Tesis sobre el tema "Physiopathologie virale"

Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (severe acute respiratory syndrome-related coronavirus, SARS-CoV-2), de la famille Coronaviridae, est responsable de la maladie à coronavirus de 2019 (coronavirus disease 2019, COVID-19). Malgré la disponibilité de vaccins, en cause dans la fin de l’urgence sanitaire de la COVID-19, la circulation virale du SARS-CoV-2 subsiste ainsi que les recherches sur la compréhension de sa physiopathologie, notamment l’implication et le rôle des microARN (miARN) dans cette infection virale. Les miARN sont des petits ARN non codants régulant l’expression des gènes et connus pour leurs implications dans de nombreuses voies de régulation cellulaire. Récemment, ils se sont révélés l’être également dans l’infection par le SARS-CoV-2. Ces recherches permettraient une meilleure connaissance dans ce domaine et pourraient s’avérer utiles dans le développement de nouveaux diagnostics et de traitements cliniques contre cette infection virale ou d’autres infections de la même famille virale. Ainsi, dans ce projet de recherche, nous avons d’abord caractérisé les miARN cellulaires biomarqueurs de l’infection virale par le SARS-CoV-2 à partir de prélèvements nasopharyngés de patients, qui est le prélèvement recommandé pour le diagnostic de cette infection virale. Nos travaux ont identifié en particulier, des miARN associés à des formes sévères de la COVID-19. Ces derniers ciblent des gènes impliqués dans les infections virales et les réponses antivirales et anti-inflammatoires aux infections virales. Ces potentiels effets antiviraux et anti-inflammatoires des miARN sur l’infection virale par le SARS-CoV-2 n’ont pas pu être démontrés in vitro lors de cette étude. Par la suite, on s’est penché sur l’hypothèse de la dérégulation de la biogénèse des miARN par cette infection virale. On a trouvé aucune sous-expression des ARNm des gènes impliqués de la voie de biogénèse des miARN lors de l’infection par le SARS-CoV-2, que ce soit en ex vivo ou en in vitro. Pour finir, nous avons voulu développer un possible traitement clinique contre l’infection virale par le SARS-CoV-2 ou tout autre pathologie par la délivrance de miARN d’intérêt. Il s’agirait de développer des nanoparticules et des nanomatériaux couplés à des miARN ou autres ARN doubles brins messagers ou non, afin de permettre l’entrée de ces derniers au sein des cellules et rétablir ainsi l’expression basale des gènes impliqués dans l’infection virale
Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2 (SARS-CoV-2), a member of the Coronaviridae family, is responsible for coronavirus disease 2019 (COVID-19). Despite the availability of vaccines that helped end the COVID-19 health emergency, the viral circulation of SARS-CoV-2 remains, as well as research on the understanding of its pathophysiology, in particular the involvement and role of microRNAs (miRNAs) in this viral infection. miRNAs are small non-coding RNAs that regulate gene expression and are known to be involved in numerous cellular regulatory pathways. Recently, they have also been shown to be involved in SARS-CoV-2 infection. Such research would provide a better knowledge in this field and could be useful in the development of new diagnoses and clinical treatments against viral infection with SARS-CoV-2 or other infections of the same viral family. Thus, in this research project, we first characterized the cellular miRNA biomarkers of SARS-CoV-2 viral infection from patient nasopharyngeal swabs, which is the first diagnostic tool for this viral infection. In particular, our work has identified miRNAs associated with severe forms of COVID-19. These miRNA target genes involved in viral infections and antiviral and anti-inflammatory responses to viral infections. These potential antiviral and anti-inflammatory effects of miRNAs on SARS-CoV-2 viral infection could not be demonstrated in vitro in this study. Then, the hypothesis of deregulation of miRNA biogenesis by this viral infection was investigated. No under-expression of mRNAs of genes involved in the miRNA biogenesis pathway was found upon infection with SARS-CoV-2, either ex vivo or in vitro. Finally, based on a miRNA of clinical interest, we wanted to develop a possible clinical treatment against viral infection by SARS-CoV-2 or any other pathology through the delivery of miRNAs of interest, in this case antiviral. This would involve developing nanoparticles and nanomaterials coupled to miRNAs or other double-stranded messenger or non-messenger RNAs, to enable the latter to enter cells and thus restore basal expression of the genes involved in viral infection

L'infection de macaques par des lentivirus simiens sivmac reproduit la clinique et la biologie de l'infection humaine par le VIH. La disponibilité de virus attenues, suite à une délétion dans NEF, permet une analyse comparative de la charge virale et de la réponse immune à l'infection dans ces deux types d'infection par sivmac. L'infection par le VIH/SIV s'accompagne d'une atteinte profonde du système immunitaire. Les cytokines sont au centre de la régulation des fonctions immunitaires et de l'expression virale. Deux groupes de macaques ont été inocules par le virus pathogène SIVMAC251 ou le virus attenue SIVMACNEF. L'expression de gènes codant les cytokines a été évaluée dans le sang et dans les ganglions durant la primo-infection des 2 groupes d'animaux. Les animaux infectés par le virus pathogène ont développé une charge virale systémique plus élevée d'environ 2 logs, et une séroconversion en moyenne plus tardive que les singes infectes par le virus attenue. Une augmentation de l'expression des gènes codant l'IFN OU L'IL-13 est mise en évidence dans le sang et les ganglions des deux groupes d'animaux durant le premier mois P. I. . Une induction du gène codant l'IL-2 n'est mesurée que dans les CMSP et les CMGLP des animaux infectés par le virus attenue. En effet, les niveaux des ARNM codant l'IL-2 restent indétectables ou faiblement détectables dans le sang et les ganglions des animaux infectés par le virus pathogène. En revanche, alors que le niveau d'expression du gène codant l'IL-4 reste indétectable chez les animaux infectes par le virus attenue, une surexpression de ce gène est mesurée dans les ganglions des animaux infectes par le virus pathogène. Ces résultats montrent que la primo-infection par un virus pathogène ou un virus attenue s'accompagne de profils cytokiniques différents, qui ne correspondent ni à une réponse de type 1 ni de type 2. La production d'IL-4 durant la primo-infection par le virus pathogène pourrait favoriser la réplication virale, comme le suggère la réplication préférentielle du VIH dans les clones TH2 produisant de l'IL-4. Par ailleurs, la production d'IL-2 restreinte aux macaques infectés par le virus delete dans NEF, suggère que nef puisse interagir avec la voie de transcription de l'IL-2 in vivo, comme cela a été démontré in vitro.

Etude des determinants antigeniques de l'hemagglutinine (h), de la nucleoproteine (np) et de la proteine fusion (f) du virus de la rougeole. Le potentiel immunogene de ces differentes proteines virales a ete estime. Il apparait que les proteines h et f procurent une protection des souris contre une encephalite rougeoleuse. Toutefois l'efficacite de la protection depend du systeme d'histocompatibilite des animaux. De plus, il semble necessaire d'etudier les epitopes impliques soit dans une immunite humorale (epitope b), soit dans une immunite cellulaire (epitope t) afin de pouvoir realiser des vaccins susceptibles de procurer une immunite efficace

La proteine tat du virus vih-1 est un trans-activateur puissant permettant la surexpression de tous les genes viraux, par l'intermediaire de sa cible arn, tar, situee dans le ltr 3' du virus. L'objectif premier de ce travail a ete de purifier la proteine tat sous forme native correctement repliee afin de tester son activite biologique. Differents systemes d'expression et schemas de purification ont ete etudies, dans lesquels l'usage d'agents denaturants a ete proscrit, car la renaturation d'une telle proteine genere le plus souvent un melange en partie inactif. Le gene tat a ete clone et exprime chez e. Coli, seul ou en fusion avec les genes de la glutathione s-transferase (gst) ou de la beta-galactosidase. Seule la fraction de proteine tat soluble, non agregee est utilisee dans les procedures de purification. Par rapport a tat, les niveaux d'expression et de solubilite de la fusion gst-tat sont significativement ameliores (7-8% des proteines totales, dont 80% solubles). Toutefois, l'utilisation de la beta-galactosidase en tant qu'etiquette de purification par affinite s'est averee plus efficace et specifique que la gst. La mise au point de la chromatographie d'immunoaffinite a finalement permis d'isoler tat, non fusionnee ou issue du clivage de la fusion beta-gal-tat par la thrombine, a plus de 90% de purete. Les differents echantillons de tat ont ete testees in vitro pour determiner leur capacite, d'une part a interagir avec tar, et d'autre part a trans-activer l'expression du gene rapporteur cat dans des cellules hela en culture. Les differentes voies de production de tat ne sont pas strictement equivalentes en terme d'activite biologique. Toutes les formes presentent une certaine activite trans-activatrice mais les resultats les plus coherents entre les deux tests sont obtenus avec la proteine non fusionnee. Ceci indique que le repliement de tat, implique dans son activite biologique, est probablement modifie par son partenaire de fusion. Des etudes preliminaires montrent par ailleurs que la proteine tat purifiee exogene est capable d'activer des cellules endotheliales, en provoquant leur adhesion a une lignee de macrophages en synergie avec le tnf-alpha. Tat pourrait ainsi jouer un role indirect dans l'inflammation et eventuellement dans la dissemination des tumeurs, associees a l'infection par le virus

Des lymphocytes T activés infiltrent en permanence le SNC (Système Nerveux Central) mais sont rapidement éliminés par apoptose. La persistance de lymphocytes T activés dans le SNC pourrait être impliquées dans le développement de maladies inflammatoires du SNC, telles que la SEP (Sclérose En Plaques) et la TSP/HAM (myélopathie associée au virus HTLV-I), caractérisées par une infiltration du SNC par des lymphocytes T activés, une destruction de la myéline et une perte anoxale. Les lymphocytes T activés sont suspectés induire la mort des oligodendrocytes et des précurseurs d'oligodendrocytes impliqués dans la remyélinisation du SNC. Un des mécanisme suspectés est un effet "bystander" non MHC-restreint, via la libération de facteurs toxiques (FasL, TNF", NO. . . ) par les lymphocytes T activés. L'implication du récepteur de mort, Fas, et son ligand, FasL, est suspectée. Mais les mécanismes d'activation de Fas et les voies de signalisation mises en jeu ne sont par encore élucidés. Notre but a été de mettre en évidence que des lymphocytes T activés peuvent induire la mort de précurseurs du SNC par l'activation de Fas, et d'analyser les voies de signalisation mises en jeu. Nous avons établi un modèle d'inflammation du SNC mimant les interactions entre des lymphocytes T activés, soit par PMA-ionomycine, soit par une infection virale, et des cellules du SNC. Seuls, des lymphocytes T activés par une infection virale peuvent induire la mort de précurseurs du SNC. Cette mort par apoptose implique l'activation de Fas, mais est indépendante de FasL. Elle est caspasesdépendante et met en jeu la mitochondrie. D'autre part, les lymphocytes T activés par une infection virale sont responsables de l'acquisition de la susceptibilité à la mort, en induisant l'exposition de Fas à la surface des précurseurs du SNC. Cette susceptibilité à la mort est régulée par les métalloprotéases et leurs inhibiteurs endogènes. Ces résultats supportent l'hypothèse que la mort de précurseurs d'oligodendrocytes, induite par des lymphocytes T activés infiltrant le SNC de patients développant la SEP ou la TSP/HAM, pourrait contribuer à la démyélinisation et à l'incapacité de remyélinisation observée chez les patients.

Le virus Lassa entraine une fièvre hémorragique endémique en Afrique de l’Ouest et représente un problème de santé publique. Les connaissances sur la pathogénèse et les réponses immunitaires associées à la maladie sont partielles. Nous avons suivi les paramètres pathologiques, virologiques et immunologiques associés aux infections létales et non létales du LASV chez le singe cynomolgus. Le tableau clinique a été caractérisé par une dépression, une anorexie, une perte de poids et une asthénie chez les animaux survivants, tandis que ces mêmes symptômes ont été accompagnés de fièvre, de difficultés respiratoires et d’épistaxis chez les animaux infectés par une dose létale. Seuls ces derniers ont montré une perturbation des paramètres de coagulation, une rhabdomyolyse et une hausse des marqueurs de lésions rénales. Nous avons observé un tropisme radicalement différent en fonction de la sévérité de la maladie, avec une dissémination virale dans les organes plus importante et plus rapide chez les animaux décédés, la présence de particules infectieuses plus nombreuses et des modifications anatomopathologiques plus sévères. Une réponse immunitaire innée et adaptative précoce et puissante a été associée avec le contrôle de l’infection et la survie tandis que les infections fatales ont été caractérisées par une réponse inflammatoire ressemblant au choc septique, une défaillance de la réponse immunitaire ainsi qu’une réplication virale incontrôlée. Cette étude permet d’améliorer nos connaissances de la pathogénèse de la fièvre de Lassa et d’apporter des marqueurs d’infection prédictifs de la maladie
Lassa virus causes a hemorrhagic fever endemic in West Africa and represents a threat for civilians. The pathogenesis and the immune responses associated with the disease are poorly understood. We followed pathological, virological and immunological parameters associated with fatal and non-fatal Lassa virus infection in the cynomolgus monkey. The clinical picture was characterized by depression, anorexia, weight loss and asthenia in survivors whereas the same symptoms were supported by fever, respiratory difficulties and epistaxis in animals infected with the lethal dose. Only fatalities have shown coagulation parameters dysfunction, rhabdomyolysis and an increase of renal function markers. We observed a different viral tropism in a function of the disease severity, with viral dissemination in organs that was more important and faster in fatalities, the appearance of numerous infectious particles number and more severe pathologic changes. Early and robust innate and adaptive immune response has been associated with the control of infection and recovery whereas fatal infections were characterized by a sepsis like inflammatory response, defective immune response as well as uncontrolled viral replication. This study sheds light on the pathogenesis of Lassa fever and reveals infection markers predictive of the disease outcome

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est parmi les principales causes de mortalité dans le monde et les traitements disponibles sont insuffisants. Ceci est dû à la connaissance limitée de la complexité biologique et du microenvironnement hépatiques en situation normale et pathologique. Pour répondre à ces besoins, nous avons développé un protocole de séquençage d’ARN sur cellule unique (scRNA-seq) à partir de tissus primaires de foie humain. Nous avons assemblé un atlas de cellules du foie humain et comparé le profil scRNA-seq du foie normal au profil du CHC. L’atlas a révélé l’hétérogénéité au sein des principales populations de cellules hépatiques, la zonation transcriptomique des cellules endothéliales et l'existence de progéniteurs épithéliaux dans le foie adulte capable de se différencier à la fois en cholangiocytes et en hépatocytes. L'analyse par scRNA-seq du CHC a dévoilé l'hétérogénéité marquée de cette tumeur, les modifications de son microenvironnement cellule par cellule et les interactions entre les cellules tumorales et le virus de l’hépatite B en découvrant des voies et des facteurs moteurs de la cancérogenèse hépatique jusque-là inconnus
Hepatocellular carcinoma (HCC) is a leading cause of death worldwide and the current treatments are unsatisfactory. One reason is the limited knowledge on the complexity and microenvironment of healthy and diseased liver. To address this gap, we have developed a single cell RNA sequencing (scRNA-seq) pipeline for primary human liver tissues. We have assembled an atlas of human liver cells and compared the scRNA-seq profile of normal liver and HCC. The atlas revealed an unknown heterogeneity within the main populations of liver cells, the transcriptomic zonation of endothelial cells and the existence of an epithelial progenitor in the adult liver capable of differentiating into both cholangiocytes and hepatocytes. ScRNA-seq analysis uncovered the marked cell heterogeneity of HCC, its microenvironment changes at single-cell level and the interactions between tumor cells and hepatitis B virus discovering previously unknown pathways and drivers of hepatocarcinogenesis

Les @entérovirus (Picornaviridae) sont des agents infectieux communs divisés en 5 espèces (Poliovirus et Entérovirus humains A à D) qui regroupent actuellement 89 sérotypes. Ces virus à ARN positif simple brin, sont responsables de syndromes infectieux variés incluant des infections des voies respiratoires hautes ou basses chez l'adulte ou l’enfant. Actuellement l’importance épidémiologique, les caractéristiques cliniques ainsi que les mécanismes physiopathologiques des infections respiratoires par les entérovirus restent à préciser. La première partie de notre travail a eu pour objectif d’évaluer le rôle étiologique potentiel des picornavirus à tropisme respiratoire chez 192 enfants âgés de moins de 36 mois et hospitalisés pour bronchiolite. Un agent viral a été identifié chez 138 (72. 5%) des 192 enfants étudiés. Les virus les plus fréquemment détectés étaient respectivement le Virus Respiratoire Syncytial (VRS) (30%), les Rhinovirus (RVH) (21%), les entérovirus (EV) (9%), et les Métapneumovirus humains (MPVh) (4%). Les RVH et les EV sont apparus comme étant la seule cause de l'infection virale de l’arbre respiratoire dans 57 (30%) des 192 jeunes enfants, tandis qu’une co-infection avec du RVH ou du EV a été détectée dans 25 (13%) des 192 jeunes enfants (30 vs. 13%, P<10-3). Ces données suggèrent que les picornavirus (RVH et EV) à tropisme respiratoire seraient l'une des principales causes virales de bronchiolite en France. Dans une seconde étude, nous avons analysé 252 cas d’infections pédiatriques à EV diagnostiqués chez 11509 enfants. Les souches d’EV ont été isolées dans des échantillons naso-pharyngés grâce à la culture virale, et identifiées par séroneutralisation. Les syndromes respiratoires (79 (31%) des 252 infections à EV) associés à une infection par un EV sont apparus comme étant la deuxième plus fréquente pathologie pédiatrique après la méningite (111 (44%) des 252 cas) (44 vs 31%, p <10-3). Les EVs ont contribué aux infections respiratoires bases dans 54 % des 79 cas d’infection à EV. La bronchiolite a été la pathologie la plus souvent diagnostiquée dans les infections respiratoires à EV (34 (43%) des 79 cas, p <10-3), survenant le plus souvent chez les enfants âgés de 1-12 mois (P = 0. 0002). Les echovirus 11, 6 et 13 ont été les souches les plus fréquemment identifiées dans les infections respiratoires (24, 13 et 11%, respectivement). L’analyse phylogénétique du gène codant pour la protéine de capside VP1 a révélé la circulation concomitante ou successive de souches distinctes EV à tropisme respiratoire au cours du même mois ou de la période épidémique. Ces résultats indiquent que les infections des voies respiratoires représentent 30% des cas des infections pédiatriques à entérovirus. De plus, la circulation concomitante ou successives de souches génétiquement distinctes d’EV indique la possibilité d’infections respiratoires répétées au sein de la même saison épidémique, et suggère la possibilité de mécanismes de recombinaison génétique entre des souches d’EV d’espèces A ou B. Afin d’identifier les mécanismes qui peuvent réguler le développement de l’inflammation des muqueuses respiratoires au cours de l’infection des voies aériennes basses par les EVs, nous avons étudié les profils et les niveaux de production de « CC et CXC chimiokines » de cellules épithéliales pulmonaires humaines primaires (SAEC), infectées par deux souches sauvages d’EV à tropisme respiratoire. L’exposition des SAEC à l'interféron gamma (INF-γ) et aux virus sauvages de type Coxsackie B5 ou ECHO 30 induit une augmentation significative de la production de RANTES qui est synergique par rapport celle obtenue par l’infection virale ou par l’INF-γ seul. Nous avons observé que l'infection réplicative des entérovirus dans les SAEC induisait une augmentation dose et temps-dépendante des ARNm, et des protéines RANTES, MCP-1 et l'IL-8. La sécrétion de ces chimiokines est significativement augmenté à 48 ou 72 heures suivant l’infection dans les cultures traitées par de faibles doses d’INF-γ, et ceci comparativement aux cellules non infectées (P <0,001). Les chimiokines produites par les SAEC en réponse à l’infection virale ont montrés une forte activité chimiotactique pour les éosinophiles humains du sang périphérique. En outre, nous avons observé une infection productive par les entérovirus à tropisme respiratoire dans les éosinophiles. Ceux-ci ont spécifiquement sécrété des niveaux significatifs de RANTES et MCP-1,et ceci 24 heures après l'infection. Par conséquent, le processus inflammatoire induit par les entérovirus semble être déclenché par l'infection de cellules épithéliales, et amplifié par des mécanismes déclenchés par l’INF-γ ainsi que par la sécrétion de chimiokines par les éosinophiles recrutés dans la lumière bronchique. En conclusion, nos travaux indiquent que les EVs sont une cause fréquente d'infection des voies respiratoires chez les enfants, et qu’ils sont capables d’induire au cours de l’infection des cellules de l'épithélium bronchique, une sécrétion spécifique de chimiokines de type RANTES, MCP-1 et IL-8. Ces résultats suggèrent l’importance du rôle des entérovirus dans le développement de pathologies respiratoires chez les enfants immunocompétents
Enteroviruses (EV) (Picornaviridae) are among the most common viruses infecting human beings worldwide. These viral agents are associated with a wide range of human pathologies, including upper respiratory but also lower respiratory tract infections resulting in bronchitis, pneumonia or bronchiolitis in adults or in infants. In the first study, we assessed the potential role of the respiratory picornaviruses as causative agents of bronchiolitis in 192 infants ≤36 months of age and hospitalized for acute bronchiolitis. The detection of common respiratory viruses (respiratory syncytial virus, influenza virus A and B, parainfluenza virus I, II, III, and adenovirus) was performed using classical immunofluorescence antigens and cell culture detection assays in nasopharyngeal aspirates whereas the detection of human metapneumovirus (HMPV) rhinoviruses and enteroviruses was performed by molecular techniques. A potential causative virus was detected in 72. 5 % of the 192 study infants. RSV (30%), rhinovirus (21%), enterovirus (9%), influenza virus A (6%) and human metapneumovirus (4%) were the most frequent causative agents detected. Rhinoviruses or enteroviruses were detected as the only evidence of respiratory viral tract infection in 57 (30%) of 192 infants, whereas rhinovirus or enterovirus occurred in mixed viral infection detected in 25 (13%) of 192 study cases (30 vs. 13%, p<10-3). Our data suggest that respiratory picornaviruses are one of the leading etiological causes of bronchiolitis in French infants. In the second part our investigations, we analysed 252 EV-related infection cases (median age, 5. 1 years) diagnosed among 11,509 consecutive children visiting emergency departments within a 7-year period in the North of France. EV strains were isolated from nasopharyngeal samples by viral cell culture, identified by seroneutralization assay and genetically compared by partial amplification and sequencing of the VP1 gene. The respiratory syndromes (79 (31%) of 252 EV infections) appeared as the second more frequent EV induced pediatric pathologies after meningitis (111 (44%) of 252 cases) (44 vs. 31%, P<10-3), contributing to lower respiratory tract infection (LRTI) in 43 (54%) of 79 EV respiratory infection cases. Bronchiolitis was the most frequent EV induced LRTI (34 (43%) of 79 cases, P<10-3) occurring more often in infants aged 1-12 months (P=0. 0002) with spring-fall seasonality. Viruses ECHO 11, 6 and 13 were the more frequently identified respiratory strains (24, 13 and 11%, respectively). The VP1 gene phylogenetic analysis showed the concomitant or successive circulation of genetically distinct EV respiratory strains (species A or B) during the same month or annual epidemic period. Our findings indicated that respiratory tract infections accounted for appreciatively 30% of EV-induced paediatric pathologies, contributing to LRTIs in 54% of these cases. Moreover, the concomitant or successive circulation of genetically distinct EV strains indicated the possibility of paediatric repeated respiratory infections within the same epidemic season. To identify the mechanisms that can regulate the development of airway mucosa inflammation during EV respiratory lower tract infection, we investigated the production of chemokines by EV-infected bronchial epithelial cells. Cultures of primary human small airway epithelial cell (SAEC) were infected by wild-type respiratory EV strains, demonstrating a replicative and productive infection by Coxsackievirus B5 and Echovirus 30 strains. Exposure of SAEC to gamma interferon (INF-γ), in combination with Coxsackievirus B5 and Echovirus 30 infection, induced a significant increase in RANTES production that was synergistic with respect to that obtained by EV-infection or INF-γ treatment alone. We observed that the replicative infection of the SAEC by Coxsackievirus B5 and Echovirus 30 wild-type viruses induced dose and time-dependent increases in mRNA and protein secretion for RANTES, MCP-1 and IL-8. The protein secretion of these chemokines appeared to be significantly increased at 48 or 72 hours post-infection in cultures treated by low-doses of INF-γ comparatively to mock-infected cells (P<0. 001), and was correlated to the viral replication activity. SAEC-derived chemokines exhibited a strong chemotactic activity for normal human blood eosinophils. Furthermore, we observed an EV productive infection in eosinophils, which specifically released significant levels of RANTES and MCP-1, 24 hours post-infection. Therefore, the inflammatory process in EV-induced bronchiolitis appears to be triggered by the infection of epithelial cells and further amplified via mechanisms driven by INF-γ and by the secretion of eosinophil chemokines. Altogether, our findings suggest that EVs are a common cause of respiratory tract infections in paediatric patients, where they can induce the release of chemokines by bronchial epithelial cells, which may significantly contribute to the various histologic and inflammatory features of EV-induced airway disease

La réponse immune lors d'une infection par le VHB est essentielle pour éliminer le virus. Le virus module le système immunitaire pour échapper à son contrôle. Le mécanisme par lequel le virus module l'immunité est encore mal connu. Les cellules dendritiques plasmocytoides (pDC) jouent un rôle crucial dans l'immunité antivirale de part leur capacité à capturer et apprêter les antigènes viraux afin d'induire une réponse immune adaptative. Les pDCs représentent un bon potentiel pour restaurer une immunité anti-VHB fonctionnelle, mais le VHB pourrait moduler les pDCs pour échapper au contrôle immunitaire. Dans une première partie, nous avons évalué le potentiel des pDCs à restaurer l'immunité anti-VHB en contexte d'hépatite B chronique. Nous avons utilisé une lignée de pDCs HLA-A*0201+ chargée avec des peptides HLA-A*0201 restreints dérivés des antigènes HBc et HBs du virus afin d'amplifier des lymphocytes T spécifiques ex vivo à partir de cellules de patients atteints d'hépatite B chronique. Nous avons ensuite établi un modèle de souris humanisées (Hepato-HuPBL) afin d'évaluer le potentiel thérapeutique de la stratégie in vivo. La stimulation de PBMC ou de lymphocytes infiltrant le foie (LIL) issus de patients HLA-A*0201+ par la lignée de pDC chargée avec le peptide HBc a permis d'amplifier des lymphocytes T spécifiques de HBc et fonctionnels dans 45,8% des cas. Le groupe de non répondeurs était caractérisé par la présence d'Ag HBe ou un plus fort niveau de lymphocytes T régulateurs. L'efficacité thérapeutique du vaccin de pDC a été évaluée dans un modèle de souris NOD-SCID β2m-/- reconstituées avec des PBMC issus de patient VHB et xenotransplantées avec des hépatocytes humains transfectés avec le VHB. La vaccination de ces souris avec la lignée de pDC chargée avec les peptides HBc et HBs a permis l'amplification de lymphocytes T CD8 spécifiques du VHB capables de lyser spécifiquement les hépatocytes infectés in vivo. Ainsi, la lignée de pDC chargée avec des peptides dérivés du VHB est capable d'amplifier des lymphocytes T CD8 spécifiques du VHB et fonctionnels in vitro et in vivo. Cette nouvelle stratégie d'immunothérapie pourrait donc restaurer une immunité antivirale et permettre l'élimination du virus chez les patients atteints d'hépatite B chronique. Dans une deuxième partie, nous avons évalué le rôle physiopathologique des pDCs au cours de l'infection chronique par le VHB et les conséquences fonctionnelles sur le cross-talk pDC/NK. Des défauts fonctionnels des pDCs et des cellules NK ont été observé chez les patients atteints d'hépatite B chronique. Cependant le cross-talk pDC/NK ainsi que les mécanismes en jeu n'ont pas encore été élucidé. Nous avons étudié le phénotype et la capacité de répondre à une stimulation TLR-L des pDCs de patients comparé aux pDCs de donneurs sains puis nous avons étudié les conséquences sur le cross-talk entre pDCs de patients (virémiques ou avirémiques) et cellules NK hétérologues. Les pDCs de patients montrent un phénotype plus activé que les pDCs de donneurs sains mais ne sont pas capables de répondre à une stimulation TLR9-L. De plus, les pDCs de patients virémiques ne sont pas capables d'activer les fonctions cytotoxiques des cellules NK. Cette perturbation du cross-talk pDC/NK semble liée à un défaut de production d'IFNα et d'expression d'OX40L par les pDCs de patients virémiques, ainsi qu'à la présence d'une quantité importante d'IP-10 dans le plasma des patients. Ainsi, le VHB pourrait échapper à l'immunité en altérant la fonction des pDCs et perturbant le cross-talk pDC/NK par un mécanisme dépendant de IP-10, OX40L et IFNα.

Le virus de Borna (BDV) est un virus à ARN négatif simple brin non segmenté. Il est responsable d'une infection persistante du système nerveux central (SNC) à l'origine de troubles comportementaux dans un grand nombre d'espèces de mammifères. C'est un pathogène reconnu en médecine vétérinaire et des données épidémiologiques suggèrent que le BDV, ou un virus proche, pourrait également infecter l'homme. Au cours de ce travail de thèse, nous nous sommes tout d'abord attachés à l'étude des propriétés et des mécanismes d'action de molécules antivirales dirigés contre le BDV. Nos résultats montrent que la 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine agit comme un inhibiteur compétitif du BDV, probablement au niveau de la polymérase virale. Nous avons également identifié le 2'-fluoro-2'-désoxycytidine (2'-FdC), un analogue nucléosidique peu toxique inhibant efficacement le BDV. Ce résultat ouvre la voie au développement d'une chimiothérapie efficace contre le BDV. Le deuxième objectif de ce travail de thèse a été de préciser les mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine des troubles comportementaux associés à la persistance du BDV dans le SNC. Nous avons observé que le BDV ne modifie pas l'activité présynaptique dans les conditions spontanées ou en réponse à une stimulation prolongée. De façon intéressante, le BDV perturbe spécifiquement la potentialisation à long terme du recyclage des VS. Ce déficit de potentialisation a été corrélé à une interférence spécifique du BDV avec la voie de la protéine kinase C (PKC). Afin d'étudier les propriétés électrophysiologiques des neurones infectés par le BDV, nous avons enregistré l'activité électrique de réseaux de neurones corticaux, mis en culture sur des supports à électrodes multiples
Borna Disease Virus (BDV) is a negative, non-segmented single stranded RNA virus that causes a persistent infection of the central nervous System (CNS) in a wide variety of mammals, leading to behavioral disorders. BDV is a well known pathogen in veterinary medicine and epidemiological evidence suggests that BDV, or a BDV-like virus, could also infect humans. During this thesis, we first aimed to study the mechanism of action and the antiviral properties of nucleoside analogs against BDV. Our results show that 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine acts as competitive inhibitor of BDV, probably at the level of the viral polymerase. We have also identified the nucleoside analog 2’-fluoro-2'-deoxycytidine (2'-FdC), a nucleoside analog that exhibits potent antiviral activity against BDV. Importantly, 2'-FdC-associated cytotoxicity is negligible, indicating 2'-FdC as an excellent candidate for the development of antiviral therapy against BDV. The second goal of this thesis was to clarify the cellular and molecular bases for the behavioral alterations associated with BDV persistence in the CNS. Since BDV is non-cytolytic, we have hypothesized that these symptoms could be due to an impairment of synaptic transmission in infected neurons. We report that BDV does not affect spontaneous or evoked vesicular cycling. Interestingly, BDV selectively blocks activity-dependent potentiation of SV recycling. This blockade is linked to an interference with protein kinase C (PKC) signaling. In order to study the electrophysiological properties of BDV infected neurons, we have recorded the electrical activity of cortical neurons grown of multi-electrode arrays. This study supports our conclusions that BDV does not alter neuronal activity under basai conditions, but selectively blocks long term potentiation of neuronal network activity

Lors de l'entrée du VIH dans une cellule cible, le virus doit fixer un corécepteur qui peut-être le CCR5 ou le CXCR4. Le maraviroc est uniquement efficace sur les virus de tropisme R5. Le VIH-2 présente une résistance naturelle à 1/3 des antirétroviraux commercialisés. Il n'existait pas de méthode diagnostique de détermination du tropisme du VIH-2 et la sensibilité du VIH-2 au maraviroc était inconnue. Le tropisme viral phénotypique de 53 souches de VIH-2 a été déterminé et la boucle V3 a été séquencée pour analyser l'association des mutations observées avec le tropisme viral. La sensibilité phénotypique du VIH-2 au maraviroc a été déterminée sur un modèle de leucocytes de donneurs. Le tropisme génotypique a été comparé entre l'ARN viral et l'ADN proviral pour 43 prélèvements. Nous avons identifié 4 déterminants génotypiques majeurs associés à l'utilisation du CXCR4 (L18Z, V19K/R, insertion en position 24, charge nette de la boucle V3 >+6). Le VIH-2 a une sensibilité phénotypique au maraviroc équivalente au VIH-1, avec une CI50 médiane de 0,80 nM et un plateau maximal d'inhibition médian de 93 %. Le tropisme génotypique de l'ARN viral et de l'ADN proviral est concordant dans 74 % des cas. Dans ce travail nous avons établi le premier algorithme génotypique de détermination du tropisme du VIH-2 e observé une sensibilité in vitro du VIH-2 au maraviroc équivalente à celle du VIH-1. Nous avons établi la bonne concordance entre le tropisme viral de l'ARN circulant et de l'ADN proviral. Ces données permettent désormais l'identification des patients infectés par le VIH-2 éligible pour le maraviroc. Le caractère pronostic du tropisme viral va maintenant être évalué
During HIV entry in target cells, the virus must attach a coreceptor: CR5 or CXCR4. Maraviroc is only effective on R5-tropic viruses. HIV-2 is a highly resistant virus with natural résistance to one third on HIV-1 effective antiretroviral drugs. HIV-2 infected patients often displayed a spontaneously undetectable viral load in absence of treatment. There was no assay for HIV-2 tropism determination and HIV-2 susceptibility to maraviroc remained unknown. We determined phenotypic tropism of 53 HIV-2 strains and sequenced the V3 loop. Association between the V3 loop sequence and the phenotypic viral tropism was analyzed. HIV-2 phenotypic susceptibility to maraviroc was studied with a PBMC model. Finally, concordance between genotypic tropism of viral RNA and proviral DNA was studied. We identified 4 HIV-2 major genotypic determinants associated with the use of CXCR4 (L18Z, V19K/R, an insertion at position 24, V3 loop global net charge >+6). HIV-2 phenotypic susceptibility to maraviroc is similar HIV-1, with a IC50 median of 0. 80 nM and a median maximum inhibition plate of 93%. Genotypic tropism of viral RNA and proviral DNA were concordant in 74% of tested samples. Ail discrepancies were due to R5 tropism in viral RNA and X4 tropism in proviral DNA. We developed the first HIV-2 algorithm for genotypic tropism prediction. We demonstrated in vitro susceptibility of HIV-2 to maraviroc. We have predicted the good correlation between genotypic viral tropism established from circulating RNA and proviral DNA. This allows identification of HIV-2 infected patients eligible for maraviroc treatment. HIV-2 tropism will now be examined for its predictive value of progression to AIDS

Les infections virales respiratoires demeurent un enjeu majeur de santé publique dans le monde entier. C’est notamment le cas de la grippe, causée par les virus influenza, et de la COVID-19, une maladie infectieuse émergente due au virus SARS-CoV-2. De manière notable, les populations les plus à risque de développer des formes sévères de grippe ou de COVID-19, sont les individus obèses et les personnes âgées. Bien que l’obésité et le vieillissement soient associées à des altérations fonctionnelles majeures du tissu adipeux blanc, la participation de ce dernier dans la physiopathologie de la grippe ou de la COVID-19 reste très peu étudiée. Le projet de thèse s’inscrit dans cette thématique générale.Les travaux récents de notre équipe ont montré, chez la souris, que l’infection par le virus influenza entraine une reprogrammation métabolique des dépôts sous-cutanés de tissu adipeux blanc, notamment caractérisée par le brunissement du tissu : un phénomène qui correspond à l’émergence d’adipocytes beiges présentant une activité thermogénique accrue. Lors de ma thèse, par des approches expérimentales in vivo, in vitro, ex vivo et in silico complémentaires, nous avons montré que la réponse au stress du réticulum endoplasmique induit par l’infection par le virus de la grippe, et plus spécifiquement la voie signalétique PERK, est impliquée dans le brunissement du tissu adipeux blanc. Outre identifier un nouveau mécanisme moléculaire de régulation de la thermogenèse, nos travaux précisent un peu plus la place du tissu adipeux blanc dans l’infection grippale.En parallèle, nous avons étudié l’impact de l’infection par le virus SARS-CoV-2 sur les tissus adipeux blancs de hamsters jeunes adultes ou âgés - un modèle préclinique de COVID-19 récemment mis en place dans notre équipe. Nos résultats montrent que l’infection est plus sévère, en termes de morbi-mortalité, chez les animaux âgés que chez les jeunes adultes. L’analyse histomorphométrique des tissus adipeux blancs sous-cutanés et viscéraux a permis de montrer que l’infection par SARS-CoV-2 est associée à une diminution de la taille des adipocytes dans ces deux dépôts ; effet qui persiste uniquement chez les animaux âgés. De manière très intéressante, l’analyse histologique des tissus révèle la présence de nombreuses et larges zones de nécrose adipocytaire (ressemblant aux crown-like structures décrites dans les tissus adipeux blancs en contexte d’obésité) uniquement dans les dépôts sous-cutanés de tissu adipeux des animaux âgés, y compris à distance de l’infection. En cela, notre étude confirme et renforce les plus récentes données de la littérature qui décrivent un rôle majeur du tissu adipeux blanc dans la physiopathologie de la COVID-19
Respiratory viral infections remain a major public health issue, worldwide. This is particularly the case with flu, caused by influenza viruses, and COVID-19, an emerging infectious disease caused by the SARS-CoV-2 virus. Importantly, the populations most at risk of developing severe forms of flu or COVID-19 are obese individuals and the elderly. Although obesity and aging are both associated with major functional alterations of the white adipose tissue, the latter's involvement in the pathophysiology of influenza or COVID-19 remains poorly studied. The thesis project falls within this general theme.Recent work by our team has shown, in mice, that infection with the influenza virus causes metabolic reprogramming of the subcutaneous fat depots, mainly characterized by the browning of the tissue: a phenomenon which corresponds to the emergence of beige adipocytes with increased thermogenic activity. During my PhD, using complementary experimental in vivo, in vitro, ex vivo and in silico approaches, we showed that the response to influenza-infection-induced endoplasmic reticulum stress, and more specifically the PERK signaling pathway, is involved in white adipose tissue browning. Besides identifying a novel molecular mechanism that regulates thermogenesis, our work further specifies the role of the white adipose tissue in influenza infection.In parallel, we studied the impact of infection with the SARS-CoV-2 virus on the white adipose tissues of young adult and old hamsters - a preclinical model of COVID-19 recently implemented in our team. Our results showed that the infection is more severe - in terms of morbidity and mortality - in older animals than in young adults. Histomorphometric analysis of subcutaneous and visceral white adipose tissues showed that infection with SARS-CoV-2 is associated with a decrease in the size of adipocytes in these two depots; an effect that persists only in the older animals. Remarkably, the histological analysis of the tissues reveals the presence of numerous and large areas of adipocyte necrosis (resembling the “crown-like structures” that can be observed in white adipose tissues in the context of obesity) only in the subcutaneous fat depots of the older animals, even at distance from infection. As such, our study confirms and strengthens the most recent data in the literature, which describes a major role of the white adipose tissue in the pathophysiology of COVID-19

Les infections chroniques de l’Immunodéficience Humaine et de l’Hépatite C (VIH et VHC) sont à l’origine de pandémies. Malgré des traitements avancés, leurs relations avec le système immunitaire ne sont pas résolues et restent nécessaires pour établir de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les cellules Natural Killer (NK) sont des effecteurs majeurs antiviraux et sont importants pour l’immunité innée et adaptative. Ils contrôlent leur cytotoxicité et leur fonction immunorégulatrice via de multiples récepteurs activateurs et inhibiteurs qui sont enclenchés par interaction avec leurs ligands respectifs. Parmi tous les récepteurs, je me suis particulièrement intéressé aux Natural Cytotoxicity Receptors NKp30 et NKp44. Il est intéressant de noter que le laboratoire a précédemment identifié un épitope conservé de la gp41 du VIH-1 qui induit l’expression du ligand de NKp44 sur des LT CD4+ les rendant susceptibles à la lyse par des cellules NK-NKp44+. Après plusieurs études, le laboratoire a mis en place une stratégie vaccinale basée sur un peptide de l’épitope conservé de la gp41 qui induit chez la souris des Anticorps Neutralisants (AcNs W614A-3S) contre l’infection VIH-1. Alors que le VIH-2 est considéré comme un modèle unique d’une infection VIH contrôlée, les données sur les cellules NK y sont très limitées. Nous avons observé une dérégulation du récepteur NKp30 et une augmentation de ses ligands qui conduisent à des déficiences de leurs fonctions et représentent un nouveau mécanisme de persistance virale. Ensuite, nous avons observé pendant l’infection chronique par le VHC une forte proportion de cellules NK intra-hépatiques exprimant NKp44 qui corrèle avec la fibrose et la charge virale. De plus, nous avons identifié un épitope conservé de la protéine Core du VHC qui induit le ligand de NKp44 sur des lignées hépatiques. Ces données suggèrent que la déplétion des hépatocytes passe par un mécanisme similaire à celui observé pendant l’infection VIH-1. Enfin, une étude sur des patients VIH-1 contrôleurs nous a permis d’identifier la présence d’AcNs W614A-3S qui sont associées au contrôle viral et au maintien de LT CD4+ fonctionnelles. Ces données ont confirmé le potentiel de ces AcNs et, dont leur production par vaccination, ont été confirmée chez le lapin et le singe. Ainsi, ces études apportent de nouvelles données dans les relations entre les cellules NK et le VIH ou le VHC ainsi que de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ces études ont notamment confirmé le pouvoir des AcNs W614A-3S dans un vaccin contre le VIH-1
Human Immunodeficiency and Hepatitis C (HIV and HCV) chronic infections are at the origin of pandemics. Despite advance drug treatments, their relationship with the immune system is not resolved and is still required to establish new therapeutic strategies. Natural Killer (NK) cells are major antiviral effectors of the immune system and are important for innate and adaptive immune processes. They mediate cytotoxicity and immunoregulation via various activator and inhibitor receptors that are triggered upon interaction with their cognate ligands. Among all receptors, I particularly took an interest in Natural Cytotoxicity Receptors NKp30 and NKp44. Interestingly, the lab previously identified a conserved HIV-1 gp41 épitope that induce expression of NKp44 ligand on CD4+ T cells making them susceptible to lyses by NK-NKp44+ cells. After various studies, the lab established a vaccine strategy based on a peptide from the conserved gp41 épitope that induced in mice Neutralizing Antibodies (Nab W614A-3S) against HIV-1 infection. Whereas HIV-2 infection could be considered as a HIV control infection unique model, data on NK cells are very limited. We found a down-modulation of NKp30 receptor and an increased of its ligands that lead to functional impairments of NK cells and could represent a new viral persistence mechanism. Then, during the HCV chronic infection we found a high proportion of intrahepatic NK cells expressing NKp44 that correlates with fibrosis and viral load. Furthermore we identified a conserved épitope of HCV core protein that induced NKp44 ligand on hepatic cell lines. These data suggest that destruction of hepatocyte might occur by a similar mechanism observed during HIV-1 infection. Finally, a study on HIV-1 controllers patients allow us to identify the presence of Nab W614A-3S that correlates with viral control and the preservation of functional CD4+ T cells. These data confirm the potency of this Nab and their induction by vaccination has been also confirmed in rabbit and macaques. Thus, these studies highlight new data regarding relationship between NK cells and HIV or HCV that could represent new therapeutic approaches. These studies especially confirm the potency of Nab W614A-3S to implement a vaccine against HIV-1

Chemoattractant agents play a crucial role in the initiation of immune responses, by regulating the traffic and function of leucocyte populations. Their receptors are therefore considered as potential targets for the development of new therapies in the fields of cancer and inflammatory diseases. ChemR23, a previously orphan receptor discovered in the laboratory, is structurally related to receptors for chemoattractant agents. It is expressed on immature myeloid and plasmacytoid dendritic cells (mDCs and pDCs respectively), as well as on adipocytes, macrophages, NK and endothelial cells. Chemerin, the endogenous ligand of ChemR23, is abundant in various human samples originating from inflammatory diseases, including pleural effusions. Chemerin is secreted as an inactive precursor, prochemerin, and is activated by the removal of six or seven amino-acids from its carboxy-terminus by serine proteases, such as as cathepsin G and elastase. Chemerin acts as a chemoattractant agent of low nanomolar potency for macrophages, immature mDCs and pDCs. It is however more active on pDCs, in line with the higher expression of ChemR23 on these cells. pDCs possess important immunoregulatory properties in lung diseases, and their ability to secrete large amounts of type I interferon (IFN) upon viral infection makes them crucial players in anti-viral immunity.

According to these elements, and to the role of neutrophils in the physiopathology of many inflammatory lung diseases and in the generation of active chemerin, we began in 2007 to study the role of chemerin and its receptor ChemR23 in inflammatory lung diseases. We first characterized the mouse chemerin/ChemR23 system, and described that this system was very similar to the human one, in terms of distribution, pharmacology and functional properties. We then used wild type mice (WT) and mice invalidated for the receptor (ChemR23-/-) in various models of inflammatory lung diseases, including asthma, lung fibrosis, viral pneumonia, and acute lung injury.

Whereas the asthma and lung fibrosis models did not allow to demonstrate a significant role of the chemerin/ChemR23 system (possibly as a result of the lack of production of active chemerin in these models), infection by either the Pneumonia Virus of Mice (PVM), the mouse counterpart of human RSV, or by a murinized H1N1 influenza strain resulted in a significantly higher mortality rate in ChemR23-/- mice as compared to their WT counterparts. Using the PVM-induced pneumonia model, we observed that the excessive mortality of knock-out mice is caused by an inadequate and excessive innate immune response characterized by a massive recruitment of neutrophils to the lungs, associated with a delayed viral clearance and lower type I IFN synthesis. This latter observation suggested an impairment of pDC recruitment, according to the important contribution of pDCs to the production of type I IFNs in viral diseases, and the role of chemerin in the recruitment of these cells. We indeed confirmed a lower recruitment of pDCs in the lung of infected ChemR23-/- mice, as compared to WT mice. However, experiments of adoptive transfert and depletion of pDCs failed to proof a link between impaired pDC recruitment and the excessive morbidity and mortality observed in ChemR23-invalidated mice.

In parallel, we studied the role of the chemerin/ChemR23 system in the control of innate immune responses, by using a model of acute lung injury caused by the intra-tracheal instillation of bacterial lipopolysaccharide (LPS). In this model, administration of recombinant chemerin together with LPS in WT mice resulted in a significant (about 50%) reduction of neutrophil recruitment to both lung parenchyma and airways. Assessment of pro-inflammatory cytokines and chemokines in broncho-alveolar lavage fluids confirmed this anti-inflammatory effect of chemerin, which was ChemR23-dependent, as the inflammatory response of ChemR23-/- mice was unaffected by chemerin. In our hands, chemerin does not modulate macrophage functions, in contrast to data recently published by other groups, attributing anti-inflammatory effects of chemerin or chemerin-derived peptide to the modulation of macrophage activation and phagocytosis. Other hypotheses that could take our observations into account are presently investigated, including an immunomodulatory role of chemerin on lung epithelial or endothelial cells, and/or the ChemR23-dependent recruitment of subtypes of macrophages or other myeloid cells endowed with immunosuppressive properties.

In conclusion, our studies characterized the mouse chemerin/ChemR23 system and highlighted the role of this system in the physiopathology of some inflammatory lung diseases. Our results suggest that the chemerin/ChemR23 system might be considered as a potential therapeutic target for the development of future anti-infectious and anti-inflammatory therapies, particularly for viral pneumonia, which represent a major public health problem, as well as for acute respiratory distress syndrome (ARDS) following severe acute lung injuries.

Les agents chimioattractants jouent un rôle fondamental dans l’initiation des réponses immunes en régulant le trafic et la fonction des populations leucocytaires. Leurs récepteurs constituent dès lors des cibles d’intérêt pour le développement de traitements contre les maladies inflammatoires et le cancer. Le laboratoire d’accueil a identifié le récepteur ChemR23, exprimé à la surface des cellules dendritiques myéloïdes (mDCs) et plasmacytoïdes (pDCs) immatures, des macrophages, des cellules NK, des adipocytes, et des cellules endothéliales. Le ligand endogène du récepteur ChemR23, la chémérine, est présent en abondance dans divers échantillons pathologiques d’origine inflammatoire. La chémérine est produite sous la forme d'un précurseur inactif, la prochémérine, qui nécessite pour devenir active le clivage protéolytique de six ou sept acides aminés à son extrémité carboxy-terminale. La chémérine induit le chimiotactisme des macrophages et des DCs immatures, et en particulier des pDCs immatures en accord avec l’expression plus importante de ChemR23 par les pDCs. Les pDCs jouent un rôle immunorégulateur important en pathologie pulmonaire, en particulier dans la physiopathologie des pneumonies virales, par leur capacité à produire d’importantes quantités d’interféron (IFN) de type I.

Compte tenu de ces éléments et du rôle des polynucléaires neutrophiles dans de nombreuses pathologies pulmonaires, ainsi que dans la génération de chémérine active à partir de son précurseur, nous avons débuté en octobre 2007, l’étude du rôle de la chémérine et de son récepteur ChemR23 dans le contrôle des pathologies pulmonaires inflammatoires. Nous avons tout d’abord caractérisé le système chémérine/ChemR23 chez la souris et avons montré que ce système présentait des caractéristiques similaires à celles décrites chez l’homme, en termes de distribution, de pharmacologie et de propriétés fonctionnelles.

Ensuite, nous avons comparé des souris sauvages et invalidées pour le récepteur ChemR23 (ChemR23-/-) dans divers modèles de pathologies pulmonaires. Les modèles d’asthme et de fibrose pulmonaire induite par instillation de bléomycine ou de silice n’ont pas permis de mettre en évidence un rôle important du couple chémérine/ChemR23, peut-être en raison de l’absence de génération de forme active de chémérine dans ces modèles. En revanche, l’administration de deux agents viraux différents, le PVM (Pneumonia Virus of Mice), l’équivalent murin du RSV humain, et un virus de l’influenza H1N1 murinisé, a résulté en un taux de mortalité 40% plus élevé pour les souris ChemR23-/- par rapport à leurs homologues sauvages. En utilisant le modèle de pneumonie induite par le PVM, nous avons montré que cette différence de mortalité est causée par une réponse immune inappropriée et excessive, associée à une réduction de l’élimination du virus, ainsi qu’à un déficit de synthèse d’IFN de type I. Les pDCs, dans un contexte d’infection virale, sont capables de synthétiser d’importantes quantités d’IFN de type I, et nous avons mis en évidence un déficit relatif de recrutement en pDCs chez les souris ChemR23-/- infectées. Néanmoins, les expériences de transfert adoptif et de déplétion de pDCs n’ont pas permis de lier ce défaut de recrutement à l’excès de morbidité et de mortalité observé chez les souris ChemR23-/- infectées.

En parallèle, le rôle de ce couple ligand-récepteur dans le contrôle des réponses immunitaires innées a été étudié dans un modèle de pneumopathie aiguë induite par instillation intra-trachéale de lipopolysaccharide (LPS). Dans ce modèle, l’administration simultanée de chémérine recombinante avec le LPS entraîne chez les souris sauvages une diminution significative (environ 50%) du nombre de polynucléaires neutrophiles recrutés dans les voies aériennes et dans le parenchyme pulmonaire, ainsi qu’une importante diminution de synthèse de cytokines pro-inflammatoires. Cet effet anti-inflammatoire de la chémérine est dépendant de ChemR23, et ne semble pas être secondaire à un effet de la chémérine sur l’activation des macrophages, contrairement à certaines données publiées récemment par d’autres groupes. D’autres hypothèses permettraient cependant de prendre en compte ces observations, notamment un effet de la chémérine sur les cellules épithéliales et/ou endothéliales pulmonaires, ainsi que sur le recrutement de sous-populations de macrophages ou d’autres cellules myéloïdes possédant des propriétés immunosuppressives. Des expériences complémentaires ont été initiées afin de tester ces hypothèses.

En conclusion, après avoir caractérisé le système chémérine/ChemR23 chez la souris, nos études ont permis de mettre en évidence le rôle de ce couple ligand/récepteur dans la physiopathologie de certaines pneumopathies inflammatoires, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques, en particulier pour le traitement des pneumopathies virales, qui constituent un problème de santé publique majeur, ainsi que des syndromes de détresse respiratoire aiguë (ARDS).
Doctorat en Sciences médicales
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Background and aim: Hepatocellular carcinoma (HCC) is the first cause of liver tumor and the leading cause of death among patients with liver cirrhosis. HCC is a major public health concern, with an incidence and mortality of HCC in increasing in North America and in some European regions1. In this contest, is strategically relevant to determine HCC epidemiology, physiopathological alterations and its potential early biomarkers. The aim of the three studies presented in this thesis is to define HCC incidence in HCV patients treated with direct acting antiviral drugs (DAAs), and investigate the role of novel targets and circulating biomarker in HCC related to chronic viral hepatitis. The main aim of study 1 is to evaluate incidence of newly diagnosed HCC in patients with advanced hepatitis C treated with DAAs. Aim of study 2 is to evaluate the expression of mi-RNAs in patients with HCC, compared with patients without HCC. The main aims of study 3 is to better define the role of OPN in HCC and elucidate the immunoregulatory functions of OPN in Hepatocellular Carcinoma Methods: Study1. The study is based on the NAVIGATORE platform, a prospectively recording database of all patients with hepatitis C receiving DAAs in Veneto region (Italy). Inclusion criteria: fibrosis stage ≥ F3. Exclusion criteria: Child-Pugh C, liver transplantation before DAAs, history or presence of HCC, follow-up <4 weeks after starting DAAs. Study 2. A total of 68 patients with cirrhosis HCV related who achieved SVR after therapy with DAAs have bee enrolled. 20 patients with HCC within the 24 weeks after the end of therapy with DAAs and 48 patients without HCC after DAAs. In the two groups selected micro-RNAs have been analyzed at the start and at the end of DAAs therapy. Study 3. This study includes: measurement of Osteopontin (OPN) in the plasma of patients with HCC, analysis of OPN on supernatant of Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) culture in HCC patients and evaluation of the impact of recombinant OPN on modulating the phenotype of PBMCs in patients with HCC. Results: Study 1. During the first year, HCC incidence was 0.46% (95% CI: 0.12-1.17) in F3, 1.49% (1.03-2.08) in Child-Pugh-A and 3.61% (1.86-6.31) in Child-Pugh-B cirrhotics. In the second year HCC incidences were: 0%, 0.2%, and 0.69%, respectively. Study 2. When we have compared mi-RNAs expression between the two groups (patients with HCC or without HCC after DAAs) at baseline, miR28-5p is resulted significantly increased (p=0.029) in HCC group compared to not HCC group. Study 3. In patients with HCC hepatitis B (HCC-CHB) related and with HCC non-viral related, the levels of OPN are higher than patients with chronic hepatitis without HCC (p=0.0016 and p=0.0063 respectively). In the analysis of OPN on supernatant of PBMCs cultured with Glypican 3, following PD1 blockade, OPN production was reduced (p=0.023) in HCC-non viral but not HCC-CHB or Healthy controls. We also observed a reduction in OPN in both HCC-non viral (p=0.0078) and HCC-CHB (p=0.0010) in PBMCs cultured with p53. Conclusions: Study 1 These data, obtained in a large, prospective, population-based study, indicate that in patients with advanced hepatitis C receiving DAAs, the risk of "de novo" hepatocarcinoma during the first year is not higher, and might be lower, than that of untreated patients, and further declines thereafter. Study 2. In conclusion the expression of miR 28-5p is altered in patients treated with DAAs who develop HCC, suggesting its potential prognostic role in HCC related to HCV. Study 3. These results suggest its use as biomarker of HCC and reveal an immunomodulatory role for Osteopontin in HCC and warrant its further investigation as an immunotherapeutic target for HCC.

A evolução da recorrência da hepatie C pós-transplante hepático pode ter um curso bastante variável. Raramente a doença pode progredir para uma forma conhecida como hepatite recorrente colestática grave, cuja patogenia ainda não é bem conhecida. Nós estudamos nesse trabalho alguns aspectos virológicos, histológicos e imunohistoquímicos de seis pacientes com essa forma rara de recorrência da doença, tendo como comparação um grupo pareado de seis pacientes transplantados com a forma leve de hepatite C recorrente, e como controle imunocompetente, cinco pacientes não transplantados com hepatite crônica pelo vírus C. Foram avaliados como possíveis fatores preditivos de gravidade da progressão da recorrência: viremia do VHC, evolução de quasispécies, parâmetros histopatológicos, e imunoreatividade para o antígeno core do VHC.
Following liver transplantation (OLT) HCV-related disease severity is highly variable, with a minority of cases progressing to an extremely severe form of cholestatic hepatitis, in which the pathogenesis is not yet understood. We aim to compare virological, histological and immunohistological changes in patients developing mild and severe post-OLT HCV recurrence. Twelve patients with recurrent HCV infection were studied (6 with severe and 6 with mild disease). Five HCV-infected immunocompetent patients were used as controls. We looked at viral load, quasispecies evolution of HCV, several histological parameters and immuno-reactivity of core antigens at three time-points (pre-OLT, early post-OLT and late post-OLT) as predictors of severity of recurrence post-OLT.

La primo-infection est un moment critique de l’établissement du réservoir justifiant de l’initiation d’un traitement précoce. Nous avons initié un essai randomisé évaluant l’impact de deux ans d’un traitement antirétroviral intense (essai ANRS147 OPTIPRIM, trithérapie versus pentathérapie) sur le réservoir et avons initié des études physiopathologiques au cours de cet essai. Nous montrons ainsi la faible diversité génétique des virus en primo-infection dans les compartiments sanguins et rectaux. Le réservoir s’établit dès le premier mois de l’infection par diffusion d’un cluster viral homogène au sein des lymphocytaires T CD4 naïfs (TN) et mémoires centrales (TCM), transitionnelles (TTM), effectrices (TEM) quiescents. Il en résulte une perturbation de l’homéostasie lymphocytaire associée à une faible contribution au réservoir des cellules peu différenciées à longue demi-vie, TN et TCM. Par ailleurs nous montrons que la majorité des patients au moment de leur primo-infection n’ont pas la capacité de développer des réponses T CD8 à même de supprimer la réplication virale comme chez les patients HIV Controllers. Après deux ans de traitement, nous observons que la diversité virale n’a pas évolué, par contre la taille du réservoir est fortement réduite. Les anomalies de l’homéostasie lymphocytaire T CD4 persistent, par contre le traitement très précoce a permis de protéger les TN et TCM. Il n’y a pas de bénéfice additionnel d’une pentathérapie mais nous avons validé le concept qu’un traitement précoce permet d’induire un contrôle virologique au long cours après arrêt de traitement. Nos résultats indiquent qu’un traitement plus long que deux ans permettrait de renforcer la diminution du réservoir. Ces résultats seront à prendre en compte pour l’élaboration de futurs essais en primo-infection visant à réduire le réservoir pour une rémission au long cours
HIV primary infection is a critical period in the establishment of the reservoirs that justifies the initiation of an early treatment. We started a randomised trial to assess the impact of a two-year intense HAART (ANRS147 OPTIPRIM trial: five-drug therapy versus. three-drug therapy) on the blood reservoir; within this this trial, we included some pathophysiological studies. Thus, we show that during the primary infection, viruses have a low genetic diversity in blood and rectal compartments. The reservoir establishes itself as early as the first month of the infection by spreading a homogeneous viral cluster in CD4 T cells subsets, naive T cells (TN), central memories (TCM), transitional memories (TTM), effector memories (TEM), and resting T cells. This results in a disruption of the lymphocyte homeostasis, linked to the low contribution to the reservoir of TN and TCM, which are little differentiated cells with long half-lives. Moreover, we show that, at the time of the primary infection, the majority of patients do not have the ability to develop CD8 T cells responses that could suppress the viral replication, as HIV Controllers patients do. After two years of treatment, we observe that there is no evolution of the viral diversity, but the size of the reservoir is significantly reduced. The abnormalities of the CD4 T cells lymphocyte homeostasis remain, but the very early treatment was able to protect the TN and TCM. The five-drug therapy does not have any additional benefit, but we confirm the idea that early treatment can induce long-term virological control after the discontinuation of the treatment. Our results show that a treatment lasting more than two years would be able to reinforce the reduction of the reservoir. These results should be taken into account in the development of future trials aiming to reduce the reservoir in patients treated at the time of primary infection for a sustainable remission

En vue de contribuer à une meilleure compréhension des atteintes du système musculo-squelettique consécutives à une infection par un arthropod-borne-virus (arbovirus), deux arbovirus ont été étudiés : le virus du chikungunya (CHIKV) et le virus Zika (ZIKV), respectivement de la famille des Togaviridae et des Flaviviridae. Cette étude a été réalisée selon deux axes. Le premier s’intéresse aux atteintes articulaires consécutives à l’infection par le CHIKV. Nous avons mis au point un modèle d’imagerie in vivo reposant sur l’utilisation d’un virus recombinant exprimant la NanoLuciférase. Dans ce modèle, nous démontrons une persistance du signal bioluminescent dans les articulations 34 jours après infection. Par isolement des cartilages articulaires et des cellules constitutives, nous avons pu démontrer que les chondrocytes des cartilages métatarso-phalangiens sont infectés par le CHIKV de manière persistante, suggérant un rôle de réservoir de ces cellules. Les conséquences de l’infection au niveau cellulaire ont ensuite été étudiées in vitro. En utilisant des chondrocytes primaires humains, nous avons confirmé ces observations. De plus, les chondrocytes infectés produisent de nombreuses cytokines, induisant une stimulation du catabolisme du cartilage avec en particulier la synthèse de métalloprotéinases de matrice 3 et 9. De plus, l’infection par le CHIKV provoque la mort des cellules par apoptose, comme démontré par marquage TUNEL et par mesure de l’activité des caspases. Nous avons ensuite étudié les atteintes musculaires et le tropisme cellulaire du ZIKV. Dans un modèle murin, nous avons confirmé la présence de lésions musculaires, et l’utilisation de cellules musculaires primaires humaines a montré la sensibilité des myoblastes à l’infection, les myotubes étant résistants, suggérant un tropisme du ZIKV dépendant de la différenciation cellulaire. Trois souches virales ont été testées, sans relever de différences significatives en termes de cinétique d’infection, de nombre de cellules infectées et de production virale. L’infection des myoblastes entraîne la mort de ces cellules par un mécanisme caspase-indépendant. Des observations en microscopie électronique ont mis en évidence une vacuolisation du cytoplasme suite à l’infection, caractéristique d’une mort cellulaire par paraptose. Une analyse protéomique a démontré que l’infection des myoblastes par une souche asiatique conduit à une modification du protéome s’accentuant entre 24 heures et 48 heures post-infection, avec 225 protéines modulées 24 heures après infection contre 473 après 48 heures, indiquant une activation des voies de synthèse Interferon de type I et l’inhibition des capacités de synthèse des protéines. Ces résultats permettent une meilleure compréhension des atteintes du système-musculo-squelettique par les arbovirus
Musculoskeletal lesions caused by arthropod-borne-viruses (arboviruses) are invalidating for patients and remain poorly understood. In this study, we investigated the development of these manifestations after infection with two arboviruses: chikungunya virus (CHIKV) from the Togaviridae family, and Zika virus (ZIKV) from the Flaviviridae family. The first part of the study focused on arthritis following CHIKV infection. For this purpose, we developed a reporter virus expressing NanoLuciferase and performed experimental infections in a murine model. In vivo, a strong bioluminescent signal indicated viral replication and we observed persistence of the signal in the joints up to 34 days post-infection. By isolating primary murine cells from cartilage, we demonstrated the susceptibility of chondrocytes to CHIKV infection suggesting a role of reservoir of these cells. Furthermore, we investigated the consequences of the infection using in vitro models. We showed that primary human chondrocytes are also susceptible to CHIKV infection, which leads to the production of several cytokines involved in cartilage catabolism and induces apoptosis. In the second part of the study, we studied ZIKV muscular tropism and the associated lesions. Firstly, we confirmed the development of muscular lesions in a mouse model of ZIKA. Then, using human primary muscle cells we observed the infection of myoblasts but not myotubes, suggesting a differentiation-dependent tropism. We compared three viral strains and observed no significant difference in terms of replication, number of infected cells and viral production. Myoblasts infection induced a caspase-independent cells death mechanism and electronic microscope observations revealed intense vacuolization of cytoplasm, suggesting a paraptosis-like cell death. Proteomic analysis revealed that the Asian ZIKV strain modulated protein expression of infected cells with an increased effect after 48 hours. ZIKV-infection induced an important upregulation of biological processes associated with type I interferon and an inhibition of protein synthesis in the infected cells. These results provide valuable information about the mechanisms involved in the development of musculoskeletal lesions during arboviroses