Tesis sobre el tema "Sistema immunitario (Immune system)"

Hypertension is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Historically, an increase of the sympathetic nerve activity represents one of the principal features of hypertension. Mounting evidence suggests that novel players also contribute to the development of the disease as the immune system. In fact, how the immunity is activated after a hypertensive stimulus is to date an intriguing question. In this dissertation, we show how hypertensive challenges activate the sympathetic nerve drive to prime immune responses in the spleen causing the onset of the disease. First, we observe that the splenic sympathetic nerve activity is significantly increased in mice upon 3 days of chronic AngiotensinII (AngII) or Deoxycorticosterone acetate (DOCA)-salt as compared to mice treated with vehicle or placebo, respectively. Then, we show that the splenic nerve discharge is absent in both coeliac vagotomized mice and in mice lacking nicotinic cholinergic receptors (7nAChR) upon AngII. Indeed, we find that a vagus-splenic nerve pathway, mediated by 7nAChR expressed in the coeliac ganglion, is modulated by chronic infusion of AngII. The integrity of this cholinergic-sympathetic pathway is necessary for the activation of T cell and their egression towards target organs of hypertension, as kidneys and vasculature. In order to evaluate whether the sympathetic neuro-immune drive is relevant for hypertension, we perform the denervation of the splenic artery by thermoablation in mice infused with chronic AngII, finding a protection from the increase of blood pressure levels induced by this hypertensive stimulus. We also confirm the efficacy of the splenic denervation by injecting a retrograde neurotracer in the spleen, which label neurons of coeliac ganglion only in sham mice but not in denervated mice. This novel experimental procedure suggests new clinical strategies for resistant hypertension. To evaluate how the activation of the immune system is mediated in the spleen, we explore the role of the neuro-splenic sympathetic drive in the murine model of DOCA-salt hypertension. This model of hypertension completely resembles the excessive salt consumption in humans and it is optimal to obtain a peripheral low-circulation of renin-angiotensin system (RAS) activity, contemporary to en elevation of RAS activity in the brain. First, we challenge splenectomized mice with DOCA-salt for 21 days finding that they are protected from blood pressure elevation induced by this hypertensive stimulus. We observe the same results in mice with left coeliac ganglionectomy (CGX) equally treated with DOCA-salt. Then, by ELISA and immunofluorescence quantitative analysis, we measure the levels of the placental growth factor (PlGF) upon DOCA-salt showing an increased expression in mice with an intact neuro-splenic axis but not in CGX mice. Therefore, PlGF KO mice are significantly protected from blood pressure increase induced by DOCA-salt, as compared to WT mice. Additionally, the absence of PlGF hinders the costimulation pathway of T cells with a consequent reduction of their migration toward kidneys. Kidneys of WT mice show an increased deposition of fibrotic tissue upon DOCA-salt, in both glomeruli and tubules, suggesting that infiltrating T cells determinate structural alterations that deteriorate renal function. We assesse key parameters of renal function in PlGF KO and WT mice placed in metabolic cages after DOCA-salt or placebo administration. PlGF KO mice show a reduced urine output as compared to WT mice after DOCA-salt. The creatinine clearance is significantly reduced in WT mice but not in PlGF KO mice and similarly, PlGF KO mice are protected from DOCA-salt induced renal damage observed in WT mice in terms of protein excretion. These data demonstrate that the coupling of nervous and immune system activation in the marginal zone of the spleen is established through a sympathetic-mediated PlGF release, suggesting that this pathway could be a valid therapeutic target for hypertension.

Il presente lavoro di tesi è incentrato sul possibile recupero di scarti derivanti dall’industria enologica al fine ottenere sostanze bioattive dal ruolo immunomodulante che possano essere introdotte, quali supplemento, nell’alimentazione dei ruminanti. Recentemente, il Parlamento Europeo ha introdotto la “Waste Framework directive” (Direttiva 2008/98/EC) con l’intento di promuovere il riciclo e il recupero degli scarti e dei sottoprodotti per ottenere nuove materie prime. Come, infatti, è descritto nella direttiva suddetta, un sottoprodotto è: un “prodotto”, che deriva dalla dal processo produttivo, ma che non rappresenta l’oggetto ultimo della produzione. Il progetto si staglia in uno scenario che vede da una parte una ingente produzione di scarti agroindustriali e dall’altra la crescente preoccupazione del consumatore rispetto alla salubrità dei prodotti di origine animale e al benessere animale. È noto che l'uva e i prodotti enologici sono ricchi di sostanze antiossidanti quali i polifenoli a cui è associato un ruolo antiossidante, antimicrobico e anticarcinogenico accanto alla capacità di modulare il sistema immunitario e il metabolismo ormonale. Il lavoro è suddiviso in tre prove, condotte in vitro, e mira al recupero di due sottoprodotti: i wine lees e i grape pomace. Al fine di valorizzare la produzione locale e l’economia Pugliese, i sottoprodotti sono stati prelevati presso due aziende locali: Cantine La Marchesa (Lucera, FG) e Cantine Pirro (Troia, FG). I sottoprodotti scelti derivano dalla lavorazione di vitigni autoctoni: Bombino e Trebbiano d'Abruzzo per le vinificazioni in bianco (Cantine La Marchesa) e Nero di Troia per le vinificazioni in rosé e rosso (Cantine Pirro). Al fine di operare in un’ottica di basso impatto ambientale i solventi e le procedure utilizzate sono state attentamente scelte. Nel primo trial i wine lees, per definizione il residuo che si ritrova sul fondo dei silos al termine delle operazioni di svinamento, bianchi, rosé e rossi sono stati prelevati e sottoposti ad estrazione microonde assistita (MAE) con i seguenti solventi: acqua, alcool e la loro miscela 1:1, in presenza o meno di catalizzatore e quattro diverse temperature 50°C, 100°C, 150°C e 200°C. Al termine della fase estrattiva, gli estratti sono stati sottoposti ad analisi spettrofotometrica al fine di determinare il contenuto di fenoli totali, antociani, flavonoidi e la capacità antiossidante. Gli estratti sono stati poi testati a due differenti concentrazioni, 0,4 mg/mL e 0,8 mg/mL, in vitro su culture di PBMC ovine al fine di ottenere informazioni relative alla proliferazione linfomonocitaria e alla produzione di citochine. Sui surnatanti, inoltre, è stata determinata la presenza di proteine Bax e Bcl2 legate all’apoptosi cellulare. Infine, negli estratti, tramite analisi GC-MS/MS è stata determinata la presenza di 5-idrossimetilfurfurale e tramite analisi enzimatica si sono ottenute informazioni circa la presenza di solfiti e acidi organici con lo scopo di escludere un loro impatto sulla capacità antiossidante degli estratti. I risultati ottenuti da questo primo trial evidenziano che il contenuto in fenoli totali è legato alla tipologia di wine lees e al solvente utilizzato per l’estrazione: i wine lees derivanti dalla vinificazione in bianco presentano un maggiore contenuto di flavonoidi mentre i wine lees ottenuti dalla vinificazione in rosato contengono più antociani, infine i wine lees della vinificazione in rosso presentano una capacità antiossidante in termine di potere scavenging superiore agli altri wine lees selezionati. I test condotti in vitro sui PBMC hanno confermato la capacità degli estratti di wine lees di agire sul sistema immunitario ovino portando ad una riduzione massiva della proliferazione linfomonocitaria indifferentemente dall’estratto preso in considerazione. Nessuna variazione significativa è stata ritrovata per ciò che riguarda le citochine pro-infiammatorie al contrario, un incremento significativo dell’IFN-γ e dell’IL-10 è stato evidenziato per l’estratto ottenuto da wine lees Nero di Troia vinificato in rosso ed estratto in acqua (ReW). Questo risultato dimostra la capacità immunostimolante di questo estratto che può essere associata alla sua elevata capacità scavenging (ABTS+). Quest’ultima attività può essere attribuita alla presenza di 5-idrossimetilfurfurale (5-HMF) così come riportato dai risultati ottenuti dall’analisi gas cromatografica del Nero di Troia estratto in acqua (ReW). Il 5-HMF può influenzare l’apoptosi cellulare agendo a livello della famiglia delle proteine dell’apoptosi Bcl2 e nel presente studio l’incremento delle proteine pro-apoptotiche Bax sembrerebbe essere legato alla presenza di 5-HMF nell’estratto ReW. Nel secondo trial gli estratti ottenuti per estrazione al microonde in acqua a 200°C, sono stati sottoposti a separazione mediante imbuto separatore e successivamente a purificazione tramite cromatografia flash (FLC) e le frazioni così ottenute sono state sottoposte ad analisi GC-MS/MS. Dall’analisi gas cromatografica è risultata la presenza di dichetopiperazine con una diversa distribuzione isomerica a seconda della frazione considerata. Sulla base di questi risultati, le frazioni sono state accorpate e per ogni wine lees due diversi accorpamenti F1 ed F2 sono stati scelti come campioni da testare a due diverse concentrazioni (0,4mg/mL e 0,8 mg/mL) in vitro su PBMC ovini. Il secondo trial è stato suddiviso in due esperimenti di cui uno condotto in condizione di stress termico (43°C) per 24h e l’altro condotto in condizioni di normotermia (37°C) per 48h; per entrambi gli esperimenti sono stati valutati la proliferazione dei linfomonociti e la produzione di citochine, inoltre sull’esperimento condotto in condizioni di stress termico è stata effettuata una valutazione della salute mitocondriale mediante il microscopio EVOS FL Cell Imaging System (Thermo Fisher) utilizzando il kit HCS Mitochondrial Health (Invitrogen). Recenti studi hanno riportato che le dichetopiperazine hanno capacità antiossidanti, antivirali, antimicrobiche e immunomodulanti. I risultati ottenuti in questo studio riportano una marcata riduzione della proliferazione dei PBMC e della vitalità cellulare in condizioni di normotermia e in maniera più accentuata nello stress termico. Per quanto concerne la produzione di citochine, in condizioni di normotermia si osserva un decremento della produzione di IL-6 nei surnatanti delle cellule coltivate in presenza di WhF1, RoF1 a 0,8 mg/mL, ReF1 a 0,8 mg/mL e ReF2, mente un aumento della IL-10 si osserva in presenza della frazione F2 del wine lees da vinificazione in bianco. In condizioni di stress termico, invece, la IL-6 subisce una riduzione nei surnatanti delle cellule in presenza della F2 di ciascun wine lees e della concentrazione 0,8 mg/mL del ReF1; contrariamente, a 39°C si registra un decremento di questa citochina in presenza della concentrazione 0,8 mg/mL di RoF1. Il livello di IFN-γ aumenta in presenza di ReF2 a 0.8 mg/mL in condizioni di stress termico dimostrando la capacità di questa frazione di favorire la produzione di citochine anti-infiammatorie a scapito delle pro-infiammatorie. Il terzo trial mira alla valorizzazione dei grape pomace che sono principalmente composti da semi e bucce. I grape pomace di Nero di Troia sono stati sottoposti ad estrazione MAE e alla analisi spettrofotometrica così come riportato per il primo trial. Gli estratti ottenuti sono stati poi testati a due diverse concentrazioni (0,4 mg/mL e 0,8 mg/mL) su PBMC ovini separati da sangue periferico durante il transition period. A tal fine il sangue è stato prelevato 15 giorni (t1), 7 giorni (t2) prima del parto, al parto (t3) and 7 giorni (t4) dopo il parto. I risultati ottenuti da questo trial dimostrano come i diversi estratti abbiano un’azione differente sulla proliferazione linfomonocitaria. La proliferazione aumenta al tempo t3 e t4 in presenza di tutti gli estratti tranne con quello a 200°C in acqua ad entrambe le concentrazioni e in etanolo a 0.8 mg/mL in corrispondenza dei quali si osserva un decremento della proliferazione dei PBMC. Il livello di IL-6 aumenta per tutti i tempi considerati quando le cellule sono stimolate con i grape pomace estratti in acqua/etanolo e in solo etanolo rispettivamente a 150°C e 200°C. Al momento del parto e 7 giorni dopo esso, si registra un aumento della IL.10. L’incremento della concentrazione di questa citochina e della IL-6 che si verifica con alcuni estratti potrebbe essere associato all’attivazione del sistema immunitario innato. Infine il livello di IFN-ɣ risulta più elevato 7 giorni dopo il parto nei surnatanti delle cellule stimolate con grape pomace estratti in etanolo e catalizzatore e in solo etanolo. Da quanto suddetto è possibile concludere che, gli estratti di wine lees possono trovare applicazione come immunostimolanti e antiossidanti e le loro frazioni, purificate così come nel secondo trial, possono essere utilizzate come chemioterapici ed immunomodulanti. In ultimo, gli estratti di grape pomace possono trovare impiego quali anti-infiammatori ed immunomodulanti anche in condizioni di stress come quello legato al transition period. Ulteriori studi dovrebbero essere orientati alla valutazione dell’impatto che questi estratti e frazioni possono avere sul sistema immunitario dell’animale in vivo.
This thesis focused on the potential reuse of winery by-products as immunomodulants in sheep. Recently, EU Parliament introduced the “Waste Framework Directive” (Directive 2008/98/EC) with the intent to promote the recycling and recovery of waste and by-products in order to obtain a secondary raw material. As describe in this directive a by-product is: a substance or object, resulting from a production process, the primary aim of which is not the production of that item. In this scenario is integrated the “zero waste economy” which is based on the circular economy concept. In this point of view waste can be used as new material to generate products. Nowadays, consumers are attentive to the healthiness and safety of animal products moreover, worldwide is generally accepted that industries generate a large amount of waste leading to a huge environmental impact. It is generally known that winery products contain considerable number of bioactive compounds mainly phenols with strong antioxidant activity, antimicrobial and anticancer activity, modulation of detoxification enzymes, activity on the immune system and modulation of hormone metabolism. Starting from this consideration this thesis is oriented to characterize two different oenological byproducts, wine lees and grape pomace, with the objective of extracting bioactive substances which can be used as supplements in sheep diet. This dissertation provides an in vitro overview of the immunomodulants properties of winery by-products extracts, so further researchers are required to evaluate their impact in vivo. The thesis is divided into three different trials. Winery by-products where collected at two local wineries: Cantine La Marchesa (Lucera, FG) and Cantine Pirro (Troia, FG), in order to support our economy, moreover the choice was made taking into account the vines processed in order to valorizate the Apulia Region production. The winery by-products chosen belong to local cultivar of Vitis Vinifera: Bombino and Trebbiano d’Abruzzo for white vinification (Cantine La Marchesa) and Nero di Troia for rosè and red vinification (Cantine Pirro). To operate in an “enviromentaly friendly” approach solvent and procedures were carefully chosen. In the first trial wine lees, classified as the residues remain at the bottom of recipients after wine production, were collected and submitted to extraction procedures in order to isolate bioactive compounds. The extraction of bioactive substances was conducted using a microwave assisted extraction (MAE) technique with low impact solvents such as water, ethanol and their mixture 1:1 and catalyser/no catalyser to increase the extraction yeald. In this experiment, three different wine lees from Bombino/Trebbiano d’Abruzzo in white vinifiaction and Nero di Troia in rosè and red vinification were submitted to MAE extraction operating at four different temperatures 50°C, 100°C, 150°C and 200°C then total phenols, antocians, flavonoids content and antioxidant capacity were assessed. MAE extracts were tested at 0.4 mg/mL and 0.8 mg/mL on in vitro PBMC proliferation and cytokines’ production. In addition, an apoptosis ELISA assay was done to measure the presence of pro-apoptotic and anti-apoptotic proteins in cells supernatants. Wine lees extracts were submitted to a GC-MS/MS to investigate the presence of further compounds such as 5-hydroxymetylfurfural. An enzymatic determination of sulphites and organic acids was done to excludes the impact of these substances on wine lees’ antioxidant capacity. Results from this in vitro trial demonstrates that wine lees extracts contain a different total phenols content depends on the type of extraction solvent: white wine lees contains more flavonoids while Rosè lees contains more antocians and ABTS+ ability was higher in Red lees in water extraction. Tests on PBMCs confirm the hypothesis that wine lees are able to affect sheep immune system, reporting a reduction of their proliferation with all wine lees extracts. Even though no significative variation of pro-inflammatory cytokines were found, anti-inflammatory IFN-γ and IL-10 result augmented when Nero di Troia red wine lees in water (ReW) were added to PBMC, demonstrating an immunostimulatory effect of this wine lees extract which can be associated to the high scavenging activity of this extract. From GC-MS/MS analysis in Nero di Troia red wine lees extracted in water results the precense of 5-hydroxymethylfurfural (5-HMF) to whose is connected the high ABTS+ capacity. Moreover, 5-HMF affected the apoptotic pathway through the BCl2 protein family resulting in an increment of the level of pro-apoptotic Bax proteins. In the second trial, MAE’ wine lees extracts in water at 200°C from previous trial were further extracted in separating funnel then purified by flash liquid chromatography (FLC) and submitted to a GC-MS/MS analysis. Results from gas chromatography report the presence of a family of diketopiperazines in these wine lees fractions with a different isomers distribution in different fractions. Based on these results fractions were merged and then two fractions (F1 and F2) of each wine lees where chosen and tested on in vitro PBMCs at two concentration 0.4 mg/mL and 0.8 mg/mL. This trial consist of two experiments conducted at two different temperatures simulating condition of thermal stress (43°C) for 24 h and condition of normothermia (37°C) for 48 hours; proliferation assay and cytokines determination were done for both experiment and, in addition, a mitochondrial health assay was conducted on cells cultivated in heat stress condition with EVOS FL Cell Imaging System (Thermo Fisher) using the HCS Mitochondrial Health Kit (Invitrogen). Recent studies revealed that diketopiperazines have antioxidant, antiviral, antimicrobial and immunstimulants properties. Results from this second trial report a marked decrement of lymphomonocytes proliferation and cells viability in condition of normothermia even more accentuated in thermal stress conditions. As concern the cytokines pattern, in condition of normothermia a decrement of IL-6 was observed in supernatants of cells harvested with WhF1, RoF1 0.8, ReF1 0.8 and ReF2 while an increment of IL-10 was observed in presence of White wine lees F2. Differently, in condition of thermal stress at 43°C, IL-6 undergone a reduction when cells were stimulated with F2 of each wine lees and with ReF1 0.8 while at 39°C a decrement was registered with RoF1 0.8. IFN-γ level increase in presence of ReF2 0.8 when administered in condition of thermal stress demonstrating the capacity of this wine lees fraction to increase anti-inflammatory cytokines at the expense of pro-antiflammatory cytokines. Third trial focused on grape pomace which consist mainly in grape skin and seeds. Nero di Troia grape pomace were collected and submitted to MAE extraction with water, ethanol and water/ethanol 1:1 and catalyser/no catalyser at 50°C, 100°C, 150°C and 200°C and then total phenols, antocians and flavonoids content and antioxidant capacity were assessed. Grape pomace extracts were tested on in vitro PBMC of sheep during transition period. Blood where collected 15 days (t1), 7 days (t2) before lambing, at lambing (t3) and 7 days (t4) after lambing. Results demonstrate a different impact on PBMC proliferation depending on the types of extracts; PBMCs proliferation increase respect to CS at t3 and t4 except in presence of 200°C extracts in water at both concentrations and in ethanol at 0.8 mg/mL that undergone to a decrement. This result could be associated with an immunosuppressive role of these extracts. The level of IL-6 resulted higher at all time of experiment when cells were stimulated with grape pomace extracted in water/ethanol or in ethanol at 150 and 200°C respectively. At day of lambing and seven days after, it was registered an increment of the level of IL-10. This cytokine and the IL-6 resulted both higher in some extracts and this effect can be linked to the activation of the innate immune response. Lastly, in this trial the level of the anti-inflammatory IFN-ɣ was higher in cells harvested with ethanol and catalyser and ethanol extracts seven days after lambing. From the above consideration is possible to assert that the reuse of winery by-products is possible to obtain bioactive compounds useful in animal nutrition thanks to their immunomodulants capacity. To sum up, wine lees extracts can be used as immunostimolants and antioxidants and their purified fractions, as obtained in the second trial, are useful as chemotherapeutic and anti-inflammatory compounds. Lastely, grape pomace can be used as anti-inflammatory and immunomodulants even in condition of stress linked to the transition period. Further studies can be directed to in vivo experiment in order to better understand the immune impact of these extracts and fractions with the last aim of sustaining animal immune response and meanwhile reducing the environmental impact of oenological by-products.

El gènere Aeromonas inclou més de 32 espècies, algunes de les quals estan distribuïdes en el medi ambient i es consideren autòctones dels sistemes aquàtics. L'objectiu principal d'aquesta tesi va ser contribuir al millor coneixement de l'epidemiologia i la patogenicitat d'aquest gènere. En aquest treball s'ha investigat la presència d'Aeromonas en diferents mostres d'aigua demostrant que el mètode de floculació de llet desnatada utilitzat per a la detecció de virus sembla ser un bon mètode per a la detecció d'aquestes. A més, l'anàlisi d' A salmonicida, una espècie associada clàssicament amb malalties en peixos utilitzant un model de ratolí, va confirmar que aquesta espècie pot infectar mamífers amb diferents nivells de patogenicitat. Tenint en compte l'augment de les infeccions per Aeromonas en els últims anys, diferents col·laboracions amb hospitals universitaris s'han dut a terme. També es va demostrar que l'ús de MALDI-TOF per a la identificació d'Aeromonas aïllades de peixos era poc precisa a causa de les mancances a la base de dades. L'ús de genomes, la seva comparació i el desenvolupament de noves eines bioinformàtiques, va demostrar ser útil per entendre la potencial funció de les espècies en l'ambient. En aquesta tesi doctoral es va realitzat la caracterització de la metalochaperona HypA prèviament descrita en altres patògens, demostrant el paper en la tolerància a l'àcid de l'estómac i en la defensa d'Aeromonas contra macròfags. A més, s'ha demostrat el role de la toxina ExoA i el sistema de secreció tipus VI (SST6) en les infeccions mixtes que progressen en una fascitis necrotitzant, mitjançant l'estudi de soques aïllades d'un pacient d'Estats Units. Finalment,, un estudi de la defensa de monòcits humans contra Aeromonas es va dur a terme. Els resultats van demostrar una resposta immune espècie-específica, a més les espècies més prevalents en clínica presentaren una resposta més forta.
El género Aeromonas incluye más de 32 especies, algunas de las cuales están distribuidas en el medio ambiente y se consideran autóctonas de los sistemas acuáticos. El objetivo principal de esta tesis fue contribuir al mejor conocimiento de la epidemiología y la patogenicidad de este género. En este trabajo se ha investigado la presencia de Aeromonas en diferentes fuentes de agua demostrando que el método de floculación de leche desnatada utilizado para detección de virus parece ser un buen método para la detección de estas. Además, el análisis de A. salmonicida, una especie asociada clásicamente con enfermedades en peces utilizando un modelo de ratón, confirmó que esta especie puede infectar mamíferos con diferentes niveles de patogenicidad. Teniendo en cuenta el aumento de las infecciones por Aeromonas en los últimos años, se han llevado a cabo colaboraciones con hospitales. También se demostró que el uso de MALDI-TOF para la identificación de Aeromonas aisladas de peces era poco precisa debido a las carencias en la base de datos. El uso de genomas, su comparación y el desarrollo de nuevas herramientas bioinformáticas, demostró ser útil para entender la función de las especies. En esta tesis doctoral se llevó a cabo la caracterización de la metalochaperona HypA previamente descrita en otros patógenos, demostrando el rol en la tolerancia al ácido del estómago y en la defensa de Aeromonas contra macrófagos. Además, se ha demostrado el rol de la toxina ExoA y el sistema de secreción tipo VI (SST6) en las infecciones mixtas que progresan en una fascitis necrotizante, mediante el estudio de cepas aisladas de un paciente de Estados Unidos. Finalmente, un estudio de la defensa de monocitos humanos contra Aeromonas se llevó a cabo. Los resultados demostraron una respuesta immune especie-específica, siendo más fuerte en las especies más prevalentes en clínica.
The genus Aeromonas includes more than 32 species, some of which are distributed in the environment and are considered to be indigenous to aquatic systems. The main objective of this thesis was to contribute to a better knowledge of the epidemiology and pathogenicity of this genus. In this work we have investigated the presence of Aeromonas in different water sources demonstrating the method of skimmed milk flocculation used for virus detection, it seems to be a good method for the detection of these bacteria. In addition, the analysis of A. salmonicida, a species classically associated with fish diseases using an in vivo model, confirmed that this species can infect mammals with different levels of pathogenicity. Considering the increase of infections by Aeromonas in recent years, different collaborations with university hospitals have been carried out to investigated different cases . It was also shown that the use of MALDI-TOF for the identification of Aeromonas spp isolated from clinical cases and fish was not precise due to the deficiencies in the database. The use of genomes, their comparison and the development of new bioinformatic tools, proved to be useful to understand the potential function of A. lusitana and A. salmonicida in the environment. In this doctoral thesis the metallochaperone HypA previously described with role in tolerance to stomach acid in other pathogens was characterized and in the defense of Aeromonas against macrophages. In addition, the role of the ExoA toxin and the type VI secretion system (T6SS) in mixed infections that progress in a necrotizing fasciitis have been demonstrated, using several mutant strains. Finally, a study of the defense of human monocytes against Aeromonas was performed. The results showed a species-specific immune response, that was higher in the most prevalent clinical species.

The gut microbiota establishes dynamic and complex interactions with the intestinal epithelium and the immune system. In this regard, commensal microbiota plays essential role in the development and maturation of the host immune system, which must learn to discriminate between commensal and pathogenic bacteria. Appropriate development of the immune system is crucial to maintain intestinal homeostasis. Microbiota-host communication does not involve direct intercellular contacts since the intestinal epithelium is protected by a mucus layer that segregates luminal microbes from host cells. Therefore, the gut microbiota mainly communicates with the host through the secretion of bacterial factors which can diffuse through the mucus layer and reach epithelial and immune cells of the intestinal mucosa. In addition to metabolites and soluble proteins, microbiota releases bacterial extracellular vesicles (BEVs) as a mechanism of intercellular communication. BEVs are membranous structures that act as a crucial mechanism for intra- and inter-kingdom communication, allowing long distance delivery of bacterial effectors. In particular, our group has reported numerous beneficial properties associated to microbiota-derived BEVs. Our model of study is Escherichia coli, a natural gut colonizer species, and particularly the probiotic E. coli Nissle 1917 (EcN) and commensal E. coli strains. However, deep knowledge of the immune regulatory mechanisms involved in the mediated effects has been poorly understood. Therefore, the main objective of this thesis was to study the molecular mechanisms used by the gut microbiota to modulate innate and adaptative immune responses and safeguard intestinal homeostasis. In our first study, we evaluated the ability of BEVs released by the probiotic EcN and commensal E. coli strains to modulate dendritic cell (DC) function and the subsequent Th cell effector responses (Chapter 1). The experimental approach consisted in an in vitro model of human monocyte-derived DCs (mo-DCs) co-cultivated with total human CD4+ T cells isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy donors. The effects were evaluated by cytokine quantification and flow cytometry analysis of specific markers. Results showed that BEVs represent a mechanism used by gut resident microbiota to prime the innate immune system, activating DCs in a strain-specific manner. BEVs from commensal and probiotic E. coli strains elicit similar Th17/Th17/Th22 responses and mainly differ in their ability to induce Th1 and Treg responses. BEVs from the probiotic EcN exert complex immunomodulatory Th/Treg responses, consistent with the beneficial effects of this probiotic. In this context, EcN BEVs promote a strong Th1 response, a mechanism that may account for the protective effects of this probiotic against enteric virus. In contrast, the commensal ECOR12 (group A) secretes BEVs that mainly contribute to maintaining host tolerance against gut microbes by increasing Treg/Th17 balance and promoting Th22 response. However, vesicles from this commensal do not trigger proper Th1 responses. These results provide evidence on the specific immunomodulatory properties of BEVs from probiotic and commensal strains, and their collaborative role in the maintenance of intestinal homeostasis. Since gut-derived BEVs activate DCs in a strain-specific manner, we next wanted to investigate the regulatory mechanisms involved in these effects. To this end, we performed a miRNA deep sequencing approach trying to identify miRNAs differentially expressed in mo-DCs in response to BEVs from the probiotic EcN and the commensal ECOR12 strain (Chapter 2). Results indicated that the immunomodulatory properties of BEVs released by the probiotic EcN and the commensal ECOR12 in DCs are in part mediated through the regulation of miRNAs. The analysis revealed a common set of miRNAs modulated by BEVs from both strains. These miRNAs modulate basic biological processes, including metabolism, cell growth, and development. Importantly, some miRNAs such as miR-155, miR-let7i and miR-146a are related to DC activation and maturation, being involved in DC antigen-presenting functions, TLR signaling pathways, and release of inflammatory mediators. In addition, we identified a number of miRNAs that showed differential expression depending on the bacterial strain. Some of them were related with immune function and their differential expression was in accordance with the cytokine profile and derived specific Th responses described in the previous chapter. In this context, BEVs from the probiotic EcN trigger upregulation of miR-29a, and consequently reduce the expression of its target IDO2. This regulatory mechanism is compatible with the weaker tolerogenic responses induced by EcN BEVs in comparison to ECOR12 BEVs. In contrast, ECOR12- derived BEVs trigger upregulation of miR-146b, miR-125a, and miR-125b-99b-let7e cluster. The differential upregulation of these miRNAs that attenuate the inflammatory response by targeting IL-12, IFN-γ, and TNF-α and proteins of TLR signaling pathways may contribute to the anti-inflammatory/tolerogenic action of ECOR12 BEVs. Taken together, these results indicate that differential regulation of miRNAs by BEVs is one of the mechanisms used by the gut microbiota to train the immune system and help to preserve intestinal homeostasis. In addition to physical cell-to-cell contacts, DCs communicate with neighbouring T cells through secreted mediators that include cytokines and extracellular vesicles (EVs) such as exosomes. To get new insights into the mechanisms that mediate activation of T cell responses by BEV-stimulated DCs, in the third section we focused on DC-secreted factors. In particular, we evaluated the ability of DCs activated by EcN and ECOR12 BEVs to release cytokines and exosomes that distinctly influence derived CD4+ T cell responses (Chapter 3). We set up two cellular models to mimic the communication between DCs and T cells (i) Direct model, in which activated mo-DCs and naïve CD4+ T cells are co-cultured together in the same plate, and therefore can stablish physical interaction (ii) Indirect model using Transwell permeable supports, in which DC and T cells only communicate through released factors. Quantification of secreted cytokines revealed indirect communication between activated DCs and naïve CD4+ T cells despite the absence of direct cellular contacts. Similar T effector responses were observed in both models, although levels of secreted cytokines were lower in the indirect co-culture model. The main differences between bacterial strains also affected the Th1 and Treg responses. Moreover, characterization of DC-derived exosomes by Cryo-transmission electron microscopy (TEM) and nanoparticle tracking analysis (NTA) revealed no significant differences in the amount, size, or structure between EVs produced by immature DCs or BEV-stimulated DCs. Next, we analysed whether microbiota vesicles could influence the functional properties and cargo of DC-derived exosomes. The results revealed that activation of mo-DCs by microbiota BEVs leads to significant changes in the exosomal content of costimulatory molecules and miRNAs compared to non-treated immature DCs. In this context, exosomes derived from BEV- activated DCs contain the typical exosome markers and are enriched in costimulatory molecules CD86, CD44, CD40, and MHC-II that are involved in antigen presentation, T cell activation or proliferation. Concerning their miRNA cargo, quantification of immune-related miRNAs in exosomes derived from BEV-stimulated DCs evidenced distinct miRNA profile depending whether DCs were stimulated with EcN or ECOR12 BEVs. These differences showed good correlation with their differential expression in DCs (Chapter 2) and are in accordance with the elicited Th responses elicited. Particularly, miRNAs that drive tolerogenic and anti-inflammatory profiles (miR-146b, miR-125a, miR-125b and miR-24) are increased in exosomes derived from DCs stimulated with ECOR12. In conclusion, data presented in this thesis show that BEVs released by microbiota E. coli strains modulate host immune responses to preserve the intestinal balance. BEVs deliver bacterial effectors that drive DCs to coordinate appropriate T cell responses through several mechanisms that include regulation of miRNA expression and differential release of immune mediators through exosomes.

La psoriasis es una enfermedad inflamatoria crónica inmunomediada principalmente cutánea caracterizada por la presencia de placas eritematodescamativas en zonas de extensión y cuero cabelludo. En su fisiopatogenia se implican múltiples componentes tanto al sistema inmunitario innato como adaptativo. En esta Tesis Doctoral, se presentan 4 trabajos originales en los que se analiza el impacto de distintos polimorfismos genéticos de receptores del sistema inmunitario innato (receptores toll-like y de la Fc-gamma) y de sistema inmunitario adaptativo (CD5 y CD6) como factores modificadores del fenotipo, de susceptibilidad a la enfermedad y de respuesta al tratamiento de la psoriasis. Además, se aportan las primeras evidencias experimentales in vivo e in vitro de la implicación del receptor linfocítico CD6 en la fisiopatogenia de la enfermedad.
Psoriasis is a chronic immuno-mediated inflammatory cutaneous disease characterized by the presence of erythematous and desquamative plaques tipically appearing in extension areas and the scalp. In its pathophysiology, multiple components of both the innate and adaptive immune system have been implicated. In this Doctoral Thesis, 4 original studies are presented analyzing different genetic polymorphisms of receptors belonging to both the innate (toll-like and Fc-gamma receptors) and adaptive immune system (CD5 and CD6) as potential factors that modify the phenotype, the susceptibility and the response to treatment in psoriasis. In addition, the first in vivo and in vitro experimental evidences of the involvement of CD6 lymphocyte receptor in psoriasis are provided.

Introducció: La Fibromiàlgia (FM) és una síndrome que cursa amb dolor musculoesquelètic generalitzat i crònic, hiperalgèsia i al·lodínia, rigidesa muscular, fatiga, trastorns del son i presenta un alt percentatge de patologies concomitants, un 84% dels casos a Espanya. L’impacte de la FM en la vida diària acostuma a ser sever i afecta a molts nivells del dia a dia. Un dels principals problemes de la recerca i la pràctica clínica relacionades amb la FM és la falta de marcadors diagnòstics; en aquesta tesi doctoral es buscarà definir el perfil immunitari de les persones amb FM, i se n’estudiarà el paper en la fisiopatologia i el manteniment dels símptomes de la FM. D’altra banda, malauradament a dia d’avui no hi ha cap tractament curatiu per a la FM. Les guies de tractament de la FM coincideixen a recomanar intervencions multidisciplinàries i multicomponent dirigides a abordar la simptomatologia concreta de cada pacient. Dins de les intervencions psicològiques, les intervencions basades en Mindfulness (MBIs) estan resultant en una millora de la qualitat de vida i una reducció del deteriorament funcional associat a la malaltia. Concretament, la Reducció d’Estrès Basada en Mindfulness (MBSR), afegida al tractament habitual, està tenint resultats molt bons en la millora de la severitat de la FM i dels símptomes associats. Objectius: Aquesta tesi es planteja en dos blocs, el primer se centra en caracteritzar el perfil immunològic de la FM mitjançant dos estudis. El primer és un estudi de casos i controls on es comparen els perfils immunològics de les pacients amb FM vs. un grup de dones sanes, tenint en compte possibles variables de confusió en els nivells de marcadors inflamatoris en sang; i el segon una metaanàlisi, on es busca contrastar els resultats obtinguts en el primer estudi tenint en compte el conjunt de les dades publicades fins al moment. En el segon bloc de la tesi, el focus es posarà en conèixer quin efecte pot tenir una intervenció basada en mindfulness en la qualitat de vida i els marcadors immunitaris de les pacients amb FM. Conclusions: Les persones amb FM presenten un perfil immunològic característic respecte de les persones que no pateixen la síndrome, diferència que es manté quan es tenen en compte les variables de confusió. Aquest perfil immunitari es caracteritza per una anòmala regulació a l’alça dels fenotips IRS i CIRS. Hem vist que valors més baixos d’IL-10 estan significativament relacionats amb el diagnòstic de FM, alhora que nivells baixos dels marcadors immunes IL-6, IL-10 i CXCL-8 ajuden a la predicció del nivell de dolor crònic d’aquestes pacients. El programa d’MBSR, ha estat eficaç per reduir la simptomatologia clínica, la severitat, l’afectació funcional, la simptomatologia depressiva i l’estrès percebut en pacients amb FM. Més enllà de les mesures d’autoinforme, l’MBSR ha mantingut estables els nivell d’IL-10, indicant una potencial capacitat de regulació de les alteracions immunitàries de la FM. Addicionalment, hem observat una relació entre nivells basals més elevats de CXCL-8 i una resposta de menor eficàcia al tractament MBSR, en especial en la millora del dolor. Alhora, hem trobat una associació similar entre nivells basals més elevats dels índex IL-6/IL-10 i CXCL-8/IL-10, i una menor millora de la inflexibilitat psicològica després de la intervenció d’MBSR. Els resultats d’aquesta tesi aporten nova informació respecte del perfil immunitari de les persones que pateixen de FM, i el potencial que té l’MBSR com a intervenció coadjuvant.
Introducción: La Fibromialgia (FM) es un síndrome que cursa con dolor musculoesquelético generalizado y crónico, hiperalgesia y alodinia, rigidez muscular, fatiga, trastornos del sueño y presenta un alto porcentaje de patologías concomitantes, en un 84% de los casos en España. El impacto de la FM en el día a día suele ser severo y afecta a muchos niveles. Uno de los principales problemas de la investigación y la práctica clínica relacionadas con la FM es la ausencia de marcadores diagnósticos. En esta tesis doctoral se buscará definir el perfil inmunitario de las personas con FM, y se estudiará el papel en la fisiopatología y el mantenimiento de los síntomas de la FM. Por otro lado, a día de hoy no existe ningún tratamiento curativo para la FM. Las guías de tratamiento de la FM coinciden en recomendar intervenciones multidisciplinarias y multicomponente dirigidas a abordar la sintomatología concreta de cada paciente. Dentro de las intervenciones psicológicas, las intervenciones basadas en Mindfulness (MBIs) están resultando en una mejora de la calidad de vida y una reducción del deterioro funcional asociado a la enfermedad. Concretamente, la Reducción de Estrés Basada en Mindfulness (MBSR), añadida al tratamiento habitual, está teniendo buenos resultados en la mejora de la severidad de la FM y los síntomas asociados. Objetivos: Esta tesis se plantea en dos bloques, el primero se centra en caracterizar el perfil inmunológico de la FM mediante dos estudios. El primero es un estudio de casos y controles donde se comparan los perfiles inmunológicos de las pacientes con FM vs. un grupo de mujeres sanas, teniendo en cuenta posibles variables de confusión en los niveles de marcadores inflamatorios en sangre; y el segundo un metaanálisis, donde se busca contrastar los resultados obtenidos en el primer estudio teniendo en cuenta el conjunto de los datos publicados hasta el momento. En el segundo bloque de la tesis, el foco se pondrá en conocer qué efecto puede tener una intervención basada en mindfulness en la calidad de vida y los marcadores inmunitarios de las pacientes con FM. Conclusiones: Las personas con FM presentan un perfil inmunológico característico respecto de las personas que no padecen el síndrome, diferencia que se mantiene cuando se tienen en cuenta las variables de confusión. Este perfil inmunitario se caracteriza por una anómala regulación al alza de los fenotipos IRS y CIRS. Hemos visto que valores más bajos de IL-10 están significativamente relacionados con el diagnóstico de FM, al tiempo que niveles bajos de los marcadores inmunes IL-6, IL-10 y CXCL-8 ayudan a la predicción del nivel de dolor crónico de estas pacientes. El programa de MBSR ha sido eficaz para reducir la sintomatología clínica, la severidad, la afectación funcional, la sintomatología depresiva y el estrés percibido en pacientes con FM. Más allá de las medidas de autoinforme, el MBSR ha mantenido estables los niveles de IL-10, indicando una potencial capacidad de regulación de las alteraciones inmunitarias de la FM. Adicionalmente, hemos observado una relación entre niveles basales más elevados de CXCL-8 y una respuesta de menor eficacia en el tratamiento MBSR, en especial en la mejora del dolor. Asimismo, hemos encontrado una asociación similar entre niveles basales más elevados de los índices IL-6 / IL-10 y CXCL-8 / IL-10, y una menor mejora de la inflexibilidad psicológica tras la intervención de MBSR. Los resultados de esta tesis aportan nueva información respecto del perfil inmunitario de las personas que sufren de FM, y el potencial que tiene el MBSR como intervención coadyuvante.
Introduction: Fibromyalgia (FM) is a chronic pain syndrome characterized by musculoskeletal pain, coupled with fatigue, stiffness, disordered sleep, perceived cognitive dysfunction, and mood disturbances. FM affects around 1.78% of worldwide population, and around 2.4% of Spanish population. Additionally, a high percentage of FM patients (84% in Spain) presents comorbid pathologies. FM impact on everyday life of patients who suffer it is usually severe and affects at multiple levels. One of the main problems in research and clinical practice related to FM is the lack of biomarkers for diagnose. The main aims of this thesis is to define the immune profile of people with FM, and to study the its role on the physiopathology and maintenance of FM symptomatology. Additionally, there are no curative treatments for FM. However, evidence-based guidelines on the treatment of FM agree on the recommendations of multidisciplinary and multicomponent interventions directed towards the specific symptomatology of each individual patient. Within psychological interventions, Mindfulness Based Interventions (MBIs), and specifically Mindfulness Based Stress Reduction (MBSR) are arising as promising interventions to accomplish a better quality of life, and a lesser impairment in functionality associated to FM. Objectives: This thesis is presented in two sections, the first is focused on determining the immunological differences between FM and CS through two studies. The first is a case-control study compares the immunological profiles of patients with FM vs a group of healthy women, controlling by cofounding variables; the second one is a meta-analysis, which seeks to contrast the results obtained in the first study considering the published data so far. In the second block of the thesis, the focus is on the mindfulness effects in clinical severity and the immune system of patients with FM. Conclusions FM patients present a characteristic immune-inflammatory profile, different from persons without the syndrome. These differences are maintained even after controlling by cofounding variables. This immune profile presents an anomalous upregulation of the IRS/CIRS phenotypes. Lower levels of IL-10 seem to be significantly related with the FM diagnose, while lower levels of IL-6, IL-10 and CXCL-8 contribute to the prediction of the chronic pain levels of these patients. MBSR is an effective intervention to reduce clinical symptomatology, severity, functional impairment, depressive symptomatology and perceived stress in patients with FM. Additionally, MBSR intervention had a significant effect on IL-10, since its levels decreased in the treatment as usual group, but not after MBSR, suggesting a potential effect of the intervention on the immune regulation in patients with FM. MBSR efficacy on reducing perceived pain was buffered when FM patients presented higher basal levels of CXCL-8. At the same time, there was a similar association between higher levels of IL-6/IL-10 and CXCL-8/IL-10 and less improvement in psychological inflexibility after MBSR. The results of this thesis provide new information regarding the immune profile of people suffering from FM, and the potential of MBSR as an adjuvant intervention.

Els nounats neixen amb un sistema immunitari immadur, que es desenvolupa durant les primeres etapes de la vida. Aquesta immaduresa és més acusada en nadons prematurs. La llet materna conté nombrosos factors bioactius, com ara les adipocines (leptina i adiponectina). Encara que aquestes adipocines intervenen en el control dels sistemes endocrí i metabòlic, en les últimes dècades s'ha descrit que també tenen propietats immunomoduladores en adults. Tot i així, no existeixen estudis relatius a l’efecte d’aquestes adipocines sobre la resposta immunitària en les primeres etapes de vida. En base a aquestes premisses, l’objectiu de la present tesi ha estat establir la influència de la suplementació amb leptina o adiponectina en la maduració del sistema immunitari sistèmic i intestinal en rates lactants nascudes a terme i a preterme. Per assolir la primera part del objectiu, es van suplementar diàriament amb leptina o adiponectina rates Wistar nascudes a terme durant el període de lactància. Pel que fa al sistema immunitari sistèmic, la suplementació amb adipocines va ser capaç de modificar el patró d’immunoglobulines plasmàtiques, incrementant els isotips IgM i els d’IgG relacionats amb la resposta Th2. A més, la composició limfòcitaria de la melsa i la secreció de citocines van ser influïdes també per la suplementació amb adipocines, sense afectar la seva capacitat proliferativa. En el cas del sistema immunitari intestinal, la suplementació amb adipocines va produir canvis en la producció de citocines i també en la composició dels limfòcits dels compartiments inductor i efector del teixit limfoide associat a l'intestí. A més, l’adiponectina va ser capaç de potenciar la proliferació de limfòcits de ganglis limfàtics mesentèrics. La suplementació amb adipocines també va canviar l'expressió de diversos gens implicats en la resposta immunitària innata i la maduració intestinal i va modificar la composició de la microbiota intestinal reduint l'abundància del fílum Proteobacteria. D’altra banda s’ha avaluat la influència de la leptina, en condicions de prematuritat. Per tal d’assolir l’objectiu, es va establir un model de rata prematura, degut a que actualment no s’ha descrit cap model de rosegadors en condicions de prematuritat, on s’estudiï la maduració del sistema immunitari. Les rates prematures, nascudes per cesària, van mostrar canvis en diversos biomarcadors de la immunitat innata i adaptativa. En base a aquest model, es va suplementar rates Wistar prematures amb leptina durant els primers 17 dies de vida. Els resultats van mostrar que la suplementació diària amb leptina va ser capaç de contrarestar parcialment algunes de les alteracions produïdes per la prematuritat, com ara els canvis en l'activitat fagocítica dels monòcits, les concentracions plasmàtiques d’Ig, la permeabilitat intestinal, la grandària de la cèl·lula Goblet i l’expressió de certs gens intestinals. Globalment, els resultats obtinguts en aquesta tesi han demostrat que la suplementació amb leptina i adiponectina durant la lactància promou la maduració del sistema immunitari sistèmic i intestinal en rates nascudes a terme, modulant la resposta immunitària en les primeres etapes de vida. En el cas de la leptina, aquest efecte també s’ha observat en condicions de prematuritat.
Neonates are born with an immature immune system, which develops during the first stages of life. This early immaturity is more acute in preterm newborns. Breast milk contains numerous bioactive factors, such as adipokines (leptin and adiponectin). It has been described that they also have immunomodulatory properties. However, little is known about their effects in the development of the immune system in early life. On this basis, the aim of the present thesis was to establish the influence of a supplementation with leptin and adiponectin on the maturation of the systemic and intestinal immune system in term and preterm suckling rats. To achieve this goal, neonate Wistar rats born at term were daily supplemented with leptin or adiponectin throughout the suckling period. Regarding the systemic immune system, adipokine supplementation was able to modify the plasma immunoglobulin (Ig) pattern. Moreover, spleen lymphocyte composition and cytokine secretion were influenced by adipokine supplementations, without affecting their proliferative ability. In the case of the intestinal immune system, adipokine supplementations produced changes in cytokine production and also in the lymphocyte composition of both the inductor and effector compartments of the gut-associated lymphoid tissue. Furthermore, adiponectin was able to enhance the proliferation of lymphocytes from mesenteric lymph nodes. Adipokine supplementation also changed the expression of genes involved in the innate immune response and intestinal maturation and modified the microbiota composition. To accomplish the second part of the goal – evaluate the influence of one of the adipokines in premature conditions− a preterm rat model was established. Preterm rats, born by a Caesarean, showed affectation in several biomarkers of innate and adaptive immunity. Using this model, premature rats were supplemented with leptin during the first 17 days of life. Results showed that leptin supplementation was able to counteract some of the alterations produced by prematurity, such as the changes in phagocytic activity of monocytes, plasma Ig concentrations, intestinal permeability, goblet cell size and the expression of particular intestinal genes. Overall, leptin and adiponectin supplementation during suckling promote the systemic and the intestinal immune system maturation in rats born at term. In the case of leptin, this effect was also demonstrated in preterm conditions.

En els últims anys ha crescut considerablement l’interès per descobrir aliments naturals funcionals amb propietats beneficioses per a l’hoste. En aquest sentit, el cacau ha passat a ser un dels principals subjectes d’estudi pel seu contingut en flavonoides. Són molts els estudis que associen la ingesta de cacau amb efectes beneficiosos sobre la salut. A més, se li han atribuït propietats immunomoduladores en rata. En base a aquests efectes descrits, l’objectiu d’aquesta Tesi Doctoral va ser establir l’efecte de dietes enriquides amb cacau, flavonoides del cacau i fibra de cacau sobre la microbiota intestinal així com sobre la funció immunitària intestinals. Per tal d’assolir aquests objectius, s’han portat a terme estudis preclínics en rata amb una dieta enriquida amb cacau convencional al 10%, dietes elaborades a partir de dos extractes de cacau no fermentats i una dieta amb fibra de cacau. Pel que fa als resultats de microbiota, es va observar diferent patró de composició després de la intervenció nutricional amb les dietes enriquides amb flavonoides del cacau però únicament la dieta de fibra de cacau va mostrar un efecte prebiòtic al promoure el creixement dels gèneres Bifidobacterium i Lactobacillus. A més, la dieta de fibra de cacau va comportar els canvis més pronunciats en la producció d’AGCC en femtes i contingut cecal. Particularment, va augmentar la concentració a nivell fecal i cecal dels àcids acètic, propiònic i butíric. A més, les dietes de cacau i fibra de cacau van modular de forma diferencial l’expressió gènica de TLR en còlon. Quant a les immunoglobulines en el compartiment mucosal, totes les dietes enriquides amb polifenols del cacau van modular la secreció d’IgA intestinal, tot i que de forma no proporcional al seu contingut en flavonoides. La fibra de cacau, depenent del compartiment intestinal estudiat, va exercir un efecte o un altre. Pel que fa al compartiment extraintestinal, tot i que la dieta de fibra de cacau va mostrar el mateix efecte atenuador de la síntesi d’IgA i d’IgM que la dieta de cacau, el mecanisme d’acció va ser diferent. A més, totes les dietes enriquides amb flavonoides del cacau, van disminuir la seva proporció de bacteris fecals units a IgA independentment del seu contingut en flavonoides, mentre que aquest percentatge va incrementar amb la dieta de fibra de cacau. Únicament la dieta al 10% de cacau provoca un alentiment en la corba ponderal. Aquest efecte es correlaciona amb els canvis produïts en la microbiota i es pot associar amb la modificació de l’expressió en còlon dels gens implicats en el metabolisme lipídic. Pel que fa al perfil metabòlic en orina, les dietes de cacau i fibra de cacau van provocar patrons diferencials, els quals poden ser usats com a marcadors d’ingesta. El perfil metabòlic es correlacionen amb els efectes del cacau sobre el pes corporal, amb les hormones metabòliques, amb la immunitat intestinal i amb la composició de la microbiota. A més, aquestes variables també mostren correlació entre si. Els efectes del cacau són el resultat de la suma del efectes del components bioactius present en el cacau: polifenols i fibra de cacau, els quals exerceixen efectes sinèrgics o bé contraris depenent de la variable estudiada. Altres components del cacau també estan involucrats en aquests efectes.
In the last few years, cocoa has become one of the main subjects of study due to its high content in flavonoids. Several studies have associated the cocoa intake with health benefits. Moreover, immunomodulatory properties in rats have been also attributed to cocoa. On this basis, the aim of the present thesis was to establish the impact of diets enriched with cocoa, cocoa flavonoids or cocoa fiber on the fecal microbiota composition and its activity as well as on the immune function in the gut. To achieve this objective, preclinical studies were carried out in rats fed a 10% conventional cocoa-enriched diet, diets elaborated with different amounts of non- fermented cocoa extracts and cocoa fiber diet. Regarding microbiota results, differential composition pattern was observed after all the experimental diets intake but only the cocoa fiber diet increased the Bifidobacterium spp. and Lactobacillus spp. proportion. In addition, the cocoa fiber diet was the one which caused the most pronounced changes in the short chain fatty acids (SCFA) production. Particularly, it increased the cecal and fecal concentration of acetic, propionic and butyric acids. Moreover, both the 10%-cocoa diet and cocoa fiber diets differentially modulated the TLR gene expression in the colon. Concerning the mucosal immunoglobulin production, all cocoa polyphenol-enriched diets modulated the intestinal IgA secretion although this effect was not proportional to their flavonoid content. The cocoa fiber diet also exerted an effect on intestinal IgA secretion but in a different way depending on the compartment. Focusing on the extraintestinal compartment, although the cocoa fiber diet showed the same down- modulatory effect on IgA and IgM secretion as the cocoa diet, its mechanisms were different. In addition, all cocoa flavonoid-enriched diets decreased IgA-coated bacteria proportion in a non-dose dependent manner whereas this percentage increased by the cocoa fiber intake The 10% cocoa diet was the only one that caused a slower body weight gain. This effect is correlated with the microbiota modulation. The change induced by cocoa diet on the expression of genes involved in the lipid metabolism in the colon could be also involved. Regarding the urinary metabolites, the cocoa and the coca fiber diets caused differential metabolic profile that can be used as consumption marker. The metabolic fingerprint correlated well with the body weight, the metabolic hormones, the intestinal immunity and the microbiota composition. Moreover, all these variables showed also an association between them. Therefore, the effects produced by cocoa intake are due to the differential effects caused by each one of its main bioactive compounds - polyphenols and fiber - which act in a synergistic or opposite manner depending on the variable. Other cocoa compounds are also involved in such effects.

La funció del sistema immunitari és eliminar qualsevol agent infecciós o cèl·lula danyada, propocionant una protecció a llarg termini contra aquests. A més a més, disposa de diferents mecanismes de selecció i tolerància per tal de controlar als limfòcits autoreactius. Defectes en la regulació d’aquests mecanismes poden donar lloc a l’aparició de malalties autoimmunitàries com la Diabetis Tipus 1 (T1D), la qual es caracteritza per la destrucció selectiva de les cèl·lules β pancreàtiques. Malgrat aquestes són la principal diana de l’atac autoimmunitari, no són la única. Alteracions en les neurones sensorials aferents que innerven el pàncrees i que tenen els seus cossos cel·lulars als ganglis dorsals raquidis (DRG), s’han relacionat amb el desenvolupament de la T1D. En el present treball, es va realitzar un anàlisi de l’expressió de ARNm en cèl·lules dels DRG que demostra la presència d’alteracions funcionals en aquest tipus cel·lular, avalant la hipòtesi que la T1D és una malaltia multisistèmica i que, entre el conjunt de cèl·lules afectades per l’atac autoimmunitari, s’hi podrien trobar també les cèl·lules dels DRG. Aquestes presenten un conjunt d’alteracions en l’expressió de diverses proteïnes que podrien generar una resposta autoimmunitària contra autoantígens tant del Sistema Nerviós Perifèric com de les cèl·lules β. Algunes d’aquestes alteracions es van veure també en leucòcits de sang perifèrica, esdevenint possibles biomarcadors de susceptibilitat a desenvolupar T1D. Tot i així, caldria fer més estudis per tal de comprendre el paper d’aquesta neurodegeneració en el desenvolupament de la T1D així com per determinar quin o quins gens podrien ser bons biomarcadors per a detectar pacients susceptibles a desenvolupar T1D. Paral·lelament als estudis de les cèl·lules dels DRG, en el transcurs de l’estudi del paper de la periferina com a autoantigen en la T1D, es va veure que un dels pèptids derivats d’aquesta molècula (DIF-P) estimulava la producció de citocines proinflamatòries per part dels monòcits i induïa la mort de diversos tipus cel·lulars. A més a més, aquestes propietats funcionals es trobaven alterades quan es modificava el pèptid amb una cua de 3 lisines (DIF-P3K) o de 8 arginines (DIF-P8R), probablement degut a que aquestes cues d’aminoàcids els converteixen en pèptids penetrants cel·lulars (CPPs) que permeten la seva millor internalització. Donades les propietats citotòxiques i immunoestimuladores de DIFP, DIF-P3K i DIF-P8R, es va decidir fer un salt als estudis in vivo per tal d’estudiar el seu potencial com a agents immunterapèutics contra el càncer. Els diversos estudis in vivo realitzats fins al moment demostren l’activitat antitumoral dels pèptids DIF en els models de melanoma i mastocitoma, indicant el seu ús potencial en el tractament de càncer humà, ja sigui com a agents citostàtics i/o immunoterapèutics, i d'aquesta manera passar a formar part de l'arsenal terapèutic d'aquesta malaltia.
La función del sistema inmunitario es eliminar cualquier agente infeccioso o célula dañada, propocionando una protección a largo plazo contra estos. Además, dispone de diferentes mecanismos de selección y tolerancia para controlar a los linfocitos autorreactivos. Defectos en la regulación de estos mecanismos pueden dar lugar a la aparición de enfermedades autoinmunes como la Diabetes Tipo 1 (T1D), que se caracteriza por la destrucción selectiva de las células β pancreáticas. A pesar de que éstas son la principal diana del ataque autoinmunitario, no son la única. Alteraciones en las neuronas sensoriales aferentes que inervan el páncreas y que tienen sus cuerpos celulares en los ganglios dorsales raquídeos (DRG), se han relacionado con el desarrollo de la T1D. En el presente trabajo, se realizó un análisis de la expresión de ARNm en células de los DRG que demuestra la presencia de alteraciones funcionales en este tipo celular, avalando la hipótesis de que la T1D es una enfermedad multisistémica y que, entre el conjunto de células afectadas por el ataque autoinmunitario, se podrían encontrar también las células de los DRG. Estas presentan un conjunto de alteraciones en la expresión de varias proteínas que podrían generar una respuesta autoinmune contra autoantígenos tanto del Sistema Nervioso Periférico como de las células β. Algunas de estas alteraciones se observaron también en leucocitos de sangre periférica, convirtiéndose en posibles biomarcadores de susceptibilidad a desarrollar T1D. Sin embargo, habría que hacer más estudios para comprender el papel de esta neurodegeneración en el desarrollo de la T1D así como para determinar qué genes podrían ser buenos biomarcadores para detectar pacientes susceptibles a desarrollar T1D. Paralelamente a los estudios de las células de los DRG, en el transcurso del estudio del papel de la periferina como autoantígeno en la T1D, se vió que uno de los péptidos derivados de esta molécula (DIF-P) estimulaba la producción de citoquinas proinflamatorias por parte de los monocitos e inducía la muerte de distintos tipos celulares. Además, estas propiedades funcionales estaban alteradas cuando se modificaba el péptido con una cola de 3 lisinas (DIF-P3K) o de 8 argininas (DIF-P8R), probablemente debido a que estas colas de aminoácidos los convertían en péptidos penetrantes celulares (CPPs) y permitían su mejor internalización. Dadas las propiedades citotóxicas y inmunoestimuladoras de DIF-P, DIF-P3K y DIF-P8R, se decidió dar un salto a los estudios in vivo para estudiar su potencial como agentes immunterapéuticos contra el cáncer. Los diferentes estudios in vivo realizados hasta el momento demuestran la actividad antitumoral de los péptidos DIF en los modelos de melanoma y mastocitoma, indicando su uso potencial en el tratamiento de cáncer humano, ya sea como agentes citostáticos y/o inmunoterapéuticos, y de este modo pasar a formar parte del arsenal terapéutico de esta enfermedad.
The main function of the immune system is to eliminate any infectious agents or damaged cells, providing long-term protection against them. Moreover, it has different selection and tolerance mechanisms in order to control self-reactive lymphocytes. Defects in the regulation of these mechanisms can lead to the onset of autoimmune diseases such as Type 1 Diabetes (T1D), which is characterized by the selective destruction of pancreatic β cells. Although these cells are the main target of the autoimmune attack, they are not the only one. Alterations in the afferent sensory neurons innervating the pancreas and having their cell bodies in the Dorsal Root Ganglia (DRG) have been linked to T1D development. In the present study, we performed an analysis of mRNA expression in DRG that demonstrates the presence of functional alterations in this cell type, supporting the hypothesis that T1D is a multisystemic disease and that DRG cells can be found among the set of cells affected by the autoimmune attack. These cells present a set of alterations in the expression of various proteins that could generate an autoimmune response against autoantigens of both the Peripheral Nervous System and β cells. Some of these alterations were also found in peripheral blood leukocytes, suggesting their possible role as biomarkers of susceptibility to develope T1D. However, further studies are needed to better understand the role of this neurodegeneration in the development of T1D as well as to determine which genes could be good biomarkers for detecting patients susceptible to develope T1D. In parallel with the DRG cells studies, in the course of the study of the role of peripherin as an autoantigen in T1D, it was seen that one of the peptides derived from this molecule (DIF-P) stimulated the production of proinflammatory cytokines by monocytes as well as inducing the death of various cell types. In addition, these functional properties were altered when the peptide was modified with a 3-lysine (DIF-P3K) or 8-arginine (DIF-P8R) tail, probably because these amino acid tails turn them into Cell Penetrating Peptides (CPPs) allowing for better internalization. Given the cytotoxic and immunostimulatory properties of DIF-P, DIF-P3K, and DIF-P8R, it was decided to make a leap into in vivo studies to study their potential as immunotherapeutic agents against cancer. The different in vivo studies performed so far demonstrate the antitumor activity of DIF peptides in the models of melanoma and mastocytoma, indicating their potential use in the treatment of human cancer, either as cytostatic and/or immunotherapeutic agents, and this way become part of the therapeutic arsenal of this disease.

Diferents estudis han assenyalat la importància del sistema immunitari adaptatiu en la etiopatogènia de la malaltia de Parkinson (PD). La infiltració de limfòcits T s’ha descrit tant en models animals com en teixit postmortem humà. Alguns autors han proposat les modificacions post-traduccionals de l’α-sinucleïna com a possible antigen que indueix la resposta immunitària adaptativa. Per tant, l’objectiu principal d’aquesta tesi va ser determinar si els limfòcits T participen en l’inici i la progressió de la PD. A més, volíem saber si l’α-sinucleïna es comportava com un neoantigen. Vam analitzar i caracteritzar fenotípicament els limfòcits T que infiltren la substantia nigra pars compacta (SNpc) en teixit postmortem humà en diferents etapes de la malaltia. Teixit de PD i casos incidental de cossos de Lewy (iLBD), els quals són considerats un estadi inicial pre-motor de la malaltia, van ser analitzats. Vam estudiar la relació entre la infiltració de limfòcits T amb la mort de neurones dopaminèrgiques i la sinucleinopatia, dos pedres angulars de la malaltia. Vam detectar una infiltració bifàsica de limfòcits T citotòxics CD8+ (CTL) a la SNpc. Inesperadament, el primer i més important pic es produeix quan la sinucleinopatia i la mort dopaminèrgica no estan establerts. La infiltració de CTL es redueix un cop la sinucleinopatia i la mort dopaminèrgica comencen. La infiltració de CTL torna a augmentar en casos de PD on la densitat de limfòcits T CD8+ correlaciona amb la mort neuronal. Resultats semblants van ser obtinguts en un altra àrea cerebral afectada en la PD com és ara el locus coeruleus (LC). El fet que els CTLs fessin contacte amb neurones dopaminèrgiques i correlacionessin amb la seva pèrdua, suggereix un possible rol en la mort dopaminèrgica. Per anar més enllà, vam detectar que els CTLs expressaven maquinària citotòxica com ara granzims i interferó-g. La infiltració de CTLs granzims+ a la SNpc estava augmentada en casos iLBD indicant una resposta immunitària adaptativa aguda en estadis inicials de la malaltia. Un alt percentatge de CTLs eren limfòcits T memòria residents de teixit identificats per CD103. La presentació antigènica via micròglia MHC-II+ estava reduïda en estadis inicials de la malaltia. Baixes densitats de micròglia MHC-II+ tipus ameboide/activada correlacionaven amb més pèrdua dopaminèrgica, suggerint un rol positiu de la micròglia MHC-II+. Per tal de determinar el millor model rosegador per analitzar el rol de limfòcits T, vam caracteritzar la resposta immunitària en ratolins injectats amb MPTP i en rates que sobre-expressaven α-sinucleïna. Vam trobar una infiltració transitòria de limfòcits T CD4+ i CD8+ que precedien la mort dopaminèrgica en el model MPTP subagut i que correlacionaven amb una afectació estriatal. Tot i així, l’eliminació de la tolerància immunitària a través de la depleció dels Tregs no va augmentar el dany nigroestriatal. Finalment, també vam observar la infiltració de limfòcits T CD4+ i CD8+ a la SNpc en rates sobre-expressant α-sinucleïna. No obstant, aquestes rates no mostraven ni canvis motors ni dany nigroestriatal. En conclusió, la resposta immunitària adaptativa en cervells de casos amb la PD és diferent a l’observada en models animals de la malaltia. A la SNpc, els limfòcits T CD4+ no estaven augmentats i la infiltració de CTL precedia la sinucleinopatia. Aquests resultats assenyalen el fet que l’α-sinucleïna no sembla ser l’antigen que provoca un atac citotòxic. En general, aquesta tesi ha demostrat que la infiltració de CTL és un esdeveniment inicial en la malaltia precedint tant la mort dopaminèrgica com la sinculeinopatia. Per tant, el sistema immunitari adaptatiu pot ser una bona diana terapèutica tant en estadis inicials com finals de la malaltia. Emperò, urgeix la necessitat d’establir nous models animals que recapitulin la resposta humana immunitària adaptativa.
Diferentes estudios han señalado la importancia del sistema inmune adaptativo en la etiopatogenia de la enfermedad de Parkinson (PD). La infiltración de linfocitos T se ha descrito tanto en modelos animales como en tejido postmortem humano. Algunos autores han propuesta las modificaciones post-traduccionales de la α-sinucleína como posible antígeno que induzca la respuesta inmune adaptativa. Por lo tanto, el objetivo principal de esta tesis fue determinar si los linfocitos T participan en el inicio y la progresión de la PD. Además, queríamos saber si la α-sinucleína se comportaba como un neoantígeno. Analizamos y caracterizamos fenotípicamente los linfocitos T que infiltran la substantia nigra pars compacta (SNpc) en tejido postmortem humano en diferentes etapas de la enfermedad. Tejido de PD y casos incidentales de cuerpos de Lewy (iLBD), los cuales son considerados un estadio inicial pre-motor de la enfermedad, fueron analizados. Estudiamos la relación entre la infiltración de linfocitos T con la muerte de neuronas dopaminérgicas y la sinucleinopatía, dos piedras angulares de la enfermedad. Detectamos una infiltración bifásica de linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) en la SNpc. Inesperadamente, el primer y más importante pico se produce cuando la sinucleinopatía y la muerte dopaminérgica aún no están establecidas. La infiltración de CTL se reduce cuando la sinucleinopatía y la muerte dopaminérgica empiezan. La infiltración de CTL vuelve a aumentar en los casos de PD donde la densidad de linfocitos T CD8+ correlaciona con la pérdida neuronal. Resultados parecidos fueron obtenidos en otra área cerebral afectada en la PD como es el locus coeruleus (LC). El hecho que los CTLs contactasen con neuronas dopaminérgicas y correlacionasen con su pérdida, sugiere un posible rol en la muerte dopaminérgica. Más específicamente, detectamos que los CTLs expresaban maquinaria citotóxica como granzimas e interferón-g. La infiltración de CTLs granzimas+ en la SNpc estaba augmentada en casos iLBD indicando una respuesta inmune adaptativa aguda en estadios iniciales de la enfermedad. Un elevado porcentaje de CTLs eran linfocitos T memoria residentes de tejido identificados por CD103. La presentación antigénica vía microglía MHC-II+ estaba reducida en estadios iniciales de la enfermedad. Bajas densidades de microglía MHC-II+ tipo ameboide/activada correlacionaban con más pérdida dopaminérgica, sugiriendo un rol positivo de la microglía MHC-II+. Para determinar el mejor modelo roedor con la intención de analizar el rol de los linfocitos T, caracterizamos la respuesta inmune adaptativa en ratones inyectados con MPTP y en ratas que sobre-expresaban α-sinucleína. Encontramos una infiltración transitoria de linfocitos T CD4+ y CD8+ que precedían la muerte dopaminérgica en el modelo MPTP subaguda y que correlacionaban con una afectación estriatal. Aún así, la eliminación de la tolerancia inmunitaria vía la depleción de los Tregs no augmentó el daño nigroestriatal. Finalmente, también observamos la infiltración de linfocitos T CD4 y CD8+ en la SNpc en ratas sobre-expresando α-sinucleína. No obstante, estas ratas no mostraban ni cambios motores ni daño nigroestriatal. En conclusión, la respuesta inmune adaptativa en cerebros de casos con la PD es diferente a la observada en modelos animales de la enfermedad. En la SNpc, los linfocitos T CD4+ no están augmentados y la infiltración de CTL precede la sinucleinopatía. Estos resultados señalan el hecho que la α-sinucleína no parace ser el antígeno que provoca un ataque citotóxico. En general, esta tesis ha demostrado que la infiltración de CTL es un evento inicial en la enfermedad precediendo tanto la muerte dopaminérgica como la sinucleinopatía. Por lo tanto, el sistema inmune adaptativo puede ser una buena diana terapéutica tanto en estados iniciales como finales de la enfermedad. Aún así, urge la necesidad de establecer nuevos modelos animales que recapitulen la respuesta humana inmune adaptativa.
Mounting evidence has pointed out that the adaptive immune system has an important role in Parkinson’s disease (PD) etiopathogenesis. T cell infiltration has been described in both PD experimental animal models and post-mortem human tissue. Some authors have proposed α-synuclein posttranslational modifications as the antigen eliciting this adaptive immune response. Thus, the main goal of this thesis was to determine whether T cells participate in the onset and progression of the disease. Moreover, we wanted to know whether α-synuclein behaved as a neoantigen. In order to overcome this, we analyzed and phenotypically characterized substantia nigra pars compacta (SNpc) infiltrating T cells in post-mortem human tissue at distinct disease stages. PD and incidental Lewy Body disease (iLBD) cases, which are considered to be an early pre-motor stage of the disorder, were analyzed. We studied the relationship between T cell infiltration with dopaminergic cell loss and synucleinopathy, two hallmarks of the disorder. We found a biphasic SNpc CD8+ cytotoxic T lymphocyte (CTL) infiltration. Strikingly, the first and highest peak was found when synucleinopathy and dopaminergic cell loss were not established. SNpc CTL infiltration subsided when synucleinopathy and dopaminergic cell loss started. SNpc CTL infiltration again increased in PD cases where CD8+ T cell densities correlated with neuronal death. Similar results were also obtained in another PD brain affected area such as locus coeruleus (LC). The fact that SNpc CTLs made contact with dopaminergic neurons and correlated with dopaminergic cell loss, suggests a likely role in dopaminergic cell death. To delve further into this concept, we found that SNpc CTLs expressed cytotoxic machinery i.e. granzymes and interferon-g. Infiltrating SNpc granzyme+ CTLs were found increased in iLBD cases indicating an acute adaptive immune response in early stages of the disease. A high percentage of SNpc CTLs were tissue resident memory T cells identified by CD103 expression. Antigen presentation by means of MHC class-II+ microglia was reduced in early stages of the disease. Low densities of ameboid/activated MHC class-II+ microglial cells correlated with higher dopaminergic cell loss, suggesting a positive role of MHC class-II+ microglia in the disease. To determine the best rodent model to assess the T cell role in PD, we characterized the immune response in MPTP injected mice and rats overexpressing α-synuclein. We found a transient CD4+ and CD8+ T cell infiltration preceding dopaminergic cell death in the subacute MPTP injected mice which correlated with striatal damage. Nonetheless, breaking immune tolerance through systemic Treg depletion did not increase nigrostriatal damage. Finally, we also observed CD4+ and CD8+ T cell SNpc infiltration in rats overexpressing α-synuclein. However, these rats did show neither behavioural motor changes nor nigrostriatal damage. To conclude, human PD-specific brain adaptive immune response reported in our study is different to the one observed in PD experimental animal models. In SNpc human tissue CD4+ T cells were not elevated, and CTL infiltration preceded synucleinopathy. These results point out the fact that α-synuclein seems not to be the antigen for the cytotoxic attack elicited by CD8+ T cells. Overall, this thesis demonstrated that CTL infiltration is an early event of the disease preceding both α-synuclein deposition and dopaminergic cell loss. Thus, targeting the adaptive immune response in both early and late stages of the disease may have beneficial effects. Nevertheless, there is a need to establish new PD experimental animal models which recapitulate the human adaptive immune response.
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Neurociències

Macrophages exert potent microbicidal functions against pathogens; however, some intracellular bacteria have developed strategies to survive within intracellular phagolysosomes and use macrophages as a preferential niche to replicate. Liver X receptors (LXRs) are ligand- activated transcription factors of the nuclear receptor superfamily that regulate metabolic and immune functions. In this study, we explored the impact of LXR activation on host–bacteria interactions and its consequences on infection. In a murine model of orally-acquired salmonellosis, the pharmacological activation of LXRs reduced extraintestinal bacterial dissemination and attenuated the clinical signs of infection. The beneficial effects of LXR activation in the control of infection required the expression of the multifunctional protein CD38 in bone marrow-derived cells. We had previously described CD38 as a new LXR target gene that is synergistically induced by the combination of LXR agonists and inflammatory stimuli in macrophages. Here, we have identified the transcription factor C/EBPβ as an essential mediator of Cd38 induction by TNFα, IFNγ, or LPS, as well as by the combination of these inflammatory signals and an LXR agonist. In murine macrophages, LXR activation reduced the internalisation of Salmonella Typhimurium, uropathogenic E. coli, and enteroinvasive E. coli (EIEC) but not of Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, or latex microspheres. After analysing several LXR-mediated activities, we found that S. Typhimurium infection correlated with the abundance of free cholesterol in macrophages, indicating that the reduction in cellular cholesterol caused by LXR activation might mediate the inhibitory effect on bacterial entry. In primary human macrophages, LXR activation reduced the infection by S. Typhimurium but not by EIEC or S. aureus. Strikingly, LXR activation caused either no effect or a reduction in the internalisation of L. monocytogenes and latex microspheres depending on the donor. In conclusion, this work delves into the mechanisms by which LXRs modulate host interactions with bacteria. Given that the ability of many bacteria to invade host cells largely depends on initial surface contacts, modulating these events through LXR-targeting compounds opens new potential therapeutic opportunities for antibacterial drug development.

El sistema inmunitario no es totalmente funcional en el momento del nacimiento, sino que va desarrollando su capacidad defensiva frente a patógenos durante las primeras etapas de vida. Esta inmadurez en la respuesta inmunitaria innata y adaptativa es aún más acentuada en niños prematuros, y justifica su elevada susceptibilidad a padecer infecciones. En este contexto, la leche materna es la fuente de alimento más idónea para el recién nacido, ya que además de nutrientes contiene una gran variedad de factores bioactivos con propiedades inmunomoduladoras. Entre estos componentes se encuentran el factor de crecimiento transformante-β2 (TGF-β2), el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21), el cual ha sido identificado en leche humana recientemente. Actualmente, se dispone de poca información sobre la influencia de dichos componentes bioactivos sobre el desarrollo del sistema inmunitario en edades tempranas. En este contexto, el objetivo general de esta tesis ha sido establecer el impacto de una suplementación dietética con TGF-β2, EGF y FGF21 en la maduración de la barrera intestinal, del sistema inmunitario intestinal y del sistema inmunitario sistémico en ratas lactantes nacidas a término y pretérmino. Para alcanzar la primera parte de este objetivo, se utilizaron ratas Wistar nacidas a término que fueron suplementadas diariamente con TGF-β2, EGF o FGF21 desde el día de nacimiento y durante todo el período de lactancia. En relación al sistema inmunitario intestinal, se observó que la suplementación con los tres factores bioactivos ensayados induce cambios en la producción de citocinas y en la composición de linfocitos -tanto del compartimento intestinal inductor como del efector- siendo más evidentes en el caso de EGF y FGF21. Además, EGF y FGF21 también incrementaron la expresión génica de moléculas de defensa innata y de maduración intestinal, respectivamente. En ningún caso, se observó potenciación temprana de la función epitelial de barrera asociada a los suplementos administrados. En el caso del sistema inmunitario sistémico, la suplementación con TGF-β2, EGF y FGF21 promovió el desarrollo de un patrón de inmunoglobulinas plasmáticas asociado a una respuesta de tipo Th2, la cual es predominante en estas primeras etapas de vida. Además, la suplementación con estos factores condujo a pequeñas modificaciones en la composición de linfocitos esplénicos y su capacidad para secretar citocinas, sin afectar su respuesta proliferativa. En una segunda fase del estudio, se determinó la influencia de la suplementación con EGF en ratas lactantes nacidas en condiciones de prematuridad. Se demostró que la suplementación diaria con EGF durante los primeros 17 días de vida es capaz de potenciar la respuesta inmunitaria innata -incrementando la proporción de linfocitos NK a nivel intestinal- y de contrarrestar parcialmente algunas de las alteraciones producidas por la prematuridad, como el desequilibrio en el patrón de inmunoglobulinas plasmáticas Th1/Th2, la permeabilidad intestinal, el tamaño de las células caliciformes y la expresión génica de algunas moléculas a nivel intestinal. Globalmente, la suplementación con TGF-β2, EGF y FGF21 durante la lactancia promueve el desarrollo del sistema inmunitario intestinal y sistémico en ratas lactantes nacidas a término. Además, en el caso de EGF se ha demostrado su influencia en la maduración de la función de barrera intestinal e inmunitaria en condiciones de prematuridad, lo cual podría reducir el riesgo de infección asociado a este tipo de parto.
The neonatal immune system is immature and prematurity magnifies this state, provoking severe deficiencies. In addition, breast milk have several bioactive compounds such as transforming growth factor-β2 (TGF-β2), epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor 21 (FGF21) that may have a key role promoting intestinal and immune maturation. In this line, the aim for this thesis was to evaluate whether the daily supplementation with TGF-β2, EGF and FGF21 was able to enhance the intestinal barrier maturation and to promote the development of the intestinal and systemic immune system in both term and preterm rats. For the first part, newborn Wistar rats were daily supplemented with TGF-β2, EGF and FGF21 during the suckling period. On the one hand, in the intestinal immune system, the three bioactive factors studied produced changes on the production of cytokines and lymphocyte composition being more evident for EGF and FGF21 supplementations. Moreover, EGF and FGF21 increased gene expression related with intestinal maturation. On the systemic immune system, these bioactive factors promoted a cytokine pattern related with a Th2 response that it is characteristic of the first days of life. Moreover, some changes on the spleen composition of lymphocytes subsets were observed without changes on proliferation response. On the second part of this thesis, we studied the effect of EGF supplementation in premature rats. Its daily supplementation during the first 17 days of life was able to enhance the innate immune response by increasing the proportion of NK cells at the intestinal site. Moreover, the supplementation was able to revert some of the deficiencies found in the prematurity status, such as the imbalance in the Th1 / Th2 plasma immunoglobulins pattern, intestinal permeability, Goblet cells size and gene expression of some molecules at the intestinal level. These results suggest that the supplementation with TGF-β2, EGF and FGF21 during breastfeeding promotes the development of the intestinal and systemic immune system in full-term suckling rats. In addition, EGF is involved in the maturation of the intestinal and immune barrier function in premature conditions, which could reduce the risk of infections associated with this type of delivery.

Yersinia enterocolitica es un patógeno Gram-negativo que provoca diversos síndromes gastrointestinales y expresa una panoplia de factores de virulencia, la mayoría regulados por la temperatura. El lipopolisacatido (LPS) es uno de los principales factores de virulencia de las bacterias Gram-negativas patógenas. Además, es una de las moléculas reconocidas por el sistema inmune innato y diana de los péptidos antimicrobianos. Por consiguiente, no es de extrañar que las bacterias modifiquen la estructura de su LPS con el fin de resistir a la defensa del sistema inmune. En esta Tesis Doctoral se han identificado los loci responsables de las modificaciones del lípido A de Y. enterocolitica O:8 (YeO8) y se ha demostrado que están reguladas por la temperatura. Se ha definido un circuito regulatorio complejo en el que intervienen los sistemas PhoP/PhoQ y PmrA/PmrB y en el que RovA y H-NS son piezas centrales. Además se demuestra que el lípido A tiene un papel en la virulencia de YeO8. Por último , se han identificado por primera vez en YeO8 la enzima PmrC, encargada de la adición de fosfoetanolamina al lípido A y la enzima LpxR encargada de la deacilación del lípido A.

No mundo, o nÃmero de indivÃduos cuja idade à superior a 60 anos crescerà exponencialmente e, em 2025, espera-se uma elevaÃÃo de 694 milhÃes no nÃmero de pessoas mais velhas. O envelhecimento à um processo complexo que afeta uma variedade de funÃÃes, incluindo o desenvolvimento e a manutenÃÃo do sistema imunolÃgico. Dessa forma, os idosos sÃo mais freqÃentemente acometidos por infecÃÃes e neoplasias do que os jovens. Essas patologias podem ser atribuÃdas, em parte, ao envelhecimento do sistema imunolÃgico, chamado imunossenescÃncia. O objetivo deste trabalho foi descrever o perfil imunolÃgico de uma populaÃÃo de idosos saudÃveis. Foram colhidas amostras de 35 voluntÃrios com idade igual ou superior a 60 anos, de ambos os sexos, onde foi utilizado, como controle, o mesmo nÃmero de voluntÃrios com idade entre 20 e 38 anos. Foram realizados 16 exames laboratoriais diferentes para definir as principais alteraÃÃes na imunossenescÃncia. Os resultados evidenciaram alteraÃÃes tanto na imunidade inata, quanto na imunidade adaptativa no organismo idoso. As alteraÃÃes encontradas na imunidade inata foram: aumento do nÃmero de neutrÃfilos no sangue venoso; aumento da concentraÃÃo do componente C4 do complemento; e aumento da concentraÃÃo de interleucina-6. As alteraÃÃes da imunidade adaptativa foram: reduÃÃo na quantidade dos linfÃcitos (leucograma) e das subpopulaÃÃes linfocitÃrias CD2+, CD3+ e CD8+ (imunofenotipagem); e aumento na concentraÃÃo da imunoglobulina IgA e diminuiÃÃo da concentraÃÃo de IgM. Podemos concluir, dessa forma, que este trabalho foi de grande relevÃncia para definir os parÃmetros normais do sistema imunolÃgico de um indivÃduo idoso saudÃvel e aperfeiÃoar a nossa compreensÃo deste sistema. Assim, tambÃm se constitui num passo necessÃrio no sentido de identificar, no futuro, formas de melhor tratar as causas subjacentes da imunossenescÃncia e suas conseqÃÃncias.
Worldwide, the number of individuals whose age is over 60 years will grow exponentially. Is provided an increase of 694 million in the number of older people in 2025. Ageing is a complex process that negatively impacts the development of the immune system and its ability to function. Immunosenescence is a multifactorial condition leading to many pathologically significant health problems in the aged population, it is becoming recognized that the immune system declines with age, a term known as immunosenescence, which leads to a higher incidence of infections, neoplasia and autoimmune diseases. This study attempts to describe the immunological profile of a population of healthy elderly. Thirty five elderly patients aged 60 years were subjected to a study and the same numbers of young volunteers aged between twenty and thirty eight were examinated like control group. Were investigated sixteen laboratorial exams to define the main changes in immunosenescence. The results showed changes in both innate immunity and adaptive immunity in the elderly body. The changes found in innate immunity were: increase the number of neutrophils in venous blood, increasing the concentration of C4 complement component, and increased levels of interleukin-6. Changes in adaptative immunity were: reduction in the number of lymphocytes (WBC) and lymphocyte subsets CD2 +, CD3 + and CD8 + (immunophenotyping) and increased concentration of immunoglobulin IgA and decreased IgM concentration. In cloncusion, this work was important to define the normal parameters of the immune system of a healthy elderly and improve our understanding of this system. Thus, it also constitutes a necessary step to identify how best to treat the underlying causes of immunosenescence and its consequence.

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas
Durante o último século, o homem tem vindo a adotar hábitos cada vez mais sedentários. Tais comportamentos têm promovido o aumento de algumas doenças, alterando estados metabólicos e também o sistema imunitário. A prática regular de exercício físico é essencial para a saúde e para um aumento da qualidade de vida. O presente trabalho visa relacionar a prática de exercício físico com o desenvolvimento da resposta imunológica. O atual conhecimento permite considerar que os benefícios inerentes à prática de exercício físico são responsáveis, também, por alterações no sistema imunitário. During the last century, man has been adopting increasingly sedentary habits. Such behaviors have promoted the increase of some diseases, changing metabolic states and also the immune system. The regular practice of physical exercise produces many benefits for a good health and improves the quality health of life. The present work aims to relate the physical exercise with the development of the immune response. Current knowledge allows us to consider that physical exercise as benefits and is responsible for changes, also, in the immune system.

Os linfócitos, principais células do sistema imune, podem ser encontrados em órgãos e tecidos de dois grandes sistemas do corpo: o sistema linfático, composto por uma extensa rede de vasos linfáticos e linfonodos; e o sistema linfoide, mais abrangente e que, além de englobar o sistema linfático, abrange todas as células, tecidos e órgãos do corpo que contêm agregados linfocitários, tais como o timo, baço e linfonodos. Embora esteja amplamente descrito para animais domésticos e alguns animais silvestres, estudos sobre o sistema imune em cetáceos são escassos. A influência negativa de contaminantes no sistema imune em mamíferos aquáticos está em constante discussão. Assim, um conhecimento mais profundo da anatomia deste sistema é essencial para a interpretação clínica e de achados de necropsia, para uma melhor compreensão dos achados patológicos. Portanto, o objetivo deste estudo foi caracterizar morfológica e ultraestruturalmente os órgãos do sistema linfoides de odontocetos de ocorrência no litoral brasileiro. As amostras utilizadas foram procedentes de animais encalhados nas regiões norte e nordeste do Brasil. Os órgãos analisados foram baço, timo e linfonodo, bem como os tecidos linfoides associados à mucosa. Primeiramente as amostras foram localizadas topograficamente e avaliadas macroscopicamente. Posteriormente, as amostras foram fixadas e analisadas por microscopias de luz, eletrônica de varredura e transmissão, imunohistoquímica e histomorfometria. Através das análises realizadas foi possível observar que os órgãos e tecidos linfoides em cetáceos são semelhantes ao observado em mamíferos domésticos, com algumas particularidades. Não existem diferenças morfológicas com relação ao timo entre as espécies estudadas, com exceção da não existência de tecido adiposo substituindo o órgão em animais mais jovens, e a presença de Corpúsculos de Hassal mais evidentes em tamanho neste grupo. Novos grupos de linfonodos foram descritos de acordo com a sua localização, entretanto todos possuiram arquitetura semelhante ao descrito na literatura para mamíferos terrestres. Os linfonodos estavam dispostos de forma solitária ou em grupos e apresentavam formato variado, recobertos por uma cápsula, e o parênquima do órgão dividiu-se em região cortical e medular. Os centros germinativos apresentaram-se mais evidentes e desenvolvidos em animais filhotes e jovens. Os baços e baços acessórios eram morfologicamente semelhantes, caracterizados por numerosos nódulos linfáticos delimitados pela bainha linfoide periarterial e uma rede celular difusa que circundava os nódulos linfáticos, sem diferenciação entre as camadas cortical e medular. Centros germinativos se tornaram mais discretos e reduzidos em número com o aumento da idade. Os baços acessórios estavam firmemente aderidos ao baço e/ou à grande curvatura da primeira cavidade do estômago, sendo mais prevalentes em animais com maior escore corporal e de mergulhos mais profundos, sugerindo uma função de reservatório sanguíneo complementar. Os tecidos linfoides associados à mucosa em cetáceos foram semelhantes aos observados em mamíferos terrestres, com adaptações inerentes ao meio aquático, como a presença de tonsilas orofaríngea e anal, assegurando uma resposta imunológica mais eficiente diante de desafios antigênicos constantes presentes em seu habitat. Sugere-se que este segmento do sistema linfoide é essencial para a proteção do animal diante dos contaminantes presentes em seu habitat. Com base nos achados do presente estudo, será possível uma melhor compreensão do funcionamento e estrutura do sistema imunológico das espécies estudadas, colaborando na elucidação das causas de encalhe destes animais, que poderão funcionar como potenciais indicadores ambientais
Lymphocytes, key cells of the immune system, can be found in organs and tissues of two major systems of the body: the lymphatic system, composed of an extensive network of lymph vessels and lymph nodes; and the lymphoid system, more comprehensive that, in addition to comprise the lymphatic system, includes all cells, tissues and organs containing lymphoid aggregates, such as the thymus and spleen. Although these systems are widely described in domestic animals and some wildlife species, studies about marine mammals are scarce. The negative influence of contaminants in the immune system of aquatic mammals is in constant discussion. The knowledge on the anatomy of these systems is essential for clinical interpretation and necropsy, providing a better understanding of the pathological findings. Therefore, the aim of this study was to characterize the morphology and ultrastructure of lymphoid system of odontocetes occurring in the Brazilian coast. Samples from animals stranded in the northern and northeastern regions of Brazil were collected and organs spleen, thymus and lymph node and mucosa-associated lymphoid tissue were analyzed. First, all samples were evaluated macroscopically and topographically located. Subsequently, they were fixed and analyzed by light microscopy, scanning electron and transmission, immunohistochemistry and histomorphometry. Through these analyzes it was observed that the organs and lymphoid tissues in cetaceans are similar to that observed in domestic mammals, with some peculiarities inherent to their habitat. There were no morphological differences from the thymus in the species studied, except for the absence of adipose tissue replacing the organ in younger animals, and the presence of Hassall corpuscles more prominent in this group. New groups of lymph nodes were described, possessing architecture similar to that described in the literature for terrestrial mammals. Lymph nodes were arranged solitarily or in groups and had varied format, covered by a capsule and the parenchyma of the organ was divided into cortical and medullary region. Their germinal centers had become more evident and developed in puppies and young animals. Spleens and accessory spleens were morphologically similar, characterized by numerous lymph nodules delimited by periarterial lymphoid sheath and a diffuse cellular network in its surrounding area, without differentiation between cortical and medullary layers. Germinal centers became more discrete and reduced in number with increasing age. Accessory spleens were firmly adhered to the spleen and / or the greater curvature of the first stomach and were more prevalent in animals with higher body score and dives deeper, suggesting a role of complement blood reservoir. The mucosa-associated lymphoid tissues in cetaceans were similar to those observed in terrestrial mammals, with inherent aquatic adaptations, such as the presence of oropharyngeal and anal tonsils, ensuring a more efficient immune response in the face of constant antigenic challenges present in their habitat. It is suggested that this segment of the lymphoid system is essential for the protection of the animal before the contaminants in their habitat. Based on these findings, this study will enable a better understanding of the structure and functioning of the immune system of the species studied, collaborating in the elucidation of causes of stranding of these animals, whicih may act as potential environmental indicators

Intestinal neuropathies have been described in a variety of functional and inflammatory gastrointestinal disorders. Although the degenerative alterations and neuronal are often associated to a lymphocytic inflammatory infiltrate, the underlying mechanisms remain obscure. Potential etiologic factors are neurotropic viruses, since they are able to specifically infect neurons and cause cell damage through direct or indirect mechanisms. Among the neurotrophic viruses the HSV-1 shows several interesting features. HSV-1 is most commonly known to latently infect the trigeminal ganglion of cranial nerve innervating the face and oral mucosa but latent HSV-1 has also been found in the nodose ganglia innervating the gastrointestinal tract in humans possibly as a consequence of swallowed viral particles. The working hypothesis of my PhD work was that swallowed HSV-1 can infect the enteric nervous system and locally trigger an immune mediated response damaging neurons. To assess the ability of α-herpesvirinae (HSV-1, HSV-2, VZV) to infect human ENS we performed a prospective cohort study using human surgical ileocolonic specimens of patients affected by colon carcinoma (CC), Crohn’s disease (CD), ulcerative colitis (UC) and diverticular disease (DD). A total of 121 patients were studies and presence of herpes simplex virus (HSV) types-1 and -2 and varicella-zoster virus (VZV) DNA was examined by RT-PCR in the muscle intestinal layer including the myenteric plexus. The α-herpesviruses DNA was detected in 44,5 % and 52 % of ileum and colon samples, respectively. No significant differences in the viral DNA positivity were observed among the different groups whereas the viral DNA load was significantly higher in samples of patients affected by Crohn’s disease. Moreover, HSV DNA was detected more frequently than VZV DNA, 46% vs 3%, respectively. In order to mimic the human α-herpesvirinae infection and spread in ENS, my research group has established an original murine model of persistent ENS infection with HSV-1. Using this model we demonstrated that HSV-1 infection resulted in time-dependent intestinal neuromuscular abnormalities, providing the first in vivo evidence for the ability of neurotropic viruses to reach and damage the ENS. Since significant intestinal motility anomalies and damage of enteric nerves were evident 8 - 10 weeks (W) post intragastric (IG) challenge with HSV-1, I attempted to characterize the adaptive immune response to HSV-1 and whether was causing the neuromuscular abnormalities. In the longitudinal muscle myenteric plexus (LMMP) I observed an increase in CD3+ lymphocytes starting at 6 W and persisting up to 10 W after viral IG inoculum. At 8 weeks post IG viral inoculum, HSV-1 reactive CD3+CD4+IL4+ and CD3+CD8+INF-γ+ were detected, whereas at 10 W activated CD8+ T-cells infiltrated the LMMP. By immunohistochemistry CD3+ lymphocytes were demonstrated in the myenteric ganglia of HSV-1 infected mice 6-10 W post IG viral challenge. To verify the involvement of CD8+ and CD4+ T-cells in HSV-1 induced dysmotility we performed depletion experiments by administration of monoclonal antibody. ENS damage and the neuromuscular anomalies were observed only after depletion of CD8 T cells at 8 and 10 W after viral IG inoculum. To validate the role of lymphocytes in HSV-1 induced ENS dysfunction, CD3+CD4+ and CD+CD8+ cells were isolated from the LMMP of mice 8-10 W after viral IG inoculum, in vitro pulsed with HSV-1, and injected in recipient mice. The effects on isometric muscle tension were determined after one week. Adoptive transfer of CD8+ T cells isolated from LMMP at 8 W post IG HSV-1 inoculum caused significant neuromuscular anomalies (p<0.01 vs control) in recipient mice only if HSV-1 pulsed in vitro. Instead, the adoptive transfer of both CD4+ and CD8+ T cells isolated from 10 W infected mice resulted in dysmotility with or without in vitro exposure to viral antigens in recipient mice. In conclusion, in this study we showed that α-herpesvirinae DNA is present in a large percentage of patients and the presence of HSV-1 in murine myenteric ganglia triggered a strong and specific immune response able to damage the ENS. We speculate that persistent HSV-1 infection in the ENS, in predisposed individuals, may contribute to alter neuronal functional integrity favouring the onset of bowel disorders.
Le neuropatie intestinali sono state descritte in una varietà di disturbi gastrointestinali di natura funzionale e infiammatoria. Inoltre le alterazioni neuronali sono spesso state associate alla presenza di un infiltrato infiammatorio linfocitario, ma rimangono ancora oscuri i meccanismi alla base di questi processi. I potenziali fattori eziologici sono rappresentati da virus neurotropi, i quali sono in grado di infettare specificatamente i neuroni e causare danni alle cellule attraverso meccanismi diretti o indiretti. Tra i virus neurotropici, Herpes Simplex Virus type-1 sembra mostrare diverse caratteristiche interessanti. Anche se l’HSV-1 è più comunemente noto per infettare latentemente il ganglio trigemino del nervo cranico che innerva viso e mucosa orale, HSV-1 è stato trovato anche in gangli che innervano il tratto gastrointestinale nell'uomo probabilmente come conseguenza di particelle virali ingerite. L’attività di ricerca svolta durante il mio periodo di dottorato si basa sull’ipotesi che HSV-1 è capace di infettare il sistema nervoso enterico e innescare localmente una risposta immunitaria in grado di danneggiare i neuroni del tratto gastrointestinale. Per valutare la capacità della subfamiglia degli α-Herpesviridae (HSV-1, HSV-2, VZV) di infettare il sistema nervoso enterico (SNE) umano, abbiamo effettuato uno studio di coorte prospettico su resezioni ileocoliche chirurgiche di pazienti affetti da carcinoma del colon, morbo di Crohn, colite ulcerosa e malattia diverticolare. Un totale di 121 pazienti sono stati collezionati e mediante Real Time-PCR è stata valutata la presenza di DNA virale di HSV-1, HSV-2 e varicella-zoster (VZV), nello strato muscolare intestinale che comprende il plesso mienterico. La presenza di α-herpesvirus è stata evidenziata nel 44,5% dei campioni ileali e nel 52% dei campioni estratti da colon. La frequenza di campioni positivi al DNA virale non evidenzia alcuna correlazione significata con specifiche patologie. E’ stato però osservato che i livelli di DNA virale erano significativamente maggiori nei campioni di pazienti affetti da morbo di Crohn. Inoltre, il DNA di HSV è stato rilevato più frequentemente rispetto a VZV, 46% e 3%, rispettivamente. Al fine di simulare l'infezione da α-herpesvirinae e la conseguente diffusione nel SNE umano, il mio gruppo ha messo a punto un modello murino di infezione persistente di HSV-1 nel SNE. Utilizzando questo modello abbiamo dimostrato che l’infezione intestinale da HSV-1 provoca anomalie neuromuscolari correlate al tempo d’infezione, fornendo per per la prima volta la prova in vivo che i virus neurotropi sono capaci di raggiungere e, conseguentemente, danneggiare il SNE. In particolare, significative anomalie della motilità intestinale e danni funzionali dei nervi enterici sono stati evidenziati tra le 8 e 10 settimane dopo l’inoculo intragastrico (IG) in topi infettati con HSV-1. Il mio studio si è focalizzato sulla caratterizzazione della risposta immunitaria adattativa durante l’infezione da HSV-1 con lo scopo di chiarire un possibile coinvolgimento delle cellule immuni sulle alterazione neuronali che causano disfunzioni gastrointestinali. Abbiamo analizzato la presenza d’infiltrato linfocitario nel plesso mienterico (LMMP) di topi infettati con HSV-1 ed è stato osservato un aumento del numero di linfociti CD3+ a partire dalla sesta settimana e persistenti fino alla decima settimana dopo inoculo IG. In particolare all’ottava settimana d’infezione sono stati osservati sia CD3+CD4+IL4+ che CD3+CD8+INF-γ+ specificatamente attivati e reattivi ad HSV-1, mentre alla decima settimana dopo inoculo IG vi era una maggiore presenza di CD3+CD8+INF-γ+. Con saggi d’immunoistochimica, la localizzazione dei linfociti CD3+ è stata confermata al livello dei gangli mienterici in topi inoculati con HSV-1 dalla sesta alla decina settimana post infezione. Per verificare il coinvolgimento delle cellule T CD8+ e CD4+ nelle dismotilità indotte da HSV-1 sono stati effettuati esperimenti di deplezione tramite somministrazione di anticorpi monoclonali anti-CD4 e anti-CD8. Danni al SNE e anomalie neuromuscolari sono state osservate solo dopo l'esaurimento delle cellule T CD8+ all’ottava e decima dopo inoculo IG. Per validare ulteriormente il ruolo dei linfociti T reattivi al virus nel danno neuronale, CD3+CD4+ e CD3+CD8+ sono stati isolati dal plesso mienterico di topi infetti da 8 e 10 settimane e, dopo stimolazione in vitro con HSV-1, trapianti in topi sani. Una settimana dopo il trapianto sono stati valutati gli effetti sulla motilità intestinale nei topi trapiantati. Il trasferimento di cellule T CD8+ isolate dal plesso mienterico a 8 settimane hanno causato significative anomalie neuromuscolari (p <0.01 vs controllo) in topi controllo trapianti, solo in seguito a stimolazione in vitro con HSV-1. Invece, alterazioni della motilità sono state riscontrate in seguito al trapianto di entrambe le sottopopolazioni linfocitarie, CD4+ e CD8+ isolati dal plesso mientercio di topi infetti a 10 settimane, con o senza una precedente esposizione in vitro di antigeni virali. In conclusione, in questo studio abbiamo dimostrato che α-herpesvirinae DNA è presente in una grande percentuale di pazienti e che la presenza di HSV-1 nei gangli mienterici murini innesca una robusta risposta immunitaria specifica in grado di danneggiare il SNE. Noi ipotizziamo che una persistente infezione da HSV-1 nel SNE, in soggetti predisposti, può contribuire ad alterare l'integrità funzionale neuronale favorendo l'insorgenza di disturbi intestinali.

Trabalho apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
A evasão ao sistema imunulógico, por parte dos parasitas, está actualmente omnipresente e envolve uma série de mecanismos moleculares, que reflectem a evolução, reprodução e crescimento parasitário. Existem uma série de formas e processos de escape parasitário permitindo com que estes garantam, simultaneamente, a sua sobrevivência e a do hospedeiro. A co-evolução convergente entre hospedeiro e parasita sustêm a base destes mecanismos que se baseiam na manipulação dos processos que fazem parte e regulam a resposta imunitária e o normal funcionamento das células de defesa do hospedeiro, ficando a resposta inata e adaptativa vulnerável à acção parasitária. O fenómeno de evasão parasitária foi descoberto há cerca de 100 anos, por aquele que é considerado o pai da Imunologia, Paul Erlich; este durante alguns dos seus estudos observou “o desaparecimento dos receptores” característicos dos anticorpos do sistema imune, em Trypanossomas africanos. A partir daí as funções genéticas, alterações de variantes antigénicas, moléculas supressoras do sistema imune têm sido amplamente descobertas e estudadas. A importância do conhecimento das adaptações parasitárias é fundamental para o desenvolvimento de terapeuticas na área da medicina, imunologia, parasitologia e farmacologia visto que destas se obtêm dados fundamentais sobre a interecção entre estes microorganismos e sobre as patologias que podem causar. Desta feita este trabalho aborda, então esses mecanismos, explicando ainda de forma sintética a constituição do sistema imune de forma a direccionar facilmente e localizar o centro de ataque parasitário, demonstrando a forma ágil e habilidosa com que estes seres conseguem ludibriar um complexo sistema como é o sistema imunitário de um indivíduo imunocompetente. Evasion of immunologic system, by parasites, is now ubiquitous and involves several molecular mechanisms that reflect the evolution, parasite growth and its reproduction. There are a number of forms and escape processes which have been adopted by parasits ensuring survival of both parasite and host. The convergent co-evolution of host and parasite is the basis of these mechanisms that rely on manipulation of the processes which are part of the immune response and regulate it, as well as, the normal functioning of host defense cells, leaving the innate and adaptive response vulnerable to parasite activity. The phenomenon of parasite evasion was discovered about 100 years ago, by one considered the father of Immunology, Paul Ehrlich. This has been found during some of his studies where disappearance of the antibody receptors characteristic of the immune system of the African trypanosome, was observed. Since then, gene functions, changes in antigenic variants and suppressing molecules of immune system have been extensively discovered and studied. The importance of the knowledge of parasitic adaptations is crucial for the development of new therapeutics in medicine, immunology, parasitology and pharmacology since these data reflect the interaction between microorganisms and the immune system and also related diseases. With this dissertation we will have an overview of these mechanisms and a brief explanation of the immune system in order to easily locate the center of parasitic attack, demonstrating how agile and skilled these living beings can evade a complex system like the immune system of immunocompetent individuals.

Mestrado em Psicologia da Saúde e Reabilitação Psicológica
O sistema imuno-comportamental é caraterizado por processos afetivos, cognitivos e comportamentais que trabalham de forma articulada para prevenir a ocorrência de uma infeção. Da mesma forma, tanto a atenção como a memória evoluíram para aumentar as probabilidades de sobrevivência do organismo e, por isso, devem estar associadas ao sistema imuno-comportamental. Assim, o presente estudo investigou os efeitos da atenção e da memória para faces neutras após ativação contextual do sistema imuno-comportamental. Preocupações com doenças infeciosas ou não-infeciosas foram elicitadas nos participantes através da utilização de vídeos. Depois, eles realizaram uma tarefa de atenção exógena baseada na discriminação de letras alvo com faces neutras apresentadas como distratores, seguida de uma tarefa de reconhecimento surpresa para as faces. Os resultados mostraram que os participantes na condição de doença infeciosa apresentaram melhor desempenho na tarefa atencional do que os participantes na condição de controlo. Não foi encontrada nenhuma diferença significativa entre os grupos quanto à tarefa de reconhecimento. Em geral, estes resultados sugerem que o sistema imuno-comportamental pode estar associado a um estado de hipervigilância perante pistas sociais em geral e que a sua ativação por meio deste tipo de priming pode não ser suficiente para ativar mecanismos mnésicos.
The behavioural immune system (BIS) is characterized by affective, cognitive and behavioural processes that work in an articulated way to prevent the occurrence of an infection in the first place. Likewise, both attention and memory evolved to enhance the organism’s chances of survival and should, therefore, be associated with the BIS. Thus, the present study investigated the effects of attention and memory for neutral faces after a contextual activation of the behavioural immune system. Participants were primed either with infectious disease concerns or non-infectious disease concerns, using film clips. Then, they performed an exogenous attentional task based on the discrimination of target letters with face stimuli presented as distractors, followed by a surprise recognition task for the faces. The results showed that participants in the infectious disease condition performed better in the attentional task than participants in the control condition. No significant difference between groups was found regarding the recognition task. Overall, these results suggest that the BIS might be associated with a hypervigilant state towards social cues in general and that BIS activation through this type of priming may not be sufficient to activate mnemonic mechanisms

O nonilfenol etoxilado (NPE) é um desregulador endócrino que está presente no meio ambiente devido ao seu uso como detergente nos processos de limpeza de efluentes industriais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do NPE sobre o sistema imune adaptativo em ratos Wistar machos. Nestes animais foram avaliados o efeito do NPE sobre as células linfocitárias periféricas através da realização de hemograma e do perfil linfocitário adaptativo, analisando os marcadores de superfície CD4, CD8, CD28 e CD45 RA. Foi também avaliado o efeito do tratamento sobre o fígado e baço, bem como sobre o metabolismo intermediário, através das análises de glicemia, triglicerídeos e colesterol. Os dados não demonstraram diferenças significativas em relação ao índice hepático e esplênico. O nível de triglicerídeos apresentou um aumento de 50% nos grupos tratados, na avaliação dos níveis de colesterol e glicose não foi demonstrado diferenças significativas entre os grupos. Os resultados indicaram que o número de linfócitos e monócitos dos grupos tratados tiveram uma queda significativa de aproximadamente 25% e 50% em relação ao grupo controle. Foi demonstrado que o número de células fortemente marcadas quanto à presença da proteína CD45RA High na superfície celular dos linfócitos é maior nas células dos ratos do grupo tratado e que o tratamento aumenta a relação entre as células CD45RA High/Dim. Esses resultados levantam a hipótese que as células aumentadas nos grupos tratados apresentam fenótipo de membrana compatível com células T terminalmente diferenciadas (TEMRA). Este estudo forneceu dados novos sobre a ação do NPE, até onde se tem conhecimento, é a primeira pesquisa a constatar a presença elevada de células TEMRA em animais tratados com NPE, contribuindo com um novo foco para futuras pesquisas dessa substância.
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq
Ethoxylated nonylphenol (NPE) is an endocrine disruptor that is present in the environment because of its use as a detergent in the industrial effluent cleaning processes. The objective of this work was to evaluate the influence of ethoxylated nonylphenol (NPE) on the adaptive immune system in male Wistar rats. In these animals, the effect of NPE on peripheral lymphocyte cells was evaluate by performing hemogram and adaptive lymphocytic profile, analyzing CD4, CD8, CD28 and CD45 RA surface markers. The effect of treatment on the liver and spleen, as well as on the intermediate metabolism, was also evaluate through glycemic, triglyceride and cholesterol analyzes. The data did not show significant differences in relation to the hepatic and splenic index. The level of triglycerides presented a 50% increase in the treated groups; in the evaluation of cholesterol and glucose levels, no significant differences between the groups were demonstrate. The results indicated that both, the number of lymphocytes and monocytes of the treated groups had a significant decrease of approximately 25% and 50% relative to the control group. The number of strongly labeled cells for the presence of the CD45RA High protein on the cell surface of the lymphocytes showed to be higher in the cells of the mice in the treated group and that the treatment increases the ratio between the CD45RA High/Dim cells. These results raise the hypothesis that enlarged cells in the treated groups exhibit terminally differentiated T cell (TEMRA). This study provided new data on the action of NPE, to the best of our knowledge, is the first research to verify the elevated presence of TEMRA cells in animals treated with NPE. In addition, these findings contribute a new focus for future research on this substance.

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Os códigos maliciosos (malware) podem causar danos graves em sistemas de computação e dados. O mecanismo que o sistema imunológico humano utiliza para proteger e detectar os organismos que ameaçam o corpo humano demonstra ser eficiente e pode ser adaptado para a detecção de malware atuantes na Internet. Neste contexto, propõe-se no presente trabalho um sistema que realiza coleta distribuída, análise e detecção de programas maliciosos, sendo a detecção inspirada no sistema imunológico humano. Após a coleta de amostras de malware da Internet, as amostras são analisadas de forma dinâmica de modo a proporcionar rastros de execução em nível do sistema operacional e dos fluxos de rede que são usados para criar um modelo comportamental e para gerar uma assinatura de detecção. Essas assinaturas servem como entrada para o detector de malware e atuam como anticorpos no processo de detecção de antígenos realizado pelo sistema imunológico humano. Isso permite entender o ataque realizado pelo malware e auxilia nos processos de remoção de infecções
Malicious programs (malware) can cause severe damages on computer systems and data. The mechanism that the human immune system uses to detect and protect from organisms that threaten the human body is efficient and can be adapted to detect malware attacks. In this context, we propose a system to perform malware distributed collection, analysis and detection, this last inspired by the human immune system. After collecting malware samples from Internet, they are dynamically analyzed so as to provide execution traces at the operating system level and network flows that are used to create a behavioral model and to generate a detection signature. Those signatures serve as input to a malware detector, acting as the antibodies in the antigen detection process performed by immune human system. This allows us to understand the malware attack and aids in the infection removal procedures

Orientador: Margareth Castro Ozelo
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
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Resumo: Os principais problemas relacionados ao tratamento de pacientes portadores de hemofilia A estão relacionados ao uso terapêutico de fator VIII (FVIII), sendo estes o desenvolvimento de anticorpos neutralizantes anti-FVIII (inibidores), e o desenvolvimento de reações anafiláticas, que são eventos raros, no entanto potencialmente graves. As informações quanto aos isotipos de imunoglobulinas associados a estas duas situações clínicas ainda é limitado. O objetivo deste projeto foi avaliar as características da resposta imune humoral em pacientes com hemofilia A que apresentam inibidor e/ou em condição de reação alérgica ao FVIII. Para estas análises três metodologias foram aplicadas, (1) determinação de anticorpos inibitórios por método de Bethesda-Nijmegen, (2) determinação do isotipo de imunoglobulinas envolvidas subclasses da IgG, IgM e IgE anti-FVIII, por método de ELISA e (3) determinação de citocinas por método multiplex BDTM CBA® (cytometric bead array). Esse projeto foi dividido em três estudos. No primeiro estudo, foram analisadas amostras de 25 pacientes brasileiros com hemofilia A, sendo 44% destes afrodescendentes. Todos os pacientes receberam exclusivamente terapia de reposição com concentrado de FVIII derivado de plasma (pdFVIII) e produtos bypass após o desenvolvimento de inibidor. Cinco pacientes deste grupo foram acompanhados por uma análise longitudinal no período de até três anos. No segundo estudo, 4 pacientes com hemofilia A com inibidor foram avaliados no período em que foram tratados através do protocolo de indução de imunotolerância (ITI) para erradicação do inibidor, também em análise longitudinal. O terceiro consistiu da avaliação de incidência de reação alérgica em pacientes com hemofilia A. Três de 322 pacientes (0,9%) apresentaram reação alérgica após a exposição exclusivamente para pdFVIII durante os últimos quinze anos em nosso centro. Os resultados evidenciaram que a subclasse IgG4 é a principal na modulação em presença de anticorpos inibitórios, enquanto a IgG1 na maior parte das análises estava presente junto a baixos títulos de inibidor.Durante o tratamento de ITI os níveis das interleucinas anti-inflamatórias IL-4 e IL-6 acompanharam o decaimento dos títulos de inibidor e IgG4 nos pacientes que obtiveram sucesso ao tratamento. Além disso, no decorrer do protocolo observou-se uma resposta polarizada para o tipo Th1 como padrão de resposta na conquista da tolerância completa ao FVIII. No contexto da reação alérgica, apenas um dos três pacientes apresentou reatividade da IgE que foi exclusiva ao pdFVIII, sendo negativa no ensaio do IgE anti-rFVIII (anti-fator VIII recombinante), demonstrando que a reatividade não foi específica ao FVIII. O entendimento resposta imune humoral em pacientes com hemofilia A, incluindo a participação da IgG4 e IgG1 no mecanismos envolvendo a presença e erradicação dos inibidores e da IgE na reação alérgica, possibilita ampliar conceitos estabelecidos dos mecanismos envolvidos nessas duas situações. Isso poderá auxiliar no desenvolvimento de novos produtos menos imunogênicos e de novas estratégias para a indução de tolerância ao FVIII, que tenham maior eficiência e melhor custo benefício
Abstract: The main problems related to the treatment of hemophilia A patients are linked to the use of therapeutic factor VIII (FVIII). First, the development of neutralizing antibodies against FVIII (inhibitors), and second development of anaphylactic reactions, which are rare, however potencialy severe. The knowledge about the immunoglobulin isotypes associated with these two clinical situations is still limited.The aim of this project was to evaluate the characteristics of the humoral immune response in patients with hemophilia A who have inhibitors and/or allergic reaction to FVIII. For these analyzes three methods were used (1) inhibitory anti-FVIII antibodies assay by Bethesda-Nijmegen (2) immunoglobulins isotype ELISA assay for anti-FVIII IgG subclasses, IgM and IgE and (3) cytokines assay by BDTM Cytometric bead array (BD CBA®) multiplex method. This project was divided in three studies. In the first study, we analyzed samples from 25 Brazilian hemophilia A patients with 44% African-descents. All patients received exclusively replacement therapy with plasma-derived (pdFVIII) concentrates, and bypassing agents after the development of inhibitors. Five patients from this group were followed for a longitudinal analysis in a period up to three years. In the second study, 4 hemophilia A patients with inhibitor were evaluated also in longitudinal analyses, during the induction of immunotolerance (ITI) treatment for the eradication of the inhibitor. The third study included the evaluation of the incidence of allergic reaction among hemophilia A patients. Three out of 322 patients (0.9%) had allergic reaction after exclusively exposure to pdFVIII during the last fifteen years in our center. The results of these studies demonstrated that IgG4 subclass is the main immunoglobulin involved in the modulation of the inhibitory antibodies, while IgG1 is associated with low-titer inhibitors. During the ITI protocol, the anti- inflammatory interleukins, IL-4 and IL-6 decreased following the IgG4 reduction among the patients that achieved success in the ITI treatment. In addition, during the ITI protocol it was observed a polarized Th1 immune response after the complete success achievement. In the context of allergic reaction, only one out of three patients presented IgE reactivity that was exclusively to pdFVIII, and the assay IgE anti-rFVIII (anti-recombinant FVIII) was negative, confirming that the reativity was not specific to FVIII. The understanding of the humoral immune response in hemophilia A patients, including the role of IgG4 and IgG1 in the mechanisms involving the presence and eradication of inhibitors, and the participation of IgE in allergic reaction, allows to better understand the established concepts of the mechanisms involved in these two situations. This may help the development of less immunogenic new products and new strategies for induction of tolerance to FVIII, with higher efficiency and best value
Mestrado
Clinica Medica
Mestra em Clínica Médica

A L-arginina é reconhecida como um nutriente de fundamental importância na resposta imune, apesar de seus efeitos serem, por vezes, considerados inconstantes. O autoimplante esplênico tem sido proposto como alternativa à esplenectomia total isolada, mas existem preocupações quanto à eficácia do restabelecimento da resposta imune, haja vista que o paciente pode permanecer com risco aumentado de desenvolvimento de infecção fulminante pós esplenectomia, mesmo após a regeneração morfológica do órgão. O objetivo deste estudo foi avaliar a participação da suplementação dietética com L-arginina em subpopulações linfocitárias no sangue, no baço e nos autoimplantes esplênicos de ratos submetidos a esplenectomia isolada ou combinada com autoimplante esplênico. Foram utilizados 42 ratos Sprague-Dawley machos, randomicamente distribuídos em seis grupos: 1 Controle operação simulada; 2 esplenectomia total; 3 esplenectomia total combinada com autoimplante esplênico; 4 Controle operação simulada, com suplementação de L-arginina; 5 esplenectomia total, com suplementação de L-arginina; e 6 esplenectomia total combinada com autoimplante esplênico, com suplementação de L-arginina. Os animais dos grupos 4, 5 e 6 receberam suplementação de L-arginina, uma vez ao dia, durante 15 dias anteriores a coleta sangüínea realizada imediatamente antes dos procedimentos operatórios (semanas 0 e 12). A dose utilizada foi de 1,0 g/kg/dia, administrada por via intragástrica em bolus. As avaliações foram realizadas por meio de hemograma e citometria de fluxo. A análise estatística utilizou testes paramétricos e nãoparamétricos, sendo p<0,05 considerado para a rejeição da hipótese nula. A suplementação com L-arginina acarretou elevação da contagem relativa e absoluta de neutrófilos periféricos, 12 semanas após a realização de esplenectomia total combinada com autoimplante esplênico. A esplenectomia total ocasionou diminuição da contagem relativa de linfócitos T totais, T CD4+ e T CD8β no sangue, mas a suplementação dietética com L-arginina evitou a diminuição do percentual de células T totais e T CD8β no sangue dos animais submetidos a autoimplante esplênico. Tanto a realização de autoimplante esplênico como a suplementação de L-arginina previnem a diminuição da subpopulação de linfócitos T CD4+ no sangue periférico, fato que usualmente ocorre após realização de esplenectomia total. Houve maior proliferação de células brancas / g de tecido nos autoimplante esplênico dos animais suplementados, porém a suplementação não influenciou a contagem de linfócitos T, T CD4+ e B de zona marginal de baço. A suplementação do aminoácido L-arginina após a realização de esplenectomia total combinada com autoimplante esplênico em ratos foi capaz de reverter alterações observadas em algumas das subpopulações linfocitárias, ocasionadas pela esplenectomia.
L-arginine is recognized as a nutrient of fundamental importance in immune response, although its effects are sometimes considered unstable. The splenic autoimplants has been proposed as an alternative to total splenectomy isolated, but there are concerns about the effectiveness of the restoration of the immune response, considering that the patient can remain at increased risk of developing overwhelming postsplenectomy infection, even after morphological regeneration of the organ. The aim of this study was to determine the role of dietary supplementation with L-arginine in lymphocyte subsets in blood, spleen, and splenic auto-transplantation in rats subjected to total splenectomy alone or in combination with splenic autotransplantation. Forty two male Sprague-Dawley rats, were randomly divided into six groups: 1 - Control sham operation, 2 total splenectomy 3 total splenectomy combined with splenic auto-implants, 4 - Control - sham operation, with L-arginine supplementation, 5 total splenectomy, supplemented with L-arginine, and 6 total splenectomy combined with splenic auto-implants, supplemented with L-arginine. Animals in groups 4, 5 and 6 were supplemented with L-arginine, once daily for 15 days before blood sample was collected immediately before the operative procedures (weeks 0 and 12). The dose was 1.0 g / kg / day administered by intragastric bolus. The laboratory evaluations were made by blood count and flow cytometry. Statistical analysis used parametric tests and nonparametric, p<0.05 was considered to reject the null hypothesis. Supplementation with L-arginine led to increase in relative and absolute count of peripheral neutrophils, 12 weeks after completion of total splenectomy combined with splenic auto-implants. Total splenectomy caused a decrease in relative count of T lymphocytes, CD4+ and CD8β in blood, but dietary supplementation with L-arginine prevented the decrease in the percentage of total T cells and CD8β in the blood of animals subjected to splenic auto-transplantation. Both the completion of splenic auto-implants and the L-arginine supplementation may prevent the decrease of the subpopulation of CD4+ T cells in peripheral blood, a fact that usually occurs after completion of total splenectomy. There was a greater proliferation of white blood cells / g of tissue in the splenic autoimplants supplemented animals, but supplementation did not influence the T lymphocyte counts, CD4+ T and B splenic marginal zone. Supplementation of Larginine after performing total splenectomy combined with splenic autotransplantation in rats was able to reverse some of the changes observed in lymphocyte subsets, caused by splenectomy.

Orientador: Hyun Mo Yang
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Matematica, Estatistica e Computação Cientifica
Made available in DSpace on 2018-08-15T07:14:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_LiciaSilva_M.pdf: 2109455 bytes, checksum: 069de481ab0344fa7d803510e59bfd4a (MD5) Previous issue date: 2010
Resumo: A ação da resposta imunológica na infecção de Trypanosoma cruzi envolve dois mecanismos: um que resulta na produçao de anticorpos específicos contra antígenos do parasita e outro correponde a resposta imunológica celular com atividade citotoxica, que mata as celulas infectadas ou aqueles que expressam antígeno parasitario pela acao de linfócitos T citotóxicos. Com o objetivo de abordar o processo de infeccao por Trypanosoma cruzi e o mecanismo de delimitacao no organismo do hospedeiro promovida pelo sistema imunologico, dois modelos matematicos da interacao entre sistema imune e Trypanosoma cruzi são apresentadas. Apesar da simplicidade da dinamica das populacoes isoladas de organismos patogenicos e das celulas, a descriçao da interacao entre eles se torna altamente complexo. Assim, apresentamos o desenvolvimento de dois modelos simplificados pela necessidade de anaílise quantitativa das respostas humoral e celular
Abstract: The action of the immune response in the infection of Trypanosoma cruzi involves two mechanisms: one that results in the production of specific antibodies against antigens of the parasite and the cellular immune response with cytotoxic activity, which kills infected cells or those expressing antigen parasitic by the action of cytotoxic T lymphocytes. Aiming to address the process of infection by Trypanosoma cruzi and the mechanism of delimitation in the organism of the host promoted by immune system, two mathematical models of the interaction between system immune and Trypanosoma cruzi are presented. Despite of the simplicity of the dynamic of the isolated populations of pathogen and the cells, the description of the interaction of them becomes highly complex. Hence, we present the development of two simplified models by the necessity of quantitative analysis of humoral e cell responses
Mestrado
Biomatematica
Mestre em Matemática Aplicada

Orientador: Glaucia Maria Pastore
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
Made available in DSpace on 2018-08-10T04:17:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lemos_AdrianeCristinaGarcia_M.pdf: 3126675 bytes, checksum: d4e933e5a55a5976601fb2fd461ad4cb (MD5) Previous issue date: 2008
Resumo: Os prebióticos são alimentos indigeríveis, porém fermentáveis, que afetam o hospedeiro por estimulação seletiva do crescimento e atividade de uma espécie de bactérias ou um número limitado de bactérias no cólon. De todos os prebióticos disponíveis, os únicos que possuem estudos para serem classificados como componentes ativos de alimentos funcionais são os frutooligossacarídeos (FOS), inulina e o galactooligossacarídeos (GOS). Devido à sua estrutura química são fermentados no cólon por bactérias endógenas para substratos metabólicos e energéticos e promove melhoria das funções intestinais por meio do estímulo ao crescimento de bactérias benéficas, resultando em efeitos específicos sobre a fisiologia gastrointestinal, biodisponibilidade de minerais, sistema imune, gênese de tumores e regulação do colesterol sérico. No momento pouco é conhecido sobre o efeito do FOS no desenvolvimento de órgãos linfóides ou os mecanismos moleculares de sua ação na resposta imunológica. O objetivo do presente estudo é investigar o efeito da suplementação de FOS sobre o sistema imunológico em ratos. Para o desenvolvimento deste trabalho, foram utilizados 32 ratos machos, adultos jovens, da linhagem Wistar. Os animais foram alimentados com ração balanceada padrão para roedores (Purina) e água ¿ad libidum¿, mantidos em gaiolas à temperatura ambiente de 25ºC e foto período de 12 horas de claro e 12 de escuro. Durante o ensaio biológico os animais foram divididos em 4 grupos (n=8), o suplemento foi administrado diariamente por 21 e 42 dias por gavagem, nas diferentes concentrações (0, 50, 100 e 150 mg/kg). Ao final do período experimental os animais foram anestesiados e as amostras de sangue (5ml) coletadas por punção cardíaca, centrifugadas por 15 minutos, sendo o soro sanguíneo separado. Os órgãos linfóides (timo, baço) foram removidos e pesados. Todos os procedimentos experimentais foram previamente aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Estadual de Campinas. O soro coletado foi mantido a temperatura de 5°C e encaminhado ao laboratório de Bioquímica da Universidade do Sagrado Coração (Bauru) para a quantificação das imunoglobulinas IgA, IgG e IgM através da técnica de nefelometria. Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM) e submetidos a analise de variância (ANOVA) As comparações entre grupos foram realizadas empregando-se o teste Tukey. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas para p<0,05. O efeito da suplementação dietética com FOS na concentração de 100 e 150 mg/kg aumentou (p <0,05) as concentrações no soro das Imunoglobulinas IgA, IgG e IgM. Em ambos os períodos de 21 e 42 dias a suplementação dietética com 50 mg/Kg não aumentam (p>0,05) as concentrações no soro de imunoglobulinas. A suplementação dietética com 100 mg/Kg e 150 mg/kg promoveu um aumento (p <0,05) nas concentrações no soro de imunoglobulinas durantes os 21 e 42 dias de suplementação. A Suplementação com FOS não promoveu o aumento (p>0,05) no desenvolvimento dos órgãos linfóides. Os animais que foram suplementados com 100 e 150 mg/kg apresentaram um ganho de peso estatisticamente significativo (p<0,05) quando comparados com grupo controle. Com os resultados do presente estudo pode se concluir que o FOS melhorou a resposta imune em ratos, por modulação positiva da resposta imune
Abstract: The prebiotics are non-digestible foods, however fermented, they affect the host by selectively stimulating the growth and/or activity of one of a limited number of bacteria in the colon. From all the available prebiotics, the only ones that possess enough studies of activity are the Fructooligosaccharides (FOS), inulin and galactooligosaccharides. Due to their chemical structure, they are fermented in the colon by endogenous bacterias to metabolic and energy substrata and they promote improvement of the intestinal functions by inducing the growth of beneficial bacterias, resulting in specific effects on the gastrointestinal physiology, mineral availability, immune system, genesis of tumors and regulation of the Serum cholesterol. At present, little is known about the effect of FOS on the development of lymphoid organs or the molecular mechanisms of it's action on the immune response. The objective of this study was to determine the effects of supplementation with FOS on immune system in rats. For the development of this work, 32 male Wister rats were used, young adults, of the lineage Wistar. The animals were fed with standard food for rodents (Purina) and water ¿ad libitum¿, maintained in cages at temperature of 25ºC and picture period of 12 hours of light and 12 of darkness. During biological assays the animals were divided into 4 groups (n=8), the supplement was administered daily by 21 and 42 days by gavage, in different concentrations (0, 50, 100 and 150 mg/kg). At the end of the experimental period the animals were anesthetized and the samples of blood (5ml) collected by heart puncture, centrifuged by 15 minutes, being the separate sanguine serum. The llymphoid organs (thymus, spleen) they were removed and wighted. All the experimental procedures were previously approved for the Committee of ethical in Animal Research of the State University of Campinas. The collected serum was maintained at 5°C and direc ted to the laboratory of Biochemistry of the University of the Sacred Heart (Bauru) for the quantification of imunoglobulins IgA, IgG and IgM following the nefelometria technique. The data were expressed as average ± standard deviation of the average (SD) and submitted to analyzes of variance (ANOVA). The comparisons among groups were accomplished Tukey test. The differences were considered statistically significative for p <0,05. The effect of dietary supplementation with FOS in the concentration of 100 to 150 mg/kg increased (p<0,05) on serum concentrations of Imunoglobulins IgA, IgG e IgM. In both of periods 21 and 42 day, dietary supplementation wich 50 mg/Kg did not increase (p>0,05) serum concentrations of imunoglobulins, Dietary supplementation with 100 mg/Kg e 150 mg/kg resulted in higher (p <0,05) serum concentration of imunoglobulins and 21 and 42 day. The suplementation with FOS don¿t increase (p>0,05) lymphoid organ development. The animals that were suplementation with 100 and 150 mg/kg presented an weight gain statistically significant (p <0,05) when compared with control group. The results of the present study it may concluded that FOS can improve immune response in rats, Through positive modulation of the immune response
Mestrado
Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Margareth Castro Ozelo
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Made available in DSpace on 2018-08-15T17:29:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_Andreydos_D.pdf: 4770033 bytes, checksum: 92cd7a4adf25e169140e6fbbb68fe9d2 (MD5) Previous issue date: 2010
Resumo: Uma complicação decorrente do tratamento da hemofilia é a formação de anticorpos neutralizadores da atividade coagulante do fator VIII ou IX (inibidores). Diversos fatores estão relacionados com o desenvolvimento desses inibidores em indivíduos com hemofilia, incluindo fatores genéticos e ambientais. Entre os fatores genéticos, a mutação associada ao diagnóstico da hemofilia é um fator de risco bem documentado. Recentemente foi observada a maior ocorrência de inibidores em indivíduos da etnia negra. O objetivo deste trabalho foi analisar os aspectos genéticos e não genéticos envolvidos no desenvolvimento de inibidores. Foram incluídos nesse estudo 411 pacientes hemofílicos, sendo 321 com hemofilia A (HA) (238 famílias) e 99 com hemofilia B (HB) (59 famílias). A presença de inibidores foi constatada apenas entre os pacientes HA graves. Do total de 220 HA graves desse estudo, 46 (20,9%) apresentaram inibidor detectado em pelo menos uma ocasião após sua inclusão no estudo. Mutações consideradas de alto-risco para o desenvolvimento de inibidores foram identificadas em 125/220 pacientes HA graves (58,8%), e 33 deles desenvolveram inibidores (26,4%). Considerando o grupo étnico de acordo com traços físicos e ancestralidade, 38% dos pacientes HA graves foram classificados como negros. A incidência de inibidores foi maior nesse grupo de pacientes (31% do total de pacientes HA graves classificados como negros) quando comparada aos pacientes caucasóides (20% do total de pacientes HA graves classificados como caucasóides). Recentemente, foi observado que a maior incidência de inibidores em uma população norte-americana de pacientes com HA, estava relacionada com a presença de determinados haplótipos no gene do fator VIII. Esta observação poderia ser explicada pelo fato dos as proteínas expressas pelos haplótipos que aparecem exclusivamente entre a população negra (denominados H3 e H4), estarem ausentes nos concentrados de fator VIII recombinantes utilizados rotineiramente no tratamento desses pacientes. Em nossa análise a presença desses haplótipos não está relacionada com a maior freqüência de inibidor na população negra desse estudo. Além disso, a distribuição dos diferentes haplótipos do gene do fator VIII, classificados de H1 a H6, foi distinta entre todos os grupos étnicos brasileiros e norte-americanos. Essa observação pode ser explicada pela origem distinta entre os negros que imigraram da África para o Brasil e para a América do Norte, assim como o alto índice de miscigenação de nossa população. Em outra fase desse estudo, foi realizada a análise comparativa da expressão gênica a partir de amostras de RNA mensageiro (RNAm) extraídas em pool leucocitário de pacientes com HA grave, com ou sem a presença de inibidores. Na avaliação que incluiu numa primeira análise pacientes de uma mesma família discordante para a presença de inibidor e, em uma segunda fase, indivíduos não relacionados, foram observados 50 genes mais expressos e 16 genes menos expressos em pacientes com inibidor em comparação aos sem inibidor. Dentre esses genes foram selecionados dez, levando-se em conta sua participação na resposta imune ou sua correlação prévia com o desenvolvimento de inibidores em outros estudos. Pela técnica de PCR em tempo real, observou-se que os genes da interleucina 8 (IL-8) e da cistatina F (CST7) demonstraram ser mais expressos em pacientes com inibidor, enquanto que o gene da interleucina 10 (IL-10) foi menos expresso nesse grupo de pacientes. Dessa forma, nossos resultados fortalecem a idéia de que o mecanismo de desenvolvimento de inibidores em hemofilia é complexo e ainda não totalmente esclarecido e que existe um grande envolvimento de diversos genes relacionados com sistema imune na formação desses inibidores. O estudo em diferentes populações é uma importante etapa para o entendimento dos fatores de risco para o desenvolvimento de inibidores. Esse foi o primeiro trabalho realizado no Brasil incluindo pacientes de diversas regiões e analisando simultaneamente diferentes fatores e seu envolvimento com o desenvolvimento de inibidores. A determinação desses fatores de risco ajudará no futuro a determinar um tratamento diferenciado para o controle e sobretudo prevenção do desenvolvimento de inibidores
Abstract: The most serious complication of the treatment of hemophilia is the development of neutralizing antibodies to coagulation activity of factor VIII or IX (inhibitors). Several risk factors are related to the development of these inhibitors in patients with hemophilia, including genetic and environmental factors. Among genetic factors, the mutation associated with the diagnosis of hemophilia is a risk factor well documented. Recently, it was observed a higher incidence of inhibitors in African ancestry patients. The aim of this study was to analyze the genetic and non-genetic factors involved in the development of inhibitors. The study included 411 hemophilia patients, of which 321 with hemophilia A (HA) and 99 with hemophilia B (HB), belonging to a total of 238 and 59 families, respectively. The inhibitors were observed only in severe HA patients. From the 220 severe HA, 46 (20.9%) had inhibitor. The high risk mutation for the development of inhibitors were identified in 125 / 220 (58.8 %) severe HA patients, and 33 (26.4 %) of them developed inhibitors. Considering the ethnic group according to physical traits and ancestry, 38 % of severe HA patients were classified as black. The incidence of inhibitors is higher in this group of patients (31%) when compared to Caucasian patients (20%). The higher risk of inhibitor among African-Brazilians, could not be explained by the presence of the distinct factor VIII haplotypes, such as H3 and H4, as suggested in previous study. In fact, the prevalence rates of these haplotypes were distinct between Brazilians and North Americans, probably due to the fact that migrations of blacks to Brazil and to North America were originated from different geographic areas of Africa. In another phase of this study, we performed a comparative analysis of gene expression in samples of messenger RNA (mRNA) extracted from leukocytes of inhibitor and non-inhibitor patients with severe HA was performed. The evaluation consisted of an initial analysis of severe HA patients siblings, or from the same family, discordant for inhibitor development and in a second phase a group of unrelated individuals. Using the bioarrays technology 50 genes were upregulated and 16 were downregulated in inhibitor patients compared with non-inhibitor patients. Ten genes were selected among them, which are involved in immune response and were related to inhibitors development in other studies. It was observed by real time PCR that the genes for interleukin 8 (IL-8) and cystatin F (CST7) were upregulated and for interleukin 10 (IL-10) was downregulated in inhibitor patients. In conclusion, our results strengthen the idea that the mechanism of inhibitor development in hemophilia is complex, not clear and there is a large involvement of several genes related to the immune system in the development of these inhibitors. The study in different populations is important to understand the risk factors for the development of inhibitors. This is the first work in Brazil, to study patients from various regions and to performe analysis of different factors and their involvement in the development of inhibitors. The determination of these risk factors will help in the future to determine differential treatment for the control and in particular, for preventing the development of inhibitors
Doutorado
Clinica Medica
Doutor em Clínica Médica

A leptospirose é uma zoonose causada por leptospiras patogênicas. Para estabelecer a infecção, estas bactérias desenvolveram estratégias de escape ao sistema complemento. Neste trabalho demonstramos que o sobrenadante de cultura de leptospiras patogênicas é capaz de inibir as três vias do complemento. Observamos que esse sobrenadante possui atividade proteolítica sobre C3, C3b e iC3b, além do FB (via alternativa), C2 e C4b (via clássica e das lectinas). As proteínas C3, C4, C2 e FB também foram clivadas quando soro humano normal (SHN) foi utilizado como fonte de complemento. Demonstramos que as proteases atuam em conjunto com os reguladores do hospedeiro Fator I e Fator H na clivagem de C3b. As clivagens foram inibidas pela 1,10-fenantrolina, sugerindo a participação de metaloproteases. Metaloproteases de leptospira da família das termolisinas foram produzidas como proteínas recombinantes e clivaram C3 no SHN. Concluímos que proteases de leptospiras patogênicas podem desativar moléculas do complemento e são potencias alvos para novas terapias em leptospirose.
Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic Leptospira. To establish the infection, these bacteria have developed strategies to escape the complement system. In this work, we demonstrate that culture supernatant from pathogenic Leptospira is capable of inhibiting the three complement pathways. We observe that this supernatant possess proteolytic activity under C3, C3b and iC3b, FB (alternative pathway), C2 and C4b (classical and lectin pathways). The proteins C3, C4, C2 and FB were also cleaved when normal human serum (NHS) was used as a source of complement. We demonstrate that these proteases act together with the host regulators Factor I and Factor H in C3b cleavage. The cleavages were inhibited by 1,10-phenanthroline, suggesting the involvement of metalloproteinases. Leptospira metalloproteinases from the thermolysin family were produced as recombinant proteins and cleaved C3 in NHS. We concluded that proteases from pathogenic Leptospira can inactivate complement molecules and are potential targets for new therapies in leptospirosis.

Aquesta tesi (mitjançant cinc estudis) va ser destinada a investigar factors que tenen un efecte potencial sobre la salut materna durant la gestació i el postpart temprà, tenint en compte la melatonina com una possible millora de la salut i el rendiment de les vaques. En el primer estudi, els factors que afecten els leucòcits perifèrics de la mare, com un indicador d'estat immune, entre els dies 90-210 de gestació van ser, la interacció entre l'edat de la vaca i Neospora caninum, l'estació, la gestació gemelar, la producció de llet i el temps de mostreig. Seguint el sistema immune matern més enllà en la seva fase més crítica, el segon i el tercer estudis resumeixen els diferents factors que afecten el sistema immunològic de la mare des del dia 220 de gestació fins a 30 dies postpart. El toro d'IA, les glicoproteïnes associades a la gestació (PAG), la interacció N. caninum-C. burnetii, l'estació, l'edat, la gestació gemelar i el temps de mostreig afectaven significativament els leucòcits materns. L'objectiu del quart estudi va ser avaluar la dosi adequada de la melatonina, per provar els seus possibles efectes en la millora de la salut de la mare durant el peripart i la dosi de 332 mg / kg era la més adequada. Finalment, els possibles efectes de la melatonina en millorar la salut materna durant el peripart van ser avaluats en el cinquè estudi. Les vaques tractades amb melatonina tenien menys probabilitat de ser repetidores i de perdre la gestació, i, per tant, tenien menys dies oberts.
Esta tesis (mediante cinco estudios) fue destinada a investigar factores que tienen un efecto potencial sobre la salud materna durante la gestación y el posparto temprano, teniendo en cuenta la melatonina como una posible mejora de la salud y el rendimiento de las vacas. En el primer estudio, los factores que afectan a los leucocitos periféricos de la madre, como un indicador de estado inmune, entre los días 90-210 de gestaion fueron, la interacción entre la edad de la vaca y Neospora caninum, la estación, la gestación gemelar, la producción de leche y el tiempo de muestreo. Siguiendo el sistema inmune materno más allá en su fase más crítica, el segundo y el tercer estudios resumen los diferentes factores que afectan al sistema inmunológico de la madre desde el día 220 de gestación hasta 30 días posparto. El toro de IA, las glicoproteínas asociadas a la gestación (PAG), la interacción N. caninum-C. burnetii, la estación, la edad, la gestación gemelar y el tiempo de muestreo afectaban significativamente los leucocitos maternos. El objetivo del cuarto estudio fue evaluar la dosis adecuada de la melatonina, para probar sus posibles efectos en la mejora de la salud de la madre durante el periparto y la dosis de 332 mg/kg era la más adecuada. Por último, los posibles efectos de la melatonina en mejorar la salud materna durante el periparto fueron evaluados en el quinto estudio. Las vacas tratadas con melatonina tenian menos probabilidad de ser repetidoras y de perder la gestación, y, por lo tanto, tenian menos días abiertos.
This thesis (by means of five studies) aimed at investigating factors that have potential effect on the maternal health during gestation and the early postpartum, plus considering melatonin for improving cows’ health and performance. In the first study, factors affecting maternal peripheral leukocytes, as an indicator to immune status, between Days 90-210 of gestaion were, the interaction between cows’ age and Neospora caninum-seropositivity, season, twin-pregnancy, milk production and time. Following the maternal immune system further in its most critical phase, the second and third studies summarize different factors affecting maternal immune system from gestation Day 220 till 30 days postpartum. Artificial inseminating bull, plasma pregnancy associated glycoproteins (PAGs), N. caninum-C. burnetii interaction, season, age, twin-pregnancy and time were found to significantly affect maternal peripheral leukocytes during that stage. The aim of the forth study was to evaluate proper melatonin dose as subcutaneous implants, for testing its possible effects in enhancing maternal health during the peripartum. Melatonin dose of 332 μg/kg was the most adequate. Finally, possible melatonin effects on enhancing maternal health during the peripartum were evaluated in the fifth study. Melatonin treated cows were found to have less likelihood of repeat breeding syndrome and pregnancy loss, and, therefore, less days open.

La producción acuícola en Europa está dominada por un pequeño grupo de especies, como salmón, trucha, carpa, lubina, dorada, que a su vez limita el número de productos acuícolas disponibles en el mercado. Estas especies han experimentado algunos problemas en relación al precio de mercado que menudo se encuentra cerca o por debajo del coste mínimo de producción, como consecuencia de ello el crecimiento de la acuicultura en la UE se ha visto limitado, no alcanzando las cantidades previstas a la vez que se han ido incrementando las importaciones desde otros países. Sin embargo, un sistema sostenible basado en la incorporación de nuevas especies podría mermar en cierto modo gran parte del problema. Actualmente, el nivel de concienciación en la industria de la acuicultura de investigar la biología de nuevas especies contribuye a fortalecer la sostenibilidad económica, lo que trae como consecuencia un mayor interés por buscar nuevas especies con ciertas características como: rápido crecimiento, facilidad de cultivo, adaptabilidad a grandes volúmenes de cultivo y alta productividad, que ofrezcan excelentes oportunidades para el procesamiento y desarrollo de valor añadido. El propósito de este trabajo, es el estudio de una especies considerada prometedora para la acuicultura mediterránea, perteneciente a la familia Sciaenidae y conocida comúnmente como corvina (Argyrososmus regius). Esta especie se caracteriza por su alta tasa de crecimiento (1 kg año-1) y su buen índice de conversión entre otras. Sin embargo, como toda especie nueva cuenta con algunos cuello de botellas presentes durante sus primeras etapas de desarrollo que necesitan ser resueltos. Así los objetivos generales de esta tesis van dirigidos a estudiar los siguientes aspectos: (1) morfología y desarrollo funcional del sistema digestivo de la larva, basado en el análisis histológico y actividad enzimática durante su fase de crecimiento, (2) estudio del efecto de diferentes estrategias de alimentación temprana de alimento artificial y reducción del uso de nauplios de Artemia (destete temprano) a un 50% de la cantidad utilizada en protocolos estándar de producción, evaluando los efectos en el desarrollo, particularmente en crecimiento, supervivencia, digestión y deformaciones. Dos experimentos fueron diseñados con diferentes protocolos de alimentación orientados especialmente en la incorporación temprana de alimento artificial, evaluando su efecto en la morfología y desarrollo funcional, mediante marcadores enzimáticos que reflejan la madurez del tracto digestivo. Sin embargo ciertos problemas inherentes a la especie particularmente, su conducta caníbal durante la fase de post-flexión marcaron efectos sobre la supervivencia, no obstante el destete temprano no tuvo mayor influencia en el desarrollo de deformaciones a nivel de estructuras esqueléticas. En este sentido se procedió al (3) estudio de los requerimientos nutricionales durante el desarrollo larvario, especialmente en la composición de ácidos grasos, con el intento de examinar los efectos sobre el crecimiento y supervivencia mediante diferentes composición de ácidos grasos en larvas, específicamente contenido de DHA y relación DHA/EPA, así como también, evaluar su capacidad de poder elongar y desaturar ácidos grasos de sus precursores usando una emulsión con bajo contenido de DHA (aceite Hemp). Dos experimentos fueron diseñados durante el cultivo larvario, utilizando varios contenidos de DHA (alto, medio, bajo) demostrado que los requerimientos en cuantos ácidos grados (DHA) son específicos a nivel de especie, además de evidenciar la incapacidad de la larva por elongar y desaturar cuando sus precursores son ofrecidos en el alimento vivo. El sistema inmune es otros de los aspectos de gran importancia durante la cría larvaria ya que por lo general el éxito de un cultivo larvario se basa no solo en la nutrición sino también en los mecanismos de defensa con que cuenta la larva frente a innumerable agentes patógenos presentes en el medio de cultivo. La larva durante su desarrollo depende de una serie de importantes moléculas de protección que hacen frente a potenciales patógenos hasta que su sistema adaptativo o específico está completamente maduro. Particularmente, la mayor parte de la mortalidad durante un cultivo peces se presenta durante las etapas más críticas de crecimiento, limitando la producción de juveniles. En este sentido, para evaluar el tiempo en que la larva es más susceptible a factores externos, y su capacidad de afrontar una respuesta inmune, (4) se estudió la ontogenia del sistema inmune innato durante el desarrollo larvario, enfocado en la organogénesis de los principales órganos linfoides tales como el timo, el riñón y el bazo, además de tejidos linfoides asociados a las mucosas del intestino y branquias. Para este propósito se tomaron muestras de larvas en los periodos más importantes del crecimiento, considerando también las fases criticas de cambio en el desarrollo (metamorfosis), para este fin, se utilizaron técnicas histológicas mediante tinciones específicas para detectar los principales cambios a nivel de composición y estructuras en estos órganos y tejidos. A. regius, presenta patrones similares a la mayoría de teleósteos durante la organogénesis, pero el tiempo de aparición de estas estructuras durante su crecimiento es específico. Además y para completar este estudio del desarrollo del sistema inmune (5) se analizó la expresión de ciertos genes relacionados con el sistema inmune inespecífico con el propósito de identificar posibles marcadores de inmunidad durante el crecimiento, particularmente su presencia durante periodos tempranos de desarrollo así como cambios a nivel de expresión en larvas y tejidos de juveniles, además, evaluar si la expresión relativa de estos genes puede estar correlacionada con cambios morfológicos observados por la histología. Los resultados mostraron que estos genes pueden detectarse durante la etapa temprana de desarrollo y sus perfiles de expresión pueden estar influenciados por la dieta durante el cultivo.
Aquaculture production in Europe is dominated by a small group of species, such as salmon, trout, carp, seabass, seabream that limits the number of aquaculture products available on the market, and to some extent, the geographic regions where aquaculture can be done profitably. The market price of these species is often close to or below the minimum cost of production, which has consequent negative influences on the growth of aquaculture in the EU. A sustainable system based on the incorporation of new species could, to a certain extent, reduce the problem by providing a diversified market with increased geographic dispersal of production sites that can reduce transport costs form “farm to table”. Thus, in order to increase aquaculture products in the market new species have been selected taking in account characteristics such as rapid growth, ease of cultivation, adaptability to large volumes under intensive rearing, large body size to facilitate automated post-harvest processing and development of value-added consumer products. The purpose of this thesis is to study a species considered promising for Mediterranean aquaculture belonging to the family Sciaenidae and commonly known as meagre (Argyrososmus regius). This species is characterized by its high growth rate (1 kg year-1) and good feed conversion rate. However, as other new species, meagre has some bottlenecks present during its early stages of development that need to be solved. Thus, the general objectives of this thesis aims to evaluate the following aspects: (1) morphology and functional development of the digestive system, based on histological and enzymatic activity analyses, (2) study the effect of different strategies for early weaning onto artificial feed, reduce the use of Artemia to 50% of the amount used in standard production protocols, and evaluate the effects of these diets on development, digestion, growth, survival, and deformations. Two experiments were carried out using different feeding protocols designed for an early incorporation of artificial feed, then evaluate its effects on morphology and functional development using enzymatic markers that reflect the maturity of the digestive tract. Certain problems inherent to the species, in particular, their cannibalistic behavior during the post-flexion phase had effects on survival rate, although early weaning had no major influence on the presence of skeletal deformities. In this sense, we proceeded to the (3) study of fatty acid requirements during larval development (DHA -22:6n-3- and DHA/EPA ratio) in order to examine the effects of different live prey enrichments on larval growth and survival, and evaluate their ability to elongate and desaturate fatty acids from their precursors. Two experiments were designed during larval culture using high, medium and low content of DHA demonstrating that the fatty acids requirements (DHA) are species-specific. The use of hemp oil (rich in 18:3n-6 and 18:4n-3) served to demonstrate the inability of meagre larva to elongate and desaturate fatty acids even when the precursors are offered in the live food. The immune system is another aspect of great importance during larval rearing, since the success of larval culture is based not only in nutrition, but also on the defense mechanisms that the larva possess against potential pathogens present in the water. The larva depends on a suite of important protective molecules of the innate immune system that deal with potential pathogens until the adaptive or specific system is completely mature. Most of the mortality afflicting industrial aquaculture occurs during the critical stages larval growth, thus limiting the production of juveniles. In this sense, to evaluate the time in which the larva is more susceptible to external factors and its ability to cope with an immune response, we have studied (4) the ontogeny of the innate immune system during larval development, focused on the organogenesis of the major lymphoid organs (thymus, kidney, and spleen), and lymphoid tissues associated with mucosal gut and gills. For this purpose, larval samples were taken in several developmental periods including the critical change in development (metamorphosis) where rapid changes in growth require tissue modification and increased bioenergetic consumption. For this objective we have used histological techniques and specific stains to detect the main changes in composition and structures in these organs and tissues. A. regius shows similar patterns to most teleosts during organogenesis, but the time of appearance of these structures during their growth is species-specific. In addition, and to complete this study of the development of the immune system (5) the expression of certain genes related to the non-specific immune system was analyzed in order to identify possible markers of immunity during growth. Particularly, we wanted to determine the presence during early developmental periods of significant immune gene transcripts as well changes in expression level in larvae and juvenile tissues, and study whether the relative expression of these genes may be correlated to observed morphological changes seen by histology. The results indicated that the genes under study for this work can be detected during the early stages of development and we found indications that their expression profiles may be influenced by significant dietary changes made during the larval and early juvenile culture.

Em bovinos, o desenvolvimento embrionário pré implantacional depende das funções do endométrio bovino que tem suas funções mediadas por uma complexa interação da ação e dos efeitos dos hormônios esteroides ovarianos E2 e P4. Estes hormônios regulam a expressão gênica e controlam o ambiente uterino modulando, entre outros, a expressão de microRNAs e a rede de citocinas relacionadas ao sistema imune. Os objetivos do presente trabalho foram abordados em dois capítulos, sendo (I) comparar os efeitos dos distintos ambientes endócrinos peri-ovulatórios sobre a expressão de microRNAs (II) e na modulação do sistema IL1/TLR no endométrio bovino nos dias 4 e 7 após a indução da ovulação. Para isso, controlou-se farmacologicamente o crescimento do folículo objetivando induzir a ovulação de folículos de maior diâmetro (grupo folículo grande-CL grande, FG-CLG) ou de menor diâmetro (grupo folículo pequeno-CL Pequeno, FP-CLP). Vinte e duas vacas multíparas nelore, foram pré-sincronizadas, metade destes animais foram destinados para o grupo FG-CLG e receberam uma dose de prostaglandina F2α (PGF) e um dispositivo de progesterona, juntamente com benzoato de estradiol no D10. No momento da retirada dos dispositivos de progesterona (entre D1,75 e D2,5) todos os animas receberam uma dose de PGF. A ovulação foi induzida com acetato de buserelina (D0). O que diferiu entre os tratamentos foi que os animais do grupo FP-CLP não receberam uma dose de PGF no D10 e o momento da retirada dos dispositivos foi entre D1,25 e o D1,5. No capítulo I, o a expressão de microRNAs foi determinada por qPCR nos dias 4 e 7. Dos 90 microRNAs testados, 21 apresentaram se up-regulated e dois down-regulated no grupo FG-CLG (P<0.1) no D4. No D7, quatro microRNAs foram diferentemente expressos, sendo um up-regulated e três down-regulated no grupo FG-CLG (P<0.1) no D7. Para os microRNAs diferentemente expressos determinou-se mRNA-alvos preditos. Uma análise de ontologia demonstrou que os mRNAs-alvos apresentaram enriquecimento funcional na via dos receptores de hormônios esteroides, entre outras. No capítulo II, o sistema IL1/TLR foi avaliado quanto a abundância de transcriptos envolvidos neste sistema, do microRNA bta-mir-155 e das proteínas IL1β e IL1R1. A abundância relativa de mRNA apresentou diferença (P<0.1) na abundância dos mRNAs de IL1R1, TAB1 e FOXP3, das proteínas IL1β e IL1R1, sendo essas moléculas up-regulated no grupo FG-CLG. O microRNA bta-mir-155 foi down-regulated no grupo FG-CLG (P<0.1). Diante disto, pode-se concluir que o ambiente endócrino peri-ovulatório determina o perfil de expressão de microRNAs e modula o sistema IL1/TLR no endométrio bovino
In cattle, the pre implantation embryo development depends on the functions of the bovine endometrium that has its functions mediated by a complex interaction of action and the effects of ovarian steroid hormones E2 and P4. These hormones regulate gene expression and control the modulating uterine environment among others, the expression of microRNAs and the network of cytokines related to the immune system. The objectives of this study were discussed in two chapters, (I) to compare the effects of different peri-ovulatory endocrine environment on the expression of microRNAs (II) and modulation of the IL-1 system / TLR in bovine endometrium on days 4 and 7 after induction of ovulation. For this, it was controlled pharmacologically follicle growth aiming to induce ovulation of follicles larger diameter (great grand-CL follicle group, FG-CLG) or smaller in diameter (small-CL Small follicle group, FP-PLC). Twenty two nelore multiparous cows were pre-sync, half of these animals were used for the FG-NCG group and received a dose of F2á prostaglandin (PGF) and progesterone device along with oestradiol benzoate in D-10. Upon withdrawal of progesterone devices (between 1.75 and D-D-2,5) all animas received a dose of PGF. Ovulation was induced with buserelin acetate (D0). What differed between treatments was that animals FP-CLP group did not receive a dose of PGF in the D-10 and the time of removal of the devices was between D-1,25 and D-1.5. In Chapter I, the expression of microRNAs was determined by qPCR on 4 and 7. Of the 90 microRNAs tested, 21 showed was up-regulated and down-regulated in two FG-CLG group (P <0.1) in the D4. In D7 four microRNAs were differently expressed, one up-regulated and down-regulated in three FG-CLG group (P <0.1) at D7. For differently expressed microRNAs was determined predicted mRNA-target. An ontology analysis showed that the mRNA-targets had functional enrichment in via the steroid hormone receptors, among others. In Chapter II, the IL-1 / TLR system was evaluated as the abundance of transcripts involved in this system, the bta-mir-155 microRNA and IL1β and IL1R1 proteins. The relative abundance of mRNA was different (P <0.1) in the abundance of mRNAs IL1R1, TAB1 and FOXP3, the IL1β and IL1R1 proteins, and these up-regulated molecules in the FG-CLG group. The bta-mir-155 microRNA was down-regulated in the FG-CLG group (P <0.1). Given this, we can conclude that the peri-ovulatory endocrine milieu determines the profile of microRNA expression and modulates the IL1 / TLR system in bovine endometrium

Imunossenescência, termo que designa o envelhecimento do sistema imune, contribui com o aumento das infecções, doença autoimune, câncer e baixa eficiência das vacinações, favorecendo o aumento da morbi-mortalidade entre os indivíduos idosos. Dentre as mudanças, destacam-se as alterações no tamanho da subpopulação de célula T, com aumento de células de memória e diminuição de células naive; no padrão de secreção de citocinas, na capacidade de replicação das células e na produção de anticorpos, as quais culminam em um estado pró-inflamatório chamado \'inflamm-aging\' e uma capacidade diminuída para responder a novos antígenos. Além disto, o acúmulo de linfócitos T CD8+CD28- nos idosos também se correlaciona com uma diminuição do controle sobre a infecção. No entanto, há poucos relatos sobre o papel do exercício regular na prevenção ou tratamento de imunossenescência. O objetivo deste estudo foi verificar os efeitos da atividade física intensa e regular na imunossenescência de idosos. Foram selecionados 15 indivíduos idosos em treinamento intenso de corrida (meia maratona e/ou maratona há pelo menos 5 anos, TI), e 16 indivíduos idosos não praticantes de atividade física, NT. Todos os indivíduos eram do sexo masculino, com idade entre 65 a 85 anos, apresentavam auto percepção de saúde positiva e ausência de co-morbidades e/ou em tratamento com impacto significativo para o sistema imune. Foram avaliadas as subpopulações de células T (CD8+CD28+ e CD8+CD28-; CD4+ naive e de memória) em relação ao comprimento de seus telômeros, resposta proliferativa e marcadores de apoptose, síntese de citocinas (Th1/Th2); níveis séricos de citocinas inflamatórias; frequência das subpopulações (naive, memória central, memória efetora e terminalmente diferenciada) dos linfócitos T CD4+ e CD8+ no sangue periférico e a quantificação da produção de anticorpos anti-Influenza. Verificamos no grupo TI, em relação ao NT, aumento de células TME e diminuição de TEMRA; maior proliferação de linfócitos T CD4+ naive estimulados com mitógeno; maior comprimento do telômero em linfócitos T CD3+, T CD3+CD8+ e T CD3+CD8+CD28-, esta última considerada subpopulação associada à imunossenescência; preservação dos mecanismos anti-apoptóricos, verificado pelo aumento da expressão in vitro de Bcl-2 e redução de caspase-3 em células TCD4+ (memória e naive) e T CD8+ (senescentes e não senescentes) não estimuladas; parâmetros estes denotando uma provável melhor capacidade funcional de células T. Além disso, verificamos aumento da produção sérica de títulos de anticorpos anti-influenza pré e pós-vacinação, evidenciando possível papel adjuvante do exercício intenso na resposta vacinal. E finalmente, observamos equivalência entre os dois grupos com relação ao padrão de secreção de citocinas séricas e secretadas in vitro associadas com o Inflammaging. Os resultados evidenciaram que a prática da atividade física intensa e regular teria um efeito protetor contra alguns parâmetros associados à imunossenescência
Immunosenescence, the term used to designate the process of aging of the immune system, is associated with to the increased rate of infections, autoimmune diseases, cancer and low efficiency of vaccinations in elderly, favoring their increased morbidity and mortality. Immunosenescence is associated with changes in the size of the T cell subpopulation with increased proportion of memory T cells and decrease proportion of naive T cells, in the pattern of cytokine secretion, in cell replication capability and in antibody production, all of which culminate in a pro-inflammatory state called \"inflamm-aging\" and diminished capacity to responding to new antigens. In addition, the accumulation of CD8+CD28- lymphocytes in elderly also correlates with a decreased control of infections. However, there are few reports on the role of chronic regular exercise in the prevention or treatment of immunosenescence. The objective of this study was to investigate the effects of intense regular physical activity on immunosenescence of elderly men. We selected 15 elderly men with intensive training for at least the last 5 years (IT, participating in half marathon and/or marathon), and 16 elderly men not training, NT. They were 65-85 years and had self perception of positive health and lack of co-morbidities and/or treatment with significant impact on the immune system. T-cell subpopulations were assessed (CD8+CD28+ and CD8+CD28-; CD4+ naive and memory) with respect to telomere length, proliferative responses, apoptosis markers, cytokine synthesis (Th1/Th2); serum levels of inflammatory cytokines; distribution of the naive, central memory, effector memory, and terminally differentiated CD4+ and CD8+ lymphocyte subpopulations in peripheral blood, and anti-influenza antibodies production. We found in the IT group, compared with the NT, in the T-cell subsets, increased percentages of effector memory T-cells and decreased percentages of terminally differentiated T-cells; higher proliferation of naive CD4+T cells stimulated with mitogen; larger telomere length in TCD3+, TCD3+CD8+ and TCD3+CD8+CD28- cells (the latter subset being a marker of immunosenescence), preservation of the anti-apoptotic mechanisms, indicated by increased Bcl-2 expression and decreased caspase-3 expression in in vitro resting memory and naive CD4+ T-cell and in senescent and non-senescent CD8+ T-cells; all of which denote a potentially better T-cell functioning. There was also increased anti-influenza antibody titers pre and post-vaccination, indicating a possible adjuvant role of intense exercise in vaccine responses. Finally there was a similar pattern between the two groups in in vitro secreted and in serum cytokines associated with Inflamm-aging. The results showed that the practice of regular intense physical activity has a protective effect against some parameters associated with immunosenescence

Orientador: Adriano Mauro Cansian
Banca: Marcos Antonio Cavenaghi
Banca: Rafael Duarte Coelho dos Santos
Resumo: Os códigos maliciosos (malware) podem causar danos graves em sistemas de computação e dados. O mecanismo que o sistema imunológico humano utiliza para proteger e detectar os organismos que ameaçam o corpo humano demonstra ser eficiente e pode ser adaptado para a detecção de malware atuantes na Internet. Neste contexto, propõe-se no presente trabalho um sistema que realiza coleta distribuída, análise e detecção de programas maliciosos, sendo a detecção inspirada no sistema imunológico humano. Após a coleta de amostras de malware da Internet, as amostras são analisadas de forma dinâmica de modo a proporcionar rastros de execução em nível do sistema operacional e dos fluxos de rede que são usados para criar um modelo comportamental e para gerar uma assinatura de detecção. Essas assinaturas servem como entrada para o detector de malware e atuam como anticorpos no processo de detecção de antígenos realizado pelo sistema imunológico humano. Isso permite entender o ataque realizado pelo malware e auxilia nos processos de remoção de infecções
Abstract: Malicious programs (malware) can cause severe damages on computer systems and data. The mechanism that the human immune system uses to detect and protect from organisms that threaten the human body is efficient and can be adapted to detect malware attacks. In this context, we propose a system to perform malware distributed collection, analysis and detection, this last inspired by the human immune system. After collecting malware samples from Internet, they are dynamically analyzed so as to provide execution traces at the operating system level and network flows that are used to create a behavioral model and to generate a detection signature. Those signatures serve as input to a malware detector, acting as the antibodies in the antigen detection process performed by immune human system. This allows us to understand the malware attack and aids in the infection removal procedures
Mestre

Orientador: Renata de Oliveira Mattos-Graner
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Made available in DSpace on 2018-08-08T06:03:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nogueira_RucheleDias_D.pdf: 12321915 bytes, checksum: 624bf1e6309c440b0fb9bf9a2ed120f8 (MD5) Previous issue date: 2006
Resumo: Streptococcus mutans (SM) são os principais patógenos da cárie dental. Neste estudo exploramos a influência do sistema imune de mucosa na infecção inicial pelo SM em crianças altamente expostas a este microrganismo. Cento e dezenove crianças, com idade inicial entre 5 a 13 meses de idade foram analisadas no início do estudo (T0) e após 6 (T6), 12 (T12) e 18 (T18) meses, amostras bucais foram coletadas para determinação dos níveis de infecção por SM, através do cultivo em mitis salivarius ágar com bacitracina. Os níveis de IgA, IgA1 e IgM foram também determinados em amostras de saliva, através de ensaios de ELISA. Um subgrupo de 21 crianças infectadas por SM (entre T0 e T6) foram pareadas a outras 21 crianças da amostra sem níveis detectáveis de SM. As reações entre anticorpos IgA da saliva com antígenos (Ags) de SM foram comparadas entre estes subgrupos, através de ensaios de western blot. A intensidade das bandas reativas foi determinada através da densitometria e expressas como unidades arbitrárias (ua). A reatividade de IgA salivar com peptídeos derivados da seqüência da GbpB, preditos como regiões ligantes à MHC de classe II, foram também avaliados através de multiplex com o Luminex. Os níveis salivares de IgA aumentaram com a idade (de 82,4 a 823,4µg/ml), enquanto que os níveis de IgM mantiveram-se baixos durante todo o estudo (média:4,2-2,8 µg/ml). Os níveis de infecção por SM foram maiores em T6 (média:45 ufc/área) e uma forte resposta de IgA aos Ags de SM pôde ser detectada logo aos 6 meses de idade. A resposta de IgA anti-GbpB foi observada em 38% das 21 crianças infectadas por SM, enquanto que 73% dos pares não infectados apresentavam estes anticorpos (Qui-quadrado, p<0.03). Um pico de resposta de IgA a GbpB ocorreu durante a fase de maior desafio de infecção (T6). Não houve diferenças significativas nos padrões de reatividade de IgA aos diversos peptídeos de GbpB testados, entre os grupos de crianças infectadas e não infectadas por SM. Os resultados indicam que uma resposta complexa de IgA a SM pode ocorrer a partir dos 6 meses e que a especificidade de resposta a Ags envolvidos na virulência podem influenciar na susceptibilidade à infecção por SM. Nenhum dos peptídeos da GbpB correspondeu às intensidades de resposta à GbpB nativa observadas entre os pares de crianças estudados
Abstract: Mutans streptococci (MS) are the main pathogens of dental caries. In this study we explored the influence of the muccosal immune system in the initial colonization by MS in children highly exposed to this microorganism. A total of 119 children, who were of 5 to 13 months of age, were enrolled in this prospective study. MS levels of infection were determined in cultures on mitis salivarius agar with bacitracin at baseline (T0), 6 (T6), 12 (T12) and 18 months (T18)-of follow-up. Saliva samples were also collected at all phases of the study for determination of the levels of antibodies IgA, IgA1 and IgM in ELISA assays. A subset of 21 MS-infected early between T0 and T6 were matched to other 21children, but who were not MS-infected. Patterns of IgA antibody reactivity to MS Ags were compared between these 21 pairs through assays of western blot. Intensities of IgAreactive bands were determined densitometrically and were expressed as arbitrary unit (au). Reactivities of salivary IgA antibodies to peptides derived from the GbpB sequence, which were predicted as having affinity to MHC of class II molecules were evaluated in multiplex with the help of the Luminex technology. Levels of antibody IgA in saliva increased with age (82.4-823.35 µg/ml), while levels of IgM remained at low levels (mean:4.2-2.78 µg/ml). The highest levels of MS infection in the infected group were observed at T6 (mean:45 cfu/plate). Robust responses to SM antigens were detected in children as early as 6 months of age. Only 38% of early-infected children carried IgA-reative GbpB while this antigen was recognized by the majority (73%) of children that were not infected by these microorganisms (chi-square, p<0.03). A peak of IgA response to GbpB occurred during the phase of highest SM infectious challenge (by T6). All the GbpB-derived peptides have shown reactivity with salivary IgA, independently of the status of MS infection. The results indicated that complex salivary IgA responses to MS Ags can occur by 6 months of age and that the patterns of salivary IgA specificities might influence in the susceptibility of initial infections to MS. Neither of the peptides tested corresponded to differences in response to the native protein observed between the pairs of children studied.
Doutorado
Microbiologia e Imunologia
Doutor em Biologia Buco-Dental

Sabe-se que o sistema imune, através de um fenômeno denominado imunossenescência, gradativamente diminui a sua capacidade de resposta durante a vida. Este fato pode tornar o indivíduo mais suscetível a infecções e outras patologias. Neste contexto, seria útil procurar por fatores que alterassem esta evolução natural, principalmente os capazes de acelerar este processo. Por esta razão, nós procuramos por diferenças nos parâmetros imunológicos entre o antes e o depois da cirurgia de valva cardíaca em idosos com mais de 65 anos. Nossos resultados não apontaram, no pós-operatório, para uma diminuição da capacidade imune, uma vez que os testes cutâneos de hipersensibilidade para o PPD, tricofitina e candidina não se alteraram. Quando a resposta linfoproliferativa foi avaliada in vitro, também não apresentou diferença. Por outro lado, nós observamos um aumento na porcentagem de células T CD3 +, T CD4 + e monócitos no sangue periférico, quando comparamos os períodos. Sendo que os marcadores de ativação cellular CD25 +, CD69 + e o CD95 também se apresentaram elevados. Quanto a secreção de citocinas, nossos resultados apontam para um amento de IL-4 e IL-8. Inversamente, concentrações reduzidas de IL-2, IL-12 e IFN- foram detectadas no sobrenadante de PBMCs quando estimuladas in vitro. Em suma, nossos dados demonstram que a cirurgia de valva cardiaca é capaz de alterar vários parâmetros da resposta immune, com um aumenrto da porcentagem de células, quanto da expressão de marcadores de ativação celular e secreção de citocinas
It is known that the immune system, through a phenomenon called immunosenescence, undergoes functional changes during life which may culminate in a diminished capacity of response, turning the subject more susceptible to infections and other pathologies. In this context, it is useful to search for factors that alter this natural evolution, mainly able to delay this process. For this reason, we assessed different immunologic parameters before and after cardiac valve surgery in 65 year-old patients. Our results did not point to a postoperative immunedeficiency-like state, once that the cutaneous tests to PPD, candidin and tricophytin remained positive for most of the subjects. When the proliferative response was assessed in vitro, there were also no differences. On the other hand, we observed a post-surgical increase in the percentage of T CD3 +, T CD4 + cells and in monocytes from peripheral blood when we compare both periods. Moreover, it is important to highlight that activation markers, such as CD25, CD69 and CD95 were also presented in higher levels. According to the cytokine secretion, our results appointed to a greater secretion of IL-4 and IL-8 postoperative. Conversely, reduced concentrations of IL-2, IL-12 and IFN- were detected in supernatant of PBMCs when stimulated in vitro. In summary, our data reveal that the cardiac valve surgery with extra corporeal procedure and anesthesia is able to alter several parameters of the immune response, with an increased percentage of the major assessed cells, as well as in the expression of activation markers and cytokine secretion

A expressão de antígenos restritos a tecidos (TRAs do inglês tissue restricted antigens) no timo pelas células epiteliais medulares (mTECs de medullary thymic epithelial cells) é essencial para a tolerância central das células T. Devido à sua heterogeneidade em termos de representação de autoantígenos, esse fenômeno foi denominado como expressão gênica promíscua (PGE de promiscuous gene expression), no qual o gene Aire (de autoimmune regulator) desempenha um papel como principal regulador transcricional positivo sobre um grande conjunto de TRAs dependentes de Aire. A proteína Aire tem a capacidade de interagir com seqüências específicas de DNA desempenhando um papel como regulador direto. Neste estudo utilizamos o método dos cDNA microarrays para acessar a PGE em células mTEC CD80+ murinas cultivadas in vitro. O agrupamento hierárquico dos dados permitiu a observação de que os genes de TRAs foram diferencialmente expressos. Para testar essa hipótese, inicialmente silenciamos o gene Aire pelo método de RNA interferente (RNAi) nas células mTEC. O agrupamento hierárquico dos dados de cDNA microarray mostrou um conjunto de genes de TRAs dependentes de Aire, os quais foram reprimidos após o silenciamento deste último. Redes gênicas reconstruídas desses dados permitiram a identificação de um nó gênico (Gucy2d) estabelecendo regulação positiva sobre genes downstream nas células mTEC normais. Entretanto, sob efeito do silenciamento de Aire, Gucy2d passou a ser um repressor. Esses resultados evidenciaram que genes da PGE estão conectados em rede, que um nó gênico pode atuar como intermediário no seu controle e que Aire na rede PGE desempenha seu controle como regulador upstream.
The expression of tissue restricted antigens (TRAs) in thymus by medullary thymic epithelial cells (mTECs) is essential for the central selftolerance of T cells. Due to heterogeneity of autoantigen representation this phenomenon has been termed promiscuous gene expression (PGE), in which the autoimmune regulator (Aire) gene plays a role as main positive transcriptional regulator on a large set of Aire-dependent TRAs. Aire protein is able in binding to specific DNA sequence motifs and plays a role as a direct regulator. Here we used the cDNA microarray method to access PGE in murine CD80+ mTECs cultured in vitro. Hierarchical clustering of the data allowed observation that TRA genes were differentially expressed. To further investigate the control of PGE, we hypothesize that TRA genes establish networks contributing it selves to modulate their transcriptional levels. Aire in this case plays a role as upstream positive modulator. To test this hypothesis, initially we silenced Aire by gene knockdown (RNA interference) in mTECs. Hierarchical clustering of cDNA microarray data showed a set of Airedependent TRAs genes, which were down regulated after Aire silencing. Gene networks reconstructed from these data allowed the identification of a gene node (Gucy2d) establishing positive regulation upon downstream genes in normal mTECs. Nevertheless, under silencing of Aire, Gucy2d has become a repressor. These finding evidentiate that, genes features in PGE are connected in network; a gene node may act as intermediate in their control and that Aire in PGE network plays a role as an upstream regulator.

O tumor de Ehrlich (TE) foi descrito inicialmente, como adenocarcinoma mamário de camundongos, desenvolvendo-se na forma ascítica ou sólida a partir de sucessivos transplantes no peritônio ou tecido subcutâneo destes animais. O tumor ascítico de Ehrlich (TAE) tem sido utilizado como um tumor transplantável para o desenvolvimento de pesquisas relacionadas à oncologia. Estudos tem demonstrado que o desenvolvimento de TAE resulta no estímulo de células citotóxicas, como os linfócitos T e células Natural Killer (NK), mediadas principalmente por macrófagos. Os macrófagos e as células dendríticas (DCs), podem induzir a síntese da enzima indoleamina 2,3 dioxigenase (IDO) em tecidos tumorais, via ligação das moléculas co-estimuladoras B7-1 e B7-2, presentes nestas células, com a molécula CTLA-4 (antígeno 4 associado a linfócitos T citotóxicos), presente em linfócitos T reguladores CD4+ CD25+. A IDO é uma enzima que degrada o aminoácido essencial triptofano, processo que além de levar à privação do mesmo no microambiente celular, gera metabólitos que impedem a ativação e proliferação de linfócitos T e, consequentemente, mecanismos a eles associados como os de rejeição podem ser seriamente comprometidos. Mediante o exposto e pela presença de células imunológicas que expressam IDO no microambiente do tumor ascítico de Ehrlich, este trabalho teve como objetivo verificar a expressão da IDO após o bloqueio da interação B7/CTLA-4 por meio da citometria de fluxo. De acordo com as análises realizadas, os resultados demostraram que houve redução de 4,9% para 2,53% na expressão da enzima IDO. Em face dos resultados, parece plausível sugerir que o bloqueio desta via de ligação foi eficaz na redução dos níveis de atividade da IDO, o que poderia restaurar a capacidade de resposta dos linfócitos T contra as células tumorais. Nesta perspectiva sobre a IDO como mediadora no controle do escape imune feito pelas células tumorais, tais resultados podem colaborar para modulação desta enzima no microambiente tumoral.
The Ehrlich tumor (TE) was first described, as breast adenocarcinoma of mice. The TE develops in ascitic or solid form from successive transplantations in the peritoneum or subcutaneous tissue of these animals. The Ehrlich ascites tumor (TAE) has been used as a transplantable tumor for the development of research related to oncology. Studies have shown that the development of TAE results in stimulation of cytotoxic cells, such as T lymphocytes and Natural Killer cells (NK), mediated mainly by macrophages. Macrophages and dendritic cells (DCs) in tumor tissues, via co-stimulation of molecules B7-1 and B7-2, present in these cells, toghether with the CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated antigen 4) molecule, present on regulatory T CD4 + CD25 + lymphocytes , may induce the synthesis of indoleamine 2, 3 dioxygenase (IDO). IDO is an enzyme that catabolizes the essential amino acid tryptophan, impairing activation and proliferation of T lymphocytes and consequently, compromising mechanisms associated with them such as rejection. Considering the presence of immune cells in the tumor microenvironment Ehrlich ascites that express IDO, this study aimed to verify the expression of IDO after the blockade of interaction B7/CTLA-4 by flow cytometry. Results demonstrated that there was a reduction of 4.9% to 2.53%in the expression of IDO. Given the results, it seems plausible to suggest that blocking this binding via was effective in reducing the levels of expression of IDO, which could restore the responsiveness of T cells against tumor cells. In this perspective on the IDO as a mediator in the control of immune escape made by tumor cells, these results may collaborate for modulation of this enzyme in the microenvironment.

A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial, com maior incidência nas regiões tropicais. As bactérias que causam a doença pertencem ao gênero Leptospira, família Leptospiracea e ordem Spirochaetales. A leptospirose é mantida na natureza pela colonização persistente dos túbulos renais proximais dos animais portadores. Uma estratégia adotada por estas espiroquetas para sobreviver à ação do sistema imune inato do hospedeiro é a capacidade que possuem de interagir com os reguladores do sistema complemento Fator H (FH) e proteína de ligação a C4b (C4BP). O sistema complemento é um componente vital da imunidade inata, uma vez que desempenha um papel crucial na defesa do hospedeiro, particularmente contra bactérias Gram-negativas. Dados recentes gerados por nosso grupo mostraram que C4BP interage com a proteína de superfície LcpA de Leptospira. Com cerca de 20 kDa, essa proteína é capaz de se ligar a C4BP purificado ou solúvel no soro de maneira dose-dependente. Uma vez ligado à proteína, C4BP permanece funcional agindo como cofator de Fator I na clivagem de C4b. O presente estudo teve como principal objetivo avaliar a interação da proteína LcpA com FH humano, principal regulador solúvel da via alternativa do sistema complemento. A proteína LcpA e suas porções N-Terminal, Intermediária e CTerminal recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade a metal a partir da fração insolúvel. A interação dessas proteínas com FH foi avaliada por dois métodos distintos: ELISA e Western blot com overlay. Os resultados indicaram que a porção C-Terminal da proteína LcpA é responsável pela interação com FH. Curiosamente, C4BP também se liga a esse domínio da proteína. Uma vez que esses dois reguladores solúveis do sistema complemento interagem com o mesmo segmento da LcpA, realizaram-se, a seguir, ensaios de competição com o objetivo de avaliar se ambos compartilhariam os mesmos sítios de interação. Os dados mostraram que FH e C4BP devem se ligar a sequências distintas desta proteína. Com o objetivo de se avaliar a funcionalidade de FH ligado à LcpA, realizou-se um ensaio para investigar sua atividade de co-fator de Fator I na clivagem de C3b. Produtos de degradação de 46 kDa e 43 kDa da cadeia α' de C3b foram detectados, indicando que FH permanece funcional. Em se tratando de uma proteína com funções relacionadas ao processo de evasão ao sistema imune inato, decidiu-se realizar ensaios de desafio em modelo de hamster com a finalidade de se avaliar seu potencial imunoprotetor. Os três ensaios realizados indicaram que a proteína não é capaz de conferir proteção. Os ensaios de ELISA visando à avaliação dos títulos de anticorpos mostraram que LcpA não é imunogênica, fato que explica os resultados dos ensaios de desafio observados. Portanto, embora interaja com moléculas do hospedeiro e pareça contribuir para o processo de evasão ao sistema imune inato, essa proteína de membrana não se mostrou promissora como candidato vacinal contra leptospirose.
Leptospirosis is a zoonosis of global distribution, with higher incidence in tropical areas. The bacteria that cause the disease belong to the genus Leptospira, family Leptospiracea and order Spirochaetales. Leptospirosis is maintained in nature by persistent colonization of proximal renal tubules of carrier animals. One strategy adopted by these spirochetes to escape from host´s innate immune system is the ability to interact with the complement regulators Factor H (FH) and C4b Binding Protein (C4BP). The complement system is a vital component of the innate immune system, being crucial for host´s defense, particularly against Gram-negative bacteria. According to our recent published data, C4BP interacts with the leptospiral surface protein LcpA. This 20 kDa outer membrane protein binds both purified and serum C4BP in a dose-dependent manner. Once bound, C4BP remains functional acting as a cofactor for Factor I in the cleavage of C4b. In the present study we evaluated the interaction of LcpA with human FH, the main soluble regulator of the alternative pathway of complement. The intact protein as well as its N-terminal, intermediate and C-terminal portions were purified by metal-affinity chromatography from the insoluble pellet. The interaction of these proteins with FH was evaluated by two distinct methods: ELISA and Western blot overlay. Our results indicate that the C-terminal domain of LcpA mediates interaction with FH, and also with C4BP. Since both complement regulators interact with the same fragment of LcpA, we next performed competition assays to assess if they would share binding sites. According to our data, FH and C4BP have distinct binding sites on LcpA. Cofactor activity of FH bound to immobilized LcpA was confirmed by detecting the C3b α' chain cleavage fragments of 46 and 43 kDa upon incubation with Factor I, thus indicating that it remains functionally active. Given the LcpA´s role in host´s innate immune evasion, we also evaluated its vaccine potential in a hamster model. Data from three challenge assays indicated that the protein can not afford protection. Low ELISA antibody titers of hamsters immunized with LcpA were observed, which strongly suggests that this protein is not immunogenic. In conclusion, LcpA interacts with host´s molecules and seems to contribute to the bacterial immune evasion. Nevertheless, this outer membrane protein is not a promising vaccine candidate against leptospirosis.

Orientador: Gláucia Maria Pastore
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
Made available in DSpace on 2018-08-19T17:48:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ChoqueDelgado_GrethelTeresa_D.pdf: 4927853 bytes, checksum: ef8c679c8f9658e583bf806254de0d6b (MD5) Previous issue date: 2012
Resumo: O yacon (Smallanthus sonchifolius), raiz andina, tem se destacado pelo seu potencial prebiótico devido aos elevados teores de frutooligossacarídeos (FOS) e inulina em sua composição. O objetivo deste trabalho foi verificar se a alimentação com yacon alteraria o sistema imune de camundongas BALB/c e se sua ingestão regular seria capaz de modular a resposta intestinal induzida pela instilação retal de ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS). Para avaliar os efeitos do consumo regular de yacon sobre o sistema imune murino, camundongas BALB/c com oito semanas de idade foram divididas em quatro grupos experimentais alimentados por trinta dias com dieta: controle AIN-93M; 5% de FOS comercial; 3% e 5% FOS de yacon. O peso corporal e consumo da ração foram acompanhados semanalmente. Os níveis de anticorpos IgA, IgM, IgG séricos e IgA fecal, a produção de óxido nítrico (NO) por macrófagos, a frequência de linfócitos T e B sanguíneos e a proliferação de células esplênicas in vitro foram avaliados. Para avaliar o efeito do consumo regular de yacon sobre a colite experimental, metade dos animais que ingeriram as dietas teste foi instilada por via retal durante sete dias consecutivos com solução contendo TNBS, enquanto que o restante recebeu veículo (etanol). Foram analisados o peso corpóreo, histopatologia dos intestinos, bem como a proliferação de células esplênicas e dosagem de citocinas. Os animais alimentados com yacon apresentaram respostas semelhantes aos camundongos que ingeriram as demais dietas em relação ao ganho de peso, consumo de ração, níveis de anticorpos séricos, frequência de linfócitos T e B sanguíneos e produção de NO por macrófagos. Entretanto, observou-se um aumento significativo tanto na secreção de IgA fecal quanto na proliferação de células esplênicas de animais alimentados com yacon. Os camundongos alimentados com yacon sofreram menor perda de peso após instilação com TNBS do que os animais alimentados com AIN93M e FOS. Os animais que consumiram yacon apresentaram intestinos íntegros e funcionais, oposto ao observado nos animais dos demais grupos. Não foram encontradas diferenças significativas na proliferação de células esplênicas e produção de citocinas entre os diferentes grupos, salvo a maior produção de IL-17 e menor secreção de IL-10 nas culturas de células de animais alimentados com FOS. Nossos dados indicam que o consumo regular de yacon não acarreta efeitos adversos à fisiologia e sistema imune murino, levando à melhora no quadro de colite induzida por instilação com TNBS
Abstract: Yacon (Smallanthus sonchifolius), Andean root, has been recognized for its prebiotic potential due to its high levels of fructooligosaccharides (FOS) and inulin. The objective of this study was to verify if the regular consumption of yacon alters the immune system of BALB/c mice and if it may modulate intestinal inflammation induced by the rectal instillation of trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS). To evaluate the effects of regular yacon consumption on the murine immune system, eight-week-old BALB/c mice were divided into four experimental groups fed for thirty days with diet: control AIN-93M, 5% commercial FOS, or 3% or 5% yacon FOS. Body weight and food consumption were monitored weekly. The serum levels of IgA, IgM and IgG and fecal IgA, the nitric oxide (NO) production by macrophages, the frequency of T and B lymphocytes in the blood and the proliferation of spleen cells (in vitro) were evaluated. To evaluate the effects of regular yacon consumption on experimental colitis, half of the animals was instilled rectally with a solution containing TNBS for seven consecutive days while the rest received vehicle (ethanol). We analyzed the body weight, histopathology of the intestines, spleen cell proliferation and cytokine production. The animals fed yacon showed responses similar to mice that consumed the other diets in relation to weight gain, food intake, serum antibody levels, frequencies of T and B lymphocytes in the blood and NO production by macrophages. There was a significant increase in both fecal IgA secretion and the proliferation of spleen cells from animals fed yacon. The mice fed yacon suffered less TNBS-induced weight loss than animals fed the FOS and AIN93M diets. The animals that consumed yacon also showed intact and functional intestines, as opposed to the other groups of animals. There were no significant differences in spleen cell proliferation or cytokine production among groups, except for the increased production of IL-17 and lower IL-10 secretion in the cultures of cells from animals fed FOS. Our data indicate that the regular consumption of yacon does not cause adverse effects on the physiology or the murine immune system and that yacon consumption ameliorates colitis induced by TNBS instillation
Doutorado
Ciência de Alimentos
Doutor em Ciência de Alimentos

Orientadores: Patrícia Maria Bergamo Favaro, Sara Teresinha Olalla Saad
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Made available in DSpace on 2018-08-21T08:21:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes_MatheusRodrigues_M.pdf: 3896765 bytes, checksum: d056b823ef7d5306e932f125ae5b6eaa (MD5) Previous issue date: 2012
Resumo: As síndromes mielodisplásicas (SMD) são um grupo heterogêneo de doenças caracterizadas por hematopoese ineficaz e risco de progressão para leucemia mieloide aguda (LMA). SMD de baixo de risco é caracterizada por um aumento de apoptose na medula óssea e alterações clínicas com perfil autoimune, enquanto que na SMD de alto risco há uma evasão imune, baixa apoptose e danos secundários ao DNA, contribuindo para a progressão para LMA. Essas evidências, junto com os dados de terapia imunossupressora em pacientes com SMD, sugerem o papel do sistema imune na progressão desta doença. Entretanto, o papel do sistema imune não é claro, e estudos que abordem o perfil das células T são importantes para o melhor entendimento da patogênese da SMD. Formin-like 1 (FMNL1) pertence à família de proteínas formina, indispensáveis para muitos processos fundamentais actina-dependentes. FMNL1 é restritamente expressa em células derivadas de linhagem hematopoética e superexpressa em células neoplásicas hematopoéticas malignas. Recentemente, foi descrito que FMNL1 está envolvida no processo de citotoxicidade de células CD8+. Desse modo, estudar a expressão de FMNL1 tanto nos linfócitos como nas células da MO dos pacientes com SMD, poderia contribuir para o melhor entendimento do papel dessa nova proteína neste modelo de neoplasia hematológica. No presente estudo, foi observada uma diminuição significativa na contagem absoluta de linfócitos periféricos no grupo SMD, após ajuste para idade, quando comparada com o grupo de doadores saudáveis (controle). Entretanto, houve um aumento da frequência de células CD3+, resultante do aumento significativo das subpopulações de células CD3+CD4+ no grupo de alto risco e CD3+CD8+ no grupo de baixo risco, de acordo com as classificações FAB e WHO. A razão CD4:CD8 encontrou-se aumentada no grupo de alto risco comparado com o de baixo risco. Dependência transfusional foi correlacionada positivamente com a porcentagem de CD3+CD4+, enquanto que a idade dos pacientes correlacionou-se de forma negativa com a porcentagem de CD3+ e CD3+CD8+. Os níveis de expressão de FOXP3, nas células CD3+ de sangue periférico, foram significativamente menores no grupo de baixo risco quando comparado com o grupo controle, e esse padrão se repetiu para a expressão de IL10. A quantificação dos transcritos de IL10 correlacionou-se negativamente com a porcentagem de células CD3+CD8+. Em conclusão, evidenciamos que pacientes com SMD apresentaram um menor número de linfócitos, porém com a frequências das células T CD3+, CD3+CD4+ e CD3+CD8+ aumentadas. Os pacientes de baixo risco apresentaram uma diminuição da expressão de FOXP3 e de IL10, quadro característico de um microambiente apoptótico e inflamatório. Já no grupo de alto risco, a expressão de FOXP3 e de IL10 aumenta em relação ao grupo de baixo risco. É interessante ressaltar que nos pacientes com SMD houve uma correlação entre o aumento da expressão de IL10 e a diminuição das células T CD3+CD8+, sugerindo a contribuição das Tregs na progressão da doença através da produção de IL10. A análise da expressão de FMNL1 em células CD3+ de sangue periférico não denotou diferenças significativas entre os pacientes com SMD e o grupo controle. Entretanto observou-se uma correlação positiva entre a expressão de FMNL1 e o número de células CD3+CD4+ e ambos com a dependência transfusional. Quanto à expressão de FMNL1 em amostras de MO, houve uma expressão significativamente menor nos pacientes com SMD quando comparado com as células de doadores normais, além de uma correlação negativa entre FMNL1 e número de citopenias. Usando modelos de linhagens celulares hematopoéticas para a diferenciação, observou-se um aumento significativo na expressão gênica e protéica de FMNL1 durante a diferenciação megacariocítica. Esses resultados sugerem a participação de FMNL1 na ativação de linfócitos CD4+ no sangue periférico e na diferenciação hematopoética na medula óssea
Abstract: Myelodysplastic syndromes (MDS) are a heterogeneous group of disorders characterized by ineffective hematopoiesis and risk of progression towards acute myeloid leukemia. Low-risk MDS is characterized by increased apoptosis in the bone marrow (BM), with a clinical autoimmune profile, whereas in high-risk MDS an immune evasion, low apoptosis and secondary DNA damage occurs, contributing to the progression of AML. This evidence, together with the data of immunosuppressive therapy in patients with MDS, suggests a role of the immune system in the progression of this disease. However, this role of the immune system is remains unclear, and studies that address the profile of T cells are important for a better understanding of the pathogenesis of MDS. Formin-like 1 (FMNL1) belongs to the family of proteins formina indispensable for many fundamental processes in actin-dependent. FMNL1 is strictly expressed in hematopoietic lineage derived cells, and overexpressed in malignant hematopoietic neoplastic cells. FMNL1 has recently been reported to be involved in the cytotoxicity of CD8+ cells. Thus, studies on the expression of FMNL1, both in lymphocytes and BM cells of MDS patients, could contribute to a better understanding of the role of this protein in this new model of hematologic malignancy. In the present study, we observed a significant decrease in absolute peripheral lymphocyte counts in the MDS group, after adjusting for age, compared with the healthy donor group (control). However, there was an increased frequency of CD3+, resulting in a significant increase of the CD3+CD4+ subpopulation in high risk and CD3+CD8+ in MDS low risk, according to FAB and WHO classifications. CD4:CD8 ratio was increased in the high risk when compared to the low risk group. Transfusion dependence was positively correlated with the percentage of CD3+CD4+, whereas the age of patients correlated negatively with the percentage of CD3+ and CD3+CD8+. The expression levels of FOXP3, in peripheral blood CD3+ cells, was significantly lower in the low risk group compared to controls and this pattern was repeated for the expression of IL10. Interestingly, IL10 transcripts correlated negatively with the percentage of CD3+CD8+. In conclusion, we found that patients with MDS had a lower lymphocyte number, however presented an increased frequency of CD3+ and CD3+CD8+ T cells. Our low risk patients showed a decreased expression of FOXP3 and IL10, characteristic of apoptotic and inflammatory microenvironment. In the high risk group, the expression of FOXP3 and IL10 was normal. Interestingly, there was a correlation between increasing expression of IL10 and reduction of CD3+CD8+ T cells in patients, suggesting the contribution of Treg in disease progression due to IL10 production. Analysis of FMNL1expression in CD3+ cells of peripheral blood showed no significant differences between patients with MDS and the control group. However, there was a positive correlation between FMNL1 expression and the number of CD3+CD4+, and both were transfusion dependence. FMNL1 expression in BM samples was significantly lower in MDS patients when compared with cells from normal donors, and there was a negative correlation between FMNL1 and number of cytopenias. Using models of hematopoietic cell lineages for differentiation, we observed an increase in gene and protein expression of FMNL1 during megakaryocytic and granulocytic differentiation. These results suggest the participation of FMNL1 in the activation of CD4+ lymphocytes in peripheral blood and bone marrow hematopoietic differentiation
Mestrado
Fisiopatologia Médica
Mestre em Ciências

Melatonin – is a hormone produced by the pineal gland during the dark time. Light during the night suppresses melatonin production. Melatonin is an important biological body regulator: it controls daily and seasonal biorhythms, glucose metabolism, gonadal activity, cardiovascular system, gastrointestinal tract and the activity of the immune system There is a lot of scientific information about the immunoregulative properties of melatonin. Melatonin modulates the development of some organs of the immune system, cell differentiation, immune response and cytokine production. The imunomodulatory activity of melatonin is usually determined by the following experimental models: surgical pinealectomy, in vivo treatment with melatonin or in vitro treatment of the immune cells with melatonin. However, during the experiments while keeping animals under constant light conditions, melatonin production was rarely naturally inhibited. For the experiments of this study, the method of constant lighting in the mouse model was applied. Our aim was to artificially evoke shift work conditions in order to find out how the deficiency of melatonin production influences the immune system of the shift workers. The results obtained showed that keeping mouse under constant lighting conditions the homeostasis of the immune system (antibody production, leukocyte and granulocyte migration) is disrupted. Therefore, shift work and its influence on the immune system could be considered as a factor for... [to full text]
Melatoninas – tamsiuoju paros metu kankorėžinėje liaukoje gaminamas hormonas. Šviesa nakties metu slopina melatonino produkciją. Melatoninas yra svarbus organizmo biologinis reguliatorius. Jis reguliuoja paros ir sezono bioritmus, gliukozės metabolizmą, lytinių liaukų aktyvumą, širdies ir kraujagyslių sistemos veiklą, virškinimo trakto veiklą, kitų endokrininių liaukų aktyvumą, imuninės sistemos veiklą. Literatūroje paskelbta nemažai duomenų apie imunoreguliacines melatonino savybes. Melatoninas panaikina su amžiumi susijusias užkrūčio liaukos ir blužnies involiucijas, skatina imuninės sistemos ląstelių proliferaciją, pagerina imuninį atsaką. Tyrinėjant imunoreguliacines melatonino savybes daugeliu atvejų taikomi tyrimo metodai, kurių metu atliekamos melatonino injekcijos arba pašalinama pagrindinė melatonino gamybos vieta - kankorėžinė liauka. Tačiau ankstesnių eksperimentų metu melatonino gamyba retai buvo natūraliai slopinama, laikant gyvūnus pastovaus apšvietimo sąlygomis. Disertacijos darbuose buvo taikytas pastovaus apšvietimo metodas modelinėje pelių sistemoje. Taip buvo siekta atkurti pamaininio darbo sąlygas ir ištirti galimą melatonino trūkumo poveikį žmonių, dirbančių pamaininį darbą, imuninei sistemai. Gauti rezultatai rodo, kad, laikant peles pastovaus apšvietimo sąlygomis, sutrinka jų imuninės sistemos homeostazė: antikūnų gamyba, leukocitų, granuliocitų migravimas. Dirbant pamaininį darbą reikėtų atkreipti dėmesį į jo poveikį imuninei sistemai ir įvertinti... [toliau žr. visą tekstą]

Melatoninas – tamsiuoju paros metu kankorėžinėje liaukoje gaminamas hormonas. Šviesa nakties metu slopina melatonino produkciją. Melatoninas yra svarbus organizmo biologinis reguliatorius. Jis reguliuoja paros ir sezono bioritmus, gliukozės metabolizmą, lytinių liaukų aktyvumą, širdies ir kraujagyslių sistemos veiklą, virškinimo trakto veiklą, kitų endokrininių liaukų aktyvumą, imuninės sistemos veiklą. Literatūroje paskelbta nemažai duomenų apie imunoreguliacines melatonino savybes. Melatoninas panaikina su amžiumi susijusias užkrūčio liaukos ir blužnies involiucijas, skatina imuninės sistemos ląstelių proliferaciją, pagerina imuninį atsaką. Tyrinėjant imunoreguliacines melatonino savybes daugeliu atvejų taikomi tyrimo metodai, kurių metu atliekamos melatonino injekcijos arba pašalinama pagrindinė melatonino gamybos vieta - kankorėžinė liauka. Tačiau ankstesnių eksperimentų metu melatonino gamyba retai buvo natūraliai slopinama, laikant gyvūnus pastovaus apšvietimo sąlygomis. Disertacijos darbuose buvo taikytas pastovaus apšvietimo metodas modelinėje pelių sistemoje. Taip buvo siekta atkurti pamaininio darbo sąlygas ir ištirti galimą melatonino trūkumo poveikį žmonių, dirbančių pamaininį darbą, imuninei sistemai. Gauti rezultatai rodo, kad, laikant peles pastovaus apšvietimo sąlygomis, sutrinka jų imuninės sistemos homeostazė: antikūnų gamyba, leukocitų, granuliocitų migravimas. Dirbant pamaininį darbą reikėtų atkreipti dėmesį į jo poveikį imuninei sistemai ir įvertinti... [toliau žr. visą tekstą]
Melatonin – is a hormone produced by the pineal gland during the dark time. Light during the night suppresses melatonin production. Melatonin is an important biological body regulator: it controls daily and seasonal biorhythms, glucose metabolism, gonadal activity, cardiovascular system, gastrointestinal tract and the activity of the immune system There is a lot of scientific information about the immunoregulative properties of melatonin. Melatonin modulates the development of some organs of the immune system, cell differentiation, immune response and cytokine production. The imunomodulatory activity of melatonin is usually determined by the following experimental models: surgical pinealectomy, in vivo treatment with melatonin or in vitro treatment of the immune cells with melatonin. However, during the experiments while keeping animals under constant light conditions, melatonin production was rarely naturally inhibited. For the experiments of this study, the method of constant lighting in the mouse model was applied. Our aim was to artificially evoke shift work conditions in order to find out how the deficiency of melatonin production influences the immune system of the shift workers. The results obtained showed that keeping mouse under constant lighting conditions the homeostasis of the immune system (antibody production, leukocyte and granulocyte migration) is disrupted. Therefore, shift work and its influence on the immune system could be considered as a factor for... [to full text]

A desnutrição é capaz de induzir diversas alterações metabólicas afetando marcadamente a composição corporal e o sistema imunológico. O exercício físico, por sua vez, produz alterações no organismo para uma melhor capacidade de adaptação a situações de estresse. O desvio da situação de homeostase produzida pelo exercício físico induz uma reorganização de seus mecanismos funcionais, principalmente dos mecanismos endócrinos e imunológicos. Ainda é pouco conhecida a influência do exercício sobre a desnutrição e também as conseqüências sobre o sistema imunológico quando as duas variáveis são combinadas. Assim, esse trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos do exercício físico de endurance sobre ratos submetidos a um protocolo de desnutrição crônica. Avaliamos ratos Wistar machos, desnutridos por 16 semanas, divididos em 4 grupos: eutrófico sedentário (ES), eutrófico treinado (ET), desnutrido sedentário (DS), desnutrido treinado (DT). O treinamento físico foi realizado em esteira, por 10 semanas, 5 vezes por semana, com intensidade aproximada de 60- 65% do consumo máximo de oxigênio. Avaliou-se a composição corporal, através da aferição do peso corporal, peso dos tecidos muscular esquelético e adiposo, do fígado, do conteúdo de gordura e proteína na carcaça, e a concentração de leptina, ACTH, glicose, insulina, e glutamina no plasma. Avaliamos também, através de citometria de fluxo, os marcadores de superfície celular CD3 e CD4, bem como a celularidade no timo. O consumo máximo de oxigênio e o desempenho através de um teste até a exaustão também foram analisados. A análise estatística utilizada foi o teste de variância ANOVA two-way com pós teste de Bonferroni e, nível de significância adotado de p<0,05. Os resultados encontrados demonstraram que o treinamento de endurance em ratos submetidos à desnutrição crônica promoveu uma acentuada redução do peso e da adiposidade corporal; um aumento da massa muscular relativa ao peso corporal; um restabelecimento da glicemia aos valores normais; uma melhor relação da concentração insulina/glicose, sugerindo uma sensibilidade à insulina aumentada; um aumento dos estoques de glicogênio muscular; um maior consumo máximo de oxigênio; e uma recuperação na morfologia e fisiologia tímica, uma maior resposta proliferativa do baço e linfonodos estimulados com IL2. Concluímos desta forma que o exercício foi capaz de recuperar a morfologia, como também a maturação timócitos CD3 e CD4 e sua celuraridade em ratos desnutridos. A resposta proliferativa à estimulação da IL2 também foi recuperada.
Malnutrition is capable of inducing diverse metabolic alterations, markedly affecting body composition and the immune system. Physical exercise, on the other hand, induces a renders the organism more capable of adaptation to stress. Still, little is known about the influence of exercise training upon malnutrition-related alterations and its consequences on the immune system. Our aim was to evaluate the effect of moderate intensity exercise training in rats submitted to a protocol (16wk) of chronic malnutrition. Male Wistar rats were divided in to 4 groups: sedentary, fed ad libitum (SF); trained fed ad libitum (TF); sedentary energy restricted (RES); and trained energy restricted (TER). Training was carried out on a treadmill for 10 weeks, 5 time wk, under an intensity of 60-65% of the maximal oxygen consumption. We evaluated the Corporal composition, the variation of body weight, and the weight of the skeletal muscle, adipose tissues, and liver; as well as fat and protein content in the carcass; and also plasma leptin, ACTH, glucose, insulin and glutamine concentration. We also examined through flow cytometry CD3 and CD4, as well as the celularity in the thymus. The maximum consumption of oxygen and the performance were also assessed. The results demonstrate that endurance training in rats submitted to the chronic malnutrition protocol promoted reduction of body weight and of corporal adiposity; an increase in the relative contribution of muscle to body weight; the reestablishment of glicemia; improval of insulin/glucose reason, suggesting increased sensitivy to insulin; an increase of muscle glycogen content; enhanced oxygen consumption; are recovery of the morphology and physiology of the thymus, together with a proliferative response of the spleen and lymph nodes stimulated with IL2. We conclude in such a way that moderate intensity training restored thymus morphology and the capacity of maturation of CD3 and CD4 and also timocyte number and the of proliferative response to IL2 stimulation.

Parasitas e agentes infecciosos devem representar uma importante pressão seletiva atuante sobre a evolução de aspectos da história de vida dos hospedeiros. Os desafios impostos aos hospedeiros pelos patógenos resultam em uma séria de respostas fisiológicas e comportamentais, respostas estas pouco conhecidas para a maioria das espécies de hospedeiros ectotermos, como anfíbios anuros. O objetivo deste estudo foi quantificar os efeitos da ativação do sistema imune via injeção de LPS (lipopolissacarídeo), em duas diferentes concentrações, sobre o comportamento alimentar, taxa metabólica de repouso, atividade locomotora espontânea e comportamento anti-predatório de machos adultos da perereca das bromélias: Scinax gr. perpusillus . O tratamento com LPS provocou redução na taxa de alimentos ingeridos, confirmando o efeito anorexigênico deste componente, e aumento na atividade locomotora espontânea, porém não apresentou efeito sobre a taxa metabólica de repouso ou sobre o comportamento anti-predatório das pererecas
Parasites and infectious agents should represent important selective pressure acting on the evolution of aspects of life history of the hosts. The challenges posed by pathogens to hosts result in a series of physiological and behavioral responses, which are not well known to most ecthoterm hosts species, such as anuran amphibians. The aim of this study was to quantify the effects of activation of the immune system via injection of LPS (lipopolysaccharide) in two different concentrations, on feeding behavior, resting metabolic rates, spontaneous locomotor activity, and antipredatory behavior of adult males of the bromeliad tree-frog: Scinax gr. perpusillus . Treatment with LPS caused a reduction in the rate of food intake confirming the anorexigenic effect of this component and an increase in spontaneous locomotor activity, but had no effect on the resting metabolic rate or in the the antipredator behavior of frogs

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
Human activities have caused climate changes and altered the salinity of the oceans. Salinity is one of the factors that limit the distribution and the survival of marine organisms. Coelomocytes are the immune system cells of the echinoderms and have been studied as biomarkers in stress situations. The aim of the present study was to investigate the effect of the salinity in the immune system cells of the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Animals were collected in João Pessoa coast (Brazilian Northeast). Animals or coelomocytes were exposed to different salinity (25‰ to 45‰) and phagocytic parameters, production of reactive oxygen species (ROS), mitochondrial activity and ABC transporter activity analyzed. The phagocytic parameters did not change when animals or cells were exposed to low or high salinity in any time intervals monitored. However, our data showed an increase in the coelomocytes concentration when animals were exposed to 25‰. ROS levels were higher when cells were incubated at 25‰ and lower when cells were cultured at 45‰. We noted a loss of the mitochondrial inner membrane potential when coelomocytes were incubated at 45‰. The activity of ABC transporters decreased when cells were incubated at low salinity and increased when cells were incubated at high salinity. Our work shows that the immune system of the tropical sea urchins E. lucunter tolerates salinity changes from 25‰ to 45‰ and suggests two cellular parameters (ROS levels and ABC transporters activity) as potential biomarkers on the monitoring of the impact of environmental salinity changes.
As atividades humanas têm causado mudanças climáticas e alterado a salinidade dos oceanos. A salinidade é um dos fatores que limitam a distribuição e sobrevivência de organismos marinhos. Celomócitos são as células do sistema imune dos equinodermos e têm sido estudados como biomarcadores em situações de estresse. O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito da salinidade em celomáticos do ouriço-do-mar tropical Echinometra lucunter. Os animais foram coletados na costa de João Pessoa (Nordeste do Brasil). Os animais ou os celomócitos foram expostos a diferentes salinidades (25‰ e 45‰) e parâmetros fagocíticos, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), atividade mitocondrial e atividade dos transportadores ABC analisados. Os parâmetros fagocíticos não alteraram quando os animais ou as células foram expostos a 25‰ ou 45‰ nos intervalos de tempo monitorados. Porém, foi observado um aumento na concentração de celomócitos quando os animais foram expostos a 25‰. Os níveis de ROS foram maiores quando as células foram incubadas a 25‰, e menores quando as células foram cultivadas a 45‰. Foi observada uma perda do potencial de membrana mitocondrial interna quando os celomócitos foram incubados a 45‰. A atividade dos transportadores ABC diminuiu quando as células foram incubadas a 25‰ e aumentou quando as células foram incubadas a 45‰. O presente trabalho demonstra que o sistema imune do ouriço-do-mar E. lucunter tolera mudanças de salinidade (25‰ até 45‰), e sugere dois parâmetros celulares (níveis de ROS e atividade de transportadores ABC) como potenciais biomarcadores no monitoramento de mudanças na salinidade ambiental.

A caquexia associada ao câncer é caracterizada pela perda de peso severa e um desequilíbrio metabólico.Acredita-se que resulta da interação entre o hospedeiro e tumor que induz a inflamação sistêmica,portanto compreender essa relação é fundamental para a descoberta de marcadores efetivos para diagnóstico.O objetivo do trabalho foi caracterizar diferenças nos infiltrados imunitários do tumor e analisar aspectos moleculares ligados à inflamação,a fim de avaliar se a presença da caquexia é determinada pelo perfil inflamatório do tumor.O estudo envolveu pacientes com câncer colorretal e posteriormente distribuídos em dois grupos:Câncer sem caquexia(WSC) e Câncer com caquexia (CC).A análise histopatológica mostrou que o estadiamento independende da caquexia e caracterização dos macrófagos infiltrantes resultou M2 menor em CC,já a expressão proteica de citocinas indicou IL-13 menor em CC e citocinas pró-iflamatórias estavam aumentadas em CC. A correlação de macrófagos com citocinas foi positiva com M1 e negativa com M2.Esses resultados fornecem evidências de que o tumor possui um perfil de secreção diferente entre os grupos no que diz respeito a fatores inflamatórios e diferentes percentuais de fenótipo de macrófagos.
Cancer cachexia is characterized by severe weight loss and large metabolic imbalance.It is a result of the interaction between the host\'s cells and the tumour, which induces systemic inflammation.Understand the relationship is required for the discovery of diagnostic markers.The aim of the present study was to characterize differences in inflammatory tumour infiltrate and molecular aspects in order to assess whether the presence of cachexia is determined by the inflammatory tumour profile. The study involved patients diagnosed with colorectal cancer and then distributed into two groups: cancer without cachexia(WSC) and cancer cachexia(CC).Histopathological analysis showed that the presence of cachexia in patients with colo-rectal cancer was independent from tumour staging.Characterization of infiltrating macrophages revealed a lower percentage of M2 profile in CC.Protein expression of cytokines demonstrated lower of IL-13 in CC and pro-inflammatory cytokines is higher in CC. Correlation between macrophages and cytokines was shown positive with macrophages type M1.These results provide evidence that tumor has a different secretion profile between the groups with regard to inflammatory factors and different percentages of macrophage phenotype.

No intuito de promover a saúde e reduzir o risco de doenças, a nutrição de animais de companhia tem evoluído de forma semelhante à humana, na busca por alimentos funcionais. Neste sentido, as Saccharomyces cerevisiea são leveduras com potencial prebiótico, pois podem estimular a produção de substâncias com propriedades imunoestimulatórias e aumentar a capacidade de prevenir a colonização de bactérias patogênicas no trato gastrintestinal. Porém, a composição e processo de produção podem influenciar na sua capacidade de atuação. Este estudo objetivou avaliar os efeitos da inclusão de teores crescentes de leveduras com metabólitos ativos (LMA) dietéticos na digestibilidade aparente dos nutrientes, microbiota e produtos da fermentação fecal e parâmetros imunológicos de cães adultos. Foram utilizados 18 cães adultos hígidos, machos e fêmeas, peso corporal médio de 15,8±7,37kg, distribuídos em delineamento inteiramente casualizado constituído de três tratamentos experimentais, denominados: DC (dieta controle), LMA 0,3 (dieta controle com 0,3% de leveduras com metabólitos ativos) e LMA 0,6 (dieta controle com 0,6% de leveduras com metabólitos ativos). As médias dos resultados obtidos foram comparadas pelo teste de Tukey (p<0,05) no SAS. Pôde-se verificar que a inclusão do aditivo alterou a digestibilidade aparente da fibra bruta, da proteína bruta, extrativos não nitrogenados e energia metabolizável (p<0,05). Os produtos de fermentação não foram afetados pelo aumento da inclusão do prebiótico (P>0,05). O índice de fagocitose foi maior nas dietas LMA 0,3 e LMA 0,6 (P<0,05). Nas dosagens de LMA 0,3 e 0,6 as concentrações fecais de Prevotela, Allobaculum, Fusobacterium reduziram e Clostridium aumentaram (p<0,05). Collinsela aumentou em LMA 0,6 (p<0,05). Blautia apresentou tendência de aumento em LMA 0,3 e 0,6 e Lactobacillus em LMA 0,3 (p<0,10). De acordo com os teores de inclusão e os parâmetros avaliados neste estudo, o aditivo pode apresentar possível efeito na imunidade inata e inespecífica e promover modestas alterações na microbiota fecal de cães adultos saudáveis.
In order to promote health and reduce the risk of diseases, pet nutrition has evolved in a similar way to human, in the search for functional foods. In this sense, Saccharomyces cerevisiaa are yeasts with high prebiotic capacity, since they stimulate the production of substances with immunostimulatory properties and increase the capacity to prevent the colonization of pathogenic bacteria in the gastrointestinal tract. However, its composition and production process determine the ability to act, based on the substrate and medium in which it was nourished. The objective of this study was to evaluate the effects of increasing levels of yeast with active metabolites (YAM), based on the fermentation of specific substrates, on the apparent digestibility of dietary nutrients, fecal fermentation products, microbiota, and immunological parameters of adult dogs. Eighteen adult healthy male and female dogs with a mean body weight of 15.8 ± 7.37 kg were distributed in a completely randomized design consisting of three experimental treatments: CD (control diet), YAM 0.3 (control diet with 0.3% of yeasts with active metabolites) and YAM 0.6 (control diet with 0.6% of yeasts with active metabolites). The mean of the obtained results were compared by the Tukey test (p<0,05) in the SAS. It can be verified that the inclusion of the additive altered the apparent digestibility of crude fiber, crude protein, nitrogen free extract and metabolizable energy (p<0.05). Regarding the fermentation products, they were not affected by the prebiotic (P>0.05). The phagocytosis index was higher in the diets YAM 0.3 and YAM 0.6 (P<0.05). At the dosages of YAM 0.3 and 0.6, fecal concentrations of Prevotela, Allobaculum, Fusobacterium reduced and Clostridium increased (p<0.05). Collinsela increased with LMA 0.6 (p<0.05). Blautia tended to increase with YAM 0.3 and 0.6 and Lactobacillus with YAM 0.3 (p<0.10). According to the inclusion levels and the parameters evaluated in this study, the additive may present a possible effect on innate and nonspecific immunity and promote modest changes in the fecal microbiota of healthy adult dogs.

Estudos prévios em nosso laboratório mostraram na interface materno-fetal de camundongos, aos 10 dias de gestação, a expressão máxima do fator de inibição de migração de macrófagos (MIF) pelas células trofoblásticas e de seus receptores (CD44/CD74) pelas células deciduais, tornando estas células potenciais alvos da ação desta citocina. Dentre funções atribuídas a esta citocina, destacam-se ações pró-inflamatórias sobre a resposta imunológica e sobre processos de proliferação e sobrevivência celular. Neste contexto, este estudo tem como objetivo analisar uma possível participação de MIF na ativação de processos de sobrevivência celular mediados pela proteína quinase Akt, nas células deciduais de camundongo, in vitro. Utilizou-se cultivo primário de células deciduais que receberam MIF recombinante de camundongo (mrMIF) associado ou não a inibidores da via PI3K/AKT (LY294002 e Wortmannin). As culturas foram analisadas por meio de reações imuno-histoquímicas, Western blot e ensaios de morte celular. Assim como in vivo, o complexo receptor de MIF, CD74/CD44 foi imunolocalizado nas células deciduais cultivadas. A adição de MIF exógeno reduziu os níveis de apoptose. MIF também interferiu no processo de sobrevivência das células deciduais in vitro diminuindo as taxas de morte por apoptose quando desafiadas com peróxido de hidrogênio. Além disto, as células tratadas com mrMIF apresentaram maior expressão de pAKT e pMDM2. Dados da literatura mostram que a via AKT é responsável por ativar mecanismos de sobrevivência celular e sua ativação por MIF nas células deciduais pode indicar um papel para esta citocina na homeostase decidual, garantindo a integridade da barreira materno-fetal e, desta forma, a manutenção desta interface imprescindível para o sucesso da gestação.
Previous studies from our laboratory showed that the maternal-fetal interface in mouse at gestation day 10 exhibits high levels of macrophage inhibiting migration factor (MIF) expressed by trophoblast cells and its receptors (CD44/CD74) by decidual cells, making these cells potential targets for this cytokine action. Among the roles attributed to this cytokine, it can be highlighted the pro inflammatory actions on the immune response and on proliferation and cellular survival processes. In this context, this study aim to analyze the possible role of MIF in the activation of survival mechanisms mediated by the protein kinase Akt in mouse decidual cells in vitro. We have used primary culture of decidual cells receiving recombinant mouse MIF (mrMIF) with or without the PI3K/AKT pathway inhibitor (LY294002 and Wortmannin). Cultures were analyzed by immunohistochemical reactions, Western blotting and cell death analysis. As in vivo, the MIF receptor complex, CD74/CD44 was immunolocalized in the cultured decidual cells. The addition of exogenous MIF reduced the apoptotic rates in decidual cells. MIF also interfered in the process of survival of decidual cells in vitro by decreasing rates of cell death by apoptosis when challenged with hydrogen peroxide. In addition, cells treated with mrMIF have higher expression of pAKT and pMDM2. Recent studies show that AKT pathway is responsible for cell survival. In this context, AKT activation by MIF in decidual cells may indicate a role for this cytokine in decidual homeostasis by ensuring the integrity of the maternal-fetal barrier and thereby, maintaining this essential interface and successful pregnancy.

Glicoesfingolipídios (GSLs) podem se inserir em regiões específicas das membranas (lipid rafts) quando adicionados em culturas celulares, modulando sua função. Nós avaliamos se GSLs de Paracoccidioides brasiliensis, glucosilceramida (CMH) e glicoinositolfosfoceramida (GIPC) possuem atividade imuno-moduladora. Foram estudados indivíduos com (grupo curado) ou sem histórico de paracoccidioidomicose (grupo controle). CMH elevou a expressão de CD80 e CD86 em monócitos, a linfoproliferação em PBMCs no grupo controle e reduziu a capacidade de DCs em induzir linfoproliferação. No grupo curado, CMH inibiu proliferação em culturas com CMA e gp43, reduziu a produção de IL-10 por DCs e aumentou a produção de IL-12. Já GIPC aumentou a produção de citocinas Th1, elevou a fagocitose de leveduras, reduziu a maturação de DCs e sua capacidade de induzir linfoproliferação. A avaliação de células iNKT não mostrou diferença no número de células, na expansão e produção de citocinas entre os grupos. Em conclusão, GSLs de P. brasiliensis alteram a função de células do sistema imune.
Glycosphingolipids (GSL) may insert into specific membrane regions (lipid rafts) when added to cell culture, modulating its function. We evaluated whether glucosylceramide (CMH) and glycoinositol-phosphoceramide (GIPC), extracted from Paracoccidioides brasiliensis, are able to modulate immune cells functions of cured paracoccidioidomycosis (PCM) patients (control group) or individuals who never had PCM (cured group). CMH increased CD80 and CD86 expression on monocytes, increased lymph-proliferation on PBMCs and reduced lympho-proliferation in co-cultures with dendritic cells (DCs). In cured groups, CMH decreased gp43 and CMA- induced lymph proliferation, reduced IL-10 and increased IL-12 production by DCs. GIPC increased phagocytic capacity, reduced the maturation levels on DCs and DC capacity to induce lymph-proliferation. iNKT cells were analyzed and there were no differences in iNKT cells number, expansion capacity and cytokines production among the groups. In conclusion, GSL extracted from P. brasiliensis are able to modulate immune cells functions.

A malária é responsável pela morte de mais de um milhão de pessoas por ano no mundo. As complicações decorrentes da doença, em humanos infectados por parasitas do gênero Plasmodium, parecem estar relacionadas à resposta imune exacerbada à infecção. As moléculas inibitórias, PD-1 e PD-L1 encontram-se expressas em níveis elevados em células T de camundongos na fase aguda da infecção pelo P. chabaudi. Então, o objetivo foi verificar o papel de PD-1 e PD-L1 na ativação e regulação das células T do baço de camundongos na infecção aguda pelo P. chabaudi. Os resultados mostram um aumento na expressão de PD-1 em células T CD4+ e um aumento na expressão de PD-L1 nas células T e B. Vimos o papel regulador de PD-1 e PD-L1 quando houve uma menor proliferação de células T CD4+ que expressam PD-1, estimuladas com anti-CD3; e também, quando observamos redução na produção de IFN-g. Portanto, PD-1 e PD-L1 podem ser importantes para o controle da resposta imune exacerbada durante a fase aguda da infecção, bem como para a geração de resposta específica para a fase crônica.
Malaria is responsible to kill over a million people a year worldwide. The complications of the disease in humans infected by parasites of the genus Plasmodium, appears to be to the exacerbated immune response to infection. Inhibitory molecules such as PD-1 and PD-L1 are expressed at high levels in T cells in mice in the acute phase of infection by P. chabaudi. Then, the aim was to examine the role of PD-1 and PD-L1 in the activation and regulation of T spleen cells of mice during acute infection with P. chabaudi. The results show an increase of PD-1 expression in CD4+ T cells, and an increase of PD-L1 expression on T and B cells. We observed the regulatory role of these molecules when we find a lower proliferation of CD4+ T cells expressing PD-1 stimulated with anti-CD3; and also, when we observed a reduction in IFN-g production. Therefore, PD-1 and PD-L1 may be important in the control of immune response during the acute phase of infection, as well as for the generation of more specific response to the chronic phase.