Tesis sobre el tema "Stabilté des protéines"

Présente chez les mammifères, mitoNEET (mNT) est une protéine à centre Fe-S ancrée à la membrane externe de la mitochondrie. Cette protéine dimérique possède un centre [2Fe-2S] par monomère lié de façon atypique à la protéine par trois cystéines et une histidine. Notre équipe a auparavant montré l’implication de mNT dans une nouvelle voie de réparation du centre [4Fe-4S] de l’Iron Regulatory Protein-1 (IRP-1), régulateur majeur de l’homéostasie du fer intracellulaire, par transfert du centre Fe-S de mNT à l’IRP-1 à réparer. Au cours de ma thèse, je me suis focalisée sur la caractérisation in vitro de la réaction de transfert de centre Fe-S de mNT vers une protéine réceptrice modèle, l’apo-ferrédoxine d’E. coli. En combinant des approches de biochimie et biophysique (réalisées en collaboration) à l’aide de protéines purifiées, cette étude a permis de démontrer que mNT agit comme un interrupteur moléculaire : lorsque son centre Fe-S est réduit, la protéine est extrêmement stable et le centre ne peut être ni perdu ni transféré; une fois oxydé, il peut alors être transféré à une protéine réceptrice. La présence d’oxygène n’affecte pas cette réaction même s’il s’agit d’un déterminant majeur de la stabilité de la protéine. De plus, la vitesse de transfert du centre est très sensible au pH, ce qui fait de mNT un senseur de pH. Ces études ont aussi montré que mNT est extrêmement résistante à H2O2 en comparaison à d’autres protéines de transfert de centre Fe-S. J’ai également étudié l’interaction d’une molécule anti-oxydante, le resvératrol-3 sulfate, avec mNT. Pour finir, je me suis intéressée à l’effet du glutathion sur mNT. Acteur majeur de la régulation de l’homéostasie rédox, le glutathion existe sous deux formes: oxydée (GSSG) et réduite (GSH). J’ai alors constaté que le GSH déstabilise fortement mNT à certains pH et peut même se lier à cette protéine. La fonction thiol du GSH et la formation de radicaux sur cette dernière sont clairement impliquées dans la déstabilisation de mNT
Present in mammals, mitoNEET (mNT) is an Fe-S protein anchored to the outer mitochondrial membrane. This dimeric protein contains a [2Fe-2S] per monomer with an atypical ligation involving three cysteines and one histidine. Previously, our team proposed that mNT is involved in a new pathway dedicated to the reparation of the oxidatively damaged [4Fe-4S] cluster of human iron-regulatory protein-1 (IRP-1)/cytosolic aconitase, a key player of the regulation of cellular iron homeostasis. This reparation occurs via Fe-S cluster transfer from mNT to IRP-1 to repair. In the course of my thesis, I focused on the characterization of cluster transfer reaction from mNT to a model receptor protein, the E. coli apo-ferredoxin. Using purified proteins and combining biochemical approaches with biophysical ones performed in colaboration, this study showed that mNT acts as a redox switch: when the Fe-S cluster is reduced, the protein is extremely stable and it cannot be lost or transferred; when it is oxidized, it can be transferred to a receptor protein. Dioxygen does not affect this transfer reaction whereas this is a major determinant of protein stability. The transfer speed is highly sensitive to pH. Thus, mNT seems to act also as a pH sensor. Moreover, this study shows that mNT is extremely resistant to H2O2 compared to other Fe-S cluster transfer proteins. I also looked at the interaction of an antioxidant molecule, the resveratrol-3-sulfate, with mNT. Finally, I studied the effects of glutathione on mNT. Major player of the regulation of redox homeostasis, glutathione exists under two states: a reduced state (GSH) and an oxidized one (GSSG). I observed that GSH strongly destabilizes mNT at specific pHs and can even directly interact with the protein. The thiol function of GSH and the radical formation on this function are clearly involved in the mNT Fe-S destabilization

Récemment Franzetti et al. Ont découvert un nouveau type de protéases auto-compartimentées indépendantes d'énergie dans les archaeas. Les particules ont été appelées TET pour leurs structures tridimensionnelles tétraédriques. Les TETs forment de grands complexes d'un poids moléculaire d'environ 500kDa. Leur rôle dans l'organisme est pourtant inconnu. Dans P. Horikoshii, une Archaea hyperthermophile de la mer profonde, trois protéases TET ont été identifiées (PhTET1, 2 et 3). Nous avons exprimé et purifié PhTET3 recombinante. L'enzyme a été caractérisée biochimiquement et nous avons déterminé la structure d'un complexe de PhTET3 de 12 sous-unités par cristallographie aux rayons X. Afin de mieux comprendre son rôle physiologique potentiel et de s'assurer pourquoi il y a trois protéases TET dans P. Horikoshii, la structure et les propriétés enzymatiques de PhTET3 ont été comparées à celles de deux autres protéases TET déjà caractérisées. Puisque l'auto-compartimentage joue un rôle important dans le fonctionnement et la régulation des protéases, les facteurs commandant l'oligomérisation de PhTET3 in vitro ont été étudiés par ultracentrifugation analytique et diffusion de neutrons aux petits angles. Finalement, dans des états physiologiques de mer profonde, l'enzyme est exposée à la haute température (jusqu'à 100°C) et à la haute pression. Afin d'étudier les limites de la stabilité de grands assemblages macromoléculaires, la structure à basse résolution et l'activité enzymatique de PhTET3 ont été mesurées à hautes pressions et à hautes températures en utilisant la diffusion des rayons X aux petits angles et la spectrophotométrie à haute pression. Au total, ces études ont indiqué que les protéases TET de P. Horikoshii forment un système intégré de dégradation de peptides et que PhTET3 montre une stabilité exceptionnelle à haute pression et à haute température aussi bien que des propriétés enzymatiques associées aux conditions environnementales
Recently Franzetti et al. Discovered a new type of energy-independent self-compartmentalized proteases in Archaea. The particles were named TET for their tetrahedral three-dimensional structure. The TETs self assemble as large molecular weight complexes of about 500kDa. Their role in the organism is yet unknown. In P. Horikoshii, a hyperthermophilic Archaea from the deep sea, three TET proteases have been identified (PhTET1, 2 and 3). We have expressed and purified recombinant PhTET3. The enzyme was characterized biochemically and we determined the structure of a PhTET3 12 subunit complex by x-ray crystallography. In order to gain insight into its potential physiological role and to ascertain why there are three TET proteases in P. Horikoshii, the structure and the enzymatic properties of PhTET3 have been compared to the two other TET proteases that were characterized before. As self-compartmentalization plays an important role in functioning and regulation of proteases, the factors controlling PhTET3 oligomerization in vitro have been studied by analytical ultracentrifugation and small angle neutron scattering. Finally, under physiological deep sea conditions, the enzyme is exposed to high temperature (up to 100°C) and high pressure. In order to study the limits of stability of large molecular weight assemblies, the low-resolution structure and the enzymatic activity of PhTET3 have been monitored under high pressures and temperatures using small angle x-ray scattering and high-pressure spectrophotometry. Taken together, these studies revealed that the TET proteases of P. Horikoshii form an integrated peptide degradation systems and that PhTET3 exhibits unusual stability under high pressure and temperature as well as environment-associated enzymatic properties

LES ANTICORPS RECOMBINANTS ONT DE NOMBREUSES APPLICATIONS, LIMITEES PAR UNE STABILITE INSUFFISANTE. NOUS VOULIONS DEVELOPPER UNE METHODE SIMPLE ET ROBUSTE DE STABILISATION DES FRAGMENTS D'ANTICORPS, ET COMPRENDRE LES MECANISMES DE STABILISATION CORRESPONDANTS. NOUS AVONS DEVELOPPE UNE METHODE FIABLE ET PRECISE POUR MESURER LA STABILITE DES FRAGMENTS D'ANTICORPS. POUR CELA, NOUS AVONS ETABLI UNE LOI RIGOUREUSE DU SIGNAL POUR LA LONGUEUR D'ONDE DU MAXIMUM DE FLUORESCENCE LMAX. LES TERMES CORRECTIFS A APPORTER A LA STABILITE ΔG(H2O) ET AU COEFFICIENT DE COOPERATIVITE m, OBTENUS EN UTILISANT UNE LOI LINEAIRE EMPIRIQUE DU SIGNAL POUR LMAX, ETAIENT MESURABLES EXPERIMENTALEMENT. NOUS AVONS PREDIT AVEC SUCCES UN ENSEMBLE DE MUTATIONS STABILISATRICES SUR LE FRAGMENT MODELE scFvD1. 3, EN UTILISANT DES CRITERES COMPLEMENTAIRES DE STRUCTURES, SEQUENCES ET DONNEES EXPERIMENTALES SUR LES ANTICORPS. UN DERIVE RECOMBINANT CES MUTATIONS AVAIT UNE TRES HAUTE STABILITE, UNE AMELIORATION DE STABILITE ΔΔG(H2O) SUPERIEURE A CELLES PUBLIEES PRECEDEMMENT, UNE ACTIVITE CYTOPLASMIQUE AMELIOREE, ET UNE AFFINITE INCHANGEE POUR L'ANTIGENE. NOS REGLES DE CONCEPTION PERMETTAIENT DE PREDIRE LES EFFETS DES MUTATIONS DE FAÇON QUALITATIVE POUR ΔG(H2O) ET QUANTITATIVE POUR LA CONCENTRATION EN UREE DE DEMI-DENATURATION. L'ACCROISSEMENT DE m CONSTITUAIT UN MECANISME IMPORTANT DE STABILISATION. LES EFFETS DES MUTATIONS DEPENDAIENT DU CONTEXTE STRUCTURAL. CES RESULTATS INDIQUAIENT L'EXISTENCE DE STRUCTURES RESIDUELLES DANS L'ETAT DENATURE DU TYPE PARENTAL. CETTE METHODE A ETE APPLIQUEE A LA STABILISATION DTMMUNOCAPTEURS FLUORESCENTS AUTONOMES, QUI POURRONT SERVIR DE BASE A LA CONSTRUCTION DE PUCES A PROTEINES
RECOMBINANT ANTIBODIES HAVE A NUMBER OF APPLICATIONS, SOME OF THEM LIMITED BY A LOW STABILITY. WE INTENTED TO DEVELOP A SIMPLE AND ROBUST METHOD TO IMPROVE RECOMBINANT ANTIBODIES STABILITY, AND TO UNDERSTAND THE UNDERLYING MECHANISMS OF STABILISATION. WE DEVELOPED A RELIABLE METHOD TO PRECISELY MEASURE THE STABILITY OF ANTIBODY FRAGMENTS. WE ESTABLISHED A RIGOROUS LAW OF THE SIGNAL FOR THE WAVELENGTH OF THE MAXIMUM FLUORESCENCE INTENSITY LAMBDA MAX. THE STABILITY ΔG(H2O) AND THE COEFFICIENT OF COOPERATIVITY m WHEN THE EMPIRICAL LINEAR LAW OF THE SIGNAL IS APPLIED, HAVE TO BE CORRECTED. THE CORRECTIVE TERMS CAN BE DETERMINED EXPERIMENTALE Y. USING COMPLEMENTARY CRITERIA OF SEQUENCE, STRUCTURE AND EXPERIMENTAL DATA ON ANTIBODIES, WE FRAGMENT, COMBINING ALL THE DESIGNED MUTATIONS, HAD A PARTICULARLY HIGH STABILITY, A STABILITY IMPROVEMENT COMPARED TO THE WILD-TYPE HlGHER THAN REPORTED SO FAR BY ANY METHOD, AN INCREASED CYTOPLASMIC ACTIVITY, AND AN UNMODIFIED AFFINITY FOR THE ANTIGEN. OUR RULES OF DESIGN ALLOWED US TO PREDICT THE EFFECTS OF MUTATIONS QUALITATIVELY FOR ΔG(H2O) AND QUANTITATIVELY FOR THE CONCENTRATION OF UREA AT HALF-DENATURATION. THE IMPROVEMENT OF m WAS AN IMPORTANT MECHANISM OF STABILISATION. THE EFFECTS OF MUTATIONS DEPENDED OF THE STRUCTURAL CONTEXT. THESE RESULTS INDICATED THE EXISTENCE OF RESIDUAL STRUCTURES IN THE DENATURATE STATE OF THE WILD-TYPE. WE THEN USED THIS METHOD TO IMPROVE THE PRODUCTION LEVEE AND THE LIFE-SPAN OF REAGENTLESS FLUORESCENT IMMUNOSENSORS, WHICH COULD BE USED FOR THE DEVELOPMENT OF ANTIBODY ARRAYS

La transmission des virus grippaux de type A s’effectue via l’eau, l’air ou les surfaces. Elle implique donc toujours une étape dans l’environnement, durant laquelle les virus sont inactivés plus ou moins rapidement en fonction du sous-type ou de la souche virale analysés. Cependant, à ce jour, les facteurs moléculaires déterminant la stabilité des particules virales en dehors de l’hôte restent largement méconnus. Dans le but d’identifier ces déterminants, nous avons généré différentes combinaisons de réassortiments entre deux virus grippaux de sous-types H1N1 possédant un phénotype de stabilité différent. Les stabilités respectives de ces virus réassortants ont été évaluées dans un environnement-modèle, puis comparées entre elles. Pour cela, nous avons utilisé un système d’analyse en temps réel des cultures cellulaires, permettant de calculer, pour chacun des virus testés, une pente d’inactivation moyenne et, in fine, de mesurer l’influence respective de chacun des segments viraux sur le phénotype de stabilité des virus. D’après nos résultats, le phénotype de stabilité des virus grippaux est majoritairement déterminé par l’hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA), qui sont les principales glycoprotéines de surface de ces virus. De plus, nous avons identifié des changements d’acides aminés dans la HA et dans la NA, qui ont pour effet une diminution ou une augmentation de la stabilité des particules virales dans l’environnement. Nous avons également montré qu’un virus avec un gène de la HA codons-optimisés, et donc porteur de mutations synonymes, suffit pour augmenter significativement la stabilité des particules virales dans l’environnement. La stabilité de la HA à pH acide, le taux d’expression de la HA dans les cellules infectées, et le nombre de sites de fixation aux ions calcium dans la NA sont modifiés par les mutations décrites dans cette étude, et sont donc des facteurs de stabilité des particules virales. De plus, une analyse en microscopie a permis de montrer que les virus inactivés dans l’environnement peuvent fixer leurs récepteurs cellulaires, mais sont incompétents pour induire l’étape de fusion dans l’endosome nécessaire à l’entrée des virus dans la cellule. Ces deux étapes du cycle viral sont dépendantes de la HA. Dans l’ensemble, nos résultats montrent l’importance de la HA et de la NA des virus grippaux dans la détermination du phénotype de stabilité des virus grippaux dans l’environnement. Par conséquent, la diversité connue des HA et NA dans la nature laisse supposer des variations fréquentes du phénotype de stabilité de ces virus. Leur étude pourrait permettre de mieux décrire l’écologie et l’épidémiologie de ces virus. L’analyse des données épidémiologiques et climatiques des épidémies de grippe saisonnière, sur 5 ans et dans 13 pays, a ainsi révélé une différence de distribution des virus H1N1 et H3N2, en fonction de la température hebdomadaire dans ces pays. La comparaison de la stabilité de ces virus sur des surfaces, à 4 °C et à 20 °C, suggère que la distribution des sous-types viraux au début des épidémies est en partie régulée par leur stabilité en fonction de la température
The transmission of Influenza A viruses (IAV), either airborne in mammals or oro-faecal in aquatic birds, submits viral particle to a wide range of environmental conditions. These environmental conditions modulate IAV survival outside the host, which is also dependent on the viral subtype or strains. To date, the molecular drivers of IAV environmental persistence remain to be identified. In order to identify IAV molecular drivers of the environmental persistence, we generated different reassortant viruses between two H1N1 viruses that do not have the same stability outside the host. To this purpose, we performed survival kinetic and compared the inactivation slope of generated reassortant viruses in our controlledenvironment, using a real time cell analysis system. Our results demonstrate that the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA) are the main viral segments driving IAV environmental persistence. In addition, mutations driving viral stability in the environment were identified in the HA and NA amino-acid sequences. We also demonstrated that synonymous mutations introduced in the HA, using a codon-optimization strategy, drive the environmental persistence of IAV. The HA stability at low pH, HA surface expression levels in infected cells and the number of calcium binding sites of the NA were alternately changed by the mutations described in our study, indicating that these are stability determinants of IAV survival outside the host. Then, the sequential events of viral entry were analysed with fluorescence microscopy assays, showing that viral particles being exposed for a long period in saline water at 35°C are still able to bind their cellular receptor whereas the HA-mediated fusion within the endosome is not possible anymore. These two steps of the viral cycle are mainly mediated by the HA protein. Altogether, these result highlight the importance of the HA and the NA proteins, driving the environmental persistence of IAV. Given the known diversity of these two proteins in nature, this arouses interest in studying IAV environmental persistence at a more global scale. Such study could improve our knowledge on IAV ecology and epidemiology. Epidemiologic and climatic data analyse of human seasonal influenza viruses during 5 years and from 13 countries revealed that H1N1 virus and H3N2 virus distribution differs according to the mean weekly temperature in these countries. We then compared the H1N1 virus and H3N2 virus persistence on stainless steel surface at 4 °C and 20 °C, and the preliminary results suggest that IAV seasonal subtypes distribution might be partly regulated by their stability according to the temperature

Chez les mammifères, près de 8 % ARNm présentent dans leur région 3’ non traduite des éléments riches en en adénines et uridines appelés AREs (AU-rich elements). Ces séquences sont reconnues par des facteurs variés, telles les protéines de la famille de la tristétraproline (TTP) qui régulent la vitesse de dégradation et/ou la traduction de ces ARNm. La protéine Tis11 membre fondateur de la famille TTP, contient des deux doigts de zinc en tandem ( domaine TZF) permettant de fixer les AREs et reconnait ainsi des ARNm codant principalement des cytokines et stimule leur dégradation par un mécanisme encore mal connu. Chez Saccharomyces cerevisae, Cth2 la dégradation d’ARNm contenant des AREs et codant des protéines en relation avec le métabolisme du fer. Afin de mieux comprendre le mécanisme permettant de déstabiliser ces ARNm, nous avons entrepris une analyse structure/fonction de Cth2. Nous avons ainsi identifié un domaine conservé appelé CR1, essentiel pour déstabiliser les ARNm mais non requis pour la fixation des AREs. De manière inattendue, l’expression de mutants dépourvus de ce domaine conduit à une accumulation de transcrits cibles présentant une extension en positon 3’. L’analyse de mutants affectant la machinerie de polyadénylation ainsi que l’observation d’une localisation majoritairement nucléaire de Cth2 ont permis de montrer que l’altération de la maturation 3’ de ces ARNm résulte d’une compétition entre Cth2 et la machinerie de polyadénylation au niveau des ARE. Nos résultats révèlent pour la première fois qu’une protéine apparentée au TTP peut affecter la maturation 3’ des ARNm contribuant ainsi à leur déstabilisation
Almost 8 % of mammalian mRNAs display AU-rich element (ARE) in their3’ untranslated region (UTR). Many are specifically bound by ARE-binding proteins, such as the members of the tristetrapolin family (TTP), that act to modulate mRNA decay and/or translation. HTTP contains a characteristic tandem repeat CCCH zinc finger domain involved in ARE binding. Upon binding hTTP destabilizes its targets such as cytokines encoding mRNAs, but its precise mechanism of action remains poorly understood. In budding yeast, Cth2, has recently been shown as a functional homologue of TTP. Under iron deprivation conditions, Cth2 is expressed, binds to ARE of its mRNAs targets, encoding iron metabolism related proteins, and finally stimulates their decay. To understand the mode of action of Cth2, we undertook a structure-function analysis of this factor. Our analysis identified a conserved region (CR1) that is essential to Cth2 activity but unessential for the ARE binding capacity. Interesting, mutants lacking this region exhibited a novel molecular phenotype with accumulation of 3’ elongated forms of target mRNAs. The analysis of mutants affecting the polyadénylation machinery together with the observation of a predominant nuclear localization of Cth2 indicate that Cth2 has also a function in regulating 3’ end processing of ARE containing mRNAs. For the time, our results show that a TTp-related protein can affect mRNA decay and also regulate the 3’ end processing of its ARE-containing mRNA targets

Ce travail de thèse est porté sur l’étude des interactions protéines-protéines, protéines-peptides ainsi que la stabilité des protéines en faisant appel à la spectroscopie Raman et infrarouge. Dans la première partie, nous nous sommes focalisés sur l’étude de l’interaction entre les différentes protéines d’adrénodoxine et d’adrénodoxine réductase afin d’apporter de nouvelles données pour compléter la compréhension du mécanisme d’échange électronique. Le deuxième objectif à atteindre dans le cadre de ce travail est de suivre les changements conformationnels au niveau de la structure secondaire et tertiaire qui se produisent en présence et en absence des peptides lors de la formation des complexes. Enfin, la dernière partie est dédiée dans un premier temps à une étude comparative de la stabilité des hémocyanines de Limulus polyphemus et Eurypelma californicum issue de deux organismes ayant des conditions de vie différentes en suivant l’effet de la température (294-20 K) et du pH sur la structure secondaire des protéines. Dans un deuxième temps l’étude porte sur l’influence de la teneur en oxygène sur la structure secondaire et sur le site actif des hemocyanines de Limulus polyphemus, Eurypelma californicum et Astacus leptodactylus
This thesis is focused on the study of protein-protein and protein-peptide interactions as well as the study of proteins stability by means of Raman and infrared spectroscopies. In the first part, we focused on the interactions between different adrenodoxin and adrenodoxin reductase proteins in order to get a better understanding of the electron transfer mechanism. The second part of the thesis concerns the changes in the secondary and tertiary structure of PDZ domains in the presence and absence of peptides during complex formation. The last part is dedicated to a comparative study of hemocyanins originated from organisms living in vastly different conditions such as Limulus polyphemus and Eurypelma californicum. This part of the project concerns the effect of temperature (294-20 K) and pH on the secondary structure of proteins. Finally the influence of oxygen binding on the secondary structure and the active site of Limulus polyphemus, Eurypelma californicum and Astacus leptodactylus was investigated

Les Nucléoside Diphosphate kinases (NDPK) sont des enzymes responsables de la synthèse des nucléosides triphosphates. Hexamériques chez les eucaryotes, leur structure stabilise les monomères. Chez l'homme, l'isoforme A est codé par le gène Nm23 lequel est également un gène suppresseur de métastases. La mutation naturelle S120G déstabilise les monomères qui perdent leur capacité à se renaturer correctement et restent in vitro sous forme d'intermédiaires de repliement de type molten-globule. (1) Nous avons montré que l'ATP corrige le défaut de repliement du mutant S120G en phosphorylant son histidine catalytique. Ce mécanisme physiologiquement pertinent explique pourquoi la protéine mutée est fonctionnelle dans les cellules cancéreuses. Le chaperon chimique triméthylamine-N-oxyde corrige également le défaut de repliement du mutant S120G, mais par un mécanisme différent de celui de la phosphorylation. Ces deux mécanismes ont un effet additif. Enfin, l'introduction d'une deuxième mutation "suppresseur intra-génique" corrige partiellement le défaut de repliement. (2) Nous avons également montré que le mutant S120G peut adopter une conformation alternative aberrante et former des fibres amyloides en feuillets β. Plusieurs modèles corrèlent la stabilité des enzymes oligomériques à l'aire d'interface enfouie. Plus l'interface est grande, plus le complexe est thermostable. La NDPK de M. Tuberculosis est hexamérique et présente une interface de 30 % plus faible que celle d'autres NDPK (celle de D. Discoideum par exemple) pour une stabilité thermique plus élevée. (3) La stabilité de cette NDPK a été étudiée pour comprendre ce paradoxe au niveau structural
Nucleoside Diphosphate kinases (NDPK) are enzymes responsible of nucleoside triphosphate synthesis. Hexameric in eukaryotes, their quaternary structure stabilises monomers. The human isoforme A is encoded by the Nm23 gene which is also known to be a metastasis suppressor. The S120G natural mutation destabilises monomers which become unable to refold correctly and stay in vitro under a molten-globule like intermediate conformation. (1) We have shown that ATP corrects the S120G mutant folding defect by phosphorylating its catalytic histidine. The refolding mechanism by phosphorylation is pertinent physiologically and explains why the mutated protein is functional in tumoral cells. The presence of the chemical chaperone trimethylamine-N-oxyde corrects the folding defect of the S120G mutant but by a mechanism different of that of phosphorylation. Both mechanisms have an additive effect. Introduction of a second site suppressor mutation partially corrects the S120G mutant folding defect. (2) Moreover, we have shown that the S120G mutant can adopt an alternative aberrant conformation and form amyloid fibres rich in β sheets. Several models correlate the stability of oligomeric enzymes to the interface area. Larger is the interface, more thermostable is the complex. The M. Tuberculosis NDPK is hexameric and presents 30 % less of interface, as compared to the others NDPK (such as Dictyostelium discoideum, for example) the thermostability of which is higher. (3) We have studied the NDPK stability in order to understand such a paradox at the structural level

L’objectif de ce travail est d’identifier les conditions et les mécanismes permettant la création d'aptitudes nouvelles ou améliorées des protéines du lactosérum à la stabilisation et texturation des mousses alimentaires.À cette fin, nous avons étudié la rhéologie interfaciale de protéines adsorbées à l’interface eau/air, les réarrangements topologiques à l’échelle de quelques films liquides, la stabilité et la rhéologie de mousses de protéines. L’étude a porté à la fois sur un mélange de protéines du lactosérum et sur sa protéine majoritaire purifiée, la ß-lactoglobuline. Pour identifier les liens avec leurs propriétés structurales et physico-chimiques, des modifications des protéines ont été générées par étuvage de poudres. Plusieurs paramètres d’étuvage ont été variés simultanément. Une large gamme de modifications structurales des protéines a été obtenue grâce au contrôle de ces paramètres. Nous avons mis en évidence que de petites modifications structurales des protéines ont des conséquences majeures sur la rhéologie interfaciale, la dynamique des réarrangements de films, la stabilité et la rhéologie des mousses.Les effets de l’étuvage des poudres sur les propriétés des mousses sont complexes, car ils dépendent étroitement de la combinaison des effets des paramètres d’étuvage, comme de la propriété de la mousse qui est mesurée. Parallèlement, l’examen de la variabilité des comportements à plusieurs échelles apporte un éclairage original sur la contribution de la rhéologie interfaciale aux propriétés de mousses de protéines. Il met notamment en évidence l’intérê
The objective of this work is to identify the conditions and mechanisms of the creation or improvement of the stability and rheology of whey proteins foams. To this aim, we studied the interfacial rheology of protein layers adsorbed at the air/water interface, the liquid films dynamics after a topological rearrangement, the stability and rheology of whey protein foams. Both a mixture of whey proteins and purified ß-lactoglobulin, used as a model protein, were studied. To study the relationships with protein structure, proteins were modified by dry-heating of whey protein powders. A wide variety of structural changes was obtained by varying simultaneously multiple dry-heating parameters.Interestingly, low-extent structural modifications have a dramatic impact on interfacial rheology, liquid film dynamics, foam stability and foam rheology. The effects of dry-heating parameters on the foam properties are complex and depend on their combination and the considered foam feature. Our original multiscale approach (interface, film dynamics and foam) sheds light on the contribution of the interfacial rheology to protein foam properties. In particular, foam dynamics have been shown to play a predominant role

La cellule est un environnement complexe. Le pH, la force ionique ou l'encombrement cytoplasmique. . . Sont influencent les réactions biochimiques. Il est généralement difficile d'étudier in-vivo l'influence d'un seul de ces paramètres. Le volume exclu induit par la présence de nombreuses macromolécules en solution créé des interactions non spécifiques stériques. Nous avons étudié celle de l'encombrement sur deux aspects différents : la dynamique des protéines et l’équilibre état natif /état dénaturé. Des études ont permis de mettre en évidence que l'encombrement stabilisait la protéine à l'état natif en déstabilisant l'ensemble des états dénaturés. Les protéines dénaturées adoptent une conformation de chaîne gaussienne. Des mesures de diffusion de neutrons aux petits angles ont montré que le rayon de giration d'une chaîne gaussienne modèle diminuait considérablement avec la fraction massique en agent d'encombrement. Dans le cas de la myoglobine, celle-ci est stabilisée. En présence d'encombrement, le rayon de giration de la protéine dénaturée diminue. L'encombrement cytoplasmique modifie la dynamique des protéines. Il existe différents régimes de diffusion collective ou individuelle (à temps court et long). Le temps de relaxation mesuré pour les solutions d'hémoglobine fortement concentrées ne peut-être associé à un mouvement purement diffusif et peut être lié à un mouvement localisé. Nous avons étudié la structure d'un substitut sanguin, l'hémoglobine greffée de deux poly(ethylene glycol). La réactivité du complexe varie avec le poids moléculaire des polymères. L'étude de sa structure a permis d'observer que celle-ci était sans doute fortement reliée à sa réactivité.

Afin d’améliorer la stabilité plasmatique de peptides, nous avons développé une nouvelle stratégie basée sur l’introduction d’une chaîne fluorocarbonée dans la séquence d’un peptide natif. En appliquant le concept à l’apeline-17, un peptide présentant un intérêt potentiel pour le traitement de maladies cardiovasculaires, nous avons amélioré sa stabilité plasmatique de 4 min à plus de 24 h ainsi que son efficacité in vivo. L’étude du mécanisme de stabilisation a permis de mettre en évidence la liaison de la fluoroapeline à l’albumine, conduisant à la protection du peptide vis-à-vis de la protéolyse. Le concept a été appliqué à d’autres peptides tels que l’apeline-13, l’angiotensine II, l’ocytocine et la spexine, démontrant ainsi l’étendue et les limitations de la méthode. Enfin, nous avons également conçu des sondes fluorescentes « turn-on » originales capables de révéler leur fluorescence uniquement après liaison au récepteur ciblé. Ces sondes pourront nous servir, par la suite, pour l’étude in vivo de la biodistribution des fluoropeptides
In order to improve the plasma stability of peptides, we have developed a new strategy based on the introduction of a fluorocarbon chain in the sequence of a native peptide. By applying this concept to apelin-17, a peptide showing a potential interest for the treatment of cardiovascular diseases, we have improved its plasma stability from 4.6 min to more than 24 h as well as its in vivo efficacy. The mechanism leading to the increase of plasma stability has been carefully investigated demonstrating the binding of the fluoroapeline to the albumin, leading to protection towards roteolysis. The concept has been applied to other peptides such as apelin-13, angiotensin II, oxytocin and spexine, showing the extension and the limitations of this method. Finally, we have designed original fluorescent fluorogenic probes which turn on their fluorescence only after binding to the targeted receptor. These probes could be used for in vivo biodistribution studies of fluoropeptides

L’apoptose ou mort cellulaire programmée joue un rôle prépondérant dans l’homéostasie cellulaire. Ce processus est très finement régulé par les protéines de la famille BCL-2 qui contrôlent la perméabilité de membrane mitochondriale externe et la libération du cytochrome c, deux événements majeurs précédant la mort cellulaire. Les protéines anti-apoptotiques de la famille BCL-2 contribuent à la tumorigenèse et sont impliquées dans la résistance des cancers aux molécules chimiothérapeutiques ; à ce titre, elles représentent des cibles importantes pour le développement de nouvelles thérapies. BCL2A1 est un membre anti-apoptotique de la famille BCL-2 impliqué dans la chimiorésistance de nombreuses tumeurs. La protéine BCL2A1 a pour caractéristique d’avoir une demi-vie courte due à sa dégradation constitutive par le système ubiquitine-protéasome. Ceci régule la stabilité et la fonction anti-apoptotique de BCL2A1 et représente un mécanisme suppresseur de tumeur majeur. Cependant, les enzymes qui contrôlent les modifications post-traductionnelles impliquées dans l’ubiquitination et la dégradation de BCL2A1 demeurent, à ce jour, inconnues. Dans la présente thèse, nous donnons un aperçu des acteurs et des mécanismes impliqués dans la régulation de l’ubiquitination de BCL2A1. Nous présentons des preuves que TRIM28 est une E3 ubiquitine-ligase pour BCL2A1. En effet, les protéines TRIM28 et BCL2A1 endogènes interagissent ensemble au niveau des mitochondries et la déplétion de TRIM28 diminue l’ubiquitination de BCL2A1. Nous montrons aussi que TRIM17 stabilise BCL2A1 en empêchant son interaction avec TRIM28 et son ubiquitination médiée par TRIM28, et que l’activité de GSK3 est impliquée dans l’inhibition de la dégradation de BCL2A1. Ainsi, BCL2A1 et son proche homologue MCL-1 sont régulés par des facteurs communs mais de façon opposé. Finalement, la surexpression de TRIM28 ou l’inactivation de TRIM17 diminue le niveau protéique de BCL2A1 et restaure la sensibilité des cellules de mélanomes aux thérapies utilisant des inhibiteurs de la kinase BRAF. Globalement, nos résultats décrivent un rhéostat moléculaire au sein duquel deux protéines de la famille TRIM régulent de façon antagoniste la stabilité de BCL2A1 et modulent ainsi la mort cellulaire
Apoptosis or programmed cell death plays a crucial role in tissue homeostasis and is regulated by the Bcl-2 proteins, which control mitochondria membrane permeability and cytochrome c release, two events that precede cell demise. Anti-apoptotic Bcl-2 family members can contribute to tumorigenesis and cause resistance to anti-cancer regimens, therefore representing important targets for novel therapeutics. BCL2A1 is an anti-apoptotic member of the BCL-2 family that contributes to chemoresistance in a subset of tumors. BCL2A1 has a short half-life due to its constitutive processing by the ubiquitin-proteasome system. This constitutes a major tumor-suppressor mechanism regulating BCL2A1 function. However, the enzymes involved in the regulation of BCL2A1 protein stability are currently unknown. Here we provide the first insight into the regulation of BCL2A1 ubiquitination. We present evidence that TRIM28 is an E3 ubiquitin-ligase for BCL2A1. Indeed, endogenous TRIM28 and BCL2A1 bind to each other at the mitochondria and TRIM28 knock-down decreases BCL2A1 ubiquitination. We also show that TRIM17 stabilizes BCL2A1 by blocking TRIM28 from binding and ubiquitinating BCL2A1, and that GSK3 is involved in the phosphorylation-mediated inhibition of BCL2A1 degradation. BCL2A1 and its close relative MCL1 are thus regulated by common factors but with opposite outcome. Finally, overexpression of TRIM28 or knock-out of TRIM17 reduced BCLA1 protein levels and restored sensitivity of melanoma cells to BRAF-targeted therapy. Therefore, our data describe a molecular rheostat in which two proteins of the TRIM family antagonistically regulate BCL2A1 stability and modulate cell death.Sommaire

Les émulsions laitières sont des systèmes thermodynamiquement instables qui doivent résister aux contraintes technologiques (chauffage, congélation) appliquées lors de leur fabrication ou usage. Les émulsions riches en protéines de lactosérum sont particulièrement sensibles et l’emploi d’additifs alimentaires est un moyen de ralentir leur déstabilisation. Dans l’objectif d’offrir des produits 100 % lait aux consommateurs, concevoir des émulsions, riches en protéines de lactosérum, sans additifs alimentaires et stables aux traitements technologiques, constitue un réel challenge. La stratégie employée dans ce projet de thèse a été de combiner les propriétés des agrégats de protéines de lactosérum et des caséines pour stabiliser des émulsions aux cours des traitements technologiques sur une large gamme de concentration.Des émulsions ont été préparées avec des agrégats de protéines de lactosérum de structure différente et avec différents ratios agrégats/caséines. Quelle que soit leur structure, la présence d’agrégats à la surface des globules gras déstabilise l’émulsion (gélification /séparation de phase) alors que dans la phase dispersante ceux-ci sont stables aux traitements technologiques. A l’inverse, les émulsions dont la surface des globules gras est recouverte de caséines sont très stables aux traitements technologiques. Ainsi, il est possible de moduler la stabilité des émulsions riches en protéines de lactosérum aux cours des traitements technologiques en exploitant les propriétés des agrégats et des caséines et en contrôlant leur répartition entre la surface des glo
Dairy emulsions are thermodynamically unstable systems, which have to be resistant to the technological treatments (heating, freezing/thawing) applied during their manufacture or use. Whey protein-rich emulsions are particularly sensitive to technological treatments and instabilities are currently tackled by the use of non-dairy additives. With aim to offer products that are more natural to consumers (additive-free), the preparation of whey protein-rich emulsions without additive and stable during technological treatments constitutes a major challenge for dairy companies. The strategy adopted during this thesis was to combine the properties of the whey proteins aggregates and caseins in order to stabilize emulsion during technological treatments in a large range of protein concentrationsEmulsions were prepared with various whey protein aggregates and various whey protein aggregates/caseins ratio. Whatever the whey protein aggregates, their presence at the fat droplet surface destabilize the emulsions (gelation/phase separation) whereas they are stable in the continuous phase of the emulsions during technological treatments. In contrast, emulsions are extremely stable during technological treatments when caseins fully cover the fat droplet surface. The results obtained highlighted the possibility of modulating the stability during technological treatments of whey protein-rich emulsions by combining the properties of the whey protein aggregates and the caseins and by controlling their repartition between the fat droplet surface and the continuous phase of the emulsion

LicT est une protéine de Bacillus subtilis appartenant à la famille BglG/SacY. Elle régule, par un mécanisme d'antiterminaison transcriptionnelle, l'expression du gène licS impliqué dans le métabolisme des β-glucosides. Une fois activée, LicT se fixe sur l'ARN messager naissant et empêche l'arrêt précoce de la transcription. LicT est une protéine modulaire constituée d'un domaine de liaison à l'ARN, CAT (Co-AntiTerminator) et d'un domaine régulateur, PRD (PTS Regulation Domain) composé de deux sous domaines homologues PRD1 et PRD2. Les structures des domaines isolés CAT et PRD ont été récemment élucidées. La structure du sous-ensemble CAT-PRD1 (LicT1-167) de la protéine LicT est désormais essentielle pour comprendre la transmission des signaux de régulation entre domaine régulateur et effecteur. Le domaine CAT-PRD1 a été produit et purifié avec succès. La précipitation des échantillons de RMN nous a conduit à élaborer une méthodologie pour déterminer les conditions de solubilité et de stabilité des protéines. Le domaine CAT-PRD1 forme en solution un homo dimère symétrique de 40 kDa. Son enrichissement 2H, 13C et 15N a permis l'attribution des résonances de son squelette peptidique et d'identifier une structure secondaire en hélice a reliant les domaines CAT et PRD1. Les variations structurales induites par le domaine PRD1 sur le domaine CAT ont été localisées. Seule l'interface de dimérisation du domaine CAT est affectée et suggère une ouverture ou une réorientation des monomères de ce domaine. Le rôle de déstabilisation joué par le domaine PRD1 a été précisé. Il déplacerait les équilibres défInis dans le modèle de régulation de la protéine LicT vers ses formes inactives. L'hélice α située entre les domaines CAT et PRD1 aurait un rôle central dans l'inactivation de la protéine et dans la transmission des signaux de régulation. Un modèle préliminaire du domaine CAT-PRD1, basé sur des expériences de relaxation, est présenté et montre la monomérisâtion du domaine CAT
LicT is a protein of the BglG/SacY family from Bacillus subtilis. It regulates, by a transcriptional antitermination mecanism, the expression of the licS gene involved in the β-glucosides metabolism. Once activated, LicT prevents transcriptional termination by fixation to its RNA target. LicT is a modular protein constituted by an RNA binding domain, CAT (Co- Antiterminator) and a regulatory domain, PRD (PTS Regulation Domain) composed of two homologous domains PRD1 and PRD2. The structures of the isolated CAT and PRD domains were recently resolved. Then, the structure of the CAT-PRD1 domain (LicTl-167) is now essential to the understanding of the transmission of the regulation signals between regulator and effector domains. CAT-PRD1 domain was successfully produced and purified. The precipitation of the NMR samples has led us to set up a methodology for the determination of solubility and stability conditions of proteins. Then, CAT-PRD1 domain was identified in solution as a symetrical homodimer of 40 kDa. Its 2H, 13C and 15N labelling has enabled the backbone resonance assignment and the identification of an α-helical folding of the linker region between the CAT and PRD1 domains. Structural variations induced by PRD1 domain on CAT domain were localised. Only the dimer interface of CAT domain was affected and suggests the opening or reorientation of the CAT monomers. The destabilising effect of PRD1 domain was specified. It would shift the equilibrium defined in the regulation model of LicT toward its inactive forms. The α-helix linker between CAT and PRD1 domains would have a central role in the inactivation of the LicT protein and in the transmission of the regulation signals. A preliminary model of CAT PRD1 domain based on relaxation data is presented and shows the monomerisation of CAT domain

L'organisation en chromatine permet de compacter l’ADN génomique et de réguler finement le métabolisme de l’ADN. La chromatine peut s’organiser en domaines nucléaires caractérisés par un enrichissement en facteurs spécifiques. Un enjeu majeur est de comprendre les mécanismes qui contrôlent l’établissement et le maintien de ces domaines au cours des divisions cellulaires. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée aux domaines péricentriques. Il s’agit de l’hétérochromatine constitutive du centromère caractérisée épigénétiquement par l’enrichissement en protéines HP1, qui confèrent à ces régions une fonction critique pour la ségrégation des chromosomes. Les mécanismes de régulation de la localisation de HP1 à ces régions sont donc à considérer. Mes travaux de thèse ont mis en évidence un nouveau composant enrichi à l’hétérochromatine péricentrique de souris, la SUMO-protéase SENP7. SENP7 interagit directement avec HP1 grâce à deux motifs conservés dits PxVxL. La fonction de SENP7 à ces régions est particulièrement critique car la perte de SENP7 induit une perte d’enrichissement en protéines HP1α aux domaines péricentriques. Ce mécanisme ne dépend que des deux motifs PxVxL de SENP7. Notre hypothèse est que SENP7 verrouillerait via ces motifs PxVxL les molécules de HP1 à l’hétérochromatine péricentrique, afin de stabiliser HP1 en restreignant sa dynamique. Ces résultats ouvrent la porte à de nombreuses perspectives de recherche visant à identifier les mécanismes de stabilisation des protéines HP1 aux domaines péricentriques, et au-delà de HP1, à caractériser des mécanismes impliqués dans le maintien de l’architecture nucléaire et ainsi dans la stabilité du génome
In the nucleus of all eukaryotic organisms, genomic DNA is organized in chromatin. This organization contributes to different degrees of DNA compaction, which define functional nuclear domains characterized by the enrichment of specific factors. A central question is to understand how such functional chromatin domains are established and maintained throughout multiple cellular divisions. During my PhD, I focused on pericentric domains, the constitutive heterochromatin of the centromere. This heterochromatin is characterized epigenetically by an enrichment of HP1 proteins that confer a critical function in chromosome segregation. It is thus crucial to maintain HP1 enrichment at pericentric domains for genome stability and integrity. During my PhD, I identified a new component of pericentric domains, the SUMO-protease SENP7. SENP7 is enriched at pericentric domains and interacts with HP1 with two HP1-interaction motifs, the so-called PxVxL motifs. SENP7 function is particularly important at pericentric heterochromatin as it is required for HP1 enrichment at these regions. Notably, the SENP7 desumoylation activity is not involved in this function. Rather, I showed that the two HP1-interaction motifs are critical for HP1 enrichment. We propose that HP1 interactors with two HP1-interaction motifs could lock nucleosome-bound HP1 and act as key contributors for maintaining HP1 enrichment at heterochromatin domains. These results open up new avenues to explore the maintenance mechanisms of HP1 enrichment that would stabilize HP1 proteins, but also mechanisms associated to other proteins and functional nuclear domains that could impact nuclear architecture and genome stability

Des mutations germinales du gène suppresseur de tumeur LKB1 prédisposent les individus porteurs au développement d'une pathologie héréditaire appelée syndrome de Peutz-Jeghers. Les patients affectés par cette maladie présentent une hyperpigmentation cutanée et des polypes hamartomateux au niveau du tube digestif. Ils développent aussi, avec une incidence élevée, différents types de cancers. La protéine LKB1 est une sérine/thréonine kinase localisée dans le noyau et dans le cytoplasme des cellules. LKB1 s'associe à deux autres protéines, STRAD et MO25, et la formation de ce complexe hétéro-trimérique est requise pour stabiliser et potentialiser l'activité kinase de LKB1. Un des substrats physiologiques de LKB1 est la protéine kinase AMPK (AMP-activated protein kinase), régulateur métabolique activé lorsque la cellule est exposée à des situations de carence énergétique. LKB1 est aussi un régulateur de la polarisation cellulaire. Au cours de ce travail de thèse, nous avons pu établir que l'interaction du complexe chaperon Hsp90/Cdc37 avec LKB1 est essentielle pour la stabilisation de LKB1. Lorsque les protéines Hsp90/Cdc37 et LKB1 sont dissociées, cette dernière est ubiquitinée et dégradée par le protéasome. La suite de notre travail a permis d'établir que l'ubiquitine ligase CHIP est recrutée dans le complexe LKB1 via le chaperon Hsp/Hsc70 est qu'elle participe à l'ubiquitination de la kinase. A l'inverse, l'isopeptidase USP11 se fixe à LKB1 et la stabilise en éliminant les chaînes de poly-ubiquitine qui lui sont fixées. Ainsi notre travail a permis de mettre en évidence l'existence de différents complexes moléculaires assurant de manière dynamique la régulation de la stabilité de LKB1. Ces résultats suggèrent que des perturbations de la fonction de ces complexes pourraient être associées au processus tumoral en prévenant la stabilisation de LKB1 ou d'autres protéines dotées d'une activité onco-suppressive

En raison de leur haute spécificité d’interaction, les protéines thérapeutiques sont de plus en plus utilisées et représentent une part majoritaire du marché pharmaceutique. Néanmoins, ces molécules sont fragiles et leur stabilité est une problématique majeure pour l'industrie pharmaceutique. La dégradation des protéines thérapeutiques peut survenir à chaque étape de leur cycle de vie : production, stockage, transport et administration au patient. Les modifications chimiques, l'exposition à des forces de cisaillement (fort débit fluidique), la température, le pH et les interactions avec les matériaux et/ou les interfaces gazeuses sont autant de facteurs qui peuvent nuire à la stabilité de ces protéines. De plus, l'utilisation croissante de dispositifs médicaux automatisés pour la manipulation et l'injection de protéines thérapeutiques augmente drastiquement le risque de dégradation. Dans cette thèse, nous étudions l’effet et le rôle de la triple interface solide/liquide/air sur l'agrégation des protéines. Ce phénomène se produit fréquemment dans les procédés de manipulation d’une solution de protéines thérapeutiques (cavitation, agitation…). Lors d’un mouillage intermittent, les interfaces air/liquide et liquide/solide se confondent en une seule et même interface appelée triple interface ou ligne triple. La ligne triple est une zone favorisant fortement l'agrégation des protéines. Notre étude, basée sur l’insuline, montre que la ligne triple cause une accumulation progressive de protéines qui déclenche, après une période de nucléation, leur agrégation, précisément à l’endroit de cette ligne triple. Nos résultats démontrent aussi que les forces de cisaillement, seules, n’entrainent pas l’agrégation de l’insuline. De plus, nous observons que la diminution de la tension superficielle (induite par l’ajout de polysorbates) d'une solution de protéines réduit le risque de formation d’agrégats. En conclusion de ce travail, nous proposons des recommandations pour la conception des dispositifs médicaux de préparation et d’administration de protéines thérapeutiques
Due to the high specificity of their interactions, proteins are increasingly used in therapy and represent a vast majority of the global pharmaceutical market. Nevertheless, these molecules are fragile and therapeutic protein stability is a major concern in pharmaceutical industry. Protein degradation and aggregation can occur at every step during production, storage, transport and delivery. In this thesis, we interrogate the possible role of intermittent wetting in protein aggregation. Intermittent wetting frequently occurs in protocols involving pumping (cavitation), agitation, and liquid handling. During intermittent wetting, the air/liquid and liquid/solid interfaces meet at a triple line or triple interface, which is a local trigger for protein aggregation because it concentrates the mechanical action of the recessing fluid on the surface adsorbed proteins. We study the effect of surface intermittent wetting on insulin aggregation. Our results demonstrate that the triple interface line, where an air/water interface meets a hydrophobic surface, allows progressive protein accumulation, and finally triggers local insulin aggregation. We also show that shear stress, alone, is not detrimental for protein stability. Additionally, Additives such as polysorbates were tested, showing that the modification of the surface tension of a protein solution impacts its ability to form aggregates. Based on this work, we propose recommendations for the design of drug delivery and preparation devices in order to limit the risk of protein aggregation at the triple interface

Dans le but de déterminer l'influence du groupement trifluorométhyle sur les propriétés physico-chimiques et biologiques de peptides fluorés, nous avons désiré synthétiser des peptides incorporant un aminoacide α-trifluorométhylé.Chaque énantiomère de l'α-Tfm-Alanine a été synthétisé de manière énantiomériquement pure et à grande échelle selon une voie synthétique efficace. Le groupement trifluorométhyle placé en position α désactivant fortement sa fonction amine, son couplage a nécessité des conditions d'activation puissantes à l'aide des anhydrides mixtes.La variation de l'hydrophobie de peptides fluorés par une méthode analytique basée sur la mesure d'indices dérivés des temps de rétention par RP-HPLC a permis de mettre en évidence l'influence considérable du groupement trifluorométhyle sur l'augmentation de l'hydrophobie.Les interactions peptides fluorés/peptides ont été étudiées dans le cadre de l'inhibition de l'agrégation du peptide Aβ42 responsable du dépôt de plaques amyloïdes chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Les premiers résultats montrent un ralentissement de l'agrégation de Aβ42 par un peptide fluoré.La digestion enzymatique par la pepsine d'un tétrapeptide fluoré indique un ralentissement considérable de sa vitesse d'hydrolyse par rapport au peptide incorporant un résidu Alanine. L'utilisation de la méthode de détection sensible par RMN 19F appelée 3-FABS a permis de mettre en évidence la reconnaissance et le clivage d'un peptide fluoré par la trypsine, caractéristiques d'un bon substrat
In order to determine the impact of the trifluoromethyl group on the physico-chemical and biological properties of fluorinated peptides, we have decided to synthesize peptides incorporating α-trifluoromethyl amino-acids.Each enantiomer of α-Tfm-Alanine was prepared in an enantiopure form and in a large scale. The trifluoromethyle group placed in the α position deactivates its amine function so that its coupling needs harsh activation conditions to be achieved with mixed anhydride.The determination of the hydrophobicity of fluorinated peptides with an analytical method based on the measurement of indexes derived from retention times by RP-HPLC showed the dramatic influence of the trifluorométhyl group on the increase of the hydrophobicity.Fluorinated peptides/peptides interactions were studied for the inhibition of the aggregation of Aβ42 in patients suffering from Alzheimer's disease. The first results indicate a reduction of Aβ42 aggregation by a fluorinated peptide.Pepsine digestion of a fluorinated tetrapeptide showed a dramatic reduction of the rate of its cleavage in comparision with the peptide incorporating an alanine residu. The use of the sensitive 3-FABS 19F NMR detection method showed the recognition and the cleavage of a fluorinated peptide by trypsin which definites it as a substrate for trypsin

Un algorithme de simulation sur réseau cubique des premières étapes du repliement protéique a été développé précédemment pour déterminer quels étaient les résidus impliqués tout particulièrement dans le noyau du repliement (les Most Interacting Residues ou MIR). L'évaluation de cet outil a montré que tous les résidus importants pour le repliement étaient spécifiés mais un certain nombre de faux positifs aussi. Afin d'améliorer la précision de nos résultats, la démarche a consisté à introduire de nouvelles données structurales dans l'algorithme. Dans un premier temps, différentes pistes ont été explorées que ce soit au niveau de la détection de motifs structuraux déduits d'alignements multiples et conservés (PRINTS), de fragments autonomes du repliement (Foldons), du découpage d'une structure en fragments selon des critères topologiques (TEF) et de triplets d'acides aminés conservés au cours de l'évolution (Triplets). Seule l'information fournie par les TEFs nous a permis de conclure à une amélioration. Dans un deuxième temps, une étude comparable a été menée sur l'ajout de données issues de la stabilité de la structure 3D d'une protéine après des mutations ponctuelles. Nous avons montré une corrélation importante entre les mutations déstabilisantes pour la structure native et les MIR. Les résultats sont disponibles dans une base de données accessible à l'adresse suivante http://bioinformatics. Eas. Asu. Edu/sprouts. Html. Ces différentes études nous ont permis de proposer une méthode de prédiction des résidus du noyau du repliement dont les premiers résultats sont encourageants
The calculation of a 3D structure for a globular protein is well established, however, thé mechanisms involved in the folding process are still hypothetical. An algorithm that simulates the early steps of folding, on a lattice network, has previously been developed, allowing prediction of which amino acids are required to define the folding core of a protein. These residues are called Most Interacting Residues (MIR). Evaluation of this tool concludes that whilst all the essential residues needed for folding are captured, there still remains a number of false positives. Therefore, the tool's precision needs to be increased, thus additional structural data added into the current algorithm. Initially, several options were explored with the aim of improving the algorithm, these were: detection of structural and conserved motifs obtained from multiple alignments (PRINTS), autonomous folding units (Foldons), structure splitting in topological fragments (Tightened End Fragments or TEF) or triplet of conserved amino acids during Evolution (Triplets). Only thé information provided by the TEF approach allow us to achieve an improvement in our method. Subsequently, a further study was undertaken with additional data on the structural stability of a protein after point mutations. Our results show that there is a strong correlation between highly destabilizing positions in a protein structure and the MIR. All the results are available on a database located at the following URL: http://bioinformatics. Eas. Asu. Edu/sprouts. Html. These studies have given rise to a new method devoted to the prediction of residues involved in the folding nucleus, and the preliminary results are encouraging

Les breuvages enrichis en protéines et fibres alimentaires sont des produits en croissance mais leur développement constitue un défi technologique dû à l’instabilité des protéines en milieu acide après un traitement thermique. L’objectif de cette étude était d’étudier l’effet de l’homogénéisation (1500 psi, 4°C) sur la stabilité des protéines seules et des complexes protéines/pectines en présence de β-glucan dans un jus modèle au cours de l’entreposage (4°C). La stabilité a été évaluée par observation visuelle (séparation des phases, précipitation) et la distribution des protéines dans les phases a été effectuée en fonction du temps d’entreposage (jours 1, 7, 14, 21 et 28). La taille, la charge des particules et la viscosité des solutions ont été mesurées aux jours 1 et 28. L’homogénéisation effectuée après la pasteurisation a augmenté la stabilité des protéines seules grâce à une diminution significative de la taille des agrégats des protéines. Toutefois, l’homogénéisation effectuée avant la pasteurisation n’a pas eu d’effet sur la stabilité. L’ajout de faibles concentrations de pectine n’a pas amélioré la stabilité des protéines en milieu acide après la pasteurisation. Les complexes obtenus avaient une charge faible et une taille élevée que l’homogénéisation n’a pas pu réduire. L’ajout de β-glucan a favorisé l’augmentation de la proportion de précipité pour les breuvages enrichis en protéines seules, et n’a pas modifié la stabilité des protéines en présence de pectines. Cependant, les protéines insolubles se trouvant dans les phases précipitées sont faciles à resuspendre après l’agitation des breuvages. Ce travail a démontré que l’homogénéisation est un traitement simple qui permet la stabilisation des breuvages enrichis, mais qui nécessite une adaptation au procédé habituel.
There is an increasing demand for beverages enriched with proteins and dietary fibers but this development is still a technological challenge due to protein instability in acidic condition after heat treatment. The objective of this work was to study the effect of homogenization before/after pasteurization on the stability of proteins and proteins/pectin complexes in presence of β-glucan in juice model during the storage at 4°C. The stability was evaluated by visual observation (phase separation, precipitation) and distribution of proteins was determined at storage time of 1, 7, 14, 21 and 28 days. The size, the charge of the particles and the viscosity of the solutions were measured in days 1 and 28. A homogenization step performed after pasteurization increased the proteins’ stability by significant decrease in particle size. However, the homogenization performed before pasteurization had no effect. The addition of low concentrations of pectin did not stabilize the proteins after pasteurization. The complexes obtained had a low charge and a large size that homogenization could not reduce. The addition of β-glucan promoted the proportion of precipitate for the beverage with proteins alone and did not affect proteins’ stability in the presence of pectin. However, the insoluble proteins in the precipitate phases are resuspended easily by some tube inversions. This work demonstrated that homogenization is a simple treatment that could help stabilize fortified beverages but it requires adaptation to usual procedure.

La protéine EDEN-BP se lie au motif EDEN riche en U/purine et est impliquée dans la désadénylation d'ARNm. EDEN-BP présente 3 motifs de liaison à l'ARN (RRM, RNA Recognition Motif). Les 2 premiers RRM sont situés en N-terminal et une région "linker" les séparent du troisième RRM situé en C-terminal. La cartographie des domaines d'EDEN-BP nécessaires à la reconnaissance spécifique d'EDEN a été réalisée à l'aide de protéines recombinantes en utilisant la technique du transfert de marquage. Les RRM1 et 2, et une information de séquence dans le "linker" sont nécessaires à la fixation d'EDEN-BP à l'EDEN. Des expériences de gel-retard et de double hybride indiquent que la forme active du complexe EDEN/EDEN-BP contient un dimère d'EDEN-BP. Par ailleurs, la chromatographie d'affinité avec ligand ARN a été mise au point pour purifier des facteurs impliqués dans la déstabilisation des ARN présentant un motif AUUUA chez le xénope. 6 facteurs spécifiques de ce motif ont été observés.

L’ezrine appartient à la famille des protéines ERM. Ces protéines assurent la liaison entre la membrane plasmique et le cytosquelette d’actine. L’ezrine est impliquée dans le trafic de protéines membranaires, cependant sa fonction dans ce processus n’est pas connue à ce jour. Des cribles doubles hybrides utilisant l’ezrine comme appât ont permis l’identification de protéines impliquées dans le transport de protéines membranaires. Nous avons étudié la fonction de l’interaction de l’ezrine avec la sous unité Vps11 du complex HOPS et WWP1, une ubiquitine ligase de type E3. Le complexe HOPS orchestre la fusion de compartiments intracellulaires car il coordonne les activités des protéines Rab et SNARE. Nous avons étudié comment l’interaction de l’ezrine avec Vps11 régule le transport du récepteur de l’EGF vers la voie de dégradation par les lysosomes. Nous avons montré que cette interaction promeut la maturation des endosomes et qu’elle est nécessaire au transport du récepteur à l’EGF des endosomes précoces aux tardifs ainsi participant à la régulation de la dégradation du récepteur à l’EGF. WWP1 a été impliquée dans la régulation et la dégradation des récepteurs aux facteurs de croissance ainsi que des facteurs de transcription. Nous avons montré que l’interaction entre l’ezrine et WWP1 induit l’ubiquitylation de l’ezrine sans toutefois entraîner sa dégradation. Nous avons montré que l’interaction de l’ezrine avec WWP1 stabilise le récepteur c-Met. Nos résultats indiquent que l’ezrine participe au contrôle de la dégradation des récepteurs de type tyrosine kinase en régulant l’assemblage de complexes multiprotéiques impliqués dans le transport et l’ubiquitylation des protéines
Ezrin is a member of the ERM protein family, which provides a regulated linkage between the plasma membrane and the actin cytoskeleton. Ezrin has been involved in the trafficking of membrane proteins however its function in this process is as of yet unknown. Two-hybrid screens performed with ezrin as baits led to the identification of proteins involved in membrane protein transport. We analyzed the function of ezrin association with two new interactors: the HOPS complex subunit Vps11 and the E3 ubiquitin ligase WWP1. Vps11 is a member of the tethering HOPS complex that coordinates Rab and SNARE functions during vesicular fusion along the endocytic pathway. We have investigated the role of ezrin/Vps11 interaction in the endocytosis of the EGF receptor. We have shown that the interaction between ezrin and the HOPS complex promotes endosome maturation and is necessary for EGF receptor transport from early to late endosomes, therefore participating in the regulation of EGFR endocytosis and degradation. WWP1 is an E3 ubiquitin ligase of the Nedd4 family. A role for WWP1 was identified in the regulation and degradation of growth factors receptors and transcription factors. We have shown that Ezrin/WWP1 interaction results in ezrin ubiquitylation, but is not involved in regulating ezrin degradation. Rather, we were able to show that this ubiquitylation likely mediates protein interaction and that the binding between ezrin and WWP1 promotes c-Met receptor stabilization. Altogether our results indicate that ezrin participates in the control of tyrosine kinase receptor degradation by regulating the assembly of multimeric complexes involved in protein trafficking and ubiquitylation

À la suite de l’endosymbiose, le génome chloroplastique a rétréci et dépend maintenant du génome nucléaire pour son expression. Chez Chlamydomonas reinhardtii, les protéines Octotricopeptide repeat (OPR), codées dans le noyau, contrôlent l’expression d’ARNm chloroplastiques spécifiques. La répétition OPR est un motif dégénéré de 38 acides aminés, qui forme un tandem d’hélices α antiparallèles qui lient l’ARN. Une répétition OPR est prédite pour interagir avec un nucléotide spécifique grâce à des résidus variables à des positions précises. La succession de répétitions permet aux protéines OPR de se lier à une séquence donnée. En partant d’un « code OPR » théorique, j’ai cherché à étudier cette spécificité de reconnaissance. J’ai mute in vivo les cibles chloroplastiques de facteurs OPR pour empêcher l’interaction OPR/ARN, puis j’ai tenté de la restaurer en mutant les résidus conférant la spécificité dans les répétitions correspondantes. Étonnamment, les interactions OPR/ARN sont très résilientes, ce qui a complétement changé notre vision de ces interactions in vivo. Des études fonctionnelles complémentaires que j’ai réalisées sur les facteurs OPR MDB1 and MTHI1 ont révélé que l’expression des gènes chloroplastiques dépend probablement de systèmes de facteurs nucléaires. En coopérant ces facteurs auraient une affinité combinée plus forte et seraient ainsi plus résilients
Following endosymbiosis, the chloroplast genome shrunk and became reliant on the host genome for its expression. In Chlamydomonas reinhardtii, Octotricopeptide repeat proteins (OPR), encoded in the nucleus, control the expression of a specific organellar mRNA. The OPR repeat is a degenerate motif of 38 amino-acids, folding into a tandem of antiparallel α-helices which can bind to RNA. An individual OPR repeat is predicted to interact with one given nucleotide thanks to specificity-conferring residues at defined positions within the repeat. OPR proteins contain tracks of successive OPR motifs, thus they can bind to a specific RNA “target” sequence and act on it. I aimed to study this specificity, called the “OPR code”, starting with a draft code based on known OPR protein/mRNA couples. I mutated in vivo the chloroplast targets of some OPR factors to disrupt the OPR/RNA interaction, and then tried to restore it by mutating the specificity-conferring residues in the corresponding repeats. Surprisingly, OPR/RNA interactions seem very resilient, challenging our view of how the specificity is established in vivo. Complementary functional studies that I performed on the OPR factors MDB1 and MTHI1 revealed that chloroplast gene expression might rely on complex networks of nuclear factors. By cooperating those putative systems would be both more specific and more resilient

Les colloi͏̈des sont présents dans un grand nombre d'industries telles que les industries alimentaires, pétrolières, pharmaceuticales ou cosmétiques. La compréhension et la maîtrise des mécanismes de stabilisation, dépendant des propriétés interfaciales de ces systèmes, sont d'une importance primordiale, tant au niveau de la formulation que des procédés de fabrication. Dans ce travail de thèse, nous avons étudié le comportement de films protéiques (caséine ß, caséine as, caséinate, ou ß-lactoglobuline) aux interfaces huile/eau par tensiométrie, rhéologie interfaciale dilatationnelle et rhéologie interfaciale de cisaillement. Cette étude a permis de montrer l'influence des paramètres de milieu dont la présence de tensioactifs de faible masse moléculaire (monolaurine, monopalmitine, monooléine et Tween 20), du pH, de la concentration des protéines dans la phase aqueuse, la nature de l'huile et de la température. Nos résultats mettent en évidence des changements de propriétés des films protéiques interfaciaux au cours du temps, expliqués en termes de synergie, de compétitions liées à des interactions physico-chimiques ainsi qu'en terme de structurations liées à l'établissement de liaisons chimiques (polycondensation de la ß-lactoglobuline en particulier) induites ou non par chauffage. De nombreuses hypothèses ou conclusions ont été émises quant aux interactions entre surfactants à l'interface ou encore quant à l'interprétation des notions de viscosité ou élasticité de surface. La rhéologie interfaciale s'est montrée être un outil de viscosité ou élasticité de surface. La rhéologie interfaciale s'est montrée être un outil puissant pour l'étude des phénomènes de compétition, de synergie ou de déplacement et pour l'étude de la topologie des protéines adsorbées.

Les invalidations individuelles et simultanées des protéines de mise en faisceau de l’actine, villine, I-fimbrine et espine, n’abolissent pas la formation de microvillosités intestinales. Leur formation en absence de protéines de mise en faisceau est discutée. Quelle est alors la fonction de ces protéines ? L’étude du rôle de la villine démontre que son activité de fragmentation augmente la dynamique d’un mouvement dépendant de l’actine. La I-fimbrine apparaît comme un acteur central de la polarité et de la stabilité du réseau apical des entérocytes. Enfin, un modèle est envisagé selon lequel la villine agirait comme un facteur déstabilisant du cytosquelette de la microvillosité compensé en partie ou en totalité par le rôle stabilisateur de la I-fimbrine. Ces deux protéines seraient des protagonistes permettant d’une part le maintien de la microvillosité en équilibre dynamique en conditions normales, et d’autre part son remodelage rapide en réponse à des situations de stress
The individual and the simultaneous invalidations of the genes encoding for the bundling proteins, villin, I-fimbrin ans espin do not abolish the formation of intestinal microvilli in mice. The possibilities of formation of this structure in the absence of bundling proteins is discussed. What is then the role of these proteins in the enterocytes ? We demonstrate that villin actin severing property enhances an actin-based movement. We also report polarity and stability defects of the apical network of the enterocytes lacking I-fimbrin. A model in which villin acts as a destabilising factor of the cytoskeleton of the microvilli that would be compensated by the stabilising effect of I-fimbrin is proposed. These two proteins would be two protagonists, on the one hand maintaining the microvilli in a dynamic equilibrium in normal conditions, and on the other hand allowing a fast remodelling of the structure in response to stresses

La transmission fidèle des chromosomes lors des divisions mitotiques est essentielle à la stabilité du génome. En début de mitose, les chromosomes préalablement dupliqués en phase S condensent sous la forme de deux chromatides soeurs associées et les centromètres capturent les microtubulures du fuseau. Lors de la transition métaphase-anaphase, la cohésion des chromatides soeurs est éliminée, déclenchant leur migration vers les pôles opposés du fuseau. La cohésion est assurée par le complexe cohésine, chargé sur les chromosomes en phase G1 du cycle cellulaire et maintenu jusqu'en anaphase. Les mécanismes par lesquels les cohésines s'associent aux chromosomes et assurent la cohésion sont mal compris. Les centromères sont généralement constitués d'hétérochromatine, une forme compacte de la chromatine, dont l'assemblage fait intervenir la machinerie de RNAi. Des mutations affectant certains composants structuraux de l'hétérochromatine, comme Swi6/HP1 chez Saccharomyces pombe, altèrent la ségrégation des chromosomes en mitose. Afin d'appréhender les rôles de Swi6, ses partenaires fonctionnels ont été recherchés par un crible génétique. Ici, je présente l'étude des gènes ss13 et ss138 (swi6 synthétique létal). Le gène ss13 code un facteur de chargement des cohésines en phase G1 du cycle cellulaire, dont la fonction est conservée au cours de l'évolution. Etonnament, ss138 code un composant du spliceosome. Les résultats présentés montrent que Ss138 est nécessaire à l'intégrité de l'hétérochromatine centromérique. La signification biologique du lien entre Ss138, la maturation des ARNs, et l'assemblage de l'hétérochromatine centrométrique est discutée
In all eukaryotes, the genome stability relies on accurate chromosome segregation throughout mitotic divisions. During early mitosis, each duplicated chromosomes condense into a pair of tightly linked sister chromatids and centromeres capture spindle microtubules. At the metaphase to anaphase transition, cohesion between sister chromatids is removed, triggering their migration towards the opposite spindle poles. Sister chromatid cohesion is ensured by cohesin, a proteinaceous complex loaded onto chromosomes in G1 and maitained chromosomally bound until anaphase onset. The mechanisms through which cohesin is loaded onto chromosomes and ensures cohesion are ill defined. In most eukaryotes, centromeres are made of heterochromatin : a specialized form of chromatin whose assembly and maintenance rely on the RNAi pathway. Mutations affecting structural components of heterochromatin, such as Swi6/HP1 in fission yeast, impair chromosome segregation. In order to investigate the biological functions of Swi6, its functional partners were sought through a genetic screen. Here I report on the study of ss13 and ss138 (swi6 synthetic lethal). The ss13 gene encodes a cohesin loading factor, whose function in G1 in evolutionarily conserved. Unexpectedly, ss138 encodes a spliceosome component. Experimental data indicate that ss138 is essential for centrometric heterochromatin integrity and accurate chromosome segregation. The biological significance of a link between Ss138, RNA modifications and the assembly of centrometric heterochromatin is discussed

Les protéines capables de lier des ARNs sont essentielles pour les différentes étapes de maturation de l'ARN messager (ARNm), en dirigeant leur localisation et leur devenir dans la cellule, et en formant avec les ARNs des particules ribonucléoprotéiques (mRNPs). Les mRNPS peuvent former des structures cellulaires dynamiques qui sont adressées vers des fonctions spécifiques. Ces granules, tels que les granules de stress formés suite à un stress cellulaire, contiennent des ARNm dont la traduction est inhibée et qui sont stockés transitoirement. Ma thèse a consisté en la caractérisation fonctionnelle de G3BP (RasGAP SH3 binding protein), une RBP exprimée de façon ubiquitaire chez l'homme et la souris, et impliquée dans l'assemblage des granules de stress. Par recombinaison homologue classique, des souris knock-out pour G3BP ont été générées. Ces souris ont une espérance de vie faible et des défauts du comportement associés au Système Nerveux Central, en particulier un phénotype de type ataxie. Des expériences d'électrophysiologie ont aussi montré une altération de la plasticité synaptique dans l'hippocampe des souris KO. J'ai donc réalisé des expériences d'immunoprécipitation après cross-link (Cross-Linking and Immunoprecipitation, CLIP) pour purifier à partir de cerveau de souris un complexe stable contenant G3BP, et les ARNs associés ont été identifiés par séquençage haut débit (High-Throughput Sequencing, HITS-CLIP). De façon surprenante, la plupart des cibles de G3BP correspondent à des transcrits codants mais qui contiennent des séquences introniques, et des ARNs non codants. De plus, mes résultats ont montré que l'absence de G3BP1 affecte la stabilité de ces transcrits pré-matures spécifiquement dans le cervelet, ce qui peut être corrélé au phénotype d'ataxie des souris KO G3BP1. Cela suggère un nouveau mécanisme de régulation qui passe par la stabilisation de transcrits pré-matures, qui pourraient être convertis en transcrits matures par exemple lors d'un stress et de la séquestration de G3BP dans les granules
RNA binding proteins (RBPs) are essential in the different steps of processing of the messenger RNAs (mRNAs), directing their localization and fate within the cell, and forming with them the ribonucleoprotein particles (mRNPs). mRNPs can assemble into dynamic cellular structures in which they are routed towards specific functions. RNA granules such as stress granules (SGs) contain translationally silenced mRNPs storing transiently repressed mRNAs.My thesis work consisted in the functional characterization of G3BP (RasGAP SH3 binding protein), an RBP that is expressed ubiquitously in both humans and mice and is involved in the assembly of SGs. Using classical homozygous recombination, viable G3BP1 knock out mice were generated that demonstrated short lifespan.and behavioral defects linked to the Central Nervous System (CNS), notably an ataxia phenotype. Electrophysiology experiments showed an alteration of synaptic plasticity in the hippocampus of KO mice. Therefore, I used Cross-Linking and Immunoprecipitation (CLIP) to purify from mouse brain a stable complex containing G3BP, and performed High-Throughput Sequencing (HITS-CLIP) to identify associated RNAs. Strikingly, most of the G3BP targets correspond to intron sequence-retaining transcripts and non-coding RNAs. My results also showed that G3BP1 depletion influences the stability of these premature transcripts in the cerebellum, which can be correlated to the ataxia phenotype of the G3BP1 KO mice. This comprehensive analysis suggests a new mechanism of gene regulation based on stabilization of silenced premature transcripts which might be converted to mature transcripts under stress condition and sequestration of G3BP in SGs

Cette thèse de doctorat s’inscrit dans le cadre de l’étude in silico des relations qui lient la séquence d’une protéine à sa structure, sa stabilité et sa fonction. Elle a pour objectif de permettre à terme la conception rationnelle de protéines modifiées qui restent actives dans des conditions physico chimiques non physiologiques. Nous nous sommes plus particulièrement penchés sur la stabilité thermique des protéines, qui est définie par leur température de fusion Tm au delà de laquelle leur structure n’est thermodynamiquement plus stable. Notre travail s’articule en trois grandes parties :la recherche de facteurs favorisant la thermostabilité des protéines parmi des familles de protéines homologues, la mise sur pied d’une base de données de protéines de structure et de Tm déterminées expérimentalement, de laquelle sont dérivés des potentiels statistiques dépendant de la température, et enfin la mise au point de deux outils bioinformatiques visant à prédire d’une part la Tm d’une protéine à partir de la Tm de protéines homologues et d’autre part les changements de thermostabilité d’une protéine (Tm) engendrés par l’introduction d’une mutation ponctuelle.

La première partie a pour objectif l’identification des facteurs de séquence et de structure (e.g. fréquence de ponts salins, d’interactions cation-{pi}) responsables des différentes stabilités thermiques de protéines homologues au sein de huit familles (chapitre 2). La spécificité de chaque famille ne nous a pas permis de généraliser l’impact de ces différents facteurs sur la stabilité thermique des protéines. Cependant, cette approche nous a permis de constater la multitude de stratégies différentes suivies par les protéines pour atteindre une plus grande thermostabilité.

La deuxième partie concerne le développement d’une approche originale pour évaluer l’influence de la température sur la contribution de différents types d’interactions à l’énergie libre de repliement des protéines (chapitres 3 et 4). Cette approche repose sur la dérivation de potentiels statistiques à partir d’ensembles de protéines de thermostabilité moyenne distincte. Nous avons d’une part collecté le plus grand nombre possible de protéines de structure et de Tm déterminées expérimentalement, et d’autre part développé des potentiels tenant compte de l’adaptation des protéines aux températures extrêmes au cours de leur évolution. Cette méthode originale a mis en évidence la dépendance en la température d’interactions protéiques tels les ponts salins, les interactions cation-{pi}, certains empilements hydrophobes .Elle nous a en outre permis de mettre le doigt sur l’importance de considérer la dépendance en la température non seulement des interactions attractives mais également des interactions répulsives, ainsi que sur l’importance de décrire la résistance thermique par la Tm plutôt que la Tenv, température de l’environnement de l’organisme dont elle provient (chapitre 5).

La dernière partie de cette thèse concerne l’utilisation des profils énergétiques dans un but prédictif. Tout d’abord, nous avons développé un logiciel bioinformatique pour prédire la thermostabilité d’une protéine sur la base de la thermostabilité de protéines homologues. Cet outil s’est avéré prometteur après l’avoir testé sur huit familles de protéines homologues. Nous avons également développé un deuxième outil bioinformatique pour prédire les changements de thermostabilité d’une protéine engendrés par l’introduction d’une mutation ponctuelle, en s’inspirant d’un logiciel de prédiction des changements de stabilité thermodynamique des protéines développé au sein de notre équipe de recherche. Ce deuxième algorithme de prédiction repose sur le développement d’une grande base de données de mutants caractérisés expérimentalement, d’une combinaison linéaire de potentiels pour évaluer la Tm, et d’un réseau de neurones pour identifier les coefficients de la combinaison. Les prédictions générées par notre logiciel ont été comparées à celles obtenues via la corrélation qui existe entre stabilités thermique et thermodynamique, et se sont avérées plus fiables.

Les travaux décrits dans notre thèse, et en particulier le développement de potentiels statistiques dépendant de la température, constituent une nouvelle approche très prometteuse pour comprendre et prédire la thermostabilité des protéines. En outre, nos travaux de recherche ont permis de développer une méthodologie qui pourra être adaptée à l’étude et à la prédiction d’autres propriétés physico chimiques des protéines comme leur solubilité, leur stabilité vis à vis de l’acidité, de la pression, de la salinité .lorsque suffisamment de données expérimentales seront disponibles.

Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique
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Nous decrivons les progres recents de la spectrometrie de masse dans l'etude structurale des proteines. Nos etudes associent la degradation chimique d'edman, les hydrolyses enzymatiques et les analyses par esims pour resoudre des problemes specifiques a la caracterisation de la structure primaire des proteines. Ainsi nous montrons qu'il est possible de preparer des sels d'ammonium quaternaires d'isothiocyanates par synthese chimique et de les utiliser dans les conditions de la degradation d'edman. La detection des produits resultants est realisee par esims afin d'ameliorer la sensibilite et d'assurer la caracterisation de certains residus. La connaissance de la structure primaire des proteines nous a conduit a l'etude de la localisation des ponts disulfures, responsables en partie du maintien de la structure tridimensionnelle des proteines. Une approche nouvelle utilisant la tris-(2-carboxyethyl) phosphine pour la reduction des ponts disulfures et le n-hydroxymethyl benzamide comme methode d'alkylation des cysteines libres en milieu acide est presentee. Apres avoir realise une etude comparative de peptides lies a l'aide d'un pont disulfure par sm avec divers modes d'ionisation, nous avons identifie ceux des puroindolines a et b de ble. Enfin, par esims, nous avons obtenu des renseignements sur la stabilite et la conformation des cytochromes c#2 et c#5#5#3 sauvages et mutes. Nous avons mis en evidence la presence de plusieurs conformeres de proteines par observation de la distribution des etats de charges et par la mesure des echanges isotopiques (h/d). Nous avons ainsi classe en fonction de leur stabilite, les mutants des deux cytochromes par rapport aux types sauvages. De plus, nous avons mis au point et realise l'etude des sites de deuteriation des hydrogenes amidiques du squelette polypeptidique. Celle-ci utilise les echanges isotopiques suivis d'une digestion rapide par la pepsine permettant d'obtenir des informations locales sur la penetration du solvant deuterie dans la proteine

En œnologie, la formation de trouble d'origine protéique dans les vins blancs est un défaut visuel inacceptable d'un point de vue commercial. Il est attribué à des modifications lentes de la conformation des protéines (présentes à une concentration de 15 à 330 mg.L-1), conduisant à des phénomènes d'agrégation. Ce phénomène est accéléré par une exposition du vin à des températures élevées pendant le transport ou le stockage. Il peut aussi se développer dans des conditions de stockage conventionnelles mais suivant des cinétiques très lentes (> 12 mois). Il est aussi influencé par la composition du vin en ions, polyphénols et polysaccharides. Pour éviter ce problème, des tests et traitements efficaces mais non spécifiques sont appliqués avant embouteillage. Il en résulte une diminution de la qualité organoleptique du vin ainsi qu'une perte non négligeable de produit.L'objectif des travaux présentés dans cette thèse est de progresser dans l'identification des mécanismes physico-chimiques impliqués dans le développement de troubles protéiques. Pour cela, les expérimentations ont été réalisées sur des systèmes modèles et des systèmes réels (vin) dans différentes conditions de température, pH et force ionique. Les résultats ont permis de mettre en évidence les protéines impliquées dans le trouble ainsi que le rôle déterminant du pH et de la force ionique sur les mécanismes d'agrégation, les caractéristiques des agrégats et le trouble final. Les polysaccharides du vin modulent le phénomène d'agrégation mais ne le préviennent pas. Par ailleurs, des modifications de la conformation des protéines du vin induites par le pH ont été mises en évidence. Ces résultats permettent d'apporter des informations supplémentaires pour le développement de tests et de traitements alternatifs plus spécifiques
In enology, the haze formation in white wine is a visual defect, related to the presence of proteins. This problem is inacceptable for the consumer. It is attributed to a slow unfolding of protein conformation (in white wine at a concentration ranging from 15 to 330 mg.L-1), leading to their aggregation. This phenomenon is accelerated by an exposure to excessive temperature during the storage or the transport. It can also develop on conventional storage conditions but following very slow kinetics (> 12 months). It is influenced by the wine composition in non proteinaceous compounds such as ions, polyphenols and polysaccharides. To prevent this problem, some tests and treatments are used before bottling. However, even if they are efficient, they are non specific to proteins and lead to a diminution of wine organoleptic quality and a non negligible loss of product. The aim of this work is to progress on the identification of physico-chemical mechanisms involved in aggregation. To this end, experiments were performed on model systems and wine, at different conditions of temperature, pH, ionic strength. Results evidenced that specific wine proteins were involved in haze formation whereas others were not. The main role played by pH and ionic strength on aggregation mechanisms, aggregates characteristics and final haze was highlighted. The impact of wine polysaccharides was studied. They modulated the aggregation phenomenon but did not prevent it. Moreover, conformational modifications induced by low pH of some wine proteins were highlighted. These results give some supplementary information for the development of news tests and treatments alternatives, more specific

L'agrégation protéique induite par la surface des matériaux est un phénomène important dans la stabilité des protéines thérapeutiques. En utilisant l'insuline humaine, nous avons étudié les phénomènes agrégation en présence de surfaces neutres hydrophobes ou hydrophiles et avons montré que la nucléation a lieu sur les surfaces hydrophobes que l'on soit à pH 2.5 ou 7.3. Nous avons montré que l'énergie d'activation de la nucléation est abaissée sur surface hydrophobe. De plus, il apparait que l'agitation de la solution a des effets antagonistes. En particulier, les forces hydrodynamiques de cisaillement détachent de la surface les fibres. Par Résonance Plasmonique de Surface, spectroscopie infrarouge et microscopie à fluorescence, nous avons pu définir les étapes moléculaires ayant lieu à l'interface matériaux hydrophobe/solution. L'insuline s'adsorbe tout d'abord rapidement sur la surface, puis s'accumule lentement parallèlement à une transition de la structure α initiale vers une structure β, aboutissant à la formation de fibres amyloïdes. Par la suite, nous avons étudié le mécanisme d'action d'un peptide connu pour accélérer l'agrégation de l'insuline (LVEALYL). Ce peptide s'adsorbe de façon stable sur la surface hydrophobe en structure β et facilite l'accumulation d'insuline. De plus, il apparait que la séquence du peptide n'est pas essentielle à son action car différents peptides adoptant une structure β sur la surface sont également capables d'induire l'agrégation de l'insuline. La présence de prolines aboli cette action. Ces résultats apportent d'importantes informations sur les mécanismes moléculaires d'auto-association de l'insuline. L'hydrophobicité du matériau facilite le dépliement de l'insuline adsorbée, aboutissant à l'exposition du segment LVEALYL. Cette séquence facilite la propagation du changement de conformation vers les molécules nouvellement adsorbées. Agir contre ce phénomène pourrait permettre de stabiliser les solutions protéiques.

Au cours du développement, les cellules acquièrent progressivement leur identité en établissant des profils transcriptionnels spécifiques qui seront maintenus à travers les divisions cellulaires successives par des mécanismes dits épigénétiques. En dépit de nombreuses sources de variations de l’environnement, génétiques ou aléatoires, les organismes vivants présentent des phénotypes très stéréotypés. Cela suggère l’existence de processus de régulation assurant l’homéostasie du développement. Chez la drosophile, la protéine Cycline G jouerait un rôle dans la stabilité du développement, processus qui tamponne les variations aléatoires du développement. De plus, cette cycline est un régulateur trancriptionnel et interagit avec deux Enhancers de Trithorax et Polycomb (ETP) : ASX et Corto, impliqués dans l’activation et la répression de nombreux gènes. L’analyse du= transcriptome des disques imaginaux d’ailes de larves de drosophile qui surpexpriment CycG nous a permis d’identifier ses cibles transcriptionnelles. Nous avons montré que le domaine d’interaction avec les ETP (ASX et Corto) de Cycline G pourrait être impliqué dans la stabilité du développement. Nos résultats suggèrent qu’une interaction fonctionnelle entre Cycline G et deux complexes Polycomb répresseurs (PR-DUB et PRC1), contrôlerait l’expression de gènes importants pour la stabilité du développement. Par ailleurs, l’interaction fonctionnelle entre des facteurs d’épissage et Cycline G serait également impliquée dans la stabilité du développement. Nos résultats suggèrent que la dérégulation de CycG induirait une augmentation du bruit transcriptionnel, ayant des répercussions sur la stabilité du développement
During development, cells progressively acquire their identity by establishing specific transcriptional profiles that will be maintained throughout successive cell divisions by epigenetic mechanisms. Despite numerous sources of developmental variability - whether environmental, genetic or stochastic, living organisms exhibit uncannily stereotyped phenotypes, suggesting the existence of regulation processes tending to developmental homeostasis. In Drosophila, Cyclin G could participate in developmental stability, which buffers stochastic developmental variation. Moreover, this cyclin is a transcriptional regulator and interacts with two Enhancers of Trithorax and Polycomb (ETP): ASX and Corto, both involved in transcriptional gene silencing and activation. By studying the transcriptome of Drosophila imaginal wing discs overexpressing Cyclin G, we have identified its transcriptional targets. We determined that the ETP-interacting domain of Cyclin G (which binds ASX and Corto) may be involved in developmental stability. Our results show that a functional interaction between Cyclin G and two Polycomb group complexes involved in transcriptional gene silencing (PR-DUB and PRC1), may control the expression of genes required for developmental stability. Additionally, Cycling G might participate indevelopmental stability through functional interactions with splicing factors. Altogether, our results suggest that Cyclin G deregulation may induce an increase in transcriptional noise, resulting in heightened developmental variation

Nous avons étudié le couplage dépliement-transport de la Maltose Binding Protein (MBP ou MalE), une protéine périplasmique d'E. Coli et d'un mutant instable, le MalE219, en fonction de la concentration d'un agent dénaturant, le chlorure de guanidium (GdnHCl) à l'échelle de la molécule unique. La technique utilisée est basée sur la détection électrique du transport de macromolécules à travers un nanopore protéique (l'Aérolysine d'Aeromonas Hydrophila) inséré dans une bicouche lipidique plane. Les résultats obtenus ont été comparés à ceux obtenus lors d'une précédente étude réalisée à travers un autre nanopore protéique, l'alpha-hémolysine du Staphylocoque doré, de géométrie et de charge nette différente. Nous avons montré l'existence de temps courts et longs de blocage du courant associés à des protéines dépliées ou partiellement repliées. La fréquence des blocages du courant permet d'obtenir la fraction de protéine dépliée passant à travers le pore en fonction de la concentration en GdnHCl. Les courbes de dénaturation obtenues avec les deux pores montrent un comportement sigmoïdale très similaire. Le type de pore n'influence donc pas la dénaturation des protéines, mais uniquement leur dynamique de transport. En revanche, la courbe de dénaturation du mutant instable présente un déplacement vers les concentrations plus faibles en GdnHCl. Il a été montré également que la présence du maltose comme ligand sur le MalE219 stabilise nettement sa structure. Pour La MBP, les temps de blocages longs diminuent avec l'augmentation de la concentration de GdnHCl montrant une dynamique de transition vitreuse . Cette technique est appropriée à l'étude du dépliement et des changements de conformation de protéines, mais ne permet pas d'obtenir des informations structurales sur les états intermédiaires de repliement. Ainsi, la spectroscopie RMN a été utilisée pour tenter de caractériser ces états intermédiaires de repliement, notamment par la méthode d'échange proton-deutérium. Elle consiste à suivre les cinétiques d'échange des résidus de la protéine sur des spectres 2D 1H-15N HSQC à différentes concentrations de GdnHCl.Ainsi 180 résidus sur les 370 que compte la MBP ont été suivis lors de la dénaturation en présence de GdnHCl. Les deux hélices en C-terminal sont très accessibles au solvant et se dénaturent facilement. La MBP est composée de deux domaines globulaires, le domaine N-ter et le domaine C-ter. Les éléments de structures secondaires situés dans la zone intermédiaire entre les deux domaines (principalement des brins β) sont particulièrement affectés par l'agent dénaturant. D'autres structures secondaires dans les domaines globulaires sont très protégées et plutôt stables. Il est donc proposé que les protéines partiellement dépliées s'insèrent dans le pore par l'extrémité C-terminal et que des parties de structuration tertiaire restent stable entraînant le blocage du pore
We study the unfolding-transport mechanism of the Maltose Binding Protein (MBP or MalE), a periplasm protein of E. Coli and a destabilised variant, the MalE219, as the function of the concentration of denaturing agent, Guanidine Hydrochloride(GdnHCl) at the single molecule level. The technique is based on the electrical detection of the macromolecule transport through a nanometer-scale channel, Aerolysin channel, inserted into a planar lipid bilayer. Results obtained were compared to previous data with another channel, the alpha-Hemolysin. Both channels have different geometry and net charge.We show that we can distinguish unfolded states from partially folded ones with aerolysin pore.Unfolded proteins induce short current blockades, their duration is constant as a function of the concentration of denaturing agent. Partially folded proteins exhibit long blockades whose life times decrease as the concentration of GdnHCl increase, this indicates a possible glassy dynamics.The frequency of the short current blockades increases as the concentration of denaturing agent increases, following a sigmoidal denaturation curve.The unfolding curve of native MBP with Aerolysin pore is similar to the one previously measured with Hemolysin channel. The denaturation curve of the destabilized variant obtained with Aerolysin is shifted towards lower value of GdnHCl concentration in agreement with bulk measurements. We show also that the addition of maltose stabilizes the structure of MalE219. This nanopore recording technique is also suitable for the study of unfolding and conformation changes of proteins.In order to obtain structural informations that nanopore recording cannot provides, the structure of MBP along its denaturation curve was studied by NMR spectroscopy. The Hydrogen-exchange method known to be sensitive to folding intermediates was specially used. It consists in tracking hydrogen-deuterium exchange rates for amino on the 2D 1H-15N HSQC spectra.Thus, 180 residus of 370 for MBP was followed during denaturation in the presence of GdnHCl. The two last helices in C-terminal of MBP are accessible to the solvent and are denaturated easily. MBP is a two domains protein, N-ter domain and C-ter domain. It was found out that the C- and D-domain of MBP (mainly alpha-helices) could be relatively stable in presence of denaturing agent and that beta strands which make the link between the two domains would be affected by the denaturing agent. It was proposed that partially unfolded proteins enter the pore by the C-terminal end and that stable tertiary structure still present block the pore

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008.
Le complexe MRN (MRE11-RAD50-NBS1) est essentiel au maintien de la stabilité du génome chez les eucaryotes supérieurs. Il a été démontré que la sous-unité MRE11 du complexe MRN, qui possède une activité nucléase nécessaire aux mécanismes de réparation des cassures double-brin (CDBs). est méthylée sur les arginines de façon asymétrique. Cette méthylation est effectuée par la protéine PRMT1 et survient sur les arginines du motif GAR (Glycine-Arginine Rich) de la protéine MRE11. Cet événement arrive apparemment avant l'incorporation de MRE11 dans le complexe MRN. Le motif GAR de MRE11 influence la relocalisation in vivo de MRN en réponse aux CDBs. en plus d'affecter la réponse de signalisation des CDBs. De plus, une analyse des mutants ponctuels sur les arginines du motif GAR de MRE11 montre que ces arginines normalement méthylées influencent l'activité nucléase de MRE11 in vitro. Finalement, nous montrons que le domaine GAR de MRE11 permet la liaison de la protéine SMN par son domaine tudor, in vivo et in vitro. Cette interaction suggère la participation de SMN au niveau de la réparation des CDBs, ce qui est supporté par la sensibilité aux CDBs des cellules mutantes pour le gène smnl. Nos résultats démontrent, pour la première fois, une implication possible de SMN dans la réparation de l'ADN.

Les protéines liées à l'ADN, comme les ARN polymérases peuvent arrêter la réplication. Chez E. Coli, le chromosome est simultanément transcrit et répliqué, et la réplication progresse 10 fois plus vite que la transcription. Les gènes essentiels et fortement transcrits sont co-orientés avec la réplication, comme les 7 opérons ribosomiques (rrn), transcrits mais pas traduits. L'inversion de grandes régions chromosomiques contenant plusieurs rrn n'affecte pas la viabilité des cellules, suggérant qu'il existe des protéines dont le rôle est de faciliter la progression des fourches de réplication à travers les rrn inversés. Nous avons montré que les hélicases DinG, Rep et UvrD sont essentielles pour le passage de la réplication à travers des rrn fortement transcrits en orientation opposée. Deux de ces trois hélicases sont nécessaires pour empêcher le blocage de la réplication et DinG est capable d'enlever les R-loop. Lorsque la fourches de réplication est bloquée, les brins néo-synthétisés peuvent s'apparier, formant une extrémité double-brin et une jonction de Holliday. Cette réaction est appelée réversion de la fourche de réplication (RFR). Les extrémités double-brin sont prises en charge par RecBCD et les jonctions de Holliday par RuvABC. Lorsqu'un rrn est inversé, la RFR et la re-réplication des fourches arrêtées créent des cassures du chromosome. Nos résultats montrent que les extrémités double-brin formées par ces cassures sont reconnues par des exonucléases telles que RecBCD et RecJ et que leur dégradation est ralentie au niveau des rrn. Nous proposons que le redémarrage des fourches après réversion soit couplé à l'action des hélicases qui délogent les ARN polymérases.

Des travaux antérieurs sur les protéases ont suggéré que, dans des conditions d'autolyse, les parties superficielles pourraient être importantes pour la stabilité. Dans cette étude, les techniques d'ingénierie des protéines ont été utilisées pour examiner le rôle de ces éléments structuraux dans la stabilité des protéases neutres de la famille des Bacilli. Deux types de régions ont été ciblés : des boucles irrégulières du domaine C-terminal de la protéase neutre de B. Subtilis (NP-sub) et une boucle du domaine N-terminal de la protéase neutre de B. Stearothermophilus (NP-ste). Dans NP-sub, deux mutants Del1 et Del2, étant chacun amputés de quatre résidus, ont été construits en remplaçant une région exposée par les segments homologues du variant le plus thermostable, la thermolysine (TLN). Des analyses chimiques et biochimiques de ces mutants ont montré que ces délétions ont peu d'effets sur la structure, la fonction et la stabilité de l'enzyme de type sauvage. Dans la thermolysine, la partie modifiée interagit avec une « B-hairpin » de 10 résidus. Afin de tester le rôle de l'interaction entre ces éléments structuraux dans la thermostabilité, nous avons implanté la « B-hairpin » dans Del2, le mutant le plus proche de la thermolysine. Cette enzyme hybride a maintenu les propriétés fonctionnelles de l'enzyme de type sauvage et un effet stabilisant de 1. 1 degrés C a été observé. Ces résultats illustrent la tolérance des protéines aux changements superficiels. Cependant, des mutations ponctuelles réalisées dans la boucle 63-69 de NP-ste ont conduit à de grands changements de stabilité. En particulier, la mutation D67N a causé une déstabilisation de 21 degrés C. Par ailleurs, un effet stabilisant (plus 4. 2 degrés C) a été obtenu lorsqu'une sérine exposée a été substituée par une proline en position 65. Ces différences importantes de stabilité reflètent la sensibilité de cette région aux mutations. Ces résultats sont en accord avec un modèle interprétant la stabilité des protéases sur la base de phénomènes de dépliements locaux. Dans le cadre de ce modèle, la boucle 63-69 et son environnement pourraient être interprétés comme une des premières parties de la molécule qui se déplie lors du traitement thermique.

La protéine d'enveloppe des Flavivirus comprend 3 ectodomaines et un segment membranaire. J'ai caractérisé les propriétés de son domaine III (ED3) in vitro. J'ai mesuré la stabilité thermodynamiques d'ED3 par des expériences d'équilibres de dépliement, induits chimiquement ou thermiquement, et suivis par spectrofluorimétrie; augmenté la stabilité d'ED3 par des changements de résidus dans son coeur hydrophobe sans affecter son antigénicité; et montré qu'un domaine ED3 consensus des virus de la dengue (DENV) était hautement stable. La Protéine Ribosomale SA (RPSA) humaine comprend un domaine N-terminal replié et un domaine C-terminal désordonné. Nous avons quantifié leurs interactions avec les domaines ED3 de Flavivirus pathogènes, la laminine, l'héparine et un anticancéreux (EGCG) par des méthodes immunochimiques et spectrofluorimétriques in vitro. J'ai montré que les domaines-N ,et -C avaient à la fois des fonctions idiosyncratiques et des fonctions partagées, et que le domaine-C mimait l'héparine. J'ai déterminé la spécificité de serotype des IgMs dirigées contre le domaine ED3 d'un des 4 sérotypes de DENV en utilisant des sérums humains infectés ou non-infectes par DENV et une analyse par courbe ROC (Receiving Operator Characteristic). Ces sérums ont été testées en MAC-ELISA au moyen des 4 sérotypes d'un hybride dimérique entre ED3 et phosphatase alcaline d'E. Coli. La discrimination par ED3 entre sérums infectés par le DENV homotypique et sérums non-infectes variait avec le serotype; elle était maximale pour ED3 de DENV1 quel que soit le serotype infectant. Certains domaines ED3 discriminaient entre sérotypes de DENV. Des applications potentielles sont considérées
The envelope protein of Flaviviruses includes 3 ectodomains and a membrane segment. I have characterized the properties of its domain III (ED3) in vitro. I measured the thermodynamic stability of ED3 by experiments of unfolding equilibria, chemically or thermically induced and monitored by spectrofluorimetry; increased the stability of ED3 by changes of residues in its hydrophobic core without affecting its antigenicity; and showed that an ED3 domain, consensus for all the dengue viruses (DENV), was highly stable. The human Ribosomal Protein SA (RPSA) includes a folded N-terminal domain and a disordered C-terminal domain. We quantified their interactions with the ED3 domains of pathogenic Flaviviruses, laminin, heparin and an anticarcinogen (EGCG) by immunochemical and spectrofluorimétrie methods in vitro. I showed that the N- and C-domains had both idiosyncratic and shared fonctions, and that the C-domain mimicked heparin. We determined the serotype specificity of IgMs that were directed to the ED3 domain of each serotype of DENV by using DENV-infected or -uninfected human serums and a statistical analysis by receiving operator characteristic (ROC) curves. These serums were tested in MAC-ELISA with the 4 serotypes of a dimeric hybrid between ED3 and E, coli alkaline phosphatase. The discrimination by ED3 between serums infected by the homotypic DENV and uninfected serums varied with the serotype; it was maximal with the ED3 from DENV1 whatever the infecting serotype. Some ED3 domains discriminated between sérotypes of DENV. Potential applications are described

Asf1 est une protéine chaperon d’histone, qui participe à l’assemblage et au désassemblage des histones H3/H4 sur l’ADN. Asf1 n’est pas essentiel pour la viabilité cellulaire chez S. cerevisiae, mais les voies de surveillance des dommages à l’ADN sont activées de façon constitutive dans les cellules dépourvues d’Asf1 et celles-ci sont hypersensibles à plusieurs types de stress génotoxiques. Chez S. cerevisiae, Asf1 forme un complexe stable avec Rad53 en absence de stress génotoxique. Nos résultats suggèrent qu’au moins trois surfaces d’interaction sont impliquées dans le complexe Asf1-Rad53. Le domaine FHA1 de Rad53 fixe Asf1 phosphorylé sur T270, l’extrémité C-terminale de Rad53 fixe la même surface d’Asf1 impliquée dans la fixation des co-chaperones HirA/CAF-1, et un troisième site putative est constituée de la surface d’Asf1 impliquée dans la fixation de l’histone H3 avec le domaine kinase de Rad53. Lors des stress génotoxiques, Rad53 est phosphorylée et activée. Mes résultats montrent une dissociation totale du complexe Rad53-Asf1 après traitement HU, mais la préservation du complexe après traitement des cellules avec une gamme de concentration de MMS. Nous pensons que la régulation du complexe traduisent des réponses cellulaires distinctes adaptées à des stress génotoxiques spécifiques. Par ailleurs, grâce à la structure du complexe formé par un peptide C-terminal de Rad53 et le domaine N-terminal d’Asf1, nous avons isolé une mutation rad53_A806R-L808R. Nous avons constaté que cette mutation déstabilise l’interaction entre Asf1 et Rad53 et augmente la viabilité des mutants rad9 et rad24 aux stress génotoxiquex. Ce mutant rad53_A806R-L808R semble retourne plus vite dans le cycle cellulaire et/ou traverse plus vite la phase S par rapport à Rad53-WT, et augmente la réparation de l’ADN ou l’adaptation aux dommages du simple mutant rad24Δ
Asf1 is a histone chaperone, which participates in the assembly and disassembly of histones H3/H4 on DNA. Asf1 is not essential for cell viability in yeast, but the DNA damage checkpoints are constitutively activated in cells lacking Asf1 and they are hypersensitive to several types of genotoxic stress. In yeast, Asf1 forms a stable complex with Rad53 in the absence of genotoxic stress. Our results suggest that this complex involves at Ieast three interaction surfaces. One site involves the H3-binding surface of Asf1 with an as yet undefined surface of Rad53, probably reside in the kinase domain of Rad53. A second site is formed by the Rad53-FHA1 domain binding to Asf1-T270. The third site involves the C-terminal 21 aa of Rad53 bound to the conserved Asf1 N-terminal domain, where Rad53 competes with histone H3/H4 and co-chaperones HirA/CAF-1 for binding to the same surface of Asf1. Rad53 is phosphorylated and activated upon genotoxic stress. The Asf1-Rad53 complex dissociated when cells were treated with hydroxyurea but not methyl methane sulfonate, suggesting a regulation of the complex as a function of the stress.In addition to these results, we also found that the rad53-A806R+L808R mutation at the C-terminus of Rad53 destabilized the Asf1-Rad53 interaction and increased the viability of rad9 and rad24 mutants to genotoxic stress. The rad53-ALRR mutant also appeared to re-enter the cell cycle and/or traverse S-phase more rapidly than wild type and increased repair or adaptation when combined with the rad24 mutant

CFTR est un canal chlorure appartenant à la superfamille des transporteurs ABC. Cette protéine est composée de 5 domaines : 2 domaines de liaison aux nucléotides (NBDs), 2 domaines transmembranaires (TMD) et un domaine de régulation. Les interactions entre ces différents domaines sont essentielles pour de nombreux processus, tels que le repliement, la maturation et la fonction de CFTR. Cependant, les rôles de ces domaines de manière individuelle dans la biogenèse, le repliement, la maturation, la fonction et la stabilité membranaire de CFTR restent inconnus.
Dans le but de préciser ceux-ci, nous avons étudié le comportement intracellulaire de protéines CFTR génétiquement modifiées. Nos résultats ont confirmé que contrairement à NBD2, NBD1 est essentiel pour la maturation et le trafic de CFTR vers la membrane plasmique. Bien que NBD2 ne soit pas important pour le repliement de la protéine, nous avons montré pour la première fois que celui-ci était nécessaire pour la stabilité de CFTR à la membrane plasmique. Nous avons montré que le 6ème segment transmembranaire de TMD1 n'est pas stable dans la membrane plasmique et doit être important pour le repliement de la protéine, sans doute par son implication dans l'interaction entre les TMDs.
L'ensemble de ces résultats confirme aussi l'importance des interactions interdomaines dans le comportement cellulaire de la protéine CFTR.

CFTR est un canal chlorure appartenant à la superfamille des transporteurs ABC. Cette protéine est composée de 5 domaines : 2 domaines de liaison aux nucléotides (NBDs), 2 domaines transmembranaires (TMD) et un domaine de régulation. Les interactions entre ces différents domaines sont essentielles pour de nombreux processus, tels que le repliement, la maturation et la fonction de CFTR. Cependant, les rôles de ces domaines de manière individuelle dans la biogenèse, le repliement, la maturation, la fonction et la stabilité membranaire de CFTR restent inconnus. Dans le but de préciser ceux-ci, nous avons étudié le comportement intracellulaire de protéines CFTR génétiquement modifiées. Nos résultats ont confirmé que contrairement à NBD2, NBD1 est essentiel pour la maturation et le trafic de CFTR vers la membrane plasmique. Bien que NBD2 ne soit pas important pour le repliement de la protéine, nous avons montré pour la première fois que celui-ci était nécessaire pour la stabilité de CFTR à la membrane plasmique. Nous avons montré que le 6ème segment transmembranaire de TMD1 n’est pas stable dans la membrane plasmique et doit être important pour le repliement de la protéine, sans doute par son implication dans l’interaction entre les TMDs. L’ensemble de ces résultats confirme aussi l’importance des interactions interdomaines dans le comportement cellulaire de la protéine CFTR
Deletion of Phe-508 (Delta F508) in the NBD1 of CFTR, an ABC chloride channel protein, causes its retention in the endoplasmic reticulum (ER) by preventing its conformational maturation without altering profoundly the local structure of NBD1, but possibly by disrupting the interaction between NBD1, NBD2, TMD1 and/or TMD2. However, the individual role of each domain in biogenesis, folding, maturation and membrane stability of a full length CFTR is still under debate. Using biochemistry, molecular and cellular biology methods, we demonstrate for the first time that each CFTR domain has a specific role. Our results showed that intact NBD1 at its N-terminal position is important in maturation and folding processes compared to NBD2 that was mandatory for CFTR function and membrane stability. The later was not affected by the CFTR folding state. Finally, TMD1 transmembrane segment 6 (S6) did not affect CFTR lipid bilayer orientation but did stop its maturation, suggesting the implication of S6 in CFTR domains interaction that is necessary for its normal cellular behaviour. Together, our results showed that CFTR folding is tightly depending on its domains interaction

La valorisation de farines de blé tendre pour la meunerie et la boulangerie est définie actuellement par des critères agronomiques, technologiques et biochimiques. Ils sont dépendants de facteurs (variété, lieu et année) et de leurs interactions. Pour des raisons de performance et stabilité au champ et en transformation boulangère, des variétés hybrides de blé tendre ont été analysées pour répondre à ces deux principales demandes de la filière blé tendre. Aussi bien pour la performance que pour la stabilité, la distribution des masses moléculaires (DMM) des protéines de blé a été reliée avec des variables du test de panification et du mixographe. L'écueil de non caractérisation de la DMM des polymères de taille supérieure à la limite d'exclusion stérique d'un support chromatographique a été levé par la mise en place d'une application de fractionnement par flux-force couplée avec un détecteur UV et de diffusion laser. Ainsi des échantillons de farine ont été différenciés selon la DMM des polymères de gluténine ; le dispositif expérimental comportant 5 variétés hybrides et 11 lignées fixées (dont neufs étaient parentales), obtenues sur 16 lieux en deux années. L'héritabilité des caractères a été calculée et est apparue faible pour les variables de DMM des polymères de gluténine. Ceci confirmerait l'hypothèse d'hyper agrégation des polymères de gluténine au cours de la phase de maturation du grain, régie principalement par l'effet lieu. Nos travaux ont permis d'identifier des critères agronomiques, biochimiques et technologiques pour lesquels les variétés hybrides de blé tendre à notre disposition étaient performantes (rendement) et/ou stables (volume de pain, temps de développement du pic au maximum de consistance au mixographe et paramètres de DMM) par rapport à des variétés fixées parentales et témoins. La stabilité du volume de pain a été reliée avec celle de la DMM des polymères de gluténine (R2 compris entre 0. 70 et 0. 76)
Milling and breadmaking end-uses are defining by agronomical, technological and biochemical criterion. Roots of variations are variety, location, year and theirs respective interactions. As for performance as stability, molecular weight distribution (MWD) of wheat proteins are related with mixograph test and breadmaking. Lacks of the characterization of molecular weight distribution for polymer sizes upper than steric exclusion size limit do not exist with the use of field-flow fractination combined with UV and light scattering detectors. This application allowed us to differentiate flours saples for their MWD ; experimental design contained 5 hybrid wheat warieties and 11 cultivars (9 parental) on 8 localisations for 2 years (at different location). Heritability for all criterions was calculated and was small calculated and was small for glutenin polymers MWD. It confirmed polymers hyperagration hypothesis during grain maturation, witch was major influenced by location effect. For performance and stability reasons for yield and end-use quality, hybrid wheat varieties have been analysed to respond at miller and baker industries. Our works identified agronomical, technological and biochemical parameters for witch analysed hybrid flours were performing (yield) and stable (loaf volume, mixograph peak time MWD parameters) comparing with fixed varieties. Loaf volume stability has been related with glutenin polymers MWD stability (R2 between 0. 70 et 0. 76)

Le comportement de quatre enzymes, l'-amylase d'aspergillus oryzae, l'invertase, le lysozyme et la glucose oxydase a ete etudie du point de vue de leur activite, de leur specificite et de leur stabilite dans des conditions de microenvironnement se rapprochant des conditions industrielles: milieux concentres en substrats, milieux modeles concentres en additifs depresseurs de l'activite de l'eau ou bien en presence de limitations diffusionnelles. L'evolution de l'activite catalytique des enzymes dans ce type de milieu faiblement hydrate ne repond pas a une regle generale et depend a la fois de la nature de l'enzyme (sa conformation, ses sous-unites) et de la nature du milieu de reaction (structure du solvant et du substrat, diffusion et viscosite). Une grande variete d'additifs (polyols, halogenures alcalins, polyethylene glycols) augmente de maniere notable le temps de demi-vie des enzymes, vis-a-vis de la denaturation thermique. Cet effet protecteur correspond a un renforcement des interactions hydrophobes a l'interieur de la proteine. Il a ete montre que l'action de ces molecules est d'autant plus important que la surface de la proteine est hydrophile. La mesure de la balance hydrophile/hydrophobe de cette surface, par chromatographie sur colonne hydrophobe, est un parametre essentiel pour determiner l'efficacite d'un additif. Enfin, l'etude par spectroscopie raman de la dynamique de l'eau montre que les polyols ont une influence plus faible que les sels (halogenures alcalins) et, que les anions, par leur sphere d'hydratation induisent des modifications de structure du solvant plus importante que les cations. Le mecanisme de stabilisation des enzymes par modification de leur microenvironnement qui a ete etabli, prend en compte l'effet direct des additifs sur l'enzyme et leur effet indirect sur le degre d'association des molecules de solvant

La sumoylation est un mécanisme conservé de modification post-traductionnelle aboutissant à l'attachement d'une petite protéine reliée à l'ubiquitine et appelée SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) sur les protéines cibles. Ici, nous avons utilisé S. Pombe. Un organisme eucaryote unicellulaire génétiquement puissant, comme modèle d'étude pour élucider le rôle de la sumoylation dans les processus cellulaires responsables de la maintenance de la stabilité du génome. Nous avons montré que Pli 1p est une SUMO E3-ligase de la famille Siz/PIAS impliquée dans trois fonctions clé pour la stabilité génétique: les centromères, les télomères et la réparation des dommages à l'ADN durant la phase de duplication du génome
Sumoylation represents a conserved mechanism of post-translational modification resulting in the covalent attachment of the Small Ubiquitin-like Modifier SUMO protein on target proteins. Here, we have used S. Pombe, a monocellular eukaryotic organism providinq powerfull genetic tools as a model system to elucidate the roles of sumoylation in cellullar processes responsible for the maintenance of the stability of the genome. We showed Pli 1p to be a SUMO E3 Ligase of the Siz/PIAS family implicated in three key nuclear fonctions for genetic stability : the centromeres, the telomères and the repair of DMA damage occurring durina the S phase of genome duplication

Cette thèse se place dans le cadre de l'étude in silico, c'est-à-dire assistée par ordinateur, des liens qui unissent la séquence d'une protéine à la (ou aux) structure(s) tri-dimensionnelle(s) qu'elle adopte. Le décryptage de ces liens présente de nombreuses applications dans divers domaines et constitue sans doute l'une des problématiques les plus fascinantes de la recherche en biologie moléculaire.

Le premier aspect de notre travail concerne le développement de potentiels statistiques dérivés de bases de données de protéines dont les structures sont connues. Ces potentiels présentent plusieurs avantages: ils peuvent être aisément adaptés à des représentations structurales simplifiées, et permettent de définir un nombre limité de fonctions énergétiques qui incarnent l'ensemble complexe d'interactions gouvernant la structure et la stabilité des protéines, et qui incluent également certaines contributions entropiques. Cependant, leur signification physique reste assez nébuleuse, car l'impact des diverses hypothèses nécessaires à leur dérivation est loin d'être clairement établi. Nous nous sommes attachés à l'étude de certaines limitations des ces potentiels: leur dépendance en la taille des protéines incluses dans la base de données, la non-additivité des termes de potentiels, et l'importance souvent négligée de l'environnement protéique spécifique ressenti par chaque résidu. Nous avons ainsi mis en évidence que l'influence de la taille des protéines de la base de données sur les potentiels de distance entre résidus est spécifique à chaque paire d'acides aminés, peut être relativement importante, et résulte essentiellement de la répartition inhomogène des résidus hydrophobes et hydrophiles entre le coeur et la surface des protéines. Ces résultats ont guidé la mise au point de fonctions correctives qui permettent de tenir compte de cette influence lors de la dérivation des potentiels. Par ailleurs, la définition d'une procédure générale de dérivation de potentiels et de termes de couplage a rendu possible la création d'une fonction énergétique qui tient compte simultanément de plusieurs descripteurs de séquence et de structure (la nature des résidus, leurs conformations, leurs accessibilités au solvant, ainsi que les distances qui les séparent dans l'espace et le long de la séquence). Cette fonction énergétique présente des performances nettement améliorées par rapport aux potentiels originaux, et par rapport à d'autres potentiels décrits dans la littérature.

Le deuxième aspect de notre travail concerne l'application de programmes basés sur des potentiels statistiques à l'étude de protéines qui adoptent des structures alternatives. La permutation de domaines est un phénomène qui affecte diverses protéines et qui implique la génération d'un oligomère suite à l'échange de fragments structuraux entre monomères identiques. Nos résultats suggèrent que la présence de "faiblesses structurales", c'est-à-dire de régions qui ne sont pas optimales vis-à-vis de la stabilité de la structure native ou qui présentent une préférence marquée pour une conformation non-native en absence d'interactions tertiaires, est intimement liée aux mécanismes de permutation. Nous avons également mis en évidence l'importance des interactions de type cation-{pi}, qui sont fréquemment observées dans certaines zones clés de la permutation. Finalement, nous avons sélectionné un ensemble de mutations susceptibles de modifier sensiblement la propension de diverses protéines à permuter. L'étude expérimentale de ces mutations devrait permettre de valider, ou de raffiner, les hypothèses que nous avons proposées quant au rôle joué par les faiblesses structurales et les interactions de type cation-{pi}. Nous avons également analysé une autre protéine soumise à d'importants réarrangements conformationnels: l'{alpha}1-antitrypsine. Dans le cas de cette protéine, les modifications structurales sont indispensables à l'exécution de l'activité biologique normale, mais peuvent sous certaines conditions mener à la formation de polymères insolubles et au développement de maladies. Afin de contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la polymérisation, nous avons cherché à concevoir rationnellement des protéines mutantes qui présentent une propension à polymériser contrôlée. Des tests expérimentaux ont été réalisés par le groupe australien du Professeur S.P. Bottomley, et ont permis de valider nos prédictions de manière assez remarquable.

The work presented in this thesis concerns the computational study of the relationships between the sequence of a protein and its three-dimensional structure(s). The unravelling of these relationships has many applications in different domains and is probably one of the most fascinating issues in molecular biology.

The first part of our work is devoted to the development of statistical potentials derived from databases of known protein structures. These potentials allow to define a limited number of energetic functions embodying the complex ensemble of interactions that rule protein folding and stability (including some entropic contributions), and can be easily adapted to simplified representations of protein structures. However, their physical meaning remains unclear since several hypotheses and approximations are necessary, whose impact is far from clearly understood. We studied some of the limitations of these potentials: their dependence on the size of the proteins included in the database, the non-additivity of the different potential terms, and the importance of the specific environment of each residue. Our results show that residue-based distance potentials are affected by the size of the database proteins, and that this effect can be quite strong, is residue-specific, and seems to result mostly from the inhomogeneous partition of hydrophobic and hydrophilic residues between the surface and the core of proteins. On the basis of these observations, we defined a set of corrective functions in order to take protein size into account while deriving the potentials. On the other hand, we developed a general procedure of derivation of potentials and coupling terms and consequently created an energetic function describing the correlations between several sequence and structure descriptors (the nature of each residue, the conformation of its main chain, its solvent accessibility, and the distances that separate it from other residues, in space and along the sequence). This energetic function presents a strongly improved predictive power, in comparison with the original potentials and with other potentials described in the literature.

The second part describes the application of different programs, based on statistical potentials, to the study of proteins that adopt alternative structures. Domain swapping involves the exchange of a structural element between identical proteins, and leads to the generation of an oligomeric unit. We showed that the presence of “structural weaknesses”, regions that are not optimal with respect to the folding mechanisms or to the stability of the native structure, seems to be intimately linked with the swapping mechanisms. In addition, cation-{pi} interactions were frequently detected in some key locations and might also play an important role. Finally, we designed a set of mutations that are likely to affect the swapping propensities of different proteins. The experimental study of these mutations should allow to validate, or refine, our hypotheses concerning the importance of structural weaknesses and cation-{pi} interactions. We also analysed another protein that undergoes large conformational changes: {alpha}1-antitrypsin. In this case, the structural modifications are necessary to the proper execution of the biological activity. However, under certain circumstances, they lead to the formation of insoluble polymers and the development of diseases. With the aim of reaching a better understanding of the mechanisms that are responsible for this polymerisation, we tried to design mutant proteins that display a controlled polymerisation propensity. An experimental study of these mutants was conducted by the group of Prof. S.P. Bottomley, and remarkably confirmed our predictions.

Doctorat en sciences appliquées
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La température est un paramètre crucial dans le fonctionnement du monde vivant, notamment de la machinerie moléculaire (les protéines) dont la stabilité et l’activité en dépendent sensiblement. Celles-ci sont souvent considérées comme étant équivalentes : si une protéine fonctionne, c’est qu’elle est stable, et vice-versa. Cependant, les protéines des organismes thermophiles, qui prolifèrent dans de températures élevées, sont stables à température ambiante, mais y présentent une faible activité. Cette dernière est optimale à la température de croissance de l’organisme hôte. Lorsqu’on parle de stabilité et d’activité protéique, la rigidité mécanique est souvent utilisée comme paramètre pertinent, offrant une explication simple et attractive à la fois pour la stabilité thermodynamique à haute température et au manque d’activité à des températures plus modérés. La réalité s’avère souvent plus complexe, et les mécanismes moléculaires reliant rigidité/flexibilité avec la stabilité et l’activité sont encore mal compris. Dans ce travail, nous abordons le problème au travers de trois systèmes. Nous avons examiné l’activation thermique des modes fonctionnels du domaine G de la protéine EF ainsi que les homologues mésophiles et thermophiles de la déshydrogénase Lactate/Malate. Par ailleurs, nous avons mis en évidence l’existence d’un paramètre unique (la moyenne des fluctuations atomiques) permettant d’expliquer la dynamique de la protéine lysozyme près de son point de fusion, et ce quelle que soit la nature de l’environnement autour de la protéine (qui décale le point de fusion). Nos conclusions se basent principalement sur une approche in silico où la dynamique moléculaire et des techniques d’échantillonnage améliorées sont utilisées et sont complémentées par des expériences de diffraction de neutrons
Temperature is one of the major factors governing life as demonstrated by the fine tuning of stability and activity of the molecular machinery, proteins in particular. The structural stability and activity of proteins have been often presented as equivalent. However, the thermophilic proteins are stable at ambient condition, but lack activity, the latter recovered only when the temperature increases to match that of the optimal growth condition for the hosting organism. In discussing the protein stability and activity, mechanical rigidity is often used as a relevant parameter, offering a simple and appealing explanation of both the extreme thermodynamic stability and the lack of activity at low temperature. The reality, however, illustrates the complexity of the rigidity/flexibility trade off in ensuring stability and activity through intricate thermodynamic and molecular mechanisms. Here we investigate the problem by studying three study cases. These are used to relate the thermal effects on mechanical properties and the stability and activity of the proteins. For instance, we have probed the thermal activation of functional modes in EF G-domain and Lactate/Malate dehydrogenase mesophilic and thermophilic homologues and verified a “universal” scaling of atomistic fluctuation of the Lysozyme approaching the melting in different environmental conditions. Our conclusions largely rest on an in silico approach, where molecular dynamics and enhanced sampling techniques are utilized, and are often complemented with neutron scattering experiments

Les kinases de la famille Pim sont impliquées dans de nombreux cancers hématologiques dont la leucémie aigüe myéloïde (LAM) et le myélome multiple. Contrairement à la plupart des autres protéines kinases dont l’activation nécessite la phosphorylation préalable du domaine catalytique, l’activité des Pim kinases est constitutive. Les mécanismes de régulation de l’expression de Pim2 ainsi que ses mécanismes d’action sont très peu connus. Une partie de mon projet a consisté en l’étude de l’expression et de la stabilité de Pim dans des cellules de LAM et de myélome. J’ai montré que l’expression de Pim2 est régulée au niveau transcriptionnel par STAT5. Les trois isoformes de Pim2 ont une demi-vie très courte. Leur rapide dégradation semble constitutive et indépendante des relais de signalisation intracellulaire. Elle implique la machinerie du protéasome mais ne semble pas nécessiter l’ubiquitination préalable de la protéine. Les formes de Pim2 qui s’accumulent dans les cellules sous l’action des inhibiteurs du protéasome sont constitutivement actives. Ces premières données m’ont conduit à envisager l’intérêt d’inhibiteurs de Pim dans le myélome multiple, où l’inhibition du protéasome comme traitement favorise l’accumulation de cette kinase oncogénique. La seconde partie de mon projet a consisté en l’identification de substrats et de partenaires potentiels de Pim2 dans les LAM. Pour cela, j’ai mis au point une méthode de marquage métabolique couplée à une analyse phosphoprotéomique quantitative globale, ainsi qu’une analyse de l’interactome de Pim2 après avoir produit un anticorps contre cette protéine. Les informations obtenues m’ont permis de montrer l’activation de la voie mTORC1 par Pim2 et d’identifier la Polo-Like Kinase (PLK1) comme un nouveau substrat et partenaire de Pim2. Mes résultats montrent une colocalisation de Pim2 et de PLK1 au cours des différentes phases de la mitose et en particulier au niveau du corps intermédiaire lors de la séparation des cellules filles
The kinases of Pim family are implicated in many haematological cancers, whose Acute Myeloid Leukemia (AML) and multiple myeloma. Contrary of the most others proteins kinases which needs activation by the preliminary phosphorylation of catalytic domain, the activity of Pim kinases is constitutive. The regulation of Pim2 expression and its mechanisms of action are not well-known. One part of my project consisted in the study of the expression and stability of Pim2 in AML and myeloma cells. I have shown that the expression of Pim2 is regulated at transcriptional level by STAT5. The three isoforms of Pim2 have very short half-lives. Theirs fast degradations seem to be constitutive and independent of intracellular pathway. It involves the proteasome machinery but not seems to need the preliminary ubiquitination of the protein. Forms of Pim2 accumulated in the cells when the proteasome is inhibited are actives. These firsts data drove me to think about the interest of Pim inhibitor in multiple myeloma, where the using of proteasome inhibitor as treatment increase the accumulation of this oncogenic kinase. The second part of my project was to identify the potentials substrates and partners of Pim2 in AML. In this aim, I developed a method of metabolic labelling coupled with a global quantitative phosphoproteomic approach, as well as a specific antibody targeted against this protein to realize an interactome analysis of Pim2. The informations obtained allowed me to show the activation of mTORC1 pathway by Pim2 and to identify the Polo-Like Kinase (PLK1) as a new substrate and partner of Pim2. My results show that Pim2 and PLK1 are colocalized during the differents mitotic phases, particularly at the midbody level during the separation of cell

L'etude des determinants au niveau moleculaire de la stabilite des proteines est d'une importance fondamentale en biochimie. La comprehension du chemin de repliement des proteines est aussi une autre question biochimique centrale. Afin d'etudier ces questions, nous avons choisi deux proteines modeles de l'archaebacterie sulfolobus solfataricus : la ribonuclease sso7d et une carboxypeptidase. Ces proteines d'archaebacteries sont connues pour leur extreme stabilite et leurs proprietes catalytiques qui font d'elles des candidates ideales pour ce genre d'etudes. Les experiences menees dans cette these constituent une investigation thermodynamique et cinetique par le biais de la pression afin d'etudier la relation structure-fonction des proteines. La comprehension notamment de l'effet de la pression sur les proteines est parmi les aspects les moins explores en biophysique. Notre travail sur la carboxypeptidase suggere que la pression peut etre employee dans le domaine biotechnologique en tant que facteur thermo-stabilisant des proteines. L'etude effectuee sur la ribonuclease sso7d a demontre l'importance de la juxtaposition des acides amines aromatiques a l'interieur du centre hydrophobe et des liaisons hydrogene afin de stabiliser la structure native des proteines. L'etude des cinetiques de repliement (induites par des sauts de pression) a permis de caracteriser l'etat de transition de la reaction du repliement de sso7d par son volume d'activation. De plus, l'analyse fine des spectres d'absorbance uv par la methode des derivees quatriemes a revele des informations nouvelles concernant la mobilite des residus a l'interieur des proteines.

Les patients infectés chroniquement par le VHB ont un risque élevé de développer des maladies graves du foie telles que le carcinome hépatocellulaire. Dans les cellules infectées, le virus persiste sous la forme d’un ADN circulaire covalemment clos (ADNccc) qui reste stable même chez les patients qui suivent un traitement. La protéine virale HBc, en plus de son rôle dans la formation des capsides, est retrouvée dans le noyau et est recrutée sur l’ADNccc et modifie sa structure. Cependant son rôle dans ce contexte n’est pas encore compris. Afin de mieux comprendre le rôle nucléaire d’HBc notamment sur la biologie de l’ADNccc et l’expression des ARN viraux, nous avons construit plusieurs mutants déficients pour l’expression d’HBc. Nous avons tout d’abord construit un mutant qui possède deux codons stop après le codon 27 d’HBc suivi d’une substitution d’une partie du gène HBc par une séquence codant différents épitopes. Lors de l’infection, ce virus possède un fort défaut d’expression des ARN viraux, qui ne peut être restauré par la ré-expression d’HBc. La quantification des ARN naissants montre que le défaut semble être post-transcriptionnel mais est présent rapidement après la transcription (<2h). Ces résultats suggèrent que le défaut observé est indépendant d’HBc et que la séquence délétée de HBV HBc-Flag27* pourrait être impliquée dans un mécanisme de régulation post-transcriptionnelle. Grâce à ce virus, nous avons pu mettre en évidence que la protéine HBc apportée avec la capside lors de l’infection est capable de se réassocier sur l’ADNccc dans le noyau. Nous avons ensuite étudié des mutants ayant une séquence plus proche de la souche sauvage, sans cette substitution. Lorsqu’ils sont exprimés à partir d’un plasmide exprimant à la fois le génome et la protéine HBc sous le contrôle d’un promoteur SV40, nous observons un défaut d’expression de l’ARNpg pour des mutants possédant les codons stop après le 27e ou le 38e codon du gène HBc, mais pas lorsqu’il est placé après le 67e codon. Ces résultats suggèrent que le déplacement du codon stop d’HBc induit la diminution de l’expression de l’ARNpg et que le codon stop naturel d’HBc pourrait être protégé des voies de surveillance des ARN viraux comme la nonsense-mediated decay (NMD) qui reconnait les ARN ayant un codon stop prématuré. Lors des infections par ces virus, et donc en absence d’HBc, nous observons un défaut accru pour les virus ayant des codons stop aux codons 27 et 38 et un défaut apparait pour le virus ayant le codon stop après la position 67. Dans ce contexte, en absence d’HBc, nous avons pu voir que les ARN codants pour les protéines de surface sont également impactés et que l’expression des ARN peut être partiellement restaurée par l’expression d’HBc. Par des techniques de chromosome conformation capture nous avons pu mettre en évidence que le virus HBV HBc-27* n’est plus exclu des régions réprimées contactant des lamines, indiquant que la protéine HBc pourrait être impliquée dans la l’adressage de l’ADNccc vers des régions favorables pour la transcription. Afin de comprendre les mécanismes impliqués dans la régulation par HBc, nous avons isolé les partenaires nucléaires de la protéine et mis en évidence de nombreux facteurs impliqués dans la régulation de l’ADN et de la transcription ainsi que dans la réparation des dommages à l’ADN.Dans l’ensemble, nos résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes de régulation de la biologie des ARN du VHB
Chronic HBV carriers (CHB) are at high risk of developing hepatocellular carcinoma. Because covalently closed circular DNA (cccDNA) persists in infected cells through RNA expression, deciphering the mechanisms involved in RNA transcription and stability is a crucial step to identify new antiviral targets. In addition to its role in capsid formation, HBV core protein (HBc) has been shown to be associated with the cccDNA and to modulate its structure, yet the impact of this modification on HBV transcription is not fully understood. To better understand the role of HBc in this context we constructed several mutants deficient for HBc expression. The first mutant has two stop codons after codon 27 in HBc followed by a substitution of the HBc sequence by a sequence encoding different epitopes. During infection, this virus shows a strong decrease in expression of viral RNA, which cannot be rescued by re-expression of HBc. The quantification of nascent RNAs shows that the defect appears to be post-transcriptional and is present as early as 2h after transcription. These results suggest that the observed defect is independent of HBc and that the deleted sequence in the HBV genome of this mutant could be involved in a post-transcriptional regulatory mechanism. With this mutant, we have been able to demonstrate that the HBc protein provided by the capsid during infection is able to re-associate onto the cccDNA in the nucleus. We then studied HBc mutants generated in the context of the the wild-type virus sequence, without the substitution. When expressed from a plasmid expressing both the genome and the HBc protein under the control of SV40 promoter, we observe a decrease of the pgRNA expression for mutants having the stop codons after the 27th or 38th codon of HBc, but not when the stop codon is located after the 67th codon. These results suggest that displacement of the HBc stop codon induces a decrease in pgRNA expression, independently of HBc protein, and that the natural stop codon of HBc could be protected from viral RNA surveillance pathways such as nonsense-mediated decay (NMD) that recognizes RNAs with a premature stop codon. During infections with these viruses, and therefore in the absence of HBc, we observed an increased in the defect for viruses having stop codons at position 27 and 38 and a defect appears for a virus having the stop codon at position 67. In this context, in the absence of HBc, we have seen that RNAs encoding surface proteins are also impacted and that RNA expression can be partially restored by HBc expression. By chromosome conformation capture techniques we were able to observe that the HBc-27* HBV virus is no longer excluded from repressed regions associated with lamins, indicating that the HBc protein could be involved in the localization of the cccDNA at active chromatin regions favorable for transcription.In order to understand the mechanisms involved in HBc regulation, we have isolated the nuclear partners of HBc and highlighted many factors involved in the RNA and DNA regulation, in the DNA damage repair and RNA processing.Overall, our results shed light on the regulatory mechanisms of HBV RNA biology