Literatura académica sobre el tema "Tessuto muscolare"

In questa seconda parte, l’attenzione viene focalizzata sulle “cellule staminali non embrionali”, cioè le cellule staminali somatiche (di origine fetale o adulta) e le cellule staminali del sangue del cordone ombelicale. Queste cellule, spesso definite “cellule staminali adulte”, sono state identificate prima delle cellule staminali embrionali. Infatti, l’espressione stessa di cellula “staminale” deriva dall’identificazione delle cellule staminali emopoietiche nel midollo osseo (1961). Più tardi le ricerche hanno evidenziato la presenza di tali cellule immature, multipotenti, che si auto-rinnovano e si auto-differenziano pressoché in tutti i tessuti ed organi del feto e dell’adulto. Appena scoperte, queste cellule staminali “adulte” hanno trovato subito un impiego terapeutico con i primi trapianti di midollo osseo per il trattamento di patologie, maligne e non, del sangue e del sistema linfoide. Oggi le cellule staminali emopoietiche sono usate anche nel trattamento di malattie auto-immuni, come la sclerosi multipla o il lupus erythematosus e nella medicina rigenerativa. Una seconda fonte importante di cellule staminali “adulte” è rappresentata dalle cellule staminali mesenchimali, situate principalmente nel midollo osseo, progenitrici di vari ceppi cellulari: osso, cartilagine, muscolo, tessuto adiposo e astrociti. Queste cellule sembrano avere un ruolo-chiave nella rigenerazione dei tessuti. Sono stati isolati diversi tipi di cellule mesenchimali multipotenti, con proprietà paragonabili a quelle delle cellule staminali embrionali. Il più noto è quello delle MAPCs di Catherine Verfaillie. Queste cellule sono usate clinicamente per vari scopi, tra cui la rigenerazione del miocardio infartuato, l’angiogenesi terapeutica in pazienti con ischemia periferica acuta (specialmente la malattia di Buerger) e il bioengineering (rivestimento cellulare di legamenti o di valvole cardiache sostitutive). In questo ambito si sono registrati risultati incoraggianti nell’animale per il trattamento delle malattie neurodegenerative, dell’ictus, del trauma cerebrale e dei danni del midollo spinale. Sono stati isolati molti altri tipi di cellule staminali “adulte” le cui proprietà riparatrici sono state verificate con successo nell’animale: cellule staminali neuronali (per il morbo di Parkinson, la sclerosi multipla, il morbo di Huntington, l’ictus, il trauma cerebrale, le lesioni del midollo spinale), cellule staminali muscolari (per l’incontinenza urinaria, il danno miocardico), cellule staminali endoteliali (per l’ischemia acuta periferica), cellule staminali cardiache, cellule staminali della retina (per la degenerazione maculare), cellule staminali del limbus della cornea (per il danno corneale). Allo stato attuale, i risultati clinici più promettenti si sono ottenuti con le cellule staminali del sangue del cordone ombelicale (UCB), che hanno portato allo sviluppo di un’area di mercato caratterizzata dalla creazione di banche private di UCB. Generalmente le cellule UCB provocano, al massimo, una reazione immune piuttosto blanda quando vengono trapiantate in soggetti con donatori non compatibili. Si usano con successo laddove sia necessaria una riparazione o rigenerazione nell’organismo del ricevente. I migliori risultati con cellule staminali UCB, fino ad ora, sono stati ottenuti nel trattamento di bambini con morbo di Krabbe. Benefici si sono ottenuti anche dal trapianto locale di cellule UCB in pazienti con danni al midollo spinale. ---------- In this second part of the article, the attention is focused on “non embryonic stem cells”, that is somatic stem cells (from fetus or adult organisms), and umbilical cord blood stem cells. These stem cells, sometimes referred to as “adult stem cells”, were known and recognized as such before the embryonic ones. In fact the mere expression “stem” cells to designate this particular type of immature cell, from which derive all the others, more differentiated cells, came from the identification of the hematopoietic stem cells, in bone marrow (1961). Later investigations have shown that there are such cells, immature, multipotent, self-renewing, and self-differentiating ones in almost all tissues and organs of fetus or adult organism. As soon as they were discovered, these “adult”, autologous stem cells were immediately put in the service of patients, with the first transplantations of bone marrow performed either for the treatment of malignancies, or for the treatment of hematologic disorders. Today, autologous hematopoietic stem cells are also used for the treatment of auto-immune diseases, such as multiple sclerosis or lupus erythematosus and for regenerative medicine. A second, important source of “adult” stem cells are the mesenchymal stem cells, found mainly in bone marrow, but also in blood, progenitors of multiple cell lineages, including bone, cartilage, muscle, adipose tissue and astrocytes, and which seem to hold the key to tissue regeneration. Different types of multipotent mesenchymal stem cells, with properties comparable to those of embryonic stem cells, have been isolated, the best known being the multipotent adult progenitor cells (MAPCs). These cells are used clinically mainly for the healing of the heart after myocardial infarction, with positive statistically significant results, for therapeutic angiogenesis in patients suffering of peripheric ischemic disease (especially Buerger’s disease), and for bioengineering (cellular coating of artificial ligaments or of prosthetic heart valves). They have given promising results in animals for the treatment of neurodegenerative diseases, ictus, brain trauma and spinal cord injuries. Many other types of “adult” stem cells have been isolated and their healing properties assessed with success in animals, such as neural stem cells (for Parkinson’s disease, multiple sclerosis, Huntington’s disease, ictus, brain trauma, spinal cord injury), muscle stem cells (for urinary incontinence, myocardial infarction), endothelial stem cells (for critical limb ischemia), cardiac stem cells, retinal stem cells (for macular degeneration), limbal stem cells (for damaged cornea). At the moment, the more promising results in patients have been obtained with umbilical cord blood stem cells (UCB), prompting the birth of a commercial trade based on private banks. Umbilical cord blood stem cells offer indeed the advantage of their immaturity: as such, they rarely trigger more than a mild immune reaction when transplanted in unrelated recipient organisms. They are used with profit wherever a healing or regenerative process is necessary in a given patient. Up to now, best results with the UCB cells have been obtained in the treatment of children with Krabbe’s disease. Some patients with injured spinal cords have also experienced benefits from UCB cells grafts.

Il tessuto muscolare scheletrico costituisce circa il 40% della massa corporea ed è di fondamentale importanza per un organismo in quanto è responsabile dei movimenti, della postura e dell’equilibrio, oltre che di importanti funzioni metaboliche. La perdita di questo tessuto può essere causata da una malattia progressiva oppure da un danno accidentale e tuttavia il muscolo scheletrico ha la capacità di rigenerarsi in modo rapido e completo così da prevenire la perdita di massa muscolare. Le cellule satelliti, cellule localizzate tra la membrana plasmatica e la lamina basale di ciascuna fibra, sono considerate le cellule staminali muscolari: in occasione di un qualsiasi processo degenerativo, esse vengono attivate ed iniziano a proliferare. Le cellule figlie migrano per formare catene di cellule satelliti disposte longitudinalmente sotto la lamina basale, qui si fondono tra di loro o con altri miotubi preesistenti per formare nuove fibre muscolari multinucleate. Le cellule satelliti hanno una limitata capacità proliferativa e probabilmente non possono sostenere molteplici cicli di rigenerazione durante fasi ripetute di degenerazione e rigenerazione, ciò è verosimilmente la causa della natura progressiva delle distrofie muscolari. L’ingegneria tissutale del muscolo, ovvero l’utilizzo di un’impalcatura artificiale a supporto di mioblasti/cellule staminali, sta delineandosi da alcuni anni come una strategia terapeutica innovativa per la cura di molte malattie del sistema muscolare scheletrico. Lo scopo dell’ingegneria tissutale è recuperare tessuti ed organi persi, danneggiati o compromessi, partendo da cellule proliferanti in coltura per terminare con strutture cellulari differenziate tessuto-simili. La matrice extracellulare (ECM) gioca un ruolo essenziale nel determinare il comportamento delle cellule durante i processi di rimodellamento tissutale che portano a strutturare tissuti maturi. Quindi, è auspicabile controllare il differenziamento cellulare durante la rigenerazione del tessuto, mimando l’ECM mediante l’uso di materiali ingegnerizzati. La modifica delle proprieta’ biofisiche e meccaniche di questi biomateriali puo’ essere usata come strategia per indurre risposte cellulari specifiche. Inoltre, un biomateriale iniettabile sotto forma di idrogel, avendo queste caratteristiche, ha come vantaggio ulteriore quello di essere facilmente engrafted in vivo al fine di trasportare cellule staminali e/o molecole bioattive per promuovere il rinnovamento tissutale. La nostra ricerca ha avuto come scopo l’utilizzo di un idrogel iniettabile fatto di glicole polietilenico (PEG) coniugato al fibrinogeno, il PEG-fibrinogeno (PF). Questo biomateriale è stato usato come scaffold per la ricostruzione muscolare in vitro ad opera di mesoangioblasti (Mabs), cellule progenitrici mesodermiche associate ai vasi, e di mioblasti (cellule satelliti, SCs) isolati freschi. Inoltre il PF è stato testato come carrier per il delivery dei Mabs in vivo al fine di incrementare il processo rigenerativo di muscoli danneggiati. Gli scaffold di PF usati per le colture in tre-dimensioni in vitro hanno permesso una buona sopravvivenza cellulare ed hanno accelerato il processo differenziativo in muscolo scheletrico, portando alla formazione di miotubi contrattili entro le ventriquattro ore (normalmente, le colture in due dimensioni richiedono tre giorni prima di esibire la formazione di miotubi). Inoltre, utilizzando il biomateriale con un disegno più complesso, cioè contenente al suo interno dei microcanali creati con la microablazione laser, il PF ha permesso l’allineamento delle cellule lungo i canali, quindi il differenziamento e la formazione di fibre muscolari mature ben orientate. In una prima serie di esperimenti in vivo siamo riusciti ad indurre il differenziamento di tessuti simil muscolo da PF e Mabs impiantati sotto la cute in topi immunodeficienti. Il PF ha mostrato di essere in grado di promuovere la crescita ed il differenziamento dei precursori miogenici, proprio come accade in vitro, portando alla formazione di un vero e proprio organoide, senza dare segni di tumorigenicità. Nella seconda serie di esperimenti in vivo, invece, il PF è stato usato come carrier di Mabs in muscoli danneggiati (tibiali anteriori) di topi immunodeficienti. La presenza del PF ha permesso un’aumentata sopravvivenza delle cellule trapiantate, una migliore ritenzione cellulare in situ e un complessivo miglioramento nell’engraftment cellulare, che si è tradotto in una più rapida rigenerazione del tessuto danneggiato. In conclusione, i biomateriali ed in particolare gli idrogel come il PF possono essere facilmente utilizzati per il trasferimento di cellule muscolari scheletriche, mediante una semplice procedura di iniezione one-step, e quindi potrebbero avere un enorme impatto nel trattamento di patologie degenerative a carico dei muscoli scheletrici, come la distrofia muscolare.
Tissue engineering aims to replace lost, damaged or failing tissue and organs, starting with cultured proliferating cells and ending with tissue-like structures. The extracellular matrix (ECM) plays a pivotal role in determining cell behavior during tissue remodelling processes leading to complete differentiated structures. Therefore it is desirable to control cell differentiation during tissue regeneration by mimicking the ECM using engineered biomaterials. To modify the biophysical and mechanical properties of these biomaterials can be used as a strategy to elicit specific cellular responses. Moreover, an injectable hydrogel biomaterial, having such capabilities, should have the advantage to be easily engrafted in vivo in order to carry stem cell and/or bioactive molecules to promote tissue renewal. Our research is thus focused on the use of an injectable hydrogel made from polyethylene glycol (PEG) conjugated to Fibrinogen. The PEG-Fibrinogen (PF) is used as scaffold for in vitro muscle reconstruction, seeded and cultured with mesoangioblasts (vessel associated progenitor cells) and freshly isolated muscle satellite cells (SCs). The PF, which can be controlled in terms of its matrix modulus, is tested in vivo as mesoangioblast carrier for muscle regeneration. The PF scaffold used for in vitro 3-D cultures promoted good survival of miogenic precursors and accelerated skeletal muscle differentiation (contractile myotubes) within 24 hours (normally, 2-D cultures take three days to exhibit myotube formation). The confining geometry of the microchannels created with microablation in the PF scaffolds promoted the development of oriented mature muscle fibers. Sub-cutaneous PF/miogenic precursors implants in Rag2 Chain -/- mice were able to form a “muscle organoid”. Finally, in vivo experiments using PF as a cell carrier showed increased transplanted cell survival, ameliorated in situ cellular retention and an overall improvement in cell engraftment. Injectable hydrogel biomaterials can be readily applied for skeletal muscle cell delivery by a simple one-step injection procedure and could have a noteworthy impact in the treatment of muscular dystrophy.

2012/2013
The skeletal muscle is a terminally differentiated tissue. Its capacity to repair following injury or disease depends on a population of myogenic precursors, named satellite cells. These cells are localized beneath the skeletal muscle fiber, in a specialized microenvironment, the niche. The niche preserves the homeostatic conditions of satellite cell quiescence, but at the same time, it ensures their responsiveness to mechanical, physical and chemical triggers from the surrounding environment. Therefore, the composition of the external milieu is critical in determining satellite cell behavior. As a matter of fact, during aging or under pathological conditions, alterations of the extracellular environment entail a severe impairment of satellite cell ability to sustain regeneration and repair of the skeletal muscle tissue. The general goal of this thesis was to focus on some of the trophic factors potentially present in the satellite cell niche in vivo and to characterize their role on the modulation of satellite cell functions in vitro. The first part of the research activity dealt with the study of the trophic effect of ATP on mouse myoblast proliferation. From literature, it emerged that ATP is a potential regulator of the skeletal muscle regenerative program, however the signalling mechanism remained partially unknown. We observed that ATP increased myoblast growth rate, effect that was mimicked by low concentrations of H2O2. Reactive oxygen species (ROS) imaging revealed that ATP induced H2O2 production, at concentrations comparable to those effective in triggering myoblast proliferation. Interestingly, the exposure to equimolar concentrations of adenosine did not mimic the effect of ATP, excluding any role for the main hydrolysis product of ATP in the control of cell cycling. This result was in agreement with data reporting that the specific enzymes responsible for ATP degradation are poorly expressed in myoblasts and become upregulated after cell differentiation. In line with the latter observation, it appeared reasonable that the differentiating skeletal muscle cells were more exposed to ATP-derived adenosine than proliferating myoblasts, and this suggested a potential physiological role for the nucleoside adenosine in the later phases of myogenesis. Taking into account that adenosine receptors (ARs) are present in mouse myotubes, in a second study we hypothesized a crosstalk between nAChRs and ARs. Using the Ca2+-imaging technique, we observed that the pharmacological modulation of ARs triggered variations in the nAChR-driven ([Ca2+]i) spikes. Moreover, our preliminary results suggest not only an interplay between the two receptors but also that endogenous adenosine is tonically released by twitching myotubes and activates its receptors. The third research project was aimed at exploring the role of neural agrin, a heparan sulphate proteoglycan, so far known as the key organizer of post-synaptic elements during skeletal muscle differentiation/regeneration. Besides agrin’s canonical effect on the maturation of the NMJ, novel roles have been discovered in the recent years, suggesting that the neurotrophic factor has pleiotropic effects. In this new context, we pursued the identification of potential new roles for neural agrin in the determination of satellite cell behaviour. Firstly, the analysis of different cell models, including C2C12 cell line and primary mouse and human cells, and revealed an increase in IL-6 secretion following exposure to agrin. Secondly, we addressed the hypothesis of agrin as a potential modulator of human myoblasts proliferation. Our preliminary results demonstrate that agrin enhances the proliferative capacity of human satellite cells and suggest the potential mechanism involved in the signaling cascade.
Il muscolo scheletrico è un tessuto terminalmente differenziato. La sua capacità rigenerativa in seguito a danno o patologia dipende da una popolazione di precursori miogenici, le cellule satelliti. Esse sono localizzate sulla superficie della fibra muscolare, racchiuse in un ambiente altamente specializzato, la nicchia. La nicchia assicura il mantenimento della quiescenza cellulare, ma allo stesso tempo fa sì che la cellula satellite risponda a stimoli meccanici, fisici o chimici, provenienti dall’ambiente esterno. Per questo motivo, la composizione dell’ambiente circostante condiziona altamente il comportamento della cellula satellite. Infatti, le alterazioni che si verificano con l’invecchiamento o in seguito a patologia compromettono la capacità dei precursori miogenici di sostenere la rigenerazione del tessuto. Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di individuare e caratterizzare alcuni dei fattori trofici che compongono il microambiente della cellula satellite in vivo, per cercare di capire come essi modulino le funzioni dei precursori miogenici durante la rigenerazione in vitro. La prima parte dell’attività di ricerca ha riguardato lo studio dell’effetto trofico dell’ATP sulla proliferazione mioblastica. Studi in letteratura hanno fatto emergere il potenziale ruolo regolatore dell’ATP nella rigenerazione muscolare, anche se i meccanismi attraverso cui opera non sono ancora chiari. I risultati da noi ottenuti hanno dimostrato che l’ATP aumenta la proliferazione mioblastica e che un effetto simile si osserva in presenza di H2O2. L’imaging per le specie reattive dell’ossigeno (ROS) ha inoltre dimostrato che l’ATP induce la produzione di H2O2, a concentrazioni paragonabili a quelle capaci di aumentare la proliferazione. In presenza di concentrazioni equimolari di adenosina non è stato osservato alcun effetto sulla proliferazione cellulare, fatto che suggerisce che il ruolo dell’ATP non sia attribuibile all’adenosina, il suo principale prodotto di degradazione. Questo risultato è in accordo con quanto già riportato da altri Autori a proposito degli enzimi responsabili dell’idrolisi dell’ATP: essi sono poco espressi nei mioblasti in proliferazione, mentre la loro espressione aumenta notevolmente con il differenziamento cellulare. Alla luce di queste osservazioni, risultava verosimile che i miotubi fossero più esposti rispetto ai mioblasti all’adenosina derivante dall’ATP e che pertanto l’adenosina avesse un ruolo fisiologico preponderante nelle fasi avanzate della miogenesi. Dal momento che i recettori per l’adenosina (ARs) sono espressi nei miotubi murini, un secondo lavoro ha avuto come obiettivo quello di investigare un possibile “crosstalk” tra i ARs e i nAChRs. Esperimenti di Ca2+- imaging hanno dimostrato come la modulazione farmacologica dei ARs si traduca in una variazione nelle oscillazioni di [Ca2+]i indotte dall’attività del nAChR. Questi risultati, sebbene preliminari, suggeriscono non solo che i due recettori interagiscono tra loro, ma anche che l’adenosina è tonicamente secreta dai miotubi in contrazione e agisca attivando i suoi recettori. Il terzo progetto di ricerca è stato finalizzato allo studio del ruolo dell’agrina neuronale, un proteoglicano eparan solfato, già noto per la sua capacità di aggregare elementi sinaptici durante la fase di differenziamento e di rigenerazione del muscolo scheletrico. Accanto al ruolo canonico che la vede coinvolta nella maturazione della giunzione neuromuscolare, negli ultimi anni sono state descritte nuove funzioni per l’agrina neuronale, che la indicano come un fattore pleiotropico. In questo contesto, abbiamo esplorato nuove proprietà dell’agrina. In primo luogo, l’analisi di diversi modelli cellulari, incluse la linea cellulare C2C12 e cellule primarie murine e umane, ha dimostrato che il fattore neurotrofico potenzia il rilascio di IL-6. In un secondo studio, è stato ipotizzato un potenziale effetto di modulazione della proliferazione di mioblasti umani da parte dell’agrina neuronale. Risultati preliminari hanno dimostrato che l’agrina aumenta la capacità proliferativa delle cellule satelliti umane. Inoltre, sono stati individuati alcuni dei fattori molecolari che partecipano alla cascata di segnalazione.
XXVI Ciclo
1986

Background: L’inibizione muscolare artrogenica (AMI) è una reazione riflessa della muscolatura che circonda un'articolazione dopo una distensione o un danno strutturale. È data dall’alterazione delle informazioni provenienti dai recettori interni all’articolazione e può essere la causa sottostante dell'instabilità funzionale della caviglia. Obiettivi: L’obiettivo della revisione è quello di studiare l’AMI a livello dell’articolazione tibio-tarsica e i metodi di trattamento più efficaci per diminuire l’inibizione muscolare e la disabilità correlata all’instabilità funzionale. Materiali e metodi: La strategia di ricerca degli articoli comprende l’utilizzo di motori di ricerca generali come Google Scholar e di database elettronici quali PubMed, Cochrane Library, PEDro e Tripdatabase. I criteri di eleggibilità per la selezione degli articoli sono i seguenti: lingua inglese e disponibilità del full-text; RCTs e/o systematic review e/o meta-analisi. I partecipanti agli studi sono pazienti che soffrono di instabilità funzionale/cronica della caviglia (P) e sono soggetti a un trattamento riabilitativo (I) volto alla diminuzione della disabilità correlata all’instabilità (O). Risultati: Dai 75 articoli inizialmente selezionati, 52 sono stati scartati perché non rilevanti, 6 perché doppioni, 12 per disegno di studio inadeguato, domanda di studio non pertinente o outcomes non rilevanti. La revisione si è quindi basata sullo studio di 5 RCTs. Conclusioni: Sono state individuate cinque tipologie di trattamento diverse: il bendaggio di riposizionamento fibulare (FRT), gli esercizi propriocettivi e di rinforzo combinati a tecniche di terapia manuale, l’utilizzo di dispositivi di destabilizzazione, il programma di allenamento Whole-body Vibration (WBV) e la stimolazione trans-cranica anodica a corrente continua (aTDCS). Tutte hanno dimostrato un livello di efficacia almeno su un parametro della funzionalità articolare e/o della disabilità percepita dal paziente.

The purpose of this thesis was to study the stress response of muscle cells using in vivo and in vitro experimental procedures. Animal models which replicate cytoprotective (mild exercise training) or pathologic (muscle disuse atrophy) conditions were used to analyze the extent of the stress response and the cellular distribution of stress proteins in muscle tissues. Here we show that mild exercise training (up to 30m/min treadmill run for 1h/day) significantly increased Hsp70 expression in cardiac and skeletal muscles. Studies on the cellular distribution of this protein showed that the percentage of Hsp70-positive myofibers increased about 3-fold in trained fast muscles of the posterior rat hindlimb, compared to the sedentary ones (P<0.001), and involved a larger subset of both type 2A and intermediate type 2A/2X-myofibers (P<0.001), and vascular smooth muscle cells. Therefore, chronic induction of Hsp70 expression in rat skeletal muscles is not obligatory related to the slow fiber phenotype, but reveals the occurrence of a stress-response (Tarricone et al. 2008). In addition, training significantly increased protein levels of HO-1 in the myocardium, which contributed to the reduced infarct size occurring after ischemia-reperfusion (Marini et al. 2007). Muscle disuse atrophy is characterized by increased ROS production. Experimental muscle disuse atrophy was achieved in the rat soleus muscles by means of hindlimb unloading by tail-suspension for 4 to 21 days. Our results showed significant and transient upregulation of heme oxygenase-1 at 7 days of unloading, whereas the relative amounts of the Glucose- regulated proteins Grp94 and Grp78 decreased significantly after 14 days of unloading to about 50% and 75%, respectively, of the protein levels of the non-suspended age- and sexmatched controls. In addition, protein oxidation was significantly increased in unloaded atrophic muscles. It is therefore possible that the reduced levels of the ER chaperones which bind calcium, such as Grp94 or Grp78, might adversley affect calcium homeostasis and potentially enhance oxidative stress of disused myofibers and favour progression of muscle atrophy. In vitro studies were then performed in order to analyze more precisely the contribution of Grp94 protein levels to cytoprotection of muscle cells againstapoptosis and oxidative damage, and mechanistichally to the control of calcium homeostasis. Grp94 overexpression was achieved by means of both stable and transient transfer of Grp94 cDNA into the myogenic cell line C2C12. The effects of pharmacological treatments, which selectively increased Grp94 cellular levels, were also explored. Results show that Grp94 overexpression obtained by gene transfer, protected myogenic C2C12 cells against apoptosis induced by exposure to 1µM staurosporin. Caspase-3 activation was reduced by 40-80% compared to control clones (p<0.05). Additional experiments showed that the percentage of apoptotic death, revealed by TUNEL assay, in C2C12 cells transiently transfected with grp94 cDNA was reduced by 50%, compared to empty vector-transfected cells. Furthermore, Grp94 overexpression reduced the degree of protein oxidation induced by exposure to hydrogen peroxide. A comparable effect was obtained when cells were transiently exposed, 24 hour in advance, to curcumin, an antioxidant which is also a SERCA inhibitor. Through its latter property, curcumin was effective in inducing a mild ER response, which apparently upregulated Grp94, in a selective manner, without changing protein levels of other ER chaperones, such as Grp78, calreticulin and HO-1. Subsequent exposure of curcumin- pretreated cells to hydrogen peroxide indeed showed reduced degree of protein oxidation. In order to identify the molecular mechanism through which Grp94 exerts antiapoptotic and anti-oxidant cytoprotection, we investigated changes in calcium homeostasis occurring in Grp94 overexpressing cells. By means of the fluorescent Ca2+ probe fura-2, Grp94- overexpressing clones showed a reduction ranging from 40 to 80% in ciclopiazonic acid-released Ca2+ compared to control clones. Transient co-transfection of C2C12 with both Grp94 and the cDNA coding for the recombinant luminescent Ca2+ sensor aequorin specifically targeted to the ER showed a slight (20%), but significant, decrease in [Ca2+]er (p<0.01), compared to control, void vector-transfected cells. However, when transient co-transfections were performed in HeLa or HEK-293 cells, no significant difference in [Ca2+]er was observed between Grp94 overexpressing and control cells, suggesting that Grp94 overexpression did not directly affect ER Ca2+ load. Experiments of immunoprecipitation from wild type C2C12 cells, processed with chemical cross-linking before lysis, showed that SERCA2 co-immunoprecipitated with Grp94. The Grp94-SERCA2 co-immunoprecipitation was clearly evident in C2C12 cells, whereas it was barely detectable in HeLa and HEK-293 cells, despite the higher relative amount of both Grp94 and SERCA2 in these two latter cell lines. The possibility that Grp94 overexpression affected [Ca2+]er by interaction with SERCA2 was further suggested by the analysis of the ER calcium refilling traces: the SERCA2 activity showed a significant decrease (20%) (p<0.01) in Grp94 overexpressing C2C12 cells compared to controls, while no differences were found in HeLa and HEK293. The possibility that Grp94 overexpression exerts a cytoprotective role by reducing [Ca2+]er load of myogenic cells through a specific inhibitory interaction with SERCA2 is supposed.

Tuberous sclerosis complex (TSC) and lymphangioleiomymatosis (LAM) are rare diseases. TSC is a genetic disease caused by mutation in TSC1 or TSC2 genes. TSC2 cells form hamartomas and might invade lungs causing the fatal diseases LAM. From an angiomylipoma (AML) of a TSC male patient we isolated a TSC2 smooth muscle (ASM) population. The growth of these cells was EGF-dependent. They showed a constitutive S6 phosphorylation, and lacked tuberin as the result of TSC2 promoter methylation (TSC2-/meth ASM cells). Chromatin remodeling agents, such as trichostatin–A and 5-azacytidine de-methylated TSC2-/meth ASM cell promoter and induced tuberin expression. The blockade of EGF-receptor with specific antibodies results in cell death as shown in TSC2-/- ASM cells, a population previously isolated from an AML of female TSC patient. LAM cells migrate or metastasize to other organs, in fact cells with TSC2 mutation have been found in AMLs and lung lesions of LAM patients. We isolated a population from chylous of a TSC/LAM patient, in which, as in TSC2-/meth cells, tuberin expression was induced by 5-azacytidine and trichostatin A treatments. These cells required the supplementation of EGF for proliferation, such as TSC2-/- and TSC2-/meth ASM cells. Chylous TSC/LAM cells expressed marker for identification of mesenchimal characteristics, such as vimentin and SNAIL, while E-cadherin, usually not expressed in metastatized cancer cells, was not detectable. The acquisition of mesenchymal characteristics for cancer cells is a transient event that might be important for migration and tissue invasion. Chylous TSC/LAM cells switched from a short floating stage, with low S6 phosphorylation levels, to a stage of adhesion with high S6 phosphorylation. These data suggest a novel therapeutic approach for the control of TSC and LAM abnormal cell growth using anti-EGFR antibody in addition to rapamycin, and, in some cases, the chromatin remodelling agents. Moreover, our data confirm the evidence that TSC2 pathogenesis might originate from an epigenetic defect.

Il tessuto adiposo (TA) bianco ha degli effetti negativi sulla funzione e sulla qualità del muscolo scheletrico ma si hanno poche informazioni sugli effetti degli adipociti senescenti e disfunzionali sulle cellule muscolari. Il TA e quello muscolare, possono comunicare tra loro attraverso le extra-vescicole (EV) che possono regolare la sensibilità all’insulina. Abbiamo realizzato un modello in vitro utilizzando un terreno di coltura condizionato ottenuto da adipociti murini 3T3-L1 maturi, invecchiati, insulino-resistenti ed esposti a stress ossidativo per trattare miociti C2C12. Dal medium sono state inoltre estratte e caratterizzate le EV mediante microscopia elettronica e tecnica del rilevamento di impulsi resistivi sintonizzabili (TRPS). Le analisi hanno indicato una significativa diminuzione del diametro dei miociti e dell’indice di fusione dopo il trattamento con medium di adipociti invecchiati o sottoposti a stress ossidativo o resi insulino-resistenti.
Inoltre, in queste cellule, si riduce l’espressione genica dei marcatori di differenziazione miogenica (MyHC-Iib, MyoD) ed è stato osservato una tendenza verso un’aumentata espressione di geni coinvolti nella fibrosi (CCN-2, COL1A1) e nell’atrofia muscolare (Atrogin-1, MuRF1) nei miociti trattati con medium di adipociti invecchiati o stressati. Esiste una tendenziale riduzione della sintesi proteica ed un significativo aumento dell’espressione della miostatina nelle cellule C2C12 trattate con medium di adipociti invecchiati rispetto ai controlli e c’è concentrazione di EV maggiore nel gruppo insulino-resistente rispetto al controllo. Questi risultati preliminari suggeriscono che gli adipociti invecchiati o disfunzionali potrebbero influenzare negativamente il trofismo, la funzione e la capacità rigenerativa dei miociti attraverso una rete paracrina di segnalazione e le EV potrebbero essere coinvolte in questi processi.

Il tessuto adiposo (TA) bianco ha degli effetti negativi sulla funzione e sulla qualità del muscolo scheletrico ma si hanno poche informazioni sugli effetti degli adipociti senescenti e disfunzionali sulle cellule muscolari. Il TA e quello muscolare, possono comunicare tra loro attraverso le extra-vescicole (EV) che possono regolare la sensibilità all’insulina. Abbiamo realizzato un modello in vitro utilizzando un terreno di coltura condizionato ottenuto da adipociti murini 3T3-L1 maturi, invecchiati, insulino-resistenti ed esposti a stress ossidativo per trattare miociti C2C12. Dal medium sono state inoltre estratte e caratterizzate le EV mediante microscopia elettronica e tecnica del rilevamento di impulsi resistivi sintonizzabili (TRPS). Le analisi hanno indicato una significativa diminuzione del diametro dei miociti e dell’indice di fusione dopo il trattamento con medium di adipociti invecchiati o sottoposti a stress ossidativo o resi insulino-resistenti.
Abbiamo osservato che nei miociti trattati col terreno ottenuto da adipociti invecchiati e/o disfunzionali, si riduce l’espressione genica dei marcatori di differenziazione miogenica (MyHC-Iib, MyoD) e si osserva una tendenza verso un’aumentata espressione di geni coinvolti nella fibrosi (CCN-2, COL1A1) e nell’atrofia muscolare (Atrogin-1, MuRF1) nei miociti trattati con medium di adipociti invecchiati o stressati. Esiste una tendenziale riduzione della sintesi proteica ed un significativo aumento dell’espressione della miostatina nelle cellule C2C12 trattate con medium di adipociti invecchiati rispetto ai controlli e c’è concentrazione di EV maggiore nel gruppo insulino-resistente rispetto al controllo. Questi risultati preliminari suggeriscono che gli adipociti invecchiati o disfunzionali potrebbero influenzare negativamente il trofismo, la funzione e la capacità rigenerativa dei miociti attraverso una rete paracrina di segnalazione e le EV potrebbero essere coinvolte in questi processi.