Tesis sobre el tema "Rectum – Cancer – Aspect immunologique"

Dans ce travail de thèse, j’ai analysé la qualité de l’infiltrat immunitaire des cancers du rectum localement avancés (LARC) et montré qu’une adaptation du test Immunoscore aux biopsies diagnostiques (ISB : infiltration tumorale en lymphocytes T CD3+ et CD8+) était réalisable. Sur deux cohortes (n1 = 131, n2=118) de patients LARC traités par radiochimiothérapie néoadjuvante (nRCT) avant chirurgie, j’ai observé que la qualité de l’infiltrat immunitaire, évalué par ISB, avait une valeur pronostique en termes de survie sans récidive [HR= 0.21 ; 95%CI 0.06-0.78, P=0.009], et était prédictive de la qualité de la réponse à la nRCT (P<0.001). Les analyses transcriptomiques et protéiques tumorales ont montré une hétérogénéité de réponse immunitaire locale à la nCRT. Une augmentation significative du niveau d’expression de gènes impliqués dans la cytotoxicité (GZMA, GZMH, GZMK, PRF-1), la réponse Th1 (TBX21, STAT4), l’activation (CD69) et la co-stimulation inhibitrice (CTLA-4, LAG3) était observée chez les patients répondeurs. Le statut d’activation immunitaire post-nCRT, était corrélé à l’ISB initial. L’ISB couplé aux examens d’imagerie post-nRCT améliore la prédiction de réponse complète histologique à la nRCT, et donc la sélection de patients éligibles à une stratégie de conservation d’organe (Watch&Wait, W&W). Sur 2 cohortes indépendantes de patients W&W, un ISB High prédisait un faible risque de récidive à 5 ans (3% ; CI95% 0-10%). Enfin, nous avons montré que les patients répondeurs à la nRCT pourraient présenter des signes de stimulation immunitaire adaptative T et B, soulignant le bénéfice immunitaire d’une préservation d’organe (et des ganglions drainants) en situation de réponse à la nCRT
In this work, I analyzed the quality of the immune infiltrate of locally advanced rectal cancer (LARC) and showed that an adaptation of the Immunoscore test to diagnostic biopsies (ISB: tumor infiltration in T cells CD3+ and CD8+) was feasible. In two cohorts (n1=131, n2=118) of LARC patients treated with neoadjuvant radiochemotherapy (nRCT) before surgery, I observed that the quality of the immune infiltrate, assessed by ISB, had a prognostic value in terms of recurrence-free survival [HR= 0.21; 95%CI 0.06-0.78, P=0.009], and was predictive of the quality of the response to nRCT (P<0.001). Tumor transcriptomic and protein analyses showed heterogeneity in local immune response to nCRT. A significant increase in the expression level of genes involved in cytotoxicity (GZMA, GZMH, GZMK, PRF-1), Th1 response (TBX21, STAT4), activation (CD69) and inhibitory costimulation (CTLA-4, LAG3) was observed in responder patients. The post-nCRT immune activation status correlated with the initial ISB. ISB coupled with post-nRCT imaging improves the prediction of histological complete response to nRCT, and thus the selection of patients eligible for an organ preservation strategy (Watch&Wait, W&W). In 2 independent cohorts of W&W patients, a High ISB predicted a low risk of recurrence at 5 years (3%; CI95% 0-10%). Finally, we showed that nRCT responder patients could show evidence of adaptive T and B immune stimulation, highlighting the immune benefit of organ (and draining lymph node) preservation in the nRCT response setting

Nous avons analysé la relation entre le risque de cancer colorectal et la consommation de viande et de poisson dans la population qui participe dans l’Etude Prospective Européenne sur le Cancer et la Nutrition. Il s’agit d’une étude sur plus de 400 000 sujets volontaires de dix pays européens. Le risque de cancer colorectal apparaît lié à un niveau de consommation élevé de viande rouge. Le hazard ratio associé à une consommation supérieure à 160 grammes par jour par rapport à une consommation inférieure à 20 grammes par jour est de 1. 35 (95% IC=0. 96-1. 88). La consommation élevée de poisson semble diminuer le risque de cancer colorectal. Le hazard ratio pour une consommation de poisson supérieure à 80 grammes par jour par rapport à celle de moins de 10 grammes par jour est de 0. 69 (IC=0. 54-0. 88). La consommation de volailles n’a pas d’incidence sur le risque de cancer colorectal. Nous avons intégré par méta-analyse nos résultats avec ceux des études prospectives publiées entre 1990 et juin 2006. D’après 14 études, le risque relatif moyen associé aux niveaux de consommation de viande rouge les plus hauts par rapport aux niveaux les plus bas est de 1. 34 (95% CI=1. 09-1. 21). En ce qui concerne les niveaux de consommation de poisson les plus hauts par rapport aux niveaux les plus bas (treize études), le risque relatif moyen est de 0. 87 (95%CI=0. 78-0. 97). Nos résultats montrent qu’une diminution des apports de viande rouge parmi les gros consommateurs devrait conduire à une diminution du risque de cancer colorectal pour cette population. La consommation de fibre alimentaire et de poisson en grosses quantités semble diminuer le risque, mais cette relation doit être confirmée par d’autres études.

IntroductionLe cancer colorectal est la 2ème cause de mortalité par cancer en France (HAS, 2013) mais aussi le 3ème cancer le plus fréquent (INCa, 2014). Un dépistage organisé existe depuis 2008, pourtant, les taux de participation restent faibles : 33,5% en France (Santé Publique France, 20018). D’après la littérature, les principaux freins à la participation au dépistage sont le manque de confiance envers le système de soins (Clavarino et al, 2004) ; l’embarras, l’inconfort et le déplaisir accompagnant les procédures des tests (Varela et al, 2010) ; ou encore le manque de temps. Enfin, le manque de recommandations de la part du médecin représente l’un des freins les plus importants (Walsh et al, 2010 ; Powell et al, 2009). Le test Hémoccult II, utilisé dans le cadre du dépistage organisé jusqu’en mars 2015, a été remplacé par un nouveau test immunologique, jugé plus sensible, plus spécifique et plus fiable par la communauté médicale (INCa, 2014).Objectifs et méthodeAu regard des faibles taux de dépistage et des principaux freins identifiés dans la littérature, ce travail de thèse a pour but d’analyser les déterminants de la participation au dépistage à la fois du point de vue des patients mais aussi des médecins généralistes. De plus, il apparaît nécessaire d’évaluer les enjeux de l’arrivée du nouveau test immunologique.Ce travail doctoral est basé sur la technique de la triangulation (théorique, méthodologique et des données). Plus précisément, deux cadres théoriques validés et reconnus en psychologie sociale de la santé ont été mobilisés, à savoir la Théorie des Représentations Sociales (Moscovici, 1984), et la Théorie du Comportement Planifié (Ajzen et al, 1991), permettant l’adoption d’une approche compréhensive aussi bien que prédictive du dépistage. Trois études ont ainsi été développées :- Une étude qualitative par entretiens semi-directifs, menée auprès de 17 médecins généralistes, ayant pour but d’appréhender leurs représentations sociales du dépistage du cancer colorectal ainsi que la manière dont celui-ci peut s’ancrer dans leur pratique de recommandation ;- Une étude qualitative par focus groups, menée auprès de 29 participants issus de la population générale dont l’objectif était d’appréhender leurs représentations sociales du dépistage du cancer colorectal ainsi que les freins et facilitateurs à son adhésion.- Une étude quantitative par questionnaires, menée auprès de 160 participants issus de la population générale, visant à identifier les principaux prédicteurs de l’intention et du comportement de dépistage du cancer colorectal.Principaux résultatsL’analyse des entretiens a révélé une incohérence entre le rôle que les médecins pensent devoir jouer auprès des patients dans la prévention et le dépistage, et la réalité de leur pratique qui ne leur laisse que peu de temps à y consacrer. L’analyse des focus groups a révélé que les principaux freins à la participation au dépistage sont : le manque d’accessibilité du test (nécessité de consulter le médecin généraliste pour obtenir le kit de dépistage), une faible préoccupation pour la prévention, mais aussi le fait que le cancer colorectal se réfère à une partie du corps liée à un tabou, et considérée comme sale. Enfin, l’analyse des questionnaires a permis d’identifier plusieurs variables ayant une influence sur l’intention et le comportement de dépistage, à savoir : le comportement antérieur de dépistage, la fréquence de dépistage, le déni, la proximité sociale, les normes sociales et le contrôle comportemental perçu. Les analyses ont particulièrement mis en avant l’importance du contrôle comportemental perçu, pouvant agir directement sur le comportement sans passer par l’intention.ConclusionLes conclusions révèlent la pertinence d’allier une approche compréhensive à une approche prédictive. Nos perspectives proposent la mise en place d’interventions visant à améliorer le niveau de contrôle perçu de la population générale face à ce dépistage
IntroductionColorectal cancer is the second leading cause of cancer deaths in France (HAS, 2013) but also the third most common cancer (INCa, 2014). An organized screening programme has been put in place since 2008, but participation rates remain low: 33.5% in France (Santé Publique France, 2018). According to the literature, the main barriers to participation in screening are the lack of confidence in the health care system (Clavarino et al, 2004) ; embarrassment, discomfort and dissatisfaction accompanying testing procedures (Varela et al, 2010); or lack of time. Finally, the lack of general practitioners’ recommendations is one of the most significant obstacles (Walsh et al, 2010, Powell et al, 2009). The Hemoccult II test, used as part of organized screening until March 2015, was replaced by a new immunological test, considered more sensitive, more specific and more reliable by the medical community (INCa, 2014).Objectives and methodFaced with the low screening rates and main obstacles identified in the literature, this thesis aims at analyzing the determinants of screening participation, with both patient and general practitioner points of view. Moreover, it appears necessary to evaluate issues with the arrival of the new immunological test.This doctoral work is based on the technique of triangulation (theoretical, methodological and data triangulation). More precisely, two validated and recognized theoretical frameworks in health and social psychology were employed, namely the Theory of Social Representations (Moscovici, 1984), and the Theory of Planned Behaviour (Ajzen et al, 1991), allowing the adoption of a comprehensive approach as well as a predictive approach to studying screening participation. Three studies have been set up:- A qualitative study through semi-structured interviews, conducted with 17 general practitioners, aimed at understanding their social representations of colorectal cancer screening and how it can be anchored in their practice of recommendation;- A qualitative study by focus groups, conducted with 29 participants from the general population. The objective was to apprehend their social representations of colorectal cancer screening as well as the obstacles and facilitators to screening participation.- A quantitative study by questionnaire, including 160 participants from the general population, endeavours to identify the key predictors of colorectal cancer screening intention and behaviour.Main resultsThe analysis of interviews revealed an inconsistency between the role general practitioners think they should play with patients in prevention and screening, and the reality of their practice which leaves them insufficient time to devote to it. The focus group analysis revealed that the main barriers to participation in screening are: the lack of accessibility of the test (needing to consult the general practitioner in order to obtain the screening kit), a low concern for prevention, but also the fact that colorectal cancer refers to a body part that is deemed taboo, and considered “dirty”. Finally, the analysis of questionnaires allowed the identification of several variables influencing intention and behaviour of screening, namely: previous screening behaviour, frequency of screening, denial, social proximity, social norms and perceived behavioural control. Analysis particularly emphasized the value of perceived behavioural control, which can directly influence behaviour without going through intention.ConclusionResults reveal the relevance of combining a comprehensive approach with a predictive approach. Our perspectives suggest the implementation of interventions aimed at improving the perceived level of control of the general population faced with this screening

La consommation de charcuterie est associée au risque de cancer colorectal. L'objectif de cette thèse était (i) valider l'effet promoteur des charcuteries dans un modèle animal de cancérogenèse et (ii) de trouver des composés antagonistes de cet effet promoteur. De l'épaule de porc riche en hème, salée et nitritée, puis cuite et oxydée (à l'air 5 j à 4°C) est promotrice des lésions précancéreuses chez le rat chimio-induit par la diméthylhydrazine. Cette promotion s'accompagne d'une augmentation de composés N-nitrosés fécaux. L'ajout de calcium dans le régime ou d'a-tocophérol dans la viande inhibe la promotion induite par cette viande saumurée. Par ailleurs, la saucisse de type hot-dog est promotrice des lésions précancéreuses, cette promotion étant aussi inhibée par le calcium du régime. Nous pensons donc que l'on pourrait diminuer l'incidence du cancer par la consommation de produits riches en calcium ou par des modifications du procédé de fabrication des charcuteries
Consumption of cured meat is associated with increased risk of colorectal cancer. The aim of this thesis was (i) to validate this promotive in a rodent model and (ii) to find compounds that inhibit this promoting effect. A pork shoulder, rich in heam, cured with nitrited salt, cooked and oxidized (5d in a fridge) promoted preneoplasic lesions in dimethylhydrazine-initiated rat. This promotion was associated high level of fecal N-nitroso compounds. When diet was added with calcium carbonate, or when cured meat was added with a-tocopherol, meat-induced promotion was inhibited. Besides, hot dog sausage promotes preneoplasic lesions in rats, and dietary calcium inhibited this promotion. We think cancer incidence could be reduced by increasing calcium intake, or by changing cured meat process

Une etude cas-temoin, realisee en suivant la filiation adenome-cancer, a permis d'analyser les differents facteurs alimentaires intervenant aux trois etapes de la cancerogenese colorectale (petit adenome, gros adenome et cancer colorectal). Les resultats sont discutes a la lumiere de donnees epidemiologiques de la litterature. De facon globale, le risque de genese d'un adenome serait influence par le tabagisme et l'apport en acide folique. Les etudes epidemiologiques ont peu etudie cette premiere etape et ne permettent pas d'apprehender avec precision les facteurs alimentaires susceptibles d'avoir un effet protecteur, en dehors, peut-etre, des folates. Les etudes d'intervention n'ont pas permis de prevenir la recidive des adenomes, sauf une utilisant des supplements de calcium. La croissance d'un adenome semble essentiellement liee aux antecedents familiaux de cancer colorectal, a la consommation de tabac et d'alcool, a la sedentarite, a la consommation de viande grasse et de charcuterie. Enfin, l'etape de transformation maligne serait influencee par les antecedents familiaux de cancer, par la consommation de charcuterie, de produits cerealiers raffines ainsi que par l'exces calorique et la sedentarite. Les elements protecteurs proviendraient de fibres d'origine variee (vegetaux, fruits, cereales) et previendraient le risque de cancer colorectal principalement au niveau du colon distal. Nous avons egalement synthetise ces resultats sous forme de typologies alimentaires permettant de conseiller une alimentation "prudente" (c'est-a-dire limitee en calories et equilibree avec un apport faible de graisses saturees et hydrates de carbone raffines) ou de type mediterraneenne (riche en huile d'olive, fruits et legumes). Ce travail incite a une prudence concernant d'une part l'enrichissement systematique dans les aliments de consommation courante en micronutriments et, d'autre part, les etudes d'intervention portant sur les adenomes, car tres peu de donnees sont encore disponibles.

Le cancer colorectal métastatique est l’une des premières causes de décès par cancer dans les pays occidentaux, malgré le développement récent de nouveaux traitements ciblés. L’amélioration de la survie des patients passe par une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la progression tumorale et la formation des métastases. Compte tenu de l’importance du rôle des axes mTOR/HIF1α et CXCL12/CXCR4/CXCR7 dans le processus métastatique, nos objectifs ont été : i) d’analyser de façon extensive le statut de CXCL12 dans une collection de polypes et de tumeurs coliques de tous stades et phénotypes en comparaison avec la muqueuse saine, puis de comprendre les mécanismes régulant l’expression de la chimiokine dans les cellules tumorales ; ii) d’étudier in vitro le rôle de l’hypoxie dans la régulation de la signalisation induite par CXCL12 via CXCR4 et CXCR7 et l’intérêt d’une inhibition des axes mTOR/HIF-1α et CXCL12/CXCR4/CXCR7 en particulier sur les capacités migratoires des cellules tumorales.Nous avons montré que l’extinction du gène CXCL12 est un évènement précoce et systématique au cours de la cancérogenèse colique et que cette perte d’expression pourrait être régulée par un mécanisme d’acétylation au niveau des histones. Une expression différentielle de CXCR4 et CXCR7 au sein des tumeurs du colon a été mise en évidence. L’augmentation d’expression de CXCR7 dans les métastases par rapport aux stades précoces montre l’importance de cet axe dans le processus métastatique. Le maintien de l’expression à la surface cellulaire de CXCR4 en normoxie pendant au moins 24h après un bref passage en hypoxie n’avait pas encore été décrit. Ceci pourrait expliquer le « homing » des cellules tumorales circulantes dans les niches métastatiques selon un gradient de CXCL12. L’utilisation combinée d’irinotécan et de chalcone permettant d’inhiber la migration des cellules tumorales est une approche originale in vitro. Enfin, nous avons initié le développement de modèles métastatiques de cancer du colon par greffe orthotopique sur le caecum de souris NUDE dans l’objectif de tester de nouvelles approches thérapeutiques ciblées in vivo
Despite the recent development of new targeted chemotherapies, metastatic colorectal cancer is still one of the leading causes of cancer related deaths in western countries. A better understanding of metastatic process would improve survival. Since the role of mTOR/HIF1α and CXCL12/CXCR4/CXCR7 axes in metastasis formation, our objectives were: i) to analyze extensively CXCL12 status in a collection of polyps and colon tumors whatever stages and phenotypes; ii) to study the role of hypoxia in CXCL12/CXCR4/CXCR7 signaling pathway in vitro and on tumor cells migration. We have shown that the CXCL12 extinction is a systematic early event during colorectal carcinogenesis. CXCL12 loss expression may be regulated by histone acetylation mechanism. There is a differential CXCR4 and CXCR7 expression in colon tumors. Increased CXCR7 expression in metastasis compared to early stages underlines the importance of this axis in metastatic process. We have shown for the first time that CXCR4 expression remained stabilized at the cell membrane 24 hours after a transient passage in hypoxia. It could explain circulating cells are attracted in metastatic niches under CXCL12 gradient. Drug combinations with chalcone and irinotecan are an original approach for inhibiting cell migration in vitro. Finally, we have initiated the development of a metastatic model of colon cancer with orthotopic colon human tumors xenograft in NUDE mice to test new therapeutic approaches in vivo

Les lymphocytes T gamma delta sont des sentinelles des barrières épithéliales qui jouent un rôle majeur dans la défense contre les agressions. Dans le cancer, elles participent à l'immunosurveillance et leur présence au sein du stroma tumoral constitue le principal facteur pronostic positif. Il s’agit donc d’une population qui pourrait constituer une cible thérapeutique privilégiée en oncoimmunologie. La fonction des LTgd est finement régulée par un ensemble de cytokines et en particulier par l’interleukine 18 (IL-18). L’IL-18 est une cytokine proinflammatoire correspondant à l’un des plus puissants stimulateurs solubles des LTgd, impliquée dans l’homéostasie tissulaire au niveau des barrières épithéliales. Elle est sécrétée grâce à l’activation de l’inflammasome, complexe cytosolique composé de Nod-Like Receptors (NLRs). Néanmoins, in vitro, certaines lignées cancéreuses n’en sécrètent plus, probablement du fait de la perte d'expression des constituants de l'inflammasome.Nous avons donc voulu évaluer l’expression protéique in vivo des constituants des inflammasomes, et leur impact pronostic en clinique. L’expression protéique a été analysée dans 104 tumeurs colorectales appariées aux tissus sains, par immunofluorescence sur un tissue micro-array (TMA). Un comarquage de la cytokératine a été effectué pour évaluer l’expression de ces composants spécifiquement dans les cellules épithéliales, qu’elles soient tumorales ou saines. Nos résultats ont montré une diminution de l’expression de l’ensemble des constituants de l’inflammasome dans l’épithélium des tissus tumoraux, ainsi que de la caspase-1 et des interleukines. Néanmoins, seules les pertes d’expression de NLRC4, de NLRP6 ou de l’IL-18 étaient associées à une maladie plus avancée ainsi qu’à la mortalité des patients. De plus, la perte combinée de ces 3 marqueurs était associée à un pronostic encore plus mauvais. Ainsi, seulement 22.2% des patients NLRC4bas/NLRP6bas/IL-18bas étaient encore vivants à 5 ans contre 85.2% pour les patients NLRC4haut/NLRP6haut/IL-18haut. De plus, la perte d’expression de NLRC4 et de l’IL-18 semblait corrélée à une diminution plus importante de l’infiltrat en cellules immunitaires et en particulier en lymphocytes T CD3+. Nous avons également montré grâce à un modèle in vitro que la réexpression de NLRC4 était associée à une diminution de la prolifération des cellules tumorales coliques métastatiques. Enfin, en trancriptomique, cette réexpression de NLRC4 induisait l’expression de médiateurs de la voie de l’interféron de type I. Dans l’ensemble, ces résultats montrent que la perte d’expression protéique de NLRC4, NLRP6 et IL-18 par la tumeur pourrait constituer un mécanisme de résistance à l’immunité antitumorale et semblerait être un facteur pronostic majeur.Dans un second temps, nous avons étudié la régulation des LTgd par des molécules solubles non cytokiniques, dépendantes du métabolisme tumorale. Ainsi, nous avons montré que l’activation de l’AMPK dans les cellules cancéreuses de côlon permettait d’augmenter l’expression d’un antigène de stress appelé EphA2 reconnu par les LTgd humains. De plus, l’induction in vitro de l'activation de l’AMPK permettait la sécrétion de petits peptides qui modulent la réponse immunitaire. Ainsi, par une série de chromatographies sur les surnageants de cellules tumorales reprogrammées, nous avons pu identifier un peptide capable d’inhiber l’activation des LB in vitro. Nous tentons actuellement d’identifier d’autres cibles immunitaires, mais également d’identifier les mécanismes qui induisent cet effet.Ces 2 axes constituent autant de cibles potentielles en thérapeutiques anticancéreuse, seules ou en association avec les chimiothérapies ou avec les immunothérapies actuelles. Ceci pourrait ainsi permettre d’améliorer les réponses observées dans les cancers
Gamma delta (γδ) T cells are sentinels of the intestinal barrier, protecting the host from aggressions. In cancer, they have a crucial role in immunosurveillance and the stromal infiltration of γδ T cells is the more important prognostic factor among all immune cells. Indeed, this population could be an interesting therapeutic target in oncoimmunology. The activation of γδ T cells is tightly regulated by several cytokines and especially interleukin-18 (IL-18). IL-18 is a proinflammatory cytokine corresponding to the most powerful soluble activator of γδ T cells, involved in tissue homeostasis in the epithelial barriers. It is secreted through the activation of the inflammasome, a cytosolic complex consisting in Nod-Like Receptors (NLRs). However, in vitro, some cancer cell lines do not secrete IL-18, probably due to a loss of expression and/or activation of inflammasome components. We have assessed the protein expression in vivo of inflammasome components, and their correlation with clinical outcome of colorectal cancer patients. The expression was evaluated in 104 colorectal tumours, matched with normal tissue for each patient, through an immunofluorescence assay on a tissue micro-array (TMA). We also performed a cytokeratin staining to assess the expression of each components specifically in epithelial cells from tumour or normal tissue. We showed a decreased expression of all inflammasome components, including caspase-1 and cytokines, in the tumour epithelium compared to normal tissue. However, only the expressions of NLRC4, NLRP6 or IL-18 were associated to a more aggressive disease and to a worse outcome. Furthermore, combined downregulation of these 3 components was correlated to a poor prognosis. Indeed, only 22.2% of patients NLRC4low/NLRP6low/IL-18low were still alive after 5 years, versus 85.2% for NLRC4high/NLRP6high/IL18high patients. Furthermore, the downregulation of NLRC4 and IL-18 was associated with a decreased immune infiltration especially for CD3 positive T cells. We also showed in vitro that NLRC4 reexpression was associated to a decreased proliferation of metastatic colon cancer cell line. Finally, at a transcriptomic level, the expression of NLRC4 in these cell lines was correlated to an interferon type I signature. All these results show that the downregulation of NLRC4, NLRP6 and IL-18 by tumour cells could constitute a resistance mechanism to the antitumor immune response and seems to be an important prognostic factor. The activation of γδ T cells could also been regulated by molecules that are not cytokines, depending on tumour metabolism. Indeed, we showed that the activation of AMPK in colon cancer cell lines induced the expression of the stress antigen receptor EphA2, recognised by human γδ T lymphocytes. Furthermore, the in vitro induction of AMPK activation favoured the released of small soluble molecules that modulate the immune response. Indeed, after several chromatography of the supernatant from reprogrammed cancer cell lines, we have identified a peptide that is able to inhibit the activation of B cells in an in vitro model. We are trying to identify the mechanisms underlying this inhibition. In conclusion, we have identify potential therapeutic targets in cancer treatment, alone or in association with chemotherapies and/or immunotherapies. This could help to improve antitumor immune response and patient outcomes

FADD (FAS-Associated Death Domain) est la protéine adaptatrice clé de l'apoptose via les récepteurs de mort. Elle est également impliquée dans d'autres types de mort cellulaire, mais aussi dans des mécanismes de survie, la prolifération et le cycle cellulaire. C'est donc une protéine régulatrice de la vie et de la mort et un changement de son expression peut avoir de graves conséquences physiopathologiques. Par exemple, l'équipe a montré que l'expression de la protéine FADD pouvait être perdue dans des biopsies de cancer du poumon et que cette perte était corrélée à la sécrétion de la protéine FADD dans le milieu extracellulaire. Cette sécrétion étant associée à l'agressivité et au développement tumoral, il apparaît important de comprendre quels sont les mécanismes moléculaires impliqués dans ce processus. En plus de son rôle dans la cancérogenèse, FADD est aussi impliquée dans l'immunité innée et l'inflammation. En effet, FADD participe à l'activation de l'inflammasome NLRP3 via les trois voies décrites : canonique, non canonique et alternative. L'inflammasome NLRP3 est un gros complexe multiprotéique composé de la protéine senseur NLRP3, de la protéine adaptatrice ASC et de la pro-caspase-1, qui s'assemble en réponse à des signaux de stress ou de danger. Il conduit à l'activation de réponses inflammatoires médiées par la caspase-1, telles que le clivage et la sécrétion non conventionnelle de la cytokine pro-inflammatoire interleukine-1 beta (IL-1b). L'inflammasome NLRP3 a été largement impliqué dans le développement et la progression de plusieurs rhumatismes inflammatoires chroniques comme la goutte et, plus récemment, la polyarthrite rhumatoïde (PR). Des protéines participant au complexe NRLP3 telles que ASC et la caspase-1 peuvent être co-sécrétées avec l'IL-1b, sous la régulation de l'inflammasome NLRP3. Puisque FADD participe à son activation, les objectifs de ma thèse étaient d'étudier l'implication de l'inflammasome NLRP3 dans la sécrétion de FADD ; puis de caractériser la ou les voie(s) de sécrétion de la protéine FADD ; et enfin de déterminer si cette sécrétion pouvait être retrouvée in vivo dans des pathologies rhumatismales. Pour cette étude, nous avons utilisé la lignée monocytaire humaine THP-1, modèle classique d'étude de l'inflammasome NLRP3. Nous avons montré que la protéine FADD est sécrétée suite à la stimulation de l'inflammasome NLPR3 par des activateurs des voies canonique (nigéricine, ATP, cristaux) et non canonique (Escherichia coli entéropathogène) mais pas alternative (lipopolysaccharide). Cette sécrétion de FADD requière un efflux de potassium. A l'aide de la technique CRISPR/Cas9, nous avons montré que la sécrétion nécessite également les protéines NLRP3, ASC et caspase-1. De plus, nous avons identifié la protéine FADD comme une protéine sécrétée de façon non conventionnelle dans des microvésicules dérivées de la membrane plasmique, mais pas dans des exosomes. Ces vésicules contiennent également les protéines IL-1b, NLRP3, ASC et caspase-1. Ces résultats ont été replacés dans un contexte physiopathologique puisque des monocytes sanguins de donneurs sains sécrètent également FADD suite à l'activation canonique de l'inflammasome NLRP3. La sécrétion par des monocytes de patients atteints de PR est augmentée et de fortes concentrations de protéine FADD sont détectées dans le sérum de patients atteints de PR (cohorte ESPOIR) mais pas de donneurs sains. Dans cette cohorte, la concentration de FADD sérique est corrélée à l'évolution de l'érosion osseuse articulaire des patients. De plus, de fortes concentrations de protéine FADD sont également détectées localement dans le liquide articulaire de patients atteints de PR et de goutte, mais pas d'arthrose (pathologie peu inflammatoire). Ces concentrations sont positivement corrélées à l'état inflammatoire de l'articulation. Ainsi, la protéine FADD sécrétée serait un nouveau marqueur de l'inflammation dans ces pathologies rhumatismales
FADD (FAS-Associated Death Domain) is a key adaptor protein of death receptor-mediated apoptosis. FADD is also implicated in other types of cell death, but also in survival mechanisms, proliferation and cell cycle progression. Therefore, FADD is a regulator of life and death and a change of its expression can have dramatic physiopathological consequences. For instance, the team has showed that FADD protein expression can be lost in lung cancer biopsies. This loss is correlated with FADD protein secretion in the extracellular compartment. Since this secretion is associated with tumor development and aggressiveness, it is important to decipher the molecular mechanisms behind this process. Besides its role in tumorigenesis, FADD is also involved in innate immunity and inflammation. Indeed, FADD participates to the canonical, non-canonical and alternative pathways of activation of the NLRP3 inflammasome. This inflammasome is a large multiprotein complex composed of the sensor protein NLRP3, the adaptor protein ASC and the pro-caspase-1. This complex assembles in response to stress or danger signals. This leads to the activation of inflammatory responses mediated by caspase-1, such as cleavage and unconventional secretion of the pro-inflammatory cytokine interleukin-1 beta (IL-1b). The NLRP3 inflammasome is largely implicated in the development and progression of several chronic inflammatory rheumatisms like gout and, more recently, rheumatoid arthritis (RA). Proteins of the NLRP3 complex such as ASC and caspase-1 can be co-secreted with IL-1b following the NRLP3 inflammasome activation. Since FADD participates to the complex, the aims of my thesis were to study the involvement of the NLRP3 inflammasome in the FADD secretion process; to characterize the secretion pathway(s) implicated; and to determine if this secretion can occur in vivo during the course of chronic inflammatory rheumatisms. For this study, we used the THP-1 human monocytic cell line that is an established model for inflammasome studies. We showed that FADD protein is secreted following cell stimulation with activators of the canonical (nigericin, ATP, crystals) and non-canonical (enteropathogenic Escherichia coli) but not alternative (lipopolysaccharide) NLRP3 inflammasome pathways. Furthermore, this FADD secretion process requires potassium efflux. Using CRIPSR/Cas9 technology, we showed that FADD secretion also requires NLRP3, ASC and caspase-1 proteins. Moreover, we have identified FADD as a new member of the unconventionally secreted protein family. Indeed, FADD is secreted in plasma membrane-derived microvesicles but not in exosomes. These microvesicles also contain IL-1b, NLRP3, ASC and caspase-1 proteins. In a more physiopathological context, we showed that blood-derived primary monocytes from healthy donors secrete FADD following canonical NLRP3 inflammasome activation, and this secretion is enhanced using monocytes from RA-suffering patients. In addition, high concentration of FADD protein is detected in the sera from RA patients (ESPOIR cohort) as compared to sera from healthy donors. In this cohort, sera concentration of FADD is correlated with patient's joint bone erosion progression. Moreover, high concentration of FADD is also detected locally in the synovial fluid from RA-, gout- but not osteoarthritis (a poorly inflammatory disease)-suffering patients. This concentration is positively correlated with the inflammatory status of the joint. Thus, secreted FADD protein can be a new marker of joint inflammation in these pathologies

La tumeur est capable d'échapper au système immunitaire. Mes travaux de thèse ont permis de montrer que la tumeur est capable de perturber le recrutement des lymphocytes naïfs au sein d'un ganglion lymphatique drainant une tumeur. Ce défaut de recrutement est corrélé à une diminution de l'expression de la chimiokine CCL21, impliquée dans l'adhésion ferme des lymphocytes à la surface des cellules cuboïdales des High Endothelial Venules, veinules spécialisées dans la capture des lymphocytes. Ce défaut de recrutement des lymphocytes est généralisable à d'autres organes lymphoïdes secondaires. J'ai ensuite regardé le recrutement de diverses populations recrutées par le sang en contexte tumoral. J'ai montré que le recrutement des sous populations de lymphocytes B et T était perturbé en présence d'une tumeur. Les cellules B sont plus affectées que les cellules T. Des résultats préliminaires sur les pDC suggèrent que leur recrutement serait augmenté dans un contexte tumoral
Tumor can induce perturbations in the immune system. My PhD studies showed that recruitment of naïve lymphocytes is impaired in tumor-draining lymph nodes (LNs). Intravital microscopy analysis of the tumor-draining LNs revealed that this effect is associated with an important defect in lymphocyte adhesion in the HEVs, and a decreased of the CCL21 chemokine. This defect of recruitment is extendable to the others secondary lymphoid organs. I investigated tumor effects on the different subsets of immune cells recruited into the LNs through HEVs. I found that in tumor-draining LNs, recruitment of T cells and B cells subsets was differently affected with a similar weak alteration of homing in both populations but a more pronounced decrease of sticking in HEVs for the B cell subset. Finally, preliminary experiments indicate that plasmacytoid dendritic cells (pDC), another immune cell population entering LNs through HEVs, appear to be recruited more actively in the presence of a tumor

Le travail presente dans ce memoire est divise en deux parties. Nous nous sommes tout d'abord interesses a de nouvelles structures phosphorylees de la 5fdu a visee antitumorale. Par la suite, nous avons entrepris la synthese et l'etude d'analogues nucleosidiques de la 5-fluorouracile (5fu) et de la 5-fluorocytosine (5fc) a visee antivirale. Le premier chapitre de cette these decrit brievement le processus de cancerogenese et les differentes classes de substances chimiques utilisees en tant qu'agents antitumoraux. Parmi celles ci, nous nous sommes interesses sur la famille des antimetabolites et plus particulierement a la 5fu, la 5-fluoro-2-desoxyuridine (5fdu), la 5-fluorocytosine (5-fc) et la 5-fluoro-2-desoxycytidine (5fdc). Dans le deuxieme chapitre, nous presentons une nouvelle strategie qui consiste en l'utilisation de prodrogues mononucleotidiques (pronucleotides). Nous avons applique cette nouvelle approche a la 5-fluoro-2-desoxyuridine (5-fdu) en realisant la synthese et l'etude de differents pronucleotides mononucleosiques et dinucleosidiques de la 5fdu incorporant les groupements enzymolabiles s-acyl-2-thioethyle (sate) et 2-oxethylsulfuryl-2-thioethyle (dte). Les resultats des evaluations biologiques effectuees sur differentes lignees cellulaires tumorales sont discutes en fonction des etudes de stabilite realisees dans differents milieux biologiques. Dans le dernier chapitre, apres avoir rappele brievement les mecanismes impliques dans la replication virale et le mode d'action des analogues nucleosidiques antiviraux, nous nous sommes consacres a la synthese stereoselective d'analogues nucleosidiques de la 5fu et de la 5fc modifies en position 2 et/ou 3 afin d'etudier l'influence de ces modifications sur l'activite antivirale. Malheureusement, a l'exception de la 5fddc et de la 5fdc, aucune des molecules synthetises dans ce chapitre n'a presentee d'activite antivirale notable.

Alors que le traitement standard du cancer du rectum (traitement néoadjuvant avec chirurgie d’exérèse et stomie temporaire) n’épargne ni la psyché ni le corps, peu d’études se sont intéressées à l’ajustement psycho-social des patients qui y sont confrontés. Le corps est bien souvent perçu, à la suite des traitements, comme dérivant de la norme et générant un sentiment de honte. Ainsi le premier travail de cette thèse a été de valider un outil, en population française, permettant de mesurer la honte liée à l’image du corps. Dans un deuxième travail, nous avons pu comparer la honte liée à l’image du corps ainsi que la qualité de vie, l’image du corps, et la détresse psychologique des patients ayant reçu un traitement standard à ceux traités par excision locale (nouvelle approche proposée aux patients présentant une bonne réponse clinique aux traitements néoadjuvants). Le traitement standard entraînant des difficultés psycho-sociales plus marquées, nous avons évalué plus spécifiquement ses conséquences sur la détresse psychologique et l’image du corps dans un troisième travail. La période avec la stomie temporaire représente un temps spécifique durant lequel les patients semblent mettre leur vie entre parenthèses. Ainsi, dans un quatrième travail, nous avons investigué le rôle du temps comme un déterminant possible de la qualité de vie de ces sujets. Nos résultats ont montré qu’il conviendrait de considérer, dans le parcours de soin du patient, la façon dont celui-ci perçoit le temps, en vue de prévenir une altération de sa qualité de vie. Cette altération persiste plusieurs mois après la fin des traitements mais peu d’études s’y sont, à ce jour, intéressées. Ainsi, dans un cinquième travail, nous avons exploré la qualité de vie, deux ans après le diagnostic de cancer, chez des survivants du cancer du côlon-rectum traités par chirurgie avec ou sans stomie temporaire. Nous avons alors constaté que la qualité de vie physique était significativement plus altérée chez les patients qui ont eu une stomie. Face à ces difficultés, il convenait de proposer une intervention psycho-sociale répondant aux besoins émotionnels de ces patients. Peu d’interventions ont été développées en ce sens. Dans un sixième travail, nous avons développé et mis à l’épreuve une intervention psycho-sociale qui semble s’inscrire davantage dans une approche préventive. L’ensemble de ces travaux pourrait contribuer à améliorer l’accompagnement proposé à ces patients, même s’il est nécessaire de souligner l’importance de promouvoir la recherche dans ce domaine pour mieux comprendre encore les enjeux psycho-sociaux de ce traitement
While the standard treatment for rectal cancer (neoadjuvant treatment with rectal excision) has spared neither the psyche nor the body, few studies have focused on psychosocial adjustment of patients who have received this treatment. Following treatment, the body is often perceived as deviating from the norm, generating feelings of shame. The first objective of this thesis was to adapt, and validate, for the French population, a body image shame scale. The second step consisted in comparing body image shame, quality of life, body image, and psychological distress between rectal cancer patients treated by surgery with temporary stoma or local excision (a new treatment approach proposed for patients with rectal cancer after a good clinical response to neoadjuvant therapy). Since standard treatment leads to more psychosocial problems, in a third study, we examined the effects of standard treatment on psychological distress and body image. The temporary stoma period represents a specific time during which patients seem to temporarily suspend their lives. Thus, the fourth study of this thesis investigated how the role of time perspective might act as a determinant of quality of life for rectal cancer patients. The time perspective construct provides keys in order to improve quality of life of rectal cancer patients. Quality of life alterations persist several months after the end of treatments but, to date, few studies have focused on this topic. The fifth goal was to assess colorectal cancer survivors’ quality of life two years after diagnosis of colorectal cancer according to their stoma status (reversed or never formed). Participants with a reversed stoma score lower on the physical quality of life scale than participants without stoma. Patients with rectal cancer experience psychosocial challenges. To deal with these challenges, psychosocial interventions focused on emotional needs of rectal cancer patients treated by standard treatment should be proposed. There is a lack of this type of intervention for this population. The sixth purpose was to develop and test a psychosocial intervention which seems to be more in line with a preventive approach. Taken together, these works may contribute to improve the support offered to these patients, even though the importance of promoting research to deal with the psychosocial challenges of this treatment must be underlined

Dans cette étude, nous avons tenté de décrypter les mécanismes reliant l’augmentation de lymphocytes infiltrant les tumeurs (LIT) T CD8+ et un pronostic clinique défavorable dans le cancer du rein à cellules claires (ccRCC). Pour cela, nous avons déterminé 1) la relation entre le pronostic associé à l'expression d’immune checkpoints et l’infiltrat de cellules dendritiques (DC) et de LT CD8+ et 2) les caractéristiques phénotypiques des LIT T CD8+. L’expression des immune checkpoints a été déterminée par immunohistochimie dans une cohorte de 135 ccRCC. Nous avons constaté que les densités des cellules exprimant CD8, PD-1 et LAG-3 sont corrélées, et associées à une diminution de PFS et OS. Egalement, les patients dont les tumeurs présentent des densités élevées de cellules PD-1+ et PD-L1 et/ou PD-L2 +, ont le taux de survie le plus faible. Des densités élevées de DC immatures isolées dans le stroma tumoral sont associées à une forte expression d’immune checkpoints et à un faible taux de survie chez ces patients. En revanche, les patients présentant un taux de survie prolongé ont une densité élevée de lymphocytes CD8+, des DC matures au sein de structures lymphoïdes tertiaires, ainsi qu’une faible expression d’immune checkpoints. Nous avons analysé les LIT T CD8+ chez 21 patients ccRCC par Cytométrie de Flux. On a trouvé un groupe de patients (8/21) dont les tumeurs sont caractérisées par la surexpression de marqueurs inhibiteurs (PD1 et TIM3) et de d'activation (CD69 et CD38), par l'expansion des cellules T CD8 + mémoires effectrices et un plus grand potentiel d’agressivité. En résumé, nous avons démontré qu’une densité élevée de LIT T CD8+ dans les ccRCC est accompagnée d’une forte expression d’immune checkpoints et d’une réponse immunitaire mal coordonnée dans un sous-groupe de tumeurs agressives
To decipher the potential mechanisms linking increased CD8+ T cell infiltration with an adverse clinical outcome in ccRCC, in this study we determined: 1) the prognosis associated with the expression of immune checkpoints and its coordination with dendritic cell (DC) and CD8+ cell infiltration, and 2) the phenotypic traits of CD8+ tumor infiltrating lymphocytes. The prognosis associated with CD8+ and DC infiltrations, in addition to the expression of immune checkpoints were investigated in a cohort of 135 ccRCC by quantitative immunohistochemistry. We found that the densities of CD8+, PD-1+ and LAG-3+ cells were closely correlated, and independently associated with decreased PFS and OS. In addition, patients whose tumors presented both high densities of PD-1+ cells and PD-L1+ and/or L2+ tumor cells, displayed the worst clinical outcome. High densities of immature DC isolated in the tumour stroma were associated with high expression of immune checkpoints and patients’ poor clinical outcome. In contrast, the presence of mature DC within Tertiary Lymphoid Structures identified, among the tumours with high CD8+-TIL densities, those with low expression of immune checkpoints and prolonged survival. We also investigated the phenotype of freshly isolated CD8+TIL in 21 ccRCC by flow cytometry. We found a group tumors (8/21) characterised by the over-expression of inhibitory (PD-1 and TIM-3) and activation markers (CD69 and CD38), the expansion of the effector memory cell subpopulation (CCR7-CD45RA-), and a trend toward more aggressive features. In summary, we demonstrated that the infiltration with CD8+ TIL in ccRCC is accompanied by the enhanced expression of immune checkpoints and a poorly coordinated immune response in a subgroup of aggressive tumors

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la deuxième cause de mortalité par cancer dans le monde. Plusieurs études attestent du rôle du microenvironnement tumoral (MET) comme acteur fondamental de la carcinogenèse. A l’aide de modèles murins mimant un sous groupe de CHC fréquent, notre équipe avait identifié la molécule LECT2 comme un effecteur moléculaire important du MET dans le contrôle de l’agressivité tumorale.L'objectif de ma thèse a été d’adresser le rôle fonctionnel de LECT2 dans le microenvironnement immunitaire au cours du CHC.A l’aide de modèles murins, nous observons que l’absence de LECT2 entraine une accumulation importante de cellules myéloïdes dans le MET. Nous montrons que ces cellules myéloïdes sont immatures, arborent des capacités immunosuppressives puissantes vis-à-vis des lymphocytes T et ont un programme transcriptionnel permettant une action promotrice de tumeurs. De façon intéressante, l’accumulation de ces acteurs dans le microenvironnement est associée à l’émergence de nodules tumoraux indifférenciés exprimant des marqueurs de transition épithélio-mésenchymateuse/cellules progénitrices/métastases.D’un point de vue mécanistique, nous avons démontré une perte de différenciation plus importante des hépatocytes en absence de LECT2 dans des conditions d’activation de la signalisation β-caténine. Nous montrons également par des expériences de co-culture que les cellules myéloïdes infiltrant les tumeurs en absence de LECT2 ont une forte capacité à induire une perte de différenciation des hépatocytes.Enfin, nous avons analysé l'expression de LECT2 dans une vaste cohorte d’échantillons humains de CHC. Nous montrons que la diminution d’expression de LECT2 corrèle fortement avec 1)- la présence d’invasion vasculaire, 2)- la perte de différenciation des hépatocytes tumoraux et 3)- la présence d’infiltrats inflammatoires.L’ensemble de ces données démontre que LECT2 agit comme un régulateur essentiel dans la cancérogénèse hépatique à travers son action double sur les hépatocytes et sur la fonction des cellules myéloïdes infiltrant les tumeurs. Ainsi, ces travaux identifient LECT2 comme un biomarqueur potentiel ouvrant de nouvelles perspectives de traitement du CHC
Hepatocellular carcinoma (HCC) is the second cause of cancer-rel ated death worldwide. Several studies highlighted the tumor microenvironment (TEM) as a key player in cancer from initiation to progression steps of tumorigenesis. Using relevant HCC mouse models, our team identified the chemokine-like LECT2 as a critical actor of liver TEM in the control of tumor aggressiveness.The aim of my thesis was to address functionally the role of LECT2 in the immune microenvironment during HCC.Using mouse models, we observed that the absence of LECT2 induces a significant accumulation of myeloid cells in the TEM. We showed that these myeloid cells were immature, harbored strong immunosuppressive capabilities on T cells and expressed a transcriptional program sustaining tumor progression. Interestingly, the accumulation of these actors in the microenvironment is associated with the emergence of poorly differentiated tumor nodules expressing epithelial-to-mesenchymal transition / progenitor / metastasis markers.Mechanistically, we demonstrated that LECT2-deficient hepatocytes in the context of β-catenin activation were able to perform EMT like WT hepatocytes do after TGF-β1 challenge. In co-culture experiments, we demonstrated that tumor-infiltrating myeloid cells in the absence of LECT2 have a strong ability to induce hepatocyte EMT.Finally, we analyzed the expression of LECT2 in a vast cohort of HCC liver samples and found that downregulation of LECT2 expression strongly correlates with 1) - the presence of vascular invasion, 2) – histological grade and 3) - the presence of inflammatory infiltrates.Altogether, our data demonstrate that LECT2 acts as a strong regulator of liver tumor aggressiveness through its dual action on hepatocytes and impact on the function of tumor infiltrating myeloid cells. This work identifies LECT2 as a new biomarker for HCC and pave the way to new therapeutic strategies

Les lymphocytes T régulateurs (Tregs) jouent un rôle dans la grossesse précoce, localement dans l'utérus et de façon systémique, dans les organes lymphoïdes secondaires et dans le sang. Dans le tissu utérin, j'ai identifié une nouvelle population de Tregs effecteurs-mémoire résidant dans le tissu (uregTrm). Avant la grossesse, uregTrm ont un profil transcriptionnel et un phénotype unique en réponse au micro-environnement utérin. Au début de la grossesse, les uregTrm prolifèrent et expriment de nouveaux gènes impliqués dans des fonctions trophiques telles que le remodelage de la matrice extracellulaire, l'hypoxie et la vasculogenèse. La fonction trophique d'uregTrm a été comparée aux mécanismes développés par les Tregs dans l’infiltrat tumoral de mélanome. Dans les organes lymphoïdes secondaires et le sang, les Tregs en circulation contribuent à une grossesse réussie en favorisant la tolérance materno-foetale. Nous avons montré que ces Tregs orchestrent la régulation des réponses immunitaires dans l'utérus. En outre, les Tregs agissent en trois étapes. Tout d'abord, uregTrm et les Tregs des ganglions lymphatiques drainants auto-spécifiques contrôlent rapidement une réponse auto-immune qui aurait pu être déclenchée par la libération de débris cellulaires en raison de la prolifération de l'endomètre. Deuxièmement, uregTrm contribuent au besoin de remodelage du tissu utérin pour la placentation. Dans un troisième temps, accompagnant l'augmentation de la masse foetale, les Tregs inductibles aident à contrôler la réponse immunitaire anti-foetale. Ceci met en évidence la spécialisation des Tregs dans les tissus et souligne l’importance des Tregs pendant la grossesse et la pathologie
Regulatory T cells (Tregs) play a role during early pregnancy locally in the uterus and systemically, in the secondary lymphoid organs and blood. In the uterine tissue, I identified a novel population of tissue-resident effectors-memory regulatory T cells (uregTrm). Before pregnancy, uregTrm have a unique transcriptional profile and phenotype in response to the uterine microenvironment. During early pregnancy, uregTrm expand and express new genes implicated in trophic functions such as extracellular matrix remodeling, hypoxia and vasculogenesis. uregTrm trophic function was compared to the mechanisms developed by Tregs from melanoma tumour infiltrate. In the secondary lymphoid organs and blood, circulating Tregs contribute to successful pregnancy by promoting maternal-fetal tolerance. We showed that these Tregs orchestrate down regulation of immune responses in the early pregnant uterus. Besides, Tregs act in three stages. First, self-specific uregTrm and draining lymph nodes Tregs rapidly contain an autoimmune response that could have been triggered by release of cell debris due to the endometrium tissue high proliferation. Second, uregTrm contribute to the increased need of uterine tissue remodeling for placentation. In a third stage, accompanying the fetal mass increase, inducible Tregs help to control the anti-fetal immune response. This further highlights the specialization of Tregs in tissues and underline the relevance of Tregs during pregnancy and disease

La voie de signalisation mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) joue un rôle central dans la croissance cellulaire, le métabolisme, et l'homéostasie des lymphocytes T (LT). Lors de la transplantation d'organes, l'administration de rapamycine, un inhibiteur de mTOR (mTORi), bloque l'activation des LT et promeut la polarisation des lymphocytes T CD4 régulateur (Treg). En cancérologie, des mTORi sont utilisés pour leur action inhibitrice sur la prolifération et l'angiogenèse tumorales. Cependant l'immunosuppression via l'induction de Treg nécessaire à la prévention du rejet de greffe pourrait être délétère pour la réponse anti-tumorale. Notre hypothèse est que l'efficacité clinique des mTORi serait également dépendante de la modulation de l'immunité adaptative T induite par ces traitements chez les patients atteints de cancer.Au cours de cette thèse, nous avons abordé cette question immunologique dans une cohorte prospective de patients atteints de cancer rénal métastatique (mRCC) traités par évérolimus. L'analyse du taux de Treg et de la réponse spontanée T CD4 Thl anti-tumorale (anti-télomérase TERT) par Elispot-IFN-y a été effectuée au moment de l'inclusion des patients et tous les deux mois après le début du traitement. Nous avons observé chez la majorité des patients une augmentation du taux de Treg après traitement par évérolimus. Ces Treg expriment Hélios, suggérant un phénotype Treg naturel. La fréquence et la qualité de la réponse Thl anti-TERT sont également augmentées suite au traitement. Nous avons montré que conjointement ces deux paramètres immunologiques corrèlent avec l'efficacité clinique du traitement. Les patients présentant précocement une diminution des Treg associée à une augmentation des Thl anti-TERT ont une meilleure survie par rapport aux patients dont les paramètres immunitaires ne variaient pas, ou variaient dans une même direction (13,2 mois vs 8 et 4 mois). De plus, au moment de la progression la plupart des patients perdaient leur réponse Thl anti-TERT, et cet effet était associé à une augmentation des Treg. Les Treg traités par mTORi in vitro inhibent plus fortement la prolifération de LT allogéniques, par un mécanisme contact dépendant. Par l'utilisation d'anticorps monoclonaux déplétant les LT chez la souris et par l'utilisation de souris DEREG, nous avons montré que la présence de Treg in vivo altère l'efficacité anti-tumorale des mTORi, par un mécanisme impliquant l'inhibition des réponses T CD8 anti-tumorales. En conséquence, l'efficacité des mTORi a pu être augmentée par sa combinaison avec des agents bloquant les Treg. En addition, l'administration de temsirolimus améliore l'efficacité anti-tumorale d'un vaccin thérapeutique, en favorisant la différenciation des LT CD8 anti-tumoraux centraux mémoires (CD62L+CD127+) et précurseurs mémoires (CD127+KLRGl'°) induits par la vaccination.En conclusion, ces études ont montré pour la première fois le rôle de l'immunité T anti-tumorale sur l'efficacité clinique des mTORi et soulignent ainsi l'intérêt potentiel de combiner les mTORi avec des immunothérapies anti-tumorales
The mammalian Target of Rapamycin (mTOR) pathway plays a central role in the regulation of cell growth andmetabolism, and is involved in oncogenesis. Everolimus and temsirolimus are two mTOR inhibitors (mTORi) approvedfor renal and breast carcinoma treatments. However, accumulating evidence highlights a central role for mTOR pathwayin T cell immunity. We showed that 21 out of 23 metastatic renal cell carcinoma patients under everolimus treatmenthad an increase of Tregs atter everolimus treatment. Paradoxically, strong antitumor Th 1 responses were detected andthen greatly decreased at the time of disease progression when high expansion of Tregs occurred. Furthermore, weidentified three immune groups based on the early modulation of both Treg and anti-tumor Thl cells and found thatpatients with {low Tregs plus high anti-tumor Thl cells} showed the best survival. In vitro, mTORi-exposed Tregs highlysuppressed T cell proliferation and Thl-associated cytokines production. We showed in vivo that T cells depletiondifferentially modulated the antitumor efficacy of mTORi. Although anti-mTOR effect was loss in B16-OVA-bearingmice lacking CD8 T cells, CD4 T depletion increased mTORi efficacy. The studies conducted in mice demonstratedthat the presence of Tregs in vivo altered the responses to mTORi via a mechanism involving the inhibition of antitumorCD8 T cell responses. Finally the efficacy of mTORi was improved by combination with Tregs depleting agents andvaccines. Altogether, our results describe for the first time a dual impact of host adaptive antitumor T cell immunity onthe clinical effectiveness of mTQRi and prompt their association with immunotherapies

L’augmentation de l’incidence et l’absence de ressources thérapeutiques pour les formes non opérables de patients atteints d’un cancer HPV+ est un enjeu important. La forte immunosurveillance au sein des tumeurs associées aux HPV ainsi que la présence d’antigènes viraux associée à l’oncogenèse de ces cancers devraient privilégier le développement de stratégies d’immunothérapies comme la vaccination anti tumorale ainsi que le transfert adoptif de TILs. Ces avancées technologiques incitent à mieux comprendre les réponses immunitaires dans ces pathologies et à développer des stratégies combinant les immunothérapies pour le traitement de l’ensemble des cancers liés aux HPV. Nous avons dans un premier temps recherché les antigènes de tumeurs associés au pronostique de patients atteints d’un cancer du canal anal. Les patients ont été traités par une combinaison de chimiothérapies dont son bénéfice thérapeutique a été démontré par notre équipe. Le monitoring des réponses T spécifiques dans le sang périphérique de ces patients a permis de montrer que la Télomérase est un antigène de tumeur associé au SCCA ; et que la présence de LT Th1 spécifiques de la Télomérase est un facteur prédictif de la survie sans progression à 12 mois. Nos données ont également mis en évidence l’influence des M-MDSC sur les réponses immunitaires T spécifiques de nos antigènes ainsi que sur la survie des patients atteints d’un SCCA. Aucun effet des Treg n’a été observé sur les réponses immunitaires et la survie dans cette maladie. Les M-MDSC sont un facteur pronostique de la réponse au traitement des patients atteints d’un SCCA traités par chimiothérapies. Le second travail de cette thèse a permis de valider la faisabilité d’isoler des TILs à partir de prélèvements biopsiques issus de patients atteints d’un cancer HPV+. Les réponses immunitaires T spécifiques des oncoprotéines d’HPV16 sont corrélées dans 50 et 60% des cas entre le sang périphérique et la tumeur. Le dernier objectif de ce travail de thèse a permis de démontrer l’immunogénicité de la protéine SALL4, un facteur de transcription associé à la pluripotence et à l’auto-renouvèlement des cellules souches embryonnaires. Nous avons généré une technologie d’analyse des réponses CD4 Th1 anti-SALL4 permettant le suivi des réponses immunes chez les patients atteints d’un adénocarcinome digestif. Nos travaux ont également permis de montrer une faible fréquence de LT spécifiques de SALL4 dans le sang périphérique de patients atteints d’un SCCA. Ces résultats suggèrent que la présence de réponses spécifiques de SALL4 dans le sang périphérique de patients atteints d’un SCCA pourrait être l’objet d’une immunosurveillance menant à une diminution de la fréquence des LT CD4 SALL4+. Il serait intéressant d’analyser la présence de LT spécifiques de cet antigène dans des formes précoces de cancers HPV+
The increased incidence and the lack of therapeutic resources for non-operable forms of HPV+ cancer patients constitutes a major challenge. High immunosurveillance in HPV-associated tumors and the presence of viral antigens associated with oncogenesis of these cancers should focus on the development of immunotherapy strategies such as anti-tumor vaccination and adoptive transfer of TILs. These technological advances encourage a better understanding of immune responses in these pathologies and aim to develop strategies combining immunotherapies for the treatment of all HPV-related cancers. We first looked for tumor antigens associated with the prognosis of patients with anal canal cancer. The patients were treated with a combination of chemotherapy whose therapeutic benefit was demonstrated by our team. Monitoring specific T-immune responses in the peripheral blood of these patients has shown that telomerase is a tumor antigen associated with SCCA; and moreover that the presence of Telomerase-specific LT Th1 is a predictor of progression-free survival at 12 months. Our data also highlighted the influence of M-MDSC on the T-specific immune responses of our antigens as well as on the survival of patients with SCCA. As a result, M-MDSCs are a prognostic factor in the response to treatment of patients with metastatic SCCA treated with chemotherapy. The second work of this thesis validated the feasibility of isolating TILs from biopsy samples from patients with HPV-associated cancer. The specific T immune responses of HPV16 oncoproteins are correlated in 50 and 60% of cases between peripheral blood and tumor. The final objective of this thesis work demonstrated the immunogenicity of the SALL4 protein, a transcription factor associated with pluripotency and self-renewal of embryonic stem cells. We have generated anti-SALL4 CD4 Th1 response analysis technology to monitor immune responses in patients with digestive adenocarcinoma. Our work has also shown a low frequency of SALL4-specific T responses in the peripheral blood of patients with SCCA. These results suggest that the presence of specific SALL4 responses in the peripheral blood of SCCA patients could be subject to immunomonitoring resulting in a decrease in the frequency of CD4 LT SALL4+. It would be interesting to analyze the presence of specific LT of this antigen in the early forms of HPV-related cancers

L'expression de récepteurs inhibiteurs tels PD-1, TIM-3, LAG-3, TIGIT sur les lymphocytes T participe à l'immunosuppression dans l'environnement tumoral. Le ciblage de PD-1 par les immunothérapies anti-PD-1/PD-L1 notamment révolutionne depuis peu la prise en charge de nombreux types de cancers en particulier dans le mélanome, cancer du poumon et aussi du rein. Dans la plupart des cancers comme dans celui du poumon et le mélanome, l'infiltrat CD8 et la réponse Th-1/IFN-gamma sont associés à un meilleur pronostic, contrairement aux tumeurs du rein et aux hémopathies. Les travaux de ma thèse s'intéressent à la caractérisation de l'expression des récepteurs inhibiteurs des lymphocytes, notamment PD-1 et TIM-3 dans le carcinome rénal et dans le lymphome. Mes travaux de thèse ont été réalisés avec des outils d'exploration du microenvironnement tumoral permettant une analyse multiplexe de nombreux paramètres in situ. En théorie jusqu'à 7 protéines peuvent être mises en évidence à la fois, j'ai pu mettre au point des comarquages de 4 protéines membranaires et/ ou nucléaires + Dapi ainsi que la détection d'ARN in situ dans les tumeurs. L'utilisation d'un outil technologique de microscopie à fluorescence multispectrale a permis une étude fine de la coexpression de PD-1 et Tim-3 sur les lymphocytes T CD8 (LT-CD8) grâce à la visualisation aisée de la colocalisation de ces 3 marqueurs. De la même façon, j'ai mis en évidence de l'expression de leurs ligands PD-L1 et Galectin-9 (Gal-9) dans l'environnement des tumeurs du rein. J'ai démontré que la co-expression de Tim-3 et PD-1 sur les CD8 dans le carcinome rénal avait un rôle délétère aussi bien sur le plan (i) fonctionnel puisque les LT-CD8 sécrétaient moins d'IFN-gamma, (ii) et clinique puisque les patients présentant un infiltrat de LT-CD8 double positifs pour PD-1 et TIM-3 récidivaient plus fréquemment. La présence des ligands PD-L1 et Gal-9 a été mise en évidence dans l'environnement tumoral laissant suggérer des interactions possibles avec les récepteurs inhibiteurs exprimés par les LT. J'ai également caractérisé les LT-CD8 PD-1+ TIM-3+ dans les lymphomes en combinant un marquage CD20 (quadruple + Dapi). Selon le type de lymphome, TIM-3 était coexprimé avec PD-1 à la surface des CD8 et plus ou moins au contact avec les cellules lymphomateuses CD20+. D'autre part, lorsque TIM-3 était coexprimé, les LT-CD8 étaient plus volontiers proliférant (comarquage Ki-67) en comparaison aux PD-1+ TIM-3-. Afin de poursuivre dans la caractérisation Th-1/IFN-gamma, j'ai élaboré la mise au point de la détection d'ARN dans les lymphocytes T in situ dans la tumeur, permettant de faire des liens avec leur fonctionnalité. Au total mes travaux de thèse ont permis de mettre en évidence des biomarqueurs immunologiques composites en lien avec l'expression des récepteurs inhibiteurs PD-1 et/ou TIM-3 et la perte de fonctionnalité (IFN-gamma) des lymphocytes T intratumoraux
It has been mainly described that the inhibitory receptors coexpression (PD-1, TIM-3, LAG-3, TIGIT) by lymphocytes in the tumor microenvironment (TME) induces a local immunosuppression. Targeting these receptors particularly PD-1 and its ligand PD-L1 is of great clinical benefit in cancer many types treatment (melanoma, renal and lung cancer in particular). In the most cases of cancer, like melanoma and lung cancer, a CD8-T cell and Th-1/IFN-gamma response is of good prognosis. But this is not the case in renal cancer and in hemopathies. My PhD work attempts to characterize clinical and biological implication of PD-1 and TIM-3 expression by intra-tumor lymphocytes in the setting of renal cancer and lymphoma. My PhD work has been conducted thanks to new methods of multiplexed characterization of the TME. Multispectral immunofluorescence lead to identify 7 parameters at the same time, and in this study I elaborated the identifications of lymphocytes markers in situ within the tumor: 4 membrane and/or nuclear proteins + nuclei (Dapi counterstain) and also coupled with the RNA detection. This tool allows me to accurately study the coexpression of PD-1 and TIM-3 at the CD8-T cell surface thanks to colocalisation identification and counting of these 3 markers. With the same method, I found that PD-L1 and Gal-9, which are PD-1 and TIM-3 ligands, were also expressed in the TME of renal carcinoma. I found that the coexpression of TIM-3 together with PD-1 in the CD8-T cells had a double relevance (i) at functional level, CD8-T cells were less able to secrete gamma-IFN (ii) at clinical level, patients harboring a higher infiltrate were more likely to relapse. The presence of PD-L1 and Gal-9 suggested interactions with inhibitory receptors of T cells. I also characterized CD8-T cells expressing PD-1 and TIM-3 in lymphomas, combining a CD20 staining (quadruple staining + Dapi). TIM-3 was more or less expressed depending of the lymphoma type near to CD20+ cells. TIM-3 PD-1 CD8-T cells were more likely Ki-67+ compared to TIM-3- cells, suggesting a more proliferative capacity. In order to continue the characterization of the Th-1/gamma-IFN-gamma immune response, I elaborate a technic to detect the gamma-IFN RNA in situ, together with lymphocytes staining, allowing the exploration of functionality within the tumor. To summarize, during my PhD work I could characterize composite immune biomarkers linked to the functionality of CD8-T cell and gamma-IFN Th-1 response

L’histoire naturelle du cancer implique des interactions entre la tumeur et les mécanismes de défense de l’hôte, tout particulièrement avec le système immunitaire adaptatif. Ainsi la transformation de cellules normales en cellules malignes peut engendrer l’expression d’antigènes tumoraux reconnus par les lymphocytes T. Plusieurs sous-populations de lymphocytes T (LT) CD4 contrôlent les réponses antitumorales, parmi elles, les LT CD4 helper de type-1 (Th1) jouent un rôle activateur majeur de l’immunité à médiation cellulaire antitumorale. Ils deviennent actifs grâce à la reconnaissance des peptides de 15 à 20 acides aminés dérivés d’antigènes tumoraux et présentés par les molécules HLA de classe II. Ils sont nécessaires à l’induction et la fonction des cellules effectrices dirigées contre les tumeurs notamment les lymphocytes T CD8 cytotoxiques (CTL). De plus la présence de lymphocytes CD4 Th1 infiltrant les tumeurs est souvent associée à un bon pronostic chez les patients. A l’aide d’un modèle in vitro chez l’homme et in vivo chez des souris transgéniques HLA, nous avons identifié quatre nouveaux peptides CD4 dérivés de la télomérase (TERT) un antigène de tumeur exprimé dans la majorité des cancers humains. Ces peptides appelés «Universal Cancer Peptide, UCP» se lient à la majorité des allèles HLA-DR et sont capables d’activer spécifiquement les LT CD4 de type-1. Des LT CD4 circulants spécifiques des UCP sont naturellement détectables dans plusieurs cancers humains mais absents chez des individus sains. Des clones T CD4 spécifiques des UCP générés à partir des lymphocytes de patients, produisent de forts taux d’IFN, TNF, et d’IL-2, cytokines associées à la polarisation Th1. L’analyse par ELISPOT IFN, de LT CD4 anti-UCP circulants au sein d’une cohorte de 84 patients atteints de cancers bronchiques métastatiques a montré la présence naturelle de ces lymphocytes chez 38 % des patients. De plus un effet bénéfique de la présence de cette réponse sur la survie globale a été observé chez les patients ayant une réponse clinique objective après chimiothérapie (13 vs 10 mois, P< 003). In vivo, l’immunisation de souris transgéniques HLA-A2/HLA-DR1 (Tg A2/DR1) avec les peptides UCP stimule des réponses T CD4 spécifiques caractérisées par une polarisation Th1. Nous avons montré que la présence in vivo de LT CD4 anti-UCP est nécessaire pour l’induction de réponses CTL antitumorales efficaces. Ainsi chez des souris co-immunisées en présence d’un peptide UCP, on observe un accroissement en nombre et de la qualité des réponses CTL proportionnellement à l’aide délivrée par les LT CD4 anti-UCP. L’induction de LT CD4 anti-UCP s’accompagne également d’une activation des cellules dendritiques in vivo via un mécanisme impliquant CD40L, IFN et GM-CSF. Dans un modèle de mélanome transplantable chez les souris Tg A2/DR1 nos résultats ont montré qu’une vaccination thérapeutique comportant un peptide UCP favorise un meilleur recrutement de CTL fonctionnels dans les tumeurs et améliore ainsi l’efficacité antitumorale du vaccin. Ces résultats confirment le rôle antitumoral majeur des lymphocytes CD4 Th1 et soulignent l’intérêt clinique de stimuler des réponses T CD4 spécifiques d’antigènes tumoraux de relevance clinique comme TERT
Recent advances in immunology have now validated the concept of cancer immunosurveillance and the leading role of adaptative T cell immunity. Until a few years ago, antitumor CD8 T cell responses have been the most studied due to their direct cytotoxic activity on tumor cells. On the other hand, study of antitumor CD4 T cell responses are even more challenging because of the heterogeneity and plasticity of the various CD4 T cells subpopulations described. Among them, CD4 T helper type-1 cells (Th1), mainly characterized by the production of IFN, control the activation of antitumor cellular immunity. Thus, stimulation of specific CD4 Th1 cells may have a major interest for the development of anticancer immunotherapies. During this research thesis, we characterized novel HLA class II epitopes derived from a relevant tumor antigen, telomerase (TERT), and studied their capacities to stimulate specific CD4 Th1 cell responses. Using a method based on predictive immunology, we identified 4 peptides derived from TERT, referred as « Universal Cancer Peptides » (UCPs), enable to bind the most commonly found HLA-DR alleles in human. Using HLA-A2/HLA-DR1 transgenic mouse model, we first evaluated the in vivo immunogenicity of these peptides. Immunization of mice with UCPs induces high avidity specific CD4 T cells. The study of their polarization showed that UCP-specific CD4 T cells do not produce IL-4, -5, -10 or -17 cytokines, excluding a Th1, Treg or Th17 differentiation. In contrast, we measured high amount of IFN and IL-2 which characterize a Th1 pattern. The study of helper role allow us to demonstrate that CD8 peptide-based vaccinations in presence of UCPs enhance the efficacy of tumor specific CTL responses. Indeed, the intensity of these responses is strongly correlated with that of UCP-specific CD4 T cells induced in vivo. Furthermore, the stimulation of UCP-specific CD4 T cells promotes activation and IL-12 release by dendritic cells through a mechanism that involves IFN, GM-CSF and CD40L. We also demonstrated the antitumor efficacy of UCPs during a therapeutic vaccination in mice, as well as their capacity to foster the recruitment of specific CD8 T cells at the tumor site. In addition, the presence of naturally occurring UCP-specific CD4 T cell responses was found in different types of cancers such as leukemia, lung, colorectal or renal cancers. A study conducted in a cohort of 84 metastatic lung cancer patients revealed a synergistic effect of spontaneous UCP-specific CD4 Th1 and chemotherapy-treatment. Altogether, this study provides further evidences that stimulation of antitumor CD4 Th1 cells is a powerful method to improve cancer vaccines and also highlights the interest of TERT-derived UCPs for the innovative monitoring of antitumor CD4 T cell responses

La ténascine-C (TNC), protéine de la matrice extracellulaire, favorise la progression tumorale et la métastase par des mécanismes pas totalement élucidés. J’ai utilisé un nouveau modèle de progression tumorale de la glande mammaire basé sur une approche de greffe de cellules tumorales orthotopiques syngéniques et j’ai ainsi identifié la TNC comme un régulateur important de la croissance tumorale. L’expression concomitante de la TNC par les cellules de l’hôte et les cellules tumorales induit une régression de la tumeur en induisant une signature de présentation d’antigène. Cette signature a été corrélée avec une meilleure survie des patientes atteintes de cancer du sein. D’autre part, la TNC exprimée par les cellules tumorales induit également l’expression de CXCL12 au sein de la tumeur, piégeant les lymphocytes CD8+ dans des travées de matrice enrichies avec le CXCL12 lié à la TNC. L’inhibition du récepteur de CXCL12, le CXCR4 provoque une régression tumorale qui s’accompagne d’un afflux important de lymphocytes T CD8+ et d’une augmentation de la mort cellulaire au sein du lit tumorale. La séquestration des lymphocytes T cytotoxiques par la TNC dans les travées de matrice peut avoir une implication importante dans le développement et l’utilisation des nouvelles immunothérapies ciblant l’activité des cellules effectrices du système immunitaire
The extracellular matrix molecule tenascin-C (TNC) promotes tumor progression and metastasis by poorly understood mechanisms. I used a novel breast progression model based on a syngeneic orthotopic tumor cell grafting approach and identified TNC as an important regulator of tumor growth. I document that TNC promotes the battle between tumor regression and growth, where combined expression of tumor cell- and host-derived TNC induces tumor cell rejection. Tumor cell-derived TNC may elicit regression by induction of an antigen presenting signature (APS) expressed by the host, which correlates with better breast cancer patient survival. Tumor-cell derived TNC also triggers CXCL12 expression, thereby causing trapping of CD8+ T cells in the surrounding TNC matrix tracks. TNC binds CXCL12, and combined TNC/CXCL12 attracts and immobilizes CD8+ T cells. Inhibition of the CXCL12 receptor CXCR4 causes tumor regression that is accompanied by massive infiltration of CD8+ T cells and cell death inside the tumor cell nests. Altogether,TNC-triggered CXCL12 signaling may dampen CD8+ T cell function where physical trapping of CD8+ T cells in the TNC matrix may have implications for immune cell therapies. Our results and new tumor model, offer novel opportunities for preclinical cancer research and cancer patient therapy, by triggering the “good” and blocking the “bad” actions of TNC. In particular, overcoming the immune suppressive action of TNC, through inhibition of CXCR4, could be a useful approach

Dans les cellules des eucaryotes, la transcription des gènes est contrôlée par une pléthore de complexes protéiniques. Cependant, la plupart de nos connaissances fondamentales sur la régulation de la transcription viennent des expériences biochimiques ou des expériences d’immunofluorescences utilisant des cellules fixées. Par conséquent, beaucoup d’efforts ont été consacré récemment pour obtenir des informations sur les mouvements dynamiques ou sur l’assemblage des facteurs de transcription directement dans des cellules vivantes. Nous avons développé une stratégie de marquage, appelé « versatile antibody-based imaging approach » (VANIMA), dans laquelle des anticorps marqués avec un fluorochrome sont introduit dans des cellules vivantes pour visualiser spécifiquement des protéines endogènes ou des modifications post-traductionnelle. Nous avons pu montrer que VANIMA peut être utilisé pour étudier des processus dynamique des mécanismes fondamental de la biologie y compris les facteurs de la machinerie de transcription ainsi que les modifications des histones dans des cellules vivantes de cancer humaine en utilisant la microscopie conventionnelle ou à super-résolution. Dans l’avenir VANIMA va servir comme un outil valable pour révéler les dynamiques des processus endogènes en biologie y compris la transcription directement dans des cellules vivantes individuelles
In eukaryotic cells, gene transcription is controlled by a plethora of protein complexes. However, most of our basic knowledge about transcription regulation originate from biochemical experiments or immunofluorescence experiments using fixed cells. Consequently, many efforts have been devoted recently to obtain information about the dynamic movements or assembly of transcription factors directly from living cells. Therefore, we developed a labeling strategy, named versatile antibody-based imaging approach (VANIMA), in which fluorescently labeled antibodies are introduced into living cells to image specific endogenous proteins or posttranslational modifications. We were able to show that VANIMA can be used to study dynamical processes of fundamental biological mechanisms including factors of the transcription machinery as well as histone modifications in living human cancer cells using conventional or super-resolution microscopy. Hence, in the future VANIMA will serve as a valuable tool to uncover the dynamics of endogenous biological processes including transcription directly in single living cells