Tesis sobre el tema "Recettori per le neurotrofine"

The biological complexity of NGF action is achieved by binding two distinct Neurotrophin receptors, TrkA and p75NTR. While several reports have provided lines of evidence on the interaction between TrkA and p75NTR at the plasma membrane, much fewer data are available on the consequence of such an interaction in terms of intracellular signaling. In this study, we have focused on how p75NTR may affect TrkA downstream signaling with respect to neuronal differentiation. Here, we have shown that cooperation between p75NTR and TrkA results in an increased NGF-mediated TrkA autophosphorylation, leads to a sustained activation of ERK1/2 and accelerates neurite outgrowth. Interestingly, neurite outgrowth is concomitant with a selective enhancement of the AP-1 activity and the transcriptional activation of genes such as GAP-43 and p21(CIP/WAF), known to be involved in the differentiation process. Collectively, our results unveil a functional link between the specific expression profile of neurotrophin receptors in neuronal cells and the NGF-mediated regulation of the differentiation process possibly through a persistent ERKs activation and the selective control of the AP-1 activity. In our studies we discuss the functional role of the neurotrophin receptor p75NTR and TrkA in a ligand-dependent signal transduction. It is known that p75NTR is also involved in the mediation of cell death ligand dependent. Here we show for the first time that the membrane receptor p75NTR, upon binding to b- Amyloid (Ab) peptide, is able to transduce a cytotoxic signal through a mechanism very similar to the one adopted by Tumor Necrosis Factor Receptor 1 (TNFR1), when activated by TNFa. We define that in neuroblastoma cell line Ab cytotoxicity signals through a pathway depending on p75NTR death domain (DD), mostly through some specific conserved residues. We identified that TRADD is the first interactor recruiting to the membrane and activates JNK and NF-kB transcription factors. Since Ab is defined as the most important aetiologic element associated with the Alzheimer’s Disease (AD), characterization of the mechanism involved in the mediation of the neurodegeneration can suggest also new therapeutic approaches.

The biological complexity of NGF action is achieved by binding two distinct Neurotrophin receptors, TrkA and p75NTR. While several reports have provided lines of evidence on the interaction between TrkA and p75NTR at the plasma membrane, much fewer data are available on the consequence of such an interaction in terms of intracellular signaling. In this study, we have focused on how p75NTR may affect TrkA downstream signaling with respect to neuronal differentiation. Here, we have shown that cooperation between p75NTR and TrkA results in an increased NGF-mediated TrkA autophosphorylation, leads to a sustained activation of ERK1/2 and accelerates neurite outgrowth. Interestingly, neurite outgrowth is concomitant with a selective enhancement of the AP-1 activity and the transcriptional activation of genes such as GAP-43 and p21(CIP/WAF), known to be involved in the differentiation process. Collectively, our results unveil a functional link between the specific expression profile of neurotrophin receptors in neuronal cells and the NGF-mediated regulation of the differentiation process possibly through a persistent ERKs activation and the selective control of the AP-1 activity. In our studies we discuss the functional role of the neurotrophin receptor p75NTR and TrkA in a ligand-dependent signal transduction. It is known that p75NTR is also involved in the mediation of cell death ligand dependent. Here we show for the first time that the membrane receptor p75NTR, upon binding to b- Amyloid (Ab) peptide, is able to transduce a cytotoxic signal through a mechanism very similar to the one adopted by Tumor Necrosis Factor Receptor 1 (TNFR1), when activated by TNFa. We define that in neuroblastoma cell line Ab cytotoxicity signals through a pathway depending on p75NTR death domain (DD), mostly through some specific conserved residues. We identified that TRADD is the first interactor recruiting to the membrane and activates JNK and NF-kB transcription factors. Since Ab is defined as the most important aetiologic element associated with the Alzheimer’s Disease (AD), characterization of the mechanism involved in the mediation of the neurodegeneration can suggest also new therapeutic approaches.

2006/2007
La tesi illustra il lavoro di dottorato mirato allo sviluppo di nuovi antagonisti adenosinici attivi nei confronti dei vari sottotipi recettoriali del ligando naturale Adenosina.
XX Ciclo
1977

S1P is a bioactive metabolite of Sphingomyelin implicated in many biological processes, including growth and proliferation. This molecule can function intracellularly, as a second messenger, or extracellularly, activating S1P receptors present on the cell surface. Skeletal muscle express all the enzymes that compose the Sphingomyelin pathway, that create sphingolipids as demonstrated by the high levels in the T tubular system of Sphyngomyielin and Sphingosine (Sph, precursor of S1P) and by a great activity of sphingomyelinase, that catalyses the first step in the pathway. The sphingolipid derivates are also present at high concentration on blood, and thus skeletal muscle is steadily controlled by these factors. The first part of this research aimed to study the expression and the localization of S1P receptors in rat skeletal muscle. RT-PCR and Western Blot analyses demonstrated the expression of S1P1 and S1P3 receptors in adult soleus muscle. Immunofluorescence revealed that both S1P1 and S1P3 receptors are localized at the cell membrane of muscle fibers and in the T-tubule membranes, but only S1P1 receptor is present at higher expression at the neuromuscular junction. Both the receptors have been found also to decorate the nuclear membrane and to be expressed in the satellite cells. As the presence of S1P1 and S1P3 on skeletal muscle seemed to suggest a possible physiological action of S1P, thus the second part of the research aimed to investigate the possibility that S1P acts as trophic factor. It was studied the action of S1P and Sph by means of the model of atrophy induced by the denervation and the model of in vivo regeneration. During soleus muscle denervation, S1P was continuously delivered through a mini osmotic pump. S1P and Sph, significantly attenuated the progress of denervation-induced muscle atrophy. In other experiments the trophic effect of Sph was prevented by N, N-dimethylsphingosine, an inhibitor of Sph kinase, the enzyme that phosphorylates Sph to S1P, implying that Sph acts by previous transformation in S1P. Neutralization of circulating S1P by a specific antibody, worsen the atrophy, corroborating the trophic effect of S1P during denervation. It has also been demonstrated that S1P and Sph incremented the Myogenin and MyoD expression, and this transcriptional factors, as supposed by others, contrasted the atrophy progression. S1P and Sph also attenuated the slow-to-fast MyHC transformation due to inactivity. Denervation of rat soleus muscle, analyzed 7 and 14 days after motor nerve cut, produced the down regulation of S1P1 and S1P3 receptors, while treatment with S1P and Sph had no effect on their expression. The presence of S1P1 and S1P3 on satellite cells, probably implies function of S1P during regeneration. First, it was studied the time course expression of both receptors during regeneration of rat soleus muscle, induced by bupivacaine. During the first week of regeneration S1P1 expression, initially low, gradually increased, while S1P3, initially high, gradually decreased. These data suggest that S1P1 and S1P3 have distinct roles during regeneration. The direct injection into the regenerating muscle of S1P and Sph determinated an increase in the growth rate of regenerating fibers. In fact, in the presence of S1P and Sph, the mean cross sectional area of the 3-days regenerating fibers was significantly higher compared to the controlateral not injected regenerating muscle. The treatments also increased Akt phosphorylation level, suggesting an augment in the protein synthesis. In conclusion, the results indicate that S1P plays a significant role in the trophism and development of muscle fiber.

In Europa, la sopravvivenza a 5 anni dei pazienti affetti da leucemia mieloide acuta (LMA) è solo del 20%. La duplicazione interna in tandem del gene FLT3 (FLT3-ITD), che codifica per il recettore della tirosina chinasi FLT3, è la mutazione più frequente (~ 25%) nella LMA con cariotipo normale, dove porta all'attivazione costitutiva della chinasi FLT3. Nonostante risultati iniziali molto promettenti con inibitori di FLT3 (FLT3i) nei pazienti con questa mutazione, pochi pazienti hanno remissioni prolungate, evidenziando la necessità di nuove e più efficaci terapie. La persistenza delle cellule staminali leucemiche guida la leucemogenesi della LMA ed è responsabile della resistenza ai farmaci e della ricaduta dopo chemioterapia convenzionale. L'attivazione costitutiva di FLT3 porta all’attivazione del signaling a valle, e in particolare della via PI3K/AKT/mTOR, una cascata di segnale fortemente associata alla sopravvivenza delle cellule staminali leucemiche e al crosstalk tra le cellule staminali leucemiche e le cellule stromali associate al microambiente tumorale midollare. La nicchia midollare fornisce protezione alle cellule leucemiche FLT3-ITD nei confronti degli inibitori FLT3. Pertanto, la via PI3K/AKT/mTOR può rappresentare un bersaglio terapeutico nella AML FLT3-ITD. Questo studio mira a verificare l'ipotesi che l'inibizione di PI3K/AKT/mTOR sensibilizzi le cellule AML FLT3-ITD alla terapia mirata con RTKi utilizzando linee cellulari AML umane e blasti di pazienti primari. In particolare, ho definito il profilo fenotipico delle linee cellulari FLT3-ITD rispetto a quelle FLT3 wildtype dopo trattamento con un pannello di FLT3i o PI3K/AKT/mTORi che non hanno dimostrato sufficiente efficacia clinica se utilizzato come monoterapia. Successivamente, ho valutato l’effetto del farmaco sulla crescita cellulare e sul ciclo cellulare e l'apoptosi. I risultati ottenuti dimostrano che BAY-806946 (pan PI3Ki) e PF-04691502 (inibitore duale PI3K/mTORi) sono in grado di inibire la crescita poiché causano arresto del ciclo cellular in fase G1 e apoptosi, un effetto che appare indipendente dallo stato mutazionale di FLT3. Dimostrano inoltre che l’arresto della crescita cellulare indotto dall’inibitore di FLT3 (FLT3i) quizartinib è causato principalmente dall’induzione di apoptosi. Tuttavia l’efficacia rimane inferiore rispetto al trattamento con chemioterpia convenzionale (AraC). Inoltre, la proof of concept per l’utilizzo della combinazione del quizartinib con BAY-806946 è stata ottenuta in linee cellulari AML FLT3-ITD e blasti primari da paziente. Nel valutare i blasti primari da paziente, è stato considerato il ruolo protettivo delle cellule stromali mesenchimali in co-coltura, e dei fattori di crescita per riprodurre le condizioni del microambiente midollare. Pertanto, blasti primari da paziente LAM sono stati mantenuti in co-coltura con cellule stromali MS5 in presenza di concentrazioni fisiologiche di fattori di crescita quali IL-3, TPO e GM-CSF. Come atteso, il BAY-806946 potenzia l’effetto citostatico e citotossico del quizartinib nelle cellule MOLM-13 e nei blasti primari da paziente con mutazione FLT3-ITD in condizione di co-coltura. E’ importante sottolineare l’incremento di apoptosi osservato anche nella sottopopolazione staminale leucemica CD34+CD38-. Infine, ho valutato il profilo delle citochine e delle fosfoproteine persistenti come bersagli putativi dopo il trattamento di combinazione. Complessivamente, questo studio dimostra il potenziale di PI3Ki per migliorare l'efficacia di RTKi quizartinib nel trattamento della LMA FLT3-ITD.
Acute myeloid leukemia (AML) has a very poor 5-year survival of ~20% in Europe. The internal tandem duplication (ITD) mutation of the Fms-like receptor tyrosine kinase 3 (FLT3) (FLT3-ITD) is the most frequent mutation (~25%) in normal karyotype AML. In recent clinical studies, few patients display prolonged remissions with receptor tyrosine kinase (RTK) inhibitors, such as FLT3 inhibitors (FLT3i) therapy, highlighting a substantial unmet need for novel effective treatment. Persistence of leukemia stem cells (LSC) drive AML leukemogenesis, responsible for drug resistance and disease relapse following conventional chemotherapy. Growing evidence recognizes that FLT3-ITD mutation leads to the constitutive activation of FLT3 kinase and its downstream pathways, including PI3K/AKT/mTOR signaling, strongly associated with LSC survival and crosstalk between LSC and stromal cells associated bone marrow (BM) tumor environment (TME). The TME provides protection of FLT3-ITD AML cells against FLT3 inhibitors. Thus, the PI3K/AKT/mTOR pathway may represent as a putative target for FLT3-ITD AML. This study aims to test the hypothesis that PI3K/AKT/mTOR inhibition could sensitize FLT3-ITD AML cells to RTKi-lead targeted therapy using human AML cell lines and primary patient blasts. First, I uncover the phenotypic profile of FLT3-ITD versus FLT3 wildtype cell lines following treatment with selected FLT3i or PI3K/AKT/mTORi that have failed treatment of AML as monotherapy in clinical studies. More specifically, I determine the drug efficacy by means of cell growth measurement and assessment of cell cycle status and apoptosis. I was able to demonstrate that BAY-806946 (pan PI3Ki) and PF-04691502 (dual PI3K/mTORi) exerted growth inhibitory activity caused by G1 cell cycle arrest and apoptosis, and this effect was irrespective of FLT3 status. Quizartinib (FLT3i) selectively inhibited cell growth in FLT3-ITD AML and this effect was mainly caused by apoptosis. The observed drug-induced apoptotic effect was however not as efficient as chemotherapy. Next, I provide proof-of-concept for the combination of quizartinib and BAY-806946 using both FLT3-ITD AML cell lines and primary patient blasts. When evaluating on primary patient blasts, I take into consideration the protective role of mesenchymal stromal cells and physiological growth factors to mimic the BM microenvironment. Hereby, I co-cultured FLT3-ITD AML blasts with stromal cell line MS-5 and added growth factors essential for AML survival and differentiation such as IL-3, TPO and G-CSF at physiological concentration. As expected, treatment with BAY-806946 enhanced both cytostatic and cytotoxic effect of quizartinib in FLT3-ITD AML cell line MOLM-13 as well as primary patient blasts in co-culture. More importantly, enhanced apoptosis was measured in the stem cell like CD34+CD38- population. Lastly, I elucidate the cytokine profile and persistent phosphoproteins as putative targets following combination treatment. Ultimately, this study demonstrates the potential of PI3K/AKT/mTORi to enhance the efficacy of RTKi quizartinib for the treatment of FLT3-ITD AML.

Utilizzando il modello tumorale transgenico BALB-NeuT abbiamo analizzato la specifica interferenza, indotta dalla vaccinazione, della carcinogenesi causata in questo modello animale dal prodotto dell’oncogene neu. È stata confrontata l’inibizione della formazione di masse tumorali in seguito alla vaccinazione con neu di ratto normale (ErbB2/Neu) o con i recettori ErbB xenogenici umani (LTR-EGFR, LTR-ErbB2, LTR-ErbB3, LTR-ErbB4), espressi singolarmente in cellule murine NIH3T3, o in seguito alla vaccinazione con poxvirus ricombinante, Vaccinia virus (rV-neu). La vaccinazione precoce, allo stadio di iperplasia atipica con LTR-Neu, inibisce in maniera drastica la carcinogenesi mammaria mediata da neu e inoltre, la vaccinazione con cellule esprimenti i recettori ErbB umani interferisce, significativamente in tutti i casi, con lo sviluppo del tumore nei topi BALB-NeuT. L’aumento relativo nella sopravvivenza libera da tumore e la riduzione dell’incidenza dei tumori corrisponde alla conservazione strutturale condivisa tra i recettori umani e l’oncogene neu, infatti l’immunizzazione con cellule trasfettate con LTR-Neu è quella che ha mostrato la maggiore efficacia antitumorale seguita da LTR-ErbB2 e dagli altri tre recettori ErbB umani. Le vaccinazioni hanno dimostrato di indurre un alto, specifico e comparabile titolo anticorpale e gli effetti antitumorali indotti da questi anticorpi correlano con la cross reattività verso il dominio extracellulare, purificato in vitro, della proteina Neu. Inoltre una specifica risposta T cellulare verso epitopi del Neu di ratto, rilevabile per la reattività di queste cellule alla stimolazione con peptidi specifici, è stata anche stimolata nelle cellule di milza dei topi immunizzati con LTR-Neu e, in misura minore, nelle cellule dei topi immunizzati con LTR-ErbB2 e LTR-EGFR. L’inibizione tumorale più pronunciata in seguito alla vaccinazione con LTR-Neu è stata associata con l’infiltrato leucocitario e la necrosi tumorale in vivo, mentre i sieri immuni specificamente inducono citotossicità cellulo mediata dipendente dagli anticorpi e apoptosi delle cellule tumorali mammarie dei topi BALB-NeuT in vitro. Inoltre, valutando l’efficacia di un vaccino che usa come veicolo il virus vaccinico ricombinante per Neu, si è rilevata la capacità anche di questa immunizzazione di contrastare efficacemente la crescita dei tumori nei topi transgenici con un effetto più marcato per inoculi multipli. L’inibizione risultante è comparabile alla vaccinazione allogenica quando le somministrazioni sono effettuate agli stadi più precoci di sviluppo del tumore mentre induce una protezione superiore ad essa quando l’immunizzazione con il virus ricombinante è eseguita a partire da uno stadio tardivo di sviluppo della malattia.
Employing the transgenic animal model BALB-NeuT, the outcome of neu-mediated tumorigenesis was compared following vaccination with isogenic normal rat ErbB2/Neu (LTR-Neu) or xenogeneic human ErbB receptors (LTR-EGFR, LTR-ErbB2, LTR-ErbB3 and LTR-ErbB4), both recombinantly expressed in an NIH3T3 murine cell background, or following vaccination with neu-recombinant Vaccinia virus (rV-neu). Vaccination using rat LTR-Neu at the stage of atypical hyperplasia potently inhibited neu-mediated mammary tumorigenesis. Moreover, all human ErbB receptors specifically interfered with tumor development in BALB-NeuT mice. Relative increase in tumor-free survival and reduction in tumor incidence corresponded to structural similarity shared with the etiologic neu oncogene. The rat orthologue LTR-Neu proved most effective followed by the human homologue LTR-ErbB2 and then the other three human ErbB receptors. Vaccination resulted in high titer of specific serum antibodies whose tumor-inhibitory effects correlated with cross-reactivity to purified rat Neu extracellular domain in vitro. Furthermore, a T cell response specific for peptide epitopes of rat Neu was elicited in spleen cells of mice immunized with LTR-Neu and was remotely detectable for discrete peptides upon vaccination with LTR-ErbB2 and LTR-EGFR. The most pronounced tumor inhibition by LTR-Neu vaccination was associated with leukocyte infiltrate and tumor necrosis in vivo, while immune sera specifically induced cytotoxicity and apoptosis of BALB-NeuT tumor cells in vitro. Moreover, the multiple vaccination employing the neu-recombinant virus also resulted in a specific inhibition of neu-mediated tumorigenesis. The resulting inhibition was comparable with the allogeneic immunization schedule when started early in tumor development but gave higher protection when the vaccination was started later in tumor onset.

The α6β2∗ neuronal nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) subtype expressed in the dopaminergic mesostriatal pathway mediates many behavioural effects of nicotine, and is selectively blocked by the small disulfide-rich α-conotoxins PIA and MII. Both share a "ω-shaped" topology but PIA bears a tail in the N-terminal region containing three amino acids [arginine (R), aspartic acid (D), and proline (P)]. We synthesised a group of PIA-related peptides in which R1 was mutated or the RDP motif was gradually removed. Binding and functional studies showed that the RDP sequence is essential for the activity of PIA on the native rat α6β2* subtype, with a major role played by residue R1. Molecular modelling studies showed that recognition of PIA by α6β2* nAChRs depends on a salt bridge between the guanidine group of R1 and the highly negatively charged D166-D167 residues located on the β2 subunit. The RDP sequence was then added to the N-terminus of MII; the resulting hybrid peptide (RDP-MII) showed an increased potency (5-fold) and affinity (13-fold) for α6β2* but not for α3β2* nAChRs. Furthermore, as docking studies indicated E11 as a potential key residue engendering a α6β2* vs. α3β2* selectivity, we prepared and tested the following E11 mutated MII analogues: MII[E11R] and RDP-MII[E11R]. The binding and functional profiles of the new peptides at native rat α6β2* receptor were comparable with those of their leads while potency and affinity for native and heterologously expressed α3β2* nAChRs were reduced. Consequently, MII[E11R] and RDP-MII[E11R] are potent and α6β2* vs. α3β2* selective antagonists.

Quando le condizioni sono sfavorevoli alla crescita, membri dei generi Bacillus e Clostridia (incluso Clostridium botulinum, l’agente eziologico del botulismo) formano endospore, forme cellulari estremamente resistenti, metabolicamente dormienti e difficili da distruggere. Tuttavia, le spore attraverso il processo di germinazione, riattivano il ciclo vegetativo non appena le condizioni tornano favorevoli. Questa capacità di “riattivazione” delle spore è causa di “food spoilage” e di intossicazioni alimentari. Considerando che le specie Clostridium botulinum e Clostridium sporogenes sono filogeneticamente correlate, in questo lavoro, il ceppo Clostridium sporogenes UC9000, isolato da latte crudo, è stato utilizzato come modello non-patogeno di Clostridium botulinum per studiare la germinazione. Studi fisiologici hanno rivelato che le spore del ceppo UC9000 germinano in presenza di L-alanina/ L-cisteina in combinazione con L-lattato, mentre un analisi in silico ha permesso di identificare omologhi dei recettori coinvolti nella risposta all’L-alanina in Bacillus. Attraverso l’analisi del genoma sono stati identificati gli enzimi SleB, CwlJ e SleL, responsabili della degradazione del cortex. CwlJ è stato localizzato nel coat della spora grazie ad uno studio di proteomica, è stato espresso in forma solubile in E. coli ed un test di attività in vitro ha evidenziato la sua capacità di indurre la germinazione di spore “decoated”
When environmental conditions are unfavorable to the growth, Bacillus and Clostridium bacteria (including Clostridium botulinum, the causative agent of foodborne botulism) form endospores, metabolically dormant cell types resistant to several adverse conditions and difficult to kill. However, under suitable conditions, spores resume the vegetative life by triggering the germination process. Thus, spores are dangerous agents of human foodborne disease and food spoilage. In this work, the strain Clostridium sporogenes UC9000, isolated from raw milk, was used like not-pathogenic model of Clostridium botulinum to better understand the mechanisms underpinning the Clostridium germination. Clostridium sporogenes is a species phylogenetically related to Clostridium botulinum and often used like its surrogate. Physiological studies revealed that UC9000 spores germinate in presence of L-alanine/L-cysteine in combination with L-lactate, while in silico analyses allowed the identification of homologues of the Bacillus germinant receptors responsive to L-alanine. The genome screening also detected genes coding for SleB, CwlJ and SleL, enzymes participating to the cortex degradation. CwlJ was found resident in the spore coat by performing a proteomic analysis, it was expressed in soluble form in E. coli and an in vitro assay of activity revealed its capability to induce germination when added exogenously to decoated spores

Quando le condizioni sono sfavorevoli alla crescita, membri dei generi Bacillus e Clostridia (incluso Clostridium botulinum, l’agente eziologico del botulismo) formano endospore, forme cellulari estremamente resistenti, metabolicamente dormienti e difficili da distruggere. Tuttavia, le spore attraverso il processo di germinazione, riattivano il ciclo vegetativo non appena le condizioni tornano favorevoli. Questa capacità di “riattivazione” delle spore è causa di “food spoilage” e di intossicazioni alimentari. Considerando che le specie Clostridium botulinum e Clostridium sporogenes sono filogeneticamente correlate, in questo lavoro, il ceppo Clostridium sporogenes UC9000, isolato da latte crudo, è stato utilizzato come modello non-patogeno di Clostridium botulinum per studiare la germinazione. Studi fisiologici hanno rivelato che le spore del ceppo UC9000 germinano in presenza di L-alanina/ L-cisteina in combinazione con L-lattato, mentre un analisi in silico ha permesso di identificare omologhi dei recettori coinvolti nella risposta all’L-alanina in Bacillus. Attraverso l’analisi del genoma sono stati identificati gli enzimi SleB, CwlJ e SleL, responsabili della degradazione del cortex. CwlJ è stato localizzato nel coat della spora grazie ad uno studio di proteomica, è stato espresso in forma solubile in E. coli ed un test di attività in vitro ha evidenziato la sua capacità di indurre la germinazione di spore “decoated”
When environmental conditions are unfavorable to the growth, Bacillus and Clostridium bacteria (including Clostridium botulinum, the causative agent of foodborne botulism) form endospores, metabolically dormant cell types resistant to several adverse conditions and difficult to kill. However, under suitable conditions, spores resume the vegetative life by triggering the germination process. Thus, spores are dangerous agents of human foodborne disease and food spoilage. In this work, the strain Clostridium sporogenes UC9000, isolated from raw milk, was used like not-pathogenic model of Clostridium botulinum to better understand the mechanisms underpinning the Clostridium germination. Clostridium sporogenes is a species phylogenetically related to Clostridium botulinum and often used like its surrogate. Physiological studies revealed that UC9000 spores germinate in presence of L-alanine/L-cysteine in combination with L-lactate, while in silico analyses allowed the identification of homologues of the Bacillus germinant receptors responsive to L-alanine. The genome screening also detected genes coding for SleB, CwlJ and SleL, enzymes participating to the cortex degradation. CwlJ was found resident in the spore coat by performing a proteomic analysis, it was expressed in soluble form in E. coli and an in vitro assay of activity revealed its capability to induce germination when added exogenously to decoated spores

La nicotina è in grado di indurre effetti sia ad un livello molecolare e cellulare che sull’intero organismo ed il suo comportamento. La nicotina si lega ad un sottotipo di recettori colinergici, i recettori nicotinici (nAChRs). Essi sono strutture proteiche composte di cinque subunità, che sono organizzate per formare un canale cationico attraverso la membrana cellulare. Esistono molte subunità differenti che possono assemblarsi in una varietà di combinazioni portando ad una grande quantità di diversi nAChRs. Quando un ligando, come per esempio la nicotina, si lega ai nAChRs la permeabilità del canale può cambiare. I diversi nAChRs hanno differenti permeabilità ai vari cationi. Il nAChR omomerico contenente la subunità alfa7 esprime la più alta corrente frazionale per gli ioni calcio tra i nAChRs nel sistema nervoso. L’acetilcolina, che è il ligando naturale dei nAChRs, si degrada nelle sinapsi e dà origine alla colina. Quest’ultima è un’agonista completo e selettivo per i nAChRs alfa7. Alcuni nAChRs sono in grado di mediare una trasmissione sinaptica veloce, ma le loro funzioni più comunemente considerate sono quelle di modulazione. I nAChRs localizzati presinapticamente possono essere coinvolti nella modulazione del rilascio di neurotrasmettitori. Nei siti postsinaptici e sul soma i nAChRs possono avere effetti modulatori sia ad un livello sinaptico che ad un livello cellulare. Tanti degli effetti modulatori in cui si considerano coinvolti i nAChRs richiedono segnali di calcio, cioè cambiamenti della concentrazione intracellulare di calcio ([Ca2+]i). Dato che i nAChRs alfa7 hanno una permeabilità alta al Ca2+, essi sono considerati coinvolti in tanti di questi effetti. Quando l’ambiente cambia la cellula può cercare di adattarsi alla situazione nuova. Due esempi di neuroadattamento sono il cambiamento della [Ca2+]i e i cambiamenti dei livelli di proteine. Sia i nAChRs che i fattori neurotrofici, come le neurotrofine e i loro recettori (NTRs), sono in grado di essere coinvolti in queste due forme di neuroadattamento. La prima parte di questo lavoro cerca di studiare il ruolo dei nAChRs sui segnali del calcio ed è basata su tecniche diverse di imaging, come la immunofluorescenza e il “calcium imaging”. La seconda parte è basata su studi di Western blot e cerca di analizzare un ruolo possibile dei nAChRs sul livello d’espressione dei NTRs. In tutte e due le parti una particolare enfasi viene posta sui nAChRs alfa7 e altresì in entrambe le parti sono state usate culture primarie di cellule della corteccia cerebrale di ratto. I risultati ottenuti nella prima parte di questo lavoro indicano un coinvolgimento dei nAChRs alfa7 sui segnali di calcio nelle culture corticali e che la colina può essere selettiva per i nAChRs alfa7. Queste indicazioni derivano dal fatto che la colina induce una tendenza ad un aumento della [Ca2+]i solo in cellule che esprimono siti di legame per l’alfa-bungarotossina, siti noti per essere corrispondenti ai nAChRs alfa7. La seconda parte di questo lavoro indica un’interazione tra i nAChRs alfa7 e un NTR, cioè il TrkB, sulla base del cambiamento del livello di espressione. Questa conclusione è tratta dall’osservazione che un’esposizione alla colina delle culture attenua il livello di TrkB. Comunque, per poter chiarire il coinvolgimento dei nAChRs alfa7 in queste osservazioni saranno necessarie ulteriori analisi.
Nicotine is known to induce effects at molecular and cellular levels and to affect the whole organism and its behaviour. Nicotine binds to a group of receptors, nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs). They are protein structures composed of five subunits, which are arranged to form a cation channel through the cell membrane. Many different subunits exist and they can assemble in a variety of combinations giving rise to many forms of nAChRs. When a ligand, such as nicotine, binds to nAChRs the permeabiliy of the channels may change. Different nAChRs show differences in their permeability to various cations. The homomeric alpha7 subunit containing nAChR shows the highest fractional Ca2+ current among nAChRs in the nervous system. Choline, the degradation product of the natural nAChR ligand acetylcholine, is a full and selective agonist of alpha7 nAChRs. Some nAChRs can mediate fast synaptic transmission, but modulatory functions of nAChRs are thought to be more common. Presynaptically localized, nAChRs may be involved in modulation of neurotransmitter release. At postsynaptic and somal sites nAChRs may have modulatory effects both at synaptic and cellular level. Many of the modulatory effects in which nAChRs are thought to be involved require calcium signals, i.e. changes of intracellular calcium concentration. Since alpha7 nAChRs have a high permeability for Ca2+, they are thought to be involved in many of these effects. When the environment changes, a cell can try to adapt to the new situation. Two examples of neuroadaptation are changes of intracellular calcium concentration [Ca2+]i and changes of protein levels. Both nAChRs and neurotrophic factors, such as neurotrophins and their receptors (NTRs), can be involved in these two forms of neuroadaptation. The first part of this work aims to investigate the role of nAChRs on calcium signals and is based upon different imaging studies, such as fluorescence immuno-cytochemistry and calcium imaging. The second part is based on Western blot studies and aims to analyse a possible role of nAChRs on expression levels of NTRs. In both parts a special emphasis is put on alpha7 nAChRs and in both parts primary cell cultures from rat cerebral cortex were used. The results obtained in the first part of the present study indicate that alpha7 nAChRs may be involved in calcium signals in cortical cell cultures and that choline may be selective for alpha7 nAChRs, since it induced a trend of increased [Ca2+]i only in cells expressing alpha-bungarotoxin binding sites, known to correspond to alpha7 nAChRs. The second part of this study indicates an interaction between alpha7 nAChRs and one NTR, i.e. TrkB, on an expression level basis. This conclusion is drawn from the observation that choline exposure of cell cultures attenuated TrkB levels. However, in order to clarify the involvement of alpha7 nAChRs in these observations more analysis have to be done.

Sebbene normalmente siano anatomicamente indipendenti, il sistema nervoso centrale e il sistema immunitario danno vita ad una varietà di risposte coordinate al pericolo attraverso comuni messaggeri chimici. Ad esempio, il sistema nervoso simpatico può alterare l’equilibrio Th1\Th2 attraverso la stimolazione dei recettori β adrenergici, mentre l’istamina può essere modulata dalla produzione di citochine Th1 e Th2 attraverso una differente espressione di recettori H1 e H2. La recente scoperta di cellule T CD4+ caratterizzate dalla secrezione di interleuchina 17 (Th17) e di cellule T CD4+ CD25+ Foxp3 (Treg) ha avuto un notevole impatto sulla conoscenza dei processi immuni non spiegati, in un primo momento, dal paradigma Th1\Th2. Le cellule Th17 e Treg sono state implicate nella patogenesi di varie malattie umane autoimmuni, comprese le neuro infiammazioni. Nessuna evidenza ha provato finora una possibile interferenza nell’equilibrio tra Th17 e Treg dovuto a neurotrasmettitori. Il glutammato rappresenta in messaggero chimico comune sia alle cellule nervose che alle cellule immunitarie e per questo potrebbe essere implicato in un tale contesto. Recenti evidenze suggeriscono che il glutammato, il maggior neurotrasmettitore eccitatorio del sistema nervoso centrale, possa essere implicato nella cosiddetta “sinapsi immunologica”. Nella sinapsi immunologica, le informazioni che si hanno sui recettori metabotropici del glutammato riguardano le cellule T. I linfociti T umani, infatti, esprimono costitutivamente il recettore mGlu5, il quale sembra mediare un effetto soppressivo sulla proliferazione delle cellule T, contrariamente al recettore mGluR1, la cui espressione è inducibile e media effetti costimolatori (Franco R. 2007). I recettori mGlu del guppo I e del gruppo II nel topo sono presenti nel timo e sono differentemente espressi nei timociti e nelle cellule stromali timiche (Storto 2000). Nessuna informazione è al momento disponibile sull’espressione dei recettori mGlu nelle cellule dentritiche (DCs) anche se queste cellule possono rilasciare alti livelli di glutammato attraverso il sistema di antiporto cisteina\glutammato (Franco 2007). Tuttavia, ad oggi, manca un quadro più ampio sul profilo d’espressione, sulle vie di segnalazione e sull’effetto risultante da un’attivazione di tali recettori nelle cellule del sistema immunitario. Nell’immunoterapia sperimentale è stato dimostrato che la somministrazione dell’agonista specifico per i recettori mGlu del gruppo III (mGluR4, mGluR6, mGluR7, mGluR8) L-2amino-4-phono-butanoate (L-AP-4), è in grado di abbreviare i tempi di guarigione nell’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in ratti Lewis (Bensong 2002). La disponibilità di topi knockout (Grm4-\-) per il recettore mGlu4 e il possibile utilizzo di N-phenyl-7-(hydroxyimino)ciclopropano[b]chromen-1a-carboxamide (PHCCC), un modulatore allosterico positivo (PAM) per mGluR4, ci ha spinto ad investigare il possibile coinvolgimento dei recettori metabotropici del gruppo III nell’ encefalomielite autoimmune sperimentale ed una la loro funzione nella neuroinfiammazione in genere.