Tesis sobre el tema "Saccharomyces cerevisiae – Cultures cellulaires"

L'objectif est de quantifier le comportement dynamique de la levure Saccharomyces cerevisiae CBS 8066 en hautes densités cellulaires afin d'intensifier de façon rationnelle les productions microbiennes selon des critères industriels définis (titre, productivité, rendement). Nous avons développé un bioréateur continu bi-étagé avec recyclage cellulaire (BBRC) permettant de maîtriser de façon indépendante la concentration, l'environnement et l'état physiologique de la levure. Son originalité réside dans la gestion de l'activité microbienne via une boucle de recirculation entre les deux étages. L'influence des hautes densités cellulaires (de 30 gms. L-1 à 223 gms. L-1) a été caractérisée en régime permanent d'un point de vue physico-chimique, physico-mécanique et biologique aux échelles macro et microscopique. En focalisant l'interprétation des résultats sur la biomasse viable, nous avons montré qu'il n'y a pas d'impact des hautes densités cellulaires sur les cinétiques microbiennes de croissance et de production d'éthanol dans le domaine de variation considéré. Les effets de la concentration totale en biomasse ont été identifiés et quantifiés au niveau cellulaire (composition élémentaire, eau intracellulaire et volume cellulaire) et au niveau des paramètres physiques (rhéologie). L'application du BBRC à la production intensive d'éthanol a permis d'atteindre une des meilleures performances internationales (41 kg. M-3. H-1) en combinant productivité, titre et rendement
The study aims to quantify the dynamic behaviour of the yeast Saccharomyces cerevisiae CBS 8066 in high cell density conditions to improve microbial production taking into account defined industrial criteria (titre, productivity and yield). We developed a Two-stage Bioreactor with Cell Recycling (TBCR) to have independent controls on the cell concentration, the environment and the physiological state of the yeast. The bioprocess originality in the management of the microbial activity by the use of a recycle loop beetween the two stages. The influence of very high cell density (up to 223 gdw. L-1) was quantified on both biological and physical phenomena using macroscopic, microscopic, physico-mechanical and physico-chemical analysis in continuous steady state cultures. Considering the active part of the biomass, no biomass inhibition was shown on both growth and production kinetics. . . Total cell concentration impacts were identified and quantified at a cellular level (elementary composition, intracellular water content and cell volume) and at a physico-mechanical leved (rheology). We experimentally demonstrated the pertinence of the TBCR application to intensive bio-ethanol production according to industrial criteria such as ethanol concentration and yield to perform one of best international high bio-ethanol productivity (41 kg. M-3. H-1)

L’objectif était de caractériser les mécanismes d’interaction entre la bactérie lactique Lactococcus lactis et la levure Saccharomyces cerevisiae dans des écosystèmes modèles. Le comportement macro-cinétique de L. Lactis, analysé en co-culture avec la levure et en culture pure, semble indépendant de la présence de la levure. Par contre, la levure utilise ses propres produits de fermentation (éthanol, acétate), ainsi que le lactate produit par L. Lactis, pour prolonger sa croissance en aérobiose. Une méthode pour réduire les hybridations croisées sur les puces à ADN de L. Lactis lors de l’analyse transcriptomique des co-cultures a été développée. Ainsi, pour la première fois, le transcriptome de L. Lactis a été analysé avec des puces à ADN dans une culture mixte. La comparaison directe des cultures pure et mixte en phase exponentielle de croissance met en évidence de nombreux gènes du métabolisme des pyrimidines sous-exprimés en co-culture. Ce phénomène, confirmé par RT-qPCR, semble lié à la présence d’éthanol produit par la levure. Selon une autre stratégie, l’analyse cinétique comparative des données de transcriptome a été soumise à différents traitements statistiques pour déterminer la robustesse des données. Malgré des différences entre listes de gènes sélectionnés, le profil d’expression global est similaire en cultures pure et mixte, caractéristique de l’adaptation à la carence en glucose. Même si certains gènes de régulateurs semblent différemment exprimés en cultures pure et mixte, L. Lactis semble finalement peu affecté par la présence de la levure

Les systèmes microbiologiques naturels (colonne d’eau), semi-naturels (station d’épuration), mais surtout industriels ou de laboratoire (bioréacteurs) sont communément représentés par des modèles mathématiques destinés à l’étude, à la compréhension des phénomènes ou au contrôle des processus (de production, par exemple).

Dans l’énorme majorité des cas, lorsque les cellules (procaryotes ou eucaryotes) mises en jeu dans ces systèmes sont en suspension, le formalisme de ces modèles non structurés traite le système comme s’il était homogène. Or, en toute rigueur, il est clair que cette approche n’est qu’une approximation et que nous avons à faire à des phénomènes hétérogènes, formés de plusieurs phases (solide, liquide, gazeuse) intimement mélangées. Nous désignons ces systèmes comme « polyphasiques dispersés » (SPD). Ce sont des systèmes thermodynami-quement instables, (presque) toujours ouverts.

La démarche que nous avons entreprise consiste à examiner si le fait de considérer des systèmes dits « homogènes » comme des systèmes hétérogènes (ce qu’ils sont en réalité) apporte, malgré une complication du traitement mathématique, un complément d’information significatif et pertinent.

La démarche s’est faite en deux temps :

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Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire
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Le trehalose et le glycogene sont les sucres de reserve chez la levure, definis comme source de carbone et d'energie. Les concentrations intracellulaires dependent tres fortement des conditions de croissance (source de carbone, limitation nutritionnelle, stress, etc. ), et du mode de culture (regime respiratoire ou fermentaire, batch ou chemostat). L'objectif principal de cette these est de clarifier le role de ces reserves dans la dynamique de croissance. Dans un premier temps, la caracterisation physiologique de la souche de reference cen. Pk113-7d a mis en avant l'intime connexion entre l'accumulation de ces reserves et l'intensite du flux glycolytique. Une accumulation potentielle de trehalose est demontree par l'action du transporteur d'-glucosides code par le gene agt1. La dynamique cellulaire est abordee par des cultures continues sur glucose dans la zone oxydative des taux de croissance et l'application d'un saut du taux de dilution de 0. 05 a 0. 15 h 1. Dans ce contexte, d'importants bouleversements physiologiques sont observes : en l'occurrence, l'oscillation du taux de croissance, la mobilisation du trehalose et du glycogene et l'induction du bourgeonnement. L'augmentation du flux carbone s'accompagne d'une modification du flux energetique respiro-fermentaire. Cette dynamique macroscopique apparait fortement liee a la dynamique microscopique plus globale : stimulation des voies centrales du metabolisme de la levure et activation des voies dites du by-pass. La mise en uvre de souches deficientes dans la biosynthese du trehalose (tps1) et du glycogene (glg1glg2) a conduit aux memes observations. Toutefois, la presence de glycogene chez le triple mutant tps1glg1glg2 suggere l'existence d'un moyen independant du mode d'action des glycogenines. L'approche analytique de ces souches demontre une etroite correlation entre l'intensite du bourgeonnement et la quantite des reserves mobilisees et le role du trehalose dans le maintien d'un bon rendement energetique.

La paroi cellulaire de la levure est l'organite le plus externe de la cellule de la levure. Elle est composée d'une couche interne de polysaccharides, constituée de β-glucannes majoritairement réticulés à une quantité mineure de chitine, et à laquelle sont liées des mannoprotéines par des liaisons covalentes ou non. Les mannoprotéines forment la couche externe de la paroi cellulaire de la levure et sont considérées comme son deuxième composant le plus abondant. Les mannoprotéines de la paroi cellulaire de la levure sont des protéines fortement mannosylées par des O- glycannes simples courts et par des N-glycannes complexes et longs. Elles présentent des propriétés fonctionnelles particulières et une valeur nutritionnelle exceptionnelle liées à leur structure moléculaire, mais ont été peu étudiées. Ce travail vise à étudier la structure moléculaire des mannoprotéines de la paroi cellulaire de la levure par différentes techniques basées sur la spectrométrie de masse haute résolution.Les mannoprotéines ont été extraites par des procédés physiques ou chimiques, couplés éventuellement à un traitement enzymatique de la souche de référence S288C cultivées selon différents modes dans des bioréacteurs en présence d’un milieu de culture, ou d'échantillons levure industrielle, ou de produits industriels déjà fractionnés de levure. Ensuite, ces mannoprotéines ont été O- et N-déglycosylées chimiquement ou enzymatiquement. Les peptides obtenus ont été analysés par nanoESI-LC-MS/MS. L’analyse bio-informatique de ces données a permis l'identification et la quantification des mannoprotéines grâce à la base de données de la souche de référence de Saccharomyces cerevisiae S288C. La déglycosylation des peptides a également été vérifiée. Une analyse de l'ontologie des gènes a été ensuite réalisée pour déterminer la localisation subcellulaire des protéines identifiées. Les O- et N-glycannes ont été chimiquement dérivées par une réaction d’amination réductrice, puis analysées respectivement par µESI-LC-MS et électrophorèse capillaire.Ce travail nous a permis de comparer différentes méthodes d'extraction des mannoprotéines de la paroi cellulaire de levure. Ces méthodes entraînent un enrichissement qualitatif ou quantitatif de différents types de ces mannoprotéines, mais aussi conduisent à la présence d'autres protéines principalement annotées comme étant liées aux membranes des organelles (en particulier mitochondriales et nucléaires). Une purification supplémentaire des isolats de paroi a été appliquée pour réduire le nombre de ces protéines n’appartenant pas à la paroi. Le développement d’un protocole de N-déglycosylation enzymatique utilisant une méthode utilisant un seul contenant sans transfert de l’échantillon a permis l'augmentation de la couverture des mannoprotéines identifiées. Avec d’autres enzymes le même protocole permet une O-déglycosylation douce mais qui dégrade les O-glycannes en monosaccharides. La N-déglycosylation enzymatique combinée avec une O-déglycosylation chimique permet d’isoler simultanément les O- et N-glycannes des mannoprotéines, permettant leur analyse ultérieure par spectrométrie de masse et électrophorèse capillaire après modification chimique avec des marqueurs appropriés par réaction d'amination réductrice. Les profils de protéines diffèrent qualitativement et quantitativement selon la phase de croissance et le mode de culture. Nous avons identifié certains de leurs marqueurs protéiques, qui sont des marqueurs de la privation de glucose exprimée dans la phase de croissance stationnaire de la culture discontinue en lot et de la culture discontinue alimentée.Cette approche glycoprotéomique a également été appliquée à la caractérisation glycoprotéomique et peptidomique des produits générés par différentes méthodes de traitement industriel, destinés à un usage commercial, permettant de déchiffrer leur nature complexe en termes de composition et de structure
Yeast cell wall is the outermost organelle of the yeast cell. It composed of an inner layer of polysaccharides, consisting of β-glucans mostly cross-linked to a minor amount of chitin, and to which are linked mannoproteins by covalent or non-covalent bonds. Mannoproteins form the outer layer of the yeast cell wall and are considered as its second most abundant component. Yeast cell wall mannoproteins are proteins that are highly mannosylated by short simple O-glycans and by large complex N-glycans. They have particular functional properties and exceptional nutritional value related to their molecular structure, but have been little investigated. This work aims to study yeast cell wall mannoproteins at the molecular level by different techniques based on high resolution mass spectrometry.The mannoproteins were extracted by physical, chemical methods eventually coupled to enzymatic methods from the reference strain S288C grown in different modes in bioreactors in the presence of a culture medium, or from industrial yeast samples, or from already fractionated industrial yeast products. These mannoproteins were then O- and N-deglycosylated chemically or enzymatically. The resulting peptides were analyzed by nanoESI-LC-MS/MS. Bioinformatics analysis of these data allowed the identification and quantification of mannoproteins using Saccharomyces cerevisiae S288C reference strain database. The deglycosylation of the peptides was also verified. Gene ontology analysis was then performed to determine the subcellular location of the identified proteins. The O- and N-glycans were chemically derivatized by a reductive amination reaction and then analyzed by µESI-LC-MS and capillary electrophoresis respectively.This work allowed us to compare different methods of extraction of mannoproteins from the yeast cell wall. These different methods result in qualitative or quantitative enrichment of different types of mannoproteins and in the presence of other proteins mainly annotated as being related to organelle membranes (especially mitochondrial and nuclear). Further purification of wall isolates was applied to reduce the number of these non-cell wall proteins. The development of an enzymatic N-deglycosylation protocol using a one-pot method without sample transfer allowed an increase in the coverage of identified mannoproteins. Using other enzymes, the same protocol allows a gentle O-deglycosylation but degrades O-glycans into monosaccharides. Enzymatic N-deglycosylation combined to chemical O-deglycosylation allows the simultaneous isolation of O- and N-glycans from mannoproteins, allowing their subsequent analysis by mass spectrometry and capillary electrophoresis after chemical derivatization with appropriate labels by reductive amination reaction. The protein profiles differ qualitatively and quantitatively according to the growth phase and culture mode. We identified some of their protein markers, which are markers of glucose deprivation expressed in the stationary growth phase of batch and fed batch culture.This glycoproteomic approach was also applied to the glycoproteomic and peptidomic characterization of products generated by different industrial processing methods, intended for commercial use, allowing to decipher their complex nature in terms of composition and structure

Le rétrotransposon Tyl de Saccharomyces cerevisiae possède des analogies structurales et fonctionnelles avec les rétrovirus. Ces rétroéléments partagent notamment l'étape d'intégration, qui est catalysée par leur intégrase (IN) et ciblée vers des régions particulières du génome. Cette sélectivité d'intégration dépendrait d'une interaction entre leur IN et une ou plusieurs protéines cellulaires affines de l'ADN ou de la chromatine au site d'insertion. L'intégration de Tyl s'effectue dans une fenêtre d'une kilobase en amont des gènes transcrits par l'AR? polymérase III (Pol III) et dépend de la structure de la chromatine et de la transcription par la Pol II L'objectif de cette thèse est de caractériser les protéines interagissant avec l'IN de Tyl pour étudier leur rôle dans l'intégration. Nous avons identifié par crible double-hybride une interaction entre l'IN et les protéines AC40, Srl2 et Upc2 qui ont des fonctions liées au métabolisme de l'ADN. La protéine AC40 est une sous unité de la Pol III et pourrait donc jouer un rôle dans la sélectivité d'intégration. Nous avons confirmé l'interaction entre les deux protéines et défini le domaine minimal d'interaction de l'IN avec AC40. L fréquence de rétrotransposition de Tyl dans une souche exprimant une protéine AC40 n'interagissant pas avec l'IN n'est pas altérée, suggérant que l'interaction entre les deux protéines serait impliquée dans la sélectivité plutôt que dans l'efficacité d'intégration. A l'inverse, la fréquence de rétrotransposition diminue dans de souches dépourvues de Srl2 ou Upc2 indiquant que ces protéines joueraient un rôle dans l'efficacité de la rétrotransposition
Integration is an essential step in the retrovirus life cycle and is catalyzed by the retroviral integrase (IN). It does not occur randomly throughout the host-cell genome but presents a pattern of preferred sites that is specific to each element. A common targeting mechanism has been proposed, based on the interaction of IN with cellular factors bound at preferential insertion sites. The Tyl LTR-retrotransposon of S. Cerevisiae is analogous to retroviruses in its structure and mode of replication. Tyl integrates in a window of one kilobase upstream of RNA polymerase III (Pol III)-transcribed genes. Tyl preference depends both on the chromatin structure and Pol III transcription. The aim of this work was to identify cellular cofactors of Tyl IN and to elucidate their role in Tyl integration. We discovered an interaction between Tyl IN and AC40, a subunit of Pol III in a two-hybrid screen, suggesting that AC40 could be involved in the selectivity of Tyl integration. We confirmed the interaction between the proteins and showed that the C-terminus part of IN is necessary and sufficient. The frequency of integration is not affected by the loss of interaction, suggesting that it may be involved in the selectivity of integration rather than the efficiency. We also identified Upc2 and Srl2 as Tyl IN interacting proteins and showed that the frequency of integration decreases two-fold in their absence, indicating that these proteins may also play a role in Tyl mobility

Chlorella vulgaris (C. vulgaris) est un organisme modèle qui présente un potentiel commercial élevé dans le domaine de l'alimentation et de l'énergie, avec une faisabilité prouvée de cultures sous forme de biofilms et de co-culture de levures/microalgues pour la valorisation in situ du CO2 dans les processus biotechnologiques. Ce travail de doctorat se concentre sur les colonies immobilisées dans des cultures pures ou mixtes. Il vise une meilleure compréhension des interactions au sein des colonies et entre colonies, avec pour objectif ultime de comprendre et d'optimiser les co-cultures.Pour atteindre ces objectifs, un protocole complet et des dispositifs expérimentaux innovants ont été développés, notamment des techniques d'inoculation, des dispositifs de culture immobilisée avec capteurs de gaz, l'imagerie 3-D à l'aide d'un microscope à lumière structurée, le traitement d'images, un bilan gazeux calibré et l'analyse des données. Des précautions ont également été prises concernant les conditions d'incubation, la détermination de la masse sèche, la concentration en glucose, la taille et la densité des cellules.Tout d'abord, le développement de colonies uniques de C. vulgaris a été étudié dans des conditions hétérotrophes. Sur la base du modèle biologique proposé pour la dynamique de croissance en hauteur et en rayon, nous avons conclu que les colonies se développaient à un taux constant dans la direction horizontale et à un taux décroissant dans la direction verticale. Ces tendances sont cohérentes avec les effets cumulés de la disponibilité du glucose et de l'oxygène. Une calotte sphérique décrit le mieux la forme des colonies pendant la période de croissance. L'interaction intraspécifique de C. vulgaris a été étudiée en faisant croître plusieurs colonies sur la même plaque à des distances de initiales différentes : 1,5 mm, 3 mm et 15 mm. Aucun effet significatif de la coalescence des colonies n'a été observé sur les taux de croissance en rayon et en hauteur.Ensuite, l'effet de la lumière a été testé de deux manières : présence de lumière durant toute la culture et exposition à la lumière après une première période hétérotrophe. La forme de la colonie est significativement affectée par le mode de culture : la colonie en croissance hétérotrophe garde une calotte sphérique, tandis que la colonie en croissance mixotrophe atteint une forme cylindrique, en raison d'une croissance radiale presque complètement arrêtée après quelques jours. Grâce au dispositif de mesure des gaz, les données brutes ont été analysées à l'aide d'une équation de bilan gazeux pour obtenir les termes source biologique d'O2 et de CO2. Le rapport de masse du gaz sur la masse sèche de la cellule a été déterminé pour les différentes conditions de croissance. Une synergie est mise en évidence entre la photosynthèse au sommet de la colonie et l’hétérotrophie à la base.L'interaction inter-espèces de C. vulgaris et S. cerevisiae a été étudiée à deux niveaux : au niveau des cellules dans la même colonie et entre colonies. Au niveau de la colonie, des colonies de C. vulgaris et de S. cerevisiae ont été inoculées avec deux distances de séparation initiales différentes (3 mm et 15 mm). Les colonies ont été observées en continu pendant un mois. Même si des recherches supplémentaires sont nécessaires, la croissance et l'interaction observées semblent s'expliquer principalement par le taux de croissance beaucoup plus élevé de la levure. Après avoir fusionné, les colonies de S. cerevisiae finissent par envelopper les colonies de C. vulgaris. Au niveau des cellules, les colonies mélangées de C. vulgaris et de S. cerevisiae ont été observées en 3D. En raison de leur croissance rapide, les cellules de S. cerevisiae finissent par dominer l'ensemble de la colonie, à l'exception de quelques cellules de C. vulgaris présentes au cœur de la colonie et sur le dessus. Les cellules de C. vulgaris cessent presque de croître lorsque les nutriments sont limités
Chlorella vulgaris (C. vulgaris) is a model organism that has high commercial potential in the food and energy field, with proved feasibility of cultures as biofilms and yeast/ microalgae co-culture for in situ CO2 mitigation in biotechnological processes. This PhD work focuses on immobilized colonies in pure or mixed cultures. It proposes a better understanding of the interactions within and between colonies, with the ultimate goal of understanding and optimizing co-cultures.To archive these goals, a comprehensive protocol and required innovative experimental devices were developed including inoculation techniques, immobilized culture devices with gas sensors, 3-D imaging using a structured-light microscope, image processing, calibrated gas balance equation and data analysis. Care was also taken regarding incubation conditions, determination of dry mass, glucose concentration, cell size and density.Firstly, the development of single C. vulgaris colonies under heterotrophic conditions was studied. Based on the biological model proposed for the growth dynamics in height and radius, we concluded that the colonies expanded at a constant rate in the horizontal direction and a decreasing rate in the vertical direction. The trends are consistent with the cumulative effects of glucose and oxygen availability. A spherical cap best describes the shape of the colonies during the growth period. The intraspecies interaction of C. vulgaris was investigated by growing several colonies on the same plate with different initial separation distances: 1.5 mm, 3mm, and 15 mm. No significant effects of colony merging were observed on the growth rates in radius and height.Then, the effect of light was tested in two ways: presence of light throughout the culture and exposition to light after a first, purely heterotrophic, period. The shape of colony is significantly affected by the cultivation mode: the heterotrophic growth colony keeps a spherical cap, while the mixotrophic growth colony reaches a cylindrical shape, due to a radial growth almost completely stopped after some days. Thanks to the gas measurement device, the raw data were analyzed using a gas balance equation to obtain the biological source terms of O2 and CO2. Gas yield (mass ratio of gas to dry mass of cell) are proposed for the different growth conditions. A synergy is highlighted between photosynthesis at the top of the colony and heterotrophy at the base.The interspecies interaction of C. vulgaris and S. cerevisiae were studied at two levels: cell-cell level within the same colony and colony-colony level. At the colony-colony level, colonies of C. vulgaris and S. cerevisiae were inoculated with two different initial separation distances (3 mm and 15 mm). Colonies were observed continuously for one month. Even though additional investigation is needed, the observed growth and interaction seems to be mostly explained by the much larger growth rate of yeast. After merging S. cerevisiae colonies eventually envelop C. vulgaris colonies. At the cell-cell level, C. vulgaris and S. cerevisiae intermixed colonies were observed in 3D. Due to its fast grow, S. cerevisiae cells eventually dominate the whole colony, at the exception of some C. vulgaris cells present in the core of the colony and on the top. C. vulgaris cells almost stop growing when the nutrients are limited

Une protéine prion peut adopter deux conformations distinctes, l’une cellulaire et l’autre prion. La conformation prion est le résultat de son agrégation en fibre amyloïde. Cette fibre est le support de l’information prion à partir duquel les isoformes cellulaires sont convertis en forme prion de façon autocatalytique. La transmission de l’information prion repose donc sur la transmission de cette fibre au cours des divisions cellulaires, qui est réalisée par de petits polymères. Ceux-ci sont le résultat d’un équilibre entre la fragmentation et la polymérisation de la fibre. Une perturbation de cet équilibre provoque une agrégation massive de la protéine prion, menant à la perte de l’information prion.L’objectif de ma thèse était de comprendre ce qui définit in vivo la transmission du prion. Mon modèle d’étude est la protéine Ure2p propageant le prion [URE3] dans la levure S. cerevisiae. J’ai montré que la concentration cellulaire d’Ure2p détermine la vitesse d’agrégation de la protéine prion et donc son efficacité de transmission. En effet, de trop fortes concentrations cellulaires sont incompatibles avec la propagation du prion. La concentration cellulaire d’Ure2p définit également la diversité des souches prions. Un crible génétique m’a permit de mettre en évidence que la présence de séquences centromériques surnuméraires dans la cellule interfère avec la transmission du prion [URE3]. Le même phénomène est observé avec une augmentation du niveau de ploïdie de la cellule. Dans les deux cas, la surexpression du chaperon Hsp104 restaure une propagation normale du prion
A prion protein can adopt two distinct conformations, one cellular and one prion. Prion conformation is the result of its aggregation into amyloid fibers. This fiber is the support of the prion information from which the cellular isoforms are converted into prion form by autocatalytic manner. The prion information transmission is therefore based on the transmission of this fiber during cell division, which is done by small polymers. These are the result of a balance between fragmentation and polymerization of the fiber. A disturbance of this balance causes a massive aggregation of the prion protein, leading to the prion information loss.The objective of my thesis was to understand what defined in vivo the prion transmission. My studying model was the Ure2p protein propagating the [URE3] prion in S. cerevisiae yeast. I showed that the Ure2p cellular concentration determined the aggregation speed of the prion protein and thus its transmission efficiency. Indeed, too high cellular concentrations are incompatible with the prion propagation. The cellular concentration of Ure2p also defines the prion strains diversity. A genetic screen allowed me to highlight that the presence of centrometric supernumerary sequences in the cell interferes with the [URE3] prion transmission. The same phenomenon is observed with an increase in the cell ploidy. In both cases, overexpression of the Hsp104 chaperone restores normal prion propagation

Saccharomyces cerevisiae is one of the yeasts with major economic, social, and health significance in human culture. Depending on the growth conditions experienced by the cell, S. cerevisiae growth can proceed via fermentative, respirative, or respirofermentative metabolism. Scar formation, unequal division, a limited replicative lifespan, and increase in cell size commensurate with the cell's replicative age are individual characteristics of this yeast affecting the performance of bioprocesses. These characteristics increase the complexity of predictive models and introducing them with ease into a continuous model is not realistic. Nevertheless, an individual-based model is able to accommodate this complexity in a single computational model. Once an individual model is implemented, it has to be parameterized, calibrated, and its adequacy assessed. All these processes ideally require a high number of both individual and system-level experimental observations. The aim of the present thesis is to advance the development of an individual-based methodology to tackle the study of microbial systems driven by the relevant yeast S. cerevisiae. The adequacy of INDISIM-YEAST, an existing individual-based model of a generic budding yeast, is first assessed. In order to obtain valuable individual-based observations to support the desired individual-based methodology, the diversity of S. cerevisiae in experimental individually-oriented observations under different growth conditions and at different stages of the growth curve is verified and assessed. A quantitative individual-based model focusing on the fermentative (anaerobic) growth of the yeast S. cerevisiae has been designed, implemented in Fortran 90, and termed INDISIM-Saccha. The developed model is parameterized, calibrated, its adequacy evaluated, and used to assess in silico ethanol production by means of virtual experiments. The calibration procedure, and the performance and analysis of the data from the virtual experiments is undertaken using the statistical programming language R. The model adequacy is assessed by testing several model predictions both at a system level (glucose depletion, population growth curves) and single-cell level (fraction of budded cells, genealogical age distribution, and cell diameter distribution evolutions). Individual cell diameter observations obtained within the present thesis play a significant role in this assessment. Results of the virtual experiments suggest that differences in cell size distribution can drastically affect the performance and productivity of fermentations, and encourage routine characterization of the inocula in the biotechnological industry. INDISIM-Saccha is also adapted to take into account the aerobic growth of S. cerevisiae and contrasted with two experimental trials with different oxygen levels in the medium. The preliminary simulated results achieved with the model suggest that the approach also has the potential for reproducing aerobic batch cultures of S. cerevisiae. This represents a further step in obtaining a microbial individual-based model to account for the whole set of metabolic alternatives experienced by S. cerevisiae. In order to communicate efficiently, increase accessibility, and favour usability of the INDISIM-Saccha methodology developed, the present thesis also designs and implements INDISIM-YEAST-NL in the freely available programming environment NetLogo. The implementation of this streamlined model in NetLogo lays the foundations for a deeper understanding of the developed methodology and microbial individual-based models in general, and will facilitate future interactions with potential users of INDISIM-Saccha.
El Saccharomyces cerevisiae és un dels llevats que gaudeix de més significació econòmica, social i per a la salut humana. Depenent de les condicions experimentades, el llevat S. cerevisiae pot créixer mitjançant un metabolisme fermentatiu, respiratori o respirofermentatiu. La formació de cicatrius, una divisió desigual, una vida replicativa limitada i un increment de la mida de la cèl.lula amb l’edat replicativa són característiques individuals d’aquest llevat que afecten el comportament dels bioprocessos. Aquestes característiques incrementen la complexitat dels models predictius i dificulten, per tant, la seva inclusió en un model continu de manera realista. No obstant això, un model basat en l’individu sí que és capaç d’acomodar tota aquesta complexitat en un únic model computacional. Una vegada implementat, un model basat en l’individu ha de ser parametritzat, calibrat i la seva adequació ha de ser avaluada. Tots aquests processos requereixen idealment un gran nombre d’observacions experimentals, tant individuals com a nivell del sistema estudiat. L’objectiu general de la tesi present és avançar en el desenvolupament d’una metodologia basada en l’individu per estudiar sistemes microbians conduïts pel llevat S. cerevisiae. Primerament s’avalua l’adequació de INDISIM-YEAST, un model basat en l’individu, ja existent, focalitzat en un llevat genèric. Es verifica i s’avalua la diversitat del S. cerevisiae en observacions experimentals orientades a l’individu en diferents condicions de creixement i en diversos estadis de la corba de creixement de la població. Això permet obtenir observacions basades en l’individu molt valuoses a l’hora de donar suport a la metodologia desitjada. Es desenvolupa i s’implementa en Fortran 90 INDISIM-Saccha, un model quantitatiu basat en l’individu i focalitzat en el creixement fermentatiu (anaerobi) del S. cerevisiae. El model desenvolupat és parametritzat, calibrat, la seva adequació és avaluada i és utilitzat per estudiar in silico la producció d’etanol mitjançant experiments virtuals. El procés de calibratge, l’obtenció i l’anàlisi de les dades dels experiments virtuals s’han realitzat utilitzant el programari estadístic R. L’adequació del model s’avalua testejant diferents prediccions del model a nivell de sistema (corbes de disminució de la glucosa i de creixement de la població) i a nivell de la cèllula individual (evolucions temporals de la fracció de cèl.lules gemades, de la distribució d’edats genealògiques i de la distribució dels diàmetres cel.lulars). Les observacions del diàmetre de les cèl.lules individuals obtingudes a la tesi present juguen un paper significatiu en aquesta avaluació. Els resultats dels experiments virtuals suggereixen que les diferències en la distribució de mides cel.lulars poden afectar dràsticament l’evolució i la productivitat de les fermentacions i suggereixen una caracterització rutinària de l’inòcul a la indústria biotecnològica. L’INDISIM-Saccha també és adaptat per tenir en compte el creixement aeròbic del S. cerevisiae i és contrastat mitjançant dos assajos experimentals amb dos nivells d’oxigen al medi. Els resultats preliminars de la simulació denoten que aquesta aproximació també té el potencial de reproduir cultius discontinus aerobis del S. cerevisiae. Això representa un pas endavant cap a l’obtenció d’un model basat en l’individu que tingui en compte tot el conjunt d’alternatives metabòliques experimentades pel S. cerevisiae. Finalment, aquesta tesi també dissenya i implementa INDISIM-YEAST-NL en l’ambient de programació lliure anomenat NetLogo per tal de comunicar de manera eficient, d’incrementar l’accessibilitat i d’afavorir l’ús de la metodologia INDISIM-Saccha. La implementació d’aquest model simplificat amb NetLogo posa les bases per a una comprensió més alta de la metodologia desenvolupada, i dels models microbians basats en l’individu en general, i facilitarà futures interaccions amb usuaris potencials de l’INDISIM-Saccha.

La maîtrise de l'environnement microbiologique des cultures de microalgues en photobioréacteurs (PBR) est un des impératifs pour fiabiliser les performances des biotransformations et de la qualité des produits. L'objectif de ce travail de thèse était de vérifier la faisabilité d'un procédé de bio-protection visant à cultiver des microalgues en présence de microorganismes connus pour leurs propriétés probiotiques. L'étude a mis en évidence d'une part la sensibilité à la lumière visible de la levure Saccharomyces cerevisiae BY4743 transférée dans un milieu minéral au sein d'un photobioréacteur et d'autre part sa capacité de photo-adaptation après pré-acclimatation à la lumière en milieu YTG dilué. Les taux de survie les plus élevés ont été obtenus avec une souche variante BY4743-P6 isolée à partir de suspensions pré-incubées en PBR et différenciée par sa pigmentation et l'activité antioxydante de ses extraits. Des matières organiques dissoutes sont produites sous contraintes environnementales dans des cultures axéniques de Chlorella sorokiniana en condition photoautotrophique; elles favorisent la croissance de la levure et de plusieurs espèces de bactéries. La présence de S. Cerevisiae BY4743-P6 en ratios de populations contrôlées n'a pas eu d'effet significatif sur les cinétiques de croissance de cultures de C. Sorokiniana. L'étude a montré que la levure prévenait la croissance d'un contaminant bactérien, Micrococcus luteus, dans des cultures de microalgues. Ainsi les données expérimentales obtenues tendent à démontrer la faisabilité d'un procédé de bio-protection de cultures de microalgues par addition préventive de levures préalablement conditionnées
The control of the microbiological environment in microalgae cultures within photobioreactors (PBR) is required to ensure reliable bio-transformations efficiencies and product quality. The aim of this thesis work was to test the feasibility of a bio-protection process, consisting in culture of microalgae in presence of probiotic microorganisms. Thus, this study has shown the sensitivity to visible light of the yeast Saccharomyces cerevisiae BY4743 after its transfer to the mineral medium BGII and its capacity for photoadaptation after pre-acclimation to light in diluted YTG medium. The best survival rates were, however, obtained with a variant strain BY4743-P6 isolated from pre-incubated suspension in the PBR and characterized its pigmentation and the antioxidant activity of its extracts. The release of dissolved organic matter by axenic cultures of Chlorella sorokiniana under photoautotrophic conditions supported the growth of yeast and several species of bacteria. The presence of S. Cerevisiae BY4743-P6 in controlled populations ratios had no significant effect on the growth kinetics of C. Sorokiniana cultures. The study has shown that the yeast S. Cerevisiae BY4743- P6 could prevent the growth of bacterial contaminants such as Micrococcus luteus. Thus, the acquired experimental data tend to show the feasibility of a bio-protection process of microalgae cultures by preventive addition of previously conditioned yeast

Les potentialités liées aux cultures mixtes de micro-organismes sont immenses et ouvrent de vastes possibilités pour l’innovation dans les bioprocédés. Cependant, étant donné la complexité des phénomènes régulant la physiologie d’un seul micro-organisme, leur mise en oeuvre en culture mixte est d’autant plus difficile à maîtriser que des interactions entre ces micro-organismes viennent s’ajouter. Le travail présenté dans ce manuscrit est une étude d'un couple de levures oenologiques constitué de Saccharomyces cerevisiae et de Torulaspora delbrueckii. Son objectif est d'acquérir des informations expérimentales afin d’analyser et in fine modéliser l'évolution des cultures pures et des cultures mixtes. L'analyse des données expérimentales acquises lors des cultures pures de chaque levure a permis de quantifier l'effet favorable de la concentration initiale d'azote assimilable sur la croissance et la vitesse de fermentation des deux levures. Elle a aussi mis en évidence une prolongation de la phase de latence de T. delbrueckii induite par une augmentation des facteurs anaérobies. Les cultures mixtes ont été réalisées en présence et en absence de membrane de séparation permettant ainsi d'observer les effets du contact physique sur l'évolution des cocultures. Le contact physique influence la dynamique des populations. En culture mixte, S. cerevisiae domine T. delbrueckii dans un milieu synthétique classique. Une augmentation de la concentration initiale de facteurs anaérobies inverse complètement cette domination. L'analyse des résultats expérimentaux nous a orienté vers le développement d'un modèle «stoechio-cinétique» structuré dans lequel l'azote assimilé par la levure se répartit en deux compartiments: le compartiment constitutif et le compartiment de stockage. Ce modèle a permis une représentation fidèle des cinétiques observées en culture pure. La prise en compte des interactions s'est faite en intégrant la compétition pour les substrats, les interactions indirectes et les interactions directes. L'ensemble des hypothèses émises lors de ce travail de modélisation souligne la nécessité d'approfondir les connaissances scientifiques concernant le métabolisme deT. delbrueckii en anaérobiose stricte et l'effet des facteurs anaérobies sur les interactions microbiennes
The potentialities associated with cultures of mixed micro-organisms are tremendous and offergreat opportunities for innovation in bioprocesses. The phenomena regulating the physiology of asingle micro-organism are complicated. Furthermore, the eventual additional interactions between two micro-organisms make their implementation in mixed culture difficult to control. The workpresented in this manuscript is a study of a couple of oenological yeasts composed of Saccharomyces cerevisiae and Torulaspora delbrueckii. Its objective is to acquire experimentaldata in order to analyse and ultimately model the evolution of pure and mixed cultures. The analysis of experimental data acquired during the pure cultures of each yeast enable to quantifythe favorable effect of the initial concentration of assimilable nitrogen on the growth and fermentation rate of the two yeasts. It also shows an extended latency phase of T. delbrueckiiinduced by an increase in anaerobic factors. The mixed cultures were carried out in the presenceand absence of separation membrane in order to observe the effects of physical contact on theevolution of cocultures. Physical contact influences population dynamics. In mixed culture, S.cerevisiae dominates T. delbrueckii in a classical synthetic medium. An increase in the initialconcentration of anaerobic factors completely reverses this domination. The analysis of the experimental results has directed us towards the development of a structured stochiometric andkinetic model in which the nitrogen assimilated by the yeast is partitioned into two compartments:the constitutive compartment and the storage compartment. This model faithfully represents thekinetics observed in pure culture. The consideration of interactions was done by integrating competition for substrates, indirect interactions and direct interactions. All the hypotheses emitted during this modelling work underline the need to deepen the scientific knowledge concerning T.delbrueckii metabolism under strict anaerobic conditions and the effect of anaerobic factors onmicrobial interactions

Les éléments transposables (ETs) sont des séquences d’ADN mobiles qui ont la propriété remarquable de se déplacer et se propager dans les génomes. Découverts dans les années 1940 chez le maïs, ils sont présents dans tous les génomes séquencés à ce jour. Bien que le nombre d’études décrivant leur rôle dans l’évolution, la fonction et la structure des génomes n’a cessé d’augmenter depuis, nous sommes encore loin de comprendre toute l’étendue de l’impact biologique des ETs sur les organismes. La distribution des ETs n'est pas aléatoire, phénomène dû en partie aux mécanismes qui orientent l’intégration vers des régions préférentielles du génome. C’est le cas du rétrotransposon Ty1 de la levure S. cerevisiae, qui s’intègre principalement dans une fenêtre d’une kilobase en amont des gènes transcrits par l’ARN polymérase III (Pol III). Cette spécificité résulte d’une interaction entre l’intégrase codée par l’élément et une sous-unité de la Pol III, AC40. En son absence, Ty1 cible préférentiellement les subtélomères, ce qui suggère l’existence d’autres facteurs régulant la sélectivité d’intégration du rétrotransposon. Ce travail a eu pour but d’identifier ces facteurs par deux approches complémentaires. D’une part, nous avons étudié le rôle des marques d’histones corrélant avec les insertions de Ty1 dans le choix du site d’intégration. D’autre part, nous avons recherché de nouveaux partenaires de l’intégrase de Ty1 par une approche protéomique à grande échelle. Si nos résultats n’ont pas permis d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires impliqués dans la reconnaissance du site d’intégration de Ty1, ils ont élargi le répertoire des protéines de l’hôte qui régulent la rétrotransposition de Ty1. En effet, nous avons découvert que le variant d’histone H2A.Z et la protéine kinase CK2 répriment la rétrotransposition de Ty1. CK2 agit aux étapes transcriptionnelle et post-transcriptionnelle, interagit avec l’intégrase in vivo et la phosphoryle in vitro sur plusieurs résidus dans le domaine C-terminal, régulant probablement ainsi sa stabilité. Des expériences supplémentaires seront nécessaires pour confirmer cette hypothèse, découvrir par quel mécanisme CK2 régule Ty1, et comprendre le rôle de H2A.Z
Transposable elements (TEs) are mobile DNA sequences, with the extraordinary ability to jump and propagate in genomes. Discovered in the 1940s in maize, they are present in all sequenced genomes. Even if a large amount of data reveals their role in evolution, function and structure of genomes, we are still far from understanding every facet of their biological impact on organisms. TEs are not distributed randomly, partly due to mechanisms that target the integration to preferred genomic regions. This is the case for Ty1, a retrotransposon of S. cerevisiae, that targets a one-kilobase window upstream of RNA Polymerase III (Pol III)-transcribed genes. This specificity is due to an interaction between the element-encoded integrase and AC40, a subunit of Pol III. When this interaction is disrupted, Ty1 insertions are redistributed to subtelomeres, which suggests that other factors that regulate the integration selectivity of the retrotransposon exist. The aim of this work was to determine those factors by two complementary approaches. First, we studied the implication in this process of histone variants that correlate with Ty1 integration sites. Second, we identified new partners of Ty1 integrase by a proteomic screen. Our results did not lead us to identifying new cellular factors involved in the recognition of Ty1 integration site. They however widened the array of host proteins that regulate Ty1 retrotransposition. Indeed, we found that the histone variant H2A.Z and the protein kinase CK2 repress Ty1 retrotransposition. CK2 acts at transcriptional and post-transcriptional steps, interacts with the integrase in vivo and phosphorylates it in vitro on several residues in the C-terminal domain, probably thereby regulating its stability. Additional experiments will be required to confirm this hypothesis, to discover by which mechanisms CK2 regulates Ty1, and to understand the role of H2A.Z

L'objectif de ce travail est d'étudier la transition respiro-fermentaire chez Saccharomyces cerevisiae et de déterminer l'étape ou les étapes contrôlant ce processus, à partir d'une approche originale de génie microbiologique basée sur l'utilisation de chémostat sur substrats mixtes. Dans un premier temps, l'analyse bibliographique a orienté notre travail vers l'étude du rôle du transport du carbone du cytosol vers la mitochondrie. Pour déterminer si ce transport exerce un contrôle sur la bascule métabolique, nous avons mis en place une stratégie consistant à introduire en chémostat sous limitation glucose en mode oxydatif une perturbation métabolique ciblée ( présence de co-substrat, modification génétique) et à analyser les conséquences de cette perturbation sur la bascule métabolique étudiée. L'oléate a été un des co-substrats testés dans ce travail car il est connu pour stimuler les enzymes impliquées dans le transport du carbone à travers la membrane mitochondriale. La transition respiro-fermentaire a donc été quantifiée en chémostat glucose seul et en chémostat glucose/oléate. En présence d'oléate, il a été observé un retard dans l'apparition de la bascule métabolique et une redirection du flux carboné de la voie fermentaire vers la voie oxydative. Ce résultat marquant met en évidence une diminution de la transition respiro-fermentaire en présence d'oléate et constitue un des rares succès reporté dans la littérature de réduction de l'effet Crabtree. L'action de l'oléate a été approfondie et discutée au cours de ce travail
This work aims to study the respiro-fermentative transition in Saccharomcyces cerevisiae and to determine the controlling step(s) involved in this process, by using an original approach of microbiological engineering based on co-substrate chemostat cultivations. Based on the literature analysis, we focused our work on investigating the importance of the carbon transport from cytosol to michondria in the onset of the metabolic shift. To determine whether this transport exerts a control on the metabolic change, a strategy was implemented consisting in introducing, during oxidative glucose limited chemostat, a specific metabolic perturbation ( addition of co-substrate, genetic modification) and in analysing the consequences of such a perturbation on the studied metabolic event. The oleic acid was one of the co-substrates tested in this work; this fatty acid is indeed know to simulte enzymes implied in the carbon transport between the different cell compartments. The metabolic transition was then studied in sole glucose chemostat and in glucose/oleic acid chemostat. In the presence of oleic acid, a delay in the onset of the metabolic shift and a redirection of the carbon flux from the reductive pathway were observed. This important result shows a modulation in the respiro -fermentative transition in presence of oleic acid and constitutes one of the few success reported in the literature of reduction in the Crabtree effect. The action of the oleic acid was further investigated and discussed throughout this work

L'utilisation de souches de levures sélectionnées pour réaliser la FA est une pratique très répandue en œnologie. Après le développement de l'utilisation de levains de souche pure de Saccharomyces, l'innovation est aujourd'hui dans la mise en œuvre de levains mixtes de Saccharomyces et de non-Saccharomyces qui permettent de diversifier les produits finaux obtenus. La problématique réside dans l'existence d'interactions entre les souches rendant difficile la maîtrise de la fermentation. T. delbrueckii présente dans la flore indigène du mout de raisin est une des levures non-Saccharomyces les plus appropriées pour entrer dans la composition de ces levains mixtes. En effet, elle présente une bonne capacité fermentaire et peut permettre d'augmenter la complexité aromatique du vin ou encore de réduire son acidité volatile. L'objectif de ce travail était d'étudier les interactions pendant la FA entre des souches sélectionnées pour l'oenologie : une T. delbrueckii et une S. cerevisiae. Pour cela des expériences ont été réalisées dans des milieux synthétiques simulant le moût de raisins blancs. Le comportement des souches pures a tout d'abord été caractérisé. Il a été montré que la souche S. cerevisiae avait de meilleures performances fermentaires d'un point de vue cinétique que la souche T. delbrueckii. Toutefois, T. delbrueckii a montré des capacités acceptables pour épuiser les sucres et surtout a permis d'obtenir des profils aromatiques différents. Le comportement vis-à-vis de l'oxygénation des moûts de ces deux levures est assez semblable, T. delbrueckii étant cependant beaucoup plus sensible à ce paramètre que S. cerevisiae. L'interaction entre ces deux levures a ensuite était étudiée dans un bioréacteur à membrane sous anaérobie stricte dans différentes conditions : composition en azote assimilable du milieu et stratégie d'inoculation. Il a été clairement mis en évidence que T. delbrueckii était affectée par la présence de S. cerevisiae. Le type d'interaction soupçonné est celui d'amensalisme lié à l'excrétion par S. cerevisiae d'un constituant toxique pour T. delbrueckii. Dans ces conditions, la stratégie d'inoculation recommandée est l'ensemencement séquentiel des levures : T. delbrueckii en début de fermentation, puis l'ajout de S. cerevisiae 48 h après. Ceci permet à T. delbrueckii de se développer et d'exprimer son potentiel aromatique avant que S. cerevisiae ne soit introduit pour assurer une fin rapide de la fermentation. Toutefois, nous avons montré que même dans ces conditions, l'implantation de T. delbrueckii n'était pas garantie car, le moût n'étant pas stérile, une présence, même faible, de S. cerevisiae dans la flore naturelle peut inhiber sa croissance. Par ailleurs, il a été mis en évidence que dans les mouts à faible teneur en azote initial, ce constituant pouvait être épuisé au moment de l'inoculation de S. cerevisiae. Dans ces conditions, S. cerevisiae ne peut se développer et l'achèvement de la fermentation est alors problématique
The use of the selected yeast strains to realize the alcoholic fermentation is very prevalent practice in vinification. After the development of utilization of the preparation of pure Saccharomyces cerevisiae strain, the innovation is now to apply the mixte starter cultures of Saccharomyces and non-Saccharomyces that allow to diversifying the obtained final products. The problem resides in the existence of interactions between the strains giving the difficulty to controle the fermentation. Torulaspora delbrueckii present in the indigenous flora of the grape must is one of the most appropriate non-Saccharomyces yeasts to enter in the composition of these multistater cultures. In fact, this strain has been presented a good fermentative capacity and could allow to increasing not only the aromatic complexity of wine, but also to reducing its volatile acidity. The objective of our work is to study the interactions during the alcoholic fermentation between the selected strains for enology: one T. delbrueckii and one S. cerevisiae. For this reason, the experiments were realized in the synthetic mediums simulated to the white grape must. The behaviours of the pure strains were firstly characterized. It was shown that the S. cerevisiae strain had the best fermentative performances, a critical point in comparaison with the T. delbrueckii strain. Nevetheless, T. delbrueckii showed the acceptable capacities to exhaust the sugars and especially to allow us to obtain the different aromatic profiles to that of S. cerevisiae. The behaviour via the oxygenation to the musts of these two yeasts is enough close, T. delbrueckii being however much more sensible to that parameter than . cerevisiae. The interactions between these two yeasts were then studied in a membrane bioreacteur under strict anaerobie in different conditions: composition in assimilable nitrogen of the medium and strategy of inoculation. It has been clearly demonstrated that T. delbrueckii has been affected by the presence of S. cerevisiae. The suspected type of this interaction is the amensalism one bound to a toxic compound excreted by S. cerevisiae. In these conditions, the recommended inoculation strategy is the sequential culture of these yeasts: T. delbrueckii at the beginning of the fermentation, then the addition of S. cerevisiae after 48 h. This allows T. delbrueckii to develop and express its potentiel of aromatic production before the S. cerevisiae is introduced to assure a rapid finish of the fermentation. However, we showed that even in these conditions, T. delbrueckii growth has been not guaranteed because of, since the must is not sterilized, a presence even small of S. cerevisiae in the natural flore can inhibite the croissance of the former. It has been also demonstrated that in the must with low intitial nitrogen content, this compound could be exhausted at the moment of the S. cerevisiae inoculation. In these conditions, S. cerevisiae can not develop and the achievement of the fermentation is yet problematic

La paroi de saccharomyces cerevisiae est une structure complexe, composee de differents types de macromolecules biologiques : principalement des chaines de polysaccharides comprenant des (1,3) glucanes, des (1,6) glucanes, et de la chitine (polymere de n-acetyl glucosamine), ainsi que des proteines glycosylees presentant plusieurs types d'ancrage dans le reseau de glucanes. De nombreux genes sont impliques dans la biosynthese et dans la regulation spatiale et temporelle de l'assemblage des composants de la paroi. Le sequencage complet du genome de la levure permet de tendre vers une comprehension de l'ensemble de ces mecanismes. Il a notamment mis en evidence la redondance fonctionnelle de certains de ces genes, indice du caractere essentiel de ces fonctions, alors que leur expression est regulee de facon distincte et complementaire. L'etude de mutants de la paroi de s. Cerevisiae hypersensibles au calcofluor white nous a permis d'isoler plusieurs genes impliques dans son assemblage, en particulier dans la regulation de la synthese de deux types de polysaccharides de la paroi : la chitine et les (1,3) glucanes, ainsi que les genes faisant partie des cascades de transmission des signaux environnementaux (notamment celle dependant de la pkc1p), et des genes impliques dans la morphogenese. Nous avons particulierement etudie le gene knr4 et son influence sur la biosynthese de la chitine, et ce a differents niveaux : l'expression genique des chitines synthases, la localisation cellulaire de knr4p, l'analyse biochimique des modifications de composition de la paroi en fonction du taux d'expression du gene knr4, et enfin l'inhibition de la reponse morphologique a l'exposition a la pheromone. Le produit de ce gene nous apparait comme un maillon important dans l'etablissement des interactions entre les composants macromoleculaires de la paroi.

L'excitation de photosensibilisateurs, comme les porphyrines, par de la lumiere visible conduit a la formation d'oxygene singulet et d'espece reactives d'oxygene (ros). Ce principe de photoactivation combine a l'accumulation preferentielle des photosensibilisateurs dans les tissus tumoraux constitue la base de la photochimiotherapie des cancers (traitement photodynamique ou pdt) ; on met egalement a profit cette reaction dans le traitement de certaines affections fongiques (candidoses). Cependant le principe d'action du traitement photodynamique reste encore tres mal defini au niveau cellulaire. L'objectif du travail presente est de mettre en evidence d'une part la photocytotoxicite de nouvelles porphyrines de synthese (porphyrines o-glycosylees, s-glycosylees, porphyrines glycosylees liees a des amino-acides, porphyrines glycosylees pontees) produites au laboratoire de chimie des substances naturelles (pr. P. Krausz) et d'autre part de determiner, au niveau cellulaire, les mecanismes d'action mis en jeu lors d'un traitement pdt. Nous avons utilise deux modeles differents : la levure saccharomyces cerevisiae et les cellules promyelocytaires humaines k562. Les resultats presentes montrent que le traitement photodynamique provoque, chez les cellules de levures, une mort cellulaire tres semblable a l'apoptose observee chez les cellules animales. Les porphyrines amphiphiles se revelent les plus efficaces contre les levures traitees. Le traitement photodynamique des cellules k562 induit une sequence de phenomenes dont la chronologie repond en tout point a l'apoptose. Suite a la perte du potentiel mitochondrial, le taux cellulaire d'atp diminue, en entrainant la perte de l'asymetrie de la membrane plasmique ; ensuite, viennent la fragmentation de l'adn puis l'apparition des corps apoptotiques et finalement la perte d'integrite de la membrane plasmique. On observe cette chronologie d'evenements dans l'integralite de la population, dont l'entree en apoptose se revele donc independante du cycle cellulaire. Les porphyrines glycosylees permettent donc d'induire specifiquement l'apoptose des cellules malignes, et donc, en principe, de reduire les phenomenes de necrose observes lors de traitements photodynamiques de tumeurs. Ces proprietes, auxquelles il faut ajouter le ciblage cellulaire et la duree de vie plasmatique accrue des molecules etudiees, font des porphyrines glycosylees des molecules tres prometteuses pour le traitement photodynamique des cancers.

Pour une bonne maîtrise de la fermentation malolactique (FML) en vinification, il est important d’étudier les différents types d’interactions pouvant exister entre les souches de Saccharomyces cerevisiae et d’Oenococcus oeni, d’identifier les phénomènes et les molécules qui en sont responsables et de définir la façon pertinente de gérer le procédé notamment pour l’inoculation de ces souches. Dans ce travail, nous avons testé plusieurs couples levure-bactérie en appliquant deux stratégies d’inoculation différentes : cultures séquentielles et co-cultures, dans des milieux synthétiques liquides simulant les milieux naturels. Pour les cultures séquentielles, les bactéries lactiques ont été ensemencées à la fin de la fermentation alcoolique alors que pour les cultures mixtes les levures et les bactéries ont été ensemencées simultanément. La réalisation des cultures séquentielles a permis de quantifier l’inhibition ou la stimulation de la FML en fonction des souches sélectionnées dans un couple. Nous avons pu mettre en évidence que l’inhibition de la FML peut être en partie due à des peptides inhibiteurs, piste peu exploitée jusqu'à présent. La caractérisation partielle de deux peptides inhibiteurs synthétisés par deux souches de levure a pu être réalisée. Cet effet inhibiteur se rajoute à celui de certaines molécules inhibitrices déjà connues. Comme alternative aux cultures séquentielles, des cultures mixtes de certains couples ont été réalisées dans un bioréacteur à membrane, outil d’étude dont l’avantage est de séparer physiquement les souches tout en permettant l’homogénéisation du milieu. Pour certains couples, la co-inoculation a pu améliorer le rendement de la FML sans risque de déviation. Les résultats montrent que le choix du couple levure-bactérie est un critère très important dans la réussite de la FML. La réalisation de la co-culture peut être intéressante pour certains couples. En revanche une interaction positive a pu être observée pour d’autres couples dans le cas de cultures séquentielles. Cette stratégie classique peut alors être conservée
A good control of malolactic fermentation (MLF) during vinification, implies first to study the different kinds of interactions which may occur between Saccharomyces cerevisiae and Oenococcus oeni strains, second to identify the molecules responsible of these interactions and third to define the pertinent way of running the process notably in what concerns the inoculation of these strains. In this work, we have tested several yeast-bacteria couples by applying two different inoculation strategies: the sequential fermentation and the co-culture, using synthetic liquid media which composition simulates natural ones. While during the sequential fermentations, the lactic acid bacteria were inoculated at the end of the alcoholic fermentation; both yeasts and bacteria were inoculated simultaneously during the co-culture. The sequential fermentations allowed us to quantify the inhibition or stimulation of the MLF depending on the choice of the strains within a couple. We have also showed that the inhibition of MLF can be partially due to inhibitory peptides in addition to some classical inhibitory molecules already described. The partial characterization of two inhibitory peptides synthesized by two yeast strains was carried out in this work. This factor has not been intensively investigated till now. As an alternative for sequential fermentations, co-cultures of certain couples were carried out in a membrane bioreactor which advantage was to keep the strains physically separated while the medium was homogenous. For certain couples, the co-culture strategy improved the MLF output without a risk of deviation. Results show that the choice of a yeast-bacteria couple constitutes an important criterion for the success of MLF. The co-culture can be interesting for certain couples. However, a positive interaction was observed with other couples in the case of sequential fermentation. Therefore, this classical strategy has to be maintained

Ce travail porte sur l'etude de l'organisation fonctionnelle de l'aspartyl-trna synthetase cytoplasmique de levure (asprs). Son objet etait de reperer l'ensemble des elements contribuant directement ou indirectement a l'activite du site catalytique de l'enzyme puis d'etablir leurs fonctions. Dans une premiere partie de cette etude, nous nous sommes interesses aux residus du site actif de l'asprs. Nous avons evalue leur importance au travers de l'effet que pouvait produire leur mutation sur la croissance de la levure ; a cette fin, un systeme de chasse de plasmide utilisant le gene furi a ete mis en uvre. Une bonne correlation a pu etre observee entre les activites des asprs mutees, mesurees in vitro, et le niveau de croissance des cellules transformees correspondantes. Dans le deuxieme volet de notre travail, nous avons recherche de maniere systematique l'ensemble des residus de l'asprs dont la mutation etait susceptible d'affecter la croissance de la cellule. L'approche utilisee a consiste a selectionner par crible genetique, dans une banque de genes aps mutes au hasard, les mutants d'asprs devenus inactifs. Cette analyse nous a permis de reperer de nouveaux residus impliques dans la reconnaissance des substrats. Par la suite, et nous appuyant sur un systeme de selection mettant a profit les proprietes regulatrices du promoteur gals, nous avons verifie dans quelle mesure la substitution des residus hautement conserves de l'asprs pouvait affecter l'activite de l'enzyme. Il est apparu que seuls sont substituables les residus n'intervenant pas directement dans la fixation des substrats. Enfin, par la construction puis l'analyse des proprietes de mutants de deletion, nous avons aborde l'etude de l'organisation modulaire de l'asprs. L'importance de la structure en tonneau de la partie n-terminale et celle des helices h5, h6, h7 et h8 du domaine catalytique a clairement pu etre mise en evidence.

Efforts are made to change from 1st to 2nd generation bioethanol production, using lignocellulosics as raw materials rather than using raw materials that alternatively can be used as food sources. An issue with lignocellulosics is that a harsh pretreatment step is required in the process of converting them into fermentable sugars. In this step, inhibitory compounds such as furan aldehydes and carboxylic acids are formed, leading to suboptimal fermentation rates. Another issue is that lignocellulosics may contain a large portion of pentoses, which cannot be fermented simultaneously with glucose by Saccharomyces cerevisiae. In this thesis, high local cell density has been investigated as a means of overcoming these two issues. Encapsulation of yeast in semi-permeable alginate-chitosan capsules increased the tolerance towards furan aldehydes, but not towards carboxylic acids. The selective tolerance can be explained by differences in the concentration of compounds radially through the cell pellet inside the capsule. For inhibitors, gradients will only be formed if the compounds are readily convertible, like the furan aldehydes. Conversion of inhibitors by cells close to the membrane leads to decreased concentrations radially through the cell pellet. Thus, cells closer to the core experience subinhibitory levels of inhibitors and can ferment sugars. Carbohydrate gradients also give rise to nutrient limitations, which in turn trigger a stress response in the yeast, as was observed on mRNA and protein level. The stress response is believed to increase the robustness of the yeast and lead to improved tolerance towards additional stress. Glucose and xylose co-consumption by a recombinant strain, CEN.PK XXX, was also improved by encapsulation. Differences in affinity of the sugar transporters normally result in that glucose is taken up preferentially to xylose. However, when encapsulated, cells in different parts of the capsule experienced high and low glucose concentrations simultaneously. Xylose and glucose could thus be taken up concurrently. This improved the co-utilisation of the sugars by the system and led to 50% higher xylose consumption and 15% higher final ethanol titres. A protective effect by the capsule membrane itself could not be shown. Hence, the interest in flocculation was triggered, as a more convenient way to keep the cells together. To investigate whether flocculation increases the tolerance, like encapsulation, recombinant flocculating yeast strains were constructed and compared with the non-flocculating parental strain. Experiments showed that strong flocculation did not increase the tolerance towards carboxylic acids. However, the tolerance towards a spruce hydrolysate and especially against furfural was indeed increased. The results of this thesis show that high local cell density yeast cultures have the potential to aid against two of the major problems for 2nd generation bioethanol production: inhibitors and simultaneous hexose and pentose utilisation.

Akademisk avhandling som för avläggande av teknologie doktorsexamen vid Chalmers tekniska högskola försvaras vid offentlig disputation den 19 februari 2014,klockan 13.30 i KA-salen, Kemigården 4, Göteborg.

Dans l'optique de la production industrielle de proteines recombinantes, l'utilisation de la levure saccharomyces cerevisiae, bien que presentant de nombreux avantages, est souvent limitee par la faible permeabilite de la paroi de ce micro-organisme vis-a-vis des solutes de grande taille. Pour etudier ce probleme, nous avons construit des souches de levure recombinantes exprimant l'alpha-galactosidase de saccharomyces uvarum, enzyme majoritairement periplasmique, qui nous a permis de mesurer des cinetiques d'excretion. A l'aide de cet outil, nous avons dans un premier temps caracterise le mecanisme de passage de l'alpha-galactosidase a travers la paroi en proposant un modele rendant compte de la variation de la permeabilite cellulaire en fonction de la vitesse de croissance. Puis dans un second temps, nous avons fait varier les conditions de culture pour identifier les determinants structuraux limitant cette permeabilite et pour tenter de maximiser la production d'enzyme excrete

Les domaines d'application de la levure sont vastes, allant de la nourriture, de la brasserie à l'énergie verte. La levure Saccharomyces cerevisiae est l'espèce dominante à l’échelle mondiale. En outre, S. cerevisiae est également un organisme modèle important dans la recherche sur la biologie cellulaire moderne et est l'un des micro-organismes eucaryotes les plus étudiés.Ce travail se concentre sur le comportement des cultures de levures exposées à la pression induite par le CO₂ et l'O₂. La pression maximale étudiée est de 9 bar (A) car la pression la plus élevée pouvant être atteinte dans les bioréacteurs à l'échelle industrielle est de 8 bar (A). Afin d'exposer la culture de levure à des conditions de pression, de nouveaux bioréacteurs ont été construits et caractérisés. Deux expériences sont conçues : des expériences pour étudier la croissance des levures et des métabolites sous pression, ainsi que les expériences de biologie moléculaire pour mieux comprendre le comportement des cellules de levures sous différentes pressions d'O₂.La première expérience a permis de mieux comprendre l'influence des pressions de CO₂ et O₂ sur le comportement de culture de S. cerevisiae. En ce qui concerne l’impact du CO₂, l'étude a montré que la culture de levure a des comportements constants sous différentes pressions. Alors qu'en termes de pression O₂, sous 2 à 5 bars (A) de pression atmosphérique, les cellules de levure présentent des taux de croissance plus élevés par rapport à la pression atmosphérique. De plus, le glutathion moléculaire antioxydant a maintenu un équilibre redox. En dessous de 6 à 9 bars (A), la croissance cellulaire est inhibée et 9 bars (A) entraînent une accumulation excessive de glutathion oxydé.D'un autre côté, l'expérience moléculaire a permis de mieux comprendre le comportement de la culture sous les pressions d'O₂. L'étude de plusieurs gènes induits par le stress oxydatif a mis en évidence les effets cellulaires du stress oxydatif et la réponse des mécanismes moléculaires dans les cellules de levure. Il a été démontré que plusieurs gènes induits par le stress oxydatif étaient régulés à la hausse : le gène du facteur de transcription Msn2/4 et Yap 1, les gènes du métabolisme du glutathion GSH2 et GLR, ainsi qu'un gène de synthèse de la superoxyde dismutase SOD2
Yeast fields of application are extensive, ranging from food, brewing to green energy. The yeast Saccharomyces cerevisiae is the worldwide dominating species. In addition, S. cerevisiae is also an important model organism in modern cell biology research and is one of the most thoroughly studied eukaryotic microorganisms.This work focuses on the behaviour of yeast culture exposing to pressure induced by CO2 and O2. The pressure is set up to 9 bar (A) due to the highest pressure can be reached in industrial scale bioreactors is 8 bar (A). In order to expose yeast culture to pressure conditions, new bioreactors were built and characterised. Two experiments are designed: an experiment to investigate the yeast growth and the metabolites under pressure, as well as the molecular biology experiments to better understand yeast cells behaviour under various O₂ pressure.The first experiment has offered a better understanding of the influence of CO₂ and O₂ pressures on S. cerevisiae culture behaviour. Regarding the impact of CO₂, the study has shown that the yeast culture has consistent behaviours under different pressures. While, in terms of O₂ pressure, under 2 to 5 bar (A) air pressure, yeast cells show higher growth rates compared with atmospheric pressure. Furthermore, the antioxidant molecular glutathione kept a redox balance. Under 6 to 9 bar (A), the cells growth is inhibited and 9 bar (A) leads to the excessive oxidised glutathione accumulation.On the other hand, the molecular experiment has derived further insights on the culture behaviour under O2 pressures. The investigation of several oxidative stress induced genes has highlighted the cellular effects of oxidative stress induced by oxygen pressure and molecular mechanisms of oxidative stress response in yeast cell. It was shown that several oxidative stress induced genes were upregulated: transcription factor gene Msn2/4 and Yap 1, glutathione metabolism genes GSH2 and GLR, as well as a superoxide dismutase synthesis gene SOD2

Les levures utilisees en vinification sont produites industriellement en culture discontinue alimentee. Il est souvent admis que les performances des levures pendant le processus de vinification peuvent dependre des caracteristiques (composition cellulaire, etat physiologique, viabilite) que les levures acquierent lors du procede de production. Dans le cadre de ce travail, l'influence des variables operatoires du procede de production de biomasse sur la composition cellulaire des levures, et notamment les teneurs intracellulaires en trehalose et en azote, est tout d'abord analysee. En culture discontinue classique, saccharomyces cerevisiae accumule des quantites relativement faibles de trehalose dans la matrice cellulaire (3-4% du poids sec de la biomasse). Par contre, en culture discontinue alimentee terminee par une phase de choc thermique ou de limitation par la source azotee ou la source carbonee, la teneur intracellulaire en trehalose atteint jusqu'a 14% du poids sec. Un modele pour la description de l'accumulation du trehalose et de la croissance cellulaire est proposee. Bien que la modelisation represente qualitativement le comportement observe, elle requiert encore une validation rigoureuse avant de pouvoir etre utilisee pour la prediction de la teneur en trehalose dans la biomasse. La biomasse produite en culture discontinue alimentee a ete ensuite evaluee dans des conditions proches de la vinification. Les resultats indiquent que la teneur intracellulaire en trehalose de l'inoculum utilise pour ensemencer le jus de raisin n'a pas d'influence sur le deroulement de la fermentation alcoolique, que la levure soit prealablement sechee ou pas. Par contre, lorsque les levures sont sechees, la teneur en trehalose joue un role important dans l'operation de sechage. La viabilite apres sechage des cellules a haute teneur intracellulaire en trehalose (de l'ordre de 10%) est plus elevee que celle des cellules ayant une faible teneur du dimere (inferieure a 6%).

Le caractère aléatoire de la fermentation malolactique des vins impose l'étude de procédés d'activation de la croissance et de l'activité malolactique des bactéries lactiques. Les enveloppes de levures agissent de deux façons sur la fermentation: élimination des produits toxiques du métabolisme des levures, favorisant la croissance et la dégradation de l'acide malique, libération de facteurs nutritionnels utilisés par les bactéries (acides aminés, vitamines entre autres)

Ce travail de these porte sur la caracterisation fonctionnelle de la proteine arp5. Le gene arp5 (ynl059c) a ete identifie au cours du sequencage systematique du genome de la levure s. Cerevisiae en 1995. Il code pour une proteine hypothetique de 755 aa qui presente 26% d'identite et 51% de similarite a l'actine. Des souches de levure deletees du gene arp5 montrent qu'il est tres important voire essentielle pour leur croissance cellulaire (selon leur contexte genetique). Les mutant arp5-d, ainsi que les mutants ponctuels arp5-ts, presentent des phenotypes pleiotropes (incapacite a metaboliser differentes sources de carbone, fragilite de paroi cellulaire, etc). L'integration d'une fusion arp5-gfp (green fluorescent protein) au locus chromosomique arp5 a permis de montrer que la proteine arp5 est nucleaire tout au long du cycle cellulaire. Afin de mieux apprehender ses fonctions nucleaires, nous avons recherche des partenaires fonctionnels ou physiques d'arp5p par l'intermediaire de cribles de suppresseurs-multicopies et de double-hybrides respectivement. La proteine jusqu'alors inconnue afilp (arp-five-interacting) est la seule a avoir ete selectionnee dans les deux cribles. La proteine de fusion afil-gfp est localisee dans le noyau tout au long du cycle. La diversite des phenotypes observes pour les mutants arp5 et afil nous a suggere l'implication d'arp5p et afilp dans une fonction nucleaire generale telle que la transcription ou la maturation des arnm. Des marquages immunologiques sur chromosomes ont montre qu'arp5p et afilp se fixent a la chromatine sous forme de points bien precis (env 15 a 60 par noyau). Par ailleurs, la caracterisation d'un phenotype spt (suppressor of ty) dans les mutants arp5-d suggere qu'arp5p est impliquee plus precisement dans la regulation de la structure chromatinienne. De plus, la sensibilite des mutants arp5 et afil a des agents dommageables pour l'adn indique qu'arp5p et afilp pourraient etre impliquees dans la reparation de l'adn. Les resultats decrits dans ce travail montre qu'arp5p et afilp interagissent physiquement pour remplir une fonction commune. Ils convergent vers l'implication d'arp5p dans le controle transcriptionnel ou la reparation de l'adn via le remodelage de la chromatine.

Des mutations dans les gènes codant pour des myotubularines (MTM) sont responsables de maladies neuromusculaires telles que la XLCNM (MTM1) ou la CMT4 (MTMR2 & MTMR13). Les MTMs sont des phosphatases à phosphosinositides (PPIn), des messagers lipidiques essentiels pour la régulation spatio-temporelle de fonctions cellulaires vitales.La présence de 14 paralogues de MTMs chez l'Homme complique l'analyse de la fonction cellulaire d'un seul membre de la famille. La levure Saccharomyces cerevisiae, dont l'organisation cellulaire est comparable à une cellule humaine, ne compte en revanche qu'un seul homologue de MTM (YMR1), pour lequel nous disposons de mutants de délétion viables.L'expression de MTM1 sauvage ou mutants de patients dans la levure montre seules les myotubularines enzymatiquement actives induisent une morphologie anormale du compartiment lysosomal et un défaut du trafic membranaires endocytique.Nos résultats suggèrent que l'activité phosphatase de MTM1 ne serait pas à elle seule responsable de la XLCNM mais que d'autres mécanismes, tels que les interactions protéiques, pourraient prendre part au développement de la maladie.

Les puroindolines sont des protéines de 13 kDa qui sont impliquées entre autre dans la friabilité du grain de blé tendre. La fonction cellulaire des puroindolines et la régulation de l'expression des gènes qui les codent sont peu des domaines de recherche peu explorés. Nous avons donc étudié les interactions cellulaires des puroindolines dans un système hétérologue, la levure Saccaromyces cerevisiae. Les puroindolines ne forment pas d'homodimères ni d'hétérodimères mais elles interagissent in vivo avec la membrane plasmique de la levure. Par mutagénèse dirigée nous avons montré que pour la puroindoline-a cette interaction implique le domaine riche en tryptophane, alors que ce n'est le cas pour la puroindoline-b. Parallèlement, les promoteurs des gènes PinA et PinB ont été étudiés dans des riz transgéniques. Alors que le gène PinB s'exprime uniquement dans le grain, le gène PinA s'exprime aussi dans d'autres organes et est inductible par blessure dans les tiges et les feuilles de riz
Puroindolines are 13kDa proteins, involved in wheat grain softness. Nethertheless, Cell function and Pin genes expression regulation are not very well documented. Puroindolines cell interactions were studied in the yeast Saccaromyces cerevisiae. Puroindolines do not form homo or heterodimer but interact in vivo with the yeast plasma membrane. Site directed mutagenesis approach highlighted that the tryptophan rich domain of puroindoline-a is involved in this interaction but not in the case of puroindoline-b. In parallel, promoter of both PinA and PinB genes were studied in transgenic rice plants. PinA and PinB genes are expressed in the grain and regulated during development. Whereas PinB gene expression is grain specific, PinA gene is expressed also in other organs is wound induced in stems and leaves

L’utilisation de plusieurs souches de levures au sein d’un même inoculum peut être envisagée pour la réalisation de la fermentation alcoolique afin d’associer diverses potentialités technologiques complémentaires. Toutefois, ces associations sont limitées par l’apparition d’interactions entre souches peu étudiées jusqu’à maintenant. Nous avons tout d’abord mis au point un modèle expérimental mettant en jeu un couple de souches / Saccharomyces cerevisiae / Saccharomyces uvarum en co-culture, et permettant de mettre en évidence de telles interactions au niveau de la cinétique de fermentation, de la croissance, des produits de fermentations et du potentiel d’oxydo-réduction cellulaire. Ces modifications ont été attribuées à la diffusion d’un métabolite entre les deux souches : l’acétaldéhyde. L’extension de l’étude à diverses souches de Saccharomyces cerevisiae a révélé une production précoce importante d’acétaldéhyde pour certaines souches, propriété non encore mise en évidence par ailleurs. Afin de mieux étudier l’effet d’une telle production précoce d’acétaldéhyde au sein d’une co-culture, nous avons simulé l’élimination ou la perfusion précoce d’acétaldéhyde par des moyens physiques sur diverses souches. Les modifications métaboliques induites et leurs intensités restent très spécifiques pour chaque souche. L’étude plus particulière de la perfusion précoce d’acétaldéhyde en conditions de carence en Zinc, perfusion qui abolit les effets phénotypiques de cette carence chez de nombreuses souches de levure a été effectuée par des techniques d’analyses transcriptômique et protéômique. Cette étude nous a permis d’identifier une réponse métabolique coordonnée de la cellule à cette perfusion d’acétaldéhyde.

La chromatine est l'assemblage du matériel génétique, l'ADN et de protéines appelées histones. En plus de leur fonction d'entreposage du génome, ces dernières régulent l'accessibilité de l'ADN aux divers facteurs de régulation. Le variant d'histone H2A.Z est incorporé autour des promoteurs réprimés chez Saccharomyces cerevisiae. Ce variant semble impliqué dans la préparation des gènes réprimés. Cette préparation permet une expression rapide de ces gènes selon les conditions régulant leur activation. Bien qu'il soit essentiel à la viabilité chez les eucaryotes supérieurs, la délétion du gène HTZ1 n'est pas létale chez la levure. Celle-ci engendre cependant plusieurs phénotypes sévères, dont un ralentissement du cycle cellulaire et une sensibilité accrue à divers agents pharmacologiques. Par exemple, la caféine entraîne un arrêt en phase G1 chez le mutant. Cet arrêt correspond au point de contrôle du cycle cellulaire le plus important, le point de départ (START). Il est régulé de façon très stricte par la croissance et la taille des cellules. Lorsque toutes les conditions prolifératives sont réunies, une cascade positive active la cycline-kinase Cdc28 couplée à la cycline Cln3. Celles-ci phosphorylent l'inhibiteur (Whi5) du complexe de facteur de transcription responsable de l'induction des cyclines de la phase G1. Ce complexe, SBF, est normalement déjà lié aux promoteurs de ces cyclines et prépare le gène à une induction forte et rapide au moment opportun.

La chromatine est l'assemblage du mat??riel g??n??tique, l'ADN et de prot??ines appel??es histones. En plus de leur fonction d'entreposage du g??nome, ces derni??res r??gulent l'accessibilit?? de l'ADN aux divers facteurs de r??gulation. Le variant d'histone H2A.Z est incorpor?? autour des promoteurs r??prim??s chez Saccharomyces cerevisiae. Ce variant semble impliqu?? dans la pr??paration des g??nes r??prim??s. Cette pr??paration permet une expression rapide de ces g??nes selon les conditions r??gulant leur activation. Bien qu'il soit essentiel ?? la viabilit?? chez les eucaryotes sup??rieurs, la d??l??tion du g??ne HTZ1 n'est pas l??tale chez la levure. Celle-ci engendre cependant plusieurs ph??notypes s??v??res, dont un ralentissement du cycle cellulaire et une sensibilit?? accrue ?? divers agents pharmacologiques. Par exemple, la caf??ine entra??ne un arr??t en phase G1 chez le mutant. Cet arr??t correspond au point de contr??le du cycle cellulaire le plus important, le point de d??part (START). Il est r??gul?? de fa??on tr??s stricte par la croissance et la taille des cellules. Lorsque toutes les conditions prolif??ratives sont r??unies, une cascade positive active la cycline-kinase Cdc28 coupl??e ?? la cycline Cln3. Celles-ci phosphorylent l'inhibiteur (Whi5) du complexe de facteur de transcription responsable de l'induction des cyclines de la phase G1. Ce complexe, SBF, est normalement d??j?? li?? aux promoteurs de ces cyclines et pr??pare le g??ne ?? une induction forte et rapide au moment opportun.

L’objectif principal de ce travail de thèse est d’étudier les effets de différentes cinétiques de stress thermiques sur la physiologie de deux microorganismes : la levure S. Cerevisiae et la bactérie E. Coli. La première partie permet de comprendre les mécanismes physiologiques impliqués dans la survie et la mort de cellules exposées à différentes cinétiques de stress thermiques. Les microorganismes ont été exposés à une rampe thermique (0,5 °C. Min-1) ou un choc thermique (10 s) appliqués entre la température de croissance et une température connue pour être létale : 50 °C suivis ou non d’un maintien d’1 h à 50 °C. La part relative des mécanismes passifs (mettant en jeu les propriétés physicochimiques des constituants cellulaires) et actifs (mise en jeu des voies de régulation physiologiques) dans la survie et la mort cellulaire induites par de tels stress thermiques a été étudiée. Les résultats ont confirmé que l’application d’une rampe thermique permet d’initier un certain degré de thermotolérance à 50 °C lié à des mécanismes passifs permettant de maintenir l’intégrité de la membrane plasmique. Les mécanismes actifs tels que la synthèse de protéines néo-synthétisées et des Heat Shock Proteins (GroEL et GrpE chez la bactérie mais pas la HSP104 chez la levure) jouent un rôle minoritaire pendant le maintien ultérieur à 50 °C chez la bactérie alors qu’ils sont absents chez la levure. Par ailleurs, un choc thermique provoque une mortalité très importante principalement corrélée à une altération de la structure de la membrane plasmique. La seconde partie a permis d’apprécier les effets d’une rampe très lente (1 °C. 12 h-1) et de longue durée (9,5 jours) sur la physiologie de la bactérie mésophile E. Coli. Les cellules bactériennes se sont développées jusqu’à un niveau de température supraphysiologique : 54 °C. Des expérimentations complémentaires ont montré que ce type de thermotolérance met en jeu des mécanismes d’acclimatation indépendants de tout remaniement du génome (adaptation). La troisième et dernière partie a permis d’illustrer une application des chocs thermiques via l’utilisation d’un procédé original : le traitement par champs électriques. Ce type de traitement induit une élévation très rapide de température localisée au niveau intracellulaire en raison de la conductivité électrique importante du cytoplasme par rapport au milieu extracellulaire utilisé
The aim of this work was to study the effects of different heat stress kinetics on the physiology of two microorganisms : the yeast S. Cerevisiae and the bacteria E. Coli. First part led to better understand cellular mecanisms involved in survival and death of cells exposed to a heat slope (0,5 °C. Min-1) or a heat shock (10 s) from the growth temperature to a known lethal one : 50 °C both followed or not by a 1 h maintaining phase at 50 °C. Relative part of passive (physico-chemical properties of cell constituants) and active (physiological pathway regulation) involved in this type of survival and death were studied. Results confirmed that heat slope application induced a certain degree of thermotolerance at 50 °C which was mainly related to passive mechanisms and more particularly to maintainance of plasma membrane integrity. Active mechanisms as de novo and HSPs (GroEL and GrpE in bacteria but not HSP104 in yeast) synthesis played a minor role in survival during the following 1 h plateau phase at 50 °C. Moreover, a heat shock induced a high level of cell mortality which was related to severe alteration of plasma membrane. Second part led to appreciate the effects of a slow (1 °C. 12 h-1) and long (9. 5 days) heat slope on the mesophilic bacteria E. Coli. Bacterial cells grew up to a temperature higher than the upper limit of their thermal niche : 54 °C. Complementary experiments showed that this type of thermotolerance was related to acclimation processes and not to adaptative ones (which imply genomic mutations). Third part leads to illustrate applications of heat shock using an original thermal process : electric field treatment. Such a treatment induced a high and very fast temperature increase into the intracellular medium due to a higher electrical conductivity than the extracellular medium

ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) est un récepteur tyrosine kinase, initialement découvert dans la protéine de fusion NPM-ALK, qui est le produit de la translocation t(2;5) fréquemment associée au lymphome anaplasique à grandes cellules (ALCL). La protéine NPM-ALK est oncogénique du fait d'une activation constitutive de la kinase ALK. La protéine ALK native n'est jamais détectée dans les lymphocytes normaux. En revanche, elle est normalement exprimée dans le système nerveux au cours du développement, et plus faiblement, chez l'adulte. Notre laboratoire avait montré que NPM-ALK était anti-apoptotique quand elle était exprimée dans les cellules lymphoblastiques Jurkat traitées par des agents cytotoxiques. Dans cette thèse nous montrons que les cellules Jurkat surexprimant le récepteur ALK sauvage, contrairement à celles exprimant NPM-ALK, sont plus sensibles à l'apoptose induite par la doxorubicine que les cellules parentales. De plus, la protéine ALK est clivée durant l'apoptose de façon caspase-dépendante. La mutation des résidus acide aspartique en asparagine nous a permis de localiser le site de clivage dans la partie juxta-membranaire de ALK. Dans le but d'évaluer le rôle de ALK dans des cellules neuronales, nous avons transfecté ALK, d'une manière transitoire, dans la lignée cellulaire immortalisée neuroblastique de rat 13. S. 1. 24. L'expression de ALK, en condition de privation sérique, a facilité l'induction de la mort cellulaire de ces neuroblastes par apoptose. Au contraire, la ligation de ALK par un anticorps activateur spécifique (activant la kinase) diminue l'apoptose facilitée par ALK aussi bien dans les lignées lymphoïdes que neuronales. .
ALK (anaplastic lymphoma kinase) is a receptor tyrosine kinase, initially discovered as part of the NPM-ALK fusion protein, resulting from the t(2;5) translocation that is frequently associated with anaplastic large cell lymphomas. The native ALK protein is normally expressed in the developing and, at a weaker level, adult nervous system. We recently demonstrated that the oncogenic, constitutively kinase activated NPM-ALK protein was antiapoptotic when expressed in Jurkat lymphoblastic cells treated with cytotoxic drugs. In contrast, we now show that Jurkat cells overexpressing the wild type ALK receptor are more sensitive to doxorubicin-induced apoptosis than parental cells. Moreover, the ALK protein is cleaved during apoptosis in a caspase-dependent manner. Mutation of aspartic residues to asparagine allowed us to map the caspase cleavage site in the juxta-membrane region of ALK. In order to assess the role of ALK in a neural derived tissue, we transiently expressed ALK in the 13. S. 1. 24 rat neuroblast immortalized cell line. ALK expression led to apoptotic cell death of the neuroblasts. ALK ligation by specific activating antibodies decreased ALK-facilitated apoptosis in both lymphoid and neuronal cell lines. Moreover, ALK transfection reduced the survival of primary cultures of cortical neurons. Thus, ALK has a proapoptotic activity in the absence of ligand, whereas it is antiapoptotic in the presence of its ligand and when the kinase is intrinsically activated. .

Many industrially important fungi can grow in the form of small spherical pellets.Such pellets reduce the viscosity and enhances mass transfer rates in culture broths.The pelleted morphology also influences the fungus’s metabolism, directing it tospecific metabolites. The pellets are easily harvested from the broth and recycled.These properties makes pelleted morphology very attractive.The pelleted morphology of four Zygomycetes strains was studies. Several differentnutrient media used by other researchers for achieving pelleted growth was tested.The influence of eight factors on pelletization of Rhizopus sp. in a completely definedmedium was determined using a fractional central composite design and logistic regression.Pelleted growth of all four Zygomycetes was achieved, with very good results for twoRhizomucor sp. strains. A simple medium containing calcium carbonate was foundto induce pelletization with very high reproducibility.Immobilization of yeast cells was attempted in pellets of Rhizomucor. It was foundthat a flocculating yeast can be immobilized inside pellets of fungal mycelium, forming”biocapsules”. This is accomplished by first using a medium that induces pelletizationof the filamentous fungus and does not allow for growth of the yeast. Thepellets are then inoculated into a second medium that induces growth and flocculationof the yeast and inhibits further growth of the filamentous fungus.Non-flocculating yeasts could not be immobilized, suggesting that the flocculin proteinsin the cell wall of flocculating strains are important for proper immobilization.The flocculation and immobilization arises due to expression of several differentFLO-genes and the importance of these genes for successful immobilization isdiscussed.The results demonstrate that the morphology of Zygomycetes can be controlled andthat this may be useful in industrial fermentation. The new immobilization techniquereveals the great importance of flocculation and cell surface hydrophobicity. Usingyeast strains that express certain FLO-genes may be beneficial in fermentation oflignocellulosic hydrolysates.Microscopy techniques were developed that allows for high quality microphotographyof pellets and thin cross-sections of pellets and biocapsules.
Program: MSc in Resource Recovery - Industrial Biotechnology

Apres un apercu bibliographique faisant le point sur la floculation levurienne certaines caracteristiques de l'activite invertasique et de la floculation des souches utilisees dans ce travail ont ete definies experimentalement. Un protocole de defloculation avec l'acide ethylene diamine tetraacetique a ete mis au point. L'influence des conditions de culture sur l'activite enzymatique et la floculation a ete determinee. Les conditions optimales pour l'expression de chacun des deux phenomenes sont souvent differentes. L'etude d'un couple constitue par une souche floculante et son mutant respiratoire mitochondrial non floculant a ensuite ete realisee: la comparaison des activites invertasique et fermentaire des deux biotypes a souligne l'importance du controle des differentes proprietes des souches mutantes. La determination de parametres caracterisant le systeme heterogene constitue par un floc a permis de preciser le mode et les coefficients de diffusion de differents substrats dans les levures floculantes. Une etude cinetique (theorique puis experimentale) de l'activite invertasique dans les flocs de levure a ensuite ete engagee et a montre que cette activite est localisee a la surface du floc. Ce travail a ete complete par l'observation du comportement enzymatique et de la floculation de saccharomyces cerevisiae 38a au cours de cultures discontinues, puis continues en reacteurs pilotes. Certaines differences ont ainsi pu etre relevees entre des conditions statiques (methode analytique de dosage de l'activite invertasique) et un equilibre dynamique (cultures en reacteurs)

The present thesis, which includes four main researches, aimed to study functional meat and meat products obtained from unconventional meat species, namely the rabbit and the ostrich. The first research tested the single and combined dietary supplementation with 5% Spirulina (Arthrospira platensis) and 3% Thyme (Thymus vulgaris) to growing rabbits for 3 and 6 weeks, and it is articulated in four different subchapters. The first subchapter considered the effect on total tract apparent digestibility of nutrients and on the performances of growing rabbits and showed that that single and combined supplementation with Spirulina reduced the nutritive value of the diets. Despite this, no substantial effect on growth performance and health status, was observed. Future studies should take into consideration feed processing technology, pelleting, storage and packaging conditions, as they may reduce or nullify the nutrient and functional compounds’ availability. Moreover, Spirulina and/or Thyme effect on health status should be tested under poorer sanitary conditions. The second subchapter studied the effects on growing rabbit carcass composition, meat and bone rheological traits, and the vitamin B12 content of Longissimus dorsi (LD) meat. Spirulina was confirmed as a rich source of vitamin B12 that was successfully transferred into LD meat, thus demonstrating its value as an effective natural supplement in producing food fortified with this vital element. With this exception, the supplement as well as and the duration of treatment had no effect on the considered traits. The third subchapter evaluated the effect on rabbit meat during retail display. Thyme improved colour parameters and reduced exudative losses during a simulated retail display, also considering a shorter supplementation period. This would positively impact consumers at the time of purchase as well as farmers demand to limit production costs. Differently, Spirulina had no effect on oxidative stability of rabbit meat, maybe for the poor absorption from the gut as a result of interference on uptake of antioxidants by Spirulina, or maybe because dietary level of Spirulina was not adequate for rabbits requirements. The fourth subchapter studied the effects on raw and cooked rabbit meat quality, nutrient true retention and protection against oxidative stress conditions. The dietary inclusion of Spirulina improved the FA profile of the Longissimus dorsi and hind leg meat by significantly increasing γ-linolenic acid content. Thyme improved the oxidative stability of raw and freeze-dried HL meat but not that of cooked meat. As for the shelf-life trial, Spirulina was not observed to improve the oxidative stability of rabbit meat subjected to severe oxidative stress. The second research of the present thesis, aimed to evaluate the effect of the dietary single or combined supplementation with different natural additives (Oregano, Rosemary, vitamin E and Saccaromyces cerevisiae) on the performance of growing rabbits, the nutritional composition and oxidative stability of their meat and on their hind leg bone traits. The results of this research demonstrated that an adequate supplementation with natural antioxidants can also have a positive effect on productive performance and meat quality. The fifth chapter evaluated, for the first time, the unfermented and fermented rooibos (Aspalathus linearis) in preventing lipid oxidation in ostrich meat patties and ostrich salami. This plant showed interesting and promising antioxidant potential when applied to meat products, even if further study are necessary to deeply investigate long-term effects. The sixth chapter studied the effect of two different fat inclusion levels, NaCl contents and two LAB starter cultures on the weight loss, proximate composition and cholesterol content of ostrich salami ripened for 10 and 20 weeks. A lower fat content consistently shortened ripening time, thus being a positive aspect in terms of productivity, and it determined a higher nutrients concentration compared to high fat salami. Reducing the NaCl inclusion, retarded the weight loss of the product of about 1 week, without affecting its proximate composition. Finally, the metabolic activity of tested LAB starter cultures seemed to be influenced by the fat inclusion level, ultimately affecting the healthiness of the products at 10 weeks of ripening
La presente tesi si compone di quattro ricerche principali e si propone di studiare carne e prodotti carnei funzionali ottenuti da specie non convenzionali, lo struzzo e il coniglio. La prima ricerca ha testato l’inclusione singola o combinata, per 3 o 6 settimane, con il 5% di Spirulina (Arthrospira platensis) ed il 3% di Timo (Thymus vulgaris) nella dieta di conigli in accrescimento. Questo primo capitolo si articola in quattro sottocapitoli. Il primo ha considerato l’effetto sulla digeribilità apparente delle diete e sulle prestazioni produttive di conigli in accrescimento e ha evidenziato che l’inclusione separata o combinata di Spirulina ha ridotto il valore nutritivo delle diete. Nonostante ciò, non è stato osservato alcun effetto sulle prestazioni produttive e sullo stato di salute degli animali. Studi futuri dovranno considerare la tecnologia di produzione del mangime, la pellettatura e le condizioni di confezionamento e stoccaggio, in quanto potrebbero ridurre o nullificare la disponibilità di componenti nutritivi e funzionali. Inoltre, l’inclusione di Spirulina e/o Timo dovrebbe essere testata in condizioni sanitarie più critiche. Il secondo sottocapitolo ha valutato l’effetto dell’inclusione di Spirulina e Timo sulla composizione della carcassa, le caratteristiche reologiche di carne ed ossa ed il contenuto di vitamina B12 del Longissimus dorsi (LD). Spirulina ha confermato di essere una fonte di vitamina B12, la quale è stata trasferita con successo nella carne del LD. Spirulina ha quindi dimostrando il suo valore quale additivo naturale per produrre alimenti fortificati con questo elemento. Per quanto riguarda gli altri aspetti considerati nella presente ricerca, gli additivi naturali testati non hanno avuto alcun effetto. Il terzo sottocapitolo ha studiato la “shelf-life” della carne fresca di coniglio durante una simulazione di esposizione finalizzata alla vendita. Il timo ha migliorato il colore e ridotto le perdite essudative della carne, anche quando è stato somministrato per il periodo più breve. Questo risultato da un lato è in grado di influenzare positivamente il consumatore al momento dell’acquisto, e dall’altro va incontro alle esigenze dell’allevatore di limitare i costi di produzione. Al contrario, Spirulina non ha avuto alcun effetto sulla stabilità ossidativa della carne, forse per uno scarso assorbimento intestinale dovuto all’interferenza degli antiossidanti presenti nella Spirulina stessa, oppure perché il livello di inclusione nella dieta non era adeguato alle esigenze dei conigli. Il quarto sottocapitolo ha testato l’effetto sulla qualità della carne cruda e cotta, sulla ritenzione reale dei nutrienti e sulla protezione nei confronti di condizioni di stress ossidativo. L’inclusione di Spirulina ha migliorato il profilo acidico del Longissimus dorsi e dell’arto posteriore di coniglio, attraverso l’aumento del contenuto dell’acido grasso γ-linolenico. Il Timo ha migliorato la stabilità ossidativa della carne dell’arto posteriore cruda e liofilizzata, ma non quella della carne cotta. Come era stato osservato nel precedente esperimento sulla “shelf-life” della carne di coniglio, Spirulina non ha migliorato la stabilità ossidativa della carne sottoposta a stress ossidativo intenso. Il secondo capitolo della presente tesi, ha considerato l’effetto dell’inclusione singola o combinata con diversi additivi naturali (Origano, Rosmarino, vitamina E e Saccaromyces cerevisiae) sulle prestazioni produttive di conigli in accrescimento, la composizione nutrizionale e la stabilità ossidativa della carne nonchè sulle caratteristiche ossee degli arti. I risultati di questa ricerca hanno dimostrato che un’adeguata inclusione di antiossidanti naturali nella dieta di conigli in accrescimento ha avuto un effetto positivo anche sulle prestazioni produttive e sulla qualità della carne. Il quinto capitolo, invece, ha studiato per la prima volta l’applicazione di rooibos (Aspalathus linearis), fermentato e non, sulla carne e prodotti derivati. In particolare, è stata valutata la sua capacità di prevenire l’ossidazione lipidica in polpette e salami di struzzo. I risultati hanno rivelato un interessante e promettente potenziale antiossidante di questa pianta nei confronti dei prodotti carnei testati. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per esaminarne l’efficacia a lungo termine. Il sesto ed ultimo capitolo, ha valutato due diversi livelli di grasso e NaCl, e due diversi starter microbici, sulle perdite di peso, composizione centesimale e contenuto di colesterolo di salami di struzzo stagionati per 10 e 20 settimane. Un minore contenuto di grasso ha ridotto considerevolmente il tempo di stagionatura, essendo quindi un aspetto positivo in termini di produttività, e ha determinato una maggiore concentrazione di nutrienti rispetto al salame preparato con il più alto livello di grasso. La riduzione del contenuto di NaCl ha ritardato le perdite di peso dei salami di 1 settimana, senza tuttavia modificare la composizione centesimale del prodotto. Infine, l’attività metabolica degli starter microbici testati è sembrata essere condizionata dal contenuto di grasso del salame e ciò, a 10 settimane di stagionatura, ha influenzato la salubrità del prodotto

Les potentialités liées aux cultures mixtes de micro-organismes sont immenses et ouvrent de vastes possibilités pour l’innovation dans les bioprocédés. Cependant, étant donné la complexité des phénomènes régulant la physiologie d’un seul micro-organisme, leur mise en oeuvre en culture mixte est d’autant plus difficile à maîtriser que des interactions entre ces micro-organismes viennent s’ajouter. Le travail présenté dans ce manuscrit est une étude d'un couple de levures oenologiques constitué de Saccharomyces cerevisiae et de Torulaspora delbrueckii. Son objectif est d'acquérir des informations expérimentales afin d’analyser et in fine modéliser l'évolution des cultures pures et des cultures mixtes. L'analyse des données expérimentales acquises lors des cultures pures de chaque levure a permis de quantifier l'effet favorable de la concentration initiale d'azote assimilable sur la croissance et la vitesse de fermentation des deux levures. Elle a aussi mis en évidence une prolongation de la phase de latence de T. delbrueckii induite par une augmentation des facteurs anaérobies. Les cultures mixtes ont été réalisées en présence et en absence de membrane de séparation permettant ainsi d'observer les effets du contact physique sur l'évolution des cocultures. Le contact physique influence la dynamique des populations. En culture mixte, S. cerevisiae domine T. delbrueckii dans un milieu synthétique classique. Une augmentation de la concentration initiale de facteurs anaérobies inverse complètement cette domination. L'analyse des résultats expérimentaux nous a orienté vers le développement d'un modèle «stoechio-cinétique» structuré dans lequel l'azote assimilé par la levure se répartit en deux compartiments: le compartiment constitutif et le compartiment de stockage. Ce modèle a permis une représentation fidèle des cinétiques observées en culture pure. La prise en compte des interactions s'est faite en intégrant la compétition pour les substrats, les interactions indirectes et les interactions directes. L'ensemble des hypothèses émises lors de ce travail de modélisation souligne la nécessité d'approfondir les connaissances scientifiques concernant le métabolisme deT. delbrueckii en anaérobiose stricte et l'effet des facteurs anaérobies sur les interactions microbiennes.

碩士
國立雲林科技大學
工業化學與災害防治研究所
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A non-linear kinetic model to predict the production of γ-glutamyl- cysteine (γ-GC) and glutathione (GSH) by a mutant of baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae FC-3 was proposed. When sucrose was selected as the carbon source, results of the kinetic analysis showed that γ-GC production was non-growth associated, while GSH was growth associated. Data obtained from various initial sucrose concentrations in flask-scale fermentation were used to develop the kinetic model, and their effects on the kinetic parameters were also examined. Moreover, it was found that the logistic equation, growth-associated production with a lag time and the modified Luedeking-Piret equation could satisfactorily describe the cell growth, product formation and sugar consumption, respectively. To improve the production of γ-GC and GSH, the fed-batch operation based on the batch-culture kinetics was also studied, and the results showed that biomass, γ-GC and GSH increased about 11.6 %, 23.5 % and 7.76 %, respectively.

Pour une bonne maîtrise de la fermentation malolactique (FML) en vinification, il est important d’étudier les différents types d’interactions pouvant exister entre les souches de Saccharomyces cerevisiae et d’Oenococcus oeni, d’identifier les phénomènes et les molécules qui en sont responsables et de définir la façon pertinente de gérer le procédé notamment pour l’inoculation de ces souches. Dans ce travail, nous avons testé plusieurs couples levure-bactérie en appliquant deux stratégies d’inoculation différentes : cultures séquentielles et co-cultures, dans des milieux synthétiques liquides simulant les milieux naturels. Pour les cultures séquentielles, les bactéries lactiques ont été ensemencées à la fin de la fermentation alcoolique alors que pour les cultures mixtes les levures et les bactéries ont été ensemencées simultanément. La réalisation des cultures séquentielles a permis de quantifier l’inhibition ou la stimulation de la FML en fonction des souches sélectionnées dans un couple. Nous avons pu mettre en évidence que l’inhibition de la FML peut être en partie due à des peptides inhibiteurs, piste peu exploitée jusqu'à présent. La caractérisation partielle de deux peptides inhibiteurs synthétisés par deux souches de levure a pu être réalisée. Cet effet inhibiteur se rajoute à celui de certaines molécules inhibitrices déjà connues. Comme alternative aux cultures séquentielles, des cultures mixtes de certains couples ont été réalisées dans un bioréacteur à membrane, outil d’étude dont l’avantage est de séparer physiquement les souches tout en permettant l’homogénéisation du milieu. Pour certains couples, la co-inoculation a pu améliorer le rendement de la FML sans risque de déviation. Les résultats montrent que le choix du couple levure-bactérie est un critère très important dans la réussite de la FML. La réalisation de la co-culture peut être intéressante pour certains couples. En revanche une interaction positive a pu être observée pour d’autres couples dans le cas de cultures séquentielles. Cette stratégie classique peut alors être conservée.

This thesis describes the application of a non-genetic engineering approach, adaptive evolution, to generate variants of Saccharomyces cerevisiae that produce reduced levels of ethanol relative to the strains they were derived from. Sub-lethal concentrations of sulfite, which sequesters acetaldehyde, thereby limiting ethanol production, was used as a selection pressure. However, removal of acetaldehyde not only limits ethanol production, it also compromises redox balance by preventing the fermentative oxidation of NADH. To compensate for this, the cell regenerates NAD by producing increased amounts of glycerol; glycerol production is an NADH-driven reductive process. It was demonstrated in this thesis that culturing yeast in presence of sulfite for a number of generation, results in the generation of genetically stable variants with increased glycerol and reduced ethanol production.