Literatura académica sobre el tema "Recettori per le neurotrofine"

I pazienti affetti da IRC presentano fin dai primi stadi della malattia una ridotta attivazione del recettore per la Vitamina D (VDR), determinata da ridotti livelli sia di 1.25-idrossivitamina D (1.25(OH)2D3) che di 25-idrossivitamina D (25(OH)D3), con il conseguente sviluppo di anomalie del metabolismo osseo e minerale. La Vitamina D e i suoi metaboliti di sintesi, oltre a controllare l'iperparatiroidismo secondario (IPTS), esercitano numerosi effetti pleiotropici in diversi sistemi cellulari e, in particolare, sembrano giocare un ruolo fondamentale nella salute del sistema cardiovascolare e nella riduzione della mortalità, come suggerito da studi osservazionali. È stato di recente dimostrato che il paracalcitolo orale nell'IRC non solo riduce il paratormo-ne, ma è anche associato a un effetto antiproteinurico significativo, e ciò appare di particolare interesse in quanto la proteinuria è un fattore di rischio renale e cardiovascolare. I dati attuali non sono, tuttavia, sufficienti per raccomandare l'uso degli agenti attivatori dei VDR (VDRa) oltre al trattamento delle alterazioni del metabolismo minerale legate all'iperparatiroidismo secondario.

Lo scompenso cardiaco (SC), processo evolutivo comune di più malattie cardiovascolari a differente eziologia (ad es. infarto del miocardio, ipertensione, cardiomiopatie, disturbi valvolari e altre), è diventato sempre più comune nella popolazione anziana, influenzando drasticamente il tasso di sopravvivenza e la qualità della vita. L’iperattività del sistema nervoso simpatico (SNS) che si associa allo SC determina un aumento delle catecolamine circolanti epinefrina e norepinefrina che, attraverso l’attivazione dei recettori beta-adrenergici (β-AR), svolgono un ruolo critico nella regolazione della funzione del sistema cardiovascolare. Una caratteristica distintiva dello SC è la diminuzione o la desensibilizzazione dei recettori β1-adrenergici (β1-AR) sulla membrana delle cellule cardiache. Le catecolamine e lo stress ossidativo sono coinvolti nella regolazione della densità dei β-AR. Lo stress ossidativo associato alla disfunzione mitocondriale sembra giocare un ruolo importante nella fisiopatologia dello SC. Infatti, una condizione di stress ossidativo è stata osservata sia in pazienti con SC che in modelli animali, e un’eccessiva esposizione a specie reattive dell’ossigeno (ROS) diminuisce l’espressione di β1-AR in cardiomiociti murini, sebbene i meccanismi sottostanti rimangano ancora non chiari. Recentemente, è stato scoperto che il recettore periferico delle benzodiazepine (PBR) svolge un ruolo chiave oltre che nell’energetica cellulare, nella regolazione della fisiologia mitocondriale e dell’equilibrio redox nei cardiomiociti. Nel presente studio, abbiamo valutato gli effetti delle catecolamine e dei ligandi del PBR sulla densità dei β1- e β2-AR nei monociti umani isolati da sangue periferico, che sono noti per esprimere entrambi i β-AR. La densità dei β-AR è stata misurata mediante citometria a flusso utilizzando anticorpi selettivi diretti contro un epitopo extracellulare di β1-AR o β2-AR. Il trattamento dei monociti con benzodiazepine induceva una riduzione della densità del β1-AR, ma non del β2-AR, sulla membrana dei monociti che veniva ripristinata utilizzando [1-(2-chlorophenyl)-N-methyl-(1-meth-ylpropyl)-3 isoquinolinecarboxamide] (PK11195), un antagonista del PBR. Questi risultati suggeriscono un possibile ruolo del PBR nella regolazione della densità del β1-AR proponendo i monociti isolati dal sangue periferico sia come modello in vitro utile per lo studio del sistema recettoriale β-adrenergico che come potenziali biomarcatori di progressione della malattia e risposta alla terapia.

La menopausa costituisce un momento cruciale della vita della donna non solo dal punto di vista riproduttivo ma anche dal punto di vista fisiopatologico. Il calo della produzione ovarica di estrogeni determina una ridotta stimolazione di beta recettori endoteliali e miocardici che sono alla base di processi patologici quali le alterazioni del microcircolo coronarico o lo scompenso cardiaco a frazione d’eiezione preservata. Tali alterazioni si associano a quelle indotte da altri fattori di rischio cardiovascolare. È fondamentale in tale contesto prendere coscienza e trattare i fattori di rischio classici e quelli genere-specifici per non favorire l’insorgenza di patologie che incidono sugli eventi, sulla qualità della vita e sui costi sanitari.

Il sistema ormonale della vitamina D è classicamente implicato nella regolazione dell'omeostasi calcica e del metabolismo osseo. L'esistenza di recettori per la vitamina D in organi e tessuti non coinvolti direttamente nella regolazione del metabolismo minerale e la capacità di molte cellule di sintetizzare la forma attiva di vitamina D dal precursore circolante hanno fatto supporre che la vitamina D possa avere altri effetti oltre ai classici effetti sul metabolismo minerale. Il deficit di vitamina D induce lo sviluppo di patologie ossee ed è un importante fattore di rischio per lo sviluppo di neoplasie, malattie autoimmuni e malattie cardiovascolari. In questa rassegna vengono esaminati i risultati dei principali studi randomizzati che hanno utilizzato la supplementazione con vitamina D nella popolazione generale e nei pazienti con insufficienza renale cronica.

Per il trattamento di un disturbo mentale severo e la prevenzione delle ricadute sono indicate delle terapie a lungo termine con farmaci antipsi- cotici. Gli antipsicotici di seconda generazione sono associati ad un minor numero di sintomi extrapiramidali, tuttavia sono gravati da importanti effetti collaterali di tipo metabolico e dal rischio di aumento ponderale, effetti mediati sia dai recettori centrali e periferici, sia a modifiche della composizione del microbiota. Numerose sono le evidenze del ruolo del microbiota intestinale nell'indur- re l'aumento ponderale ed i disturbi metabolici indotti dagli antipsicotici di seconda generazione attraverso un alterato segnale dello stimolo della fame e della sazietà, una riduzione della spesa energetica, la modulazione del metabolismo lipidico e glucidico, le modifiche dell'infiammazione e del- la permeabilità della barriera intestinale. Nella prevenzione e nel trattamento integrato dell'aumento ponderale as- sociato alla terapia antipsicotica, oltre alle terapie di tipo farmacologico, i programmi nutrizionali e l'attività fisica trova impiego un approccio volto a modulare il microbiota intestinale per correggere la disbiosi. Tra i diversi probiotici impiegati quello più promettente sembra essere l'Akkermansia muchiniphila.

SommarioL’insulinoma maligno è un tumore neuroendocrino pancreatico estremamente raro ed è associato a una severa sindrome ipoglicemica che impatta negativamente sulla qualità di vita e sulla sopravvivenza dei pazienti affetti. La gestione terapeutica dell’insulinoma maligno è complessa sia per il controllo delle crisi ipoglicemiche, sia per il controllo della crescita tumorale. La sindrome ipoglicemica rappresenta una sfida terapeutica per l’endocrinologo in quanto spesso non è responsiva alla terapia medica sintomatica, in particolare al diazossido utilizzato in monoterapia o associato agli analoghi della somatostatina. Everolimus ha un ruolo nel trattamento delle crisi ipoglicemiche refrattarie da insulinoma maligno sia per l’azione di inibizione del rilascio di insulina che di insulino-resistenza. La chirurgia con approccio curativo dell’insulinoma maligno è raramente perseguibile a causa della diffusione metastatica, mentre la chirurgia a scopo di debulking può essere presa in considerazione in casi selezionati sia per il controllo sintomatico sia perché può aumentare l’efficacia delle terapie sistemiche o locoregionali. La terapia radiometabolica con analoghi caldi della somatostatina rappresenta un’opzione terapeutica nei pazienti con tumori a elevata espressione dei recettori della somatostatina sia per il controllo della sintomatologia che della crescita tumorale, sebbene l’esperienza negli insulinomi maligni sia piuttosto scarsa. Data la rarità della malattia, sono disponibili in letteratura solo descrizioni di singoli casi o studi condotti su casistiche limitate; pertanto, è difficile stabilire la sequenza terapeutica più efficace in questi casi. Recentemente è stato condotto uno studio multicentrico italiano, in 13 centri di riferimento, focalizzato sulle caratteristiche clinico-patologiche, sulle modalità di trattamento e sui fattori prognostici che condizionano decorso ed esito dell’insulinoma maligno allo scopo di individuare una strategia terapeutica mirata basata su criteri razionali ed evidenze cliniche. In questa rassegna verranno descritti i principali risultati dello studio che comprende una casistica tra le più ampie finora pubblicate.

SommarioI farmaci agonisti del recettore del Glucagon-like peptide 1 (GLP1) sono ormai da diversi anni protagonisti nella gestione terapeutica del paziente affetto da diabete mellito tipo 2. Oltre alla significativa efficacia sull’omeostasi glicemica, alcuni membri di questa categoria di farmaci trovano inoltre indicazione nel trattamento dell’obesità. Ultimamente, le evidenze in letteratura hanno infine suggerito un ruolo protettivo sulla salute cardiovascolare, tanto che le più recenti linee guida italiane e internazionali promuovono il loro impiego nei soggetti diabetici ad alto rischio. Il possibile ruolo dei farmaci agonisti del GLP1R (GLP1RAs) sui meccanismi alla base dell’infiammazione cronica e la pressoché ubiquitaria distribuzione dei recettori per il GLP1 potrebbero, in realtà, spiegare l’enorme versatilità di questi farmaci.

SommarioLe neoplasie neuroendocrine (NEN) sono un gruppo eterogeneo di tumori, a insorgenza sporadica o ereditaria nel contesto di sindromi neoplastiche genetiche. Gli analoghi della somatostatina (SSA) sono considerati il trattamento di prima linea per le forme ben differenziate, non resecabili chirurgicamente o metastatiche. In letteratura esistono pochissimi studi dedicati al trattamento con SSA nelle NEN ereditarie e la maggior parte dei dati deriva da casistiche miste con prevalenza di forme sporadiche e da piccole serie o casi clinici. La maggior parte dei dati riguardano i tumori neuroendocrini pancreatici associati a sindrome neoplastica multiendocrina di tipo 1 (MEN1). Questi tumori sembrano essere particolarmente sensibili agli SSA, data l’elevatissima espressione dei recettori somatostatinergici e lo stadio tumorale localizzato nella maggior parte dei casi. Alcuni studi su casistiche dedicate sembrano suggerire un utilizzo precoce degli SSA nella MEN1 come agenti anti-tumorali e anti-secretori.

The biological complexity of NGF action is achieved by binding two distinct Neurotrophin receptors, TrkA and p75NTR. While several reports have provided lines of evidence on the interaction between TrkA and p75NTR at the plasma membrane, much fewer data are available on the consequence of such an interaction in terms of intracellular signaling. In this study, we have focused on how p75NTR may affect TrkA downstream signaling with respect to neuronal differentiation. Here, we have shown that cooperation between p75NTR and TrkA results in an increased NGF-mediated TrkA autophosphorylation, leads to a sustained activation of ERK1/2 and accelerates neurite outgrowth. Interestingly, neurite outgrowth is concomitant with a selective enhancement of the AP-1 activity and the transcriptional activation of genes such as GAP-43 and p21(CIP/WAF), known to be involved in the differentiation process. Collectively, our results unveil a functional link between the specific expression profile of neurotrophin receptors in neuronal cells and the NGF-mediated regulation of the differentiation process possibly through a persistent ERKs activation and the selective control of the AP-1 activity. In our studies we discuss the functional role of the neurotrophin receptor p75NTR and TrkA in a ligand-dependent signal transduction. It is known that p75NTR is also involved in the mediation of cell death ligand dependent. Here we show for the first time that the membrane receptor p75NTR, upon binding to b- Amyloid (Ab) peptide, is able to transduce a cytotoxic signal through a mechanism very similar to the one adopted by Tumor Necrosis Factor Receptor 1 (TNFR1), when activated by TNFa. We define that in neuroblastoma cell line Ab cytotoxicity signals through a pathway depending on p75NTR death domain (DD), mostly through some specific conserved residues. We identified that TRADD is the first interactor recruiting to the membrane and activates JNK and NF-kB transcription factors. Since Ab is defined as the most important aetiologic element associated with the Alzheimer’s Disease (AD), characterization of the mechanism involved in the mediation of the neurodegeneration can suggest also new therapeutic approaches.

The biological complexity of NGF action is achieved by binding two distinct Neurotrophin receptors, TrkA and p75NTR. While several reports have provided lines of evidence on the interaction between TrkA and p75NTR at the plasma membrane, much fewer data are available on the consequence of such an interaction in terms of intracellular signaling. In this study, we have focused on how p75NTR may affect TrkA downstream signaling with respect to neuronal differentiation. Here, we have shown that cooperation between p75NTR and TrkA results in an increased NGF-mediated TrkA autophosphorylation, leads to a sustained activation of ERK1/2 and accelerates neurite outgrowth. Interestingly, neurite outgrowth is concomitant with a selective enhancement of the AP-1 activity and the transcriptional activation of genes such as GAP-43 and p21(CIP/WAF), known to be involved in the differentiation process. Collectively, our results unveil a functional link between the specific expression profile of neurotrophin receptors in neuronal cells and the NGF-mediated regulation of the differentiation process possibly through a persistent ERKs activation and the selective control of the AP-1 activity. In our studies we discuss the functional role of the neurotrophin receptor p75NTR and TrkA in a ligand-dependent signal transduction. It is known that p75NTR is also involved in the mediation of cell death ligand dependent. Here we show for the first time that the membrane receptor p75NTR, upon binding to b- Amyloid (Ab) peptide, is able to transduce a cytotoxic signal through a mechanism very similar to the one adopted by Tumor Necrosis Factor Receptor 1 (TNFR1), when activated by TNFa. We define that in neuroblastoma cell line Ab cytotoxicity signals through a pathway depending on p75NTR death domain (DD), mostly through some specific conserved residues. We identified that TRADD is the first interactor recruiting to the membrane and activates JNK and NF-kB transcription factors. Since Ab is defined as the most important aetiologic element associated with the Alzheimer’s Disease (AD), characterization of the mechanism involved in the mediation of the neurodegeneration can suggest also new therapeutic approaches.

2006/2007
La tesi illustra il lavoro di dottorato mirato allo sviluppo di nuovi antagonisti adenosinici attivi nei confronti dei vari sottotipi recettoriali del ligando naturale Adenosina.
XX Ciclo
1977

S1P is a bioactive metabolite of Sphingomyelin implicated in many biological processes, including growth and proliferation. This molecule can function intracellularly, as a second messenger, or extracellularly, activating S1P receptors present on the cell surface. Skeletal muscle express all the enzymes that compose the Sphingomyelin pathway, that create sphingolipids as demonstrated by the high levels in the T tubular system of Sphyngomyielin and Sphingosine (Sph, precursor of S1P) and by a great activity of sphingomyelinase, that catalyses the first step in the pathway. The sphingolipid derivates are also present at high concentration on blood, and thus skeletal muscle is steadily controlled by these factors. The first part of this research aimed to study the expression and the localization of S1P receptors in rat skeletal muscle. RT-PCR and Western Blot analyses demonstrated the expression of S1P1 and S1P3 receptors in adult soleus muscle. Immunofluorescence revealed that both S1P1 and S1P3 receptors are localized at the cell membrane of muscle fibers and in the T-tubule membranes, but only S1P1 receptor is present at higher expression at the neuromuscular junction. Both the receptors have been found also to decorate the nuclear membrane and to be expressed in the satellite cells. As the presence of S1P1 and S1P3 on skeletal muscle seemed to suggest a possible physiological action of S1P, thus the second part of the research aimed to investigate the possibility that S1P acts as trophic factor. It was studied the action of S1P and Sph by means of the model of atrophy induced by the denervation and the model of in vivo regeneration. During soleus muscle denervation, S1P was continuously delivered through a mini osmotic pump. S1P and Sph, significantly attenuated the progress of denervation-induced muscle atrophy. In other experiments the trophic effect of Sph was prevented by N, N-dimethylsphingosine, an inhibitor of Sph kinase, the enzyme that phosphorylates Sph to S1P, implying that Sph acts by previous transformation in S1P. Neutralization of circulating S1P by a specific antibody, worsen the atrophy, corroborating the trophic effect of S1P during denervation. It has also been demonstrated that S1P and Sph incremented the Myogenin and MyoD expression, and this transcriptional factors, as supposed by others, contrasted the atrophy progression. S1P and Sph also attenuated the slow-to-fast MyHC transformation due to inactivity. Denervation of rat soleus muscle, analyzed 7 and 14 days after motor nerve cut, produced the down regulation of S1P1 and S1P3 receptors, while treatment with S1P and Sph had no effect on their expression. The presence of S1P1 and S1P3 on satellite cells, probably implies function of S1P during regeneration. First, it was studied the time course expression of both receptors during regeneration of rat soleus muscle, induced by bupivacaine. During the first week of regeneration S1P1 expression, initially low, gradually increased, while S1P3, initially high, gradually decreased. These data suggest that S1P1 and S1P3 have distinct roles during regeneration. The direct injection into the regenerating muscle of S1P and Sph determinated an increase in the growth rate of regenerating fibers. In fact, in the presence of S1P and Sph, the mean cross sectional area of the 3-days regenerating fibers was significantly higher compared to the controlateral not injected regenerating muscle. The treatments also increased Akt phosphorylation level, suggesting an augment in the protein synthesis. In conclusion, the results indicate that S1P plays a significant role in the trophism and development of muscle fiber.

In Europa, la sopravvivenza a 5 anni dei pazienti affetti da leucemia mieloide acuta (LMA) è solo del 20%. La duplicazione interna in tandem del gene FLT3 (FLT3-ITD), che codifica per il recettore della tirosina chinasi FLT3, è la mutazione più frequente (~ 25%) nella LMA con cariotipo normale, dove porta all'attivazione costitutiva della chinasi FLT3. Nonostante risultati iniziali molto promettenti con inibitori di FLT3 (FLT3i) nei pazienti con questa mutazione, pochi pazienti hanno remissioni prolungate, evidenziando la necessità di nuove e più efficaci terapie. La persistenza delle cellule staminali leucemiche guida la leucemogenesi della LMA ed è responsabile della resistenza ai farmaci e della ricaduta dopo chemioterapia convenzionale. L'attivazione costitutiva di FLT3 porta all’attivazione del signaling a valle, e in particolare della via PI3K/AKT/mTOR, una cascata di segnale fortemente associata alla sopravvivenza delle cellule staminali leucemiche e al crosstalk tra le cellule staminali leucemiche e le cellule stromali associate al microambiente tumorale midollare. La nicchia midollare fornisce protezione alle cellule leucemiche FLT3-ITD nei confronti degli inibitori FLT3. Pertanto, la via PI3K/AKT/mTOR può rappresentare un bersaglio terapeutico nella AML FLT3-ITD. Questo studio mira a verificare l'ipotesi che l'inibizione di PI3K/AKT/mTOR sensibilizzi le cellule AML FLT3-ITD alla terapia mirata con RTKi utilizzando linee cellulari AML umane e blasti di pazienti primari. In particolare, ho definito il profilo fenotipico delle linee cellulari FLT3-ITD rispetto a quelle FLT3 wildtype dopo trattamento con un pannello di FLT3i o PI3K/AKT/mTORi che non hanno dimostrato sufficiente efficacia clinica se utilizzato come monoterapia. Successivamente, ho valutato l’effetto del farmaco sulla crescita cellulare e sul ciclo cellulare e l'apoptosi. I risultati ottenuti dimostrano che BAY-806946 (pan PI3Ki) e PF-04691502 (inibitore duale PI3K/mTORi) sono in grado di inibire la crescita poiché causano arresto del ciclo cellular in fase G1 e apoptosi, un effetto che appare indipendente dallo stato mutazionale di FLT3. Dimostrano inoltre che l’arresto della crescita cellulare indotto dall’inibitore di FLT3 (FLT3i) quizartinib è causato principalmente dall’induzione di apoptosi. Tuttavia l’efficacia rimane inferiore rispetto al trattamento con chemioterpia convenzionale (AraC). Inoltre, la proof of concept per l’utilizzo della combinazione del quizartinib con BAY-806946 è stata ottenuta in linee cellulari AML FLT3-ITD e blasti primari da paziente. Nel valutare i blasti primari da paziente, è stato considerato il ruolo protettivo delle cellule stromali mesenchimali in co-coltura, e dei fattori di crescita per riprodurre le condizioni del microambiente midollare. Pertanto, blasti primari da paziente LAM sono stati mantenuti in co-coltura con cellule stromali MS5 in presenza di concentrazioni fisiologiche di fattori di crescita quali IL-3, TPO e GM-CSF. Come atteso, il BAY-806946 potenzia l’effetto citostatico e citotossico del quizartinib nelle cellule MOLM-13 e nei blasti primari da paziente con mutazione FLT3-ITD in condizione di co-coltura. E’ importante sottolineare l’incremento di apoptosi osservato anche nella sottopopolazione staminale leucemica CD34+CD38-. Infine, ho valutato il profilo delle citochine e delle fosfoproteine persistenti come bersagli putativi dopo il trattamento di combinazione. Complessivamente, questo studio dimostra il potenziale di PI3Ki per migliorare l'efficacia di RTKi quizartinib nel trattamento della LMA FLT3-ITD.
Acute myeloid leukemia (AML) has a very poor 5-year survival of ~20% in Europe. The internal tandem duplication (ITD) mutation of the Fms-like receptor tyrosine kinase 3 (FLT3) (FLT3-ITD) is the most frequent mutation (~25%) in normal karyotype AML. In recent clinical studies, few patients display prolonged remissions with receptor tyrosine kinase (RTK) inhibitors, such as FLT3 inhibitors (FLT3i) therapy, highlighting a substantial unmet need for novel effective treatment. Persistence of leukemia stem cells (LSC) drive AML leukemogenesis, responsible for drug resistance and disease relapse following conventional chemotherapy. Growing evidence recognizes that FLT3-ITD mutation leads to the constitutive activation of FLT3 kinase and its downstream pathways, including PI3K/AKT/mTOR signaling, strongly associated with LSC survival and crosstalk between LSC and stromal cells associated bone marrow (BM) tumor environment (TME). The TME provides protection of FLT3-ITD AML cells against FLT3 inhibitors. Thus, the PI3K/AKT/mTOR pathway may represent as a putative target for FLT3-ITD AML. This study aims to test the hypothesis that PI3K/AKT/mTOR inhibition could sensitize FLT3-ITD AML cells to RTKi-lead targeted therapy using human AML cell lines and primary patient blasts. First, I uncover the phenotypic profile of FLT3-ITD versus FLT3 wildtype cell lines following treatment with selected FLT3i or PI3K/AKT/mTORi that have failed treatment of AML as monotherapy in clinical studies. More specifically, I determine the drug efficacy by means of cell growth measurement and assessment of cell cycle status and apoptosis. I was able to demonstrate that BAY-806946 (pan PI3Ki) and PF-04691502 (dual PI3K/mTORi) exerted growth inhibitory activity caused by G1 cell cycle arrest and apoptosis, and this effect was irrespective of FLT3 status. Quizartinib (FLT3i) selectively inhibited cell growth in FLT3-ITD AML and this effect was mainly caused by apoptosis. The observed drug-induced apoptotic effect was however not as efficient as chemotherapy. Next, I provide proof-of-concept for the combination of quizartinib and BAY-806946 using both FLT3-ITD AML cell lines and primary patient blasts. When evaluating on primary patient blasts, I take into consideration the protective role of mesenchymal stromal cells and physiological growth factors to mimic the BM microenvironment. Hereby, I co-cultured FLT3-ITD AML blasts with stromal cell line MS-5 and added growth factors essential for AML survival and differentiation such as IL-3, TPO and G-CSF at physiological concentration. As expected, treatment with BAY-806946 enhanced both cytostatic and cytotoxic effect of quizartinib in FLT3-ITD AML cell line MOLM-13 as well as primary patient blasts in co-culture. More importantly, enhanced apoptosis was measured in the stem cell like CD34+CD38- population. Lastly, I elucidate the cytokine profile and persistent phosphoproteins as putative targets following combination treatment. Ultimately, this study demonstrates the potential of PI3K/AKT/mTORi to enhance the efficacy of RTKi quizartinib for the treatment of FLT3-ITD AML.

Utilizzando il modello tumorale transgenico BALB-NeuT abbiamo analizzato la specifica interferenza, indotta dalla vaccinazione, della carcinogenesi causata in questo modello animale dal prodotto dell’oncogene neu. È stata confrontata l’inibizione della formazione di masse tumorali in seguito alla vaccinazione con neu di ratto normale (ErbB2/Neu) o con i recettori ErbB xenogenici umani (LTR-EGFR, LTR-ErbB2, LTR-ErbB3, LTR-ErbB4), espressi singolarmente in cellule murine NIH3T3, o in seguito alla vaccinazione con poxvirus ricombinante, Vaccinia virus (rV-neu). La vaccinazione precoce, allo stadio di iperplasia atipica con LTR-Neu, inibisce in maniera drastica la carcinogenesi mammaria mediata da neu e inoltre, la vaccinazione con cellule esprimenti i recettori ErbB umani interferisce, significativamente in tutti i casi, con lo sviluppo del tumore nei topi BALB-NeuT. L’aumento relativo nella sopravvivenza libera da tumore e la riduzione dell’incidenza dei tumori corrisponde alla conservazione strutturale condivisa tra i recettori umani e l’oncogene neu, infatti l’immunizzazione con cellule trasfettate con LTR-Neu è quella che ha mostrato la maggiore efficacia antitumorale seguita da LTR-ErbB2 e dagli altri tre recettori ErbB umani. Le vaccinazioni hanno dimostrato di indurre un alto, specifico e comparabile titolo anticorpale e gli effetti antitumorali indotti da questi anticorpi correlano con la cross reattività verso il dominio extracellulare, purificato in vitro, della proteina Neu. Inoltre una specifica risposta T cellulare verso epitopi del Neu di ratto, rilevabile per la reattività di queste cellule alla stimolazione con peptidi specifici, è stata anche stimolata nelle cellule di milza dei topi immunizzati con LTR-Neu e, in misura minore, nelle cellule dei topi immunizzati con LTR-ErbB2 e LTR-EGFR. L’inibizione tumorale più pronunciata in seguito alla vaccinazione con LTR-Neu è stata associata con l’infiltrato leucocitario e la necrosi tumorale in vivo, mentre i sieri immuni specificamente inducono citotossicità cellulo mediata dipendente dagli anticorpi e apoptosi delle cellule tumorali mammarie dei topi BALB-NeuT in vitro. Inoltre, valutando l’efficacia di un vaccino che usa come veicolo il virus vaccinico ricombinante per Neu, si è rilevata la capacità anche di questa immunizzazione di contrastare efficacemente la crescita dei tumori nei topi transgenici con un effetto più marcato per inoculi multipli. L’inibizione risultante è comparabile alla vaccinazione allogenica quando le somministrazioni sono effettuate agli stadi più precoci di sviluppo del tumore mentre induce una protezione superiore ad essa quando l’immunizzazione con il virus ricombinante è eseguita a partire da uno stadio tardivo di sviluppo della malattia.
Employing the transgenic animal model BALB-NeuT, the outcome of neu-mediated tumorigenesis was compared following vaccination with isogenic normal rat ErbB2/Neu (LTR-Neu) or xenogeneic human ErbB receptors (LTR-EGFR, LTR-ErbB2, LTR-ErbB3 and LTR-ErbB4), both recombinantly expressed in an NIH3T3 murine cell background, or following vaccination with neu-recombinant Vaccinia virus (rV-neu). Vaccination using rat LTR-Neu at the stage of atypical hyperplasia potently inhibited neu-mediated mammary tumorigenesis. Moreover, all human ErbB receptors specifically interfered with tumor development in BALB-NeuT mice. Relative increase in tumor-free survival and reduction in tumor incidence corresponded to structural similarity shared with the etiologic neu oncogene. The rat orthologue LTR-Neu proved most effective followed by the human homologue LTR-ErbB2 and then the other three human ErbB receptors. Vaccination resulted in high titer of specific serum antibodies whose tumor-inhibitory effects correlated with cross-reactivity to purified rat Neu extracellular domain in vitro. Furthermore, a T cell response specific for peptide epitopes of rat Neu was elicited in spleen cells of mice immunized with LTR-Neu and was remotely detectable for discrete peptides upon vaccination with LTR-ErbB2 and LTR-EGFR. The most pronounced tumor inhibition by LTR-Neu vaccination was associated with leukocyte infiltrate and tumor necrosis in vivo, while immune sera specifically induced cytotoxicity and apoptosis of BALB-NeuT tumor cells in vitro. Moreover, the multiple vaccination employing the neu-recombinant virus also resulted in a specific inhibition of neu-mediated tumorigenesis. The resulting inhibition was comparable with the allogeneic immunization schedule when started early in tumor development but gave higher protection when the vaccination was started later in tumor onset.

The α6β2∗ neuronal nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) subtype expressed in the dopaminergic mesostriatal pathway mediates many behavioural effects of nicotine, and is selectively blocked by the small disulfide-rich α-conotoxins PIA and MII. Both share a "ω-shaped" topology but PIA bears a tail in the N-terminal region containing three amino acids [arginine (R), aspartic acid (D), and proline (P)]. We synthesised a group of PIA-related peptides in which R1 was mutated or the RDP motif was gradually removed. Binding and functional studies showed that the RDP sequence is essential for the activity of PIA on the native rat α6β2* subtype, with a major role played by residue R1. Molecular modelling studies showed that recognition of PIA by α6β2* nAChRs depends on a salt bridge between the guanidine group of R1 and the highly negatively charged D166-D167 residues located on the β2 subunit. The RDP sequence was then added to the N-terminus of MII; the resulting hybrid peptide (RDP-MII) showed an increased potency (5-fold) and affinity (13-fold) for α6β2* but not for α3β2* nAChRs. Furthermore, as docking studies indicated E11 as a potential key residue engendering a α6β2* vs. α3β2* selectivity, we prepared and tested the following E11 mutated MII analogues: MII[E11R] and RDP-MII[E11R]. The binding and functional profiles of the new peptides at native rat α6β2* receptor were comparable with those of their leads while potency and affinity for native and heterologously expressed α3β2* nAChRs were reduced. Consequently, MII[E11R] and RDP-MII[E11R] are potent and α6β2* vs. α3β2* selective antagonists.

Quando le condizioni sono sfavorevoli alla crescita, membri dei generi Bacillus e Clostridia (incluso Clostridium botulinum, l’agente eziologico del botulismo) formano endospore, forme cellulari estremamente resistenti, metabolicamente dormienti e difficili da distruggere. Tuttavia, le spore attraverso il processo di germinazione, riattivano il ciclo vegetativo non appena le condizioni tornano favorevoli. Questa capacità di “riattivazione” delle spore è causa di “food spoilage” e di intossicazioni alimentari. Considerando che le specie Clostridium botulinum e Clostridium sporogenes sono filogeneticamente correlate, in questo lavoro, il ceppo Clostridium sporogenes UC9000, isolato da latte crudo, è stato utilizzato come modello non-patogeno di Clostridium botulinum per studiare la germinazione. Studi fisiologici hanno rivelato che le spore del ceppo UC9000 germinano in presenza di L-alanina/ L-cisteina in combinazione con L-lattato, mentre un analisi in silico ha permesso di identificare omologhi dei recettori coinvolti nella risposta all’L-alanina in Bacillus. Attraverso l’analisi del genoma sono stati identificati gli enzimi SleB, CwlJ e SleL, responsabili della degradazione del cortex. CwlJ è stato localizzato nel coat della spora grazie ad uno studio di proteomica, è stato espresso in forma solubile in E. coli ed un test di attività in vitro ha evidenziato la sua capacità di indurre la germinazione di spore “decoated”
When environmental conditions are unfavorable to the growth, Bacillus and Clostridium bacteria (including Clostridium botulinum, the causative agent of foodborne botulism) form endospores, metabolically dormant cell types resistant to several adverse conditions and difficult to kill. However, under suitable conditions, spores resume the vegetative life by triggering the germination process. Thus, spores are dangerous agents of human foodborne disease and food spoilage. In this work, the strain Clostridium sporogenes UC9000, isolated from raw milk, was used like not-pathogenic model of Clostridium botulinum to better understand the mechanisms underpinning the Clostridium germination. Clostridium sporogenes is a species phylogenetically related to Clostridium botulinum and often used like its surrogate. Physiological studies revealed that UC9000 spores germinate in presence of L-alanine/L-cysteine in combination with L-lactate, while in silico analyses allowed the identification of homologues of the Bacillus germinant receptors responsive to L-alanine. The genome screening also detected genes coding for SleB, CwlJ and SleL, enzymes participating to the cortex degradation. CwlJ was found resident in the spore coat by performing a proteomic analysis, it was expressed in soluble form in E. coli and an in vitro assay of activity revealed its capability to induce germination when added exogenously to decoated spores

Quando le condizioni sono sfavorevoli alla crescita, membri dei generi Bacillus e Clostridia (incluso Clostridium botulinum, l’agente eziologico del botulismo) formano endospore, forme cellulari estremamente resistenti, metabolicamente dormienti e difficili da distruggere. Tuttavia, le spore attraverso il processo di germinazione, riattivano il ciclo vegetativo non appena le condizioni tornano favorevoli. Questa capacità di “riattivazione” delle spore è causa di “food spoilage” e di intossicazioni alimentari. Considerando che le specie Clostridium botulinum e Clostridium sporogenes sono filogeneticamente correlate, in questo lavoro, il ceppo Clostridium sporogenes UC9000, isolato da latte crudo, è stato utilizzato come modello non-patogeno di Clostridium botulinum per studiare la germinazione. Studi fisiologici hanno rivelato che le spore del ceppo UC9000 germinano in presenza di L-alanina/ L-cisteina in combinazione con L-lattato, mentre un analisi in silico ha permesso di identificare omologhi dei recettori coinvolti nella risposta all’L-alanina in Bacillus. Attraverso l’analisi del genoma sono stati identificati gli enzimi SleB, CwlJ e SleL, responsabili della degradazione del cortex. CwlJ è stato localizzato nel coat della spora grazie ad uno studio di proteomica, è stato espresso in forma solubile in E. coli ed un test di attività in vitro ha evidenziato la sua capacità di indurre la germinazione di spore “decoated”
When environmental conditions are unfavorable to the growth, Bacillus and Clostridium bacteria (including Clostridium botulinum, the causative agent of foodborne botulism) form endospores, metabolically dormant cell types resistant to several adverse conditions and difficult to kill. However, under suitable conditions, spores resume the vegetative life by triggering the germination process. Thus, spores are dangerous agents of human foodborne disease and food spoilage. In this work, the strain Clostridium sporogenes UC9000, isolated from raw milk, was used like not-pathogenic model of Clostridium botulinum to better understand the mechanisms underpinning the Clostridium germination. Clostridium sporogenes is a species phylogenetically related to Clostridium botulinum and often used like its surrogate. Physiological studies revealed that UC9000 spores germinate in presence of L-alanine/L-cysteine in combination with L-lactate, while in silico analyses allowed the identification of homologues of the Bacillus germinant receptors responsive to L-alanine. The genome screening also detected genes coding for SleB, CwlJ and SleL, enzymes participating to the cortex degradation. CwlJ was found resident in the spore coat by performing a proteomic analysis, it was expressed in soluble form in E. coli and an in vitro assay of activity revealed its capability to induce germination when added exogenously to decoated spores