Tesis sobre el tema "Méthylation d'histone"

Chez les eucaryotes, les histones sont des protéines qui s'associent à l'ADN pour former la chromatine. Les modifications post-traductionnelles des histones affectent la condensation de la chromatine et l'expression des gènes. Les modifications d’histones sont régulées par plusieurs enzymes, dont les déméthylases d'histones qui contiennent souvent un domaine Jumonji C (JmjC). Chez les mammifères, il a été démontré que l’altération de l’activité des protéines JmjC entraîne divers défauts de développement, des troubles métaboliques et des cancers. Au cours de ma thèse, j’ai réalisé une analyse systématique de la fonction des protéines à domaine JmjC dans le champignon modèle Podospora anserina. Le génome de P. anserina contient 12 gènes codant des déméthylases potentielles (Kdm). L’expression de ces gènes est soit ubiquitaire soit régulée en fonction des différents stades du cycle de vie de P. anserina. Pour étudier la fonction de ces Kdms, j’ai inactivé les gènes correspondants. Mes résultats ont montré que chez P. anserina, les Kdms sont impliquées dans un large éventail de processus développementaux. PaKdm4 et PaDmm1 sont impliqués dans des voies de réponse au stress. L’absence de PaKdm1 et de PaKdm8_para1 conduit à accroitre la longévité de P. anserina. PaKdm5 et PaKdm8_para1 sont essentiels pour la reproduction sexuée. Afin de caractériser le rôle des Kdms sur la dynamique de certaines modifications d’histones, j’ai réalisé des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine. J’ai ainsi montré que l’absence de PaKdm1, contrairement à celle de PaKdm5, augmente significativement la présence de la modification H3K4me3 dans le génome de P. anserina. L’absence de PaKdm1 ou de PaKdm4 entraînent quant à elles un élargissement des domaines génomiques portant la modification H3K9me3. J’ai également réalisé des expériences de séquençage d’ARN à haut débit afin de caractériser le transcriptome de chacune des souches mutantes. J’ai ainsi constaté que l’absence des Kdms affecte l'expression des gènes. En particulier, j’ai montré que c’est l’inactivation du gène codant PaKdm5 qui a l’impact le plus important sur l'expression des gènes, tandis que la souche mutante PaKdm1 montre une reprogrammation transcriptionnelle limitée. Mon analyse montre également que PaKdm8 agit comme un régulateur positif de l'expression génique. En conclusion, mes résultats démontrent que chez l’organisme modèle P. anserina, les Kdm régulent épigénétiquement de multiples aspects du cycle de vie de P. anserina, y compris la sénescence, la reproduction sexuée et la défense du génome et fournissent de nouvelles perspectives sur le rôle des déméthylases d'histones dans la régulation transcriptionnelle des gènes
In eukaryotes, histone proteins associate with DNA in the nucleus to form chromatin. Histone post-translational modifications affect chromatin condensation and gene expression. Histone PTMs are regulated by several enzymes including histone demethylases that often contain a Jumonji C (JmjC) domain. In mammals, JmjC proteins with impaired activity have been shown to cause various developmental defects, metabolic disorders and cancer. Here I present a systematic analysis of the function of the JmjC family of proteins in the model fungus Podospora anserina. The P. anserina genome contains 12 putative lysine demethylase enzymes (Kdm) with two expression patterns, ubiquitous or differentially expressed at different stages of the life cycle. To investigate the function of these Kdms, I generated deletion mutants. My results showed that the Kdms are involved in a wide range of developmental processes in P. anserina. PaKdm4 and PaDmm1 are associated with stress response pathways. Loss of PaKdm1 and PaKdm8-para1 leads to increased longevity of P. anserina. PaKdm5 and PaKdm8-para1 are essential for sexual reproduction. To characterize the consequences of the loss of Kdms on the distribution of H3K4me3, H3K9me3 and H3K36me2/3 histone modifications, I performed chromatin immunoprecipitation on the deleted strains. Loss of PaKdm1 significantly increases H3K4me3 modification, while loss of either PaKdm1 or PaKdm4 results in larger H3K9me3 domains. Performing RNA-seq experiments, I also characterized the transcriptome of the deleted strains. I was able to show that the lack of histone demethylases affects gene expression. Specifically, loss of PaKdm5 has the most significant effect on gene expression, whereas the PaKdm1 deleted strain exhibits limited transcriptional reprogramming. PaKdm8 acts as a positive regulator of gene expression. These findings demonstrate that Kdms epigenetically regulate multiple aspects of the P. anserina life cycle, including lifespan, sexual reproduction and genome defense, and provide new insights into the critical role of histone demethylases in the transcriptional gene regulation

Cette dernière décennie a vu augmenter le nombre d’études portant sur la caractérisation des protéines JUMONJI (JMJ) et montrant leur rôle prépondérant dans la régulation des gènes et le développement des organismes. Ces protéines sont capables de déméthyler certains résidus des queues des histones et ont été organisées en groupes phylogénétiques en fonction de la conservation de leur domaine catalytique. Pour chaque clade entre un et trois substrats spécifiques ont pu être identifiés. De la sous famille KDM3, dont le résidu cible est H3K9, seul un membre, IBM1, a été caractérisé chez Arabidopsis. Cette étude montre que la mutation de JMJ24, un autre membre de ce groupe, entraine une augmentation de la taille des racines, cotylédons et organes floraux, suggérant un rôle dans le contrôle du développement à différents stades. De plus, l’analyse de l’expression tissulaire indique que JMJ24 est exprimé dans le phloème, en cohérence avec l’effet pléiotropique de sa mutation. Enfin, nos données suggèrent une interaction entre JMJ24 et d’autres protéines JMJ, telles JMJ14 et IBM1, mais aussi une interaction avec les protéines DCL, impliquées dans la régulation des gènes et des éléments transposables
Numerous studies over the last decade have reported the characterization of the JUMONJI (JMJ) proteins, showing their critical importance in regulating genes and organism’s development. These proteins are able to demethylate a subset of histone tail residues and were clustered into distinct groups using a phylogenetic analysis based on their catalytic domain conservation. Furthermore, modification of one to three specific residues has been attributed to each JMJ group. Within the KDM3 subfamily, of which target is the H3K9 residue, only one member, IBM1, was first characterized in Arabidopsis. In this report, we showed that the mutation of JMJ24, another member of this subfamily, resulted in an increase of the root length, cotyledon and floral organ size, suggesting that JMJ24 functions is needed at different developmental stage. In addition, the analysis of the tissue-specific expression of JMJ24 indicated that the gene is expressed within the phloem of all organs, correlating with the pleiotropic effect of the gene mutation. Last, our data also suggested that JMJ24 interacts with other JMJ protein like JMJ14 and IBM1, but also with the DCL proteins knowing to be involved in genes and transposable elements regulation

Les modifications post-traductionnelles (MPT) sur les queues d'histone jouent un rôle important dans des mécanismes comme la régulation de l'expression des gènes. Un mode d'action passe par le reconnaissance d'une modification covalente par un domaine protéique appartenant généralement à une protéine associée au remodelage de la chromatine (enzyme, facteur de transcription, etc. . . ). La méthylation des lysines est une modification particulièrement importante, pour laquelle plusieurs sites ont été identifiés sur les histones. Nous avons entrepris de déterminer les bases de la sélectivité de domaines protéiques pour un site de méthylation donné, en utilisant les nombreuses données disponibles dans les banques de données structurales (PDB). Nous avons utilisé des calculs de dynamique moléculaire, couplés à un protocole dérivé de la méthode MM/PBSA, pour étudier les interactions entre les peptides d'histone et les domaines protéiques. Il a dans un premier temps fallu développer et valider un jeu de paramètres permettant l'étude par dynamique moléculaire des MPT. L'analyse de nos résultats a notamment mis en évidence le fait que certains domaines protéiques reconnaissent un court motif de séquence afin de discriminer entre différents sites de méthylation. Il apparaît ainsi clairement que les chromodomaines sont spécifiques d'un motif ARKmeS, tandis que les domaines PHD lient le motif ARTKme sur H3. L'ensemble de nos données peut servir de point de départ à la recherche de nouveaux effecteurs des MPT, comme nous avons entrepris de le faire pour le cas particulier des domaines PHD
Post-translationnal modifications (PTMs) of histone tails play an important role in cellular processes such as gene expression and regulation. They can act through their specific recognition by proteic domains belonging to chromatin remodeling factors (enzymes, transcription factors, etc). A particularly important modification is the methylation of specific histone tail sites, for which there exist many. Our goal was to get insights into the molecular selectivity of these proteic domains towards a given methylation site by taking advantage of the numerous structural data available in the Protein Data Bank. We studied the interactions between the domains and histone peptides, using molecular dynamics simulations combined with a protocol using the MM/PBSA method. A pre-requisite was to develop and validate force field parameters for the of PTMs. Our results notably revealed that some domains discriminate the methlyation sites by recognizing short linear sequence motifs. It thus appears that chromodomains are specific to an ARKmeS motif, while PHD fingers bind the ARTKme motif of H3. The study carried out on PHD fingers also proves that our overall results can be used as a reference for research of other effectors of histone tails

Chez les eucaryotes, l’organisation de la chromatine est indispensable à la régulation de l’expression des gènes et la stabilité du génome. Les ciliés constituent un excellent modèle d’étude des mécanismes qui permettent de maintenir l’intégrité du génome eucaryote. Notre modèle d’étude, l’eucaryote unicellulaire Paramecium tetraurelia, se distingue par l’élimination massive et reproductible de près de 30% de séquences d’ADN germinal lors du développement du macronoyau somatique après les événements sexuels. Ces séquences sont éliminées grâce à un processus en plusieurs étapes impliquant la formation d’hétérochromatine dirigée par de petits ARN suivi d’excision par la transposase domestiquée Piggy Mac (Pgm) et de réparation. Les mécanismes moléculaires permettant de comprendre la reconnaissance spécifique de ces séquences germinales dans le contexte de la chromatine ainsi que la précision de la coupure demeurent mal compris.Le chaperon d’histone Spt16, associée au partenaire Pob3, fait partie du complexe hétéro-dimérique FACT (FAcilitates Chromatin Transactions). FACT intervient dans de nombreux mécanismes liés au métabolisme de l’ADN tels que la transcription, la réparation, la réplication ou l’accessibilité de la chromatine. Chez Paramecium tetraurelia, on a identifié deux protéines homologues de Spt16 et Pob3 exprimées uniquement durant le développement du macronoyau au moment où se produisent les réarrangements. Les protéines Spt16-1 et Pob3-1 fusionnées à la GFP se localisent dans les macronoyaux en développement. Nous avons montré que la protéine Spt16-1 est essentielle à la production d’une descendance sexuelle viable. Le reséquençage du génome après inactivation de SPT16-1 a montré que Spt16-1 est nécessaire à l‘ensemble des réarrangements du génome et conduit à des défauts semblables à ceux obtenus suite à l’inactivation de PGM. Spt16-1 agit en aval des voies de dépôt des marques d’hétérochromatine guidées par les petits ARNs mais en amont de l’endonucléase Pgm. Nous avons montré que Spt16-1 était nécessaire à la localisation correcte de Pgm responsable de l’introduction des cassures double brin dans les macronoyaux en développement. Nous proposons un modèle dans lequel Spt16-1 favorise l’interaction de la machinerie d’excision avec la chromatine pour rendre accessible les sites de coupure sur l’ADN à Pgm.La méthylation des adénines sur l’ADN (6mA), bien connue chez les bactéries pour son rôle dans le système de restriction modification, a été décrite ces deux dernières années chez plusieurs eucaryotes en faible proportion dans le génome. Cependant son rôle chez les eucaryotes est encore peu compris. D’anciennes analyses par chromatographie à l’aide de nucléotides marqués détectaient de l’ordre de 2,5% des adénines méthylées chez P. tetraurelia mais sa localisation précise n’avait jamais été montrée. Il avait été proposé que cette modification pourrait signaler avec précision les sites de coupures pendant les réarrangements d’ADN où une partie des séquences germinales présentent des bornes AT. L’abondance des adénines méthylées fait de la paramécie un excellent modèle d’étude de cette modification. En combinant des techniques d’Immunofluorescence, d’HPLC-MS et de séquençage, nous avons ainsi décrit la présence et la localisation dans la cellule et au cours du cycle de vie de 6mA chez P. tetraurelia. Ces approches ont également permis de montrer l’absence de cytosine méthylée chez la paramécie. Nous avons montré que la méthylation des adénines était retrouvée majoritairement dans le génome somatique et de manière transitoire dans le génome germinal. Elle est établie au cours du développement du macronoyau somatique quand se produisent les réarrangements du génome. Ces résultats préliminaires permettront de poursuivre l’étude de la méthylation afin d’identifier les enzymes responsables et son rôle dans la cellule
In eukaryotes, chromatin organization is required for the regulation of gene expression and genome stability. Ciliate provide excellent model to study mechanisms involved in maintain of genome integrity. Our study model, the unicellular eukaryote Paramecium tetraurelia, has the particularity to eliminate massively and reproducibly 30% of germinal DNA sequences during the development of the somatic macronucleus after sexual events. Those sequences are eliminated by a multi-step process involving small RNA-directed heterochromatin formation followed by DNA excision by the domesticated transposase Piggy Mac (Pgm) and DNA repair. Molecular mechanisms underlying the specific recognition of those germinal sequences in chromatin context and the precision of the excision, remain elusive. The histone chaperone Spt16, associated to its partner Pob3, is part of the heterodimeric complex FACT (FAcilitates Chromatin Transactions). FACT is implicated in many mechanisms involving DNA metabolism such as transcription, repair, replication or chromatin accessibility. In P. tetraurelia, we identified two homologous proteins to Spt16 and Pob3 expressed only during macronucleus development at the time when genome rearrangements occur. Spt16-1 and Pob3-1 fused to GFP are localized in developing macronuclei. We showed that Spt16-1 is required to obtain a viable sexual progeny. Genome re-sequencing after SPT16-1 inactivation showed that Spt16-1 was required for all DNA elimination events and leads to similar phenotypes and defects to those obtained after PGM inactivation. Spt16-1 acts downstream of small RNA-directed heterochromatin formation and upstream of Pgm. We showed that Spt16-1 was required for the correct localization of Pgm responsible for DNA double strand breaks in developing macronuclei. We proposed a model in which Spt16-1 mediates interaction between chromatin and excision machinery that facilitates access to DNA cleavage sites for the Pgm endonuclease. Adenine DNA methylation, well known in bacteria for its role in restriction modification system, has been described during the last two years in several eukaryotes but in low proportion in the genome. However, its role in eukaryotes remains elusive. Previous analyses by chromatography with radio labelled nucleotides detected around 2,5% of methylated adenine in P. tetraurelia but its precise localization and role have never been analyzed. It has been proposed that this modification could mark with precision the excision sites during genome rearrangements when part of the eliminated sequences carry AT boundaries. The abundance of methylated adenine makes of Paramecium an excellent model to study this modification. Combining immunofluorescence techniques, HPLC-MS and sequencing, we described the presence and the cellular localization during life cycle of 6mA in P. tetraurelia. Those approaches allowed us to show that methylated cytosine are absent in Paramecium. We showed that methylation is mainly found in the somatic genome and transiently in germinal genome. It appears during somatic macronucleus development when genome rearrangements occur. Those preliminary results will allow us to pursue the study of adenine methylation by identifying responsible enzymes and its role in the cell

La méthylation des histones constitue un niveau important de contrôle épigénétique chez les eucaryotes. Mes études portent sur la caractérisation des facteurs potentiellement intervenant dans la mise en place et la lecture de la méthylation pour mieux apprécier son rôle et des mécanismes sous-jacents dans la régulation de la transcription et du développement des plantes chez l’Arabidopsis thaliana. Ainsi, la première partie de mes travaux de thèse a contribué à l’étude d’une protéine à domaine SET (SET DOMAIN GROUP7, SDG7) et à montrer que SDG7 est nécessaire au bon déroulement de l'induction de VIN3 et du processus de vernalisation pour la floraison. Nos résultats suggèrent que SDG7 pourrait méthyler une protéine non-histone encore inconnue dans la régulation de la transcription et le contrôle de la durée de vernalisation. La deuxième partie de ma thèse porte sur l’étude de SDG8 et les H2B-UBIQUITIN-ligases HUB1/HUB2 pour examiner un cross-talk éventuel entre la triméthylation de H3K36 (H3K36me3) et la monoubiquitination d’H2B (H2Bub1). Nous avons montré que H3K36me3 et H2Bub1 sont déposés largement indépendamment, qui diffère d’une dépendance hiérarchique de déposition préalablement observée chez la levure. La dernière partie de ma thèse a permis l’identification des protéines HUA2/HULK2 à domaine PWWP comme lecteurs éventuels de H3K36me3 dans la régulation de la floraison et du développement des plantes
Histone methylation is one of the keys epigenetic marks evolutionarily conserved in eukaryotes. My study focuses on the characterization of factors potentially involved in the deposition and reading of lysine (K) methylation to appreciate its role and underlying mechanisms in the regulation of transcription and plant development, using Arabidopsis thaliana as a model organism. In the first part of my thesis, I report on our study of SET DOMAIN GROUP7 (SDG7), a protein containing the evolutionarily conserved SET domain, which is generally recognized as a signature of K-methyltransferases. We found that SDG7 plays an important role in the regulation of VIN3 induction associated with cold duration measure during vernalization treatment. Intriguingly, levels of several different histone methylations were found unchanged in the sdg7 mutant plants and the recombinant SDG7 protein failed to show a histone-methyltransferase activity in vitro. We thus conclude that SDG7 might methylate a yet unknown non-histone protein to regulate transcription and proper measurement of the duration of cold exposure in the vernalization process. In the second part, I studied interaction between SDG8 and HISTONE MONOUBIQUITINATION1 (HUB1) and HUB2. My results unravel that H3K36me3 and H2Bub1 are deposited largely independently in Arabidopsis, which is in contrast to the dependent crosstalk of these two different epigenetic marks previously reported in yeast. In the last part of my thesis, I report on the identification of the PWWP-domain proteins HUA2/HULK2 as readers of H3K36me3 and demonstrate that sdg8 and hua2 genetically interacts in the regulation of flowering time

Les gènes soumis à empreinte (GSE) se distinguent du reste du génome par une expression mono-allélique et parent-spécifique. Cette forme de régulation génique dépend de marques de méthylation différentielles héritées des gamètes parentaux au niveau de régions cis-régulatrices appelées ICR (« Imprinting Control Region »). Une centaine de GSE contrôlés par 20 ICR ont été répertoriés chez la souris et sont en général conservés chez l’Homme. Mon projet de thèse a consisté à caractériser de nouvelles ICR maternelles et à analyser leur impact sur la régulation génique, à partir d’un criblage génomique de méthylation réalisé chez la souris. J’ai ainsi participé à la révélation de l’existence de trois formes d’empreinte, qui résultent de sensibilité différente des ICR face aux changements développementaux des profils de méthylation génomique: 1) une empreinte persistante tout au long de la vie et ubiquitaire, qui caractérise les ICR classiques déjà connues, 2) transitoire, avec une existence limitée au développement pré-implantatoire, et 3) persistante tout au long de la vie mais tissu-spécifique. Plus précisément, j’ai déterminé les profils d’histones associées aux ICR des loci Cdh15 et Gpr1/Zdbf2, et mis en évidence la conservation de l’empreinte transitoire au locus GPR1/ZDBF2 chez l’humain. Je me suis ensuite focalisée sur l’ICR candidate associée au gène Socs5, dont l’empreinte s’est avérée être tissu-spécifique mais également, de façon inédite, polymorphique en fonction des lignées de souris. Cette ICR en position intragénique présente les caractéristiques d’une séquence « enhancer », hypothèse que je teste actuellement par invalidation fonctionnelle (système CRISPR/Cas9) chez la souris. La découverte de ces formes atypiques d’empreinte génomique permet de mieux cerner l’étendue du phénomène d’empreinte parentale et d’évaluer son impact sur les phénotypes
Genomic imprinting refers to the functional non-equivalence of the two parental genomes in mammals. Imprinted genes are expressed only from the paternal or maternal allele: this mono-allelic expression is regulated by parent-inherited DNA methylation of specific cis-regulatory regions called ICRs (Imprinting Control Regions). There are currently around 120 imprinted genes known in the mouse genome, which are under the control of 20 characterized ICRs, and are generally conserved in Human. My thesis project aimed at characterizing new maternal ICRs and at analyzing their impact on gene regulation, based on a genome-wide methylation screen conducted in the mouse. I participated to revealing the existence of three forms of genomic imprinting, which reflects variable susceptibility to developmentally-regulated DNA methylation changes: 1) ubiquitous and life-long imprinting, which refers to the 20 canonical ICRs, 2) transient, whose existence is limited to preimplantation development, and 3) tissue-specific. More specifically, I deciphered the histone modification profiles of two new maternal ICR associated with the Cdh15 and the Gpr1/Zdbf2 loci and confirmed that the GPR1/ZDBF2 locus is also subject to transient imprinting in Human. My main achievement concerns the characterization of a candidate ICR associated with the Socs5 gene, which I found to be tissue-specific but also strain-specific, pointing towards a new form of imprinting polymorphism. This ICR has an intragenic position and has the characteristics of an enhancer, hypothesis that I am functionally testing in vivo by a CRISPR/Cas9-mediated deletion. The discovery of these new forms of genomic imprinting provides a better understanding of this phenomenon and its impact on phenotypes

Les gènes soumis à empreinte (GSE) se distinguent du reste du génome par une expression mono-allélique et parent-spécifique. Cette forme de régulation génique dépend de marques de méthylation différentielles héritées des gamètes parentaux au niveau de régions cis-régulatrices appelées ICR (« Imprinting Control Region »). Une centaine de GSE contrôlés par 20 ICR ont été répertoriés chez la souris et sont en général conservés chez l’Homme. Mon projet de thèse a consisté à caractériser de nouvelles ICR maternelles et à analyser leur impact sur la régulation génique, à partir d’un criblage génomique de méthylation réalisé chez la souris. J’ai ainsi participé à la révélation de l’existence de trois formes d’empreinte, qui résultent de sensibilité différente des ICR face aux changements développementaux des profils de méthylation génomique: 1) une empreinte persistante tout au long de la vie et ubiquitaire, qui caractérise les ICR classiques déjà connues, 2) transitoire, avec une existence limitée au développement pré-implantatoire, et 3) persistante tout au long de la vie mais tissu-spécifique. Plus précisément, j’ai déterminé les profils d’histones associées aux ICR des loci Cdh15 et Gpr1/Zdbf2, et mis en évidence la conservation de l’empreinte transitoire au locus GPR1/ZDBF2 chez l’humain. Je me suis ensuite focalisée sur l’ICR candidate associée au gène Socs5, dont l’empreinte s’est avérée être tissu-spécifique mais également, de façon inédite, polymorphique en fonction des lignées de souris. Cette ICR en position intragénique présente les caractéristiques d’une séquence « enhancer », hypothèse que je teste actuellement par invalidation fonctionnelle (système CRISPR/Cas9) chez la souris. La découverte de ces formes atypiques d’empreinte génomique permet de mieux cerner l’étendue du phénomène d’empreinte parentale et d’évaluer son impact sur les phénotypes
Genomic imprinting refers to the functional non-equivalence of the two parental genomes in mammals. Imprinted genes are expressed only from the paternal or maternal allele: this mono-allelic expression is regulated by parent-inherited DNA methylation of specific cis-regulatory regions called ICRs (Imprinting Control Regions). There are currently around 120 imprinted genes known in the mouse genome, which are under the control of 20 characterized ICRs, and are generally conserved in Human. My thesis project aimed at characterizing new maternal ICRs and at analyzing their impact on gene regulation, based on a genome-wide methylation screen conducted in the mouse. I participated to revealing the existence of three forms of genomic imprinting, which reflects variable susceptibility to developmentally-regulated DNA methylation changes: 1) ubiquitous and life-long imprinting, which refers to the 20 canonical ICRs, 2) transient, whose existence is limited to preimplantation development, and 3) tissue-specific. More specifically, I deciphered the histone modification profiles of two new maternal ICR associated with the Cdh15 and the Gpr1/Zdbf2 loci and confirmed that the GPR1/ZDBF2 locus is also subject to transient imprinting in Human. My main achievement concerns the characterization of a candidate ICR associated with the Socs5 gene, which I found to be tissue-specific but also strain-specific, pointing towards a new form of imprinting polymorphism. This ICR has an intragenic position and has the characteristics of an enhancer, hypothesis that I am functionally testing in vivo by a CRISPR/Cas9-mediated deletion. The discovery of these new forms of genomic imprinting provides a better understanding of this phenomenon and its impact on phenotypes

Chez les eucaryotes, l’expression des gènes dépend en partie du degré de compaction de la chromatine. La structure chromatinienne est régulée par des marques dites épigénétiques,telles que les modifications post-traductionnelles des protéines structurelles de la chromatine, les histones. Ainsi, la méthylation de la lysine 9 de l’histone H3 (H3K9) sur le promoteur des gènes est essentiellement associée à la répression de la transcription. H3K9 est méthylée par différentes enzymes appelées lysine méthyltransférases (KMTs). L’objectif principal de mon projet de thèse a été de mieux comprendre le rôle de principales KMTs de H3K9, que sontG9a, GLP, Suv39h1 et SETDB1, dans la régulation de l’équilibre entre prolifération et différenciation terminale. Pour cela, j’ai utilisé le modèle de différenciation terminale de cellules du muscle squelettique. En effet, durant la différenciation terminale, les myoblastes arrêtent de proliférer et fusionnent entre eux pour former de longues cellules multi nucléées que sont les myotubes. Ce processus implique, d’une part, l’expression des gènes de différenciation musculaire et, d’autre part, la répression irréversible des gènes associés à la prolifération cellulaire. L’introduction bibliographique de ce travail de thèse est séparée en trois chapitres. Le premier chapitre porte sur la chromatine et ses modifications post-traductionnelles. Le second s’attache à décrire les rôles de la méthylation de H3K9 et, en particulier, des quatre KMTs sur lesquelles j’ai travaillé durant ma thèse : G9a, GLP, SETDB1 et Suv39h1. Dans le troisième chapitre, je présente le modèle de la différenciation terminale du muscle squelettique. Dans la partie "Résultats", je décris deux des principales études que j’ai menées durant ma thèse. La première porte sur les rôles antagonistes de G9a et GLP. La seconde porte sur le rôle de SETDB1 durant la différenciation musculaire. Les résultats que j’ai obtenus sont discutés dans cette partie. Je conclus ce manuscrit en discutant mes résultats de manière plus générale et en proposant des perspectives à long terme. Enfin, une annexe présentera les autres articles de recherche auxquels j’ai participé pendant ma thèse
In eukaryotes, gene expression partly relies on chromatin compaction degree. Chromatin status is controlled by epigenetic marks, such as histones (chromatin structural proteins) posttranslational modifications. As an example, histone H3 lysine 9 (H3K9) methylation on gene promoters is mainly associated with transcriptional repression. H3K9 is methylated by several enzymes called lysine methyltransferases (KMTs). The aim of my thesis project was to understand the role of the H3K9 KMTs, G9a, GLP, Suv39h1 and SETDB1 in regulating the balance between proliferation and terminal differentiation. For this purpose, I used skeletal muscle terminal differentiation as model. Upon muscle terminal differentiation, myoblasts exit, in an irreversible way, from the cell cycle and under go differentiation where cells fusion and form myotubes. During this process, cell cycle genes are permanently silenced and muscle specific genes are activated. Thesis introduction is divided into three chapters. The first chapter focuses on chromatin and post-translational modifications. The second chapter describes H3K9 methylation characteristics and the role of the four KMTs that I studied during my thesis project: G9a,GLP, Suv39h1 and SETDB1. In the third chapter, the skeletal muscle terminal differentiation model is described in details. Results section reports my two major studies outcomes and their discussion. The first concerns the antagonistic roles of G9a and GLP regarding the muscle terminal differentiation and the second focuses on the role of SETDB1 during muscle differentiation. Finally, I conclude this manuscript by a plainer discussion followed by long term perspectives and an appendix presents other research articles, in which I collaborated during my PhD

Le striatum est une région du cerveau impliquée dans d'importantes fonctions physiologiques telles que l'apprentissage par renforcement ou le contrôle du mouvement, mais aussi dans des pathologies comme l'addiction. Le fonctionnement de ce système s'appuie sur deux types de neurones de projection, appelés " neurones épineux de taille moyenne ". Les uns expriment le récepteur de la dopamine de type 1 (D1R) et les autres expriment le récepteur de type 2 (D2R). L'objectif de cette thèse est de caractériser ces deux types de neurones au niveau épigénétique, en conditions basales et après traitement à la cocaïne. Il a été nécessaire de développer de nouvelles méthodes utilisant la cytométrie de flux pour distinguer les populations de neurones exprimant D1R ou D2R. La première méthode utilise des souris transgéniques L10a-GFP et du tissu non fixé, la seconde répond aux limitations de la précédente et utilise du tissu fixé. Nous avons montré que la cocaïne régule de nombreuses modifications post-traductionnelles d'histones, de façon spécifique de populations neuronales. Par ailleurs, nous avons identifié plus d'une centaine de gènes différemment méthylés ou hydroxyméthylés entre les deux types neuronaux. Certains gènes sont déjà connus pour avoir un rôle fonctionnel important dans l'une des populations. La comparaison des neurones exprimant D1R ou D2R est un bon modèle pour explorer les liens entre méthylation de l'ADN, hydroxyméthylation et transcription. Par exemple, nous observons une association très claire entre l'augmentation de la méthylation de l'ADN et la répression de la transcription, ainsi qu'une corrélation entre modifications de méthylation et d'hydroxyméthylation
The striatum is a brain region implicated in physiological functions such as reinforcement learning or movement selection but also in pathologies such as addiction or Parkinson’s disease. It relies on two types of projecting neurons, named “medium spiny neurons” because of their morphology. They are very similar but have a complementary and opposite role. One type expresses the dopamine receptor type 1 (D1R) and the other type expresses the dopamine receptor type 2 (D2R). The aim of this work was to characterize this two neuronal types epigenetically, in basal conditions and after cocaine treatment. We have developed new flow cytometry techniques to be able to distinguish the two cell types. The first method uses transgenic L10-eGFP mice and fresh tissue, the second one goes beyond the limitations of the first one and uses fixed tissue. We have shown that cocaine regulates many post-translational histone modifications, dynamically, and differently between the two populations. Moreover, we have identified more than 100 genes differentially methylated or hydroxymethylated between the two neuronal types. Some of these genes are already known for having a functional role in one of the populations. The comparison between D1R and D2R neurons is a good model to explore the links between DNA methylation, hydroxymethylation and transcription. For example, we have observed a strong association between an increase in DNA methylation and a transcriptional repression, as well as a correlation between DNA methylation and hydroxymethylation

Le cancer, principale cause de mortalité dans le monde, est un problème majeur de santé publique. Malgré les nombreux traitements disponibles, il est nécessaire de développer de nouvelles thérapies plus efficaces et moins envahissantes. Aujourd’hui la connaissance du génome humain a dirigé la recherche vers de nouvelles approches: il est possible de moduler la réponse biologique en contrôlant l'accès aux informations génétiques via la régulation épigénétique.L’épigénétique est l’ensemble des modifications de l’expression des gènes n’entraînant pas de modifications dans la séquence d’ADN, qui mènent à un phénotype héritable et stable. Chez les eucaryotes, la régulation épigénétique implique des modifications covalentes de l'ADN (méthylation) et des histones (acétylation, méthylation…). Ces phénomènes modifient la structure de la chromatine, aboutissant à une configuration "ouverte" ou "fermée" permettant la transcription ou la répression de gènes. Dans une situation cancéreuse, le profil épigénétique est modifié ; la méthylation anormale de l’ADN ou des histones mène à la répression de certains gènes comme des gènes suppresseurs de tumeur, ou à l’expression des oncogènes. Contrairement aux changements génétiques irréversibles, les aberrations épigénétiques sont des modifications chimiques réversibles. Ainsi, des molécules capables de rétablir l'équilibre épigénétique représentent des outils thérapeutiques potentiels contre le cancer.La méthylation et l’acétylation sont les modifications épigénétiques les plus étudiées. La méthylation de l’ADN est catalysée par les ADN méthyltransférases (DNMTs), et la méthylation des histones par les histones méthyltransférases (HMTs).Le sujet de ce projet doctoral est porté sur les HMTs et en particulier sur DOT1L (DOT1 like, disruptor of telomericsilencing), responsable des méthylations du résidu Lys79 de l’histone 3 (H3K79), conduisant à la transcription des oncogènes. En effet, des études ont montré que DOT1L est liée à la leucémie et se révèle être une cible intéressante à inhiber. DOT1L comme les DNMT ont un même cofacteur : le SAM (S-adénosyl-L-méthionine). Certains de leurs inhibiteurs présentent un mécanisme d'inhibition commun : ils entrent en compétition avec SAM.Nous présentons la conception basée sur des études de modélisation moléculaire, et la synthèse multi-étapes des séries des molécules formées par 3 motifs principaux : a) un motif aminopyrimidine, b) un motif de type benzimidazole ou phénylurée, liés par c) un groupement phényle ou hétérocyclique. L’activité des composés synthétisés sur DOT1L a été évaluée et des relations structure-activité (RSA) ont été établies. L’activité sur DNMT et d’autres HMTs a été déterminée également afin d’étudier la spécificité de nos composés.Différents structures ont été identifiées comme point de départ pour aboutir à des inhibiteurs sélectives de DOT1L ou à des inhibiteurs mixtes DOT1L/DNMT. Ces molécules sont considérées comme des outils thérapeutiques intéressants dans le traitement du cancer
Cancer is a serious issue of public health as it is one of the main causes of mortality worldwide. Despite the multiple available treatments, it is necessary to develop more efficient and less invasive therapies against cancer. The knowledge of the human genome and epigenome has directed research to new cancer treatment approaches: it is possible to modulate the biological outcome by controlling the access to the genetic information by means of the epigenetic regulation.Epigenetics are the changes happening on the genome without modifying its DNA sequence, leading to a heritable andstable phenotype. In the eukaryotic chromatin, epigenetic regulation implies covalent modifications of DNA and histones. These chemical modifications remodel the chromatin structure leading to an “opened” or “closed” configuration, which is related to the expression or repression of genes. The epigenetic landscape is altered in cancers; for example, abnormal methylation leads to the silencing of certain genes (such as tumor suppressor genes), or to the over-expression of oncogenes. Unlike genetic alterations that are irreversible, epigenetic aberrations are reversible. Thus, molecules that can reestablish the epigenetic balance represent potent therapeutic tools for cancer treatment.Methylation and acetylation are the most studied epigenetic modifications. DNA methylation is carried out by the DNAmethyltransferases (DNMTs) and histone methylation by the histone methyltransferases (HMTs).This PhD project was focused on the histone methyltransferase DOT1L (DOT1 like, disruptor of telomeric silencing), responsible of methylation of residue Lys79 of histone 3 (H3K79), which leads to the transcription of some oncogenes. Recent studies have shown that DOT1L is implicated in MLL-rearranged leukemia (MLL-r, Myeloid-Lymphoid Leukemia) thus it is a potent target in cancer. As DOT1L and DNMTs share the same cofactor, S-adenosyl-L-methionine (SAM), DNMT and DOT1L inhibitors can present a common inhibition mechanism by competing with SAM.We present herein the in silico – based design, and the multi-step synthesis of some series of molecules containing 3 main moieties: a) an aminopyrimidine motif and b) a benzimidazole or phenylurea motif, linked by c) a phenyl or heterocycle motif. DOT1L activity was determined for the different compounds synthesized and structure-activity relationships (SAR) were established. The activity on DNMT and other HMTs was determined as well, in other to study the DOT1L specificity of our compounds.Different scaffolds were identified to obtain DOT1L-selective or DOT1L/DNMT dual inhibitors. These molecules are interesting therapeutic tools for cancer treatment

Les relations entre les histones qui composent les nucléosomes et le processus de transcription des gènes codants, sont à la fois multiples et extrêmement complexes. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé à deux de ces relations. Tout d’abord, une première étude a été réalisée en collaboration avec les laboratoires de Franck Holstege et de Catherine Dargemont. Ce travail permet de préciser clairement l’effet des différentes formes de méthylation de la lysine 4 de l’histone H3 sur l’activité transcriptionnelle. Dans cette étude nous démontrons que la méthylation de H3K4 n’influence la transcription que d’un nombre très limité de gènes. Concernant ces gènes, un profil non conventionnel de distribution des formes de méthylation de H3K4 a été identifié par la présence inhabituelle d’un enrichissement en 3’ de ces gène des formes di- et triméthylées de H3K4.L’effet majoritaire de cette marque est d’induire une répression transcriptionnelle selon au moins deux mécanismes distincts. L’enrichissement atypique de la triméthylation de H3K4 influence négativement l’expression des gènes via la production d’ARN non codant anti-sens. Concernant l’effet répressif associé à la diméthylation de H3K4, la quantité d’ARN anti-sens ainsi que sa production ne sont pas impliquées.Dans une seconde étude réalisée en collaboration avec les laboratoires de Sebastian Chavez etd’Akash Gunjan, nous nous sommes intéressés au complexe FACT qui est impliqué dans l’assemblage et le désassemblage des nucléosomes lors du passage de l’ARN polymérase II. Jusqu’alors, un défaut de croissance chez les mutants thermosensibles du complexe FACT avait pu être observé. Dans notre étude, nous montrons que l’altération de FACT conduit, lors de la transcription, à l’éviction d’histones normalement incorporées à la chromatine. L’accumulation de ces histones libres à fort potentiel toxique, induit une répression spécifique de CLN3 qui code pour la première cycline dephase G1. Pour la première fois, nous mettons en évidence dans cette étude l’existence d’un mécanisme de surveillance moléculaire du cycle cellulaire induit par l’excès d’histones non incorporées à la chromatine
Relationships between histones, components of nucleosomes, and the transcription process of coding genes are both multiple and extremely complex. During my Thesis, I looked at twoof these relationships. First, we performed a study in collaboration with the Franck Holstedge and Catherine Dargemont labs. This work has allowed us to clearly define the effect of various methylation forms of the lysine 4 of the histone 3 on gene transcription. In this study we have shownthat H3K4 methylation influences the transcription of only a very limited number of genes. For these genes, a non conventional distribution profile of H3K4 methylation forms has been identified by the presence of an unusual enrichment in di- and trimethylated H3K4 in the 3’ of these genes. The principal effect of this mark is to promote transcriptional repression by at least two distinct mechanisms. The atypical enrichment of H3K4 trimethylation negatively influences gene expressionvia the production of non coding antisense RNA. For the repressive effect associated with dimethylH3K4, the quantity of antisense RNA as well as its production are not involved. We propose severalh ypotheses that link our results to the data known on this subject. In a second study performed incollaboration with the Sebastian Chavez and Akash Gunjan labs, we concentrated on the FACT complex that is involved in the assembly and disassembly of nucleosomes as RNA polymerase IImoves past. Previously, a growth defect in thermosensitive mutants of the FACT complex had been observed. In our study, we show that FACT deterioration leads to the eviction of histones that arenormally incorporated into chromatin during transcription. The accumulation of these free histones,which have a high toxic potential, induces the specific repression of CLN3 which encodes for the firstcyclin of G1 phase. For the first time, we show in this study the existence of a cell cycle molecular surveillance mechanism that is induced by an excess of free histones

La méthylation des histones par des histone-méthyltransférases est essentielle à la régulation de la transcription. Chez les végétaux, plusieurs méthyltransférases jouent un rôle central dans différents processus cellulaires. Lors de ma thèse, j'ai étudié la fonction biologique de deux d’entre elles dans le contrôle des réponses à plusieurs stimuli chez Arabidopsis thaliana. Premièrement, mes résultats ont permis de démontrer que SDG8, une méthyltransférase spécifique de H3K36, contrôlait la transcription de NPR1, un acteur central de l’immunité induite par l’acide salicylique, et en lien avec la RNAPII permettait l’induction transcriptionnelle efficace de plusieurs gènes de défense suite à leur stimulation. Deuxièmement, j'ai démontré que SDG26, une méthyltransférase proche de SDG8, jouait un rôle important dans la réponse aux stress abiotiques. J'ai découvert ainsi que SDG26 régulait la réponse au froid en activant directement la transcription des gènes SOC1 et CBF en se liant à leur chromatine et en déposant H3K36me3. Sachant que l’acide abscissique (ABA) joue un rôle important dans la réponse aux stress abiotiques, j'ai pu constater que SDG26 contrôlait l'accumulation d'ABA en régulant l'expression de gènes liés à son homéostasie. Enfin, j'ai confirmé par une approche génétique que SDG26 était un élément appartenant à la voie de floraison dite autonome. Au sein d'un complexe multi-protéique comprenant l'histone déméthylase FLD, le facteur de transcription homéobox LD, ainsi qu'un composant de COMPASS, APRF1, SDG26 semble contrôler la transcription du répresseur de floraison, FLC, ainsi que de sa cible, l'activateur de floraison SOC1, afin de réguler précisément la transition florale
Histone methylation catalyzed by histone methyltransferase is essential in transcriptional regulation of gene expression. Histone methyltransferases are known to play crucial roles in multiple cellular processes in plants. My PhD work investigated the biological function of two histone methyltransferases in controlling plant responses to various environmental stimuli in Arabidopsis thaliana. In the first part, my results demonstrated that the H3K36-methyltransferase SDG8 transcriptionally regulates NPR1, a central player in salicylic acid-mediated immunity and co-acts with the RNAPII to enable the efficient transcriptional induction of several defense genes upon stimulation. In the second part, my work unraveled that SDG26, another ortholog of the animal H3K36-methyltransferase, plays an important role in plant response to abiotic stresses. By focusing on cold stress, SDG26 was shown to regulate the cold stress response by directly activating the transcription of SOC1 and CBF genes through binding their chromatin and depositing H3K36me3. Interestingly, SDG26 mastered the accumulation of ABA by regulating the expression of ABA homeostasis-related genes, suggesting an involvement of ABA pathway in the cold response. In the last part, using a genetic approach my work established SDG26 as an autonomous flowering pathway component. Accordingly, SDG26 was found in a multiple-protein complex comprising the histone demethylase FLD, the homeobox-domain transcription factor LD, as well as a putative COMPASS component APRF1. This multiple-protein complex was found in controlling the repression of the major flowering repressor FLC as well as the activation of the flowering activator SOC1 to precisely regulate the floral transition

Troisième dystrophie musculaire en terme d’incidence, la dystrophie facio-scapulo-humérale est une maladie qui reste encore énigmatique. Bien qu’elle a été montrée comme associée à la contraction d’un macrosatellite, D4Z4, au niveau du subtélomère 4q35 au début des années 1990, l’origine des modifications observées chez les patients est encore mal connue. C’est pourquoi nous nous sommes intéressés à différents aspects de la pathologie. Tout d’abord, nous avons étudié l’expression des gènes de la région 4q35 ainsi que de gènes impliqués dans la physiologie musculaire chez des fœtus et des adultes porteurs ou non d’une contraction du nombre de D4Z4 et avons ainsi pu mettre en évidence que les dérégulations géniques étaient déjà observable chez les fœtus, faisant de ceux-ci un modèle relevant d’étude de la pathogénèse précoce de la FSHD. Nous nous sommes ensuite intéressés à la régulation épigénétique de deux gènes situés au niveau du locus 4q35 et avons pu observer que des modifications épigénétiques globales pouvaient, ou non, moduler l’expression de ces gènes et ce dépendamment du nombre de répétitions du macrosatellite. Enfin, nous avons analysé la régulation de la région par l’effet de position télomérique et avons remarqué que seuls certains gènes de la région, distants, étaient régulés par ce mécanisme épigénétique. Ces résultats nous ont permis d’avancer un peu plus dans la connaissance de la dystrophie facio-scapulo-humérale et de valider un nouveau modèle d’étude de la pathologie
Hird more frequently myopathy, the facioscapulohumeral dystrophy is an enigmatic disease. It is associated with the macrosatellite D4Z4 contraction since 90’s but the origin of the modifications observable in patients remains unclear. That’s why, we have focused our work in different aspects of this disease. First of all, we have studied expression of 4q35 and muscular genes in fetuses and adults carrying a contraction of the D4Z4 macrosatellite and shown that the molecular deregulations can be observed since the fetal stage. So, we have validated this model as an interesting model to study the early FSHD pathogenesis. Secondly, we have been interested in epigenetic regulation of two genes located in the 4q35 region and have observed a modulation of their expression in a global epigenetic modulation contest. Those deregulations depend on the number of D4Z4 repeats. Finally, we have analyzed the region regulation by telomere position effect and have noted only some genes are deregulated by this epigenetic mechanism. With those results, we have progressed in the FSHD pathogenesis knowledge and we have validated a new model to study this pathology

L'épigénome est défini par l’ensemble de l’information chromatinienne autre que celle fournie par la séquence ADN. Au sein d'une même espèce et pour un type cellulaire donné, chaque individu présente des caractéristiques particulières de l'épigénome. Les épi-polymorphismes, définis comme étant les différences inter-individus de marques chromatiniennes, sont encore partiellement caractérisés et peuvent être liés aux phénotypes de chacun. La première partie de mon travail a été d'identifier et d'interpréter chez S.cerevisiae l'impact des épi-polymorphismes de modification des queues d'histones. Pour y parvenir, j'ai cartographié les épigénomes de cinq modifications différentes (3 acétylations et 2 méthylations) chez trois souches de levures issues de différents isolats naturels. Par une méthode de ChIP-seq et le développement d'un outil informatique, j'ai comparé les épigénomes de ces souches à l'échelle de nucléosomes individuels. L'étude des propriétés génomiques des épi-polymorphismes m'a alors permis de découvrir certaines caractéristiques encore inconnues et décrites dans ce manuscrit.Par ailleurs, j'ai voulu aborder le lien entre épi-polymorphismes et réponse transcriptionnelle à l'environnement. Pour cela, j'ai construit un jeu de souches mutantes dérivées de souches naturelles, où certains épi-polymorphismes ne peuvent plus être maintenus. J'ai analysé par RNA-seq les transcriptomes de certaines de ces souches avant et après un changement environnemental. Malheureusement, l'analyse des résultats a révélé que la qualité des données ne permettent pas d'établir le lien recherché mais les outils mis en place sont désormais disponibles.J'ai enfin étudié la dynamique d'évolution d'un épigénome en présence ou en l'absence de pression de sélection. Pour cela, j'ai suivi une modification d'histone (l'acétylation de la lysine 14 de l'histone H3) chez la levure pendant 1.000 générations dans deux conditions d'évolution expérimentale différentes : l'une sélective, l'autre neutre. J'ai mis en évidence des différences remarquables et inattendues entre ces deux régimes évolutifs. Des études mécanistiques détaillées restent à faire pour caractériser la nature et les propriétés de ces différences
Epigenome is defined as the entire chromatin information other than the DNA sequence. Within a given species and for a given cell type, each indivual has specific epigenomic characteristics. Epigenomic differences between individuals (refered to as 'epi-polymorphisms') remain poorly characterized, although cases were reported where they could be linked to phenotypic differences. In my thesis, I used the model organism S. cerevisiae to identify histone modification epi-polymorphisms and study their biological impact. I profiled the epigenome of five different histone modifications (3 acetylations and 2 methylations) in three natural yeast strains. By ChIP-seq methods and software developments, I compared these strains at single-nucleosome resolution and discovered novel characteristics of these epi-polymorphisms which are described in this manuscript.Furthermore, I constructed a research framework to investigate the link between epi-polimorphisms and response to environmental cues. For this, I built a set of mutant strains derived from natural strains but where some epi-polymorphisms can no longer be maintained. I analyzed by RNA-seq the transcriptomes of some of these mutant strains before and after an environmental shift. Unfortunately, the quality of this initial data produced was not sufficient to link epi-polymorphisms to differntial responses, but the strain resources remain available for further investigations. Finally, I studied the evolutionary dynamics of epi-polymorphisms in the presence or absence of selection pressure. To do so, I followed the evolution of H3K14ac for 1.000 generations under two conditions of yeast experimental evolution ( selective or neutral). Marked differences were observed between the two regimes, revealing unexpected consequences of the presence of selection. Further mechanistic studies will be needed to elucidate the full properties of these differences