2) et BRAF (N=1) a été mise en évidence chez 3 patients (5%). L’ensemble de ces travaux confirment que l’HT est observée à travers de nombreux points de vue. L’élaboration de nouvelles stratégies de prise en charge du cancer devra prendre compte cet aspect
Tumor heterogeneity is a typical feature of cancer. It is observed in the majority of solid malignancies regardless of the point of view: clinical, biological, pathological, and genetic. Different levels of heterogeneity have been described: interpatient, spatial heterogeneity (within the primary tumor, between primary and distant lesion) and temporal heterogeneity (tumor evolution under the influence of treatment). Tumor heterogeneity widely explains the emergence of resistant clones to anticancer drugs. The objective of the current thesis was to explore tumor heterogeneity at a clinical, pathological and genetic level, by using the model of hepatectomy for colorectal liver metastases (CLM).In the article 1, we studied pathological response to chemotherapy in patients operated on for CLM after either systemic or intra-arterial hepatic oxaliplatin-based chemotherapy. We showed that complete pathological response was more often observed after intra-arterial chemotherapy and yield far better outcomes. However, complete response was observed in a minority of patients. We hypothesized that uncomplete pathological response encompass a large group of patients with different oncological outcomes. This lead us to propose a reproducible method (article 2) to assess pathological response, including size and number of nodules. Pathological review found heterogeneity in the response among nodules within the same patients and in the type of pathological features (necrosis, fibrosis). We then explore the prognostic value of pathological heterogeneity and sought to identify predictors of heterogeneity. A dissociated response (difference in pathological response > 50% between two nodules) was observed in XX and did not impact long-term outcomes. IN patients with dissociated response, genetic heterogeneity (mutation and no mutation for KRAS, NRAS, BRAF and PI3K) between metastases was shown in 28% of patients (article 3). To study genetic heterogeneity according to tumor location and the tumor tissue analyzed (specimen, biopsy), we used data from the department of molecular biology (article 4). We found that liver metastases were more often wild type for KRAS, NRAS, BRAF compared to lung metastases or primary tumors. In the article 5, we then sought to evaluate intrametastatic heterogeneity (KRAS, BRAF, NRAS, PI3K) within a single liver metastasis (2 samples per tumor). Among the 54 patients with single lesion analyzed, a discrepancy for KRAS (n=2) and BRAF (n=1) were observed un 3 patients (5%). This work confirms that tumor heterogeneity can be observed at various levels. Elaboration of new therapeutical strategies will have to take this aspect into consideration

La technologie des microarrays est une technique d’analyse d’expression génique à grande échelle qui permet d’analyser simultanément l’expression de milliers de gènes dans différentes cellules et différentes conditions physiologiques, pathologiques ou toxicologiques (Shena et al, 2000). Dans notre étude nous avons employé cette technique pour mieux comprendre deux pathologies thyroïdiennes: les carcinomes papillaires (PTC) et les adénomes autonomes hyperfonctionnels.

L’étude des profils d’expression génique de 9 carcinomes papillaires thyroïdiens sporadiques et de 13 carcinomes papillaires post-Chernobyl a été effectuée en utilisant les lames commerciales de Perkin-Elmer (comportant 2400 cDNA) et en les comparant à leurs tissus normaux adjacents. Les PTC post-Tchernobyl constituent une population de cancers à cause bien définie puisqu’ils sont directement reliés à l’exposition du même agent mutagène, pendant une même période. L’étude des profils d’expression indique qu’il n’y a pas de signature génique spécifique permettant de distinguer les carcinomes papillaires sporadiques des post-Tchernobyl. La comparaison de ces profils d’expression à celui obtenu avec 13 adénomes autonomes a permis de mettre en évidence une signature de 6 gènes (créatine kinase B, annexine A1, clusterine, métallothionéine 1x, Fc fragment of IgG binding protein et tissue inhibitor of metalloproteinase 1) séparant les carcinomes papillaires malins des adénomes autonomes bénins.

Nous avons également analysé l’expression génique sur des mélanges de tumeurs et de leurs contrôles respectifs sur des lames à 17000 cDNA fabriquées au MAF (VIB Microarray Facility, Leuven). Un mélange de 14 cancers papillaires sporadiques, un mélange de 20 cancers papillaires provenant de la région de Tchernobyl et un mélange de 5 adénomes autonomes ont été analysés par microarray et comparés aux études existantes comme celles effectuées sur les lames Perkin-Elmer ou par d’autres groupes (Huang et al, 2001 ;Wasenius et al, 2003 ;Jarzab et al, 2005 ;Eszlinger et al, 2004).

De ces données microarray ont résulté des listes de gènes sur- et sous-exprimés dans les tumeurs comparées à leurs tissus normaux adjacents. Plusieurs gènes différentiellement exprimés ont déjà été confirmés dans différentes études réalisées aussi bien dans notre laboratoire que dans d’autres. Nous avons confirmé la modulation de plusieurs gènes intéressants par RT-PCR en temps réel (Taqman) ainsi que certaines modulations au niveau protéique (par Western Blot ou immunohistochimie). L’étude immunohistochimique nous a donné également des informations sur la distribution cellulaire et tissulaire de ces protéines.

La modulation d’expression génique dans ces tumeurs reflète des caractéristiques physiopathologiques connues (comme l’hyperactivité fonctionnelle, la faible augmentation de l’AMPc ou encore la diminution de l’apoptose dans les adénomes autonomes et la dédifférenciation ou l’invasivité dans les carcinomes papillaires), mais elle nous a également permis d’identifier des caractéristiques physiopathologiques jusqu’ici encore inconnues de ces tumeurs (comme la surexpression de la N-cadhérine et la diminution de la cavéoline1, deux marqueurs présumés de malignité, dans les tumeurs bénignes et un changement de population cellulaire aussi bien dans les adénomes autonomes que dans les carcinomes papillaires). Ces études nous ont donc permis de définir des gènes potentiellement importants dans la pathologie des différentes tumeurs étudiées, mais également des nouveaux marqueurs diagnostiques potentiels. Ainsi, l’étude immunohistochimique sur des tissu-arrays nous a permis de confirmer la surexpression de l’annexine A1 dans les carcinomes papillaires et de la créatine kinase B dans les adénomes autonomes et pas dans les autres tumeurs thyroïdiennes étudiées. L’immunomarquage de ces protéines nous a également aidé à définir la malignité d’une série d’adénomes atypiques. L’annexine A1 est un marqueur potentiel particulièrement intéressant car cette protéine n’est fortement exprimée que dans les carcinomes papillaires. Une hypothèse, encore à confirmer, sur sa fonction dans cette pathologie est décrite dans ce travail. Finalement, nous avons émis une hypothèse expliquant la raison pour laquelle les réarrangements Ret/PTC mènent à la formation de carcinomes papillaires, tandis qu’une mutation activatrice de Ras, l’effecteur directe du récepteur à activité tyrosine kinase Ret, mène à la formation de tumeurs folliculaires.
Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques
info:eu-repo/semantics/nonPublished

Orientador: Oslei Paes de Almeida
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Made available in DSpace on 2018-08-26T10:32:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martinez_MarisolMartinez_D.pdf: 11593706 bytes, checksum: 9204e3ab03e2563ba5f0fa74b21ca2e2 (MD5) Previous issue date: 2014
Resumo: Os tumores odontogênicos (TO) são um grupo heterogêneo de lesões derivadas de tecidos dentários, que ocorrem nos ossos gnáticos e tecidos adjacentes. Os TO são raros, na grande maioria benignos, representando menos de 4% de todos os espécimes recebidos em laboratórios de patologia bucal. Os TO malignos frequentemente apresentam dificuldades para diagnóstico e correta classificação, com vários pontos ainda não bem esclarecidos. O objetivo desse trabalho foi comparar as características clínicas, histológicas e imunohistoquímicas do carcinoma ameloblástico (CA) e fibrosarcoma ameloblástico (FSA) e dos seus respectivos correspondentes benignos ou seja ameloblastoma (AM) e fibroma ameloblástico (FA). O carcinoma escamocelular intra-ósseo primário (CEIP) também foi comparado com carcinoma escamocelular de mucosa bucal (CEMB). Foi avaliada a expressão imunohistoquímica de citoqueratinas 5, 7, 8, 14, 19, marcadores de proliferação celular Ki-67, p53, p63 e moléculas de adesão celular CD138 (Syndecan), E-cadherin e ?-catenin. Os resultados mostraram que o CA expressaram mais altos níveis Ki-67, p53 e p63 do que AM por tanto, poderiam ser usados como marcadores para diferenciar essas duas lesões. A expressão de CKs 5 e 19 foram alteradas com relação ao padrão observado em AM, pelo que alterações genéticas de essas proteínas poderiam estar presentes nas células malignas. CK19 pode ser um bom marcador para tumores odontogênicos benignos como AM mas não em malignos pois a expressão nestes é variável. Nas moléculas de adesão celular particularmente CD138 não foi observada diminuição da expressão em AC comparada com AM. As características histológicas assim como o perfil imunohistoquímico do CEMB e CEIP foram similares, por tanto, sugere-se que as características clínicas e radiográficas sejam os principais parâmetros para ser considerados no diagnóstico. Nos casos de fibroma ameloblástico (FA) e fibrosarcoma ameloblástico (AFS) a expressão de CKs foi similar em intensidade e localização e Ki-67 em FSA foi mais alto comparado com FA enquanto que p53 foi negative e ambas lesões. A expressão das moléculas de adesão foi similar em ambas lesões sendo mais intensa com CD138. Finalmente, foram ilustradas as características clínicas e histopatológicas de um caso de fibroodontoma ameloblástico pigmentado e um caso de CEIP originado a partir da transformação maligna de um queratocisto
Abstract: Odontogenic tumors correspond to a heterogenous group of lesions derived from dental tissues, involving the jaws and adjacent tissues. OT are rare, the majority benign, representing less than 4% of all specimens of an oral pathology laboratory. OTs frequently present difficulties for the correct diagnosis and classification, with various points yet to be clarified. The objective of this study was to analyze the clinical, histological and the expression of immunohistochemical markers in malignant odontogenic tumors and the benign counterparts. We assessed CK5, 7, 8, 14, 19, Ki-67, p53, p63, CD138 (Syndecan), E-cadherin and ?-catenin expression by immunohistochemistry in 15 and 9 cases of ameloblastoma (AM) and ameloblastic carcinoma (AC) respectively. Dez cases of primary intraosseous squamous cell carcinoma (PIOSCC), 9 cases of squamous cell carcinoma of mouth (OSCC), 8 cases of ameloblastic fibroma and ameloblastic fibrosarcoma (AFS). Also, these were compared expression patterns between these groups. In summary, Ki-67, p53 and p63 expression were higher in AC than in AM and could be used as markers of malignant transformation of AM. CKs 5 and 19 expression in AC are altered in relation to the pattern found in AM, also CK19 is a good marker for benign odontogenic tumors as AM. Our results do not permit to confirm that expression of CD138, is decreased in AC in relation to AM. The histological features as well as the immunohistochemical profile of OSCC and PIOSCC were similar, therefore, suggests that the clinical and radiographic features are the main parameters to be considered for diagnosis. In both AF and AFS the CKs expression in odontogenic islands was similar in intensity and localization, except CK7 that in most cases of AF was focally positive, while in AFS most cases were negative. Ki-67 proliferative index was higher in AFS that in AF, and p53 was negativo in both lesions. Expression of adhesion molecules was similar in AF and AFS, being most intense for CD138
Doutorado
Patologia
Doutora em Estomatopatologia

Neo-adjuvant chemo-radio therapy (pCRT) has been accepted as a standard care in the treatment of patients with locally advanced rectal cancer. The multimodality treatment has been established to improve tumour downstaging, pathological complete response, and local disease control. However, the response of individual tumors to the treament is not uniform and ranges from complete response to complete resistance. The discovery of new molecular markers that predict the tumour response is surely of wide interest for personalizing the therapy and reducing time, costs and side effects in the patients with resistant tumours. Many potential biomarkers have been evaluated in order to predict the response to pCRT, and to implement targeted therapeutics. However, single-marker or multi-markers analyses, based on pre-treatment tissue biopsies, often obtained conflicting results demonstrating the heterogeneity of the individual tumour response. Moreover, the prediction of histopathological response to neo-adjuvant treatment is complicated by the interaction and the involvement of the microenvironment in modulating the sensitivity to pCRT. In this study, we developed blood-based methods of biomarker analysis in order to evaluate the histopathological response to treatment in a broad contest that can take into account not only the signalling pathway of tumour cells but also the microenvironment as a part of a unique system. Indeed, the non-invasive nature and the dynamism for which different molecules could be detected according with physiological and pathological states has given us the possibility to monitor the response along the administration of the treatment. In particular, we focused on two different kind of circulating molecules: the cell-free DNA (cfDNA) and the circulating low molecular weight (LMW) peptides. In particular, we investigated the presence, the quantity of cfDNA and its integrity (cfDNA integrity = non apototic cfDNA / total cfDNA) along the chemo-radio treatment. For this purpose we measured the cfDNA concentration and cfDNA integrity in a prospective study of locally advanced rectal cancer patients plasma collected before the pCRT, after two weeks from initiation of the pCRT and after the pCRT. We evaluated the association of these markers with the histological response to the chemo-radio therapy, demonstrating a different kinetic of cfDNA integrity in association with the tumour response. Then we studied the LMW peptidome circulating in plasma, in order to find evidences of possible differences in the peptide profile that could reflect the tumour response. To overcome the technical difficulties in harvesting LMW species, we have employed the mesoporous chip-based technology, developed by the Nanomedicine Department of The Methodist Hospital Research Institute in Houston, Texas. This mesoporous device, in combination with matrix-assisted laser desorption/ionization - time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), allows the isolation and the detection of small peptides from the large proteins. We analyzed plasma of rectal cancer patients, with positive or negative response to the therapy, at the same time points as the cfDNA: before, during, after the chemo-radio therapy. Multivariate analyses of the LMW peptide profile at different time points identified combinations of peptides that revealed high discriminating capacity of the different tumour responses. In particular, before the pCRT, a pattern of five ionic species showed a sensitivity and a specificity of 80% and after the pCRT, a pattern of other five specific ionic species showed a sensitivity of 80% and a specificity of 85% to cluster patients on the basis of histopathologic response to pCRT. Moreover the identification of the amino acids sequences of the response-specific ionic species revealed the presence of protein fragments that could be directly or indirectly valuable for further investigation on the resistance mechanisms of the rectal tumour to the neo-adjuvant chemo-radio therapy
La radiochemioterapia neoadiuvante (pCRT) è un protocollo standard accettato per il trattamento di pazienti con cancro rettale localmente avanzato. Il trattamento preoperatorio multimodale è stato introdotto per la riduzione dello stadio del tumore, per l’aumento della risposta completa patologica e per il controllo locale della malattia. Tuttavia la risposta patologica al trattamento non è uniforme e varia da una risposta completa alla resistenza totale. La scoperta di nuovi marcatori molecolari in grado di predire la risposta del tumore è sicuramente di grande interesse al fine di personalizzare la terapia, riducendo così i tempi, i costi e gli effetti collaterali nei pazienti con tumori resistenti. Molti potenziali biomarcatori sono stati valutati con l’obiettivo di prevedere la risposta alla pCRT, e di attuare terapie mirate. Finora molti studi su singolo o multi-marcatore sono stati eseguiti prevalentemente su biopsie di tessuto pre-trattamento. I risultati ottenuti, tuttavia, erano spesso contrastanti dimostrando l'eterogeneità individuale della risposta tumorale al trattamento. Inoltre, la predizione della risposta istopatologica alla pCRT è complicata dall’interazione e dal coinvolgimento del microambiente che può modulare la sensibilità del tumore al trattamento. In questo studio, abbiamo sviluppato metodi di analisi di biomarcatori su sangue, al fine di valutare la risposta del tumore al trattamento in un contesto più ampio, che rende conto non solo dell’ambiente strettamente tumorale, ma che prende in considerazione anche il microambiente come parte di un sistema unico. Infatti, la natura non invasiva del materiale biologico analizzato e il dinamismo per cui molecole differenti possono essere rilevate secondo lo stato fisiologico e patologico dell’organismo, ci hanno permesso di monitorare la risposta lungo il tempo di somministrazione del trattamento. In particolare, ci siamo concentrati su due diversi tipi di molecole circolanti: il DNA libero da cellule (cfDNA) e i peptidi a basso peso molecolare (Low Molecular Weight, LMW). In particolare, abbiamo studiato la presenza, la quantità e l’integrità del cfDNA durante il trattamento radio-chemioterapico. A questo scopo abbiamo misurato la concentrazione e l'integrità del cfDNA (cfDNA integrity=cfDNA apoptotico/cfDNA totale) in uno studio prospettico di plasma di pazienti con carcinoma rettale localmente avanzato, raccolto prima della pCRT, dopo due settimane dall'inizio del trattamento e dopo la pCRT. Abbiamo valutato l'associazione di questi marcatori con la risposta istologica alla chemio-radio terapia, dimostrando la presenza di diversa cinetica nell’integrità del cfDNA, in associazione con la risposta tumorale. Nel plasma, abbiamo quindi studiato il peptidoma circolante a basso peso molecolare, al fine di trovare potenziali differenze nel profilo peptidico che potessero riflettere la risposta tumorale. Per superare le difficoltà tecniche nella rilevazione dei peptidi circolanti a basso peso molecolare, abbiamo utilizzato una strategia basata sull’esclusione dimensionale di un chip di silice mesoporosa (MSC), sviluppato dal Dipartimento Nanomedicina del The Methodist Hospital Research Institute di Houston, Texas. Questo dispositivo mesoporoso, in combinazione con l’utilizzo dello spettrometro di massa MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight Mass Spectrometry), consente l'efficiente rimozione di grandi proteine e l'isolamento del peptidoma circolante da campioni di fluidi corporei. Abbiamo analizzato il plasma di pazienti con cancro rettale, prelevato in diversi tempi (prima, durante, dopo la chemio-radio terapia) e stratificati secondo la risposta positiva o negativa alla pCRT. L'analisi multivariata del profilo peptidico nei diversi tempi di analisi ha identificato combinazioni di peptidi che evidenziavano un’elevata capacità discriminante della risposta tumorale. In particolare, il modello di regressione logistica ha evidenziato, prima della pCRT, una combinazione di cinque specie ioniche capace di identificare i pazienti che non rispondono al trattamento, con una sensibilità e una specificità del 80%; mentre la stessa analisi con i campioni raccolti dopo la pCRT, ha identificato un'altra combinazione di cinque specie ioniche che evidenziano una sensibilità del 80% e una specificità del 85%. Inoltre, l'identificazione delle sequenze amminoacidiche di alcune tra le specie ioniche discriminanti la risposta alla pCRT, hanno rivelato la presenza di frammenti proteici che possono essere direttamente o indirettamente utili per ulteriori indagini sui meccanismi di resistenza del tumore rettale alla radio-chemio terapia neo-adiuvante

Les TNE-GEPs constituent un groupe de tumeurs hétérogènes pour lesquelles il convient d'élargir les approches thérapeutiques. Les thérapies ciblées, particulièrement l'inhibition de la voie mTOR par l'évérolimus, sont la référence pour les TNE-GEPs pancréatiques. Néanmoins, le bénéfice thérapeutique de l'évérolimus n'a pas été évalué dans le sous-groupe des carcinomes neuroendocrines GEPs peu différenciés (pdCNE-GEPs). A travers un modèle préclinique in vivo, nous montrons que l'inhibition de mTOR pourrait constituer une option thérapeutique pour les pdCNEGEPs. Ensuite, une étude protéomique a mis en évidence de nouveaux facteurs impliqués dans la progression de TNE-GEPs. Certaines protéines identifiées présentent un rôle dans la régulation du cytosquelette. Parmi celles-ci, CRMP2 est un acteur clé de la voie de signalisation des sémaphorines de classe 3 (sema3). Un profil d'expression de ces sema3 montre que l'expression de la sema3F est diminuée dans les TNE-GEPs. La ré-expression de ce facteur dans des modèles cellulaires de TNEGEPs montre que la sema3F induit une baisse de la survie et de la prolifération. In vivo, la sema3F permet de ralentir le développement tumoral. Des études complémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre le rôle de la voie de signalisation de la sema3F dans la progression des TNE-GEPs

O adenocarcinoma pancreático é a neoplasia maligna mais comum do pâncreas. A alta taxa de mortalidade deve-se ao diagnóstico tardio e a alta agressividade do tumor. Freqüentemente observam-se indivíduos com neoplasias de mesmo estadio apresentarem sobrevivência diferente. Isso demonstra a necessidade de incluir mais variáveis na caracterização da doença. O processo de angiogênese é essencial para o crescimento tanto do tumor primário, quanto para o metastático. A medida da densidade intratumoral da microvasculatura (DMV) por imunoistoquímica é o método mais confiável para medir a atividade angiogênica tumoral. A perda da função do gene p53 influencia a resposta à quimio e à radioterapia além de regular a angiogênese. A sobrevivência está inversamente relacionada à positividade do p53 e à DMV em neoplasias de mama, pulmão, ovários, estômago, cólon, laringe e bexiga. No adenocarcinoma pancreático os resultados são controversos. Idealizou-se essa pesquisa retrospectiva analisando-se dados clínicos e os resultados de estudos imunoistoquímicos obtidos de adenocarcinomas de pâncreas ressecados com intenção curativa. Analisou-se dados clínicos, patológicos, re-estadiamento e resultados da DMV e da expressão do gene p53 em 49 pacientes. A densidade média de microvasos foi de 46,2 vasos/mm2 sendo que esse valor foi utilizado para dividir os pacientes em grupos de baixa ou alta densidade de vasos. A coloração para p53 nuclear foi considerada positiva em 20 de 49 pacientes (40,8%). A DMV foi significativamente maior nos pacientes com tumores maiores que 3,0 cm e nos pacientes com ressecções incompletas. A expressão do gene p53 e a DMV, não foram fatores preditivos da sobrevivência pós-operatória. Não foi possível verificar relação entre a expressão do gene p53 e a densidade da microvasculatura tumoral
The prognostic significance of microvessel density and the p53 expression was evaluated. Between 1993 and 2006, 49 patients with pancreatic adenocarcinoma were ressected with curative intention. Specimens were stained immunohistochemically with antibodies anti- p53 anti-CD34. Microvessel density (MVD) was assessed scanning ten areas of the tumoral section and counted at a high power in an adequate area. The MVD ranged from 21,2 to 54,2 vessels/mm2 (mean 46,2 vessels/mm2). Specific nuclear staining for p53 was determined positive in 20 patients (40,8%). The overall median survival was 24,1 months after resection and there was no difference in survival rates according to the MVD and p53 positivity. There was also no relation between the MVD and p53 expression. MVD and p53 expression could not predict survival in these patients with pancreatic adenocarcinoma. There was no correlation with p53 expression and intratumoral microvessel density. High MVD was associated with tumor size grater than 3,0 cm and positive margins

L’objet de cette thèse est de réaliser une analyse économique du champ de l’aide informelle des personnes adultes jeunes vivant à domicile et atteintes de maladie neurologique grave. La question de recherche posée concerne l’articulation entre l’organisation de l’aide informelle et la cinétique de la pathologie neurologique. La méthodologie repose sur la construction de quatre modèles neuro-pathologiques et économiques d’une part, et sur la constitution de quatre cohortes représentatives, comportant chacune une centaine de binômes « aidant-aidés » d’autre part. Ainsi, les modèles de la pathologie brutale avec handicap résiduel stabilisé, de la pathologie progressive avec handicap croissant, de la pathologie à cinétique déficitaire rapide, de la pathologie dégénérative héréditaire sont-ils respectivement illustrés par le traumatisme crânien, la sclérose en plaques, la tumeur cérébrale et la maladie de Huntington. Nos travaux (1) mettent en évidence les caractéristiques sur le plan économique des aidants informels (conjoints jeunes) qui sont fortement impliqués dans la production du soin, experts d’un accompagnement complexe et déstabilisés dans leur trajectoire professionnelle (2) font la démonstration de la prédétermination forte de la cinétique de la pathologie neurologique sur les comportements d’aide informelle à travers différents indicateurs temporels dont la prise en compte s’avère incontournable pour l’analyse économique (3) montrent la nécessité d’avoir recours à une mesure bidimensionnelle (subjective et objective) dans l’analyse du fardeau des aidants informels. Une telle mesure souligne d’une part l’insuffisance du recours à l’aide professionnelle publique et d’autre part l’impact sur les aidants des troubles cognitivo-comportementaux (handicap invisible) et de la phase neuro-palliative à domicile d’une pathologie neurologique grave. Ces résultats ouvrent des perspectives pour la mise en place de mesures d’action publiques en France dans le champ complexe du handicap neurologique
The purpose of this thesis is to achieve an economic analysis of informal caregiving of young adults living at home and suffering from a severe neurological disease. The research questions the relationship between the organization of informal care and kinetics of neurological pathology. The methodology is based on the construction of four neuro-pathological and economic models on the one hand, and on the constitution of four representative cohorts, each with a hundred pairs of "patients-caregivers" on the other. Thus, models of brutal disease stabilized with residual disability, progressive disease with increasing disability, fast kinetics disease and neuro-degenerative hereditary disease are respectively illustrated by traumatic brain injury, multiple sclerosis, malignant brain tumor and Huntington's Disease. Our work (1) highlights the economic characteristics of informal caregivers (young spouses) who are highly involved in the production of care, expert of complex care and therapeutic pathways and destabilized in their professional careers (2) demonstrates that the kinetics of neurological disease predicts the economic behavior of informal caregivers : taking account of different time indicators is crucial for economic analysis in neurodisability (3) shows that a two-dimensional subjective and objective outcome measure is necessary in the analysis of the burden of informal caregivers. Such a double indicator first stresses the inadequate use of publicly funded professional care ; it also points out the impact of cognitive-behavioral disorders (so-called “invisible disability”) and of the home neuro-palliative phase on caregivers in case of a severe neurological disease. These results open perspectives for the development of public action measures in France in the complex field of neurological disability

O melanoma é a forma mais letal entre os cânceres de pele. Essa neoplasia freqüentemente apresenta-se resistente a abordagens terapêuticas. A angiogênese associada ao tumor representa um crítico passo da tumorigênese, resultado da ação de diferentes citocinas e fatores de crescimento como VEGF produzidos no microambiente tumoral. As galectinas extracelulares participam de múltiplos processos biológicos incluindo angiogênese tumoral e metástases, sua interação com as células presentes no microambiente tumoral pode ocorrer via receptores toll-like sugerindo seu envolvimento nos processos pro-inflamatórios e na secreção de citocinas. Recentemente mostramos que a ausência de gal-3 no estroma e parênquima tumoral diminui a angiogênese por interferir na resposta de macrófagos via VEGF e/ou TGFbeta1. Entretanto, o envolvimento de galectinas extracelulares na angiogênese e na modulação do sistema imune no microambiente tumoral ainda não está esclarecido. Assim, este estudo visa buscar respostas ao envolvimento das galectinas no crescimento tumoral e angiogênese contribuindo ao combate do melanoma maligno. Nossos resultados mostram a participação das galectinas 1 e 3 no crescimento tumoral e seu envolvimento com macrófagos via receptores toll-like, além de coordenarem a modulação do perfil de polarização de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos wild-type. Dessa forma, podemos inferir que essas galectinas agem como coordenadoras de mudança de perfil dos macrófagos, uma vez que inibidas extracelularmente promovem uma diminuição do crescimento tumoral em camundongos wild-type, inoculados com células de melanoma murino e uma manutenção do perfil de macrófagos M1 in vitro. Assim, concluimos que as galectinas 1 e 3 extracelulares são importantes para o crescimento tumoral de melanomas murinos pois promovem o crescimento tumoral e são coordenadoras da mudança do perfil de macrófagos
Melanoma is the most aggressive form of skin cancer. This tumor often presents itself resistant to therapeutic approaches. The tumor-associated angiogenesis is a critical step in tumorigenesis and the result of the action of several cytokines and growth factors such as VEGF produced in the tumor microenvironment. The extracellular galectins participate in multiple biological processes including tumor angiogenesis and metastasis, their interaction with cells present in the tumor microenvironment may occur via toll-like receptors suggesting their involvement in pro-inflammatory processes and the secretion of cytokines. We have recently shown that the absence of Gal-3 the stroma and tumor parenchyma decreases angiogenesis by interfering with the macrophage response by VEGF and / or TGFbeta1. However, the involvement of extracellular galectins on angiogenesis modulation of the immune system in the tumor microenvironment is not yet clear. This study aims is to find answers to the involvement of galectins on tumor growth and angiogenesis contributing to the study of the malignant melanoma. Our results demonstrate the involvement of galectin 1 and 3 on tumor growth and its involvement in macrophage by toll-like receptors pathway, and coordinating the modulation of the polarization profile in wild-type mice bone marrow derived macrophages. Therefore, we show these galectins act as coordinators of macrophages profile change, since inhibited extracellularly promote a reduction in tumor growth in wild-type mice inoculated with murine melanoma cells and macrophages M1 maintenance of profile in vitro. Thus, we conclude that galectins 1 and 3 extracellular are important for tumor growth of murine melanomas because they promote tumor growth and are coordinators of change macrophages profile

L’angiogenèse est le processus par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins se forment à partir du réseaux préexistant. Au cours de l’angiogenèse tumorale, les cellules tumorales sécrètent des facteurs de croissance qui activent la prolifération et la migration des cellules et stimulent la surproduction du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF). Le rôle fondamental de l’approvisionnement vasculaire dans la croissance tumorale et le developement des thérapies anticancéreuses rend l’évaluation de l’angiogenèse tumorale, cruciale dans l’évaluation de l’effet des thérapies anti-angiogéniques, en tant que thérapie anticancéreuse prometteuse. Dans cette étude, nous établissons un panel quantitatif et qualitatif pour évaluer les structures des vaisseaux sanguins de la tumeur sur des images de fluorescence non invasives et des images histopathologique sur toute la surface tumorale afin d’identifier les caractéristiques architecturales et les mesures quantitatives souvent associées à la réponse thérapeutique ou prédictive de celle-ci. Nous développons un pipeline formé de Markov Random Field (MFR) et Watershed pour segmenter les vaisseaux sanguins et les composants du micro-environnement tumoral afin d’évaluer quantitativement l’effet du médicament anti-angiogénique Pazopanib sur le système vasculaire tumoral et l’interaction avec le micro-environnement de la tumeur. Le pazopanib, agent anti-angiogénèse, a montré un effet direct sur le système vasculaire du réseau tumoral via les cellules endothéliales. Nos résultats montrent une relation spécifique entre la néovascularisation apoptotique et la densité de noyau dans une tumeur murine traitée par Pazopanib. Une évaluation qualitative des vaisseaux sanguins de la tumeur est réalisée dans la suite de l’étude. Nous avons développé un modèle de réseau de neurone discriminant-générateur basé sur un modele d’apprentissage : réseau de neurones convolutionnels (CNN) et un modèle de connaissance basé sur des règles Marked Point Process (MPP) permettant de segmenter les vaisseaux sanguins sur des images très hétérogènes à l’aide de très peu de données annotées. Nous détaillons l’intuition et la conception du modèle discriminatif-génératif, sa similarité avec les Réseaux antagonistes génératifs (GAN) et nous évaluons ses performances sur des données histopathologiques et synthétiques. Les limites et les perspectives de la méthode sont présentées à la fin de notre étude
Angiogenesis is the process through which new blood vessels are formed from pre-existing ones. During angiogenesis, tumour cells secrete growth factors that activate the proliferation and migration of endothelial cells and stimulate over production of the vascular endothelial growth factor (VEGF). The fundamental role of vascular supply in tumour growth and anti-cancer therapies makes the evaluation of angiogenesis crucial in assessing the effect of anti-angiogenic therapies as a promising anti-cancer therapy. In this study, we establish a quantitative and qualitative panel to evaluate tumour blood vessels structures on non-invasive fluorescence images and histopathological slide across the full tumour to identify architectural features and quantitative measurements that are often associated with prediction of therapeutic response. We develop a Markov Random Field (MFRs) and Watershed framework to segment blood vessel structures and tumour micro-enviroment components to assess quantitatively the effect of the anti-angiogenic drug Pazopanib on the tumour vasculature and the tumour micro-enviroment interaction. The anti-angiogenesis agent Pazopanib was showing a direct effect on tumour network vasculature via the endothelial cells crossing the whole tumour. Our results show a specific relationship between apoptotic neovascularization and nucleus density in murine tumor treated by Pazopanib. Then, qualitative evaluation of tumour blood vessels structures is performed in whole slide images, known to be very heterogeneous. We develop a discriminative-generative neural network model based on both learning driven model convolutional neural network (CNN), and rule-based knowledge model Marked Point Process (MPP) to segment blood vessels in very heterogeneous images using very few annotated data comparing to the state of the art. We detail the intuition and the design behind the discriminative-generative model, and we analyze its similarity with Generative Adversarial Network (GAN). Finally, we evaluate the performance of the proposed model on histopathology slide and synthetic data. The limits of this promising framework as its perspectives are shown

Cette these presente une etude sur l'utilisation des anticorps monoclonaux radiomarques dans un but therapeutique en cancerologie. Des etudes de biodistribution de l'anticorps monoclonal oc125, qui possede une affinite specifique pour les cancers ovariens, ont ete realisees dans un modele animal greffe dans la cavite peritoneale avec un carcinome ovarien humain afin de determiner differents parametres tel que la specificite in vivo de l'anticorps, le mode d'injection et le type de radioelement. Des etudes de biodistribution chez les malades de l'oc125 marque a l'in111 sont analysees

Les gliomes malins sont caractérisés par une prolifération importante, une migration diffuse des astrocytes tumoraux dans le parenchyme cérébral et un taux important de néo-angiogenèse. La gastrine appartient à la famille des peptides apparentés à la cholécystokinine et cette dernière est présente en abondance dans le cerveau. De plus la gastrine est capable de modifier le comportement biologique d’un certain nombre de tumeurs. Le groupe de recherche au sein duquel j’ai réalisé mon travail de thèse fut le premier à suggérer le rôle potentiel de la gastrine au niveau des taux de prolifération et de migration des astrocytes tumoraux. Nous avons précisé dans le présent travail divers effets biologiques provoqués par la gastrine au niveau de gliomes et de gliosarcome expérimentaux.

Nous avons au préalable tenté de caractériser par une technique de RT-PCR l’expression d’ARN pour divers récepteurs à la gastrine au sein de tumeurs du système nerveux central et périphérique (comprenant des gliomes, des méningiomes et des schwannomes), au sein de gliomes et d’un gliosarcome expérimentaux, et au sein de cellules endothéliales humaines de veines ombilicales HUVEC et de manchons vasculaires obtenus par microdissection au laser d’un glioblastome humain. Nous avons également développé un modèle de neurochirurgie expérimentale chez le rat consistant en la résection microchirurgicale de la tumeur cérébrale après un bilan iconographique par IRM. Nous avons ainsi montré que l’administration de gastrine dans le foyer opératoire après résection tumorale augmente significativement la période de survie de rats immunodéficients porteurs du modèle de gliome humain U373 et de rats conventionnels porteurs du modèle C6 de rat. In vitro, nous avons montré grâce au test colorimétrique MTT que la gastrine induit une diminution significative du taux global de croissance de ces deux modèles avec une accumulation des astrocytes tumoraux dans la phase G1 de leur cycle cellulaire. Par la technique de Western blotting nous avons également montré que la gastrine induit une diminution significative des taux protéiques du complexe cycline D3-Cdk4 dans les deux modèles expérimentaux. Nous avons montré que la gastrine est capable de réduire significativement l’invasion des modèles C6 de rat, U373 humain et de gliosarcome 9L de rat au travers d’une matrice de collagène et de réduire l’invasion des cellules U373 en chambre de Boyden. La gastrine modifie également significativement la motilité des cellules C6 et U373 et l’organisation de leur cytosquelette d’actine.

Nous avons découvert que la gastrine administrée en intracérébral dans le foyer tumoral U373 augmente significativement le taux d’angiogenèse au sein de la tumeur. Nous avons alors investigué l’effet de la gastrine et des antagonistes des récepteurs à cholécystokinine sur le taux d’angiogenèse in vitro en utilisant le modèle des cellules HUVEC cultivées sur Matrigel. L’effet pro-angiogénique in vitro et in vivo de la gastrine est significativement contrecarré par le produit L365,260, un antagoniste relativement spécifique du récepteur CCK-B de la gastrine. La gastrine est chémoattractante sur les cellules HUVEC et augmente significativement leur sécrétion d’IL-8. Toutefois l’effet pro-angiogénique de la gastrine serait en partie dépendant de la modification du taux d’expression des sélectines par les cellules HUVEC, et non de la sécrétion d’IL-8. Nous avons réalisé une revue de la littérature pour tenter de comprendre pourquoi les astrocytes tumoraux migrants sont résistants à la chimiothérapie conventionnelle. A la fin du chapitre Discussion, dans le sous-chapitre intitulé « Quels sont les espoirs thérapeutiques dans le cas des gliomes dits diffus? », nous tentons d’analyser les implications thérapeutiques potentielles qu’il serait possible de tirer du présent travail.

Doctorat en sciences médicales
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Skin cancers are very common in humans. The two most frequent epithelial skin cancers are the basal cell carcinoma (BCC) and the squamous cell carcinoma (SCC). For the vast majority of cancers, the cell at the origin of tumour initiation is still unknown and assumptions concerning their origin rely mainly on morphological and immunohistochemical studies. Recently, adult stem cells (SCs) have been suggested to be at the origin of tumour initiation based on their long term self-renewing capacities. According to these, two important questions arise; do epithelial skin cancers arise from mutations in a specific cell lineage of the epidermis? And are the stem cells more competent to initiate tumors than committed cells?

BCCs result from aberrant activation of HH signaling and several mouse models carrying mutations in HH signaling genes are capable to form tumors resembling to human BCCs.

To identify the cell lineage at the origin of BCC and to investigate the role of stem cells in tumor initiation, we followed a genetic approach where we conditionally expressed SmoM2 oncogene (a constitutively active Smoothened mutant) in distinct skin epidermal compartments including SCs. Targeting basal epidermis cells, showed that only SmoM2-clones in the inter follicular epidermis (IFE) and the infundibulum can progress into BCC, whereas SmoM2 expression in Bulge SCs or in matrix transit amplifying progenitor cells never leads to BCC formation. Progressively after SmoM2 expression, tumor-initiating cells lose their normal differentiation to adopt a hair placode-like shape and markers, demonstrating that biochemical and morphological tumour features can be misleading in extrapolating their cellular origin.

The molecular changes occurring in tumor initiating cells and the mechanisms regulating the early steps of cancer development are poorly characterized for the majority of tumors. To address these questions in BCC, we took advantage of our ability to isolate SmoM2 expressing cells at different stages of tumor initiation and progression. Transcriptional profiling of SmoM2-basal IFE cells isolated one week (normal histology) and 4 weeks (dysplastic lesion), suggests that adult IFE cells undergo a reprogramming into embryonic hair follicle (EHFP) like fate. In addition, we showed that Wnt/β-catenin signaling is essential for BCC initiating cell reprogramming into EHFP like fate and for tumor initiation in a cell autonomous manner. Finally, we show that EHFP reprogramming occurs also in human BCCs in addition to the presence of a similar canonical Wnt activation signature to the one revealed in the SmoM2-BCC mouse model.

SCC is the second most frequent skin cancers after BCC and mutations in p53 and Ras genes has been suggested to be potentially the primary events in this tumour. SCCs present signs of squamous differentiation, suggesting that SCCs may originate from the inter follicular epidermis (IFE). To identify the cell lineage at the origin of SCC and the role of the hair follicle SCs in tumor initiation, we use a genetic tools driving oncogenic KRas (KRasG12D) expression at physiological levels in different epidermal compartments.

Targeting KRasG12D expression in bulge SCs and their progeny or in IFE results in benign tumor development with no sign of malignant transformation. In contrast, KRasG12D expression in HF Transit amplifying (TA) matrix cells do not promotes any macroscopic tumors or microscopic defects in the epidermis. Interestingly, papillomas arising from the IFE express follicular markers such as CD34 and K17, indicating that the expression of HF markers by tumor cells does not necessarily reflect their cellular origin. Using a combination of deletion of both p53 alleles together with KRasG12D expression, we showed that bulge SCs and/or their progeny but not HF matrix TA cells, promote SCC formation, suggesting that additional genetic hits such as p53 are required to promote full-blown invasive skin SCC.

In summary, our work demonstrated the non-follicular origin of BCC resulting from Smo mutation, as well as the implication of the IFE progenitors in tumor initiation. We also revealed the progressive reprogramming of BCC initiating cells towards an EHFP-like fate and the key role of Wnt/β-catenin pathway in this process. In contrast, we showed the competence of several epidermal lineages to initiate benign tumors upon expression of KRasG12D oncogene at physiological levels. We also demonstrated that lineage -specific markers expression within tumor cells does not necessarily reflect their cellular origin. Finally, we demonstrated the requirement of additional hits, such as P53 loss, to promote malignant progression in the context of oncogenic Ras.

Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques
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Nowadays the problem of improving healthcare services through implementing new investments or improvements, medical devices and software is burning. Innovations in medicine make a valuable contribution into saving human lives. In this light, a few mainstreams within the general tendency of introducing medical inventions and improvements should be mentioned.

INTRODUÇÃO: O Carcinoma de Células Renais (CCR) é reposnsável por mais de 200.000 casos a cada ano no mundo, representando cerca de 2% de todos os cânceres. O CCR do tipo células claras (CRCC) é o subtipo mais comum da doença e é responsável por 75 a 80% dos casos, com maiores taxas de invasão local, desenvolvimento de metástases e mortalidade. As novas terapias alvo são baseadas em moléculas e anticorpos antiangiogênicos alterando o curso da doença, mas os resultados até agora não são satisfatórios. OBJETIVOS: Nosso objetivo nesse estudo foi estudar miRNAs e seus possíveis genes alvo relacionados com a angiogênese em CRCC tentando trazer novos conhecimentos relacionados às vias moleculares associadas à doença. MÉTODOS: Os níveis de expressão dos miRNAs miR-99a, 99b, 100, 199a, 106a, 106b, 29a, 29b, 29c, 126, 200a, 200b e seus respectivos genes alvo: mTOR, HIF1-alfa, VHL, PDGF, VEGF, VEGFR1 e VEGFR2 foram avaliados por alfaRT-PCR utilizando amostras de tecido tumoral de 56 pacientes com diagnóstico de CRCC e 5 amostras de tecido renal benigno como controle. Os resultados foram comparados com o tamanho tumoral, grau nuclear de Fuhrman e invasão microvascular, considerando os critérios de risco propostos por Dall\'Oglio et al (2007). RESULTADOS: Encontramos subexpressão da maioria dos genes, exceto VEGFA e PDGF, enquanto que a análise dos miRNAs mostrou subexpressão apenas dos miRs 100 e 126. Comparamos a expressão dos genes com seus possíveis miRNAs reguladores, e encontramos que mTOR apresentou subexpressão, enquanto miR99a apresentou superexpressão na maioria das amostras. Esta relação também ocorreu entre VEGFA e o miR126 e entre os miRNAs 106a, 106b, e seu gene alvo VHL. Considerando os grupos de risco, a superexpressão do miR200b foi associada com pacientes de alto risco (p = 0,01) e a superexpressão do miR126 foi associada com menor grau de Fuhrman (I-II) (p = 0,03). CONCLUSÕES: Os resultados mostram que em CRCC há um desequilíbrio na expressão de genes e miRNAs relacionadas com a angiogênese. Além disso através dos nossos achados podemos especular o papel do miR200b e do miR126 no prognóstico de CRCC
BACKGROUND: There are more than 200,000 cases of renal cell carcinoma (RCC) each year in the world, accounting for approximately 2% of all cancers. RCC clear cell type (ccRCC) is the most common subtype of RCC and accounts for 75 to 80% of the cases with highest rates of local invasion, development of metastasis and mortality. New target therapy is based on antiangiogenic antibodies and molecules, changing the course of the disease, but the results so far are disappointing. OBJECTIVES: Our aim is to study miRNAs and their target genes related to angiogenesis in ccRCC trying to bring some new knowledge to the molecular pathways related to the disease. METHODS: The expression levels of miRNAs miR-99a, 99b, 100; 199a; 106a; 106b; 29a; 29b; 29c; 126; 200a, 200b and their respective target genes: mTOR, HIF1-Î ±, VHL, PDGF, VEGF, VEGFR1 and VEGFR2 were evaluated using alfaRT-PCR.in snap-frozen tumor tissue samples from 56 patients diagnosed with ccRCC and 5 samples of benign renal tissue as control. The results were related to tumor size, Fuhrman nuclear grade and microvascular invasion, considering the risk criteria proposed by Dall\'Oglio et al. (2007). RESULTS: We compared the expression of genes with their possible regulatory miRNAs, and we found that mTOR was underexpressed while miR99a was overexpressed in most samples. This relationship also occurs between VEGFA and miR126 and between miRNAs 106a, 106b, and their target gene VHL. Considering the risk groups the overexpression of miR200b was associated with high-risk patients (p = 0.01) and the overexpression of miR126 was associated with lower Fuhrman grade (I-II) (p = 0.03). CONCLUSIONS: Our results show that in ccRCC there is an unbalance in the expression of genes and miRNAs related to angiogenesis and cell proliferation and survival. Furthermore with our findings we can speculate the role of miR200b and miR126 in the prognostic of ccRCC. We believe that the relationship between miRNAs and their respective genes should be more profoundly searched as markers and possible therapeutic agents in this neoplasia

Mise au point d'une technique permettant le masquage de l'anticorps monoclonal anti hla-dr et de l'antigene hla-dr des cellules, l'immunoprecipitation des antigenes hla-dr, l'isolement de l'immun complexe et sa quantification par chromatofocusing. Mise en evidence de la regulation hormonale de l'expression des antigenes: en particulier role de la prolactine de l'oestradiol et de la progesterone. Effets de la gestation et de la lactation. Travail effectue sur la tumeur mammaire chimio-induite par la n-nitroso-n-methyluree chez la rate ainsi que sur un modele tumoral humain: la lignee mcf7

L’hypothèse prédominante de cette thèse est que les changements métaboliques tumoraux mesurés par FDG-PET/CT sous l’influence des traitements anticancéreux, apparaissent plus précocement et parfois exclusivement par rapport aux modalités d’imagerie morphologique classique. L’imagerie multimodale, en combinant les avantages de chacune des techniques, dépasse leur limitations et pourrait permettre (i) une évaluation du bénéfice du traitement plus rapide et plus adéquate ;(ii) de modifier les algorithmes thérapeutiques à différents stades de cancer colorectal et (iii) d’améliorer la compréhension des mécanismes d’échappement aux traitements anticancéreux. Pour évaluer l’apport de l’imagerie multimodale dans l’évaluation de la réponse au traitement des cancers colorectaux (CCR), nous avons poursuivi 3 séries d’expérimentation cliniques.

1) Le premier projet explore l’imagerie multimodale comme un outil d’individualisation pour la radio-embolisation (microsphères chargées en 90Yttrium) chez des patients porteurs d’un CCR métastatique au niveau du foie, pour laquelle l’imagerie morphologique classique est incapable de mesurer l’effet thérapeutique. Nous montrons que l’usage non sélectif de la radio-embolisation améliore l’histoire clinique de ces patients, bien que certains d’entre eux ne semblent pas en bénéficier. Ensuite, par une analyse multimodale lésion par lésion intégrant angiographie-CT Scan, FDG-PET/CT et scintigraphie aux macro-agrégats d’albumine marqués au 99mTechnetium, nous démontrons que la distribution pré-thérapeutique des macro-agrégats d’albumine est hétérogène entre les différentes lésions des patients et prédictive de la réponse métabolique au sein de ces lésions, permettant le développement d’un outil de prédiction et de planification pour la radio-embolisation.

2) Le deuxième projet explore le domaine du CCR métastatique traité par chimiothérapie palliative. (i) Nous démontrons d’abord que la réponse métabolique (RM) tumorale après une cure de chimiothérapie cytolytique prédit plus vite et plus adéquatement que l’imagerie morphologique basée sur les critères RECIST les bénéfices cliniques du traitement. La RM précoce a une excellente valeur prédictive négative sur l’absence de réponse morphologique et met en évidence une variabilité de réponse inter-lésionnelle chez une proportion importante des patients. (ii) L’étude SoMore explore ensuite des patients présentant un CCR avancé et réfractaire, traités par capecitabine et sorafenib, et confirme l’importance pronostique des RM mixtes, suggérant une méthodologie de classification clinique basée sur la consistance de la RM. (iii) Cette classification cherche confirmation dans l’étude RegARd-C, encore en cours, évaluant les effets du regorafenib, et explorant également la signification génomique et épigénétique de la variabilité de RM.

3) Le troisième projet cherche à utiliser les propriétés de l’imagerie métabolique pour modifier l’algorithme de traitement adjuvant des patients porteurs d’un cancer du côlon de stade III. Ce projet, encore en cours, fait l’hypothèse que l’absence de RM de la lésion primitive après une cure de chimiothérapie prédit l’absence de bénéfice du traitement adjuvant complet. Une analyse intérimaire en démontre la faisabilité et confirme la présence de 40% de tumeurs présentant des caractéristiques métaboliques de chimio-résistance.

En conclusion, pour des patients porteurs d’un CCR, l’imagerie multimodale comprenant une évaluation du métabolisme tumoral permet une évaluation plus précoce et plus adéquate du bénéfice au traitement anticancéreux pour différentes modalités thérapeutiques comme la radio-embolisation, la chimiothérapie cytotoxique et les agents biologiques. L’imagerie multimodale permet de prédire et planifier les radio-embolisations et se révèle très prometteuse pour les traitements chimiothérapiques cytotoxiques ou combinés à des biologiques en situation adjuvante ou métastatique. Elle démontre par ailleurs une importante variabilité de réponse métabolique inter-lésionnelle qui représente un axe de recherche majeur sur les mécanismes moléculaires d’hétérogénéité génomique tumorale et de résistance aux traitements anti-cancéreux.

Doctorat en Sciences médicales
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Le but de la première partie de ce travail était de mieux comprendre la tumorigenèse thyroïdienne à

partir de modèles murins transgéniques développant des tumeurs de la thyroïde. Nous avons ainsi

analysé par microarrays l’expression génique au sein de thyroïdes de souris Tg-RP3 exprimant le

réarrangement RET/PTC3, responsable de cancers papillaires de la thyroïde chez l’homme (PTC), et

de souris Tg-E7 exprimant l’oncogène E7, responsable de cancers du col de l’utérus chez la femme.

Ces deux gènes étaient exprimés exclusivement dans la thyroïde grâce à un promoteur thyroglobuline.

Nous avons comparé les profils d’expression entre les différents génotypes (sauvages, Tg-RP3 et Tg-

E7) mais également entre différents âges (2, 6 et 10 mois). Sur le plan histologique, les souris Tg-E7

développaient d’énormes goitres avec une dysplasie de plus en plus marquée, mais n’ont pas démontré

de réelles lésions de carcinomes aux différents âges étudiés. Les thyroïdes de souris Tg-RP3

démontraient quand à elle une prolifération cellulaire et une croissance plus modérées, mais des

remaniements tissulaires plus importants, présents dès 2 mois, avec apparition de lésions de carcinome

chez de nombreux animaux essentiellement à 6 et 10 mois. Les résultats de l’analyse de l’expression

génique par microarrays rejoignaient ces observations histologiques. Dans les thyroïdes E7, ce sont

essentiellement les gènes impliqués dans le cycle cellulaire qui ont démontré une surexpression

significative. Dans les thyroïdes RP3, les processus cellulaires les mieux représentés par les gènes

surexprimés étaient déjà décrits comme des processus ayant un rôle important dans la tumorigenèse

thyroïdienne humaine :l’inflammation, le remodelage du milieu extracellulaire et l’angiogenèse. De

plus, plusieurs gènes classiquement surexprimés dans les PTC humains, l’étaient également dans les

thyroïdes RP3. Parmi ceux-ci le récepteur de la vitamine D (VDR) et la 1-alpha-hydroxylase

(CYP27B1), responsable de la conversion de la 25-hydroxyvitamine D3 en 1,25-dihydroxyvitamine

D3, ont particulièrement retenu notre attention étant donné une littérature croissante sur les effets antiprolifératifs

et immuno-modulateurs de la 1,25-dihydroxyvitamine D3 (calcitriol). Nous avons donc

étudié dans la deuxième partie de notre travail les effets anti-prolifératifs et transcripionnels du

calitriol sur plusieurs modèles thyroïdiens in vitro et in vivo. Si nous n’avons pu démontrer d’effets

concluants sur des lignées de cancers thyroïdiens humains, nous avons par contre démontré un effet

anti-prolifératif, le plus souvent dose-réponse, du calcitriol sur des cultures primaires de thyroïdes de

souris sauvages, Tg-RP3, Tg-E7 et humaines. Seule la 24-hydroxylase, intervenant dans l’inactivation

de la vitamine D, et le récepteur à la TSH ont démontré une surexpression significative en présence de

calcitriol par RTQ-PCR. Une étude d’expression génique par microarrays sur des cultures primaires de

thyroïdes RP3 et humaines traitées par éthanol (contrôle) ou calcitriol a permis de mettre en évidence

3 gènes significativement régulés dans le même sens, en l’occurrence sous-exprimés, en présence de

calcitriol :la nébulette, la thymopoïétine et la cycline E2. Le rôle exact joué par ces trois protéines

dans l’effet anti-prolifératif observé reste à déterminer. Les études in vivo de carence alimentaire en

vitamine D de souris Tg-RP3 n’ont pas démontré de différences significatives entre le groupe carencé

et non carencé que ce soit en termes de croissance glandulaire ou d’expression génique, après 2 ou 6

mois de carence. Seule la 1-alpha-hydroxylase est apparue significativement surexprimée après 2

mois, surexpression disparaissant après 6 mois. Cette régulation pourrait témoigner d’un mécanisme

d’adaptation de la thyroïde qui tente de contrer la carence en vitamine D circulante en augmentant la

concentration locale de vitamine D active. Ce phénomène disparaissant à 6 mois, il serait intéressant

de prolonger la carence au-delà de 6 mois pour assurer une réelle carence locale en 1,25-

dihydroxyvitamin D3. Nous avons ensuite traité des souris Tg-RP3 puis Tg-E7 par des doses variables

de CD578, un analogue « non calcimimétique » du calcitriol. Il est apparu que la dose ayant un effet

significatif au niveau transcriptionnel (surexpression de la 24-hydroxylase) était également la dose la

plus toxique, entrainant une hypercalcémie parfois létale. Le protocole principal a du être écourté en

raison d’un excès de mortalité. Le petit nombre d’animaux ayant survécu ne nous a pas permis de

conclure à une différence d’expression significative du Ki67 dans les thyroïdes de souris traitées par

CD578 par rapport aux souris contrôles. De nouvelles expériences devront donc être réalisées aux

doses les moins toxiques, administrées sur une plus longue période et sur un plus grand nombre

d’animaux, afin d’augmenter la probabilité d’observer un effet sur la prolifération, voire la

différenciation tissulaire.
Doctorat en Sciences médicales
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Les tumeurs thyroïdiennes constituent les tumeurs endocrines les plus fréquentes. Parmi celles-ci, on distingue les adénomes, tumeurs bénignes et encapsulées, et les carcinomes, tumeurs malignes. Ceux-ci sont eux-mêmes subdivisés, principalement sur base histologique, en carcinomes papillaires ou folliculaires, qui conservent certaines caractéristiques de différenciation des cellules thyroïdiennes initiales dont ils dérivent, et qui peuvent évoluer en carcinomes anaplasiques, totalement dédifférenciés. Les carcinomes différenciés de la thyroïde sont généralement de bon pronostic, contrairement aux cancers anaplasiques qui sont nettement plus agressifs, avec un taux de survie à 5 ans inférieur à 5%.

La technologie des microarrays permet d’analyser simultanément l’expression de milliers de gènes dans différentes cellules et différentes conditions physiologiques, pathologiques ou toxicologiques. Au cours de cette thèse de doctorat, nous avons déterminé le profil d’expression génique des carcinomes papillaires de la thyroïde à l’aide de la technique des microarrays en utilisant une plateforme contenant plus de 8000 gènes. Douze des 26 cancers papillaires étudiés étaient issus de patients habitant la région de Tchernobyl lors de l’explosion de la centrale nucléaire de 1986 et sont considérés comme des cancers radio-induits. Les 14 tumeurs restantes proviennent de patients habitant la France. Leur étiologie n’étant pas connue, ils sont considérés comme des cancers sporadiques.

La réalisation de ces expériences nous a permis d’identifier des signatures moléculaires entre des sous-types de cancers papillaires. Premièrement, nous avons montré que malgré un profil d’expression génique global similaire entre les cancers papillaires sporadiques et radio-induits, une signature multigénique permet de les séparer, indiquant que des subtiles différences existent entre les deux types de tumeurs. Deux autres signatures indépendantes, l’une liée aux agents étiologiques présumés de ces tumeurs (radiation vs. H2O2), l’autre liée aux mécanismes de recombinaison homologue de l’ADN, permettent également de séparer les cancers post-Tchernobyl des cancers sporadiques. Nous avons interprété ces résultats comme une différence de susceptibilité à l’irradiation entre ces deux types de tumeurs. D’autre part, nous avons pu identifier une liste de gènes permettant de séparer les cancers papillaires à variante classique des autres sous-types de cancers papillaires. L’analyse de cette liste de gènes a permis de mettre en relation cette signature avec l’important remodelage de cette variante histologique par rapport aux autres.

Ces expériences ont aussi abouti à l’obtention d’une liste de gènes différentiellement exprimés entre les cancers papillaires et leur tissu normal adjacent. Une analyse minutieuse de cette liste à l’aide d’outils statistiques a permis de mieux comprendre la physiopathologie de ces tumeurs et d’aboutir à différentes conclusions :(1) un changement de population cellulaire est observé, avec une surexpression de gènes liés à la réponse immune, reflétant l’infiltration lymphocytaire de ces tumeurs par rapport au tissu normal adjacent (2) la voie de signalisation JNK est activée par surexpression de ses composants (3) la voie de signalisation de l’EGF, également par une surexpression de ses composants, complémente les altérations génétiques des cancers papillaires pour l’activation constitutive de la voie ERK1/2 (4) une sousexpression des gènes de réponse précoce est observée (5) une surexpression de nombreuses protéases, d’inhibiteurs de protéases et de protéines de la matrice extracellulaire permet d’expliquer l’important remodelage des cancers papillaires (6) le profil d’expression génique des cancers papillaires peut être corrélé avec un mode de migration collectif de ces tumeurs.

Finalement, dans la dernière partie de la thèse, nous avons déterminé le profil d’expression génique des cancers anaplasiques de la thyroïde et l’avons comparé à celui des cancers papillaires. Nous avons montré que les deux types de tumeurs présentent des profils moléculaires globaux distincts, reflétant leur comportement tumoral très différent.

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The p53 tumour suppressor protein has a highly complex pattern of regulation at transcriptional and posttranslationallevels. The discovery of p53 isoforms has added another layer of complexity to the mechanisms thatregulate p53 functions. Indeed, p53 is expressed as 12 isoforms that differ in their N- and C-terminus due toalternative splicing, promoter or codon initiation usage. So far, there is limited understanding of the patterns ofexpression and of the functions of each of these isoforms.In this Thesis, we have focused on the two major p53 N-terminal isoforms, Δ40p53 and Δ133p53. We haveanalysed their patterns of interactions with the full-length p53 and we have investigated whether their expressioncould be deregulated in melanoma, a cancer type in which TP53 mutations are rare. Our results show that Δ40p53 can modulate p53 function with a bi-phasic effect, acting as a repressor or activator of p53 to control itslevels and activity. Moreover, we demonstrate that the internal P2 promoter produces Δ133p53 and is regulatedby p53 in response to genotoxic stress, identifying a novel auto-regulatory loop by which p53 may control theexpression of an isoform acting as an inhibitor of p53 activities. Finally, we show that mRNAs encoding Nterminalisoforms are often over-expressed in highly metastatic melanoma when compared to non-invasiveforms, suggesting that N-terminal isoforms contribute to functionally inactivate p53. Thus, we propose that Δ40p53 and Δ133p53 modulate p53 functions within dynamic fluctuations of aprotein network. Hence, p53 isoforms may have a major role in basal p53 activities as well as in the functionalinactivation of p53 in cancer cells.

Le neuroblastome, tumeur embryonnaire d'origine neuro‐ectodermique, représente, après les tumeurs cérébrales, la tumeur maligne la plus préoccupante de l'oncologie pédiatrique. L'extrême hétérogénéité des tumeurs neuroblastiques conduit d'une part, à rechercher les mécanismes de son oncogenèse, d'autre part, à améliorer la prédiction du risque de gravité, au diagnostic de la maladie.Le travail de thèse a consisté, à l'aide d'une cohorte tumorale de patients et de lignées de neuroblastome, à rechercher les microARN impliqués dans la progression tumorale. En comparant des tumeurs de bas risque à celles de haut risque, plusieurs microARN du cluster C14MC, situés au locus 14q32.31, ont été identifiés. L'expression de ces microARN corrèle le pronostic ; les tumeurs de haut risque présentant une perte d'expression différentielle. Ainsi, l'expression de miR‐487b et miR‐410 s'est révélée être un facteur pronostique supérieur à l'algorithme de risque standard actuel (âge, stade, statut de l'amplification de l'oncogène N‐MYC). Le contexte d'empreinte génomique parentale du cluster C14MC a conduit à rechercher d'autres microARN d'intérêt sur le second cluster de microARN du génome, C19MC, lui aussi soumis à empreinte. Dans les tumeurs de haut risque, une hyper‐expression relative du miR‐516a‐5p est significativement associée au pronostic. La combinaison des niveaux d'expression de miR‐487b et miR‐516a‐5p se révèle être un facteur pronostique supérieur aux seuls microARN du cluster C14MC : elle offre une nouvelle stratification de risque.Dans les tumeurs neuroblastiques, la dérégulation d'expression serait circonscrite aux microARN des deux clusters C14MC et C19MC ainsi qu'aux gènes vicinaux DLK1 et MEG3 du locus 14q 32.31, elle résulterait d'anomalies de méthylation. Le traitement de lignées de neuroblastome de phénotype neuronal par des modulateurs de l'épigénome (5‐Azacytidine et acide phényl‐butyrique) lève l'expression des microARN du C14MC et des gènes DLK1 et MEG3. Quant aux gènes cibles des miR‐487b et miR‐516a‐5p, les recherches désignent les gènes N‐MYC, TWIST1 et TWIST2 comme candidats directs ou indirects. Ces résultats et la littérature - rapportant, dans les formes agressives de plusieurs types de cancers de l'adulte, des anomalies d'expression des microARN des clusters C14MC (hypo‐expression) et C19MC (hyperexpression) - suggèrent très fortement l'implication de ces deux clusters dans la carcinogenèse humaine.

The cytokine TRAIL is a promising cancer therapeutic candidate as it induces apoptosis selectively in transformed cells. TRAIL-induced clustering of its receptors (DR) is essential for the DISC complex formation, which induces cell death. The mechanism for TRAIL's tumour selective effect is largely unknown. We identified the cytoskeleton proteins non-muscle myosin heavy chain IIa, IIb (NMHCIIa, NMHCIIb), myosin regulatory light chain (MLC2) and ß-actin as novel DR-interactors. An initially weak and TRAIL-induced abrogation of NMHCII/DR interaction correlated with efficient DISC formation in tumour cells. In contrast, a robust NMHCII/DR interaction that was sustained upon TRAIL stimulus was accompanied by incomplete DISC arrangement. Weakening the NMHCII/DR interaction in normal cells using chemical inhibitors enhanced TRAIL-induced apoptosis. Intriguingly, siRNA-mediated NMHCIIa- but not NMHCIIb depletion potently released TRAIL resistance in normal cells and influenced DISC composition. Reduced NMHCII/DR interaction in transformed cells was characterised by diminished MLC2 phosphorylation and altered protein expression of upstream regulatory kinases. Our results suggest that normal cell resistance to TRAIL-apoptosis is based on the interaction of cytoskeleton components with DR that is impaired upon transformation. Since NMHCII function in cell adhesion and migration, it will be interesting to study possible roles of the interaction in cell detachment and altered TRAIL sensitivity; moreover this link may provide clues as to the cause of TRAIL resistance in some cancers.

Malgré les avancées récentes, le cancer reste la première cause de mortalité en France avec ~ 150000 décès recensés par an (INCa 2012). Notamment, le cancer broncho-pulmonaire est l’un des plus agressifs, avec 29100 décès en 2011. La survie à cinq ans de seulement 10% des patients atteints des cancers du poumon non à petites cellules (NSCLC, 80% des cancers bronchiques), pose un problème d’ordre scientifique, médical et de santé publique. Il est communément admis qu’une sous-population de la tumeur acquiert en raison d’une instabilité génétique de nouvelles propriétés agressives nécessaires à sa dissémination, sa prolifération et une plus grande résistance aux chimiothérapies. Une meilleure compréhension de ces propriétés tumorales constitue un enjeu majeur pour prévenir à terme cette progression maligne. Nous avons axé notre recherche sur la macro-autophagie, un processus catabolique lysosomal essentiel à l’homéostasie cellulaire et sur un de ses substrats SQSTM1 (séquestosome ou p62). Au moment où j’ai initié ma thèse, une relation étroite entre l’autophagie, SQSTM1 et la progression tumorale venait d’être mise en lumière. Plusieurs membres de la machinerie autophagique sont fréquemment mutés/déletés dans les cancers. De façon paradoxale, l’autophagie peut également permettre la survie des cellules tumorales face à l’hypoxie, la carence nutritionnelle ou les chimiothérapies
Despite recent advances, cancer remains the leading cause of death in France with~150,000 annual deaths (INCA, 2012). Notably, lung cancer is one of the most aggressive, with 29 100 deaths in 2011. The five-year survival is only 10 % of patients with lung cancer non-small cell (NSCLC, 80% of lung cancers), so it’s a medical/scientific challenge, and public health problem. Due to genetic instability, it’s commonly accepted that a subpopulation of tumor acquires new aggressive properties for its dissemination, its proliferation and greater resistance to chemotherapy. A better understanding of these tumor properties is a major issue to prevent this malignant progression. We focused our research on macro-autophagy, a lysosomal catabolic process essential for cellular homeostasis, and alos on one of its substrates SQSTM1 (Sequestosome or p62). When I started my PhD, a close relationship between autophagy, SQSTM1 and tumor progression had been highlighted. Several members of the autophagic machinery are frequently mutated/deleted in cancers. Paradoxically, autophagy can also allow the survival of tumor cells under hypoxia, nutritional deficiency or chemotherapy. How could we understand these conflicting functions, considering that the only autophagy substrates known are long half-lives proteins, damaged organelles and scaffold SQSTM1? Thus, SQSTM1 is essential for RasV12 driven oncogenesis (A Duran et al, Cancer Cell 2008)

Le traitement des gliomes de haut grade constitue aujourd'hui encore un réel enjeu médical. Les techniques actuellement disponibles sont principalement palliatives et permettent d'augmenter la survie des patients de quelques mois seulement. Une technique innovante de radiothérapie consiste à renforcer la dose déposée dans la tumeur grâce à l'injection d'atomes lourds de manière spécifique dans celle-ci au préalable d'une irradiation de photons de basse énergie (50-100 keV). Cette technique a fait l'objet d'essais précliniques et maintenant d'essais cliniques de phases I et II sur la ligne médicale du synchrotron Européen dont le rayonnement monochromatique et intense est particulièrement adapté pour l'application. L'utilisation d'un agent de contraste (AC) iodé (Z=53) injecté par voie veineuse permet d'améliorer le bénéfice de la radiothérapie mais n'est cependant pas suffisante pour l'élimination complète de la tumeur. En effet, l'accumulation passive d'atomes lourds dans la tumeur n'est pas assez importante et le caractère extracellulaire d'un AC ne maximise pas l'efficacité biologique de l'irradiation. Les nanoparticules (NPs) métalliques apparaissent comme un moyen efficace pour repousser ces limites. Dans le cadre de cette thèse, des études ont été conduites sur la lignée cellulaire de gliome F98 afin de caractériser la toxicité et l'internalisation de trois types de nanoparticules différents : nanoparticules de gadolinium (GdNPs 3 nm), d'or (AuNPs 13 nm) et de platine (PtNPs 6 nm). La survie cellulaire a également été évaluée après différentes conditions d'irradiation de photons monochromatiques en présence de ces nano-objets. La dépendance de la réponse cellulaire à l'énergie du rayonnement incident ainsi qu'à la distribution subcellulaire des NPs a permis de mettre en évidence plusieurs mécanismes mis en jeu dans ce traitement. A concentration identique, les NPs diminuent la survie cellulaire de manière plus importante qu'un AC, validant ainsi l'intérêt microdosimétrique des NPs. L'effet est préférentiel à basse énergie (keV) indiquant que la photoactivation des atomes lourds est en partie responsable la réponse cellulaire. Par ailleurs, les GdNPs et les PtNPs se sont aussi montrées efficaces pour diminuer la survie cellulaire en combinaison à une irradiation à haute énergie (1.25 MeV) indiquant qu'un mécanisme de radiosensibilisation différent de la photoactivation intervient également. Les études précliniques, ont montré que le recouvrement complet de la tumeur par les NPs constitue un point clé pour garantir le bénéfice thérapeutique du traitement. Dans cette optique, une méthode de tomographie à deux énergies développée au synchrotron, a été caractérisée dans le cadre de ce travail. L'étude a permis d'imager de manière quantitative et simultanée la tumeur (mise en évidence par un AC iodé) et son recouvrement par des GdNPs (injectées par voie directe) chez le rongeur porteur d'un gliome. La correspondance entre la distribution de l'AC et la tumeur a également été étudiée à l'aide de techniques d'imagerie à haute résolution (IRM, tomographie X par contraste de phase et histologie).

La recherche d’abords thérapeutiques innovants est particulièrement d’actualité dans l’adénocarcinome canalaire du pancréas (ACP) tant le pronostic de ce cancer, dont l’incidence augmente, reste redoutable. Une des voies d’exploration réside dans la compréhension des mécanismes entrainant l’importante réaction stromale habituellement constatée dans l’ACP et prédisant la résistance à la chimiothérapie. Cette réorganisation tissulaire ou desmoplasie, résulte de l’activation de cellules normales présentes dans le tissu conjonctif de l’organe touché par les cellules tumorales d’origine épithéliale. Se développe ainsi un terreau fertile pour l’expansion des cellules cancéreuses, dont les fibroblastes activés sont un des acteurs prépondérants. Afin de mieux appréhender les interactions entre ces fibroblastes associés au cancer (CAF), les cellules tumorales et le reste du microenvironnement tumoral, l’étude de leur(s) mode(s) d’activation apparaît comme un préalable et pourrait permettre une stratification des patients dans leur orientation thérapeutique. L’identification d’un panel d’anticorps pertinent utilisable in situ en immunohistochimie (IHC) est donc un des enjeux pour la prise en charge future des patients atteints d’ACP et constitue l’objectif de ce travail
The search for innovative therapeutic approaches is particularly topical in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), as its prognosis remains daunting. One of the avenues of exploration lies in the understanding of the mechanisms leading to the important stromal reaction usually observed in PDAC predicting resistance to chemotherapy. This tissue reorganization or desmoplasia results from the activation of normal cells present in the connective tissue of the organ affected by tumor cells of epithelial origin. A fertile breeding ground for the expansion of cancer cells develops, of which activated fibroblasts are one of the most important players. In order to better understand the interactions between these cancer-associated fibroblasts (CAF), tumor cells and the rest of the tumor microenvironment, their characterization appears as a prerequisite and could allow stratification of patients in their therapeutic orientation. The identification of a relevant antibody panel that can be used in situ in immunohistochemistry (IHC) is therefore an issue for the future management of patients with PDAC and is the objective of this work

Les macrophages représentent une population de cellules immunes très présente dans certaines tumeurs malignes au sein desquelles ils vont jouer un rôle marqué dans la progression tumorale. Les macrophages représentent donc une cible thérapeutique intéressante dans le traitement de ces tumeurs infiltrées. Ce ciblage des macrophages peut être envisagé grâce à des vecteurs comme les systèmes d'encapsulation nanoparticulaires connus pour être facilement phagocytés par les macrophages après une administration locale ou parentérale. L'objectif de ces travaux de thèse a donc été de développer des nanoparticules polymères (NP) capable de cibler les macrophages infiltrés dans la tumeur et de libérer in situ un principe actif encapsulé au sein de ces NP. Les NP pourraient ainsi modifier les fonctions des macrophages ou encore permettre l'utilisation des macrophages comme une réserve d'actif anticancéreux. Après une étude de formulation, des NP à base d'acide poly(D,L)lactique de taille de 200 nm ont été sélectionnées. Ces NP présentent une bonne internalisation par les macrophages in vitro et un ciblage spécifique des macrophages infiltrés dans une tumeur de gliome humain, implantée chez des souris nudes, suite à une injection intratumorale de NP. Le premier actif modèle encapsulé est l'acide tout-trans rétinoïque (RA), molécule immuno-modulatrice pouvant modifier les fonctions macrophagiques. Les NP-RA peuvent encapsuler environ 90% d'actif et présentent un profil de libération prolongée du RA pendant 4 jours combiné à une amélioration de sa stabilité. De plus, ces NP-RA ont montré qu'elles pouvaient engendrer in vitro, une modification de l'expression de certains gènes des macrophages. Le deuxième type d'actif encapsulé lors de ces travaux est la vitamine D3 et ses dérivés (25-OH-vitamine D3 et 1,25-(OH)2-vitamine D3) possédant des propriétés anticancéreuses mais à l'origine de nombreux effets secondaires dus à un manque de spécificité d'action. L'objectif serait alors de mieux cibler les cellules tumorales grâce aux macrophages infiltrant ces tumeurs et d'éviter ainsi les hypercalcémies secondaires dues à l'administration de fortes doses de vitamine D3. Une étude in vitro sur une lignée cellulaire de cancer de sein (MCF-7) a permis de montrer l'avantage des NP pour prolonger et intensifier l'action antiproliférative des dérivés de vitamine D3

Malgré les avancées récentes, le cancer reste la première cause de mortalité en France avec ~ 150000 décès recensés par an (INCa 2012). Notamment, le cancer broncho-pulmonaire est l'un des plus agressifs, avec 29100 décès en 2011. La survie à cinq ans de seulement 10% des patients atteints des cancers du poumon non à petites cellules (NSCLC, 80% des cancers bronchiques), pose un problème d'ordre scientifique, médical et de santé publique. Il est communément admis qu'une sous-population de la tumeur acquiert en raison d'une instabilité génétique de nouvelles propriétés agressives nécessaires à sa dissémination, sa prolifération et une plus grande résistance aux chimiothérapies. Une meilleure compréhension de ces propriétés tumorales constitue un enjeu majeur pour prévenir à terme cette progression maligne. Nous avons axé notre recherche sur la macro-autophagie, un processus catabolique lysosomal essentiel à l'homéostasie cellulaire et sur un de ses substrats SQSTM1 (séquestosome ou p62). Au moment où j'ai initié ma thèse, une relation étroite entre l'autophagie, SQSTM1 et la progression tumorale venait d'être mise en lumière. Plusieurs membres de la machinerie autophagique sont fréquemment mutés/déletés dans les cancers. De façon paradoxale, l'autophagie peut également permettre la survie des cellules tumorales face à l'hypoxie, la carence nutritionnelle ou les chimiothérapies.

Cholangiocarcinoma (CC) is a rare but fatal primary liver cancer and accounts for an estimated 15% of primary liver cancer worldwide. It is associated with high mortality due to the lack of established diagnostic approaches. Autoantibodies can be used clinically as diagnostic markers for early cancer detection of cholangiocarcinoma. Studies, indicating the presence of auto-antibodies (AAbs) in CC have not been reported yet. No immunological biomarker, correlated to the disease, has been identified. The objective of our study was to identify cellular proteins from liver tissues (tumoral and non tumoral) and cholangiocarcinoma cell lines which could be recognized by antibody of CC patients. We used serological proteome analysis (SERPA) technique which leads us to suggest some molecules as potential biomarkers for the early diagnosis of CC. Proteins from different origins were 2DE separated: CCSW1 and CCLP1 tumor cell lines, five different samples of hepatectomies for CC with respect to their tumoral and non-tumoral counterparts and a normal liver from amyloid neuropathy. Sera from 13 CC patients and a pool of 10 healthy subjects were probed on immunoblot performed with these different separations. Comparison of immunoblotting patterns given by patient's sera compared to patterns given by controls allowed to define immunoreactive spots of interest and those reacting with more than one-third of sera were identified by orbitrap type mass spectrometry. In this way we identified 10, 11, 9, 14 and 16 proteins from CCSW1, CCLP1, tumor part, non-tumor counterpart and normal liver antigenic extracts respectively. Different patterns of reactivity were observed according to sera on the same antigenic extract, and for a same serum, according to the antigenic extract, even though few common patterns were also observed. This widespread of reactivity is not unusual and reported earlier in several studies of this sort. It is indicated that a single AAb have an ability to identify only a small proportion of patient. For this reason, several antibodies in combination must be used to ensure sensitivity and specificity of assays used in the daily clinic.Identified proteins were then categorized by gene ontology analysis by which they fall into three main groups; biological process and molecular functions, protein class and molecular pathway and cellular component, according to the Panther classification. By Gene Ontology classification, two different patterns of targeted antigens were observed. The vast majority of targeted-proteins with catalytic activity were found in normal liver or non-tumor specimens. The second pattern was mainly represented by targeted proteins categorized as structural proteins extracted from CC cell lines and tumor tissues. Proteins identified with catalytic activity were: alpha-enolase, fructose biphosphate aldolase B and glyceraldedyde 3-phosphate dehydrogenase; which were reactive with more than 50% of CC sera. Proteins identified with structural activity, and detected with high rates by using cell lines and tumor tissues, were: vimentin, prelamine A/C, annexin A2 and actin; reactivity of each protein was higher than 62% with CC sera. Serotranferrin, identified under the category of transfer/carrier proteins, recognized by 100% of CC sera by using tumor tissues.High sensitivity and specificity is a prime requisite of AAbs that might be used as CC biomarkers for CC diagnosis. Most of the AAbs detected in this study had previously been reported in other cancers and auto-immune disorders. Hence it is essential to prove the specificity of antigenic proteins, a combination of various antigens therefore needs to be tested to enable the development of new biomarkers for the diagnosis and prognosis of CC.In conclusion, the proposed potential biomarkers need to be tested in a variety of different combinations with a panel of significant number of patients and using the most appropriate substrate defined during this study.

Malgré la complexité du processus de transformation, plusieurs systèmes modèles ont été développés dans lesquels les cellules normales se transforment d'une manière progressive par l'introduction d'éléments génétique. Ici, seules les cellules transformées rentrent en apoptose induite par TRAIL. Comme le milieu des cellules sénescentes a déjà été impliqué dans certaines caractéristiques tumorales (la prolifération, l'invasion et d'autres), notre objectif était d'évaluer soneffet potentiel sur l'acquisition de la sensibilité à TRAIL. Lorsque toutes les cellules de ce système de transformation sont incubés avec le milieu conditionné de cellules sénescentes (CMS) la sensibilisation à TRAIL a été observée dans les cellules pré-transformées mais pas dans les cellules immortalisées ou normales. Ainsi, nous avons conclu que les différentes étapes de la transformation fournissent un contexte cellulaire et moléculaire particulier qui agit en synergie avec le CMS afin de promouvoir la sensibilisation à TRAIL. Ces observations mettent l'accent sur le rôle spécifique descellules sénescentes et leur phénotype sécrétoire. Nous avons ensuite étudié les mécanismes activés dans les cellules pré-transformées par le CMS et responsables de leur sensibilisation à TRAIL. Nos résultats suggèrent un rôle clé de l'axe Myc-FLIPL dans la signalisation activée par le CMS.

Les tumeurs solides sont souvent confrontées à un environnement déficient en oxygène, dit hypoxique. Hypoxia-Inducible Factor 1 (HIF1) est le facteur de transcription clé de l’adaptation cellulaire à l’hypoxie, régulant de nombreux gènes impliqués dans l’angiogenèse, le métabolisme cellulaire ou la régulation du pH. Ma thèse s’articule en trois axes autour de HIF1 et de la reprogrammation métabolique hypoxique. J’ai d’abord étudié Factor-Inhibiting HIF1 (FIH), l’un des deux senseurs d’oxygène régulant HIF1. Nous avons montré que FIH est essentiel dans le développement tumoral en inhibant à la fois l’activité transcriptionnelle de HIF1 et la voie p53-p21. J’ai ensuite étudié le « shift » du métabolisme cellulaire vers la glycolyse induit par HIF1, générant une addiction pour le glucose. Nos travaux ont montré que paradoxalement, les cellules hypoxiques synthétisent du glycogène via HIF1 constituant ainsi une réserve de glucose intracellulaire. Le glycogène confère alors une résistance accrue des cellules tumorales suite à une carence en glucose. Enfin, j’ai pu montrer que l’AMPK, « gardien de la balance énergétique », n’est pas nécessaire au maintien d’un niveau viable d’ATP suite à l’inhibition de la glycolyse, via le blocage de l’export de lactate, mais exerce, un effet protecteur en absence de glucose. Cependant, l’inhibition conjointe du transporteur de lactate, MCT4, et de l’AMPK réduit fortement le développement tumoral dans un modèle de xénogreffes chez la souris, suggérant un rôle crucial de ces deux acteurs dans ce contexte. L’ensemble de ces travaux a permis d’identifier plusieurs cibles potentielles impliquées dans la plasticité métabolique en hypoxie
Cells of solid tumors are often exposed to an environment deficient in oxygen, i.e. hypoxic. The Hypoxia-Inducible Factor-1 (HIF-1) is the major transcription factor involved in cellular adaptation to hypoxia. HIF-1 regulates a wide array of genes involved in angiogenesis, cellular metabolism or pH regulation. My thesis is organized into three axes around HIF-1 and metabolic reprogramming in hypoxia. I first studied Factor-Inhibiting HIF-1 (FIH), one of two oxygen sensors regulating HIF-1. We showed that FIH is essential for tumor development through inhibition of the HIF-1 transcriptional activity as well as through the suppression of the p53-p21 axis. I then studied the HIF-1-induced « shift » in cellular metabolism toward glycolysis, which generates a type of “glucose addiction”. We showed that paradoxically, tumor cells store glycogen in hypoxia through a HIF-1 dependant mechanism. Glycogen served as a reservoir of intracellular glucose, which allows hypoxic cells to survive periods of glucose starvation. Finally, I studied AMPK «the guardian of energy », and showed that surprisingly, this kinase is not necessary in maintaining a viable level of ATP when glycolysis is inhibited (by blockade of lactate export). However, as expected, AMPK protected cells during glucose starvation. Moreover, combined inhibition of the lactate transporter MCT4 and of AMPK reduced dramatically tumor development in a xenograft model, suggesting a crucial role for these two actors in the context of growth of tumor cells in a hostile environment. Taken together these results identified several potential drug targets involved in the metabolic plasticity of hypoxic cells

Les fibromatoses agressives sont des tumeurs conjonctives rares, pouvant envahir les structures adjacentes parfois de manière très agressive et responsables de fréquentes récidives loco-régionales mais dépourvues de potentiel métastatique. Leur évolution est imprévisible. Actuellement, la stratégie de leur prise en charge est remise en cause et ces tumeurs sont de plus en plus souvent surveillées à leur diagnostic. En cas de tumeur évolutive, les traitements systémiques disponibles sont multiples mais d'efficacité variable. Aucun facteur pronostique de récidive ou d'évolutivité spontanée et aucun facteur prédictif d'efficacité des traitements médicaux n'a aujourd'hui été identifié. Les travaux de 2 premières publications ont étudié les facteurs cliniques de récidive après exérèse chirurgicale, et ont retenu le jeune âge du patient, la grande taille tumorale et sa localisation extra-abdominale comme étant de mauvais pronostic. Dans une 3ème publication, nous avons recherché si le sous-type moléculaire de mutation de CTNNB1 observé dans les fibromatoses sporadiques pouvait influencer la récidive: la mutation S45F est de moins bon pronostic que les autres. Un autre article rapporte les résultats de l'analyse des profils d'expression des miRNAs des fibromatoses qui semblent se corréler à leur pronostic mais cela doit être confirmé. Les 3 articles suivant présentent des travaux recherchant des facteurs prédictifs de réponse des fibromatoses à l'imatinib : l'expression d'aucune des cibles connues de l'imatinib n'a été retrouvée comme influençant significativement la réponse au traitement. Le rôle des variants M541L et V530I de l'exon 10 de KIT reste à déterminer

Le carcinome médullaire de la thyroïde (CMT) est une tumeur neuroendocrine rare, se développant à partir des cellules sécrétant la calcitonine. Cette tumeur survient dans un contexte familial dans un tiers des cas. Toutes les formes germinales et près de 40% des formes sporadiques sont causées par une mutation ponctuelle activatrice de l’oncogène RET, codant pour un récepteur membranaire à activité tyrosine kinase. Les événements oncogéniques à l’origine des formes sporadiques non mutées RET restent mal définis, à l’exception de mutations activatrices des oncogènes RAS découvertes récemment.Le pronostic péjoratif du CMT est essentiellement lié à un envahissement ganglionnaire précoce. A ce titre, la chirurgie initiale est souvent insuffisante et les formes métastatiques ont longtemps été considérées en impasse thérapeutique. L’avènement récent des inhibiteurs séléctifs de tyrosine kinases (ITK) a apporté un nouvel élan à la prise en charge des tumeurs réfractaires, certains d’entre eux incluant dans leur spectre d’action le récepteur RET. Mais l’optimisation de ces traitements requiert une connaissance préalable des mécanismes moléculaires sous-jacents au développement tumoral.Dans ce contexte et en nous appuyant sur une collection importante de prélèvements humains, nous avons cherché à approfondir la decription du ‘paysage génomique’ du CMT.Dans un premier temps, nous avons évalué les anomalies structurales ponctuelles et chromosomiques présentées par les CMT. Nous avons montré, par optimisation de méthodes de séquençage, que les mutations des gènes RET et RAS interviennent dans plus de 96% des cas et que ces évènements sont mutuellement exclusifs. Ces mutations permettent de distinguer plusieurs groupes d’agressivité et de réponse aux traitements par ITK. Nous avons également observé - par technique d’hybridation génomique comparative - des anomalies de grande ampleur récurrentes dans cette pathologie : les délétions du bras court du chromosome 1 et des chromosomes entiers 4 et 22 apparaissent comme étant des évènements précoces et indépendants de la tumorigenèse du CMT.Dans un second temps, nous avons déterminé - par approche de type biopuce - les profils d’expression de microARN dans les CMT. Certains de ces régulateurs post-transcriptionnels majeurs semblent liés au caractère invasif de la tumeur, et notamment les miR-21, miR-199 et miR-129. Nous avons également démontré le potentiel d’utilisation des microARN miR-21 et miR-199 en tant que biomarqueurs circulants du CMT. L’impact fonctionnel des formes précurseurs mir-21 et mir-129 a ensuite été évalué par transfection dans les modèles cellulaires TT et MZ-CRC1.Les observations ainsi obtenues offrent de nombreuses perspectives d’études. Elles permettent la définition de marqueurs tissulaires distinguant a priori les tumeurs métastatiques et/ou réfractaires aux thérapies. Enfin, elles mettent en lumière de nouvelles pistes pour la découverte de cibles thérapeutiques additionnelles dans cette pathologie
Medullary thyroid carcinoma (MTC) is a rare neuroendocrine tumor, arising from calcitonin-secreting cells. This cancer occurs in a family context in a third of cases. All inherited forms and nearly 40% of sporadic forms are caused by activating point-mutations in the RET oncogene, coding for a tyrosine-kinase receptor. Other oncogenic events causing sporadic cases remain unclear, but activating mutations of RAS oncogenes have been discovered recently.Prognosis of MTC is essentially linked to early lymph node occurrence. Initial surgery of metastatic forms is often insufficient and patients are considered in therapeutic dead-end. The recent advent of selective tyrosine-kinase inhibitors (TKIs) has brought a new impetus to the management of refractory tumors, some of them targeting the RET receptor. Optimization of these treatments require improving knowledge of the underlying molecular mechanisms of tumor development.In this context and helped by a large collection of human specimens, we have sought to deepen the description of genomic landscape of MTC.At first, we evaluated the structural and chromosomal abnormalities presented by MTC. We showed, by optimizing sequencing methods, that RET and RAS mutations are involved in over 96% of the cases, these events are mutually exclusives. These mutations can distinguish several groups of aggressiveness and of response to TKI treatments. We also observed, by comparative genomic hybridization techniques, recurrent abnormalities such as deletion of the short arm of chromosome 1 and loss of entire chromosomes 4 and 22. These losses appear to be early events of tumorigenesis MTC.In a second step, we determined - by a microarray approach – the microRNA expression profile of MTC. Some of these post-transcriptional regulators seem related to tumor invasiveness, such as miR-21, miR-199 and miR-129. We demonstrated the potential of microRNAs miR-21 and miR-199 as circulating diagnosis biomarkers of MTC. The functional impact of the precursor forms mir-21 and mir-129 was then evaluated by transfection in TT and MZ- CRC1 cellular models.Observations obtained pave the way for a lot of new potential studies. They allow the definition of tissue biomarkers distinguishing metastatic forms or refractory patients. Finally, they highlight new pathways for the discovery of additional therapeutic targets in this disease