Literatura académica sobre el tema "Séquençage Nanopore"

Après des années de développement, l’utilisation du nanopore comme sonde pour séquencer les molécules d’ADN est maintenant une possibilité viable et prometteuse. La détection d’une seule paire de bases lors du transport de l’ADN permet d’enregistrer de très longs fragments de polynucléotides, avec une parallélisation et des vitesses élevées. Dans cette revue, les méthodologies actuelles fondées sur la détection électrique et les nanopores biologiques seront présentées de même que les nouvelles méthodes utilisant des nanopores à l’état solide, ou la détection optique.

Le séquençage haut-débit a ouvert de nouvelles perspectives cliniques nous orientant aujourd’hui vers une médecine de précision. Cancérologie, infectiologie ou génomique humaine, de nombreuses applications ont vu le jour ces dernières années. L’arrivée sur le marché d’une troisième génération de technologie de séquençage fondée sur les nanopores, palliant certaines faiblesses de la génération précédente, annonce une nouvelle révolution. Portabilité, temps réel, lectures longues et coût d’investissement marginal, ces nouvelles technologies prometteuses laissent présager un nouveau changement de paradigme. Quelles sont les perspectives ouvertes par les nanopores pour les applications cliniques ?

Chez les eucaryotes, la réplication de l'ADN commence à partir de multiples origines activées à différents moments de la phase S. Chaque origine forme deux fourches de réplication divergentes où a lieu la synthèse de l'ADN. Mais alors que la duplication du génome dépend de l’avancée des fourches, les déterminants de leur progression demeurent peu connus, et on ne sait toujours pas si les fourches se déplacent à une vitesse variable ou constante le long des chromosomes. Mes travaux de thèse ont consisté à réaliser chez la levure S. cerevisiae la première carte génomique de progression des fourches de réplication basée sur la vitesse individuelle des fourches. Notre laboratoire a mis au point une méthode de cartographie de la réplication en molécule unique basée sur la détection par séquençage nanopore d'un analogue de la thymidine, le BrdU, incorporé pendant la réplication. En me basant sur cette technique, j’ai développé, en association avec des bioinformaticiens du laboratoire, un outil de mesure de la vitesse des fourches nommé NanoForkSpeed (NFS). Après détection du BrdU incorporé dans l'ADN de cellules asynchrones lors d'un court marquage, NFS procède à une segmentation des signaux pour identifier les fourches de réplication, les orienter et extraire leur vitesse ; la séquence des lectures donne quant à elle immédiatement la localisation des fourches. J'ai par ailleurs créé la souche BT1, qui incorpore très efficacement le BrdU tout en conservant une croissance similaire à celle de levures sauvages, ce qui m'a permis d'étudier la progression des fourches de réplication dans des conditions physiologiques. La vitesse moyenne des fourches mesurée par NFS dans les cellules BT1 est de 2,1 kb/min, en accord avec les précédentes estimations chez S. cerevisiae. NFS est aussi capable de détecter le ralentissement des fourches induit par l’hydroxyurée ainsi que les changements de vitesse dans des mutants où la progression du réplisome est altérée. Le débit de NFS surpassant celui des méthodes en molécule unique actuelles, plus de 125000 vitesses de fourches de réplication ont pu être positionnées sur les chromosomes de S. cerevisiae pour générer la première carte génomique de progression des fourches basée sur des mesures individuelles jamais obtenue chez un organisme. Cette carte a révélé une progression homogène des fourches sur l’ensemble du génome de la levure à l'exception de forts ralentissements au niveau des sites de pauses déjà identifiés chez cet organisme, à savoir les centromères, les télomères, l'ADN ribosomique et certains gènes d'ARN de transfert. En parallèle de NFS, j’ai développé Nanotiming, une nouvelle technique d'analyse du programme temporel de réplication du génome de S. cerevisiae. Nanotiming repose sur la quantification du taux de BrdU dans les lectures nanopores : la concentration en thymidine augmentant au cours de la phase S chez la levure, le taux de BrdU sera ainsi plus faible dans les régions se répliquant tardivement que dans celles se répliquant précocement. Contrairement aux approches actuelles basées sur l’analyse de l'augmentation du nombre de copies au cours de la phase S qui sont soit peu résolutives, soit fastidieuses car impliquant une synchronisation ou un tri cellulaire, Nanotiming requière simplement le marquage de cellules asynchrones avec du BrdU pendant un doublement. Les profils obtenus tant dans une souche sauvage que dans une souche où Rif1, un régulateur-clé du programme temporel de réplication, a été inactivé sont remarquablement similaires à ceux établis par les méthodes à haute résolution actuelles, validant mon approche. Outre sa simplicité, Nanotiming ouvre également la voie à l'analyse à haut débit du programme temporel de réplication en molécule unique, et à l'étude approfondie des variations inter-individuelles
In eukaryotes, DNA replication initiates from multiple origins activated throughout S-phase. Each origin forms two diverging replication forks that synthesize DNA. Although genome duplication depends on a proper fork progression, the governing factors are poorly understood, and little is known about replication fork velocity variations along eukaryotic genomes. My thesis project aimed at generating in the budding yeast S. cerevisiae the first ever genome-wide map of fork progression based on individual fork rates. Our laboratory has recently introduced a high-throughput, high-resolution, single molecule-based replication mapping technique relying on the detection by nanopore sequencing of 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU), a thymidine analogue incorporated in replicating DNA. In collaboration with bioinformaticians, I have developed NanoForkSpeed (NFS), a method capable of positioning, orienting and extracting the velocity of replication forks from BrdU tracks synthesized during a brief pulse-labelling of asynchronously growing cells. In addition, I have engineered the BT1 yeast strain which exhibits highly efficient BrdU incorporation and wild-type growth, allowing the measurement of fork progression in physiologically relevant conditions. NFS retrieves previous S. cerevisiae mean fork speed estimates (≈2 kb/min) and precisely quantifies speed changes in cells with altered replisome progression or exposed to hydroxyurea. The positioning of >125,000 fork velocities provides a genome-wide map of fork progression based on individual fork rates, showing a uniform fork speed across yeast chromosomes except for a marked slowdown at known pausing sites, namely centromeres, telomeres, the ribosomal DNA and some tRNA genes. During my PhD, I have also created Nanotiming, a novel method to study the replication timing (RT) of S. cerevisiae's genome. Nanotiming relies on the quantification of BrdU rates in nanopore reads: since thymidine concentration increases during S-phase in yeast, BrdU incorporation will be lower in late replicating than in early replicating regions. In contrast to reference techniques based on DNA copy number analysis, which are either low-resolution or difficult to implement as they require cell synchronization or sorting, Nanotiming only demands the labeling of asynchronously growing yeast cells with BrdU during one doubling. RT profiles obtained both in wild-type cells and in a mutant strain where Rif1, a key RT regulator, has been inactivated are remarkably similar to those established by high-resolution methods, validating my approach. In addition to its simplicity, Nanotiming also paves the way for high-throughput analysis of single molecule RT and in-depth study of inter-individual RT variability

Les plantes, organismes sessiles, sont constamment exposées à divers facteurs environnementaux et doivent donc mettre en place des mécanismes moléculaires sophistiqués afin d’assurer efficacement leur survie et leur adaptation. Les stress génotoxiques, peuvent entrainer des réarrangements chromosomiques et des modifications de l’épigénome, entraînant des conséquences sur les programmes transcriptionnels et développementaux. Il est donc important, d’étudier la relation entre la dynamique du génome et celle de l’épigénome en réponse à un stress génotoxique. Dans ce projet de thèse, Arabidopsis thaliana a été utilisée comme plante modèle pour étudier la structure du génome et le profil du méthylome en condition de stress génotoxiques ionisant (protons) et non ionisant (UVB et UVC). Le rôle des deux protéines kinases (Ataxia Telangiectasia Mutated/ATM et Ataxia Telangiectasia mutated RAD3-related/ATR), impliquées dans la DDR (DNA Damage Repair), a été étudié dans le maintien de l’intégrité du génome et celui du méthylome. Une approche de séquençage ONT (Oxford Nanopore Technology), a permis de révéler que le stress génotoxique entraine des variations structurales (VS) majoritairement constituées de délétions et d’insertions, situées dans les régions hétérochromatiniennes riches en éléments transposables (TE) et en régions intergéniques (RI). Nous avons mis en évidence qu’ATM et ATR protègent le génome contre des VS au stade végétatif et en réponse à un stress génotoxique. En effet, les TE et les gènes sont les principales entités génétiques ciblées par ATM pour leur protection contre des VS, en condition de stress. Nous avons pu déterminer que la voie du c-NHEJ (classical Non Homologous End-Joining) est prédominante pour la réparation des cassures doubles brins (DSB) par rapport à la voie MMEJ (Microhomology-Mediated End Joining) et qu’ATM/ATR préviennent l’utilisation de longue séquences MH (Microhomology) conduisant à de longues délétions lors de la réparation par la voie du MMEJ. Les profils de méthylation de l’ADN ont été déterminés par séquençage au Bisulfite et/ou ONT. Nous avons pu identifier des changements du niveau de méthylation de l’ADN principalement aux niveaux des TE, dans le contexte CHH en réponse à des stress génotoxiques. Nous avons également mis en évidence l’implication d’ATR et surtout d’ATM dans le maintien de l’intégrité du méthylome aux niveaux des gènes et des TE respectivement dans les contextes CG et CHH
Plants, sessile organisms, are constantly exposed to various environmental factors and therefore need to develop sophisticated molecular mechanisms to ensure their survival and adaptation. Genotoxic stresses can lead to chromosomal rearrangements and changes in the epigenome, impacting transcriptional and developmental programs. It is thus important to study the relationship between genome and epigenome dynamics in response to genotoxic stress. In this thesis project, Arabidopsis thaliana was used as a model plant to study genome structure and methylome profile under ionizing (proton) and non-ionizing (UVB and UVC) genotoxic stress conditions. The role of two protein kinases (Ataxia telangiectasia mutated or ATM and Ataxia telangiectasia mutated RAD3-related or ATR), involved in DDR (DNA damage Repair), have been studied in genome integrity and methylome maintenance. Using an ONT (Oxford Nanopore Technology) sequencing approach, we revealed that genotoxic stress leads to structural variations (SV) consisting mainly in deletions and insertions, located in heterochromatin regions rich in transposable elements (TE) and intergenic regions (RI). We demonstrated that ATM and ATR protect the genome against SV at the vegetative stage and in response to genotoxic stress. In fact, TEs and genes are the main genetic entities targeted by ATM for their protection against SV, under stress conditions. We have determined that c-NHEJ (classical Non-Homologous End-Joining) is the predominant pathway for DSB repair compared to MMEJ (Microhomology-mediated end joining) and that ATM/ATR prevent the use of long MH (Microhomology) sequences leading to long deletions during MMEJ repair. DNA methylation profiles were determined by Bisulfite sequencing and/or ONT. We were able to identify changes in DNA methylation levels mainly at the TE level, in the CHH context in response to genotoxic stresses. We also demonstrated the involvement of ATR and especially ATM in the maintenance of methylome integrity at the gene and TE levels in the CG and CHH contexts respectively

Les membranes nanoporeuses solides [en anglais, SSN (Solid State Nanopore)] sont devenues des dispositifs polyvalents pour l'analyse des biomolécules. L'une des applications les plus prometteuses des SSN est le séquençage de l'ADN et des protéines avec un coût réduit et une vitesse d’exécution plus rapide que les méthodes actuelles de séquençage. Le séquençage par SSN est basé sur la mesure des variations de courant ionique observées quand unebiomolécule, dans un milieu électrolytique, est forcée de traverser de manière séquentielle un nanopore sous l’action d’une différence de potentiel électrique appliquée. Lorsque la biomolécule passe au travers du nanopore, elle occupe de manière transitoire le volume du nanopore et bloque ainsi le passage des ions du milieu électrolytique. Le blocage du courant est dépendant de la nature et de l’encombrement stérique des groupements chimiques des monomères constituant la biomolécule. Donc, la détection ultra-rapide des variations de courant ionique lors du passage de celle-ci au travers du nanopore, peut fournir des informations sur sa séquence. La résolution avec laquelle la séquence peut être déterminée dépend de la taille des nanopores et de l'épaisseur de la membrane. Les matériaux à deux dimensions tels que le graphène et les matériaux dichalcogénures de métaux de transition (MoS2 , WS2, …) sont des candidats très prometteurs pour ledéveloppement des applications de séquençage par SSN. A partir de simulations de dynamique moléculaire (DM) tous atomes, nous avons étudié la faisabilité d'utiliser des SSN de type MoS2 pour le séquençage desprotéines. En premier lieu, nous avons étudié la conductance d’une membrane nanoporeuse de MoS2 de 1 à 5 couches d’épaisseur possédant un seul nanopore de diamètre compris entre 1.0 et 5.0 nm et plongée dans un électrolyte de KCl. Nous avons démontré que le modèle de conductance macroscopique des membranes nanoporeuses cessait d’être valable pour les plus petits nanopores (diamètre < 5 nm). En analysant les simulations de DM des membranes de MoS2, nous avons développé un modèle modifié qui permet d’interpréter les mesures de courant ionique quel que soit le diamètre du nanopore. En second lieu, nous avons simulé le passage de la lysine et du di-lysine, ainsi que d'une protéine modèle, au travers de nanopores de membranes de MoS2, plongées dans un électrolyte de KCl, et soumises à une différence de potentiel électrique. A partir de nos résultats, nous avons proposé que l'utilisation d'acidesaminés chargés positivement ou négativement fixés de manière covalente à une protéine pourrait s’avérer une technique efficace pour favoriser l'entrée des protéines à travers des nanopores dans des expériences de translocation. De plus, nous avons établi la relation entre la trajectoire de la protéine au travers du nanopore et les fluctuations de courant ionique simulées.En troisième lieu, nous avons examiné la conductance ionique de membranes de MoS2 dont les pores ont un diamètre inférieur au nanomètre (sub-nm). Nous avons effectué des simulations de DM de ces systèmes en utilisant le potentiel réactif ReaxFF. Ce potentiel nous a permis de caractériser les variations de la structure atomique de ces très petits pores dans le vide et de simuler la conductance ionique de ce type de membranes. En utilisant le potentiel ReaxFF, des calculs préliminaires de la réactivité des nanopores de membranes de MoS2 à des molécules d’éthanol, utilisées dans le protocole expérimental de la préparation des membranes de MoS2, ont été réalisés
Solid-state nanopores (SSN) have emerged as versatile devices for biomolecule analysis. One of the most promising applications of SSN is DNA and protein sequencing, at a low cost and faster than the current standard methods. SSN sequencing is based on the measurement of ionic current variations when a biomolecule embedded in electrolyte is driven through a nanopore under an applied electric potential. As a biomolecule translocates through the nanopore, it occupies the pore volume and blocks the passage of ions. Hence, ultrafast monitoring of ionic flow during the passage of a biomolecule yields information about its structure and chemical properties. The size of the sensing region in SSN is determined by the size and thickness of the pore membrane. Therefore, two-dimensional (2D) transition metal dichalcogenides such as molybdenum disulfide (MoS2) arise as great candidates for SSN applications as an alternative to graphene. In the present work, we investigated the feasibility of using MoS2 nanopores for protein sequencing from all-atom molecular dynamics (MD) simulations. First, we studied the ionic conductance of MoS2 nanoporous membranes by characterizing the KCl electrolyte conductivity through MoS2 nanopores with diameters ranging from 1.0 to 5.0 nm and membranes from single to five-layers. Using MD simulations, we showed the failure of the usual macroscopic model of conductance for the nanoporous membranes with the smallest diameters and developed a modified model which proves usefulness to interpret experimental data. Second, we investigated the threading and translocation of individual lysine residues and a model protein with poly-lysine tags through MoS2 nanopores under the application of an electric potential. A proof-of principle technique based on the use of positively or negatively charged amino acids for protein translocation was proposed to promote the entrance of proteins through SSN in experiments. By analyzing the current-voltage curves simulated, we established the relationship between the translocation sequence events through the nanopores observed at the atomic scale in MD simulations, and the computed current fluctuations. Finally, experimental evidence of ionic conductance measurements in sub-nanometer (sub-nm) pores made of atomic defects has been recently reported. To give a better insight of the ionic transport through atomic scale pores, we performed MD simulations of sub-nm defect MoS2 pores using the reactive potential ReaxFF. Here, we characterized the variations of the atomic structure of the pores in vacuum and then we investigated the ionic conductance performance of one of the MoS2 defect pore membranes. ReaxFF potential was also useful to investigate the possible reactivity of MoS2 defect pore membranes with ethanol molecules. In addition, these simulations might provide a better understanding of the experimental setup of DNA sequencing, in which ethanol plays an unknown role in the sample preparation of the SSN