Tesis: "Origine de la Réplication"

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Sollelis, Lauriane. "Dynamique de la réplication de l’ADN et complexe pré-réplicatif chez Leishmania sp.. : apport du système CRISPR/Cas9". Thesis, Montpellier, 2016. http://www.theses.fr/2016MONTT062/document.

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Resumen

Leishmania est un parasite eucaryote divergent responsable d’un large spectre de maladies à travers le monde. Ce parasite est caractérisé par une aneuploïdie mosaïque, constitutive, c’est-à-dire qu’au sein d’une population chaque cellule comporte une combinaison unique de mono-, di- et trisomies de chacun de ses 36 chromosomes. L’aneuploïdie mosaïque est générée et maintenue chez les générations suivantes grâce à un taux élevé de répartition asymétrique des chromosomes lors de la mitose, entrainant le gain ou la perte de chromosomes entiers. Ceci implique une régulation non-conventionnelle de la réplication, suivie d’une ségrégation permissive des chromosomes.L’objectif général de cette étude était de comprendre la dynamique de la réplication de l’ADN ainsi que de cartographier les sites d’initiation de la réplication chez Leishmania, en utilisant la technique du peignage moléculaire d’une part et celle du ChIP-seq d’une autre part. Nous avons ainsi pu caractériser les différents paramètres de progression de la fourche de réplication. Un des résultats majeurs qui ressort de cette étude est que Leishmania possède les plus grandes distances inter-origines et la plus grande vitesse de réplication parmi les autres eucaryotes déjà étudiés. Nous avons également pu estimer que le génome de Leishmania possède environ 168 origines de réplication. Afin d’étudier les acteurs impliqués dans la réplication de l’ADN chez Leishmania, nous avons développé l’outil génétique CRISPR/Cas9. Pour développer cet outil, nous avons basé notre approche sur une stratégie à deux vecteurs : l’un permet l’expression du single guide (sg)RNA et l’autre celle de l’endonucléase Cas9. La validation de cet outil génétique a été réalisée par le knock-out du locus PFR2 codant une protéine flagellaire. Dans un second temps, nous avons fait évoluer le CRISPR/Cas9 vers un système inductible pour réaliser les knock-out et des étiquetages au locus endogène de protéines d’intérêt. Nous avons utilisé ce nouveau système pour étudier la fonction de deux protéines potentiellement impliquées dans le complexe de reconnaissance des origines de réplication. Malgré une fuite du système, nous avons pu réaliser le KO des gènes Orc1b et Orc1/Cdc6 et suivre la progression du cycle cellulaire. Nous avons pu constater que la perte de ces gènes conduisait à un défaut de croissance ainsi qu’à l’apparition de cellules sans noyau. L’insertion d’une étiquette au locus endogène d’Orc1b nous a parmi de confirmer la localisation que nous avions obtenue avec une construction épisomale et va permettre d’étudier plus précisément le rôle de cette protéine.En conclusion, nous avons mis en évidence des paramètres de réplication originaux et démontré, en utilisant le CRISPR/Cas9, que les protéines Orc1b et Ocr1/Cdc6 étaient impliquées dans la duplication du noyau de Leishmania, ce qui est en accord avec leur rôle putatif dans la réplication de l’ADN
Leishmania, a protozoan parasite which causes a large range of diseases worldwide, is characterized by a constitutive 'mosaic aneuploidy', i.e. each cell in a population possesses a unique combination of mono-, di- and trisomies for each of its 36 heterologous chromosomes. Mosaic aneuploidy is generated and maintained via high rates of asymmetric chromosomal allotments during mitosis, leading to the gain or loss of whole chromosomes. This implies an unconventional regulation of the replication, followed by a permissive segregation.The main objective of this study was to unravel DNA replication dynamics and to map the replication initiation sites in Leishmania using DNA combing and ChIP-seq analyses. First, we have characterized DNA replication fork parameters. One of the major findings of this study was that Leishmania exhibits the fastest replication speed and the largest interorigin distances among the eukaryotes tested so far. We have also estimated that the Leishmania major genome possesses 168 origins of replication.To study the actors involved in DNA replication, we first had to develop novel genetic tools. The CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated endonuclease 9) system is a recently discovered powerful technique for genome editing. In order to adapt this system to Leishmania, we have chosen a two-plasmid strategy: one for the expression of the single guide (sg) RNA and a second for the expression of the endonuclease CAS9. The proof of concept has been based on the disruption of the paraflagellar rod-2 (PFR2) loci by the CRISPR-Cas9 system. In a second attempt, we have developed an inducible CRISPR-Cas9 system, both to obtain knock outs and to perform marker-free endogenous gene tagging. We used the system to investigate the function of Origin Recognition Complex proteins. Although the system was leaky, the genome was edited as expected. We thus deleted Orc1b and Orc1/Cdc6 and monitored the cell cycle progression of the parasite. We found that the depletion of these nuclear proteins lead to a growth defect and to the appearance of zoids (anucleated cells). The endogenous tagging of Orc1b confirmed the localization previously obtained using an episomal expression vector, and will allow further investigation on the role of this protein.In total, we have shown the presence of original replication dynamics parameters in Leishmania, and using CRISPR Cas9, we have demonstrated that Orc1b and Orc1/Cdc6 are involved in the nuclear duplication of Leishmania, in agreement with their putative in DNA replication

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Girard-Reydet, Claire. "Spécification endogène et expérimentale d'une origine de réplication chez l'eucaryote pluricellulaire". Montpellier 2, 2003. http://www.theses.fr/2003MON20138.

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Meisch, Françoise. "Mécanismes moléculaires de l'initiation de la réplication". Paris 7, 2010. http://www.theses.fr/2010PA077172.

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Resumen

Ma thèse a porté sur la régulation de l'initiation de la réplication chez les vertébrés. J'ai participé à l'identification et la caractérisation d'origines de réplication (ori) sur 1% du génome humain. Ces ori ont été identifiées dans des cellules HeLa grâce à la quantification de petits brins naissants, spécifiques de l'initiation de la réplication. Nous avons pu montrer qu'un lien fort existe entre les ori et les îlots CpG et que l'association des ori avec des marques de chromatine ouverte comme l'acétylation des histones n'est pas indispensable pour l'initiation. De plus, il n'y a pas de lien clair entre densité en ori et moment de réplication d'une région génomique donnée. Je me suis aussi intéressée à l'étape de licensing c. -à-d. La fixation au niveau des sites d'initiation potentiels du complexe de Pré-réplication (Pré-RC) avec en premier lieu ORC (Origin récognition complex). Le licensing s'effectue en phase Gl du cycle cellulaire et seuls les sites de fixation du Pré-RC peuvent être utilisés comme site d'initiation. Nous avons choisi de travailler avec la lignée aviaire DT40 qui effectue la recombinaison homologue à forte fréquence. J'ai donc construit des lignées qui expriment une protéine Orcl ou Orc2 étiquetée à partir du locus endogène. J'ai réalisé des immunoprécipitations de chromatine pour identifier leurs sites de fixation. Nous arrivons à avoir des enrichissements faibles mais cohérents de Orcl au niveau des ori connues du poulet. Comme les faibles enrichissements obtenus compliquent des approches plus globales, nous envisageons de répéter ces expériences sur des cellules en phase Gl, obtenues par élutriation, afin d'augmenter les enrichissements obtenus
My PhD focused on the molecular mechanisms governing initiation of DNA replication in vertebrates. I participated in the identification and characterization of origins of replication (ori) on 1% of the human genome. These ori have been identified in HeLa cells by quantification of short nascent strands, which are specific of replication initiation. We showed that a strong link exists between ori and CpG islands and that the association of ori with open chromatin marks like histone acetylation is dispensable for origin specification. Furthermore, no clear link emerges between ori density and the moment at which a genomic region replicates. I have also been interested in the licensing step which consists in the binding on the initiation sites of the Pre-replication complex (Pre-RC), in first place ORC (Origin recognition complex). Licensing takes place in the Gl phase of the cell cycle and only Pre-RC binding sites can be used as initiation sites. We chose to work with the avian DT40 cell line, able to perform homologous recombination at high frequency. I thus constructed cell lines which express tagged versions of the Orcl and Orc2 proteins and from the endogenous locus. I realized chromatin immunoprecipitations (ChIP) to identify their binding sites. We obtain small but coherent enrichments of Orcl at well known chicken ori. As these small enrichments complicate genome-wide approaches, we plan to repeat these experiments with elutriated cells in Gl phase in order to increase the ChIP enrichments

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Norais, Cédric. "Etude de la réplication de l'ADN chez l'archaea halophile Haloferax volcanii". Paris 11, 2007. http://www.theses.fr/2007PA112104.

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Resumen

J'ai étudié, durant mon travail de thèse, la réplication de l'ADN chez l'archaea halophile Haloferax volcanii. Le premier objectif de ma thèse était de mettre en place l'utilisation des outils génétiques disponibles chez H. Volcanii, dont la méthode de délétion de gène par intégration/excision de plasmide (pop-in/pop-out), pour un usage routinier au laboratoire. L'annotation partielle des gènes impliqués dans les mécanismes de réplication et réparation de l'ADN a permis d'identifier 16 protéines Initiator Cdc6/Orc1 putatives. L'utilisation des outils génétiques, combinée à une analyse des biais de représentation des nucléotides, nous ont permis d'identifier cinq origines de réplication. Le chromosome majeur possède au moins deux origines de réplication tandis qu'une autre est retrouvée sur les deux épisomes pHV1 et pHV4. L'activité in vivo de ces origines a pu être confirmée par cartographie des sites d'initiation de la réplication (RIP mapping) et par gel bidimensionnels d'ADN. L'étude des peptides interagissant avec PCNA nous a permis d'identifier que RnaseH interagit avec PCNA pour former un complexe inactif. Nos analyses génétiques chez H. Volcanii ont permis d'illustrer l'implication dans les processus de réparation de l'ADN des protéines Fen1 et de manière surprenante de RNAseH I et RnaseHII. Ces analyses ont montré que Fen1 intervient aussi dans la réplication de l'ADN. J'ai pu confirmer que les fragments d'Okazaki font moins de 200 bases et portent une amorce ARN synthétisée par la primase de type eucaryote PriS/L qui est essentielle chez H. Volcanii. En revanche, la primase de type bactérienne putative DnaG peut être inactivée, mais son rôle reste à caractériser. Mes travaux ont démontré qu'avec ses multiples réplicons et des outils génétiques efficaces permettant la caractérisation des gènes, H. Volcanii est un modèle novateur et pertinent pour l'étude de la réplication de l'ADN chez les archaea
During my doctoral work, I have studied DNA replication in the halophilic archaeon Haloferax volcanii. The first aim of this study was to establish the use of available genetic tools for H. Volcanii, including the pop-in/pop-out gene deletion system, for routine work at the laboratory. A partial annotation of the genes implicated in DNA replication and repair allowed the identification of 16 putative Initiator Cdc6/Orc1. The use of genetics combined with nucleotide skews analyses allowed the identification of five replication origins. The main chromosome carries at least two replication origins whereas another origin is used to replicate both pHV1 and pHV4. The in vivo activity of these origins could be confirmed by replication initiation point mapping and DNA two-dimensional gels. The study of PCNA interacting peptides revealed that archaeal RNAseH interacts with PCNA to form an inactive complex. Genetic analyses with H. Volcanii revealed the implication in DNA repair of Fen1 and surprisingly RnaseHI and RnaseHII. These studies also showed that Fen1 is required for DNA replication. I confirmed that H. Volcanii Okazaki fragments are less than 200 bases long and carry an RNA primer synthesized by the essential PriS/L eukaryotic-like primase. On the other hand, the putative bacterial-like primase DnaG can be deleted and its role remains to be characterized. My studies have demonstrated that with its multi-replicon structure and efficient genetic tools for gene characterization, H. Volcanii is a novel and pertinent model for the study of archaeal DNA replication

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Kirstein, Nina Danielle. "Chromatin-dependent pre-replication complex positioning and activation in mammals". Thesis, Montpellier, 2017. http://www.theses.fr/2017MONTT005/document.

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Resumen

Chaque division cellulaire requiert une duplication précise du génome. Des dizaines de milliers de sites d’initiation de la réplication d’ADN (origines de réplication) sont impliqués dans la réplication complète du génome humain. L’activation des origines de réplication est régulée précisément et des études génomiques extensives ont démontré la présence de caractéristiques génomiques associées à l’activation des origines de réplication. Le complexe de pré-réplication (pre-RC) est la base de l’initiation de la réplication et consiste en deux sous-complexes majeurs : l’ « origin recognition complex » (ORC) qui interagit directement avec l'ADN et est nécessaire pour recruter le second sous-complexe, les hélicases Mcm2 7, qui sont responsables de l'initiation de la réplication. La régulation de l’assemblage du pre-RC est bien étudiée, mais les caractéristiques de la chromatine qui déterminent le positionnement du pre-RC sur le génome restent peu connues. Les études génomiques par immuno-précipitation de la chromatine et séquençage à haut débit (ChIP-seq) des pre-RCs sont rares et jusqu’à aujourd’hui seulement disponibles pour ORC. Du fait que Mcm2-7 migre de son site de chargement initial, il est crucial d'obtenir des informations sur le positionnement des Mcm2-7 pour la compréhension complète de la régulation de la réplication. Ce travail présente la première analyse génomique par méthode ChIP-seq des deux sous-unités majeures du pre-RC, ORC et Mcm2-7, dans la lignée cellulaire de lymphome de Burkitt Raji infectée par le virus d’Epstein-Barr (EBV). La présence du génome d’EBV permet d'avoir un contrôle interne de la qualité de nos expériences, en comparant les positions de pre-RC déterminées avec des positions du pre-RC précédemment publiées. Sur le génome humain, les résultats de séquençage du pre-RC corrèlent bien avec des zones de réplication active. De façon intéressante, les zones de terminaison de la réplication étaient spécifiquement bas en pre-RC, spécialement en Mcm2-7. La localisation des sites d'initiation de la réplication identifiés est généralement bien corrélée avec les sites de transcription active. En effet, des sites d’assemblage du pre-RC de haute affinité sont localisés préférentiellement en voisinage de sites de transcription active, ce qui est possiblement dû à l’accessibilité de la chromatine dans ces régions. La fixation de Mcm2-7 fluctue de façon dépendante du cycle cellulaire, ce qui suggère des translocations de Mcm2 7 en G1, probablement dépendantes de la machinerie active de la transcription. Ces résultats indiquent que les positions de ORC et Mcm2-7 sont principalement dépendantes de l’accessibilité de la chromatine avec un accès privilégié dans la chromatine active et Mcm2 7 étant le déterminant majeur de l’initiation de la réplication. Au sein de l'hétérochromatine, ORC est enrichi dans des zones associées avec l'histone modifié H4K20me3. Cependant, cet enrichissement est moins important pour les Mcm2-7. En utilisant un système de réplication basé sur des plasmides, nous avons démontré que l’association d'ORC et H4K20me3 favorise l’assemblage du pre-RC et l’initiation de la réplication. Cette observation suggère que l’interaction ORC-chromatine est le déterminant majeur de la régulation de la réplication d’ADN au sein de l’hétérochromatine. En conclusion, cette étude propose deux mécanismes différents de la régulation de l'assemblage du pre-RC dépendants de l’environnement de la chromatine
With every cell division, the genome needs to be faithfully duplicated. Tens of thousands of DNA replication initiation sites (origins of replication) are involved in replicating the human genome. Origin activation is precisely regulated and extensive genome-wide studies found association of origin activation to several different genomic features. The pre-replication complex (pre RC) is the basis for replication initiation and consists of two major subcomponents: the origin recognition complex (ORC) binds DNA and is required for loading of the second component, Mcm2-7 helicases, which initiate DNA replication. Regulation of pre-RC assembly is well studied, however, chromatin features driving pre RC positioning on the human genome remain largely unknown. Genome-wide pre-RC chromatin immunoprecipitation experiments followed by sequencing (ChIP-seq) studies are rare and so far only performed for ORC. As Mcm2-7 can translocate from their initial loading site, information about Mcm2-7 positioning are required for full understanding of DNA replication regulation.This work presents the first genome-wide ChIP-seq analysis of the two major pre-RC subcomponents ORC and Mcm2-7 in the Epstein-Barr virus (EBV) infected Burkitt’s lymphoma cell line Raji. Successful ChIPs were validated on the EBV genome by comparing obtained pre RC positions with already existing pre-RC ChIP-on chip data. On the human genome, pre-RC sequencing results nicely correlated with zones of active replication. Interestingly, zones of replication termination were specifically depleted from pre-RC components, especially from Mcm2 7. Active DNA replication is known to correlate with active transcription. Indeed, strong pre-RC assembly preferentially occurred at sites of active transcriptional regulation, presumably determined by chromatin accessibility. Strong Mcm2-7 binding thereby fluctuated cell cycle-dependently, arguing for Mcm2-7 translocations during G1, possibly depending on the active transcriptional machinery. These results indicate ORC and Mcm2-7 positions being mainly dependent on chromatin accessibility in active chromatin, with Mcm2-7 being the major determinant of replication initiation. In heterochromatin, ORC was enriched at H4K20me3 sites, while Mcm2-7 enrichment was less prominent. Employing a plasmid-based replication system, ORC association to H4K20me3 was proven to promote successful pre-RC assembly and replication initiation, situating direct ORC-chromatin interactions being the major determinant for DNA replication regulation in heterochromatin. Taken together, this study proposes two different modes of pre-RC assembly regulation depending on chromatin environment

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Huvet, Maxime. "Rôle de la réplication dans l'évolution et l'organisation du génome humain". Paris 7, 2008. http://www.theses.fr/2008PA077032.

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Resumen

Bien que la position des gènes soit généralement considérée comme aléatoire dans les génomes eucaryotes, des groupes de gènes co-exprimés ont été mis en évidence pour divers organismes. Cependant, l'importance de ces groupes est controversée chez l'homme. Notre objectif est d'analyser l'organisation des gènes en fonction de leur distance aux origines de réplication. Nous nous sommes appuyés sur des résultats montrant l'existence d'un biais de composition nucléotidique réplicatif. Nous avons développé une méthode d'analyse multi-échelles du profil de biais de composition, basée sur la transformée en ondelettes. Un tiers du profil de biais humain est constitué de structures remarquables, les N-domaines, caractérisées par une paire de sauts ascendants (origines de réplication potentielles) encadrant un segment linéaire décroissant. Ces structures semblent avoir été conservées chez les mammifères et les oiseaux. L'analyse de données de chronologie de réplication confirme que les bords des N-domaines sont répliqués plus précocement que le centre. Autour de ces origines, les gènes sont nombreux, exprimés dans un grand nombre de tissus et co-orientées au sens de propagation des fourches de réplication. Ces caractéristiques diminuent avec la distance à l'origine. Cette organisation spécifique résulterait de contraintes sur l'initiation de la réplication et de la transcription, et de la minimisation de collision frontale entre ADN et ARN polymérases. Nos résultats permettent de proposer un nouveau modèle d'organisation des gènes chez l'homme, dans lequel la transcription, la réplication et la structure chromatinienne agissent de façon coordonnée sur l'architecture des génomes
Although genes are generally considered as randomly positioned in the genome, clusters of co-expressed genes have been identified in many organisms, from yeast to human. However, in human, the importance of these clusters is controversial. Our goal is to study human gene organisation according to replication origins. For this purpose, we based our study on previous results showing the existence of a nucleotide compositional asymmetry associated with replication. We developed a multi-scale methodology using the wavelet transform to analyse the profile of compositional asymmetries in the human genome. In one third of the genome, the skew profile is composed of structures, named N-domains, characterised by a pair of upward jumps framing a linearly decreasing segment. These jumps are associated with putative replication origins. These structures seem to have been conserved, during evolution, in mammals and birds. Analysis of replication timing data shows that in most cases, the N-domain borders are associated with replication initiation sites active in the early S phase. Around these origins, genes are abundant, broadly expressed, and co-orientated with the replication fork orientation. These properties decrease progressively with the distance to the closest putative origin. In the centre of N-domains, genes are rare and expressed in few tissues. This organisation likely results from constraints to reduce head-on collisions between the DNA and RNA polymerases. Our findings provide a new model of gene organisation in the human genome, which integrates transcription, replication, and chromatin structure as coordinated determinants of genome architecture

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Danis, Etienne. "Spécification d'une origine de réplication par des facteurs de transcription chez xenopus laevis". Montpellier 2, 2005. http://www.theses.fr/2005MON20026.

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Courbet, Sylvain. "Dynamique de la réplication et instabilité génétique chez les mammifères". Paris 6, 2008. http://www.theses.fr/2008PA066133.

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J’ai analysé la cinétique de re-programmation des paramètres de réplication en fonction de la taille des pools de nucléotides, ou en traitant les cellules avec de l’aphidicoline. J’ai ainsi pu démontrer que la densité des évènements d’initiation et l’efficacité relative des origines sont directement liées à la vitesse de progression des fourches de réplication. Plus précisément au niveau du locus AMPD2 du hamster Chinois, j’ai montré que la présence d’une origine de forte efficacité, oriGNAI3, reflête la chronologie d’activation des origines du locus. Ainsi, avec une progression des fourches rapide, le déclenchement de l’origine la plus précoce du domaine conduit à la réplication passive des origines voisines qui n’ont pas encore reçu le signal d’activation. De plus, j’ai pu mettre en évidence une corrélation entre la vitesse de réplication au cours d’une phase S donnée et la taille des boucles de chromatine lors de la phase G1 suivante. La taille de ces boucles est définie par l’espacement des séquences d’ADN ancrées à la matrice nucléaire. Les sites d’ancrage potentiels à la matrice (MARs) du locus AMPD2 colocalisent avec les origines de réplication cartographiées par peignage. J’ai montré que lorsque les fourches progressent à vitesse élevée et qu’oriGNAI3 est l’origine majeure du domaine, les boucles sont de grande taille et seule oriGNAI3 est attachée à la matrice. En revanche, lorsque les fourches progressent lentement et que les évènements d’initiation sont distribués de façon égale entre les 6 origines potentielles du locus, la taille des boucles diminue considérablement, et l’ensemble des origines apparaît ancré. Mes résultats offrent ainsi un nouvel éclairage sur les mécanismes contrôlant la hiérarchie des origines, qui reposerait sur leur affinité relative pour la matrice nucléaire, une structure cellulaire souvent considérée comme un support fonctionnel de la réplication.

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Brustel, Julien. "Principes de la régulation des origines de réplication par la lysine méthyltransférase PR-Set7". Thesis, Montpellier 1, 2012. http://www.theses.fr/2012MON13522.

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Resumen

La réplication de l'ADN au cours de la phase S est initiée au niveau de sites spécifiques, appelés origines de réplication, qui sont distribués de manière adéquate le long des chromosomes et actifs une seule fois par cycle cellulaire. Les mécanismes qui contrôlent la position des origines de réplication restent énigmatiques chez les mammifères. Les travaux réalisés pendant cette thèse révèlent que la lysine méthyltransférase PR-Set7 humaine, responsable de la mono-méthylation de la lysine 20 de l'histone H4, induit un réarrangement chromatinien au niveau des nombreuses origines de réplication des gènes actifs. Celui-ci est caractérisé par la mono- et tri-méthylation de la lysine 20 de l'histone H4 et la tri-méthylation de la lysine 4 de l'histone H3. Ce profil de méthylation d'histones constituerait un signal épigénétique pour le recrutement sur la chromatine des facteurs nécessaires à la formation des origines de réplication, indépendamment d'un rôle sur la transcription. En effet, la présence d'une forme active de PR-Set7 en amont d'un gène rapporteur est suffisante pour induire cette cascade de méthylation et la formation d'une nouvelle origine de réplication au niveau de ce gène sans en modifier son expression. De la même manière, l'inactivation de l'enzyme dans une cellule conduit à l'inverse à une diminution du nombre total d'origines sans un effet majeur sur l'expression des gènes. Lors de la phase S, PR-Set7 est dégradée via le complexe E3 ligase CRL4Cdt2 et la protéine PCNA. Cette dégradation permet la disparition au niveau de la chromatine du signal de formation des origines, s'assurant ainsi qu'elles sont actives une seule fois par cycle. La mutation du domaine d'interaction avec PCNA est suffisante en effet pour empêcher la dégradation de PR-Set7, entraînant alors la formation et activation répétées des origines pendant la phase S (phénotype de sur-réplication). Ces résultats établissent la cascade de méthylation initiée par PR-Set7 pendant la mitose comme le mécanisme épigénétique contrôlant la mise en place et l'activation d'au moins la moitié des origines de réplication chez les mammifères
In order to ensure accurate inheritance of genetic information through cell proliferation, chromosomes must be precisely copied once and only once and then correctly distributed to daughter cells. Chromosome replication occurs during the S phase of the cell cycle and is initiated at discrete chromosomal sites called replication origins. However, the ability to activate replication origins occurs during mitosis of the previous cell cycle and continuing into early G1 phase. This crucial step, called DNA replication licensing, consists of the assembly of a multi-protein pre-Replicative Complex (pre-RC) onto origins, making them competent for replication. During S phase, pre-RC are inhibited by different ways, that ensures that origins are activated only once per cycle and prevents DNA rereplication (multiple initiations from the same origin). In metazoans, functional replication origins do not show defined DNA consensus sequences, thus evoking the involvement of chromatin determinants in the selection of these origins.During my thesis, I have discovered that that the onset of licensing in mammalian cells coincides with an increase in histone H4 Lysine 20 monomethylation (H4K20me1) at replication origins by the methyltransferase PR-Set7. By genome mapping of H4-20me1 signals during the cell cycle, we found that nearly half of origins that fire during S phase are associated with H4-K20me1 during mitosis, when the process of replication licensing is activated. This mitotic H4-K20me1 signature is highly significant for origins located near transcription start sites and promoters that are characterized by the presence of CpG islands and H3-K4me3 signals. Furthermore, tethering PR-Set7 methylase activity to an origin-free genomic locus is sufficient to promote a chromatin remodeling follow by a creation of a functional origin of replication and promotes replication initiation. PR-Set7 and H4K20me1 are cell-cycle regulated, with high levels during M and early G1 and very low in S phase. At the onset of S phase, PR-Set7 undergoes an ubiquitin-mediated proteolysis, which depends on its interaction with the sliding-clamp protein PCNA and involves the ubiquitin E3 ligase CRL4-Cdt2. Strikingly, expression of a PR-Set7 mutant insensitive to this degradation causes the maintenance of H4K20me1 and repeated DNA replication at origins. This photolytic regulation controls the initiation of replication origin.This suggests that a cascade of lysine methylation events, initiated by PR-Set7 during mitosis, would define the position of origins in open chromatin structures

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Wang, Weitao. "Genome-Wide Mapping of Human DNA Replication by Optical Replication Mapping Supports a Stochastic Model of Eukaryotic Replication". Electronic Thesis or Diss., Université Paris sciences et lettres, 2021. http://www.theses.fr/2021UPSLS048.

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Resumen

La réplication de l'ADN est régulée par l'emplacement et le moment de l'initiation de la réplication. Par conséquent, beaucoup d'efforts ont été investis dans l'identification et l'analyse des sites d'initiation de la réplication dans les cellules humaines. Cependant, la nature hétérogène de la cinétique de réplication eucaryote et la faible efficacité de l'utilisation du site d'initiation individuelle chez les métazoaires a rendu difficile la cartographie de l'emplacement et du moment de l'initiation de la réplication dans les cellules humaines. Une solution potentielle au problème de la cartographie de la réplication humaine est l'analyse dans les molécules uniques. Cependant, les approches actuelles ne fournissent pas le débit requis pour les expériences à l'échelle du génome humaine. Pour relever ce défi, nous avons développé la cartographie de réplication optique (Optical Replicaiton Mapping - ORM), une approche de molécule unique à haut débit pour cartographier l'ADN nouvellement répliqué, et l'avons utilisée pour cartographier les événements d'initiation précoce dans les cellules humaines. La nature de molécule unique de nos données, et une couverture totale de plus de 2000 fois du génome humain sur 27 millions de fibres d'une longueur moyenne d'environ 300 kb, nous permettent d'identifier les sites d'initiation et leur probabilité d’initiation avec une grande confiance. En particulier, pour la première fois, nous sommes en mesure de mesurer à l'échelle du génome humain l'efficacité absolue de l'initiation de la réplication. Nous constatons que la distribution de l'initiation de la réplication humaine est cohérente avec l'initiation inefficace et stochastique de complexes d'initiation potentiels distribués de manière hétérogène enrichis en chromatine accessible. En particulier, nous constatons que les sites d'initiation de la réplication humaine ne sont pas limités à des origines de réplication bien définies, mais sont plutôt répartis sur de larges zones d'initiation constituées de nombreux sites d'initiation. De plus, nous ne trouvons aucune corrélation des événements d'initiation entre les zones d'initiation voisines. Bien que la plupart des événements d'initiation précoce se produisent dans les régions à réplication précoce du génome, un nombre significatif se produit dans les régions tardives. Le fait que les sites d'initiation dans les régions tardive aient une certaine probabilité d’initiation au début de la phase S suggère que la principale différence entre les événements d'initiation dans les régions à réplication précoce et tardive est leur probabilité intrinsèque d’initiation, et n’est pas due à une différence qualitative dans leur distribution de temps d’initiation. De plus, la modélisation de la cinétique de réplication démontre que la mesure de l'efficacité d’initiation de la zone d'initiation au début de la phase S suffit pour prédire le temps d’initiation moyen de ces zones tout au long de la phase S, ce qui suggère en outre que les différences entre les temps d’initiation des zones d'initiation précoce et tardive sont quantitatives plutôt que qualitatives. Ces observations sont cohérentes avec les modèles stochastiques de la régulation de l'initiation et suggèrent que la régulation stochastique de la cinétique de réplication est une caractéristique fondamentale de la réplication chez eucaryotes, conservée de la levure à l'homme
DNA replication is regulated by the location and timing of replication initiation. Therefore, much effort has been invested in identifying and analyzing the sites of human replication initiation. However, the heterogeneous nature of eukaryotic replication kinetics and the low efficiency of individual initiation site utilization in metazoans has made mapping the location and timing of replication initiation in human cells difficult. A potential solution to the problem of human replication mapping is single-molecule analysis. However, current approaches do not provide the throughput required for genome-wide experiments. To address this challenge, we have developed Optical Replication Mapping (ORM), a high-throughput single-molecule approach to map newly replicated DNA and used it to map early initiation events in human cells. The single-molecule nature of our data, and a total of more than 2000-fold coverage of the human genome on 27 million fibers averaging ~300 kb in length, allow us to identify initiation sites and their firing probability with high confidence. In particular, for the first time, we are able to measure genome-wide the absolute efficiency of human replication initiation. We find that the distribution of human replication initiation is consistent with inefficient, stochastic initiation of heterogeneously distributed potential initiation complexes enriched in accessible chromatin. In particular, we find sites of human replication initiation are not confined to well-defined replication origins but are instead distributed across broad initiation zones consisting of many initiation sites. Furthermore, we find no correlation of initiation events between neighboring initiation zones. Although most early initiation events occur in early-replicating regions of the genome, a significant number occur in late replicating regions. The fact that initiation sites in typically late-replicating regions. The fact that initiation sites in typically late-replicating regions have some probability of firing in early S phase suggests that the major difference between initiation events in early and late replicating regions is their intrinsic probability of firing, as opposed to a qualitative difference in their firing-time distributions. Moreover, modeling of replication kinetics demonstrates that measuring the efficiency of initiation-zone firing in early S phase suffices to predict the average firing time of such initiation zones throughout S phase, further suggesting that the differences between the firing times of early and late initiation zones are quantitative, rather than qualitative. These observations are consistent with stochastic models of initiation-timing regulation and suggest that stochastic regulation of replication kinetics is a fundamental feature of eukaryotic replication, conserved from yeast to humans

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Guilbaud, Guillaume. "Etude du programme de réplication du génome humain par peignage moléculaire de l'ADN et séquençage massif". Paris 7, 2010. http://www.theses.fr/2010PA077104.

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La réplication du génome humain démarre à partir d'environ 30 000 origines dont la position et le moment de déclenchement sont peu connus. Des analyses bioinformatiques ont mis en évidence l'existence d'une asymétrie de la composition nucléotidique entre les brins répliqués de manière continue et discontinue. L'analyse du profil de ce biais se caractérise par une forme en N (N-domaines). Il a été proposé que les bords des N-domaines correspondent à des origines de réplication efficaces. L'inversion progressive du biais d'un bord à l'autre traduirait un changement progressif de l'orientation moyenne des fourches de réplication. Nous avons caractérisé la chronologie de la réplication par séquençage massif et avons interprété le profil obtenu à partir d'observations par peignage moléculaire de l'ADN. Nous avons établi que le génome se réplique à partir de zones d'initiation contenant des origines efficaces, déclenchées en début de phase S, et que cette réplication se propage par activation progressive d'origines adjacentes de plus en plus tardives, avec un taux d'activation qui augmente au cours de la phase S. Le profil temporel des N-domaines montre une forme en U, ce qui indique que leurs bords constituent des zones d'initiation précoces à partir desquelles la réplication se propage vers leur centre par activation consécutive d'origines plus internes. Le peignage moléculaire montre que les fourches se dirigeant vers le centre ou vers les bords des N-domaines parcourent des distances inégales, en raison de cette activation consécutive. Ce processus explique quantitativement le profil temporel et le profil de polarité des fourches de réplication au sein des N-domaines
Replication of the human genome starts at some 30. 000 origins whose position and timing of replication are not well known. Bioinformatic analyses have shown a nucleotide compositional asymmetry between the lagging and the leading replicating strands. The profile of this skew revealed that an important fraction of the genome is organized in 1Mb domains that show an N-shape (called N-domains). The skew profile of N-domain borders showed a sharp upward jump that was interpreted as the signature of highly efficient replication origins. The progressive inversion of the skew between two upward jumps suggested a progressive inversion of the average replication fork orientation. We determined the timing of replication for the whole human genome and then focused on N-domains. The timing profile was obtained by massive sequencing and interpreted using single DNA molecule replication patterns obtained by molecular combing of DNA. We show that replication begins at early replicating initiation zones containing efficient origins. Replication then propagates by progressive activation of neighbouring origins with an initiation rate that increases during S phase. The average N-domain timing profile shows a U shape, which indicates that their borders constitute early and efficient initiation zones from which replication progresses towards their centre by progressive activation of inner origins. Molecular DNA combing shows that replication forks moving toward the centre or the borders do not travel the same distance, due to this sequential activation. This process quantitatively explains the timing profile and the fork polarity profile within N-domains

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Guitton-Sert, Laure. "Identification de nouveaux mécanismes de régulation temporelle des origines de réplication dans les cellules humaines". Thesis, Toulouse 3, 2015. http://www.theses.fr/2015TOU30350/document.

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La duplication de l'ADN au cours de la phase S est initiée à partir de l'activation de plusieurs dizaines de milliers d'origines de réplication. La mise en place des origines a lieu au cours de la phase G1 sous la forme de complexe de pré-réplication (pré-RC) et leur activation est orchestrée par un programme spatio-temporel. La régulation spatiale détermine les origines qui seront activées et la régulation temporelle, ou timing de réplication, détermine le moment de leur activation. En effet, toutes ces origines ne sont pas activées en même temps durant la phase S : certaines origines seront activées en début de phase S, d'autre en milieu, ou d'autre à la fin. Ce programme est établi en tout début de phase G1, au " point de décision du timing ". C'est un programme très robuste qui signe l'identité d'une cellule, son état de différenciation et le type cellulaire à laquelle elle appartient. Il a aussi été montré qu'il est altéré dans des situations pathologiques, en particulier le cancer, sans qu'on ne comprenne très bien les raisons mécanistiques. De manière générale, les mécanismes moléculaires qui régulent le timing de réplication sont méconnus. Le premier volet de ma thèse a permis l'identification d'un nouveau régulateur du timing de réplication : il s'agit de l'ADN polymérase spécialisée Thêta. Recrutée à la chromatine très tôt en phase G1, elle interagit avec des composants du pré-RC, et régule le recrutement des hélicases réplicatives à la chromatine. Enfin, sa déplétion ou sa surexpression entraîne une modification du timing de réplication à l'échelle du génome. Dans la deuxième partie de ma thèse, j'ai exploré les mécanismes qui régulent ce programme temporel d'activation des origines suite à un stress réplicatif. J'ai identifié un mécanisme de régulation transgénérationnel inédit : la modification du timing de réplication de domaines chromosomiques ayant subi un stress réplicatif au cycle cellulaire précédent. Des cellules-filles issues d'une cellule ayant subi des problèmes de réplication dans des domaines fragiles (riches en AT, et donc potentiellement structurés, et pauvres en origines) présentent un timing plus précoce de l'activation des origines au niveau de ces domaines. Ce nouveau processus biologique d'adaptation est particulièrement intéressant dans un contexte tumoral de haut stress réplicatif chronique car ce pourrait être un moyen pour la cellule tumorale de survivre à son propre stress réplicatif mais aussi aux thérapies antitumorales qui sont nombreuses à cibler la réplication de l'ADN
DNA duplication in S phase starts from thousands of initiation sites called DNA replication origins. These replication origins are set in G1 as pre-replication complexes (pre-RC) and fired in S phase following a spatio-temporal program of activation. This program determines which origins will be fired and when. Indeed, all the origins are not fired in the same time and we can distinguish early, middle and late replication origins. This temporal regulation is called "replication timing" and is determined at the "timing decision point" (TDP) in early G1. It's a robust program, which participates to the definition of cell identity, in term of differentiation state or cell type. However, the precise molecular mechanisms involved are poorly understood. Defective timing program has been evidenced in pathological contexts, in particular in cancers, but the mechanisms of this deregulation remain unclear. In the first part of my PhD, I contributed to the discovery of a new regulator of the origin timing program: the specialized DNA polymerase Theta (Pol Theta). Pol Theta is loaded onto chromatin in early G1, coimmunoprecipitates with pre-RC components and modulates the recruitment of Mcm helicases at TDP. Moreover, depletion or overexpression of Pol Theta modifies the timing of replication at a fraction of chromosomal domains. The second part of my work aimed at exploring the mechanisms that regulates replication timing after a replicative stress. I identified a totally new transgenerational adaptive mechanism of DNA replication timing regulation: the modification of the timing of origin activation at chromosomal domains that have suffered from a replicative stress during the previous cell cycle. Daughter cells from a cell that has experienced replication stress at particular domains (late replicating domains, AT rich so they can form structured DNA, and poor in origin density) shows advanced origin activation within these regions. This new biological process in response to replicative stress could be of particular interest in the context of cancer since, tumor cells are characterized by high level of intrinsic chronic replicative stress. This new mechanism may favor cancer cell survival despite replication stress, particularly upon treatments with anti-tumor agents that target DNA

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Valton, Anne-Laure. "Identification de séquences cis-nucléiques nécessaires à l'initiation de la réplication chez les vertébrés". Paris 7, 2014. http://www.theses.fr/2014PA077025.

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Des études à large échelle dans des cellules humaines et de souris ont identifié un motif riche en G, ayant la possibilité de former un G-quadruplexe (G4), associé à la majorité des origines de réplication. Cependant les preuves expérimentales de la nécessité des G4s dans l'initiation de la réplication chez les vertébrés restaient inexistantes. Nos résultats montrent que l'activité de l'origine modèle βA est diminuée de façon drastique lorsque le motif G4 est supprimé montrant le rôle crucial de ce motif pour le réplicateur. Dans une nouvelle origine modèle med14, deux motifs G4 coopèrent pour initier la réplication. Des mutations ponctuelles dans le G4 de βA affectant à des degrés variés sa stabilité ont montré que l'efficacité de l'origine de réplication était fortement corrélée avec la stabilité du G4. De plus, l'orientation du G4 détermine le positionnement du site d'initiation de la réplication. L'ensemble de ces résultats suggère fortement l'implication de G4s dans l'initiation de la réplication. Enfin, le G4 n'est pas suffisant pour l'initiation de la réplication et nécessite la coopération d'une séquence nucléique adjacente de 200 pb contenant des sites de fixations pour des facteurs de transcription comme la boîte CCAAT. Pour conclure, nos données confirment le rôle crucial des G4s dans l'initiation de la réplication et montrent que ces éléments structuraux doivent coopérer avec des modules flanquants pouvant fixer des facteurs de transcription
Most origins of replication mapped in mouse and human cells are associated with a G-rich motif that can form a G-quadruplex (G4). However, experimental proofs showing whether G4 are necessary for replication initiation in vertebrates remained to be collected. To answer this question we used homologous recombination in avian DT40 cells to target at the same locus wild type and mutated versions of the chicken βA promoter/replicator that contains a characterized G4. The results were confirmed in a new mode) origin, the med14 promoter that contains two G4 motifs. Origin activities were quantified by qPCR on Small Nascent Strands (SNS) specific of replication origins and confirmed by a new method, developed in our laboratory, based on DNA replication timing. Origin activity is dramatically reduced after G4 deletion showing its critical role in origin selection. Moreover, the two G4 motifs cooperate to create an active med14 replicator. The probability to destabilize βA G4 by several point mutations inside the G4 is correlated with the efficiency of replication initiation proving that replicator needs G4. Moreover, G4 is not only necessary for replication initiation but also positions the replication start site. We demonstrated that the G4 is not sufficient for origin activity and cooperates with a flanking 200 bp cis-element that contains a CCAAT box and potential binding sites for factors. Taken together, our data confirm the important rote of G4 in origin selection and show that these elements cooperate with cis-elements that have the capacity to be bound by transcription factors

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Molle, Dorothée. "Les étapes tardives de la réplication rétrovirale : biogénèse, trafic et bourgeonnement du VIH-1". Montpellier 2, 2008. http://www.theses.fr/2008MON20036.

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Nassar, Joelle. "Caractérisation de la fonction de OBI1, une E3 ubiquitine ligase, dans la réplication de l'ADN". Thesis, Montpellier, 2019. http://www.theses.fr/2019MONTT039.

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La division cellulaire est l’un des processus cellulaires les plus complexes. Pour que cette division se déroule correctement, la cellule doit répliquer de manière fiable l’intégralité de son génome. Durant ce processus, la réplication de l’ADN est initiée a des sites prédéfinis du génome, appelés « origines de réplication ». Vu qu’un dysfonctionnement de l'activité des origines est lié à plusieurs pathologies humaines, leur activation doit être hautement régulée. Plusieurs protéines ont été trouvées aux origines de la réplication, mais aucune n’explique comment ces origines sont reconnues et sélectionnées pour l’activation. Notre groupe de recherche vise à comprendre comment les origines de réplication sont régulées dans les cellules de métazoaires. Dans ce but, une approche protéomique a été réalisée pour définir l'interactome des origines de réplication humaine, dans l’objectif d'identifier de nouveaux facteurs qui pourraient être impliqués dans la régulation des origines. À l'aide de cette approche, une nouvelle ubiquitine ligase, nommée OBI1 (ORC-ubiquitine-ligase-1), a été identifiée avant mon arrivée au laboratoire. OBI1 se lie au complexe de reconnaissance des origines (complexe ORC) et mon projet vise à mieux caractériser le rôle de cette nouvelle protéine dans la réplication de l'ADN. Notre stratégie expérimentale est basée sur deux modèles différents: un modèle in vivo de cellules humaines en culture et un système de réplication de l'ADN in vitro dérivé d'œufs de Xénope.Nos analyses sur des cellules humaines ont d’abord révélé qu’OBI1 était crucial pour la prolifération cellulaire. Cette observation a été ensuite attribuée à son rôle dans la réplication de l’ADN et plus précisément dans l’activation des origines de réplication. En effet, la déplétion d’OBI1 a montré une diminution de recrutement à la chromatine de facteurs impliqués dans l’activation des origines. De plus, une analyse fonctionnelle a montré qu'OBI1 multiubiquitine ORC3 et ORC5, deux sous-unités du complexe ORC. Cette ubiquitination a été ensuite liée au rôle d’OBI1 dans l’activation des origines de réplication, après que la surexpression des mutants ORC3 / 5 non-ubiquitinables ait donné des résultats similaires à ceux observés lors de la déplétion d’OBI1. Dans l’ensemble, nos résultats ont démontré qu’OBI1 est une protéine essentielle à l’activation des origines et nous ont permis de mettre en place une hypothèse suggérant qu’en ubiquitinant ORC3/5, OBI1 pourrait jouer un rôle dans la sélection des origines destinées à l’activation, parmi toutes les origines définies antérieurement. Après cette étude, maintenant publiée, nous avons voulu aborder le rôle de la multiubiquitination des ORC dans l’activation des origines. Nos expériences préliminaires suggèrent un rôle de l'histone acétyl-transférase (HAT) GCN5 / KAT2A.Dans la deuxième partie de mon projet, nous avons utilisé le système in vitro, basé sur des extraits d'œufs de xénope, pour étudier le rôle de l'OBI1 et de l'ubiquitination dans l'activation des origines de réplication. Nos analyses ont confirmé la conservation d’OBI1 chez Xenopus Laevis et son recrutement a la chromatine lors de la réplication. Nous avons montré que l'ubiquitination se produit sur la chromatine lors de l'activation de l'origine. De plus, en utilisant des inhibiteurs de E1, nous avons constaté que l’ubiquitination est importante pour l’activation des origines. De façon intéressante, la déplétion de OBI1 dans ce système embryonnaire a suggéré un rôle diffèrent d’OBI1 dans l’activation des origines dans le système embryonnaire comparé aux conditions plus somatiques.Finalement, la découverte de ce nouveau facteur d'initiation a fourni des informations essentielles sur le rôle de l'ubiquitination et d’OBI1 dans l'activation et la sélection des origines de réplication. Une telle sélection pourrait également participer à la régulation du « timing » de la réplication de l'ADN
Cell division is one of the most complex processes a cell undergoes. For this to happen properly, the genetic material stored in a cell must be faithfully copied or replicated. During this process, DNA replication is initiated at pre-defined sites in the genome, called "origins of replication". The activation of these origins is highly regulated, as a dysfunction in origin activity is linked to several human pathologies. Several proteins have been found at replication origins, but none of them explain how to be activated origins are recognized and selected. Our research group aims to understand how DNA replication origins are regulated in metazoan cells, to this aim, a proteomic approach was performed to define the interactome of human replication origins. Our goal was to identify new factors that could be involved in replication origin regulation. Using this methodology, a novel E3 ubiquitin ligase, named OBI1 (for ORC-ubiquitin-ligase-1), was identified prior to my arrival in the laboratory. OBI1 binds the origin recognition complex (ORC complex) and my project aimed at further characterizing the role of this new protein in DNA replication. Our experimental strategy used two different model systems: an in-vivo model based on human cells in culture, and an in-vitro DNA replication system derived from Xenopus eggs.Our analyses in human cells revealed that OBI1 was a crucial gene involved in cellular proliferation, this observation was later attributed to OBI1’s role in DNA replication and more specifically, to replication origin activation. Indeed, OBI1 knockdown resulted in a deficient origin firing and a decrease in the chromatin recruitment of factors involved in origin firing. A further functional analysis showed that OBI1 multiubiquitylates two subunits of the ORC complex, ORC3 and ORC5. This ubiquitylation was directly linked to OBI1’s role in origin firing, after the over-expression of non-ubiquitylable ORC3/5 mutants yielded similar results to OBI1’s knock down. Altogether, our results demonstrated that OBI1 encoded for a protein essential for origin activation, and allowed us to propose its main role: by multiubiquitylating a subset of the ORC complex, OBI1 could select the replication origins to be activated amongst all the potential replication origins set in G1 phase of the cell cycle. After this set of experiments, now published, we wanted to address the mechanistic impact of the multiubiquitylation of ORC on origin activation. Our preliminary experiments suggest a role of the histone acetyl-transferase (HAT) GCN5/KAT2A in the “OBI1 pathway”In the second part of my project, we used the in vitro DNA replication system, based on Xenopus laevis egg extracts, to study the role of OBI1 and ubiquitylation in origin activation. Our in-vitro analyses confirmed the conservation of OBI1 in Xenopus Laevis and its recruitment to the chromatin during DNA replication. We showed that de novo ubiquitylation takes place on chromatin during origin activation. Moreover, using E1 inhibitors, we found that active ubiquitylation is important for efficient origin firing. Interestingly, our loss of function experiments suggested that OBI1’s impact on origin activation could defer in early development when compared to somatic-like conditions.Taken together, the discovery of this new replication initiation factor provided key information on the role of ubiquitylation in general and OBI1 in particular on origin activation and selection. Such selection could participate as well in the regulation of the timing of DNA replication

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Tourrette, Yves. "Sélection et analyse de remaniements chromosomiques chez Saccharomyces cerevisiae en contexte diploi͏̈de : Origine des délétions et des translocations réciproques". Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2004. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2004/TOURRETTE_Yves_2004.pdf.

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Les réarrangements chromosomiques de type translocation, délétion et duplication de séquences sont un moteur essentiel de l'évolution des génomes eucaryotes, mais sont également impliqués dans le phénomène d'oncogenèse chez les eucaryotes supérieurs pluricellulaires. Pour les étudier, nous utilisons un crible de sélection positive en contexte diploïde chez un organisme modèle, la levure hémiascomycète Saccharomyces cerevisiae. Nous avons isolé 39 révertants diploïdes dont certains contiennent des duplications intra ou interchromosomiques ou bien des délétions, événements déjà observés en phase haploïde. Nous avons également isolé d'autres réarrangements spécifiques du contexte diploïde : une délétion segmentale de 128,3 kb, une délétion homozygote, une translocation réciproque et une délétiontranslocation réciproque. L'analyse génétique a montré que 15 événements provoquent un caractère létal à l'état haploïde. En phase diploïde nous pouvons donc observer des événements variés et complexes dont certains sont impossibles à observer en phase haploïde. L'analyse des jonctions des délétions a permis de caractériser trois classes en fonction des séquences en répétition directe (microhomologies) qui se trouvaient aux bornes de la région délétée : la classe I présente des microhomologies de 8 à 13 bp, la classe II ne possède aucune séquence de ce type et la classe III, spécifique du contexte diploïde, montre des microhomologies de 1 à 4 bp. Les mêmes types de séquences sont trouvées aux jonctions des translocations réciproques. Ces résultats suggèrent un mécanisme de recombinaison entre courtes séquences en répétition directe dans la genèse des délétions et des translocations réciproques. Nous avons ensuite étudié l'implication du NHEJ et de la recombinaison homologue dans l'apparition de ces événements. Ceci nous a conduit à l'hypothèse d'un mécanisme, RAD52 - indépendant, mais dépendant de la voie de la recombinaison homologue pour les délétions de classe I
Genomic rearrangements such as chromosomal translocation, deletion and duplication are essential for evolution of eukaryotes genomes, but are also involved in oncogenesis phenomena in pluricellular organisms. In order to study these events, we use a positive selection screen in a diploid context with the hemiascomycet yeast model Saccharomyces cerevisiae. We obtained 39 diploid revertants containing intra- or interchromosomal duplications or deletions, events ever observed in haploids. We have also selected other rearrangements that are specific to diploids: a 128,3 kb segmental deletion, a homozygous deletion, a reciprocal translocation and a deletion-reciprocal translocation. The genetic analysis has shown that 15 events induce a lethal character in haploid context. The diploid state allow us to observe different and complex events which can't be observed in haploid context. The analysis of deletions allowed us to characterize three classes of deletions depending on short DNA direct repeats (microhomologies) that are located on the junctions of the deleted regions: the class I shares 8 to 13 bp long microhomologies, the class II doesn't have this type of sequences and the class III, that is diploid specific, shows the presence of 1 to 4 bp long microhomologies. The same types of sequences are found to the junctions of reciprocal translocations. These results suggest a recombination mechanism between short DNA direct repeats in the occurence of deletions and reciprocal translocations. Finally, we have tested the involvement of the NHEJ and the homologous recombination pathways in the appearance of these events. According to the results, we conclude that the class I deletions, are produced by a RAD52 -independent mechanism, but are dependent of the homologous recombination pathway

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Hassan, Zadeh Vahideh. "Rôle de l'insulateur 5'HS4 du poulet dans la régulation de la réplication". Paris 6, 2009. http://www.theses.fr/2009PA066172.

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L’ADN est répliqué selon un programme spatio-temporel. Je me suis intéressée à la régulation de ce programme. Pour cela, j’ai utilisé le locus -globine du poulet. Il porte un insulateur (5’HS4) et quatre origines de réplication. Mon projet consistait à étudier le rôle de 5’HS4 dans l’activité et le moment d’activation de ces origines. 5’HS4 est important dans la mise en place des domaines de transcription et des corrélations avaient été trouvées entre les domaines de réplication et de transcription. Pour tester l’hypothèse selon laquelle cet insulateur joue un rôle dans la régulation de la réplication, j’ai travaillé sur des lignées 6C2 transgéniques portant une de ces origines () flanquée par des copies de 5’HS4. J’ai montré que cette origine est un réplicateur. Contrairement à son moment d’activation, la séquence de l’origine est suffisante pour spécifier une origine de réplication. J’ai montré aussi que les insulateurs flanquants dictent une activation précoce de l’origine.

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Kahli, Malik. "Implication des protéines HMGA et HMGA2 dans les changements du programme de réplication au cours de la sénescence cellulaire". Thesis, Montpellier 2, 2011. http://www.theses.fr/2011MON20059/document.

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La sénescence, considérée comme étant un arrêt irréversible du cycle cellulaire, se caractérise par des changements drastiques de l'expression génique et de l'organisation de la structure de la chromatine. En effet, il se forme des foyers denses d'hétérochromatine au sein du noyau (SAHF) et ces modifications s'accompagnent d'un déclin progressif de la capacité à dupliquer le génome. Au cours de ma thèse, j'ai voulu savoir si ces modifications de la chromatine induite par les SAHF pouvaient influer sur le programme de réplication et changer la distribution des origines de réplication sur le génome au cours du processus d'entrée en sénescence réplicative des cellules. Nous avons donc, dans un premier temps, comparé par peignage moléculaire de l'ADN réplicatif la distribution des origines de réplication de cellules primaires prolifératives et sénescentes. Nous avons également cartographié l'ensemble de leurs origines de réplication sur la totalité du génome en purifiant les brins naissants aux origines de réplication que nous avons couplé à une analyse de séquençage à haut débit.Les protéines HMGA1 et HMGA2 étant des éléments précurseurs essentiels à la mise en place des SAHF, nous avons créé des lignées cellulaires qui, en sur-exprimant de façon inductibles ces protéines, induit une sénescence prématurée. Nous avons réalisé le même type d'analyses sur ces cellules afin de mettre en évidence le rôle de ces protéines dans les modifications du programme de réplication que nous avons observé au cours de l'entrée en sénescence de ces différents types cellulaires
Senescence, considered as an irreversible cell cycle arrest, is characterized by dramatic changes in genes expression and chromatin organisation forming dense heterochromatic foci (SAHF). These changes are concomitant to a progressive decline of the capactity to replicate the genome. My PhD topic was to investigate whether the chromatin changes induced by SAHF formation could influence the replication program and modify the origin distribution along the genome at replicative senescence. We first compared the origin distribution of proliferative and pre-senescent primary fibroblasts by DNA molecular combing. Then, we mapped the origins positions in whole human genome by using the nascent strand purification assay coupled to deep sequencing.As HMGA1 and HMGA2 proteins are essential to induce SAHF formation, we designed inducible cell lines wich overexpress these proteins, triggering premature senescence. We made the same type of experiments in these cell lines in order to investigate the implication of these proteins on the changes of the replication program we observed during senescence

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Laurent, Marc. "Rôle des G-quadruplexes dans la spécification des origines de la réplication chez les vertébrés". Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2016. http://www.theses.fr/2016USPCC162/document.

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Resumen

Les origines de réplication sont les sites à travers le génome où est initiée la synthèse de l’ADN. Les multiples cartographies des origines de réplication dans des cellules de vertébrés ont identifié une association entre origines de réplication et motifs G4. Les motifs G4 sont des séquences ayant le potentiel de se replier en G-quadruplexe. Des travaux menés précédemment au laboratoire ont montré que la capacité d’un motif G4 à se replier en G-quadruplexe est essentielle pour l’activité de deux origines de réplication modèles dans la lignée cellulaire de poulet DT40. Cependant, le motif G4 n’est pas suffisant pour spécifier une origine de réplication. Dans l’origine modèle βA, un élément cis de 227 pben 3’ du motif G4 est également nécessaire pour l’initiation de la réplication. L’analyse de la séquence de cet élément indique qu’il comporte plusieurs motifs connus pour être des sites de fixation de facteurs de transcription. Nous avons testé le rôle potentiel de ces motifs en évaluant l’effet de leurs délétions individuelles sur l’activité de l’origine βA. Ces travaux ont identifié les boites TATA et CCAAT, pouvant être liées par le facteur TBP (TATA Binding Protein) et NFY (Nuclear Factor Y) respectivement, comme étant les éléments cruciaux avec le motif G4 pour l’initiation de la réplication. Nous avons cherché à éclaircir de quelle manière ces éléments permettent la spécification d’une origine de réplication. A cet effet, nous avons émis l’hypothèse selon laquelle les motifs G4 qui se trouvent au niveau des origines de réplication sont ceux qui in vivo sont capables de former un G-quadruplexe. La formation du G-quadruplex dans l’origine βA dépendrait alors de la présence des boites TATA et CCAAT qui peuvent recruter des facteurs de transcription favorisant l’ouverture de la double hélice de l’ADN et le repliement du G-quadruplex. Cette hypothèse prévoit que la stabilisation d’un G-quadruplexe in vivo est nécessaire et suffisante pour former une nouvelle origine de réplication. Nous avons donc testé cette hypothèse de deux manières. D’abord, nous avons entrepris de stabiliser un G-quadruplex à une position donnée du génome en induisant la transcription d’un motif G4. Ensuite, nous avons déterminé les effets d’une stabilisation globale des G-quadruplexes à travers le génome sur la position des origines de réplication. Pour cela, nous avons cartographié les origines de réplication dans des lignées de cellules DT40 dans lesquelles des facteurs impliqués dans la linéarisation des G-quadruplexes ont été inactivés. Selon notre hypothèse, en l’absence de tels facteurs, comme l’hélicase FancJ ou l’ADN polymérase translésionnelle Rev1, davantage de motifs G4 pourraient se replier et former une origine de réplication. Les résultats obtenus avec chacune des deux approches indiquent que la stabilisation de G-quadruplexes ne permet pas de produire de nouvelles origines de réplication. L’ensemble de nos données indique que l’activité de l’origine βA dépend d’un motif G4 et des boites TATA et CCAAT. La manière par laquelle l’ensemble de ces éléments permettent l’initiation de la réplication reste à éclaircir
Replication origins are the position where DNA synthesis is initiated. Mapping of replication origins across the genome showed a link between origins and G4 motifs. G4 motifs are sequences the potential for forming G-quadruplexes. Works carried out previously in the laboratory showed that the ability to fold into G-quadruplex is critical for the activity of two model origin in the DT40 cell line. However, the G4 motif is not enough to specify a replication origin. In the βA model origin, a 227 bp cis element is required for the initiation of replication. The analysis of this sequence indicates the presence of several motifs known to be binding sites for transcription factors. We tested the potential roles of these motifs by evaluating the effect of their individual deletion on the activity of the βA origin. This work identified the TATA and CCAAT boxes who bind TBP (TATA Binding Protein) and NFY (Nuclear Factor Y) respectively as the crucial elements, with the G4 motifs, pour the initiation of replication.We endeavored to shed light on the manner by which these elements enable the specification of a replication origin. We hypothesized that the G4 motifs associated with replication origins are those able to form a G-quadruplex in vivo. The formation of the G-quadruplex of the βA origin would require the presence of the TATA and CCAAT boxes who could recruit transcription factors facilitating the opening of the double helix and G-quadruplex folding. We tested this hypothesis by two different manners. First, we undertook to stabilize a G-quadruplex at a given position in the genome by inducing the transcription of a G4 motif. Then, we observed the effects of a genome wide stabilization of G-quadruplexes on the position of replication origins. For that, we mapped replication origins in DT40 cell lines in which factors implicated in G-quadruplex linearization are inactivated. According to our hypothesis, without such factors, like the FancJ helicase of the translesional DNA polymerase Rev1, more G4 motifs could fold into G-quaduplexes and specify replication origins

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Levac, Pascale. "Études des origines de réplication chromosomiques [sic] chez les eucaryotes". Thesis, National Library of Canada = Bibliothèque nationale du Canada, 1997. http://www.collectionscanada.ca/obj/s4/f2/dsk3/ftp04/nq25435.pdf.

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Petit, Julie. "Conséquences d'un défaut de licensing des origines de réplication sur la stabilité du génome chez la levure Saccharomyces cerevisiae". Thesis, Montpellier 2, 2011. http://www.theses.fr/2011MON20130/document.

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Resumen

L'instabilité chromosomique, marque des cellules tumorales, peut trouver sa source dans un défaut d'initiation de la réplication. Ceci a été illustré chez la levure Saccharomyces cerevisiae et concorde avec l'observation de mutations de régulateurs de la transition G1/S dans un grand nombre de tumeurs. Toutefois, les mécanismes par lesquels cette instabilité survient n'ont pas encore été clairement définis. Pour résoudre cette question, nous avons utilisé le mutant de levure cdc6-1 où la formation des complexes pré-réplicatifs est graduellement affectée avec l'augmentation de la température. Nous avons mis en évidence que l'allongement de la durée de la réplication qui en suit induit des cassures de l'ADN (DSB) seulement à l'entrée en mitose. Par combinaisons de mutants, nous avons vu que la condensation des chromosomes est en partie responsable de ces DSB. Ces DSB sont signalées à la cellule via la protéine Rad9, protéine adaptatrice du checkpoint de dommages à l'ADN. De façon concordante, nous avons observé une activation de la protéine effectrice de ce checkpoint Rad53 à l'entrée en mitose. La viabilité des cellules cdc6-1 repose sur les protéines de checkpoint Chk1 et Rad53 ainsi que sur la présence de cohésines et des topoisomérases Top2 et Top3. Selon nous, la réplication prolongée par diminution du nombre d'origines n'est pas détectée par les cellules comme un stress réplicatif. Lors de l'entrée en mitose, la condensation des chromosomes transformerait les fourches de réplication en structures reconnues et clivées par les nucléases Mus81-Mms4 et Yen1, qui sont activées en mitose, dirigeant ces régions sous-répliquées vers la réparation par recombinaison. Ce sont les coupures induites en mitose, non la progression des fourches, qui activent le checkpoint. Nous proposons que la sous-réplication de segments d'ADN consécutive à un défaut de licensing des origines favorise la recombinaison non homologue et génère l'instabilité chromosomique, à l'image des sites fragiles communs qui sont le siège de remaniements récurrents lors de la cancérogenèse
Chromosome instability (CIN), a hallmark of cancer cells, can take its roots in the G1 phase of the cell cycle, when replication origins are licensed. This has been illustrated in the yeast Saccharomyces cerevisiae and is consistent with the fact that a vast number of tumors presents mutations in G1/S transition regulators. However the mechanisms by which this instability occurs are still not well established. Using the yeast cdc6-1 mutant in which preRC formation can be decreased gradually with temperature, we show that cells replicating from fewer origins undergo massive DNA double-strand break (DSB) formation in mitosis. Blocking mitotic entry by Swe1 overexpression or Clb1-4 depletion, and inactivation of Cdc5 (Polo) both suppress DSB formation in cdc6-1 cells, demonstrating that DSBs do not stem from collapsed forks but are actively induced during mitosis. DSB formation is dependent on chromosome condensation and the Mus81-Yen1 structure-specific endonucleases. These DSBs then trigger the Rad9 DNA damage checkpoint. Accordingly, Rad53 phosphorylation is detected only after entry into mitosis. We propose that cells replicating their DNA from fewer origins enter mitosis undetected, then condense their chromosomes and cleave unreplicated regions by Mus81-Yen1 for repair by recombination. The viability of cdc6-1 cells at semi-permissive temperature relies on Chk1 and Rad53, as well as on cohesins and topoisomerases Top2 and Top3. Cleavage of under replicated DNA segments in mitosis may favor non-homologous repair pathways leading to chromosome rearrangements, as seen for common fragile sites that co-localize with recurrent breakpoints in cancer

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Gregoire, Damien. "Spécification des origines de réplication au cours de la différenciation cellulaire". Montpellier 2, 2006. http://www.theses.fr/2006MON20073.

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Gay, Sophie. "Mécanismes impliqués dans le contrôle de l'initiation de la réplication chez les mammifères". Paris 6, 2010. http://www.theses.fr/2010PA066284.

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Resumen

La réplication est une étape clef du cycle cellulaire au cours de laquelle l'ADN est dupliqué une fois et une seule. Chez les mammifères, de nombreuses origines potentielles sont présentes le long du génome mais les mécanismes qui contrôlent leur localisation et leur efficacité sont mal compris. Durant ma thèse, j'ai tout d'abord montré que la vitesse de progression des fourches de réplication contrôle la densité en origines de réplication actives et leur sélection parmi l'ensemble des origines possibles. La sélection de l'origine majeure passe par une localisation préférentielle à la matrice nucléaire durant la phase G1. J'ai également montré que le niveau d'acétylation des histones n'est associé ni à la localisation, ni à l'efficacité des origines de réplication situées dans des régions riches en gènes. En revanche, l'inhibition des desacétylases par des drogues, comme la trichostatine A conduit à une modification de la dynamique de réplication. L'hyperacétylation provoquée entraine une diminution de l'expression de deux enzymes impliquées dans les voies de biosynthèse des dNTP, la thymidylate synthase et la CTP synthetase. Cette diminution d'expression induit une diminution de la quantité de dCTP et dTTP disponible dans la cellule, une diminution de la vitesse de réplication et une augmentation du nombre d'origines actives. Ces résultats réconcilient des données contradictoires présentes dans la littérature et pose la question de l'existence d'une nouvelle voie de contrôle de la dynamique de réplication par l'acétylation

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Rodriguez, Martinez Marta. "Genome-wide identification and characterization of C. elegans DNA replication origins during development". Thesis, Montpellier 2, 2013. http://www.theses.fr/2013MON20189.

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La réplication de l'ADN chez les eucaryotes commence lorsque le complexe de reconnaissance de l'origine (ORC) se lie à l'ADN puis recrute les facteurs nécessaires à la duplication du génome. Bien que les mécanismes biochimiques et les facteurs impliqués dans l'initiation de la réplication semblent être conservés, les séquences d'ADN (les origines de réplication) sur lesquelles ces événements ont lieu ne le sont pas. L'ensemble des données connues suggèrent fortement un rôle prépondérant de la mise en place des origines de réplication dans la structuration du génome et l'organisation des autres processus cellulaires lors de la différenciation. Comprendre la coordination de ces processus in vivo et au cours du développement est primordial pour déchiffrer la régulation cellulaire dans son contexte réel. Le modèle du développement embryonnaire du nématode C.elegans constitue un outil génétique de premier choix pour l'étude de la mise en place des origines de réplication au cours du développement. Au cours de ma thèse, j'ai dû premièrement développer une technique de culture de C.elegans synchronisée en grosse échelle, afin d'obtenir le matériel nécessaire pour identifier les origines de réplication. Cette technique nous a aussi permis de caractériser, pour la première fois, la croissance synchronisée en bioréacteur d'un métazoaire. D'autre part, l'étude des origines de réplication a révélé une distribution hétérogène des origines de réplication dans les chromosomes qui corrèle avec des domaines de certaines marques épigénétiques, une corrélation avec des séquences d'ADN capables de former des structures cruciformes de l'ADN, ainsi comme une confirmation de la corrélation avec la transcription. Nous avons aussi vu que la corrélation de origines de réplication avec des CpG, est fortement établie après le début de la gastrulation, et que l'association avec des éléments fonctionnels spécifiques du génome, comme les operons, est perdu une fois la transcription embryonnaire deviens nécessaire après la gastrulation. L'ensemble de résultats suggèrent fortement un changement dans l'organisation des origines de réplication après gastrulation, qui corrèle avec des éléments fonctionnels du génome
Eukaryotic DNA replication begins when the origin recognition complexes (ORC) binds to DNA and recruits the necessary factors for genome duplication. Even though, biochemical mechanisms as well as the factors involved seem to be well conserved, the DNA sequences (replication origins) where these events take place are not. The known data strongly suggest that replication origins establishment may play an important role in genome structuring as well as in the organization of other cellular processes during cell differentiation. To understand how these processes are coordinated in vivo and during development, is essential for deciphering cellular regulation in its real context. C.elegans embryonic development is a genetic tool of first choice for studying replication origins in vivo and their correlation with other genome features and processes during development.During my thesis and with the aim of obtaining enough material for the replication origins identification method, I've had to develop a new technique of synchronized high-scale liquid culture of the nematode C.elegans. This technique has allowed the characterization for the first time of the synchronize growth of a metazoan in bioreactor. Furthermore, the study of replication origins has revealed a heterogenic distribution of replication origins along chromosomes that correlates with specific epigenetic marks. Moreover, replication origins are strongly associated with specific DNA structures able to form cruciforms, and we have confirmed the correlation of replication origins and transcription. This study also show that the association of replication origins with CpGs is greatly increased after gastrulation, and that the association with some genetic elements, such as operons, is reduced after gastrulation begins. Taken together these results show a change of replication origins before and after cell differentiation during embryonic development that correlate with functional genome elements

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Persillon, Cécile. "Construction d'un vecteur d'expression épisomal stable dans des cellules de lépidoptère. Isolement et caractérisation d'une séquence permettant sa réplication". Toulouse, INSA, 1993. http://www.theses.fr/1993ISAT0040.

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Dans le domaine du genie genetique, la mise au point de vecteurs d'expression stables pour les cellules eucaryotes superieures est une necessite. La construction d'un vecteur de type minichromosome pour des cellules de lepidopteres a donc ete envisagee. Pour cela, une origine de replication, un centromere et des promoteurs etaient necessaires. Les promoteurs precoces du baculovirus qui dependent de l'arn polymerase ii cellulaire, ont ete choisis. Pour isoler une origine de replication cellulaire, un plasmide (pie1neo) permettant l'expression du gene resistance a la neomycine a ete construit et des fragments d'adn cellulaire y ont ete inseres au hasard. Apres transfection, seules les cellules transformees avec un plasmide portant une origine de replication devaient donner des clones resistants stables. Or, tous les plasmides y compris pie1neo ont donne lieu a des clones resistants. Il est montre que pie1neo se replique dans les cellules d'insecte sous forme d'un episome concatemerique de haut poids moleculaire (300kpb). L'origine de replication est localisee dans la partie 3' du gene precoce iel du baculovirus. L'episome est stable pendant au moins 300 generations en l'absence de pression de selection ce qui indique une segregation tres efficace lors de la mitose

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Labit, Hélène. "Régulation de l'initiation de la réplication chez les vertèbrés : analyse du programme temporel d'activation des origines de réplication dans les extraits d'oeufs de xénope". Paris 7, 2007. http://www.theses.fr/2007PA077176.

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Chez les vertébrés, l'activation des origines de réplication est soumise à une régulation spatiale et temporelle. Dans les embryons précoces de xénope, les origines sont positionnées sans aucune spécificité de séquence et sont activées en clusters à différents moments de la phase S. L'objectif principal de ce travail a consisté à caractériser cette régulation temporelle en analysant d'une part, l'activation des origines au sein de fibres individuelles d'ADN, et d'autre part, la distribution des foyers de réplication au sein de noyaux de spermatozoïde incubés dans des extraits d'œufs de xénope. Grâce à la technique de peignage moléculaire, nous avons comparé la distribution des origines de réplication au début de deux phases S consécutives. L'absence de coïncidence « temporelle » entre les origines démontre que le moment d'activation des origines ne dépend pas de la position génomique et qu'il n'existe pas de régulation épigénétique du moment de réplication à l'échelle des origines. Cependant l'observation d'une coïncidence entre les foyers utilisés au début de deux cycles consécutifs suggère qu'une organisation chromosomique pourrait influencer le moment de réplication. L'analyse de la réplication de l'ADN ribosomique par FISH a fourni un exemple de domaine chromosomique répliqué plus tardivement que l'ADN génomique global. Une structure chromatinienne particulière pourrait expliquer ce retard. Par ailleurs, la fréquence d'initiation à ce locus est deux fois plus faible dans l'espaceur intergénique très riche en G+C que dans la région codante. Au sein de ce locus, il pourrait donc exister des facteurs locaux influençant le positionnement des origines de réplication
In Vertebrates, replication origins are activated according to a spatial and temporal program. In early Xenopus embryos, origins are located at apparently random sequences and are activated in clusters that fire at different times throughout S phase. The main object of the present work is to characterize the temporal regulation of replication in Xenopus egg extracts through analysis of origin activation on single DNA fibers and replication foci distribution in sperm nuclei. Using molecular combing of DNA, we compared the distributions of replication origins fired at the beginning of two following S phases. Absence of significative coincidence between origins shows that the temporal order of replication does not depend on genomic position. Furthermore, no epigenetic central regulates the moment of origin firing. However the detection of coincidence between replication foci labeled at the beginning of two following S phases suggests that the chromosomal organization may influence the replication timing. Using FISH, we showed that the replication of the ribosomic DNA is delayed compared to the replication of whole genomic DNA. An altered chromatin structure may be responsible for this delay. Mapping of origins revealed that initiation frequency is two fold lower in the G+C rich intergenic spacer than in the coding rDNA sequence. At the rDNA, local parameters such as nucleotide composition may influence the localization of replication origins

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Velilla, Fabien. "Identification à l'échelle du génome des séquences d'ADN liés à la matrice nucléaire et leurs relations avec la réplication de l’ADN". Thesis, Montpellier 2, 2012. http://www.theses.fr/2012MON20184.

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Les chromosomes sont organisés en plusieurs niveaux hiérarchiques de repliements de la chromatine. Cette organisation spatiale de la chromatine dans le noyau a été impliquée dans la régulation de nombreux processus cellulaires comme la réplication ou la transcription. En effet, différentes expériences suggèrent que la chromatine est organisée en boucles, dont les bases seraient maintenues attachées ensemble, formant une structure qui serait un soutien structurel de la chromatine.Mon projet de thèse a visé à identifier les séquences d'ADN constituant la base de ces boucles de la chromatine par hybridation sur puces. Notre étude a été réalisée sur des MEF asynchrones et synchronisées en G0/G1 afin d'établir la dynamique des MARs au cours du cycle cellulaire.Nos résultats montrent que les MARs constituent des grands domaines, qui sont associés de façon significative avec les domaines d'ADN liées à la Lamine B1 et les domaines tardifs du timing de réplication. L'analyse des MARs ayant été réalisée sur des MEFs synchronisées en G0, les domaines de timing seraient donc déjà définis en G0/G1. L'analyse de plusieurs marques des histones suggère que les MARs sont associées à la chromatine transcriptionnellement inactive. En parallèle, nous avons réalisé une analyse protéomique de la matrice. Celle-ci a permis de valider notre approche expérimentale mais nous a aussi donné l'opportunité de caractériser la matrice nucléaire d'un point de vue protéique.L'ensemble de nos résultats révèle que les séquences d'ADN liées à la matrice nucléaire constituent une zone de répression, tant au niveau transcriptionnel que réplicatif
Chromosomes are organised into several hierarchical levels of chromatin compaction. This spatial organization of chromatin in the nucleus has been involved in regulating many cellular processes such as DNA replication and transcription. Indeed, different experiments suggest that chromatin is organized in loops, whose bases are kept attached together, forming a structure, often called the nuclear matrix, acting as a structural support of the chromatin. My project was to identify the DNA sequences that belong to the bases of these chromatin loops. Matrix-attached regions (MARs) were mapped by hybridization on microarrays. This study was performed on asynchronous as well as G0/G1-phase synchronized MEFs to establish the dynamics of MARs during the cell cycle. MARs were found in megabase-sized domains, with sequences significantly related to previously-published Lamin B1 associated domains and replication timing domains. Since our analysis of MARs was performed on G0-synchronized MEFs, our data strongly suggest that the timing domains might already be defined in G0/G1. Analysis of several histone marks suggested that MARs were associated with transcriptionally-repressed chromatin. In parallel, we also performed a proteomic analysis of our matrix preparations, and found known "matrix-attached" proteins, thus validating our experimental approach, plus other components that permitted a better characterization of the nuclear matrix. Taken together, our results show that DNA sequences bound to the nuclear matrix constitute a repressive zone, at the transcription and replication levels

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Nicolas, Armel. "AAv, HSV, cellule : interactions au coeur de la réplication d'un parasite original". Lyon, Ecole normale supérieure, 2010. http://www.theses.fr/2010ENSL0604.

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La réplication du virus défectif AAV nécessite un virus "auxiliaire" (HSV, Ad). Nous avons cherché à préciser les résultats d’études anciennes qui suggéraient qu’il pourrait se répliquer sans virus auxiliaire dans des cellules soumises à divers stress, sans jamais observer une réplication nette. Nos données suggèrent que la réplication rapportée précédemment serait due à la synergie entre les stress et des facteurs viraux transformants. Nous avons ensuite étudié l’interaction entre l’AAV et son virus auxiliaire HSV. Nous avons premièrement précisé les fonctions auxiliaires fournies par des facteurs de l'HSV a priori impliqués dans la réplication de l’AAV ; nous avons ensuite purifié et identifié par MS/MS les facteurs cellulaires et de l’HSV associés à Rep lors de cette réplication. Nous avons montré qu’au moins 10 facteurs herpétiques ont une activité auxiliaire vis-à-vis de l’AAV, et identifié environ 50 facteurs cellulaires potentiellement impliqués dans la réplication de l’AAV
The replication of the defective parvovirus AAV depends on a co-infecting “helper” virus (HSV, Ad). We tried to precise the results of previous studies that had suggested that AAV could replicate without a helper virus in cells exposed to diverse stresses, but we never observed a clear AAV replication. Our data suggest that the replication previously described was due to the synergy between stresses and transforming viral factors. We then studied the interaction between AAV and its helper virus HSV-1. We first precised the helper functions provided by several HSV-1 factors a priori involved in AAV replication; we then purified and identified by MS/MS the cellular and HSV factors associated with Rep during AAV replication. We showed that at least 10 HSV-1 factors participate to its helper effect for AAV, and identified about 50 cellular factors potentially involved in AAV replication

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Delabaere, Laetitia. "Réplication, condensation et division des chromosomes parentaux dans le zygote de drosophile". Thesis, Lyon 1, 2014. http://www.theses.fr/2014LYO10280/document.

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Chez les animaux, la conformation unique du noyau du spermatozoïde dont la chromatine est organisée avec des protéines chromosomiques spécifiques telles que les protamines le rend totalement inactif. Le remodelage de la chromatine paternelle à la fécondation par des activités d'origine maternelle sont donc des processus essentiels à la formation d'un embryon diploïde, dont les mécanismes restent très mal connus. Lors de ma thèse j'ai essayé de mieux comprendre ces processus par l'étude, chez la drosophile, d'un mutant létal embryonnaire à effet maternel : maternal haploid (mh). Ce mutant affecte l'incorporation des chromosomes paternels à la première division zygotique menant à la formation d'embryons haploïdes gynogénétiques. L'identification du gène de mh comme CG9203 m'ont permis de caractériser sa fonction. Dans les œufs mh, les chromosomes paternels se condensent anormalement et ne parviennent pas à se diviser correctement lors de la première mitose de l'embryon. Récemment, des études sur son orthologue humain, appelé Spartan/DVC1, ont montré qu'il était impliqué dans la synthèse translésionnelle (TLS), un mécanisme de tolérance aux dommages d'ADN. J'ai pu démontrer que dans les cellules somatiques, la fonction de Spartan dans le TLS est conservée chez la drosophile. Cependant, la fonction maternelle de MH ne relève pas du TLS canonique, mais permet de maintenir l'intégrité de l'ADN paternel avant la réplication. Ensemble, mes travaux soulignent la singularité du pronoyau mâle et la complexité que présente le maintien de son intégrité à la fécondation
In animals, sexual reproduction requires the union between two distinct parental gametes: the spermatozoon and the oocyte. The unique nuclear conformation of the sperm, in which the chromatin is organized with sperm-specific chromosomal protein like protamines, abolishes its activity. The paternal chromatin remodeling and the maintenance of its integrity at fertilization by maternal activities are therefore essential processes for zygote formation. However, although their mechanisms are crucial, they remain poorly understood. During my thesis, I tried to better understand the processes involved during de novo paternal chromatin assembly in Drosophila through the study of a maternal embryonic lethal mutation: maternal haploid (mh). The mutant affects the incorporation of paternal chromosomes during the first zygotic division, leading to the development of gynogenetic haploid embryos. The identification of the mh gene as CG9203, and the generation of the null allele mh2 allowed me to characterize its function. In eggs led by mh mutant females, paternal chromosomes abnormally condense and fail to divide leading to the formation of chromatin bridges at the first embryonic division. Recently, its human ortholog Spartan/DVC1, has been described to be involved in translesion synthesis (TLS), a DNA damage tolerance pathway that ensures replication fork progression. Combining genetic and cytological approaches, I demonstrated that the Spartan function in TLS is conserved in Drosophila. However, I discovered that the critical function of MH during the first embryonic division, was not consistent with a canonical TLS. Alternatively, it is specifically required to maintain paternal integrity and to allow its proper replication at the first cycle. The mh phenotype characterization, led me to compare it with others phenotypes induced by the knock-down of replication factors and to study parental chromosome condensation in the zygote. Surprisingly, one of the proteins allowing the establishment of the pre-replication complex is dispensable for the proper paternal chromosome segregation contrarily to the maternal counterpart. Altogether, these works highlight the difference that exists between the two parental pronuclei and the complexity of maintaining their integrity at fertilization

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Piot, Barbara. "Rôle de la topoisomérase II dans la mise en place du programme d'activation des origines de réplication de l'ADN". Paris 6, 2012. http://www.theses.fr/2012PA066266.

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La topoisomérase II (topo II) est une enzyme essentielle des cellules grâce à sa capacité unique à démêler l’ADN. Dans les extraits interphasiques d’œufs de xénope, où les origines de réplication s’activent par groupes de 5 à 10 tout au long de la phase S, nous avons mis en évidence un nouveau rôle majeur de la topo II en phase G1 pour contrôler le programme d’activation des origines via la quantité de MCM2-7 chargés. La quantité d’hélicases chargées sur la chromatine ayant été corrélée avec l’efficacité des origines (Wyrick J. J. Et al. 2001) et avec le moment d’activation des origines (Yang S. C. Et al. 2010), nous apportons une information clé quant au mécanisme de régulation du programme d’activation des origines. D’autres protagonistes ont récemment été identifiés au cœur de ce mécanisme, comme Rif1 (Hayano M. Et al. 2012) et Fkh1/2 (Knott S. Et al. 2012). De plus, nos résulats suggèrent que l’ICRF-193 ralentit la réplication en piégeant la topo II sur l’ADN, ce qui induirait un ralentissement des fourches et une gêne à l’activation des origines
DNA replication is a complex process that follows an established origin activation program. We demonstrate here that topoisomerase II (topo II) is involved in the establishment of this origin activation program. In interphase xenopus egg extracts, inhibition of topo II by ICRF-193, a drug that traps topo II as closed clamps on DNA, slows down fork progression and delayes origin clusters activation. This was not due to S phase checkpoint activation and only seen if the drug was added during the pre-replicative phase. If added later, during S phase, ICRF-193 does not have effects on DNA replication anymore. Opposite effects of topo II immunodepletion and topo II inhibition indicate that the slower replication with ICRF-193 is not due to topo II catalytic inhibition but to the topo II clamps on DNA that creates obstacles against fork progression. Topo II immunodepletion accelerates S phase by accelerating the activation of origin clusters without altering inter-origin distances. Add-back of recombinant topo II negates these effects. Topo II depletion increases the loading of MCM proteins during origin licensing. Addition of ICRF-193 in G1 does not affect MCM loading. We conclude that i) topo II activity is not required for S phase progression; ii) topo II acts non-catalytically in G1 to cluster origins that undergo reduced MCM loading and thus fire late in S phase; iii) ICRF-193 addition in G1 creates obstacles to origin cluster activation and fork progression, not because of topo II catalytic inhibition, but due to formation of topo II clamps. Topoisomerase II dynamic in G1 phase is important for the determinism of replication origin efficiency

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Jouanin, Lise. "La transformation par Agrobacterium rhizogenes : étude des plasmides de deux souches à agropine et de la structure de l'ADN-t dans des plantes transformées". Paris 11, 1986. http://www.theses.fr/1986PA112046.

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Agrobacterium rhizogenes, par l'intermédiaire de son plasmide Ri (pour root-inducing) est responsable du syndrome du "hairy root" sur certaines plantes. La souche HRI possède un seul plasmide (pRiHRI) tandis que la souche A4 en possède trois (pArA4a, pRiA4 et pArA4c). Les plasmides de ces deux souches à agropine ont été clonés dans un cosmide. PRiHRI (254 kb) et pRiA4 (250 kb) sont les plasmides responsables de la transformation génétique des cellules végétales. Leurs cartes de restriction sont très semblables, en particulier dans les régions dont les fonctions sont connues: région transférée (T), région de virulence et origine de réplication. PArA4a (180 kb)et pRi A4 possèdent une région commune qui permet d'expliquer la possibilité de recombinaison de ces deux plasmides pour former le coïntégrat pArA4c (430 kb)Les origines de réplication de pArA4a'et pKiA4 (ou pRiHRI)ne présentent pas d'homologie de séquence et sont compatibles avec tous les plasmides d'Agrobacterium tumefaciens Les régions impliquées dans la réplication ont été cartographiées et des cosmides navettes (10,9 kb et 8,1 kb)ont été construits chez E. Coli ; ces vecteurs sont maintenus dans Agrobacterium de manière très stable, même en absence de sélection. L'organisation de l'ADN transféré lors de la transformation a été analysée dans quelques plantes transformées (Convolvulus arvensis, Nicotiana plumbaginifolia, Nicotiana tabacum et Brassica napus); l'ADN-T se compose de deux parties: TL et TR, non contigues sur le plasmide Ri. L'ADN-TL a une taille d'environ 20 kb, avec des frontières paraissant fixes pour toutes les plantes étudiées à l'exception du tabac où il est toujours plus court. L'ADN-TR a une taille beaucoup plus variable de 0 à environ 30 kb. Il contient les gènes de synthèse de la mannopine et de l'agropine et une région pas toujours intégrée, homologue aux gènes de l'ADN-T de pTi, responsables de la synthèse d'auxine, dans les cellules transformées. Le nombre de copies de l'ADN-Test variable de 1 à 4 et certaines copies d'ADN-TL et TR peuvent être adjacentes dans le génome de la plante, avec inversion de la région TR par rapport à son orientation vis-à-vis de la région TL sur le plasmide. Une banque dans le phage Charon 4A de l'ADN d'un clone transformé de C. Arvensis (clone 7) a été réalisée, et des phages recombinants contenant différentes parties de l'ADN-T de la plante ont été sélectionnés. La comparaison des séquences des régions frontières dans ces clones avec la séquence déjà déterminée de la région TL dans pRiA4, a permis de montrer que la partie TL intégrée dans le génome végétal est bordée dans le plasmide par deux séquences très homologues à celles observées aux frontières de la région-T chez A. Tumefaciens. Les possibilités d'utilisation du plasmide Ri comme pour la transformation des plantes supérieures sont vecteur de génie génétique discutées en conclusion
Agrobacterium rhizogenes has the ability to induce hairy root, by inserting part of its root-inducing plasmid (pRi) in the plant genome. Plasmids of agropine-type A. Rhizogenes strains HKI (one plasmid, pRiHRI) and A4 (three plasmids, pArA4a, pRiA4 and pArA4c) were cloned in the cosmid PHDG262 and the libraries obtained were used to establish the restriction maps of the plasmids. The pRiHRI (254 Kb)and pRiA4 (250 kb)maps are very quiet similar and are identical in the regions where functions have been localized: T-region, virulence region and origin of replication. PArA4a (1 0 kb) and pRiA4 nave one identical region which can explain their ability to cointegrate to form pArA4c (430 kb). The origins of replication of pRiHRI and pArA4a were localized precisely, they are not homologous and are compatible with A. Tumefaciens plasmids. Cosmids containing them were used to construct vectors able to replicate in both E. Coli and Agrobacterium. These vectors are maintained stably in Agrobacterium even without selection pressure. The T-UNA structure was studied in regenerated transformed plants (Nicotiana plumbaginifolia, Nicotiana tabacum, Brassica napus and Convolvulus arvensis). The T-DNA consists of two parts: TL and TR which are not contiguous on the Ri plasmid. In all plants studied, except N. Tabacum where it is smaller, the size of the TL-DNA is constant (19-20 kb), while the size of the TR-DNA is variable (0 to 30 kb). The TR region includes the agropine synthesis genes and a region homologous to the tms genes in pTi; this last region is not always transferred to the plant genome. The copy number varies from one to four copies and some TL and TR copies are linked in the plant genome. A library of a transformed C. Arvensis plant was constructed in Charon 4A and recombinant phages including parts of the T-DNA were selected. The nucleotide sequences of the frontier regions of the TL-DNA were determined in both the plasmid and in the phages. Two direct repeats of 25 bp, highly homologous to those observed in Ti plasmids were found in pRi, at or near the TL-DNA borders. The TR-DNA is inverted in the plant genome, as compared to its orientation relative to the TL-DNA position in the Ri plasmid. The use of the Ri plasmid as a vector for genetic engireering of higher plants is discussed in conclusion

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Lebofsky, Ronald. "Réplication de l'ADN et instabilité génomique dans les cellules humaines : activité des origines et progression des fourches dans un locus répété et un locus simple". Paris 6, 2005. http://www.theses.fr/2005PA066601.

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Thomas, Mélissa. "Origins of Cellular Lethality Resulting From a Defect in Homologous Recombination in Human Cells". Thesis, université Paris-Saclay, 2021. http://www.theses.fr/2021UPASL027.

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La recombinaison homologue (RH) est impliquée dans la réparation des cassures double brin à l'ADN, et dans la gestion des fourches de réplication bloquées. Rad51 et BRCA2 en sont deux protéines pivots.J'ai montré que l'inhibition de la RH ainsi que la surexpression de Rad51 sont létales dans les cellules humaines, mais qu'un faible nombre de cellules arrivent à survivre. De plus, dans plusieurs cancers, les gènes de la RH sont mutés (BRCA1/2 dans les cancers du sein et de l'ovaire) ou la surexpression d'un gène de la RH est observée. Mon projet a pour but d'identifier les mécanismes et les causes de la létalité induite par une dérégulation de la RH dans les cellules humaines, ainsi que de comprendre comment certaines cellules arrivent à y survivre. L’analyse du cycle cellulaire et du marquage Histone H3 phosphorylée a révélé que les cellules humaines inactivées pour la RH ou surexprimant RAD51 s’accumulent à la transition G2/M. Parallèlement la vidéomicroscopie a suggéré que les cellules mourraient par apoptose, ce qui a été corroboré par des expériences utilisant l'Annexin-V comme marqueur d’apoptose et par des Western-Blot. Les Western Blots montrent que le checkpoint G2/M est activé, via l'analyse de la cyclineB1 et de cdk1, et que l'apoptose est déclenchée, via l'analyse du clivage de PARP. Mon hypothèse principale de travail étant que la surexpression d'un dominant négatif de Rad51 et possiblement la surexpression du Rad51 WT, entraîne des défauts de réplication dont l'accumulation entraînerait une activation du checkpoint. Des expériences d'incorporation de BrdU et de peignage moléculaire sont venus confirmer mon hypothèse : dans les cellules ayant une dérégulation de la RH, la vitesse de réplication est diminuée et il y a plus de fourches bloquées. Des analyses in-silico ont révélées que les cancers mutés dans la RH sont fréquemment co-mutés dans des gènes impliqués dans le checkpoint G2/M ou dans le redémarrage des fourches. Une liste de gènes candidats, enrichie de résultats de séquençages de fibroblastes de patients FANCD1, a été testée, confirmant l'analyse in-silico
Homologous recombination (HR) is involved in repairing DNA double strand breaks, and in protecting and restarting stalled or collapsed replication forks. Rad51 and BRCA2 are two key proteins of HR. I have showed that inhibiting HR, as well as over expressing Rad51, is lethal in human cells, although a very few cells still survive the inhibition. Moreover, many cancers carry mutations in an HR gene (BRCA1/2 in breast and ovary cancers) or over express an HR gene. My project aims to identify the mechanisms and the causes behind the lethality triggered by a dysregulation of HR, and to understand how a few cells manage to survive it. I have determined, through FACS and phosphorylated histone H3 labeling (IF), that HR deficient human cells, or those over expressing Rad51, accumulate at the G2/M checkpoint.At the same time, time-lapse microscopy experiments seemed to indicate that the cells died from apoptosis, which was confirmed by data from experiments using Annexin-V as an apoptosis marker and from Western-Blots. Western-Blots showed that the G2/M checkpoint is activated, through analysis of CyclinB1 and of cdk1, and that apoptosis is triggered, through analysis of PARP cleavage. My main working hypothesis was that overexpressing a dominant negative form of Rad51, and possibly also overexpressing Rad51 WT, would lead to replication defects, whose accumulation would in turn lead to an activation of the checkpoint. BrdU incorporation experients and use of the molecular combing technique confirmed this hypothesis : in HR-dysregulated cells, replication speed is slowed down and there are more stalled forks. In-silico analyses have showed that HR-mutated cancers often carry a second mutation in another gene, involved in either the G2/M checkpoint or in restarting stalled replication forks. Based on these analyses and on results from RNAseq experiments performed on FANCD1 patients' fibroblasts, candidate genes have already been listed, confirming the in-silico analysis

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Al, Ahmad Nachar Baraah. "Capacité de synthèse d’ADN réduite et allongement de la phase S sont une propriété des cellules tumorales liée à un raccourcissement de leur phase G1". Thesis, Montpellier, 2020. http://www.theses.fr/2020MONTT028.

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L’instabilité chromosomique est une propriété cardinale des tumeurs solides dont on connait encore mal l’origine. Les travaux pionniers effectués au laboratoire ont montré, dans le système modèle levure, que l'activation précoce des kinases CDK et la formation d’un nombre insuffisant d'origines de réplication (‘licensing’) en G1 conduisent à une extension de la phase S et à des remaniements chromosomiques en mitose. La plupart des cellules cancéreuses ayant des altérations génétiques ou épigénétiques d’un ou plusieurs régulateurs G1/S du cycle cellulaire qui peuvent entraver la formation des origines, j’ai analysé à l’aide de nouvelles techniques la dynamique de réplication de l’ADN dans 14 lignées de cellules cancéreuses épithéliales humaines, comparativement à celle de fibroblastes humains normaux. Mes résultats montrent que toutes les lignées cancéreuses testées ont une phase S plus longue (10-29h) que les cellules non transformées (7-9h). Les cellules cancéreuses ont aussi une densité instantanée globale de fourches de réplication (GIFD) plus faible, partiellement compensée pour certaines lignées par une vitesse de fourche (FV) accrue. Je définis la force de réplication (RP = GIFD x FV) comme un nouveau descripteur de la capacité des cellules à synthétiser l'ADN, qui intègre ce mécanisme de compensation et qui est systématiquement plus faible pour les lignées cancéreuses.Les conséquences de cette phase S allongée sur le cycle cellulaire et la mitose ont été évaluées par microscopie 4D. J’ai détecté une synthèse d’ADN en mitose (MiDAS) et des défauts de ségrégation des chromosomes dans les cellules cancéreuses non exposées à des perturbateurs de la réplication, indiquant la présence une instabilité chromosomique (CIN) constitutive. Un traitement avec des doses faibles de palbociclib, un inhibiteur des kinases de G1 CDK4/6, restaure une GIFD et durée de phase S normales dans des cellules cancéreuses pRb+. Nos données indiquent que la majorité des cellules tumorales peinent à dupliquer leur génome à cause d’une réduction de nombres d’origines actives, et que ceci pourrait être le déclencheur principal de leur instabilité génomique. Elles ouvrent aussi de nouvelles pistes pour le dépistage précoce ou le traitement des cancers
Why solid tumours show high chromosome instability is still poorly understood. Seminal work in the host lab has shown in the yeast model system that precocious CDK activation and reduced origin licensing in G1 cause S-phase extension and chromosome rearrangements in mitosis. Since most cancer cells have genetic or epigenetic alterations in one or more G1/S cell cycle regulators that can impede origin licensing, we analysed chromosome replication dynamics in fourteen human epithelial cancer cell lines using newly developed techniques, and compared it to normal human fibroblasts, mammary and retinal pigment epithelial cells. Our results show that all cancer cells spend longer time in S phase (10-29h) than untransformed cells (7-9h). Interestingly, most cancer cell lines displayed a lower global instant density of replication forks (GIFD), partly compensated for some cell lines by increased fork velocity (FV). We define replication potency (RP = GIFD x FV) as a new descriptor of cells’ capacity to synthesize DNA that integrates this compensation mechanism, and found that it was lower for cancer cell lines.The consequences of this longer S phase on the cell cycle and mitosis were assessed by 4D microscopy. We detected mitotic DNA synthesis (MiDAS) and chromosome segregation failures in cancer cells not treated with replication drugs, indicating constitutive chromosome instability (CIN). Importantly, the low GIFD and long S phase of pRb+ cancer cells was reversed by slightly extending G1 using low dose of the CDK4/6 inhibitor Palbociclib. Our data strongly suggest that S-phase extension due to lowered origin licensing in G1 is a common feature and perhaps the main trigger for the genomic instability in cancer cells

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Ciardo, Diletta. "Quantitative analysis of the regulation of the DNA replication program by the intra-S phase checkpoint in Xenopus embryos Checkpoint control of the spatio-temporal regulation of DNA replication in Xenopus early embryos Polo-like kinase 1 (Plk1) is a positive regulator of DNA replication in the Xenopus in vitro system On the Interplay of the DNA Replication Program and the Intra-S Phase Checkpoint Pathway Genome wide decrease of DNA replication eye density at the midblastula transition of Xenopus laevis Polo like kinase 1 promotes dispersed replication origin firing during S phase". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019SACLS478.

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Dans les organismes multicellulaires, plusieurs millier d’origines initient la réplication de l'ADN. Elles sont regroupées en domaines qui se répliquent tôt ou tard au cours de la phase S (origines précoces ou tardives). L'un des mécanismes régulant le programme de réplication est un point de contrôle intra phase S qui dépend des kinases ATR et Chk1. Cette voie est activée par un stress réplicatif engendré par le blocage des fourches de réplication aux origines précoces, en retour elle inhibe l’activation des origines tardives. Il a été proposé, que la protéine Polo-Like-Kinase 1 (Plk1) soit responsable du déclenchement des origines situées à proximité des fourches bloquées en cas de stress réplicatif. Cependant, aucune analyse de l’activation des origines n’a jamais été réalisée au cours d’une phase S non perturbée lorsque Plk1 est absente. Pour avoir une vue globale et unifiée du processus de réplication de l'ADN, des modèles numériques et analytiques ont été construits dans le passé, mais aucun d'eux n'intègrent le rôle de Chk1 et Plk1. L'objectif de ma thèse était d’étudier expérimentalement et analytiquement de quelle manière Chk1 peut réguler le déclenchement des origines dans l'espace et dans le temps. En particulier, de comprendre si Plk1 pouvait être impliquée dans cette régulation pendant une phase S non perturbée, à cette fin, j'ai utilisé le système réplicatif des extraits d’œuf de Xénopes. En premier lieu, j'ai intégré dans un modèle numérique l’action de Chk1 pour reproduire le programme de réplication du système Xénope. J'ai testé différents scénarios puis j’ai utilisé des données de peignage d'ADN obtenues précédemment dans des conditions d'inhibition de la kinase Chk1. Les simulations Monte Carlo obtenues ont été ajustées aux données expérimentales en optimisant les valeurs des paramètres libres des modèles. J'ai trouvé qu'il fallait ajouter deux hypothèses aux modèles de réplication développés précédemment: 1) la présence d’une forte inhibition du déclenchement des origines par Chk1 à partir du début de la phase S 2) la présence de domaines génomiques répliquant précocement et qui échappent à cette inhibition. Deuxièmement, j'ai montré expérimentalement que, Plk1 actif est recrutée sur la chromatine avant le début de la phase S non perturbée et qu'en l'absence de Plk1, la réplication de l'ADN est ralentie. De plus, l’absence de Plk1 entraîne une augmentation de la phosphorylation de Chk1 et une diminution de l’activité de la kinase Cdk2, ce qui suggère que Plk1 inhibe Chk1. En réalisant des expériences de peignage d’ADN, j'ai démontré qu’en l’absence de Plk1 on observe une baisse du niveau d’activation des origines. L'analyse de ces données par mon modèle numérique suggère que Plk1 régule négativement l’action de Chk1 levant ainsi son action inhibitrice sur l’activation globale des origines. Cet effet concorde avec mes observations expérimentales. Il semble cependant que Plk1 n’agisse pas à proximité directe des fourches de réplication, comme cela avait été proposé précédemment. Enfin, en assimilant le processus de réplication à un processus de nucléation et de croissance unidimensionnel, j'ai développé une nouvelle approche quantitative pour étudier la régulation du programme de réplication. Cette approche lie la similarité entre les profils spatiaux de réplication d'une molécule unique et les processus de régulation de la réplication de l'ADN. En analysant les données de peignage d'ADN, j'ai montré que le programme de réplication de l'ADN des embryons précoces de Xénope est régulé par deux processus exclusifs dans l'espace et dans le temps. L’un avec une fréquence faible d’activation des origines et une vitesse apparente de fourches élevée et un second, régulé par Plk1, présentant une fréquence d’activation élevée des origines avec une vitesse apparente de fourches faible
The initiation of DNA replication in multicellular organisms starts from several thousand genomic loci called replication origins. They are grouped into domains which replicate early or late during S phase. The firing of a replication origin creates two diverging replication forks that replicate flanking DNA. One of the mechanisms regulating DNA replication program is the ATR/Chk1 dependent intra-S phase checkpoint. This pathway is activated by replicative stress due to stalled replication forks at early firing origins and in turn, inhibits the late firing of origins. It has been proposed that the checkpoint recovery kinase Plk1 (Polo-Like-Kinase 1) could be responsible for allowing origin firing close to stalled forks in replication stress conditions. However, origin firing has not been analysed after Plk1 inhibition or depletion during unperturbed S phase. To assemble a comprehensive and unified view of the DNA replication process numerical and analytical models have been built in the past, but none of them integrates the role of checkpoint pathways. The goal of my thesis was to investigate experimentally and analytically how the checkpoint regulates the firing of origins in space and time and, in particular, whether the Plk1 is implicated in the regulation of origin firing during unperturbed S phase. To this end, I used the Xenopus in vitro system. First, I integrated in a numerical model the checkpoint pathway to describe the replication program in the Xenopus in vitro system. I tested different scenarios and used DNA combing data previously obtained by the laboratory after the inhibition of the checkpoint kinase Chk1. Monte Carlo simulated data were fitted to experimental data by optimizing the values of free parameters of models using a genetic algorithm. I found that two new hypothesis should be added to formerly built replication models: 1) a strong inhibition of origin firing by Chk1 from the beginning of S phase 2) the presence of early replicating genomic domains that evade the origin firing inhibition. Second, I experimentally showed that during unperturbed S phase active Plk1 is recruited to chromatin before the start of S phase and that in the absence of Plk1, DNA replication is slowed down. Moreover, Plk1 depletion led to an increase in Chk1 phosphorylation (p-Chk1) and a decrease of Cdk2 activity, suggesting that Plk1 inhibits the intra-S phase checkpoint. Performing DNA combing, I demonstrated that Plk1 depletion leads to a decrease in origin firing level. Analysis of the combing data by the developed numerical model suggested that during unchallenged S phase Plk1 down regulates the global origin firing inhibitory action of Chk1, consistent with the experimental observation of increased level of p-Chk1 in Plk1 depleted Xenopus egg extract. However, Plk1 does not seem to act close to replication forks as was proposed earlier. Finally, by considering replication process as a one-dimensional nucleation and growth process and using statistical methods, I developed a new quantitative approach to study the regulation of replication program. This approach links the similarity between single molecule replication patterns to DNA replication regulating processes. By analyzing DNA combing data, I showed that DNA replication program in Xenopus early embryos is regulated by two spatially and temporally exclusive processes. One with low frequency of origin firing and high apparent fork speed and a second, controlled by PlK1, with a high frequency of origin firing and a low apparent fork speed. Altogether my results demonstrate that Plk1 positively regulates replication origin firing during normal S phase by down regulating the replication checkpoint. The numerical model predicts the existence of replication timing domains in the Xenopus model system. Future work will show whether Plk1 regulates the replication program at the level of genomic domains

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Muñoz, Castellano Casilda. "Understanding DNA replication of Plasmodium falciparum". Electronic Thesis or Diss., Université de Montpellier (2022-....), 2023. http://www.theses.fr/2023UMONT016.

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Le parasite Plasmodium falciparum, l’agent responsable du paludisme, a un cycle de vie complexe et emploie des stratégies de multiplication atypiques, adaptées à l'expansion rapide de la population pendant la colonisation de l'hôte et la transmission, qui ne sont pas entièrement comprises. Afin de comprendre l'initiation de la réplication de l'ADN de ce pathogène humain, mon projet s'est concentré sur deux aspects principaux de ce processus : l'identification et la caractérisation des origines de la réplication et de la machinerie de réplication.Dans la première partie de ce projet, j'ai combiné trois approches différentes pour cartographier les origines de réplication chez P. falciparum : ChIP-seq, le séquençage des brins naissants d'ADN (SNS-Seq) et la méthode NanoForkSpeed (NFS). J'ai d'abord réalisé les expériences ChIP-seq sur deux sous-unités du complexe de reconnaissance des origines de réplication (PfORC1 et PfORC2) au début de la schizogonie afin d'obtenir une cartographie de tous les sites d'initiation potentiels. Ensuite, j'ai identifié les sites de réplication actifs en utilisant deux stratégies : SNS-seq et la cartographie de l'incorporation de l'analogue de la thymidine BrdU dans l'ADN en réplication, en utilisant le séquençage nanopore et l'algorithme NFS. En combinant les données issues de ces différentes méthodes, j'ai obtenu un ensemble robuste d'origines de réplication qui présentent des caractéristiques similaires à celles des origines des mammifères, comme la distribution non aléatoire dans des zones d'initiation ou ‘clusters’ et l'association avec des séquences formant des G-quadruplex. Les origines de réplication montrent également des caractéristiques uniques. Elles sont associées à des gènes fortement transcrits, mais dépourvus de sites de début de transcription (TSS). En outre, les résultats montrent que la vitesse de la fourche de réplication est uniforme sur l'ensemble du génome, à l’exception d’une diminution significative au niveau des centromères et des télomères. Des informations obtenues sur molécules uniques, utilisant des lectures contenant de multiples événements d'initiation qui n'auraient pu provenir que de cellules individuelles, ont révélé une relation entre la vitesse à laquelle les fourches de réplication se déplacent et la distance par rapport à l'origine la plus proche. Cette approche à multiples facettes a fourni la première analyse complète du paysage génétique des origines de réplication chez P. falciparum.La deuxième partie de mon projet s'est concentrée sur la caractérisation du complexe réplicatif de P. falciparum en isolant des protéines sur l'ADN naissant, qui font potentiellement partie de la machinerie du réplisome. Dans l'ensemble, ce travail contribue aux études en plein essor, sur la réplication de l’ADN des parasites Plasmodium falciparum, dans l'hôte humain, et fournira une base solide pour les futures recherches dans ce domaine
Plasmodium falciparum parasites have a complex life cycle and employ atypical multiplication strategies, tailored for fast population expansion during host colonisation and transmission, that are not fully understood. In an effort to unravel the initiation of DNA replication of these human pathogens my project focused on two main aspects of this process: (i) identifying and characterising the origins of replication and (ii) identifying and characterising the replication machinery.Regarding the first part, I combined three different approaches to map the origins of replication in P. falciparum. These were ChIP-seq, SNS-Seq and NFS. I first performed ChIP-seq on two subunits of the origin recognition complex (of PfORC1 and PfORC2) at the beginning of schizogony to obtain a cartography of all potential replication initiation sites. Next, I mapped sites of active replication using two strategies: sequencing DNA nascent strands (SNS-seq); and mapping the incorporation of the thymidine analogue BrdU into replicating DNA, using nanopore sequencing combined with NanoForkSpeed (NFS). By combining data from these different methods, I have obtained a robust set of origins of replication that display some characteristics similar to those of mammalian origins, such as the non-random distribution in initiation zones or clusters and the association with G-quadruplex forming sequences. Strikingly, they also display unique characteristics, since they are associated with highly transcribed genes but depleted from transcription start sites (TSS). Additionally, the results showed a uniform fork speed across the genome with a significant decrease in centromeres and telomeres. Single molecule information, using reads containing multiple initiation events which could have only come from individual cells, revealed a relationship between the pace at which replication forks travel and the distance to the nearest origin. This multifaceted approach provided the first comprehensive analysis of the genetic landscape of the origins of replication in P. falciparum.The second part of my project focused on the characterization of the replicative complex of P. falciparum by isolating proteins bound to nascent DNA at active replication forks.Overall, this work contributes to the growing field of studying how Plasmodium falciparum parasites replicate their genome within the human host, and I am confident that it will serve as a solid foundation for further investigations

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Dionne, Isabelle. "La réplication des télomères et la réplication conventionnelle deux mécanismes concertés". Thèse, Université de Sherbrooke, 2001. http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/4143.

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Les télomères sont constitués de répétitions de courtes séquences dont un des brins est riche en guanine (G) et l'autre riche en cytosine (C).Les télomères de Saccharomyces cerevisiae sont répliqués par la télomérase qui ajoute des répétitions nouvelles au brin G-riche. Lors de la réplication des télomères de levure, les extrémités des chromosomes acquièrent de longues extensions simple-brin 3' riche en G. Ces extensions 3' sont générées à la fin de la phase S. Le candidat idéal pour la génération de ces queues G-riche était la télomérase. Toutefois, dans une souche de levure dépourvue de la télomérase, nous avons aussi retrouvé des extensions 3' télomériques durant la phase S. Ces résultats démontrent l'existence d'une activité indépendante de la télomérase pour la génération de ces queues riche en G. Cette activité pourrait être une exonucléase 5'-3' nécessaire pour générer une structure uniforme à tous les télomères puisque suite à la réplication semi-conservative, une extrémité du chromosome va comporter une courte extension 3' et l'autre extrémité, un bout franc. Pour déterminer si cette activité de dégradation du brin C-riche était dépendante du passage de la machinerie de réplication, nous avons utilisé un plasmide linéaire comportant des télomères à chacune de ses extrémités et qui ne peut se répliquer. Dans un tel cas, les télomères n'acquièrent pas d'extensions simple-brin riche en G contrairement à un plasmide correspondant comportant une origine de réplication. Ceci nous permettait de proposer un lien entre la machinerie de réplication conventionnelle et le maintien des télomères. Pour confirmer le lien pouvant exister entre la réplication des télomères et la machinerie de réplication conventionnelle, nous avons examiné les télomères d'une souche de levure possédant une mutation dans la sous-unité catalytique de l'ADN polymérase [alpha]. En plus de posséder des télomères allongés par rapport à une souche de type sauvage, un tel mutant démontre une augmentation de la quantité de simple-brin télomérique G-riche. Cette augmentation du simple-brin terminal est probablement causée par une synthèse inefficace du brin C-riche par la machinerie du brin retardé puisque ce simple-brin télomérique est généré durant la phase S. L'augmentation de la taille des télomères étant dépendante de la télomérase, nous proposons donc un couplage de la synthèse du brin G-riche par la télomérase avec la synthèse du brin C-roche par la machinerie de réplication conventionnelle pour permettre une régulation de la taille des télomères.

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Convert, Agnès. "Parole et origine". Paris 4, 1992. http://www.theses.fr/1991PA040179.

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Cette recherche d'ontologie originelle a pour point d'ancrage la civilisation judéo-chrétienne. Dès l'origine, la parole est là. Chercher quelles sont les relations de parole et origine est s'interroger sur un mode de présence au monde. A travers l'examen de la parole-création, de la puissance de la parole et de sa justesse, on découvre un homme à la fois un et trois, à l'image de la trinité divine. On voit comment il peut être adéquat à ce qui lui est donné à vivre
This is an inquiry about original ontology. It take place in the Judeo-Christian civilization. Since the origin, the word is there. Searching what are the relations between origin and word is inquiring about a way of being in the world. Through the creative word, its transforming power, its truth, we find a man who is together one and three, build of the divine trinity. And we see haw he can be adequate to what the has to live

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GAUSSERAND, JEAN-PHILIPPE. "Origine des lunettes". Toulouse 3, 1993. http://www.theses.fr/1993TOU31111.

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Noyon-Collier, Laurent. "La mort comme origine". Thesis, Nice, 2014. http://www.theses.fr/2014NICE2019/document.

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Cette recherche porte sur la question de la mort, et de ses effets dans la pratique clinique pour un psychologue clinicien orientée par la psychanalyse. Il en découle la reprise de la question de la mort dans les œuvres de Sigmund Freud, de Jacques Lacan, et d’autres auteurs, et une critique possible du concept de pulsion de mort. Par là même, la mort se donne à entendre comme intimement liée à la question du désir. Le lien social postmoderne marquant une tendance à clore parallèlement ces deux dimensions, la question du discours qui le sous-tend en tant qu’il ne s’écrit pas, peut s’associer au passage d’un sujet s’organisant autour du fantasme, à un sujet s’organisant autour de l’image, ce qui souligne la différence à opérer entre image et imaginaire. Il en découle pour l’auteur, la remise à plat des trois questions qui l’interrogent le plus dans sa clinique : ce qu’il doit en être du désir du clinicien pour opérer des cures par la parole, ainsi que la mise en jeu de l’angoisse et du transfert dans ce type d’accompagnement thérapeutique
This research is about the question of death, and her effects in the clinical practice of the psychologist clinician directed by the psychoanalysis. It ensues from it the resumption of the question of the death in the works of Sigmund Freud, Jacques Lacan, and other authors, and a possible criticism of the concept of death drive. Thereby, the death suggests as confidentially connected to the question of the desire. The postmodern social link marking a tendency to close at the same time these two dimensions, the question of the speech which underlies it as it does not spell, can join to the passage of a subject getting organized around the fantasy, to a subject getting organized around image, what underlines the difference to be operated between image and imagination. It ensues from it for the author, the thorough review of three questions who question him most in clinical : that he has to be the desire of the clinician there to operate for cure by the words, as well as the involvement of the anxiety and for the transfer in this type of therapeutic support

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Taleb, Nassim Nicholas. "Réplication d'options et structure de marché". Paris 9, 1998. https://portail.bu.dauphine.fr/fileviewer/index.php?doc=1998PA090080.

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Brighi, Livia. "Gruppo: origine di una definizione". Bachelor's thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2012. http://amslaurea.unibo.it/4427/.

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Dedieu, Olivier. "Réplication optimiste pour les applications collaboratives asynchrones". Phd thesis, Université de Marne la Vallée, 2000. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00651743.

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Resumen

Dans cette thèse, nous présentons un système de réplication optimiste pour les applications collaboratives asynchrones. Dans notre modèle, les réplicas travaillent de façon autonome et se synchronisent deux à deux afin d'assurer la propagation épidémique des écritures et la cohérence globale à terme des données. Nous avons conçu pour cela un protocole qui garantit des échanges incrémentaux. Il optimise la consommation de bande passante et simplifie la détection des mises-à-jour à intégrer. Il repose sur un mécanisme de journalisation des écritures. Ce mode de persistance offre de bonnes performances, une grande robustesse et un support simple pour l'évolution de schéma. Lorsque deux réplicas se synchronisent, des conflits peuvent apparaître. Pour y faire face, nous proposons un mécanisme d'horloge logique qui définit un ordre total sur les écritures, cohérent avec l'ordre temporel. Il permet de résoudre les mises-à-jour conflictuelles par un ordonnancement conforme à l'intuition pour les utilisateurs. D'autres types de conflits propres à l'application et à l'intégrité des données peuvent survenir. Le développeur d'applications dispose d'une interface de programmation pour définir des procédures de résolution spécifiques. Par ailleurs, nous présentons deux extensions au protocole de propagation épidémique pour le rendre exploitable à large échelle : le contrôle de la vitesse de convergence et la réplication partielle. En complément de la réplication des données, nous proposons un "framework" pour le déploiement dynamique des mises-à-jour du code et des ressources de l'application. Enfin, l'ensemble du système de réplication est illustré sur une application collaborative asynchrone, Pharos, qui permet le partage de recommandations dans des communautés d'intérêt.

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Lagnel, Claire. "Caractérisation d'origines de réplication de Physarum polycephalum". Thesis, National Library of Canada = Bibliothèque nationale du Canada, 1998. http://www.collectionscanada.ca/obj/s4/f2/dsk2/ftp02/NQ36289.pdf.

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Stambazzi, Fabio. "Biosintesi di carotenoidi di origine microbica". Bachelor's thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2019.

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Resumen

L'interesse per i carotenoidi è aumentato considerevolmente, principalmente a causa: dei benefici per la salute umana, gli integratori alimentari, l'industria alimentare (coloranti) e prodotti farmaceutici. La produzione di carotenoidi attraverso la sintesi chimica o l'estrazione dalle piante, è limitata da basse rese che si traducono in alti costi di produzione. Inoltre, alcuni dei sottoprodotti derivanti da tali processi chimici, possono avere effetti collaterali indesiderati sul consumo. Questo porta alla ricerca della produzione microbica di carotenoidi (sintesi microbica), come alternativa che ha mostrato rendimenti migliori. In questo lavoro, sono state raccolte e analizzate le evidenze scientifiche più recenti nell’ambito della biosintesi dei carotenoidi da parte dei microrganismi, anche al fine di valutare il potenziale della ricerca biotecnologica in tale ambito. La produzione biotecnologica offre vantaggi economici, rispetto ai carotenoidi vegetali sintetici o estratti, grazie all'uso di substrati a basso costo (rifiuti agroindustriali) ed è più sicura ed efficiente rispetto ai metodi tradizionali. Molti microrganismi, soprattutto i lieviti come Rhodotorula spp, Xanthophyllomyces dendrorhous, Sacharomyces cerevisiae e Candida utilis o funghi appartenenti alle specie Blakeslea trispora e Phycomyces blakesleeanus, hanno dimostrato di essere produttori di grandi quantità di carotenoidi e hanno mostrato un'importante capacità di crescita nei rifiuti agroindustriali. La tecnologia moderna, come l'uso del DNA ricombinante, unita all'isolamento di alcuni dei geni vitali coinvolti nella biosintesi dei carotenoidi, hanno incoraggiato la ricerca sulla produzione dei carotenoidi. Nell’ambito dei batteri, sono stati studiate alcune specie che si sono rivelate particolarmente promettenti nell’ambito del genere Stafilococcus e Lactobacillus plantarum tra i batteri lattici. La produzione microbica di carotenoidi ha un notevole potenziale di mercato e industriale.

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Algrain, Isabelle. "L'alabastre attique: origine, forme et usages". Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 2011. http://hdl.handle.net/2013/ULB-DIPOT:oai:dipot.ulb.ac.be:2013/209979.

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Resumen

L’alabastre attique est une forme de vase à parfum en céramique produite à Athènes entre le milieu du VIe s. av. J.-C. et le début du IVe s. av. J.-C. L’objet de cette thèse est de présenter une étude globale, inexistante à ce jour, sur l’alabastre attique. En plus d’un examen typologique de la forme, généralement mené dans le cadre de ce type de recherche, nous avons voulu proposer une lecture économique, culturelle et sociale de l’alabastre.

La première partie de cette thèse est consacrée à l’identification de l’origine de l’alabastre et à sa diffusion en Méditerranée orientale. L’alabastre est originaire d'Égypte, où les premiers exemplaires en albâtre se développent à partir du VIIIe s. av. J.-C. Après avoir tracé son évolution morphologique, la thèse met en évidence les diverses régions de la Méditerranée orientale telles que le Levant, la Mésopotamie ou la Perse, où la forme est exportée et copiée, le plus souvent par des ateliers qui produisent des vases en pierre. Cette première partie met également l’accent sur le statut particulier de l’alabastre en pierre en Orient et en Égypte, où il restera longtemps associé au pouvoir royal ou aristocratique. Elle traite enfin de l’apparition de l’alabastre et de son statut dans le monde grec oriental. Ces importations déclenchent une réaction presque immédiate chez les artisans de ces régions qui produisent des alabastres en argent, en verre, en faïence, en ivoire, en bois et en céramique.

La seconde partie de cette étude aborde la production de l’alabastre attique en céramique qui s’étend du VIe s. av. J.-C. au début du IVe s. av. J.-C. Un premier chapitre est consacré à l’étude de son introduction dans le répertoire formel au milieu du VIe s. av. J.-C. par l’atelier d’Amasis et aux inspirations probables de cet artisan. Cette section s’est également penchée sur le difficile problème des phases de la production et de l’organisation interne des différents ateliers. Pour ce faire, nous avons élaboré une méthode d’analyse basée à la fois sur l’examen minutieux du travail du potier grâce aux variations dans les profils des vases et sur les données obtenues par les études ethno-archéologiques pour tenter de différencier les alabastres produits au sein d’ateliers différents et d’identifier, quand cela s’avérait possible, différents potiers au sein d’un même atelier. Cette étude formelle a distingué trois phases différentes de production qui présentent des caractéristiques typologiques distinctes. L’examen de l’organisation interne des ateliers a également mis en évidence les caractéristiques morphologiques des vases et a identifié les potiers les plus importants. L’examen attentif des pièces céramiques a permis de regrouper au sein d’un même atelier des artisans dont les liens étaient jusqu’alors insoupçonnés. Enfin, la deuxième partie se clôture par une analyse de la carte de distribution des alabastres attiques

La troisième partie de ce travail porte sur la fonction et les différents usages de l’alabastre sur base des sources littéraires, épigraphiques, iconographiques et archéologiques. Cette section se penche plus particulièrement sur l’identification des utilisateurs privilégiés des alabastres. En effet, de nombreuses études lient, de manière presque systématique, l’alabastre au monde féminin. Ce propos mérite d’être nuancé car, si le vase apparaît à maintes reprises dans des contextes féminins tels que ceux de la toilette et de la parure, il ne constitue pas exclusivement un symbole du monde des femmes. Cette troisième partie met en évidence le fait que l’alabastre est également utilisé dans un grand nombre d’autres contextes, notamment rituels, et représente souvent un symbole de luxe et de raffinement à l’orientale.
Doctorat en Histoire, art et archéologie
info:eu-repo/semantics/nonPublished

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Rommelaere, Samuel. "Pantéthéinases sériques : Nature, origine et fonctions". Aix-marseille, 2012. http://www.theses.fr/2012AIXM4114.

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Resumen

Les molécules Vanin (vnn) sont des patéthéinases qui hydrolysent la patéthéine en patothénate et cystéamine. Les vnn modulent le stress tissulaire en réponse à des agents inféctieux ou toxiques. Une activité pantéthéinase sérique a été identifiée mais son origine, sa fonction et son identité moléculaire sont inconnues. Notre objectif était d'identifier des régulateurs de la vnn sérique et d'étudier ses fonctions
Vanin (vnn) genes code for pantetheinases that hydrolyse pantethine to pantothenate and cysteamine. Vnn enzymes appear as modulators of tissue stress response to infectious, toxic or immune challenges. A seric pantetheinase activity has been described but its origin, molecular nature and function are not known. The objectives were to identify regulators of seric Vnn and to investigate its functions

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Knödlseder, Jürgen. "L' origine de l'26Al galactique". Toulouse 3, 1997. http://www.theses.fr/1997TOU30296.

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Resumen

L'emission de la raie gamma a 1,809 mev, correspondante a la decroissance du radio-isotope al26, temoigne de la synthese recente d'elements lourds dans notre galaxie. Une etude approfondie de cette emission est presente dans cette these, base sur l'analyse des donnes obtenues avec le telescope comptel. La premiere partie de cette these est consacree a la reconstruction de l'image du ciel dans la lumiere de la raie a 1,8 mev. Les algorithmes conventionnels, comme la methode de maximum d'entropie ou de vraisemblance maximale, menent a des images bruitees, dominees par des fluctuations statistiques du bruit de fond. Afin d'exploiter scientifiquement celles-ci, il a ete necessaire d'effectuer des simulations en particulier pour determiner les incertitudes. De plus, une approche multi-resolution est proposee, permettant une reduction significative des incertitudes dans les images. Il ressort de cette analyse, que l'emission a 1,8 mev est concentre dans le plan galactique. Cependant, l'emission distinct vers la region du cygne, la carene, et le complexe du cocher-girafe-persee indique que les etoiles massives sont les geniteurs principaux de l'al26. La deuxieme partie de cette these consiste dans une comparaison des donnees comptel a 1,8 mev avec d'autres longueurs d'onde en utilisant une approche bayesienne. Cette comparaison a montre que la distribution de la raie a 1,8 mev ressemble fortement a la distribution des electrons libres, tracee par le rayonnement de freinage thermique qui est observe dans la domaine des microondes. Cette ressemblance implique une proportionnalite directe entre la colonne densite de l'al26 et des etoiles massives, supportant fortement que les etoiles massives soient a l'origine de l'al26 galactique. Les novae o-ne-mg et les etoiles agb peuvent etre exclues comme geniteurs important de l'al26.

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Rejaud, Alexandre. "Origine et diversité des Amphibiens d'Amazonie". Thesis, Toulouse 3, 2021. http://www.theses.fr/2021TOU30161.

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Resumen

Avec une surface de plus de six millions de kilomètres carrés, l'Amazonie abrite la plus grande forêt tropicale humide au monde, ainsi qu'une grande partie de la diversité terrestre. Cependant, les origines spatiales et temporelles de cette diversité demeurent mal comprises et nécessitent d'être plus étudiées pour identifier les causes de cette impressionnante diversification. Les amphibiens sont un groupe taxonomique particulièrement adapté à l'étude de la biogéographie historique en Amazonie car ils ont diversifié de manière importante dans la région et présentent d'importante variations d'utilisation de l'habitat ainsi que de capacités de dispersion entre groupes. Nous avons d'abord reconstruit l'histoire biogéographique du genre Allobates qui se rencontre principalement dans des forêts de terra-firme et pour lequel l'Amazonie de l'Ouest a joué un rôle important de source de diversification il y a entre 14 et 10 Millions d'années. Ce patron spatio-temporel coïncide avec une période marquée par la présence d'un système de méga-marécage qui recouvrait la plupart de l'Amazonie de l'Ouest il y a entre 23 et 10 Millions d'années. La décharge progressive de ce système marécageux a été suivie par une expansion des forêts de terra-firme en Amazonie de l'Ouest, une disponibilité en habitat favorable qui a probablement contribué à la diversification d'Allobates. Nos résultats suggèrent également que les rivières de l'Ouest Amazonien ont pu promouvoir la diversification au cours des 10 derniers Millions d'années en agissant comme une barrière semi-perméable à la dispersion, permettant la spéciation par dispersion suivie d'isolation géographique. Dans un second temps, nous avons reconstruit l'histoire biogéographique du groupe Pristimantis conspicillatus qui a diversifié de manière continue au cours du temps. Ce groupe présente un patron spatial de diversification particulier, avec quatre clades anciens ayant diversifié dans différentes aires simultanément, avec relativement peu d'évènements de dispersion comparé à Allobates. Ces importantes différences suggèrent que les espèces d'amphibiens ont des capacités de dispersion très variables qui sont probablement liées à leurs traits d'histoire de vie. Pour finir, nous avons comparé les histoires biogéographiques de six clades d'amphibiens partageant des temps d'origines comparables et qui sont représentatifs de la diversité Amazonienne en termes de taxonomie, de traits d'histoire de vie, d'utilisation de l'habitat et de type de reproduction. L'Amazonie de l'Ouest a été identifiée comme la principale source de diversification pour les amphibiens Amazonien, bien qu'elle ne se soit comportée comme tel qu'à partir d'il y a 10 Millions d'années pour les groupes présentant de l'adaptabilité dans la disponibilité de l'habitat ; et seulement entre il y a 10 et 5 Millions d'années pour les groupes conservatifs dans la disponibilité de l'habitat. Cela suggère que les groupes conservatifs dans la disponibilité de l'habitat remplissent la niche écologique plus rapidement que les espèces présentant de l'adaptativité, ce qui se traduit par des phases de diversification plus courtes. Nos résultats suggèrent également que les rivières agissent comme des barrières à la dispersion uniquement pour les groupes conservatifs dans l'utilisation de l'habitat. Nous tenons à souligner que ces résultats doivent être considérés avec prudence car ils ont été obtenus en étudiant une petite fraction de la diversité Amazonienne, ils apportent néanmoins de nouveaux éléments l'influence du conservatisme de niche sur les trajectoires évolutives en Amazonie, ce qui permettra peut-être d'inciter un plus grand effort de recherche sur cette thématique
With more than six million square kilometers, Amazonia hosts the largest tract of lowland tropical rainforest in the world and a large portion of the global terrestrial diversity. However, the temporal and spatial origins of this diversity remain poorly understood and need to be better comprehended to identify the processes responsible for this tremendous diversification. Amphibians are a particularly adequate group for investigating patterns of biogeographical history within Amazonia because they extensively diversified within the region and present important disparities in habitat use and dispersal abilities across groups. We first investigated the historical biogeography of the terra-firme genus Allobates and identified western Amazonia as an important source of diversification between 14 and 10 million years ago (Mya). This spatio-temporal pattern was coinciding with the existence of the Pebas system, a mega-wetland system that occupied most of western Amazonia during this period, that was unsuitable for terra-firme species. The Pebas system discharge was likely followed by an extension of terra-firme forests that likely fostered Allobates diversification. Our results also suggested that western Amazonia rivers might have subsequently (after 10 Mya) promoted diversification, by acting as semi-permeable barriers allowing speciation by dispersal and isolation. Secondly, we investigated the biogeographical history of the Pristimantis conspicillatus group which, instead, presented a continuous diversification throughout Neogene. This group displays a striking spatial pattern of diversification with four ancient clades that have diversified concomitantly in distinct areas in Amazonia and the Atlantic Forest, with much fewer dispersal events between areas than in Allobates. These differences suggest that amphibian species display differences in dispersal abilities that can be related to their life history traits. Finally, we compared the biogeographic histories of six frog clades, including the two aforementioned ones, that share comparable crown ages and span the Amazonian frog diversity in terms of life history traits, taxonomy, habitat use and reproduction modes. We identified western Amazonia as the principal source of diversification for Amazonian amphibians, although it acted as such only after 10 Mya for the groups that have adapted to various types of habitats; and only between 10 and 5 Mya for the ecologically conservative groups. This suggest that species with lower habitat availability reach niche filling more rapidly than ecologically adaptive species, resulting in shorter diversification phases. Our results also suggest that riverine barrier effect seems to have affected solely conservative groups particularly when the river course is stable over time. While these results were obtained by considering only a fraction of Amazonian diversity, they provide interesting insights on the influence of niche conservatism upon Amazonian evolutive trajectories, which will hopefully foster further and more ample research in this direction

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VIALE, ANNE-CLAIRE. "Lymphocytes b murins : origine et devenir". Paris 6, 1992. http://www.theses.fr/1992PA066629.

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Resumen

Nous etudierons la regulation de l'expression des familles de genes vh dans des souris congeniques pour le locus igh. Cette expression par les cellules b spleniques immunocompetentes est dictee par l'haplotype igh chez le nouveau-ne et par le fond genetique chez l'adulte. Cependant, les plasmocytes spleniques adultes ont une expression dictee par l'haplotype igh, comme les cellules b du nouveau-ne. Des souris irradiees et reconstituees avec des precurseurs lymphoides b de foie ftal ou de moelle osseuse adulte montrent que la regulation differe entre ces precurseurs. Des chimeres de moelle osseuse de f1 dans un parent montrent que l'environnement cellulaire de l'hote ne peut pas induire cette regulation et l'expression des familles de genes vh par les cellules b de souris f1, triees selon l'allotype mu exprime, montre une regulation en cis. Le phenotype d'une souris congenique igh adulte montre que les plasmocytes naturels proviennent de precurseurs perinataux differents des precurseurs medullaires des cellules b au repos et des precurseurs des cellules b1. Cette regulation montre une correlation entre l'origine des precurseurs b et l'etat d'activation des cellules b. De plus, nous montrerons que la persistance ces lymphocytes b au repos est liee a la specificite de leurs immunoglobulines. Ceci montre une survie selective des lymphocytes b en absence de toute activation cellulaire ulterieure. Nous montrerons aussi que le renouvellement de cellules b monoclonales est plus eleve que celui de cellules b polyclonales. Finalement, nous montrerons que les repertoires b peripheriques de souris axeniques conservent une expression preferentielle des familles de genes vh d-proximales, caracteristique des stades precoces de l'ontogenese et de la lymphopoiese normales. Et nous montrerons que les immunoglobulines seriques normales, injectees a des souris axeniques, participent a la selection des repertoires b peripheriques, montrant une interaction constante entre les cellules b au repos et naturellement activees

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Tesis sobre el tema "Origine de la Réplication"

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