Tesis sobre el tema "LHCSR1"

Photosynthesis in higher plants relies upon collection of light by chlorophyll molecules associated with light harvesting chlorophyll a/b-binding (LHC) proteins. The two most abundant of these are Lhcb1 and Lhcb2, which make up light harvesting complex (LHC) II trimers. They are also involved in facilitating state transitions, a process during which energy balancing between photosystem (PS) II and I is achieved. Overexcitation of PSII reduces the plastoquinone pool which activates STN7, a kinase, that phosphorylates a threonine residue on Lhcb1 and Lhcb2. In order to studythe kinetics of this we developed antibodies capable of recognizingphosphorylated forms of each of these proteins. This showed that Lhcb2 is more rapidly phosphorylated than Lhcb1, that there are no differences in the migration of phosphorylated and non-phosphorylated forms of Lhcb1 and Lhcb2 and that the majority of phosphorylated LHCII (P-Lhcb1 and PLhcb2) are associated with super- and megacomplexes. Furthermore, a state 2-specific LHCII-PSI-LHCI band contains P-Lhcb2 but almost no P-Lhcb1, and a band corresponding to M trimers (band 4 from sucrose gradients, composed of LHCII, CP24 and CP29), contains only P-Lhcb1 but no P-Lhcb2. We also developed artificial microRNA lines specifically depleted in either Lhcb1 or Lhcb2, amiLhcb1 and amiLhcb2 respectively. We show that the roles of Lhcb1 and Lhcb2 in state transitions are complementary. Lhcb1 modulate the size of grana stacks. In the absence of Lhcb1 only a few LHC trimers are formed, while in the absence of Lhcb2, the antenna looks like in the wild type although the plants cannot perform state transitions normally. Trimers containing P-Lhcb2 functionally detach from PSII and connect to PSI to balance the relative excitation pressure. State transitions only occur when both Lhcb1 and Lhcb2 are present, presumably in a (Lhcb1)2 Lhcb2 heterotrimer. In absence of Lhcb2, the LHCII-PSI-LHCI supercomplex is not formed indicting that P-Lhcb2 mediates attachment of LHCII to PSI. We tried complementing amiLhcb2 with modified Lhcb2 genes coding for proteins with altered amino acids, Arg2 to Lys or the phosphorylatable Thr3 residue to Asn or Ser. Introduction of the additional gene often causes loss of amiRNA-inhibition, however we could confirm that substitution of the Thr3 with Asn led to the absence of Lhcb2 phosphorylation and thus no state transition.
Klorofyll a/b-bindande proteiner (s k light harvesting chlorophyll a/b-binding proteins eller LHC proteiner) är viktiga för högre växters fotosyntes, då deras klorofyllmolekyler skördar solljuset. Två av dessa proteiner, Lhcb1 och Lhcb2, bygger upp ”LHCII trimerer” och finns i större mängd än de andra och dessa är även viktiga för s k ”state transtions”, en process som ser till att fotosystem (PS) I och PSII exciteras lika mycket. Om PSII exciteras för mycket reduceras plastoquinon-poolen som i sin tur aktiverar ett proteinkinas, STN7, som fosforylerar en av Lhcb1/Lhcb2s treoniner. För att studera denna fosforylering har vi utvecklat antikroppar som är specifika för dessa fosforylerade former av proteinerna, och vi använde dem för att visa att Lhcb2 fosforyleras snabbare än Lhcb1, och att största delen av det fosforylerade proteinerna (P-Lhcb1 och P-Lhcb2) finns i s k super- eller megakomplex. Ett komplex som bara finns finns i ”state 2” består av LHCII, PSI och LHCI, och det innehåller endast P-Lhcb2 men nästan inget P-Lhcb1, och ett band som består av LHCII, CP24 och CP29 innehåller endast PLhcb1. Vi skapade artificiella mikro-RNA-linjer, amiLhcb1 och amiLhcb2, som saknade antingen Lhcb1 eller Lhcb2. Lhcb1 påverkar höjden av grana stackarna. Med hjälp av dessa visade vi att Lhcb1 och Lhcb2 har komplementära roller för state transitions, saknas Lhcb1 gör växten bara få LHCII trimerer, medan om Lhcb2 gör växten antennener som liknar vildtypens, men den kan inte utföra state transitions som den. Mängden Lhcb1 påverkar storleken av ”grana stacks”. Trimerer som innehåller PLhcb2 kopplas över från PSII till PSI för att balansera excitationstrycket. Både Lhcb1 och Lhcb2, antagligen i trimerer bestående av en Lhcb2 och the Lhcb1, behövs för state transitions. Saknas Lhcb2 bildas inga komplex bestående av LHCII, PSI och LHCI, vilket visar att P-Lhcb2 antagligen möjliggör LHCIIs bindning till PSI. Vi försökte komplementera amiLhcb2 med Lhcb2 gener där amino syror bytts ut, Arg2 till Lys eller den fosforylerbara Thr3 till Asn eller Ser. När denna gen introducerades försvann dock ofta amiRNA-inhiberingen, men vi kunde visa att om Thr3 ersattes med Asn skedde inga state transitions.

La sfingosina-1 fosfato (S1P) è un lisosfingolipide presente nel liquido follicolare ovarico insieme alle gonadotropine glicoproteiche. L'ormone luteinizzante (LH) e l'ormone follicolo-stimolante (FSH) sono necessari per garantire la steroidogenesi, la gametogenesi e la riproduzione. La gonadotropina corionica umana (hCG) agisce durante la gravidanza sullo stesso recettore di LH, LHCGR, per stimolare la produzione di progesterone da parte del corpo luteo e mantenere la gravidanza. Inoltre, le gonadotropine sono fattori di crescita e differenziazione, che modulano la proliferazione cellulare, la sopravvivenza e l'apoptosi. Sia S1P che le gonadotropine esercitano le loro funzioni fisiologiche legandosi a recettori accoppiati a proteine G (GPCR). S1P si lega e attiva cinque recettori specifici, S1P1-5, modulando diverse vie di segnalazione. S1P1 e S1P3 sono altamente espressi nelle cellule primarie della granulosa luteina umana (hGLC). Questo studio mira a caratterizzare il ruolo della segnalazione intracellulare indotto da S1P e gonadotropine nel determinare lo sviluppo del follicolo ovarico in vitro. A questo scopo sono state utilizzate granulose umane e linee cellulari che esprimono stabilmente FSHR e LHCGR sotto il controllo di un promotore inducibile. Sono state valutate l’eterodimerizzazione di S1PR1 con LHCGR/FSHR e GPER e la cinetica delle proteine G e il reclutamento della β-arrestina 2 con LHCGR mediate da LH e hCG, così come l'attivazione di secondi messaggeri e l’internalizzazione di LHCGR in vitro. hGLC e hGL5 sono state trattate con dose fissa (0,1 μM) di S1P e con specifici agonisti di S1P1 e S1P3, SEW2871 e CYM5541. Nelle cellule della granulosa, S1P e, in maniera minore, SEW2871 e CYM5541, hanno indotto pCREB. Non è stata rilevata alcuna produzione di cAMP e l'attivazione di pCREB è avvenuta anche in presenza dell'inibitore della PKA H-89. Inoltre, pCREB S1P-dipendente è stata attenuata dall'inibitore di MEK U0126 e da un bloccante dei canali Ca2+ di tipo L, il verapamil. La completa inibizione di pCREB si è verificata bloccando S1P2 o S1P3 con specifici antagonisti. pCREB S1P-dipendente ha indotto l’espressione di FOXO1 ed EREG, confermando il ruolo esclusivo delle gonadotropine e delle interleuchine in questo processo, ma non ha influenzato la steroidogenesi. hCG induce l'accoppiamento Gαs-, Gq e β-arrestin 2 con LHCGR in modo più efficace rispetto a LH. In presenza di Dynasore, un inibitore dell'internalizzazione, hCG mantiene una cinetica simile, ma non LH, che necessita dell'endocitosi di LHCGR per indurre l'accoppiamento del recettore. Questi dati riflettono la cinetica ormone-specifica dell'attivazione dell'effettore a valle correlata alle proteine G e alla β -arrestina 2. LH ha indotto un rapido aumento di cAMP ed è più potente di hCG nell'attivazione di pERK1/2. È interessante notare che la cinetica dell'aumento di Ca2+ intracellulare indotto da hCG dipende dall'internalizzazione di LHCGR rispetto a LH che non riesce a indurre un aumento di Ca2+ intracellulare. È stata valutata l'interazione tra LHCGR e specifici marcatori degli endosomi per studiare l'internalizzazione di LHCGR mediata dalle gonadotropine. LH è più potente di hCG nel promuovere il riciclaggio di LHCGR. Questo studio ha dimostrato che S1P può indurre un'attivazione di pCREB indipendente da cAMP nelle cellule della granulosa, sebbene ciò non sia sufficiente per indurre la sintesi del progesterone. L'espressione genica di FOXO1 ed EREG indotta da S1P suggerisce che l'attivazione dell'asse S1P-S1PR può cooperare con le gonadotropine nel modulare lo sviluppo del follicolo. L'internalizzazione di LHCGR è fondamentale per modulare i segnali specifici di LH e hCG che influenzano le proteine G e l'accoppiamento β -arrestina 2 e le cascate di segnalazione a valle.
Sphingosine-1 phosphate (S1P) is a lysosphingolipid present in the ovarian follicular fluid together with glycoprotein hormone gonadotropins. Luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) are necessary to ensure steroidogenesis, gametogenesis and reproduction. Human chorionic gonadotropin (hCG) acts during pregnancy via the same receptor for LH, the LHCGR, to stimulate progesterone production by the corpus luteum and maintaining pregnancy. In addition, gonadotropins are growth and differentiation factors, modulating cell proliferation, survival and apoptosis. Both S1P and gonadotropins exert their physiological functions by binding cognate G protein-coupled receptors (GPCRs). At nanomolar concentrations, S1P binds and activates five specific receptors, known as S1P1-5, modulating different signaling pathways. S1P1 and S1P3 are highly expressed in human primary granulosa lutein cells (hGLC). This study aims to characterize the role of S1P- and gonadotropins-induced signaling in determining ovarian follicle development in vitro. To this purpose were used human granulosa, cell lines stably expressing FSHR and LHCGR under the control of an inducible promoter, treated with gonadotropins and S1P. S1PR1 heterodimerization to LHCGR/FSHR and GPER and the kinetics of LH- and hCG-mediated G proteins and β-arrestin 2 coupling to LHCGR were evaluated, such as the activation of related second messengers and kinases, and the role of gonadotropins-induced LHCGR internalization in vitro. hGLC and hGL5 cells were treated with a fixed dose (0.1 μM) of S1P, or by S1P1- and S1P3-specific agonists SEW2871 and CYM5541. In granulosa cells, S1P and, at a lesser extent, SEW2871 and CYM5541, potently induced pCREB. No cAMP production was detected and pCREB activation occurred even in the presence of the PKA inhibitor H-89. Moreover, S1P-dependent pCREB was dampened by MEK inhibitor U0126 and by the L-type Ca2+ channel blocker verapamil. The complete inhibition of pCREB occurred by blocking either S1P2 or S1P3 with the specific receptor antagonists, or under PLC/PI3K depletion. S1P-dependent pCREB induced FOXO1 and EREG, confirming the exclusive role of gonadotropins and interleukins in this process, but did not affect steroidogenesis. The kinetics of LH and hCG-mediated G proteins and β-arrestin 2 coupling to their receptor, and the activation of related second messengers and kinases were evaluated by BRET. hCG induces Gαs-, Gq and β-arrestin 2 coupling to LHCGR more effectively than LH. Under receptor internalization blockade by Dynasore, hCG maintains similar kinetics, but not LH, which needs LHCGR endocytosis for inducing receptor coupling. These data reflect hormone-specific kinetics of downstream effector activation related to G proteins and β-arrestin 2. LH induced a rapid cAMP increase and is more potent than hCG in activating pERK1/2. Interestingly, the kinetic of hCG-induced intracellular Ca2+ increase depends on LHCGR internalization than LH that fails in inducing intracellular Ca2+ increase, consistently with weak Gq recruitment. The interaction between LHCGR and specific markers of endosomes were evaluated to estimate LHCGR internalization mediated by gonadotropins. Indeed, LH is more potent than hCG in promoting LHCGR recycling. This study demonstrated that S1P may induce a cAMP-independent activation of pCREB in granulosa cells, although this is not sufficient to induce progesterone synthesis. S1P-induced FOXO1 and EREG gene expression suggests that the activation of S1P-S1PR axis may cooperate with gonadotropins in modulating follicle development. LHCGR internalization is fundamental for modulating LH- and hCG-specific signals impacting G proteins and β-arrestin 2 coupling, and the downstream signaling cascades.

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Steroids and gonadotrophins are essential for the regulation of antral follicular development and the late stages of preantral development. Although the luteinizing hormone receptor (LHR) has been detected in the preantral follicles of rats, rabbits, and pigs, the expression of this receptor in bovine fetal ovary has not been demonstrated. The present study aimed to quantify the expression of the LHR and the mRNA abundance of the genes LHR binding protein (LRBP), STAR, HSD3B1, CYP17A1, and CYP19A1 during the development of bovine fetal ovary. In addition, we aimed to identify and quantify the expression of bta-miR-222 (a regulatory microRNA of the LHCGR gene). In summary, LHR expression was observed in the preantral follicle in bovine fetal ovary, from oogonias to primordial, primary and secondary stages, and the mRNA abundance was lower on day 150 than day 60. However, the mRNA abundance of LRBP followed the opposite pattern. The LHR protein was detected in oogonia, primordial, primary, and secondary follicles. Moreover, both oocytes and granulosa cells showed positive immunostaining for LHR. Similar to LRBP, the abundance of bta-miR-222 was higher on day 150 than day 60 or 90 of gestation. With regard to the gene expression of steroidogenic enzymes; only the mRNA abundance of STAR was higher on day 150 than on day 60. In conclusion, these results suggested the involvement of LHCGR/LRBP regulation with mechanisms related to the development of preantral follicles, especially during the establishment of secondary follicles. Furthermore, the present data reinforced that the reduced expression of LHR mRNA in bovine fetal ovaries on day 150 was related to the higher expression of LRBP and bta-miR-222.
Esteroides e gonadotrofinas são essenciais para a regulação do desenvolvimento folicular antral e os estágios finais do desenvolvimento pré-antral. Embora o receptor do hormônio luteinizante (LHR) tenha sido detectado nos folículos pré-antrais de ratos, coelhos e porcos, a expressão deste receptor no ovário fetal bovino não foi demonstrada. O presente estudo teve como objetivo quantificar a expressão do LHR e a abundância de mRNA da proteína de ligação LHR (LRBP), STAR, HSD3B1, CYP17A1 e CYP19A1 durante o desenvolvimento do ovário fetal bovino. Além disso, objetivamos identificar e quantificar a expressão de bta-miR-222 (microRNA regulador do gene LHCGR). Em resumo, a expressão de LHR foi observada no folículo pré-antral no ovário fetal de bovino e a abundância de mRNA foi menor no dia 150 do que no dia 60. No entanto, a abundância de mRNA da LRBP seguiu o padrão oposto. Semelhante a LRBP, a abundância de bta-miR-222 foi maior no dia 150 do que no dia 60 ou 90. Com relação à expressão gênica de enzimas esteroidogênicas; apenas a abundância de mRNA de STAR foi maior no dia 150 do que no dia 60. A proteína LHR foi detectada em oogônia, folículos primordiais, primários e secundários. Além disso, ambos os oócitos e células da granulosa apresentaram imunolocalização positiva para LHR. Em conclusão, estes resultados sugeriram o envolvimento da regulação do LHCGR / LBPB com mecanismos relacionados ao desenvolvimento de folículos pré-antrais, especialmente durante o estabelecimento de folículos secundários. Além disso, os presentes dados reforçaram que a expressão reduzida de mRNA de LHR em ovários fetais bovinos no dia 150 estava relacionada à maior expressão de LRBP e bta-miR-222.

Classicamente, la segnalazione dipendente dall’attivazione del cAMP mediata dal recettore dell'ormone follicolo-stimolante (FSHR) e dal recettore dell'ormone luteinizzante (LH) (LHCGR) favorisce la crescita del follicolo ovarico umano e la maturazione degli ovociti. Tuttavia, esistono dati in vitro contraddittori che suggeriscono un diverso significato fisiologico della segnalazione di cAMP mediata da FSHR, mostrando allo stesso tempo l'attivazione di eventi steroidogenici e pro-apoptotici. Questi segnali possono essere alterati dagli estrogeni che inducono eventi anti-apoptotici attraverso i loro recettori nucleari e all'azione non genomica di un recettore degli estrogeni accoppiato a proteine G (GPER). Lo scopo del progetto è chiarire il ruolo degli estrogeni/gonadotropine e dei loro recettori di membrana nella regolazione della fisiologia ovarica e nella selezione del follicolo dominante. In questo studio è stato dimostrato che GPER forma dimeri sia con FSHR che con LHCGR sulla superficie cellulare di cellule HEK293 che sovraesprimono i due recettori e di cellule primarie della granulosa luteina umana (hGLC). Gli eteromeri FSHR/GPER riprogrammano i segnali del cAMP e di morte, in stimoli proliferativi fondamentali per sostenere la sopravvivenza degli ovociti. Nelle cellule della granulosa umana, i segnali di sopravvivenza mancano quando è presente un rapporto FSHR:GPER elevato, che influisce negativamente sulla maturazione del follicolo e si correla con l'accoppiamento preferenziale alla proteina Gαs, l’attivazione della via cAMP/PKA e la capacità di risposta ad FSH dei pazienti sottoposti a stimolazione ovarica controllata. Gli eteromeri FSHR/GPER, invece, mediano segnali anti-apoptotici e proliferativi dipendenti da FSH tramite il dimero Gβγ e la compromissione della formazione degli eteromeri o il knockdown GPER aumenta la morte cellulare e la steroidogenesi FSH-dipendenti. Al contrario, il complesso GPER/LHCGR non influenza la produzione di cAMP indotta da LH e hCG e non compromette l'attivazione della via cAMP/PKA. Ciò si evince dalla simile fosforilazione di CREB ed ERK1/2 e dalla stessa produzione di progesterone in hGLC trattate con siRNA contro GPER e quelle trattato con mock. È interessante notare che GPER riduce l’accoppiamento LHCGR/Gαq e di conseguenza impedisce il rilascio intracellulare di Ca2+ e l'accumulo di IP1, dopo stimolazione con LH e hCG, in cellule HEK293 che co-esprimono LHCGR e GPER rispetto alle cellule che esprimono solo LHCGR. Inoltre, è stato dimostrato che in presenza di GPER la cinetica dell'internalizzazione di FSHR attraverso endosomi precoci e tardivi è ridotta, suggerendo la sua capacità di bloccare FSHR a livello intracellulare e riducendo il riciclaggio di FSHR sulla membrana. Infatti, l'internalizzazione di FSHR è necessaria affinché GPER inibisca la risposta del cAMP indotta da FSH. Secondo i nostri risultati, gli estrogeni sono selettivamente coinvolti nella regolazione dei segnali pro e anti-apoptotici, nell'internalizzazione dei recettori attraverso i complessi FSHR/GPER e nella modulazione della cascata di segnali mediata da LHCGR. I nostri risultati indicano come la maturazione degli ovociti dipenda dalla capacità del GPER di modulare i segnali selettivi di FSHR e LHCGR, indicando che gli eteromeri dei recettori delle gonadotropine possono essere un marker della proliferazione cellulare.
Classically, follicle-stimulating hormone receptor (FSHR) and luteinizing hormone (LH) receptor (LHCGR) -driven cAMP-mediated signaling boosts human ovarian follicle growth and oocyte maturation. However, contradicting in vitro data suggest a different view on physiological significance of FSHR-mediated cAMP signalling, showing at the same time the activation of steroidogenic and pro-apoptotic events. These signals can be impaired by estrogens inducing anti-apoptotic events via nuclear receptors and non-genomic action of a G protein-coupled estrogen receptor (GPER). The aim of the project is to better understand the role of estrogens/gonadotropins and their membrane receptors in regulating ovarian physiology and the selection of the dominant follicle. In this study it was demonstrated that GPER heteromerizes both with FSHR and LHCGR at the cell surface of HEK293 cells overexpressing the two receptors as well as human primary granulosa lutein cells (hGLC). FSHR/GPER heteromers reprogram cAMP/death signals into proliferative stimuli fundamental for sustaining oocyte survival. In human granulosa cells, survival signals are missing at high FSHR:GPER ratio, which negatively impacts follicle maturation and strongly correlates with preferential Gαs protein/cAMP-pathway coupling and FSH responsiveness of patients undergoing controlled ovarian stimulation. In contrast, FSHR/GPER heteromers triggered anti-apoptotic/proliferative FSH signaling delivered via the Gβγ dimer, whereas impairment of heteromer formation or GPER knockdown enhanced the FSH-dependent cell death and steroidogenesis. On the other hand, GPER/LHCGR complex does not affect the LH and hCG-induced cAMP production and do not compromise the activation of the cAMP/PKA pathway, as it is indicated by similar CREB and ERK1/2 phosphorylation and same progesterone production in hGLC treated with siRNA against GPER, and the mock-treated one. Interestingly, GPER displace the LHCGR/Gαq coupling and consequently impedes the intracellular Ca2+ release and IP1 accumulation in LHCGR-GPER co-expressing HEK293 cells upon LH and hCG treatment compared to LHCGR-expressing cells. Also, it was demonstrated that in presence of GPER the kinetic of FSHR internalization through early and late endosomes is reduced, suggesting its ability to blockade FSHR at the intracellular level and reduce FSHR recycling on cell membrane. Indeed, FSHR internalization is necessary for GPER to inhibit FSH-induced cAMP response. According to our results, estrogens are selectively involved in the regulation of pro- and anti-apoptotic signals and receptor internalization through FSHR/GPER complexes and in modulation of LHCGR-mediated signaling cascade. Our findings indicate how oocyte maturation depends on the capability of GPER to shape FSHR and LHCGR selective signals, indicating hormone receptor heteromers may be a marker of cell proliferation.

Orientador: Anthony César de Souza Castilho
Resumo: A superestimulação ovariana é uma biotecnologia amplamente empregada na espécie bovina para a obtenção de múltiplas ovulações. Com este objetivo diversos protocolos superestimulatórios surgiram, dentre eles o protocolo P-36 e sua variação, o protocolo P-36/eCG. Ambos os tratamentos utilizam o hormônio folículo estimulante (FSH) na indução do crescimento folicular. Como é acreditado que no último dia do tratamento, as células da granulosa folicular possuam receptores do hormônio luteinizante (LH; LHR), duas últimas doses de FSH foram substituídas pela administração de gonadotrifina coriónica equina (eCG; P-36/eCG). A molécula de eCG possui atividade tanto LH quanto FSH por se ligar a ambos receptores, aumentando a resposta ovulatória. Os dois tratamentos têm demonstrado eficácia quanto ao desenvolvimento de oócitos competentes para a produção embrionária, no entanto pouco se sabe sobre seus efeitos na diferenciação celular no folículo ovariano. Por isso, o presente estudo investigou os efeitos da superestimulação ovariana com FSH (P-36) ou FSH combinado com eCG (P-36/eCG) sobre aspectos bioquímicos e a produção de hormônios esteroides. Adicionalmente, quantificou-se a abundância de miRNAs reguladores da expressão do mRNA do LHR e outros miRNAs relacionados com o desenvolvimento folicular ovariano. Os resultados obtidos mostram que os tratamentos superestimulatórios alteram o perfil bioquímico intrafolicular e a concentração de estradiol no plasma. Aliado a isso, também alteram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Ovarian overstimulation is a biotechnology widely used in the bovine species to obtain multiple ovulations. With this objective, several protocols were introduced, including the P-36 protocol and its variation, the P-36/eCG protocol. Both treatments use follicle stimulating hormone (FSH) to induce the follicular growth. As it is believed that on the last day of treatment, follicular granulosa cells have luteinizing hormone (LHR) receptors, two last doses of FSH have been replaced by administration of equine chorionic gonadotrifine (eCG; P-36/eCG). The eCG molecule has LH and FSH activity by binding to both receptors, increasing the ovulatory response. Both treatments has demonstrated efficacy in the development of oocytes competent for embryo production, however little is known about their effects on cell differentiation in the ovarian follicle. Therefore, the present study investigated the effects of ovarian superstimulation using FSH (P-36) or FSH combined with eCG (P-36/eCG) on biochemical aspects and production of steroid hormones. In addition, the abundance of miRNAs regulating the expression of LHR mRNA and other miRNAs related to ovarian follicular development. Results demonstrated that superstimulatory treatments alter the intrafollicular biochemical profile and the plasma estradiol concentration. In addition, they also alter the expression of LHR and miRNAs regulating LHR mRNA expression, possibly modulating ovulatory capacity in superstimulated ovarian follicles.
Mestre

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is the leading cause of anovulatory infertility and the most common endocrinopathy of women of reproductive age. Genome-wide association studies (GWAS) identified a number of loci associated PCOS in different ethnic populations, including women with Asian and European ancestry. Replication studies have confirmed some of these associations. Among the loci identified are those located near the LH receptor gene (LHCGR), a clathrin-binding protein gene (DENND1A) that also functions as a guanine nucleotide exchange factor, and the gene encoding RAB5B, a GTPase and protein involved in vesicular trafficking. The functional significance of one of these GWAS candidates (DENND1A) was supported by our discovery that a truncated protein splice variant of DENND1A termed DENND1A.V2, is elevated in PCOS theca cells, and that forced expression of DENND1A.V2 in normal theca cells increased CYP11A1 and CYP17A1 expression and androgen synthesis, a hallmark of PCOS. We previously proposed that the PCOS GWAS loci could be assembled into a functional network that contributes to altered gene expression in ovarian theca cells, resulting in increased androgen synthesis. Here we demonstrate the localization of LHCGR, DENND1AV.2 and RAB5B proteins in various cellular compartments in normal and PCOS theca cells. hCG and forskolin stimulation affects the distribution and co-localization of DENND1A.V2 and RAB5B in various cellular compartments This cytological evidence supports our PCOS gene network concept, and raises the intriguing possibility that LHCGR activation, via a cAMP-mediated process, promotes the translocation of DENND1A.V2 and RAB5B-containing vesicles from the PCOS theca cell cytoplasm into the nucleus, resulting in increased transcription of genes involved in androgen synthesis.

BPS/IC (Bladder Pain Syndrome/Interstitial Cystitis) ist ein sehr schweres und noch weitgehend unverstandenes Krankheitsbild in der Urologie. Viele Frauen sind im Alltag durch den ständigen Harndrang und die Schmerzen stark eingeschränkt und von Depressionen betroffen. Die Aufklärung der Pathogenese ist deshalb sehr wichtig, um eine adäquate Therapie für die Betroffenen zu entwickeln und die Krankheit möglichst frühzeitig diagnostizieren zu können. Das Schwangerschaftshormon hCG (humanes Choriongonadotropin) besitzt differenzierende und wachstumsfördernde Eigenschaften und eine Rolle in der Urothelregeneration und – stabilisierung scheint möglich. Daher ist das Ziel dieser Arbeit seinen Rezeptor, den LHCGR (Luteinizing-Hormone/Choriogonadotropin Rezeptor), in der Harnblase nachzuweisen und die urothelialen und muskulären Charakteristika zwischen gesunden und an BPS/IC erkrankten Harnblasen zu vergleichen. Die Darstellung des LHCGR erfolgte auf Proteinebene mittels indirekter Immunfluoreszenz und auf mRNA-Ebene durch Standard-PCR. Es zeigten sich im Urothel von Harnblase und Ureter 5 unterschiedliche Verteilungsmuster des Rezeptors hinsichtlich seiner Expression in verschiedenen Zellschichten und seiner subzellulären Lokalisation. Je nach Urothelzustand und zwischen den Entitäten Kontroll- bzw. BPS/IC-Harnblase variierten diese Muster in ihrer Häufigkeit. In anderen Epithelien, wie dem Vaginalepithel, änderte sich die zelluläre Verteilung des LHCGR in Abhängigkeit vom Differenzierungsgrad der Zellen. Es scheint möglich, dass auch die Rezeptorexpression in Urothelzellen deren verschiedene Differenzierungszustände widerspiegelt. Dies unterstützt den für hCG vermuteten Einfluss auf die Epithelregeneration. Ein Vergleich der urothelialen Fluoreszenzintensitäten zwischen weiblichen Kontroll – und BPS/IC-Harnblasen zeigte eine signifikant stärkere Expression des Rezeptors bei erkrankten Patienten. Dem gegenüber war kein Unterschied im Detrusor, weder zwischen Kontroll – und BPS/IC-Harnblasen noch im geschlechtsspezifischen Vergleich, festzustellen. Damit scheint der Rezeptor seine Hauptaufgabe vorrangig im Urothel zu entfalten. Die Korrelationsanalysen ergaben keinen signifikanten Zusammenhang zwischen dem Erkrankungsalter (Zeitpunkt der Diagnosestellung und Biopsieentnahme) und der LHCGR-Immunfluoreszenz. Ein endokrinologischer Einfluss auf die Rezeptorexpression wurde dadurch unwahrscheinlich und unterstützt die immer akzeptiertere Auffassung, dass BPS/IC nicht mehr mit der Menopause assoziiert ist. Neben dem Urothel und Detrusor zeigten auch Lamina propria und Gefäße von Harnblase und Ureter die Expression des LHCGR in der Immunhistochemie. Unterschiedliche Clustermuster des Rezeptors im Detrusor ließen auf die Oligomerisierung des Rezeptors schließen. Die Bedeutung dieser Zusammenschlüsse ist jedoch noch unklar, wobei unterschiedliche funktionelle Zustände des Rezeptors vermutet werden. Orientierung bieten andere Rezeptoren, die durch Dimerisierung verschiedener Rezeptorvarianten ihre Funktionalität verbessern oder verschlechtern konnten. Obwohl für keine bisher entdeckte Variante des LHCGR eine definitive Aufgabe ermittelt werden konnte, scheinen doch viele Varianten auch unterschiedliche Funktionen wahrnehmen zu können. Besonders auf der Regulierbarkeit des Rezeptors mittels interagierender Splicevarianten sollte das Augenmerk zukünftiger Studien liegen. Ob durch Komplexbildung verschiedener Varianten oder Bildung nichtfunktioneller trunkierter Rezeptoren, die Kontrollmöglichkeiten sind vielfältig und können auch auf Liganden wirken. Letztlich ließ der Nachweis des LHCGR in allen Schichten von Harnblase und Ureter eher eine globale Rolle des Rezeptors im Harntrakt des Menschen vermuten. Dazu passten auch die bereits nachgewiesenen Einflüsse seiner Liganden auf die Blasenfunktion von Hunden. Die hier vorgelegte Arbeit untersuchte zum ersten Mal die Expression des LHCGR mittels PCR und Immunhistochemie in humanen Harnblasen und Ureteren. Dabei löste sie sich von den sonst üblichen Vorstellungen einer Beziehung des Rezeptors zu Blasentumoren, Schwangerschaft oder Inkontinenz. Diagnose und Therapie von BPS/IC sind zur Zeit noch ständigen Wandlungen unterworfen und dabei entgehen viele Patienten der (frühen) Diagnosestellung und einer adäquaten Behandlung. Diese Studie sollte dazu beitragen neue Einblicke in die Pathophysiologie der Erkrankung zu erlangen, um eine kausale Therapie entwickeln zu können. Zukünftig könnten diese Ergebnisse dabei helfen die Anwendung einer sensitiven und vor allem spezifischen Diagnostik auf molekularer Ebene (mRNA - oder Proteinnachweis) zu ermöglichen.

Introdução: Os receptores do peptídeo insulinotrópico dependente de glicose (GIPR) e do hormônio luteinizante (LHCGR) são receptores acoplados à proteína G com amplo padrão de expressão tecidual. A expressão anômala destes receptores tem sido descrita em casos de hiperplasia adrenal macronodular independente de ACTH (AIMAH) e em alguns adenomas, resultando em aumento da secreção hormonal (cortisol, andrógenos e aldosterona) pelo cortex adrenal. O papel destes receptores em outras formas de hiperplasia, como a doença adrenocortical nodular pigmentosa primária (PPNAD), aumento da adrenal associado à neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (MEN1), e em carcinoma do córtex adrenal tem sido pouco investigado; sendo assim, considera-se relevante estudar a expressão destes receptores nos pacientes com tumores adrenocorticais esporádicos, nos pacientes com AIMAH, PPNAD e aumento adrenal associado à MEN1. Objetivos: 1) Caracterização molecular dos casos de neoplasia endócrina múltipla tipo 1 e PPNAD: pesquisa de mutações dos genes MEN1 e PRKAR1A e análise da perda de heterozigose (LOH) destes genes no tecido adrenal destes pacientes. 2) Quantificar a expressão do GIPR e do LHCGR em tecido adrenocortical normal, tumoral, hiperplásico e correlacionar a expressão destes com a classificação histológica dos tumores adrenocorticais. Pacientes: 55 pacientes (30 adultos) com tumores adrenocorticais (37 adenomas e 18 carcinomas); 7 pacientes com AIMAH, 4 com MEN1, 1 com PPNAD e tecidos controles (adrenal; testículo e pâncreas). Métodos: extração de DNA genômico, RNA e síntese de DNA complementar (cDNA); amplificação por PCR das regiões codificadoras dos genes MEN1 e PRKAR1A seguida por seqüenciamento automático. Pesquisa de LOH pela amplificação de microssatélites por PCR e análise pelo programa GeneScan. Quantificação da expressão do GIPR e do LHCGR por PCR em tempo real pelo método TaqMan e estudo de imunohistoquímica para GIPR nos tumores adrenocorticais. Resultados: identificação de 3 mutações (893+ 1G>A, W183X e A68fsX118) e dois polimorfirmos (S145S e D418D) no gene MEN1 e uma mutação (Y21X) no PRKAR1A. Ausência de LOH nos tecidos adrenais estudados. A expressão do GIPR e do LHCGR foi identificada em tecidos adrenais normais, tumorais e hiperplásicos. O nível de expressão do GIPR foi mais elevado nos tumores adrenocorticais malignos que nos benignos tanto no grupo pediátrico (mediana= 18,1 e 4,6, respectivamente; p <0,05), quanto no grupo adulto (mediana = 4,8 e 1,3 respectivamente; p <0,001). O nível de expressão do LHCGR, no grupo pediátrico, foi elevado tanto nos tumores benignos quanto nos malignos (mediana= 6,4 e 4,3, respectivamente). No grupo adulto os níveis de expressão deste receptor foram extremamente baixos nos tumores malignos em relação aos benignos (mediana= 0,06 e 2,3, respectivamente; p <0,001). A imunohistoquímica para o GIPR foi variável e não correlacionada à expressão do gene GIPR. Não houve diferença nos níveis de expressão do GIPR e do LHCGR nas hiperplasias do córtex adrenal. Conclusões: a presença de LOH e mutação em heterozigose composta do gene MEN1 e do PRKAR1A foram afastadas como mecanismos responsáveis pelo aumento adrenal tanto nos pacientes com MEN1 como no paciente com PPNAD. A hiperexpressão de GIPR está associada a malignidade nos tumores adrenocorticais nos grupos adulto e pediátrico e a baixa expressão de LHCGR está associada a malignidade nos tumores adrenocorticais somente no grupo adulto.
Introduction: The glucose- dependent insulinotropic peptide receptor (GIPR) and luteinizing hormone receptor (LHCGR) are G-protein coupled receptors with a wide tissue expression pattern. The aberrant expression of these receptors has been described in cases of ACTH-independent macronodular adrenal hyperplasia (AIMAH) and in some adenomas, resulting in the increase of adrenal cortex hormonal secretion (cortisol, androgens and aldosterone). The role of these receptors in other forms of adrenocortical hyperplasia, such as primary pigmented nodular adrenocortical disease (PPNAD), adrenal enlargement associated with multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1), and adrenocortical carcinoma has been scarcely investigated. Thus, the study of the expression of these receptors in patients with sporadical adrenocortical tumors, AIMAH, PPNAD and adrenal enlargement associated to MEN1 was considered important. Objectives: 1) Molecular study in patients with multiple endocrine neoplasia type 1 and PPNAD: mutation screening of MEN1 and PRKAR1A genes and analysis of the loss of heterozygosis (LOH) of these genes in the adrenal lesions of these patients. 2) To quantify the GIPR and LHCGR expression, in normal, tumor and hyperplasic tissue and to correlate the expression of these receptors with the adrenocortical tumor histology. Patients: 55 patients (30 adults) with adrenocortical tumors (37 adenomas and 18 carcinomas); 7 patients with AIMAH, 4 with MEN1, 1 with PPNAD and control tissue (adrenal, testis and pancreas). Methods: Extraction of genomic DNA, RNA and synthesis of complementary DNA (cDNA); PCR-amplification of the coding regions of MEN1 and PRKAR1A, followed by direct sequencing. LOH study using polymorphic marker amplification by PCR and GeneScan software analysis. Quantification of GIPR and LHCGR expression using realtime PCR -TaqMan method and GIPR immunohistochemistry study in adrenocortical tumors. Results: Identification of 3 mutations (893+ 1G>A, W183X and A68fsX118) and two polymorphic alterations (S145S and D418D) in MEN1 and a mutation (Y21X) in the PRKAR1A gene; LOH was not identified in adrenal tissue. The GIPR and LHCGR expression was identified in normal, tumor and hyperplasic adrenal tissues; the GIPR expression level was more elevated in malignant tumors compared to benign tumors in pediatric (median = 18.1 and 4.6, respectively; p <0.05) and adult patients (median = 4.8 and 1.3 respectively; p <0.001). The LHCGR expression in pediatric patients was elevated in benign as well as in malignant tumors (median = 6.4 and 4.3, respectively). In the adult group, the expression level of these receptors was extremely low in malignant tumors in relation to benign ones (median = 0.06 and 2.3, respectively; p <0.001). The GIPR immunohistochemistry was variable and did not correlate with GIPR gene expression. No difference between GIPR and LHCGR expression levels was observed in the different forms of hyperplasia. Conclusions: The presence of LOH and mutations in compound heterozygosis of MEN1 and PRKAR1A genes were ruled out as the mechanisms responsible for the adrenal enlargement in patients with multiple endocrine neoplasia type 1. GIPR overexpression is associated with malignant adrenocortical tumors in the adult and pediatric patients and low LHCGR expression is associated with malignant adrenocortical tumors only in the adult patients.

L’endométriose est une pathologie chronique, bénigne, caractérisée par la présence de tissu endométrial (glande et stroma) en dehors de l’utérus. La forte prévalence de cette maladie, sa symptomatologie invalidante et son coût annuel considérable en font un véritable enjeu de santé publique. Le traitement de l’endométriose comprend un volet chirurgical, potentiellement délabrant, et un volet médical, basé sur des produits anti-gonadotropes en première intention. L’endométriose est d’origine multifactorielle. Sa physiopathologie demeure mal connue. Alors que le reflux menstruel via les trompes semble être le primum movens, plusieurs étapes sont nécessaires à la formation des lésions d’endométriose : l’adhésion et l’implantation des cellules endométriales au mésothélium péritonéal, la prolifération cellulaire soutenue par un phénomène d’angiogenèse et enfin, la réaction inflammatoire. Ces étapes sont dépendantes de facteurs génétiques, immunologiques et environnementaux. L’inflammation joue un rôle clef dans la pathogénie de l’endométriose. Nous avons montré dans un premier temps, à l’aide d’une double approche de PCR quantitative et d’immunohistochimie, la surexpression du récepteur de la LH (LHCGR) dans les tissus endometriosiques ectopiques. A l’aide d’un modèle in vitro, nous avons démontré que la stimulation du LHCGR par l’hCG activait les MAPK (avec une augmentation du rapport pERK/ERK), exerçait une effet prolifératif et enfin, induisait la surexpression de nombreux gènes cibles : CYP19A1, NR5A1, INSL3, VEGFA et PTGS2. Ensuite, nous avons étudié les principaux acteurs de la voie des prostaglandines. Nous avons montré une nette perturbation de cette voie en faveur d’une augmentation de l’inflammation avec une surexpression de la PTGS2 ainsi que des récepteurs des prostaglandines PTGER2, 3 et 4 dans l’endomètre des patientes endométriosiques. Nous avons ensuite étudié la voie des sphingosines en analysant l’expression de ses acteurs clef (SPHK1-2, SGPP1-2, SGPL1, SPHAKAP, S1PR1-5). Nous avons mis en évidence pour la première fois l’existence d’une profonde dérégulation de l’expression des enzymes et des récepteurs de cette voie en faveur d’une diminution du catabolisme du Sphingosine-1phosphate. Cette perturbation est à l’origine de la réaction inflammatoire qui participe à l’entretien de la prolifération et de la croissance des cellules endométriosiques. Dans un deuxième temps, nous avons exploré le retentissement systémique de l’endométriose à l’aide du modèle d’une interleukine pro-inflammatoire et fibrosante, l’IL-33, et de deux interleukines anti-inflammatoires l’IL-19 et l’IL-22. L’IL-33 est significativement plus élevée dans le sérum des patientes endométriosiques en particulier en cas d’endométriose profonde. Nous avons également mis en évidence l’existence d’une corrélation significative avec le nombre et la sévérité des lésions profondes. En opposition, les interleukines anti-inflammatoires IL-19 et IL-22 sont significativement diminuées dans le sérum des patientes endométriosiques. En conclusion, nous avons montré l’existence d’une perturbation des voies inflammatoires : la voie de la PTGS2 et de celle des sphingosines ainsi que le rôle pro-inflammatoire du LCGHR. Nous avons également mis en évidence le déséquilibre de la balance des cytokines systémiques inflammatoires et anti-inflammatoires dans l’endométriose. Ainsi, ces médiateurs de l’inflammation pourraient être considérés comme de potentiels marqueurs évolutifs de l’endométriose. Leur utilisation pourrait permettre d’effectuer un diagnostic plus précoce, et d’envisager de nouvelles thérapeutiques ciblées
Pas de résumé en anglais

A biomassa vegetal, seja como produto de interesse econômico ou do ponto de vista ecológico, é estritamente dependente do processo fotossintético. O advento das técnicas de biologia molecular e transformação genética de plantas trouxe boas perspectivas para a alteração do processo fotossintético, já que pouco foi conseguido com o melhoramento vegetal tradicional. Modificações genéticas nos LHCs (estruturas responsáveis pela captação e transferência da energia luminosa) mostram-se promissoras. Plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tabacum, L.) que expressam o gene quimérico Lhcb1*2 de ervilha têm sido estudadas por apresentarem uma série de alterações no metabolismo fotossintético, além de um ganho genético em relação à planta selvagem original. Vários autores observaram mudanças morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e adaptativas que favorecem estas plantas em diversas condições de cultivo. Diversos experimentos foram realizados no intuito de melhor caracterizar as plantas transformadas com o gene Lhcb1*2 de ervilha. O potencial produtivo foi avaliado através da análise de crescimento e produção de massa seca. O metabolismo fotossintético foi analisado através de medidas de assimilação de CO2, fluorescência da clorofila a, metabólitos do ciclo de Calvin-Benson, glicólise e ciclo de Krebs, carboidratos (amido e sacarose) e aminoácidos. Os resultados obtidos mostram uma redução da taxa de fotorrespiração pelas plantas transgênicas. Esta redução promoveu o aumento do período de crescimento vegetativo e produção de biomassa, à semelhança do que ocorre em plantas cultivadas sob baixa pressão de oxigênio (5%) ou alto CO2. Entretanto, ao contrário do que ocorre nessas condições, a produção de sementes e o peso nas linhagens transgênicas não foram reduzidos.
Plant biomass, seen either from the economic or the ecological points of view, is highly dependent upon photosynthesys. The development of molecular biology and genetic engineering techniques brought great perspectives for the improvement of the photosynthetic process, since few progress had been achieved with traditional plant breeding. Genetic alteration of the LHCs (structures responsible for the capture and distribution of radiant energy) seems promising. Transgenic tobacco plants (Nicotiana tabacum, L.) over expressing the pea Lhcb1*2 gene have been studied. They present several alterations in the photosynthetic metabolism which lead to a genetic improvement of them in relation to the original plant. Many authors observed morphological, physiological, biochemical and adaptative changes which were benefical to these plants to diverse growing conditions. Several experiments were carried out in order to better characterize these transgenic tobacco lines. The potential for production was evaluated, via dry wight and growth rate. The photosynthetic metabolism was analyzed through CO2 assimilation, chlorophyll fluorescence, metabolites of the Calvin-Benson, glycolysis and Krebs cycles, carbohydrates (starch and sucrose) contents and amino acids. The results obtained show a reduction in photorespiration rate in the transgenic plants. Such reduction lead to on extension of the plant growing period and on enlargment of the biomass, similar to what occurs in plants growing under low O2 (5%) or high CO2 conditions. However, in contrast to what normally happens under these conditions, dry weight and seed production were not reduced in the transgenic lines.

O sistema coletor de luz (LHC) é o principal complexo de proteínas associado a carotenóides e clorofilas, localizado nas membranas dos tilacóides nas plantas e algas superiores. O LHC atua como um sistema antena para o fotossistema I e o fotossistema II e tem um papel chave na captação da energia luminosa para a fotossíntese (Horton et aI, 1996). Os processos de transporte de elétrons, fixação do CO2 e assimilação do nitrato estão relacionados às necessidades de ATP, poder redutor e cofatores proteicos como, ferredoxina ou tiorredoxinina. Existe uma forte correlação entre o metabolismo do carbono e nitrogênio em plantas superiores, pois os esqueletos carbônicos e a energia, produtos da fotossíntese, são necessários à assimilação do nitrato direta ou indiretamente, através da síntese de sacarose (Ferrario-Mery, 1998; Foyer et al., 1998). A regulação deste processo é necessária para prevenir uma competição potencial da disponibilidade de poder redutor e precursores orgânicos, necessários para às vias biossintéticas (Champigny, 1995). A assimilação do nitrato para a biossintese de amino ácidos e outras moléculas necessita de ferredoxina reduzida (Durnford & Falkowski, 1997). Neste trabalho nós investigamos a regulação do metabolismo fotossintético e a assimilação do nitrato, em plantas trangênicas de tabaco que produzem uma proteína da ervilha de 28kDa do sistema principal do complexo LHCII. As análises foram conduzidas em condições de baixa luminosidade. Os resultados demostraram um aumento na assimilação de nitrogenio das plantas transgênicas, evidenciado pelo maior estado de ativação da nitrato redutase, maior atividade da glutarnina sintetase e mudanças no conteúdo de amino ácidos. Glutamato e Glutarnina aumentaram nas folhas das plantas transgênicas, enquanto Treonina teve uma severa diminuição.
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O complexo coletor de luz (LHC) do fotossistema II (PSII) é o principal complexo de proteínas associado a pigmentos situado na membrana dos tilacóides de cloroplastos em plantas. O LHCII funciona como uma antena de transferência de energia para a captura e direcionamento da energia luminosa do PSII para o PSI. A ação coordenada dos dois fotossistemas com o direcionamento do fluxo de elétrons gera a quebra da molécula de água, através da membrana do tilacóide, produzindo força assimilatória ATP e NADPH. A energia química produzida na fotossíntese é de suma importância para a assimilação de carbono, biossíntese de aminoácidos e metabólicos secundários. Portanto, este é um importante gene para estudos em biotecnologia. Linhagens transgênicas de tabaco (TR-1 e TR-2) as quais expressam constitutivamente o transgene Lhcb1*2 de ervilha obtidas por Labate e colaboradores (2004) foram utilizadas nesse trabalho. Estas plantas apresentaram diversos efeitos pleiotrópicos relacionados à anatomia, morfologia, bioquímica e fisiologia. Uma proteína pode não atuar isoladamente, mas freqüentemente interagindo com outras proteínas, influenciando diversos processos metabólicos. O perfil de proteômica dessas linhagens transformantes, em relação à planta selvagem (WT) foi investigado. As proteínas totais foram extraídas de folhas de plantas de três meses crescidas em câmaras de crescimento, então separadas por 2D-PAGE. As proteínas diferencialmente expressas foram identificadas por LC-MS/MS. Os resultados mostram que 244 spots apresentaram alterações significativas na expressão nas duas linhagens transgênicas em relação à WT. 122 spots são expressos exclusivamente nas linhagens transformantes, e 24 spots somente na selvagem. Muitas proteínas como ATP synthase e ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase foram mais expressas nas linhagens transgênicas, mas a glutamine synthetase, uma importante proteína na reciclagem de nitrogênio nos cloroplastos, teve sua expressão diminuída. Para analisar as alterações na expressãode genes relacionados ao ritmo circadiano entre outros, como a conformação do PSII, cotilédones de plântulas estioladas foram submetidas à luz e amostras coletadas depois de 0, 3, 6, 12 e 24 horas. O nível de transcritos foram analisados por PCR quantitativo. A diferenciação de plastídio à cloroplasto maduro foi analisado por microscopia eletrônica de transmissão, para se entender as diferenças entre os genótipos em estudo no desenvolvimento vegetal. A expressão constitutiva do gene Lhcb1*2 de ervilha em plantas transgênicas de tabaco acarretou a indução e repressão de várias proteínas e genes em distintos passos de vias metabólicas, estabilizando a homeostase celular, exercendo uma influência significativa no desenvolvimento vegetal e produção de biomassa.
The light harvesting complex (LHC) of photosystem II (PSII) is the major ensemble of pigmet-biding proteins situated in the thylakoid membranes of the chloroplast in plants. The LHCbII functions as an energy-transferring antenna for capturing and delivering light energy to the photosystems PSII and PSI. The coordinated actions of the two photosystems in turn drive the flow of electrons, generated by the splitting of water, through the thylakoid membranes to produce the assimilatory force ATP and NADPH. The chemical energy produced by photosynthesis is very important for the assimilation of carbon, amino acids biosynthesis, and secundary metabolism. Therefore it is an important gene for biotechnological studies. Transgenic tobacco lines (TR-1 and TR-2) which express the pea Lhcb1*2 transgene constitutively obtained by Labate et al. (2004) were used in this work. These plants presented pleiotropic effects related to anatomy, morphology, biochemistry and physiology. As a protein may not act by itself, but it is, frequently interacting with other proteins, influencing a lot of metabolic processes. The proteomic profile of these transgenic lines, in relation to the wild type (WT), was investigated. The total proteins extracted from leaves of three-month old plants grown in growth chambers were separated by 2DPAGE. The differentially expressed proteins were identified by LC-MS/MS. The results showed that 225 spots displayed significant changes in the expression of the two transgenic lines in relation to the WT. 122 spots were exclusively expressed in the transgenic lines, and 24 only in the wild type. Many proteins as ATP synthase and ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase are overexpressed in the transgenic lines, but the glutamine synthetase, an important protein tor nitrogen recycling in the chloroplasts, showed a reducted level of expression. In order to analyse the alterations of the expression of genes related to the circadian rhythm among others, involved in the conformation of the PSII, cotyledons from etiolated seedlings were thenexposed to light and samples collected after 0, 3, 6, 12 and 24 hours. The level of transcripts were analysed by RT/RT-PCR. The PSII conformation were analysed by transmition electron microscopy, with the aim of verifying the evolution of plastids into the chloroplasts which could be leading to changes in plant development. The overexpression of the pea Lhcb1*2 gene in transgenic tobacco plants, lead to the induction and suppression of several proteins and genes in key metabolic pathways, as a way to establish a cellular homeostasis, exerting a significant influence on plant development and biomass production.

A produção vegetal é dependente do processo fotossintético. As técnicas de biologia molecular e transformação genética de plantas trouxeram boas perspectivas para a alteração do metabolismo fotossintético. Plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tabacum, L.) que superexpressam o gene quimérico Lhcb1*2 de ervilha têm sido estudadas por apresentarem uma série de alterações no desenvolvimento e no metabolismo fotossintético, em relação à linhagem selvagem. Vários autores observaram mudanças morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e adaptativas que favorecem essas plantas em diversas condições de cultivo. O objetivo desse trabalho foi o de avaliar o impacto da superexpressão desse gene na formação plastidial de plântulas de tabaco germinadas e mantidas no escuro por sete dias e depois transferidas à luz, com coletas periódicas de 0, 6, 18 e 120 horas pós-iluminação. O desenvolvimento plastidial, avaliado por microscopia de luz, mostra um provável adiantamento na formação dos cloroplastos dos materiais vegetais transgênicos (TR1 e TR2) em relação à selvagem (WT). A análise de ultraestrutura dos plastídios por microscopia eletrônica de transmissão, demostrou um real adiantamento na formação dos cloroplastos maduros nas duas linhagens transgênicas A análise de Western blot confimou a presença de proteínas específicas do fotossistema II (Lhcb 1-2 e D1). Este fato implica que a montagem do aparato fotossintético é antecipada nos transgênicos, assim como o desenvolvimento morfológico e estrutural observado nos plastídios.
The vegetal production is strictly dependent on the photosynthetic process. Techniques of molecular biology and genetic transformation of plants brought good perspectives for the alteration of the photosynthetic metabolism. Transgenic tobacco plants (Nicotiana tabacum, L.) which express the chimeric pea Lhcb1*2 gene were pbtained and presenta series of alterations on development and photosynthetic metabolism in relation to the wild type. Previous analysis have demonstrated morphological, physiological, biochemical and adaptative changes that favour these transgenic lines in various conditions of culture. The aim of this work was to evaluate the impact of the expression of this gene in the plastid formation, of tobacco seedlings. Seeds were germinated and kept in darknes for seven days, and transferred to light. The seedlings were then collected after 0, 6, 18 and 120 hours of exposure to continuous ilumination. The plastidial development evaluated by light microscopy, showed an advanced chloroplast formation of the transgenic lines (TR1 and TR2) in relation to the wild type (WTSR1). The ultrastructural analysis of the plastids by electronic microscopy showed, indeed on advanced formation of mature chloroplasts in the transgenic lines. The Western blot analysis confirmed the presence of two specific proteins (CAB and D1), of the photosystem II. This fact implies that the assembly of the photosynthetic apparatus might occurs earlier in the transgenic lines, as well as the morphological and structural development of the plastids.

The Arbuscular mycorrhiza (AM) is an endosymbiont of higher plant roots. Most land plants and cultivated crops are concerned to AM symbiosis. This endosymbiosis is based on the mutual exchange of nutrients between plant and fungus. Therefore, AM symbiosis leads to an increased demand for photosynthetic products. The aim of this study was to investigate the pathway used by plants during AM symbiosis to increase photosynthetic performance. Therefore, we have carried out a systematic characterization of photosynthesis in Medicago truncatula (M. truncatula), which is a model legume. We observed colonization by the fungus in roots and that AM symbiosis increases the fresh and dry plant biomass. This could be attributed to an increase in both photosynthetic efficiency and capacity in AM plants. Consistent with these observations, AM symbiosis enhanced phosphorus uptake from the soil into roots, stems and leaves, as based on analyses of phosphorus content. Based on equal chl loading, no differences were found regarding D1, Lhcb1 and Lhcb2 protein content in four plant groups. This indicates similar ratio between chl and PSII proteins. Furthermore, AM symbiosis increases the amount of chlorophyll, steady state oxygen evolution activities, maximum quantum yield (Fv/Fm), and photosynthetic electron transport rate (about 5 fold). Nevertheless, photoprotection was not affected by AM symbiosis. We observed an increase in weight of seed/fruit and weight of seed/plant in AM plants (about 2 fold). Based on these results, we propose that AM symbiosis increases both the efficiency and the capacity of photosynthetic apparatus in the M. truncatula.

BPS/IC (Bladder Pain Syndrome/Interstitial Cystitis) ist ein sehr schweres und noch weitgehend unverstandenes Krankheitsbild in der Urologie. Viele Frauen sind im Alltag durch den ständigen Harndrang und die Schmerzen stark eingeschränkt und von Depressionen betroffen. Die Aufklärung der Pathogenese ist deshalb sehr wichtig, um eine adäquate Therapie für die Betroffenen zu entwickeln und die Krankheit möglichst frühzeitig diagnostizieren zu können. Das Schwangerschaftshormon hCG (humanes Choriongonadotropin) besitzt differenzierende und wachstumsfördernde Eigenschaften und eine Rolle in der Urothelregeneration und – stabilisierung scheint möglich. Daher ist das Ziel dieser Arbeit seinen Rezeptor, den LHCGR (Luteinizing-Hormone/Choriogonadotropin Rezeptor), in der Harnblase nachzuweisen und die urothelialen und muskulären Charakteristika zwischen gesunden und an BPS/IC erkrankten Harnblasen zu vergleichen. Die Darstellung des LHCGR erfolgte auf Proteinebene mittels indirekter Immunfluoreszenz und auf mRNA-Ebene durch Standard-PCR. Es zeigten sich im Urothel von Harnblase und Ureter 5 unterschiedliche Verteilungsmuster des Rezeptors hinsichtlich seiner Expression in verschiedenen Zellschichten und seiner subzellulären Lokalisation. Je nach Urothelzustand und zwischen den Entitäten Kontroll- bzw. BPS/IC-Harnblase variierten diese Muster in ihrer Häufigkeit. In anderen Epithelien, wie dem Vaginalepithel, änderte sich die zelluläre Verteilung des LHCGR in Abhängigkeit vom Differenzierungsgrad der Zellen. Es scheint möglich, dass auch die Rezeptorexpression in Urothelzellen deren verschiedene Differenzierungszustände widerspiegelt. Dies unterstützt den für hCG vermuteten Einfluss auf die Epithelregeneration. Ein Vergleich der urothelialen Fluoreszenzintensitäten zwischen weiblichen Kontroll – und BPS/IC-Harnblasen zeigte eine signifikant stärkere Expression des Rezeptors bei erkrankten Patienten. Dem gegenüber war kein Unterschied im Detrusor, weder zwischen Kontroll – und BPS/IC-Harnblasen noch im geschlechtsspezifischen Vergleich, festzustellen. Damit scheint der Rezeptor seine Hauptaufgabe vorrangig im Urothel zu entfalten. Die Korrelationsanalysen ergaben keinen signifikanten Zusammenhang zwischen dem Erkrankungsalter (Zeitpunkt der Diagnosestellung und Biopsieentnahme) und der LHCGR-Immunfluoreszenz. Ein endokrinologischer Einfluss auf die Rezeptorexpression wurde dadurch unwahrscheinlich und unterstützt die immer akzeptiertere Auffassung, dass BPS/IC nicht mehr mit der Menopause assoziiert ist. Neben dem Urothel und Detrusor zeigten auch Lamina propria und Gefäße von Harnblase und Ureter die Expression des LHCGR in der Immunhistochemie. Unterschiedliche Clustermuster des Rezeptors im Detrusor ließen auf die Oligomerisierung des Rezeptors schließen. Die Bedeutung dieser Zusammenschlüsse ist jedoch noch unklar, wobei unterschiedliche funktionelle Zustände des Rezeptors vermutet werden. Orientierung bieten andere Rezeptoren, die durch Dimerisierung verschiedener Rezeptorvarianten ihre Funktionalität verbessern oder verschlechtern konnten. Obwohl für keine bisher entdeckte Variante des LHCGR eine definitive Aufgabe ermittelt werden konnte, scheinen doch viele Varianten auch unterschiedliche Funktionen wahrnehmen zu können. Besonders auf der Regulierbarkeit des Rezeptors mittels interagierender Splicevarianten sollte das Augenmerk zukünftiger Studien liegen. Ob durch Komplexbildung verschiedener Varianten oder Bildung nichtfunktioneller trunkierter Rezeptoren, die Kontrollmöglichkeiten sind vielfältig und können auch auf Liganden wirken. Letztlich ließ der Nachweis des LHCGR in allen Schichten von Harnblase und Ureter eher eine globale Rolle des Rezeptors im Harntrakt des Menschen vermuten. Dazu passten auch die bereits nachgewiesenen Einflüsse seiner Liganden auf die Blasenfunktion von Hunden. Die hier vorgelegte Arbeit untersuchte zum ersten Mal die Expression des LHCGR mittels PCR und Immunhistochemie in humanen Harnblasen und Ureteren. Dabei löste sie sich von den sonst üblichen Vorstellungen einer Beziehung des Rezeptors zu Blasentumoren, Schwangerschaft oder Inkontinenz. Diagnose und Therapie von BPS/IC sind zur Zeit noch ständigen Wandlungen unterworfen und dabei entgehen viele Patienten der (frühen) Diagnosestellung und einer adäquaten Behandlung. Diese Studie sollte dazu beitragen neue Einblicke in die Pathophysiologie der Erkrankung zu erlangen, um eine kausale Therapie entwickeln zu können. Zukünftig könnten diese Ergebnisse dabei helfen die Anwendung einer sensitiven und vor allem spezifischen Diagnostik auf molekularer Ebene (mRNA - oder Proteinnachweis) zu ermöglichen.

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2014
Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Cancer (HLRCC) is an autosomal dominant syndrome resulting from a mutation in the Fumarate Hydratase enzyme gene which consists of leiomyomas of the skin and uterus and Renal Cell Carcinoma. The exact mechanism of tumor formation is still unknown. However, it is thought to relay on the activation of hypoxia inducible factors with promotion of angiogenesis and anaerobic glycolysis. Renal carcinomas in these patients have specific features that distinguish them from the ones found in other familial syndromes and which are important to their diagnosis and management. Although renal tumors have an incomplete penetrance in these patients, they are extremely aggressive and can metastize early, which is why annual screening with abdominal Magnetic Ressonance Imaging is recommended, as well as immediate surgical excision once detected. The following work presents a case of HLRCC and aims to review the main features and management of Renal Cell Carcinoma in these patients.
A Leiomiomatose Hereditária e Carcinoma de Células Renais (LHCCR) é um síndrome de transmissão autossómica dominante resultante de uma mutação no gene da enzima Fumarato Hidratase e caracterizado pela presença de leiomiomas cutâneos e uterinos e Carcinoma de Células Renais. Embora o exato mecanismo de génese tumoral permaneça desconhecido, pensa-se que a sua origem esteja na ativação de fatores indutores de hipoxia com promoção da angiogénese e glicólise anaeróbia. Os carcinomas renais destes doentes têm características específicas que os distinguem dos encontrados noutros síndromes familiares e que são importantes para o seu diagnóstico e abordagem terapêutica. Apesar dos tumores renais terem uma penetrância incompleta nestes doentes, são extremamente agressivos e metastizam precocemente, pelo que se aconselha a realização de rastreio anual com Ressonância Magnética abdominal e, uma vez detetados, atuação cirúrgica imediata. O trabalho apresentado reporta um caso de LHCCR e tem como objetivo rever as principais características e abordagem terapêutica do Carcinoma de Células Renais nestes doentes.