Tesis sobre el tema "Maturation ribosomique"

Les ribosomes constituent un des acteurs majeurs du mécanisme de traduction dans toute cellule vivante. La synthèse des ribosomes est un processus complexe commençant par la transcription d'un pré-ARN ribosomique (ARNr) contenant les futurs ARNr matures ainsi que des séquences qui vont être coupées tout au long de la biogenèse des sous-unités ribosomiques. Chez Saccharomyces cerevisiae, ce ne sont pas moins de 200 facteurs qui interviennent tout au long de ce processus. Nous nous sommes intéressés plus précisément à l'étape cytoplasmique de maturation de la petite sous-unité ribosomique, consistant en une coupure endonucléolytique permettant de passer d'un pré-ARNr 20S contenu dans une particule pré-40S à un ARNr 18S mature contenu dans une sous-unité 40S. Cette sous-unité mature peut ensuite initier la traduction. Le modèle initial proposait que la maturation de la petite sous-unité fût un prérequis à l'initiation de la traduction. Nos expériences ont permis d'observer qu'une fraction du pré-ARNr 20S cosédimente avec les complexes de 80S et polysomes. Cette fraction de pré-ARNr 20S est augmentée dans certains mutants où l'on bloque la maturation de la petite-sous unité dans le cytoplasme. Nous avons confirmé l'existence de ribosomes contenant des particules pré-40S et interagissant avec des ARNm par des approches biochimiques. Ainsi, nos données suggèrent que des sous-unités ribosomiques non matures peuvent initier la traduction. Ces ribosomes aberrants sont alors dégradés via le No Go decay, un mécanisme de contrôle-qualité des ARNs cytoplasmiques. Ainsi, le No Go Decay fonctionnerait comme le mécanisme ultime de contrôle-qualité des sous-unités ribosomiques 40S
Ribosomes constitute one of the major actors of the mechanism of translation in any living cell. The synthesis of ribosomes is a complex process beginning with the transcription of a pre-ribosomal RNA (rRNA) containing future mature rRNAs as well as sequences that are eliminated during ribosome biogenesis. In Saccharomyces cerevisiae, no less than 200 factors are implicated in this process. We were more precisely interested in the cytoplasmic step of the small ribosomal subunit maturation consisting of an endonucleolytic cleavage of the 20S pre-rRNA contained in a pre-40S particle and leading to the mature 18S rRNA contained in the 40S ribosomal subunit. The initial model was that 40S ribosomal subunit maturation might be a pre-requisite for translation initiation. Our experiments have led to the observation that a fraction of 20S pre-rRNA co-sediments with 80S complexes and polysomes. This 20S pre-rRNA fraction can be increased in mutants impaired in the cytoplasmic step of 40S ribosomal subunit maturation. By biochemical approaches, we confirmed the occurrence of ribosomes containing pre-40S particles and mRNAs. Thus, our data suggest that pre-40S particles can initiate translation. These aberrant ribosomes are then degraded via the No Go decay pathway involved in the quality control of some cytoplasmic RNAs. No-Go Decay would function as an ultimate quality control mechanism of the 40S ribosomal subunit

L'organisation fonctionnelle du noyau dépend de machineries nucléaires distribuées dans des domaines appelés corps nucléaires. Pour comprendre comment cette distribution est régulée,nous avons choisi le nucléole comme modèle d'étude. Nous nous sommes intéressés au trafic et à la compartimentation de la machinerie de maturation des ARNr pendant l'interphase et la mitose. Cette étude a nécessité l'utilisation de techniques de microscopie permettant le suivi de protéines en cellules vivantes telles que : le FRAP, la vidéomicoscopie et le tdFLIMFRET. Grâce à un système permettant de séparer réversiblement les machineries de transcription et de maturation des ARNr en interphase, nous avons montré que la machinerie de maturation est déconnecté des sites de transcription et se concentre dans des masses nucléaires issues du composant granulaire nucléolaire. Nous les avons nommées masses granulaires. Ce processus réversible, nous a permis d'étudier la reformation nucléolaire. Dans des cellules contrôles et grâce à un système de cellules perméabilisées, mis au point dans le laboratoire, nous avons montré que la reformation nucléolaire dépend de l'hydrolyse de l'ATP et que CK2 intervient dans la régulation de la compartimentation du nucléole. En sortie de mitose, nous avons montré que le recrutement des machineries de maturation précoce et tardive passe par les même PNB. La convergence des machineries dans un même site pourrait être l'origine de la formation des PNB. De plus, nous avons mis en évidence l'interaction des protéines B23 et Nop52 dans les PNB. Aussi, nous proposons, pour les PNB, un rôle de plateformes d'assemblage des complexes de maturation des ARNr
The functional organisation of the nucleus depends on machineries that are distributed in domains named nuclear bodies. To understand how this distribution is regulated we have chosen the nucleolus as example. We have focused our attention on traffic and compartmentation of the rRNA processing machinery during interphase and mitosis. To follow proteins in living cells we have used microscopy technologies such as: FRAP, videomicroscopy and tdFLIM-FRET. A reversible system capable of disconnecting the processing from the transcription machineries during interphase permitted us to show that the processing machinery can be disconnected from the transcription sites and accumulates in nuclear masses originating from the nucleolar granular component. We named these granular masses. This reversible process permitted us to study reformation of the nucleolus. In control cells and in an assay using permeabilized cells set up in the laboratory, we have shown that nucleolar reformation depends on ATP hydrolysis and that CK2 is involved in nucleolar compartmentation. At the exit of mitosis, we have shown that early and late processing machineries pass through the same PNB. The convergence of the machineries in a single site could be at the origin of PNB formation. Furthermore, we have demonstrated that Nop52 and B23 interact in the same PNB. For this reason, we propose that PNB are preassembly platforms for rRNA processing complexes

La biogenese des ribosomes eucaryotes met en jeu la synthese d'un long transcrit primaire appele pre-arnr. La molecule precurseur de l'arn ribosomique contient, outre les especes d'arnr matures, des sequences espaceurs qui sont excisees lors de coupures endo et exonucleolytiques. Les sequences d'arnr matures sont chimiquement modifiees durant ou immediatement apres la transcription du pre-arnr. Ces modifications sont principalement de deux types : des methylations en position 2'-o-ribose et des isomerisations de residus uridine en pseudouridine. Les cellules eucaryotes comportent un grand nombre de petits arn nucleolaires (snoarn) qui s'associent avec des proteines non ribosomiques sous forme de particules ribonucleoproteiques (snornp). La large majorite des snoarn peut etre repartie, sur la base de la conservation de motifs de sequence et de structure, en deux familles respectivement appelees famille des snoarn c/d et h/aca. Les snoarn c/d, tous associes avec une proteine nucleolaire phylogenetiquement tres conservee : la fibrillarine (nop 1p chez la levure), servent pour la plupart, de guides des methylation en position 2'-o-ribose. Nous avons montre que la proteine garlp de s. Cerevisiae requise pour la production de l'arnr 18s, est associee avec tous les snoarn h/aca et qu'elle est necessaire, a l'instar de nop 1p pour les methylations de ribose, a la pseudouridylation globale du pre-arnr. Ces resultats ont consitue le premier element tangible en faveur d'un role des snoarn h/aca dans la pseudouridylation. Peu de temps apres, l'equipe du dr. T. Kiss (lbme toulouse) a prouve que la majorite des snoarn h/aca remplit un role de guide de pseudouridylation. Nous avons ensuite etudie la proteine nucleolaire cbf5p qui presente les domaines consensus des pseudouridine synthases. Cette proteine est non seulement requise, de la meme maniere que garlp, pour la production de l'arnr 18s mais aussi pour la pseudouridylation globale du pre-arnr. Cependant nous ne pouvons affirmer qu'elle presente une activite pseudouridine synthase effective dans la mesure ou elle est indispensable a la stabilite des snoarn h/aca et de garlp. Nous avons isole, lors de la recherche de partenaires physiques de garlp, une nouvelle proteine nucleolaire nhp2p qui est tres certainement un nouveau constituant specifique de toutes les snornp h/aca. L'arn helicase potentielle roklp, que nous avons identifiee en tant que partenaire fonctionnel de garlp et de snr10 (snoarn h/aca guide de pseudoridylation et necessaire a la production de l'arnr 18s), est nucleolaire et impliquee dans la production de la grande sous-unite du ribosome. Il est probable qu'elle intervienne dans la formation et/ou la dissociation des duplex snoarn h/aca/pre-arnr formes pour l'isomerisation des uridines en pseudouridine.

La levure saccharomyces cerevisiae est le premier organisme eucaryote dont la sequence genomique nucleaire est entierement connue. La determination de cette sequence a ete realisee dans le cadre d'une collaboration internationale. L'une des plus grandes surprises due a ce travail a ete de decouvrir que le tiers seulement des genes de s. Cerevisiae avaient ete caracterises. Cette constatation a ete faite des la publication de la sequence nucleotidique du premier chromosome, chromosome iii. Un projet pilote d'analyse fonctionnelle des phases de lecture ouvertes inconnues a ete mis en place. Dans le cadre de ce projet, nous avons elabore des outils permettant une inactivation rapide et aisee des genes. Basee sur l'amplification par pcr du marqueur de deletion flanque de courtes sequences amont et aval du gene a inactiver, cette methode necessite l'utilisation d'une souche receptrice que nous avons construite, deletee pour le marqueur de selection. Quinze phases de lecture ouvertes du chromosome iii ont ainsi ete inactivees. Quatre genes ont fait l'objet d'une analyse plus approfondie. Pour trois d'entre eux, le role fonctionnel a ete etabli. Nous avons montre que le gene ycr003w code pour une proteine du ribosome mitochondrial et que son inactivation conduit au blocage de la respiration. Nous avons caracterise le gene ycl009c qui code pour la petite sous-unite regulatrice de l'acetolactate synthase et qui n'avait pu etre identifie, jusqu'ici, par des techniques de genetique classique. Enfin, nous avons etabli que le gene ycl031c code pour une proteine essentielle impliquee dans la maturation du precurseur 35s des arn ribosomiques et plus precisement dans la production de l'arn 18s.

Les ribosomes sont des complexes nucléoproétiques responsables de la traduction. Chez les eucaryotes, la biogenèse du ribosome est un processus complexe très régulé qui fait intervenir un nombre important de facteurs d’assemblages (~200). La construction d’un ribosome est initiée dans le nucléole puis continue dans le nucléoplasme et se termine dans le cytoplasme. La maturation cytoplasmique de la petite sous-unité ribosomale implique la dissociation séquentielle des facteurs d’assemblage tardifs et la maturation finale de l’ARNr 18S. Ce processus est catalysé par l’endonucléase Nob1 qui assure la coupure de l’extrémité 3’ du précurseur de l’ARNr 18S (pré-18S) aboutissant à sa forme mature. Ce mécanisme est coordonné par la protéine Pno1 qui est le partenaire de Nob1. Des informations détaillées sur l’architecture des particules pré-ribosomiques nous ont permis de mieux comprendre les différents intermédiaires de la biogenèse. Cependant, certains aspects fonctionnels comme la conformation adoptée par Nob1 pour assurer la coupure du site D du pre-18S reste encore flou. L’objectif de mon travail a été de mieux comprendre les aspects très tardifs de la maturation cytoplasmique du ribosome. Pour ce faire, nous avons redéfini l’organisation modulaire de l’endonucléase Nob1 chez les eucaryotes pour ensuite étudier son mode d’interaction avec son partenaire Pno1. Des tests fonctionnels in vitro ont été effectués pour étudier le rôle de Pno1 dans la régulation de la coupure par Nob1.Nos résultats nous ont permis de montrer que le domaine catalytique de Nob1 adopte une conformation atypique. En effet le domaine PIN est composé de deux fragments (res 1-104 and 230-255) séparé par une boucle interne qui est importante pour la reconnaissance avec son partenaire Pno1. Nos études nous ont également montré que Pno1 inhibe l’activité de Nob1 probablement en reconnaissant directement l’ARNr substrat, masquant ainsi le site de coupure de l’endonucléase. Ces résultats sont complémentaires et cohérents avec les données structurales de cryo-EM de la particule pré-40S humaine récemment publiées. En effet, Nob1 est dans une conformation incapable de couper le pré-ARNr puisque son domaine catalytique se retrouve à une distance d’environ 30Å de son ARN substrat. Ce phénomène implique donc des changements de conformations ou encore la nécessité de protéine accessoire pour déplacer certains facteurs. La protéine Cinap est impliqué dans la maturation de l’ARNr 18S. Nos études d’interaction avec les protéines localisées au niveau de la plateforme (à savoir RPS14, RPS26, le complexe Nob1/Pno1) ont permis de montrer que Cinap pouvait former un complexe tripartite avec l’endonucléase Nob1 et son partenaire Pno1. De plus, Cinap est capable de reconnaitre RPS26 dans un complexe RPS14-dépendant. Il est important de noter que RPS26 est un composant de la petite sous-unité qui remplace Pno1 dans le ribosome mature. De ce fait le recrutement de RPS26 au sein du pré-ribosome nécessite la dissociation de Pno1 et cet échange serait assurée par Cinap. Sur la base des travaux effectués, nous pouvons proposer un modèle de maturation où la formation du complexe Cinap/Pno1 induirait un changement de conformation permettant à Nob1 de reconnaitre son substrat et donc de catalyser la coupure du site D qui aboutit à la maturation de l’ARNr 18S et donc à la production de la sous-unité 40S mature
Ribosomes are translational machineries universally responsible of protein synthesis. In eukaryote, ribosome assembly is a complex and highly regulated process that requires coordinated action of more than 200 biogenesis factors. Ribosome assembly is initiated in the nucleolus, continues in the nucleoplasm and terminates in the cytoplasm. The cytoplasmic maturation events of the small ribosomal subunit are associated with sequential release of the late assembly factors and concomitant maturation of the pre-rRNA. During final maturation of the small subunit, the pre-18S rRNA is cleaved off by the endonuclease Nob1, which activity is coordinated by its binding partner Pno1. Detailed information on pre-ribosomal particle architectures have been provided by structural snapshots of maturation events. However, key functional aspects such as the architecture required for pre-rRNA cleavage have remained elusive. In order to better understand these late steps of cytoplasmic pre-40S maturation, we first redefine the domain organization of Nob1, then study its binding mode with Pno1 using different tools such as sequence analysis, structure prediction and biochemical experiments and, we then performed functional assay to elucidate the role played by Pno1 during the pre-18S rRNA maturation.Our results have shown that eukaryotic Nob1 adopts an atypical PIN domain conformation: two fragments (res 1-104 and 230-255) separated by an internal loop, which is essential for Pno1 recognition. We also found out that Pno1 inhibits Nob1 activity likely by masking the cleavage site. Our findings further support the recently published cryo-EM structure of the pre-40S, where Nob1 displays an inactive conformation. Moreover, 18S rRNA 3’-end cleavage has to happen and this implies structural rearrangement or requirement of some accessory proteins such as Cinap, an atypical kinase involved in pre-18S processing. Studying the interplay between proteins localized in the pre-40S platform (RPS14, RPS26, Nob1/Pno1 complex) has shown that Cinap is able to form a trimeric complex with Nob1 and its binding partner Pno1. Furthermore, Cinap can recognize RPS26 in a RPS14-dependent manner, which had already been studied with its yeast counterpart. It is important to note that RPS26 is the ribosomal protein replacing Pno1 in the mature ribosome. Our finding clearly suggests a mechanism where RPS26 recruitment to the ribosome requires Pno1 dissociation. This exchange would be carried out by Cinap. Therefore, we can suggest a simplified model as follow: upon binding with Pno1, the newly formed complex (Cinap/Pno1) will trigger a conformational change, which will allow the endonuclease Nob1 to reach its substrate (D-site) and perform its cleavage resulting in mature 18 rRNA generation

Dans les cellules eucaryotes, la biogenèse des ribosomes débute par la transcription des unités répétées d'ADN ribosomique (ADNr) par l'ARN polymérase I (Pol I). Ce processus génère un transcrit primaire (pré-ARNr), qui contient les séquences correspondant aux ARNr matures 18S, 5.8S et 25S. Le quatrième ARNr (5S) est transcrit indépendamment par Pol III. Le pré-ARNr s'associe de manière co-transcriptionnelle avec des protéines ribosomiques et de nombreux facteurs de maturation pour former une grande particule pré-ribosomique précoce appelée " particule 90S ". Cette particule précoce subit des étapes complexes de maturation générant les particules pré-40S et pré-60S à l'origine des deux sous-unités ribosomiques matures. Une partie de mes travaux de thèse a consisté en l'étude de l'hétérodimère Rpf2-Rrs1 chez la levure. Cet hétérodimère est connu pour son rôle essentiel dans le recrutement au sein des pré-ribosomes de la RNP 5S, une particule contenant l'ARNr 5S associé aux protéines ribosomiques RpL5 et RpL11. Nous avons révélé que Rpf2 et Rrs1 interagissent avec la chromatine de l'ADNr par des expériences d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) et que cette interaction ne dépend pas de l'intégrité des particules pré-ribosomiques. De plus, Rpf2 et Rrs1 interagissent avec des sous-unités de la Pol I et avec plusieurs facteurs associés à la chromatine de l'ADNr in vivo. Ces données suggèrent que le complexe Rpf2-Rrs1 est impliqué dans la régulation de la transcription Pol I en plus de sa fonction dans l'assemblage des pré-ribosomes. Nous avons observé par des expériences d'étalements de Miller que la perte d'expression de Rpf2 et Rrs1 est corrélée avec de fortes perturbations dans l'organisation des unités d'ADNr. Grâce à des expériences de " run-on ", une technique permettant d'évaluer la présence de Pol I actives sur l'ADNr in vivo, j'ai pu montrer par ailleurs que la perte d'expression de Rpf2 et Rrs1 affecte fortement le niveau de transcription Pol I. Des expériences complémentaires suggèrent que le complexe Rpf2-Rrs1 semble être présent sur l'ADNr en absence de transcription Pol I et a la capacité d'interagir directement avec l'ARN Pol I purifiée in vitro. Ces résultats suggèrent que le complexe Rpf2-Rrs1 joue un rôle crucial dans la coordination fonctionnelle entre transcription de l'ADNr et assemblage des particules pré-ribosomiques chez la levure. Une autre partie de mes travaux de thèse a porté sur l'étude de l'hélicase Prp43p. Prp43p est une hélicase à boite DEAH impliquée à la fois dans la synthèse des ribosomes et dans l'épissage des pré-ARNm. Cette hélicase interagit avec des protéines à domaine G-patch qui stimulent son activité enzymatique in vitro par un mécanisme inconnu. Durant ma thèse, nous avons pu montrer que l'activation de Prp43 par des protéines à domaine G-patch semble être en lien avec le mode unique de liaison de l'ATP par cette famille d'hélicases. Des données structurales indiquent que la base purique de la molécule d'ATP est empilée entre l'arginine 159 (R159) du domaine RecA1 et la phénylalanine 357 (F357) du domaine RecA2 dans le site actif de Prp43. L'étude in vitro d'un mutant de Prp43 portant une substitution du résidu F357 en alanine (F357A), nous a permis de montrer que l'absence de l'empilement de la base de l'ATP avec le résidu F357 découple les activités ATPase et hélicase de Prp43. En revanche, la substitution du résidu R159 en alanine affecte à la fois les activités ATPase et hélicase de l'enzyme. Nous avons observé par ailleurs que le mutant R159A induit le même phénotype que celui résultant de l'absence de la protéine Gno1, un des partenaires à domaine G-patch de Prp43. Ce résultat suggère fortement que les défauts de maturation observés en l'absence de Gno1 résultent d'un défaut d'activation de l'activité hélicase de Prp43. Ainsi l'empilement de la base nucléotidique entre les résidus F357 et R159 parait important pour l'activité et la régulation de cette famille d'hélicases
In eukaryotic cells, ribosome synthesis begins with the transcription of ribosomal DNA (rDNA) by RNA polymerase I (Pol I). This process generates a primary transcript (pre-rRNA), containing the sequences corresponding to the mature 18S, 5.8S and 25S rRNAs. The fourth rRNA (5S) is transcribed independently by RNA Pol III. The pre-rRNA associates co-transcriptionally with some ribosomal proteins and many maturation factors to generate a large initial pre-ribosomal particle called the 90S particle. This particle undergoes a complex maturation process generating the pre-40S and pre-60S particles that will generate the mature ribosomal subunits. The first part of my thesis work consisted in the study of the Rpf2-Rrs1 heterodimer in yeast. This heterodimer is known to be essential for the maturation of pre-60S particles through the recruitment of the 5S RNP, a module containing the 5S rRNA associated to ribosomal proteins RpL5 and RpL11. We showed that Rpf2 and Rrs1 interact with rDNA chromatin using chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments and that this interaction does not depend on the integrity of the pre-ribosomal particles. Moreover, both Rpf2 and Rrs1 interact with Pol I subunits and with several rDNA chromatin-associated factors in vivo. These data suggest a function of the Rpf2-Rrs1 heterodimer in the regulation of Pol I transcription in addition to its role in the maturation of pre-60S particles. Interestingly, we observed using Miller spread experiments that loss of expression of Rpf2 or Rrs1 is correlated with strong perturbations in the organization of rDNA units. Using the "run-on" experiment, a technique allowing to determine the occupancy of active polymerases on the rDNA units, I further showed that loss of expression of Rpf2 or Rrs1 strongly affects Pol I transcription in yeast cells. Additional experiments suggest that the Rpf2-Rrs1 complex is present on rDNA units in absence of Pol I transcription in vivo and interacts with purified Pol I in vitro. These data strongly suggest that the Rpf2-Rrs1 heterodimer is a prime candidate to plays a crucial role in the functional coupling between rDNA transcription and pre-ribosome assembly in yeast cells. The second part of my thesis work focused on the study of the Prp43 helicase in yeast. Prp43 is a helicase from the DEAH/RHA family required for both the synthesis of ribosomes and the splicing of pre-mRNAs. Prp43 interacts with G-patch domain-containing proteins which activate its enzymatic activity in vitro by an unknown mechanism. During my thesis, we showed that the activation of Prp43 by G-patch proteins seems to be linked to the unique nucleotide binding mode of this helicase family. Previous structural data showed that the base of the ATP molecule is stacked between two residues, R159 of the RecA1 domain and F357 of the RecA2 domain in the active site of Prp43. The in vitro study of a Prp43 mutant bearing a substitution of F357 to an alanine (F357A) showed that the lack of stacking of the nucleotide base to the F357 residue uncouples the NTPase and helicase activities of Prp43 in vitro. In contrast the substitution of R159 to an alanine (R159A) reduced both the ATPase and helicase activities of the enzyme. We observed in addition that the Prp43 R159A mutation induces the same phenotype as the one resulting from the absence of Gno1, one of the G-patch domain-containing partners of Prp43. This result strongly suggests that the processing defects observed in the absence of Gno1 result from a failure to activate the Prp43 helicase. Overall we propose that the stacking of the ATP base between residues R159 and F357 is important for the activity and regulation of this helicase family

Dans les cellules eucaryotes, la synthèse des ribosomes débute dans le nucléole par la transcription de l'ADN ribosomique (ADNr) par l'ARN polymérase I (pol. I). Cette transcription génère un transcrit ribosomique primaire précurseur des ARNr matures 18S, 5. 8S et 25S. Ce transcrit s'associe de manière co-transcriptionnelle avec certaines protéines ribosomiques, un grand nombre de facteurs d'assemblage et de maturation et des petites particules ribonucléoprotéiques pour générer une grande particule pré-ribosomique initiale. Celle-ci subit un processus de maturation complexe qui débute dans le nucléole et se termine dans le cytoplasme où se forment les sous-unités ribosomiques matures. La synthèse des ribosomes est l'un des processus cellulaires les plus coûteux en énergie, il doit donc faire l'objet d'une régulation minutieuse et être coordonné aux autres processus cellulaires fondamentaux. Comme mentionné précédemment, la synthèse des ribosomes fait intervenir environ 200 facteurs d'assemblage et de maturation des particules pré-ribosomiques. La fonction de l'énorme majorité d'entre eux reste encore inconnue et un des challenges actuels dans le domaine est de comprendre leur rôle moléculaire précis. Une partie de mes travaux de thèse a consisté en une étude structure/fonction du complexe Bms1p/Rcl1p impliqué dans la synthèse des ribosomes chez la levure. Rcl1p et Bms1p sont deux protéines nucléolaires essentielles qui forment un complexe requis pour la maturation de la petite sous-unité ribosomique (40S). Bms1p est une GTPase et Rcl1p est une endoribonucléase qui catalyse le clivage du pré-ARNr au site A2, l'étape qui sépare les deux voies de maturation conduisant aux sous-unités ribosomiques 40S et 60S. L'équipe de notre collaborateur Sébastien Fribourg (IECB, Bordeaux) a résolu la structure cristallographique de Rcl1p en complexe avec un fragment de Bms1p et a identifié les résidus situés à l'interface entre les deux protéines. La substitution de certains de ces acides aminés affecte l'interaction entre Bms1p et Rcl1p in vitro et induit des défauts de maturation des pré-ARNr in vivo. Nous avons montré que ces défauts sont probablement dus à un problème d'incorporation de Rcl1p dans les particules pré-ribosomiques. En effet, Bms1p et Rcl1p sont importées dans le noyau sous forme d'un complexe grâce à la séquence de localisation nucléaire (NLS) de Bms1p. Les deux protéines sont ensuite recrutées simultanément au sein des pré-ribosomes après l'incorporation des modules UTP-A et UTP-B mais indépendamment du recrutement de Rrp5p. Nos résultats suggèrent par ailleurs que la liaison de Bms1p au GTP n'est pas nécessaire au recrutement du complexe. Suite au clivage en A2, les deux protéines sont ensuite toutes les deux dissociées des particules pré-40S avant l'incorporation de Rio2p. Nos données indiquent donc que l'interaction directe entre Bms1p et Rcl1p est cruciale pour l'incorporation du complexe dans les pré-ribosomes chez la levure. Une autre partie de mes travaux de thèse a porté sur l'étude de la protéine Rpf2p, un composant des particules pré-ribosomiques pré-60S requis pour la synthèse de la grande sous-unité ribosomique. Différentes données de la littérature suggèrent que Rpf2p interagit avec des facteurs associés à la chromatine de l'ADNr. Nous avons confirmé certaines de ces interactions et nos résultats suggèrent par ailleurs que Rpf2p est associée in vivo à la chromatine de l'ADNr et plus particulièrement aux copies transcriptionnellement actives. Ces données suggèrent que Rpf2p pourrait intervenir dans des mécanismes de modification de la chromatine nécessaires à la transcription par l'ARN Pol. I et en effet, des expériences de " run-on " nucléaire indiquent que la perte d'expression de Rpf2p affecte la transcription par l'ARN pol. I. Ces résultats préliminaires suggèrent que Rpf2p pourrait intervenir dans le couplage fonctionnel entre transcription de l'ADNr et maturation des particules pré-ribosomiques
In eukaryotic cells, ribosome synthesis begins with the transcription of ribosomal DNA (rDNA) by RNA polymerase I (Pol. I) in the nucleolus. This transcription generates a primary transcript precursor to the mature 18S, 5. 8S and 25S. This transcript is co-transcriptionally associated with some ribosomal proteins, many assembly and maturation factors and a set of small ribonucleoprotein particles to generate a giant initial pre-ribosomal particle. This particle undergoes a complex maturation process which begins in the nucleolus and ends in the cytoplasm where the formation of mature ribosomal subunits occurs. Ribosome synthesis is one of the most energy-consuming cellular processes; it must be highly regulated and tightly coordinated with other fundamental cellular processes. As previously mentioned, ribosome synthesis involves around 200 dedicated to the assembly and maturation of pre-ribosomal particles. However, the function of the vast majority of them is still unknown and current challenges in the field are to understand their precise molecular role. Part of my thesis work consisted in the study of the structure / function of the Bms1p/Rcl1p complex involved in ribosome synthesis in yeast. Rcl1p and Bms1p are two essential nucleolar proteins that form a complex required for the maturation of the small ribosomal subunit (40S). Bms1p is a GTPase and Rcl1p is an endoribonuclease which catalyzes the cleavage of the pre-rRNA at site A2; the step which separates the two maturation pathways leading to the formation of ribosomal subunits 40S and 60S. The team of our collaborator Sébastien Fribourg (IECB, Bordeaux) has solved the crystal structure of Rcl1p in complex with a fragment of Bms1p and identified residues at the interface between the two proteins. The substitution of some of these amino acids affects the interaction between Rcl1p and Bms1p in vitro and induces defects in the maturation of pre-rRNA in vivo. We have shown that these defects are probably due to a problem in Rcl1p incorporation into pre-ribosomal particles. Indeed, Bms1p and Rcl1p are imported into the nucleus as a complex via the nuclear localization sequence (NLS) of Bms1p. Both proteins are then recruited simultaneously into pre-ribosomes after incorporation of UTP-A and UTP-B modules but independently of Rrp5p incorporation. Our results also suggest that the GTP-binding to Bms1p is not required for the recruitment of the complex. Following A2 cleavage, the two proteins are both released from pre-40S particles before Rio2p incorporation. Therefore, our data indicate that the direct interaction between Bms1p and Rcl1p is crucial for the incorporation of the complex into pre-ribosomes in yeast. Another part of my thesis work focused on the study of Rpf2p protein, a component of the pre-60S ribosomal particles required for the synthesis of the large ribosomal subunit. Various data from the literature suggest that Rpf2p interacts with rDNA chromatin associated factors. We have confirmed some of these interactions and our results suggest that Rpf2p is associated in vivo with rDNA chromatin and more particularly to transcriptionally active copies. These data suggest that Rpf2p could be involved in mechanisms of chromatin modification required for transcription by RNA Pol. I and indeed, nuclear "run-on" experiments indicate that the loss of Rpf2p expression affects transcription by RNA pol. I. These preliminary results suggest that Rpf2p could be involved in the functional coupling between rDNA transcription and maturation of pre-ribosomal particles

Le syndrome de Shwachman Diamond (SDS) est une ribosomopathie génétique rare entraînant une altération de la synthèse protéique associée à de nombreux symptômes, notamment une insuffisance médullaire et une neutropénie pouvant évoluer vers un syndrome de myélodysplasie ou une leucémie myéloïde aiguë. Les mutations bialléliques du gène SBDS sont responsables de plus de 90 % des cas de SDS et nous avons récemment identifié des mutations bialléliques EFL1 comme une nouvelle cause génétique de SDS. SBDS et EFL1 évincent le facteur elF6 de la sous-unité ribosomale pré60S, permettant à cette dernière d'interagir avec la sous-unité 40S pour former le ribosome mature 80S. L'acquisition naturelle d'événements génétiques somatiques au fil du temps participe au développement des maladies liées à l'âge et au développement des cancers. Cependant, dans les maladies mendéliennes, ces événements peuvent, dans de rares cas, contrer l'effet délétère de la mutation germinale et conférer un avantage sélectif aux cellules somatiquement modifiées, un phénomène appelé sauvetage génétique somatique (SGR). Nous avons récemment montré que plusieurs événements génétiques somatiques affectantl'expression ou la fonction d'elF6 sont fréquemment détectés dans les clones sanguins de patients atteints de SDS mais pas chez les individus sains, suggérant un mécanisme de SGR. Alors que la plupart de ces mutations somatiques induisent une déstabilisation de elF6 ou une haploinsuffisance d'EIF6, une mutation récurrente (N106S) n'affecte pas l'expression/stabilité d'elF6 mais réduit sa capacité à interagir avec la sous-unité 60S. Afin d'étudier plus en détail les conséquences fonctionnelles de l'haploinsuffisance de EIF6 et de la mutation N106S dans un contexte de SDS, j'ai introduit via CRISPR/Cas9 ces mutations dans des lignées fibroblastiques immortalisées de patients SDS et de contrôle. Ces modèles cellulaires originaux ont permis de déterminer l'impact de la mutation N106S sur la la localisation et la fonction d'elF6 mais aussi de préciser les effets de ces mutations sur plusieurs aspects du « fitness » cellulaire, notamment la biogenèse des ribosomes, le taux de traduction et la prolifération cellulaire. Dans l'ensemble, le développement de ce modèle a aidé à caractériser comment la mutation N106S et l'haploinsuffisance somatique de elF6 confèrent un avantage sélectif dans les cellules déficientes en SBDS ou EFL1
Shwachman Diamond syndrome (SDS) is a rare genetic ribosomopathy leading to impaired protein synthesis, which causes numerous symptoms including bone marrow failure and neutropenia that can evolve to myelodysplasia syndrome or acute myeloid leukaemia. Biallelic mutations in the SBDS gene are responsible of above 90% of the SDS cases and we recently identified biallelic EFL1 mutations as a novel cause of SDS. SBDS together with EFL1 remove the anti-association factor elF6 from the pre60S ribosomal subunit, allowing its interaction with the 40S subunit to form the mature ribosome 80S. Natural acquisition of somatic genetic events over time participâtes to age-related diseases and cancer development. However, in Mendelian diseases these events can, in rare case, counteract the deleterious effect of the germline mutation and provide a sélective advantage to the somatically modified cells, a phenomenon dubbed Somatic Genetic Rescue (SGR). We recently showed that several somatic genetic events affecting the expression or function of elF6 are frequently detected in blood clones from SDS patients but not in healthy individuals, suggesting a mechanism of SGR. While most of these somatic mutations induce elF6 destabilization or EIF6 haploinsufficiency, one récurrent mutation (N106S) did not affect the expression of elF6 but rather impact its ability to interact with the 60S subunit. In order to further investigate the functional conséquences of ElF6 haploinsufficiency and N106S mutation in a context of SDS, I introduced via CRISPR/Cas9 these mutations in immortalized fibroblastic cell line from SDS patients and control. These original cellular models hâve made it possible to détermine the impact of the N106S mutation on the localisation and function of elF6 and also to clarify the effects of these mutations on several aspects of cellular fitness, in particular ribosome biogenesis, translation rate and cell prolifération. Overall, the development of these cellular models has helped to characterise how the somatic N106S mutation and elF6 haploinsufficiency confer a sélective advantage in cells déficient in SBDS or EFL1

Le ribosome est composé de la sous-unité 40S (ARNr de 18S et environ 30 protéines), et de la sous-unité 60S (ARNr de 5,8S, 25S/28S et 5S et environ 40 protéines). Les étapes de maturation des pré-ribosomes se déroulent tout au long du transport dans le noyau, jusqu'à l'étape de translocation nucléocytoplasmique, étape essentielle est spécifique aux eucaryotes. Dans un premier temps, nous avons étudié la fonction des nucléoporines dans le transport des particules pré-40S chez S. Cerevisiae. Ce projet a abouti à une cartographie complète des nucléoporines requises dans le trafic nucléocytoplasmique des particules pré-40S et des mRNP. La translocation de ces particules requiert des ensembles distincts indiquant des modes d'export différents. Dans un deuxième temps, l'étude du transport des pré-ribosomes a été étendue aux mammifères. Pour la première fois, nous avons montré l'existence d'un précurseur de l'ARNr de 18S exporté dans le cytoplasme des mammifères, comme chez S. Cerevisiae
The ribosome is composed of the 40S subunit (18S rRNA associated with about thirty proteins), and the 60S subunit (5. 8S, 25S/28S and 5S rRNAs and approximatively forty proteins). Different maturation steps take place as pre-ribosomal particles are transported through the nucleus, from the nucleolus to the nucleoplasm, until nucleocytoplasmic translocation. On a first stage, we studied nucleoporins function in pre-40S particle transport using budding yeast mutant strains. This project has given rise to a complete inventory of nucleoporins required in both pre-40S particle and mRNP nucleocytoplasmic trafficking. Translocation of pre-ribosomal particles and mRNPs through the NPC needs distinct nucleoporins complexes, partially overlapping, indicating different export pathways. On a second stage, we extended the study of pre-ribosome transport to mammalian cells. For the first time, we show the existence of a new 18S rRNA precursor, exported to the cytoplasm, like in yeast

La nucleoline est une des proteines majoritaire du nucleole dans des cellules en phase exponentielle de croissance. La structure de cette proteine peut se diviser en trois domaines essentiels. Un domaine n-terminal constitue d'enchainement de groupes d'acides amines acides et de groupes d'acides amines basiques est implique notamment dans des interactions proteine-proteine. Un domaine central est compose de 4 domaines de liaison a l'arn rbd. Le domaine c-terminal est quant a lui appele domaine rgg ou gar est implique dans des interactions non specifiques avec l'arn mais est aussi implique dans des interactions avec les proteines ribosomiques. Diverses fonctions de la nucleoline ont ete proposees au sein de la biogenese des ribosomes, mais les mecanismes par lesquels serait mediees ces fonctions de regulation de transcription d'empaquetage reste inconnus. Au cours de mes travaux de these nous avons montre a l'aide d'extraits cellulaires totaux que la nucleoline etait impliquee dans la premiere etape de maturation du pre-arn ribosomique. Nous avons de plus pu montrer que l'interaction de la nucleoline avec le pre-arnr etait requise dans cette etape de maturation appelee clivage precoce. Le domaine n-terminal de la nucleoline est essentiel pour cette etape de clivage et permet une interaction avec la snornp u3. L'etude plus approfondie de l'interaction de la nucleoline avec l'arn competent pour la maturation nous a permis d'identifier une sequence conservee de 11 nucleotides (ecm) requise pour l'interaction avec la nucleoline. Cette sequence ecm, situee 5 ou 6 nucleotides en aval du site de clivage precoce, est essentielle pour la formation du complexe de maturation. Nous avons pu montrer que la nucleoline etait un facteur clef dans l'assemblage de ce complexe de maturation. L'etude des determinants proteiques impliques dans l'interaction entre, la sequence ecm, et la nucleoline, a revele la necessite de l'action conjointe des quatre domaines d'interaction avec l'arn (rbd) de la nucleoline. La nucleoline et son interaction avec l'arn constituent des elements essentiels dans l'etude des mecanismes moleculaires impliques dans clivage precoce du pre-arnr. Ils constituent donc un systeme de choix afin d'etudier ce premier evenement de maturation.

La synthèse des protéines cellulaires requiert à la fois des ribosomes fonctionnels et des ARN de transfert (ARNt) matures comme molécules adaptatrices. Les ribosomes sont de larges complexes ribonucléoprotéiques dont la biogenèse représente la plupart de la transcription cellulaire et consomme une majeure partie de l’énergie de la cellule. Par conséquent, la biogenèse des ribosomes fait l’objet d’une régulation importante afin d’ajuster le nombre de ribosomes aux besoins de la cellule et de dégrader efficacement les particules défectueuses qui pourraient interférer avec la traduction. Les ARNs ribosomiques (ARNr) et les ARNt sont tous deux transcrits sous formes de précurseurs et sont universellement maturés pour devenir fonctionnels pour la traduction. Ce travail de thèse a permis de mettre en évidence un couplage entre la maturation des ARNt et la biogenèse des ribosomes chez la bactérie modèle à Gram positif Bacillus subtilis. Ainsi, l’accumulation d’ARNt immatures lors d’une déplétion en enzymes de maturation, abolit spécifiquement la maturation en 3’ de l’ARNr 16S par l’endoribonucléase YqfG/YbeY, dernière étape dans la formation de la petite sous-unité ribosomique (30S). Nous avons mis en évidence que ce défaut de maturation résultait d’un défaut d’assemblage tardif du 30S coïncidant avec des changements d’expression de plusieurs facteurs d’assemblage du ribosome. Nous avons montré que cette modulation d’expression provenait d’effets transcriptionel et post-transcriptionel. De façon inédite, nos résultats indiquent que l’accumulation d’ARNt immatures est perçue par RelA (le facteur de la réponse stringente), déclenchant la production de (p)ppGpp. Nous avons observé que cette synthèse de (p)ppGpp et la baisse concomitante des niveaux de GTP cellulaire, inhibe la maturation de l’ARNr 16S en 3’, probablement via un blocage des GTPases impliquées dans l’assemblage des ribosomes. L’inhibition de la maturation de l’ARNr 16S côté 3’ est supposée conduire, par la suite, à une dégradation des particules partiellement assemblées par la RNase R. Ainsi, nos résultats supportent un modèle où RelA jouerait un rôle central ; en percevant une déficience de maturation des ARNt et en ajustant, en conséquence, la biogenèse des ribosomes via la production de (p)ppGpp. Ce mécanisme de couplage permettrait de maintenir un équilibre fonctionnel entre ARNt et ARNr, les deux composants majeurs de la machinerie de traduction
Cellular protein synthesis both requires functional ribosomes and mature transfer RNAs (tRNAs) as adapter molecules. The ribosomes are large essential ribonucleoprotein complexes whose biogenesis accounts for most of cellular transcription and consumes a major portion of the cell’s energy. Ribosome biogenesis is therefore tightly adjusted to the cellular needs and actively surveilled to rapidly degrade defective particles that could interfere with translation. Interestingly, tRNAs and ribosomal RNAs (rRNAs) are both transcribed from longer primary transcripts and universally require processing to become functional for translation. In this thesis, I have characterized a coupling mechanism between tRNA processing and ribosome biogenesis in the Gram-positive model organism Bacillus subtilis. Accumulation of immature tRNAs during tRNA maturase depletion, specifically abolishes 16S rRNA 3’ processing by the endonuclease YqfG/YbeY, the last step in small ribosomal subunit formation. We showed that this maturation deficiency resulted from a late small subunit (30S) assembly defect coinciding with changes in expression of several key 30S assembly cofactors, mediated by both transcriptional and post-transcriptional effects. Interestingly, our results indicate that accumulation of immature tRNAs is sensed by the stringent factor RelA and triggers (p)ppGpp production. We showed that (p)ppGpp synthesis and the accompanying decrease in GTP levels inhibits 16S rRNA 3’ processing, most likely by affecting GTPases involved in ribosome assembly. The inhibition of 16S rRNA 3’ processing is thought to further lead to degradation of partially assembled particles by RNase R. Thus, we propose a model where RelA senses temporary slow-downs in tRNA maturation and this leads to an appropriate readjustment of ribosome biogenesis. This coupling mechanism would maintain the physiological balance between tRNAs and rRNAs, the two major components of the translation machinery

Les alcaloïdes pyrrolizidiniques (AP) bactériens sont des métabolites secondaires d’une grande diversité chimique à l’origine de leurs propriétés pharmacologiques prometteuses (antibiotiques, anticancéreux, etc.). Bien qu’il ait été déterminé que le noyau hétérocyclique soit assemblé par des méga-synthétases de peptides non-ribosomiques (NRPS) bimodulaires, les mécanismes moléculaires qui conditionnent la variété structurale des produits et sous-tendent leurs activités biologiques restent inconnus. Compte tenu de l’intérêt majeur de ces systèmes biosynthétiques, ce projet vise à établir les relations structure-fonction de l’hydrolase XhpG et de la déshydratase AzeD impliquées dans le processus de maturation post-NRPS des AP intermédiaires chez les γ-protéobactéries pathogènes Xenorhabdus hominickii et Pseudomonas aeruginosa. Dans cet objectif, les enzymes recombinantes ont fait l’objet d’une stratégie expérimentale intégrative, de leur expression hétérologue au sein de l’hôte E. coli BL21 (DE3), dans une forme native ou mutante, jusqu’à leur purification par chromatographie en phase liquide et analyse subséquente par diffusion dynamique de la lumière. Ces étapes ont permis de confirmer l’homogénéité et la monodispersité des échantillons obtenus, des conditions nécessaires à la caractérisation structurale approfondie des apo-protéines par cristallographie aux rayons X. Dès lors, les efforts entrepris dans le criblage et l’affinement des conditions de cristallisation, ainsi que dans l’acquisition de données de diffraction à résolution atomique (1,2-1,6 Å), ont permis de résoudre la structure tridimensionnelle des enzymes biosynthétiques d’intérêt. À la lumière d’analyses complémentaires, ces résultats ont fourni une vue globale des états oligomériques et conformationnels plausibles en solution, et également un aperçu du mécanisme catalytique avec un accent sur la spécificité de substrat. À terme, les connaissances obtenues contribueront aux travaux d’ingénierie biosynthétique afin de générer des analogues azacycliques avec un potentiel thérapeutique intéressant, en l’occurrence dans la lutte contre le germe opportuniste P. aeruginosa responsable d’infections nosocomiales à l’échelle mondiale
Bacterial pyrrolizidine alkaloids (PAs) are secondary metabolites of wide chemical diversity at the origin of their promising pharmacological properties (antibiotics, anticancer, etc.). Although it has been determined that the heterocyclic core is assembled by modular non-ribosomal peptide synthetases (NRPS), the molecular mechanisms which govern the structural variety of the products and underlie their biological activities remain unknown. Given the major interest of these biosynthetic systems, this project aims to establish the structure-function relationships of the XhpG hydrolase and the AzeD dehydratase involved in the post-NRPS maturation of intermediate PAs in the pathogenic γ-proteobacteria Xenorhabdus hominickii and Pseudomonas aeruginosa. In pursuit of this objective, the recombinant enzymes have been subjected to an integrative experimental strategy, from their heterologous expression within the host E. coli BL21 (DE3), in either a native or mutant form, up to their purification by liquid chromatography and subsequent analysis via dynamic light scattering. These steps have allowed to confirm the homogeneity and monodispersity of the obtained samples, conditions necessary for the in-depth structural characterization of the apo-proteins by X-ray crystallography. Therefore, the efforts undertaken in screening and refining crystallization conditions, as well as in acquiring diffraction data at atomic resolution (1.2-1.6 Å), have permitted to elucidate the three-dimensional structure of the target biosynthetic enzymes. In light of complementary analyses, these results have provided a general overview of plausible oligomeric and conformational states in solution, and also insights into the catalytic mechanism with a focus on substrate specificity. In due course, the obtained knowledge will contribute to biosynthetic engineering endeavors to generate azacyclic analogues with interesting therapeutic potential, specifically in fighting the opportunistic pathogen P. aeruginosa responsible for nosocomial infections on a global scale

L’exosome joue un rôle fondamental dans la dégradation de 3’ en 5’ et la maturation des ARNs chez les eucaryotes. Le "coeur" de l’exosome est composé de 9 sous-unités (EXO9). EXO9 est catalytiquement inactif chez l’homme et la levure, et est associé à deux RNases, Rrp6 et Rrp44, responsables de l’activité exonucléolytique de l’exosome. Mes travaux de thèse démontrent que chez Arabidopsis, le coeur de l’exosome EXO9 possède une activité catalytique intrinsèque. Cette activité est dépendante de la présence de phosphate, produit des nucléosides diphosphates et est réversible. Elle possède de ce fait toutes les caractéristiques d’une activité phosphorolytique. L’activité d’EXO9 est impliquée dans l’élimination de sous-produits de la maturation des ARNr et dans la maturation de l’ARNr 5.8S, deux fonctions typiques de l’exosome. Mes travaux révèlent également que AtRRP44, EXO9 et AtRRP6L2 coopèrent de manière séquentielle pour la maturation de l’ARN 5.8S. Mes travaux de thèse constituent la base de travaux futurs visant à comprendre les rôles de l’activité phosphorolytique de l’exosome chez un organisme eucaryote
The eukaryotic RNA exosome complex is the main 3’-5’ degradation machinery that plays an essential role in RNA decay, quality control and maturation. The exosome core complex (EXO9) is catalytically inert in yeast and humans, and therefore relies on the catalytic activity of associated RNases, Rrp6 and Rrp44. In this study I demonstrated that EXO9 is catalytically active in Arabidopsis. EXO9’s activity is phosphate-dependent, releases nucleoside diphosphates and is reversible, meeting all criteria of a phosphorolytic activity. Importantly, EXO9’s in vivo substrates include the archetypical exosome substrates, rRNA maturation by-products and 5.8S rRNA precursors. My data show that AtRRP44, EXO9 and AtRRP6L2 sequentially cooperate for the processing of 5.8S rRNA. This work sets a basis for studies aiming at further understanding the biological functions of EXO9’s phosphorolytic activity in a eukaryotic organism

Nous montrons dans cette étude que dans les cellules déplétées pour la nucléoline, une plus faible accumulation de pré-ARNr est associée à une augmentation de marques d’hétérochromatine (H3K9me2) et une diminution de marques d’euchromatine (H4K12ac et H3K4me3) sur la chromatine des gènes ribosomiques. Des expériences de ChIP-seq montrent que la nucléoline est enrichie dans la région codante et promotrice de l’ADNr et est préférentiellement associée avec les gènes non méthylés des ARNr. La déplétion de la nucléoline entraîne une accumulation de l’ARN Pol I au début de l’ADNr et une diminution de UBF sur la région codante et promotrice. La nucléoline interfère avec la liaison de TTF-1 sur le promoteur-proximal T0, inhibant ainsi le recrutement de TIP5 du complexe NoRC, et établissant un état d’hétérochromatine répressive. Ces résultats révèlent l’importance de la nucléoline dans le maintien d’un état euchromatinien des ADNr et dans l’élongation de la transcription. Nous montrons aussi dans cette thèse que l’acétylation est une nouvelle modification post-traductionnelle de la nucléoline. Des études d’immunofluorescence utilisant l’anticorps anti nucléoline acétylée montrent que la nucléoline acétylée est exclue des nucléoles. De plus, par ChIP-seq nous n’avons jamais pu détecter d’association significative de la nucléoline acétylée sur la chromatine des ADNr. Aussi, nous n’avons détecté aucune activation de la transcription de Pol II sur des matrices de chromatine avec la nucléoline acétylée. Nous trouvons une distribution de la nucléoline acétylée majoritairement dans le nucléoplasme où elle co-localise parfaitement avec le facteur d’épissage SC35, et partiellement avec les structures marquées avec un anticorps dirigé contre Y12, mais ne co-localise pas avec des structures contenant la coïline, ce qui suggère que cette fraction de la nucléoline pourrait être impliquée dans la synthèse ou le métabolisme des pré-ARNm
Here we have shown that, in nucleolin depleted cells, lower accumulation of pre-rRNA is associated with the increase in heterochromatin marks (H3K9me2) and decrease of the euchromatin histone marks (H4K12Ac and H3K4me3) in rDNA chromatin. ChIP-seq experiments show that nucleolin is enriched in the coding and promoter region of the rDNA and is preferentially associated with the unmethylated rRNA genes. Nucleolin knockdown results in the accumulation of RNAPI at the beginning of the rDNA and a decrease of UBF in the coding and promoter regions. Nucleolin is able to interfere with the binding of TTF-1 on the promoter-proximal terminator T0 thus inhibiting the recruitment of the NoRC subunit TIP5 and HDAC1 and establishing a repressive heterochromatin state. These results reveal the importance of nucleolin in the maintenance of the euchromatin state of rDNA and transcription elongation.In this thesis we have also shown that acetylation is a novel post-translational modification of nucleolin. Immuno-fluorescence studies using anti-acetylated nucleolin antibody illustrated that acetylated nucleolin is excluded from nucleoli and interestingly, neither could we detect any significant binding of ac-nucleolin on rDNA chromatin by doing ChIP-Seq, nor did we detect any activation of Pol II transcription with ac-nucleolin from DNA and chromatin templates. Moreover, we found acetylated nucleolin had a predominant nucleoplasmic distribution where it associates with the splicing factor SC35 and partially with the structures labeled with Y12 antibody, but not with coilin containing structures

La biogenèse des ribosomes est un processus complexe et dynamique requérant l’intervention d’une multitude de facteurs d’assemblage et de maturation pour permettre la maturation du pré-ARNr et l’assemblage des protéines ribosomiques. Chez les eucaryotes, la biogenèse de la petite sous-unité ribosomique 40S, débute dans le nucléole par la transcription d’un long précurseur contenant 3 des 4 futurs ARNr matures. Le pré-ARNr 18S est modifié par un ensemble de snoRNP à boîtes C/D et H/ACA et libéré par une série de clivages précoces au niveau des sites A0, A1 et A2. Ces clivages se déroulent au sein d’un macro-complexe, le SSU-processome. Celui-ci s’assemble de manière séquentielle à l’extrémité 5’ du pré-ARNr et est composé d’une multitude de facteurs intervenant dans la maturation, notamment de la snoRNP U3, une snoRNP à boîtes C/D qui joue un rôle de chaperon du pré-ARNr. En effet, le snoARN U3 est impliqué dans la formation de 5 appariements avec le pré-ARNr permettant de positionner correctement les sites de clivages A0, A1 et A2. En plus des 4 protéines cœur retrouvées au sein des snoRNP à boîtes C/D, la snoRNP U3 possède une protéine supplémentaire essentielle à la viabilité cellulaire, Rrp9p. En C-terminal, Rrp9 présente un enchainement de 7 domaines WD40 s’organisant en une structure « beta propeller ». Pour définir le rôle essentiel de cette protéine, nous avons généré des mutants et testé leur fonction. Nous avons ainsi pu montrer que le résidu R289 de Rrp9p est important pour les étapes de clivages précoces du pré-ARNr aux sites A1 et A2. De plus, nous avons identifié de nouveaux partenaires de la protéine Rrp9p au sein du processome et montré que le résidu R289 est impliqué dans une interaction directe avec le facteur Rrp36p. Lorsque ce résidu est muté, certains des défauts de croissance cellulaire liés à la stabilisation des appariements établis entre le pré-ARNr et le snoARN U3 par mutation du snoARN U3 sont fortement renforcés, montrant un lien fonctionnel entre Rrp9p et ces appariements. Nous avons mis en évidence un réseau d’interaction au sein du processome impliquant les protéines Rrp9p, Rrp36p, Sgd1p et Rrp5p : Rrp9p interagit avec Rrp36p et Sgd1p, et ces deux dernières interagissent ensemble, ainsi qu’avec Rrp5p. Les domaines responsables de ces interactions ont été étudiés
Ribosome biogenesis is a complex and dynamic process requiring several assembly and maturation factors needed for processing of the pre-rRNA and assembly of the ribosomal protein. In eukarya, biogenesis of the 40S small subunit starts in the nucleolus with the transcription of a long pre-rRNA, containing 3 out of the 4 future rRNAs. The 18S pre-rRNA is modified by several C/D or H/ACA box snoRNPs and processed by endonucleolytic cleavages at sites A0, A1 and A2 sites. These early cleavages occur within a huge complex termed the SSU-processome. The processome assembles at the 5’ extremity of the pre-rRNA, and contains multiple factors, including the U3 snoRNP, a C/D box snoRNP chaperoning the pre-rRNA. Indeed, the U3 snoRNA is involved in formation of 5 intermolecular helix with the pre-rRNA, which defines the A0, A1 and A2 cleavage sites. In addition to the four C/D box snoRNP core proteins, the U3 snoRNP contains additional protein, Rrp9p, required for cell viability. The Rrp9p C-terminal extremity folds into a beta propeller structure. To try to decipher the Rrp9p role, we mutated several surface residues of the beta propeller protein and the effects of the mutations on cell growth were tested. Through this approach, we found that the R289 residue is important for the maturation events at A1 and A2 sites. Moreover, we identified new protein partners of Rrp9p within the processome and showed that R289 residue is involved in a direct interaction with Rrp36p. We identified a network of protein-protein interactions including Rrp9p, Rrp36p, Sgd1p and Rrp5p : Rrp9p interacts with Rrp36p and Sgd1p, Rrp36p and Sgd1p interact together and with Rrp5p. Some of the protein domains involved in the interactions were identified. In addition, the R289A mutation in Rrp9p has a strong negative effect on growth with mutations in U3 snoRNA that destabilize the U3 snoRNA/pre-rRNA interaction